DK168755B1 - Farmaceutisk præparat til diagnose og terapi af tumorer samt til behandling af svækkelser af celle- og humoral-immunforsvar - Google Patents

Description

i DK 168755 B1 *

Opfindelsen angår et farmaceutisk præparat til diagnose og terapi af maligne tumorer såvel som behandling af svækkelser i det cellulære- og humorale 5 immunforsvar.

Diagnostiseringen af og terapien for maligne tumorer er trods intensiv forskning i dag stadig vanskelig. Det er næsten umu-ligt at erkende maligne tumorer på et tidligt stade, og indtil nu er ingen fremgangsmåde tilgængelig, med hvilken man kan gennemføre en tidlig diagnose.

Terapierne for maligne tumorer er som bekendt ikke tilfreds-stillende.

U. Ehrenfeld beretter (Krebsgeschehen 5, 132 ff. (1979)) om den cancertoksiske virkning af en blanding af acetaldehyd og ethanol. Blandingen indeholder 3 til 10 g acetaldehyd pr.

2Q 1000 g ethanol. Det viste sig imidlertid, at virkningen af disse blandinger ved behandling af manifesterede maligne tumorer samt metastaser ikke er tilstrækkelig.

Det er bekendt, at man kan anvende liposomer som bærermidler 25 for lægemidler og markørstoffer samt, at man kan koncentrere disse i bestemte organer. Det er blevet fastslået, at liposomer anvendt intravenøst som lægemiddelbærere ikke kontinuerligt kan trænge igennem kapi11arvæggene og hurtigt bliver optaget af phagocytierende celler (G. Poste, Biol, of the Cell 47, 30 19 (1983)).

Samme slags liposomer kan desuden ikke forlade kredsløbet og er derfor uegnede til anvendelse som direkte bærere for markørstoffer eller medikamenter mod tumorer. En enkel an-35 vendelse af liposomer ved inhalering er tidligere slået fejl på grund af, at liposomerne ikke i det til rådighed værende tidsrum kunne gennemtrænge lungernes alveolevægge.

2 DK 168755 B1

Der blev senere foretaget forsøg, hvor liposomer sammen med immunmodulatorer injiceredes intravenøst. Denne metode viste _ sig vellykket til dyr. Eftersom liposomerne, som ovenfor nævnt, ikke uden celleformidling kan forlade kredsløbet, har denne metode imidlertid ikke hidtil været anvendelig til diagnose og terapi på mennesker.

„ Λ Der er et stort behov for et middel, som er i stand til at 10 gennemtrænge cellevægge, som f.eks. cellevæggene i lungerne, blodkarrene, lymfekarrene osv., således at det bliver muligt, at dette selv eller eventuelt bærende et lægemiddel indvirkede direkte på maligne tumorer eller bevirkede en afhjælpning af svækkelser i det cellulære immunforsvar.

15

Diagnosen for maligne tumorer er ofte ekstremt vanskelig.

Med røntgen lader maligne tumorer sig først afsløre, når de har nået en bestemt størrelse. Påvisning af små tumorer og 2Q metastaser lader sig ofte ikke gøre, hvilket medfører, at en tidlig erkendelse af tumorer ikke er mulig, og at maligne tumorer ved kirurgiske indgreb ofte kun bliver fjernet ufuldkomment. Der er derfor et behov for en diagnostiseringsmeto-de, med hvilken man også kan påvise små tumorer med enkle : 2^ og lette metoder.

I de senere år han man i stigende grad iagttaget svækkelser i immunforsvaret, som kan optræde af mange forskellige årsager. Nedsættelsen af forsvaret imod infektionssygdomme fremkaldes 3Q delvis af miljøgifte, som f.eks. bly, svovloxid, nitrogenoxid, kadmium og som følge af kobberfattig kost.

Til behandling af svækkelser i det humorale immunforsvar.anvendes immunglobulinkoncentrater. Til behandling af svækkel-3g ser i det cellulære immunforsvar anvendes HLA-lignende celle koncentrater. Disse står imidlertid kun i yderst ringe omfang til rådighed, og de har en ekstrem kort levetid, hvorfor den 4 3 DK 168755 B1 sidstnævnte terapi for det meste er resultatløs.

