CN1081041C - 一种用于治疗恶性肿瘤的药物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于治疗恶性肿瘤的药物及其制备方法,涉及生物化学领域。其特征是采用新鲜放血致死的牛颌下腺,经漂洗、匀浆化、离心等化学方法从中提取出S-Tn抗原,辅以由卵磷脂和胆固醇为原料制得的佐剂脂质体制成冻干粉剂疫苗。采用该组成和方法制得的疫苗,富含具有肿瘤特异性的羟乙酰神经胺酸;并可激活巨噬细胞和T细胞,产生多种细胞因子,杀伤肿瘤细胞。该药物制备方法简单,制成的产品性能稳定,保存活性时间长,使用对人体无毒副作用。
Description
本发明公开了一种用于肿瘤免疫治疗的药物及其制备方法,涉及生物化学领域。
恶性肿瘤作为一种较难攻克的疾病,目前临床上主要的治疗方法是依靠外科手术切除瘤体,化学药物和放射治疗,这些方法共有的不足是治疗后肿瘤细胞仍有复发和转移的可能,患者死亡率较高。肿瘤生物治疗是近年来新兴起的治疗恶性肿瘤的一种辅助疗法,它的治疗手段之一是制备肿瘤疫苗,其肿瘤疫苗的来源主要有两种途径:一种是利用患者自身的肿瘤细胞,切除后在体外经照射、病毒感染等方法降低其致瘤性,加入佐剂卡介苗制成肿瘤疫苗后回输给患者。该疫苗应用于临床后取得了良好的治疗效果,但也发现了其不足之处:疫苗中既包括了肿瘤细胞中有利的因子,也包括了有害的因子,治疗效果不稳定;治疗对象仅限于手术切除肿瘤后的患者,不能成为批量生产的药品;其佐剂卡介苗易引起局部经久不愈的溃疡,不利于该疫苗的长期使用。第二种途径是利用一些被证明能够诱发机体细胞免疫或体液免疫的已知分子结构的肿瘤抗原,如利用化学合成方法获得的S-Tn抗原,以基因工程方法、转染病毒方法以及将合成提取的抗原加佐剂等方法制成疫苗,用于肿瘤治疗。目前该疫苗处于临床I、II期试用阶段,尚未形成产品。
本发明的目的在于提供一种取材方便、制备方法简便、治疗效果好、保存活性时间长、无毒副作用、便于患者长期使用的肿瘤疫苗以及制备该肿瘤疫苗的方法。
本发明的目的是这样实现的:
A.组成
1.S-Tn抗原;化学结构式为NeuAc/NeuGc-GalNAc-o-Ser/Thre,为一分子量400KD以上的糖蛋白,其中碳水化合物占60%,蛋白质含量为37.4%;碳水化合物中主要组分为羟乙酰神经胺酸(NEUGC),含量55.3%;胺乙酰神经胺酸(NEUAC),含量28.4%;S-Tn抗原在药物中的含量(重量)为0.01~0.05%;
2.佐剂脂质体;由卵磷脂和胆固醇组成,其比例为2∶1克分子比;佐剂脂质体在药物冲的含量(重量)为0.42~0.44%;
B.制备方法
(一)S-Tn抗原的制备
1.取新鲜放血致死的牛颌下腺,立即置于液氮;
2.除去腺体表面的结缔组织和脂肪组织,将腺体剪成块状,用生理盐水漂洗;
3.将腺体与7倍体积的0.01M氯化钠混合,放入组织匀浆器内制成糊状匀浆;
4.将匀浆放入离心机内,离心12000g,20分钟,去除沉淀后加入相当于1/2体积的浓度为0.01M氯化钠溶液,混匀后离心12000g,20分钟,重复两次,合并上清液;
5.在上清液中滴加2M醋酸,调至PH值为4.7,再次离心12000g,20分钟,去除沉淀;
6.在上清液中滴加10%(M/V)十六烷基溴化胺溶液,加入比例为1克腺体原料兑加十六烷基溴化胺溶液0.1ml,放入搅拌器内搅拌1小时,去除上清液,用冷蒸馏水漂洗三次凝块;
7.在凝块中加入浓度为50%的氯化钙溶液,加入比例为1克腺体原料兑加氯化钙溶液2ml,搅拌,待凝块溶解后放置24小时,放置过程中如有沉淀现象可离心去除沉淀;
8.向溶液中兑加冷乙醇,搅拌,直至浓度达到60%~75%,沉淀放置过夜;
9.将溶液离心3000g,30分钟,弃去上清液,用冷蒸馏水溶解凝块沉淀;
10.全溶后的粘液兑加100倍体积水后透析3天,所得液体为S-Tn抗原溶液,将S-Tn抗原溶液冷冻干燥制成粉状,4℃以下封存;
(二)佐剂脂质体的制备
1.卵磷脂和脂固醇按2∶1克分子比,溶解于氯仿中,加入比例为1ml氯仿中兑加类脂质(卵磷脂+胆固醇)5.19mg;
2.将混合液旋转减压蒸发,制成半透明薄膜,室温干燥过夜;
3.薄膜置于氮气下吹20~30分钟后,加入0.9%的氯化钠溶液,调至脂质最终浓度为6.2mg/ml,在4~10℃冰浴中超声10~20分钟,即得淡黄色乳剂状脂质休溶液;
(三)疫苗的制备
1.将冷冻干燥的S-Tn抗原粉溶于0.9%氯化钠溶液中,加入比例为1mgS-Tn冻干粉兑加氯化钠溶液1ml;