5 Den foreliggende opfindelse har som udgangspunkt den opgave at stille et middel og et produkt til diagnose og terapi af maligne tumorer til rådighed. Midlet skal være højvirksomt og derfor kunne indgives i ringere koncentration end de kendte midler. Midlet ifølge opfindelsen skal bevirke, at patien-10 tens organisme bliver mindre belastet, og senerehen skal pa tientens indtagelse være mulig på en enkel måde.

I henhold til opfindelsen skal et middel stilles til rådighed, med hvilket man virkningsfuldt kan behandle svækkelser i im-munforsvaret hos mennesker og dyr. Midlet skal være til rådighed i ubegrænset mængde, og være enkelt at anvende. Det skal være let doserbart. For midlet er der ugiftige modgifte tilgængeligt i handelen. Cortisol og midler, som bevirker en cortisolfrigivelse, sætter det ud af kraft. Overraskende er 2o der nu fundet immunmodulatorer, som er i stand til frem for alt ved oral anvendelse og i særdeleshed ved anvendelse gennem inhalering at gennemtrænge cellevægge. Derved er en ny vej til erkendelse og en ny.måde at behandle maligne tumorer blevet mulig.

25

Opfindelsen angår et farmaceutisk præparat til diagnose og terapi af ondartede tumorer samt til terapi af svækkelser i det cellulære og det humorale immunforsvar, hvilket middel er ejendommeligt ved, at det foruden sædvanlige bærermaterialer 30 og/eller fortyndingsmidler indeholder mindst én bestanddel valgt blandt (l) en immunmodulator, 35 (2) en immunmodulator (a) i og/eller på liposomer eller (b) lipideret, eller 4 DK 168755 B1 (3) en med en radioaktiv emitter, et farvestof eller et cyto-statikum market immunmodul ator eller en blanding af sådanne mærkede immunmodul atorer eller (4) en med en radioaktiv emitter, et farvestof eller et cyto- 5 statikum mærket immunmodulator eller en blanding af sådanne mærkede immunmodul atorer (a) i og/eller på liposomer eller (b) lipideret, eller (5) en blanding af to eller flere af de ovennævnte bestanddele samt indeholder 10

et aldehyd med formlen I

RCHO (I) hvor R er et hydrogenatom eller en ligekædet eller forgrenet hydrocarbongruppe med 1 til 4 carbonatomer, og om ønsket

en alkohol med formlen II

RCH2OH (II) hvor R har den ovenfor angivne betydning.

15 Det farmaceutiske præparat trænger overraskende let igennem cellevæggene, i særdeleshed igennem lungealveole-, lymfe- og blodkapillarvæggene. Derved bliver en ny diagnose og en ny behandlingsmetode mod maligne tumorer muliggjort, idet de med en radioaktiv emitter påviseliggjorte immunmodulatorer umid-20 delbart vandrer til den maligne tumor og dér bibringer den højst mulige virkning i erkendelsen og behandlingen af tumoren.

5 DK 168755 B1

Det farmaceutiske præparat ifølge opfindelsen kan anvendes til diagnose af maligne tumorer in vivo og in vitro. De maligne tumorer kan diagnosticeres uden for legemet. F.eks. kan kirurgen ved en operation fjerne ondartet væv og så inkubere det 5 levende væv uden for organismen, så at vævssnit i flasker, f.eks. ved farvemarkering med fluoresceinisothiocyanat, i UV-lys lyser ondartet væv op og straks kan skelnes fra mørkt, sundt væv.

Med præparatet ifølge opfindelsen lader tumorer i størrelses-10 ordener fra 100 til 10000 celler sig eksakt kendetegne; ved yderligere oxygenmængde er midlet i stand til ved hjælp af den til diagnostikken frembragte minimale radioaktive stråling at afstedkomme en fremadskridende "betændelse" som følge af strålingsnedbrydning af tumor-vævet.

15 som immunmodulatorer kan i forbindelse med den foreliggende opfindelse anvendes alle forbindelser, som er tilgængelige i handelen og beskrevet i litteraturen.

Ved "immunmodulatorer", der også betegnes som "immunstimu-lanter", forstår man forbindelser eller blandinger, som stimu-20 lerer immunsystemet på en eller anden måde.

Immunmodulatorerne er i litteraturen ikke entydigt defineret. Bestemte lipopolysaccharider kan også falde ind under begrebet immunmodulatorer.

25

Ifølge opfindelsen foretrækkes som immunmodulatorer sådanne forbindelser, som allerede er anvendt i terapi eller diagnose for mennesker. Særlig foretrukken ifølge opfindelsen er anvendelsen af muramilsyredipeptidderivater (MDP) eller peptido-glycaner eller peptidoglycanfrie ekstrakter, eksempelvis af polysaccharidstruktur, såsom ekstrakter af Norcardia rubra eller Norcardia opaca, eller af andre bakterier, fortrinsvis 6 DK 168755 B1 af Bacillus Calmette Guérin (BCG)f samt afgiftede præparater af Salmonellaer og lipiderede polysaccharider, fortrinsvis sådanne lipiderede af Salmonellapræparaterne, der er afgiftet ved fjernelse af tilkoblede grupper og således foreligger egnede til anvendelse til mennesker med henblik på de nævnte 5 virkninger, samt derivater deraf.

Immunmodulatorerne kan være af naturlig oprindelse, dvs. naturstoffer, eller de kan være halvsyntetisk eller syntetisk fremstillede stoffer.

1°

De som immunmodulatorer betegnede peptidoglycaner består af et polysaccharidskelet, som er opbygget af disaccharidbygge-sten af N-acetylglucosaminyl-N-acylmuramyl, hvor acylgruppen dannes af en acetyl- eller glycolylgruppe. Disse enheder skal for den ønskede effekt være til stede i et tilstrækkeligt X « antal. Foruden disse enheder kan fra 0 til 10% neutralt sukker ligeledes være til stede. Disse peptidoglycaner indeholder peptidsubstituenter, der har mistet deres interpeptidbinding-er i et sådant omfang, at de er blevet vandopløselige og kun i ringe grad endnu fedtopløselige.

Ved enden af glycankæden må ingen peptidsubstituenter være til stede. Peptidoglycanerne skal være fuldkommen fri for naturlig lipider, sammen med hvilke de optræder i bakterie-vægge. Disse lipider kan imidlertid i en foretrukken udførelsesform af det opfundne præparat erstattes af andre lipider, f.eks. phosphatidylcholin alene eller sammen med phosphatidyl-serin og cholesterol i det molære forhold 8:2:10, hvorved vandopløseligheden af peptidoglycanen bevares.

30

Disse sidstnævnte lipider kan forekomme som opløsningsmiddel eller bundet til peptidoglycaner. Peptidoglycanernes N-acetyl-glucosamingrupper kan være delvist desacetyleret.' Hele molekylet kan imidlertid også yderligere være omsat med aldehyder med formlen I 35 RCHO (I) 7 DK 168755 B1 hvor R er et hydrogenatom eller en ligekædet eller forgrenet hydrocarbongruppe med 1 til 4 carbonatomer. Fortrinsvis kan de være omsat med acetaldehyd.

5

Peptidoglycanernes via L-alanin bundne peptidenheder indeholder sekvenser af L-alanin—MD-isoglutamin—*meso-a-e-di-aminopimelinsyre (DAP), hvor DAP kan være amidieret. På dets plads kan også uridindiphosphat være til stede eller natur-10 ligvis en anden aminosyre, som f.eks. lysin, der på sin side kan være substitueret.

Immunmodulatorerne kan også være tilsat humanalbumin og/eller immunglobulin og således indgives intravenøst eller intralymfa-tisk. Indgivelse i liposomer er her det foretrukne.

15

Ifølge opfindelsen kan immunmodulatorerne være mærket med en radioaktiv emitter. Markering med en radioaktiv emitter er beskrevet i litteraturen (M.P. Osborne, V.J. Richardson, K. Jeyasingh og B.E. Ryman, Int. J. Nucl. Med. Biol. 6, 75 20 (1979)).

Eksempler på radioaktive emittere er emittere, som iøvrigt finder anvendelse i terapi og diagnose, som f.eks. 99 mTc, 25 til 200 mCi, idet der ved de anvendelsesbetinget lukkede 25 inhaleringssystemer forbliver over 50% af radioaktiviteten i systemet, og høje lungebelastninger er unødvendige.

Immunmodulatorerne kan yderligere bære et cytostatikum. Eksempler på cytostatika og metastasehæmmere, som ^ kan anvendes, er alle de for tiden som cytostatika og metastasehæmmere kendte forbindelser. Eksempler herpå er melphalan, carmustin, lomustin, cyklophosphamid, estramustin-phosphat, ifosfamid, chlorambucil, methrotrexat, pegafur, fluorouracil såvel som antibiotika, der anvendes til disse 35 _ ..

formal.