2.在脂质体成品中加入S-Tn抗原溶液,其比例为0.7ml脂质体乳剂中加入S-Tn抗原溶液0.1~0.5ml;
3.在上述混合液中加入20%甘露醇注射液0.2ml;
4.将所得液体按照每瓶1ml规格分装,冷冻干燥后制成粉剂疫苗,放入冰箱,4℃保存。
使用前,向疫苗中加入1.0~1.5ml的蒸馏水,反复吹打15次以上或放入Vertax仪器中旋转振荡成乳剂,皮下注射。
采用上述组成和方法制成的肿瘤疫苗,具有以下优点:
1.制备S-Tn抗原有材料来源不同于以往。国外采用化学方法合成的S-Tn抗原,只含有胺乙酰神经胺酸;本疫苗中所含的S-Tn抗原由牛颌下腺中提取,不仅含胺乙酰神经胺酸,而且富含具有肿瘤特异性的羟乙酰神经胺酸;
2.化学方法合成的S-Tn抗原,分子量小,不足以诱发机体免疫反应,合成疫苗过程中必须连接钥孔原虫血红蛋白;本疫苗中所含的S-Tn抗原为大分子糖蛋白,本身所含的肽链不仅可以诱发体液免疫,更具有诱发细胞免疫的功能;
3.疫苗中用作佐剂的脂质体,可辅助诱发IgG抗体及辅体介导的杀伤肿瘤细胞作用,激活巨噬细胞和提呈抗原给T细胞,产生多种细胞因子,杀伤肿瘤细胞,全面调动机体的免疫功能;
4.本疫苗对人体肿瘤细胞具有特异性,即只对表达S-Tn抗原的肿瘤细胞产生杀伤力,对其它细胞无杀伤作用;
5.取材方便,制备方法简单,制成的疫苗性能稳定,保存活性时间长(1~2)年,对人体无毒副作用,注射局部无红斑、溃疡等现象,便于患者长期使用。
Claims (2)
1.一种用于治疗恶性肿瘤的药物,其特征在于含有以下成份:
(1)从牛颌下腺中提取的S-Tn抗原;化学结构式为NeuAc/NeuGc-GalNAc-o-Ser/Thre,为一分子量400KD 以上的糖蛋白;S-Tn抗原在药物中的含量(重量)为0.01~0.05%;
(2)佐剂脂质体;由卵磷脂和胆固醇组成,其比例为2∶1克分子比;佐剂脂质体在药物中的含量(重量)为0.42~0.44%。
2.一种制备如权利要求1所述药物的方法,其特征在于包括以下步骤:
(一)S-Tn抗原的制备:
(1)取新鲜放血致死的牛颌下腺,立即置于液氮;
(2)除去腺体表面的结缔组织和脂肪组织,将腺体剪成块状,用生理盐水漂洗;
(3)将腺体与7倍体积的0.01M氯化钠混合,放入组织匀浆器内制成糊状匀浆;
(4)将匀浆放入离心机内,离心12000g,20分钟,去除沉淀后加入相当于1/2体积的浓度为0.01M氯化钠溶液,混匀后离心12000g,20分钟,重复两次,合并上清液;
(5)在上清液中滴加2M醋酸,调至PH值为4.7,再次离心12000g,20分钟,去除沉淀;
(6)在上清液中滴加10%(M/V)十六烷基溴化胺溶液,加入比例为1克腺体原料兑加十六烷基溴化胺溶液0.1ml,放入搅拌器内搅拌1小时,去除上清液,用冷蒸馏水漂洗三次凝块;
(7)在凝块中加入浓度为50%的氯化钙溶液,加入比例为1克腺体原料兑加氯化钙溶液2ml,搅拌,待凝块溶解后放置24小时,放置过程中如有沉淀现象可离心去除沉淀;
(8)向溶液中兑加冷乙醇,搅拌,直至浓度达到60%~75%,沉淀放置过夜;
(9)将溶液离心3000g,30分钟,弃去上清液,用冷蒸馏水溶解凝块沉淀;
(10)全溶后的粘液兑加100倍体积水后透析3天,所得液体为S-Tn抗原溶液,将S-Tn抗原溶液冷冻干燥制成粉状,4℃以下封存;
(二)佐剂脂质体的制备
(1)卵磷脂和脂固醇按2∶1克分子比,溶解于氯仿中,加入比例为1ml氯仿中兑加卵磷脂和胆固醇5.19mg;
(2)将混合液旋转减压蒸发,制成半透明薄膜,室温干燥过夜;
(3)薄膜置于氮气下吹20~30分钟后,加入0.9%的氯化钠溶液,调至脂质最终浓度为6.2mg/ml,在4~10℃冰浴中超声10~20分钟,即得淡黄色乳剂状脂质体溶液;
(三)疫苗的制备
(1)将冷冻干燥的S-Tn抗原粉溶于0.9%氯化钠溶液中,加入比例为1mgS-Tn冻干粉兑加氯化钠溶液1ml;
(2)在脂质体成品中加入S-Tn抗原溶液,其比例为0.7ml脂质体乳剂中加入S-Tn抗原溶液0.1~0.5ml;
(3)在上述混合液中加入20%甘露醇注射液0.2ml;
(4)将所得液体按照每瓶1ml规格分装,冷冻干燥后制成粉剂疫苗,放入冰箱,4℃保存。
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CN106008617B (zh) * | 2016-06-12 | 2018-12-25 | 唐露 | Tn抗原及其合成工艺 |
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