8 DK 168755 B1

Immunmodulatorerne kan desuden være mærket med et farvestof. Som farvestoffer egner sig eksempelvis på markedet gængse og i mennesker ugiftige, aminogruppemarkerende farvestoffer, såsom blandt andet fluoresceinisothiocyanat. Af det pågældende far-5 . vestof, f.eks. fluoresceinisothiocyanat, bliver et antal mole kyler blandet med det til terapien anviste præparat af immun-modulatorer, som klart ligger under antallet af de i disse tilstedeværende aminogrupper. Derpå lader man blandingen henstå ved 37°c i 45 minutter.

10 Det er også muligt at anvende blandinger af en eller flere immunmodulatorer, som er mærket med en radioaktiv stråle, et farvestof eller et cytostatikum, såvel som blandinger af lipo-polysaccharider, og som ovenfor beskrevet markerede lipopoly-saccharider. Man kan også anvende blandinger af immun-15 modulatorer, eventuelt markerede immunmodulatorer og lipopoly-saccharider, eventuelt markerede lipopolysaccharider.

I præparaterne ifølge den foreliggende opfindelse foretrækkes det, at immunmodulatorerne henholdsvis de markerede immunmodulatorer ikke anvendes alene, men derimod anvendes sammen 20 med liposomer eller i lipideret form.

Liposomer er kugleformede dannelser af et eller flere lipid-dobbeltlag med et indre rum. Sådanne små blærer lader sig fremstille ved mekanisk findeling af phospholipider, som f.eks. lecithin i vandige medier.

25 X- præparaterne ifølge opfindelsen anvendes liposomer, der er separate unilamellare blærer (SUV) og fortrinsvis består af phosphati-dylcholin:phosphatidylserin: cholesterol i det molære forhold 8:2:10 og fremstilles ved lydbehandling. De lipider, hvoraf de er fremstillet, er tilgængelige i handelen, eksempelvis fra 30 Sigma Products. De oprenses ved søjlekromatografi, opløses DK 168755 Bl 9 i ether, inddampes under ^ og blandes med immunmodulatorerne eller den under immunmodulator, resuspenderes i phosphatpufferet kogsaltopløsning (PBS), eksempelvis ved pH 7,4, og lydbehandles derpå med en pulserende Branson 15 Sonikator, eksempelvis 5 i 25 minutter ved 2°C. Lydbehandlingen udføres normalt i

Efter lydbehandlingen bliver liposomerne kromatograferet på en Sepharose-4-B-søjle, og fortrinsvis anvendes populationsfraktionen med radier under 300 Å (C. Huang, Biochemistry 10 15, 2362 (1969)). Disse liposomer bliver derpå markeret til diagnostik på i og for sig kendt måde med fortrinsvis 99 mTc på immunmodulatoren, som beskrevet af Osborne m.fl. (Μ.P. Osborne, V.J. Richardson, K. Jeyasingh og B.E. Ryman, Int.

J. Nucl. Med. Biol. 6, 75 (1979)).

'15

For at afprøve den radioaktive markering sættes en aliquot mængde af liposomerne til en Sepharose-4-B-søjle og kromato-graferes. Man fastslår, at præparatet har en specifik aktivitet på 99,2% til immunmodulatoren bundet radioaktivitet og 20 0,8% frie pertechnetat.

Liposomerne kan overtrækkes med immunmodulatorer, som er belagt med et radioaktivt sporstof, et farvestof, et cytostatikum eller blandinger af disse forbindelser. Sådanne liposomer 25 er især egnede til diagnosen.

Ifølge en yderligere foretrukken udførelsesform for opfindelsen bliver immunmodulatoren i givet fald som ovenfor forklaret overtrukket ved dispergering i et lipid. Dispersionen sker 3 0 ved, at man bringer substanserne sammen og ligeledes underkaster dem en sonikering.

35 DK 168755 Bl 10

Afvigende fra den ovenfor nævnte fremstilling af liposomerne er f.eks.: (1) fordampningen af de herved i ethanol og ether opløste 5 foreliggende lipider under N2 udelades, og (2) efter lydbehandlingen, kromatograferingen og fraskillelsen af fraktionen med radier over 300 Å udelades, og dette produkt anvendes kun til inhalering.

10 Som lipider kan man anvende phosphatidylcholin alene eller sammen med phosphatidylserin og cholesterol, eksempelvis i det molære forhold 8:2:10.

Som ovenfor nævnt er det velkendt, at en blanding af acetal-15 dehyd og ethanol har en cancertoksisk virkning. Overraskende

er det nu fundet, at det opfundne præparat får en speciel goc virkning ved anvendelse af et hjælpemiddel, der foruden kendte bærerstoffer og/eller fortyndingsmidler indeholder et aldehyd med formlen I

20 RCHO (I)

hvor R er et hydrogenatom eller en ligekædet eller forgrenet hydrocarbongruppe med 1 til 4 carbonatomer. Det foretrækkes i særdeleshed, at hjælpemidlet ud over aldehydet med formlen 25 I også indeholder en alkohol med formlen II

R1CH2OH (II) hvor R1 har den for R givne betydning. Overraskende viste det 3 0 sig, at virkningsgraden for immunmodulatoren ved samtidig og tidsmæssig trinvis anvendelse af hjælpemidlet yderligere forbedres væsentligt. Hjælpemidlet i det opfundne præparat. kan indeholde aldehydet som sådant i sædvanlige farmakologisk acceptable bærere og/eller fortyndingsmidler. Særligt fore-35 trukket er det at anvende aldehydet i vandig og/eller alkoho lisk opløsning. I henhold til opfindelsen foretrækkes det især at anvende det pågældende aldehyd sammen med den tilsvarende alkohol.

11 DK 168755 B1

Foretrukne hjælpemidler frigør indirekte eller direkte og/eller 5 indeholder formaldehyd/methanol, acetaldehyd/ethanol, n-pro- pionaldehyd/n-propanol, isopropionaldehyd/isopropanol, n-butyr-aldehyd/n-butanol, isobutyraldehyd/isobutanol, tert.-butyr-aldehyd/tert.-butanol, n-valeraldehyd/n-pentanol eller blandinger af disse forbindelser.

10

En optimal virkning af det nye farmaceutiske præparat, blandt en forbedring af permeabiliteten for overtrukne liposomer, kan åbenbart opnås, når det er muligt at holde koncentrationen af aldehydet højt og fortrinsvis ensartet højt i legemet 15 igennem længere tidsrum. Det er velkendt, at ethanol i det menneskelige legeme omdannes til acetaldehyd, hvor nedbrydningshastigheden for ethanol over en bestemt koncentration i lighed med acetaldehyds er praktisk talt uafhængig af koncentrationen, og nedbrydningshastigheden acetaldehyd øjensynlig 20 er af samme størrelsesorden eller lidt mindre end ethanols.

Disse ved naturlig nedbrydning af alkohol optrædende koncentrationer af acetaldehyd er imidlertid øjensynlig ikke høje nok.

25 Med hjælpemidlet er det for det første muligt at opnå en til strækkelig høj koncentration af f.eks. acetaldehyd i legemet hos den, der er syg af tumorer og/eller metastasedannelse, hvorved i opfindelsens foretrukne udførelsesform ved samtidig indgivelse af et så vidt mulig uskadeligt stof - specielt 30 den tilsvarende alkohol - der ved nedbrydning deraf løbende 35 12 DK 168755 B1 efterdannes det tilsvarende aldehyd, som begunstiger gennemtrængningsforbedringen igennem celler og væv og virkningsret-5 ningen af den lipiderede immunmodulator til det cellulære immunforsvar.

Stofparret acetaldehyd/ethanol er praktisk taget ugiftigt? man kan indtage det i egnede høje doser. Deraf følger mulig-^0 heden for en vedvarende behandling, også i kombination med en strålebehandling. Det immunbiologiske system påvirkes positivt, og en kombination med andre medikamenter og med kirurgiske og radiologiske forholdsregler er mulig.

15 Foruden denne blanding ethano1/acetaldehyd er principielt også andre analoge blandinger af den ovennævnte art mulige, som f.eks. methanol/formaldehyd, propanol/propanal, butanol/ butanal osv.. Methanol nedbrydes i det menneskelige legeme væsentligt langsommere end ethanol, propanol med en faktor 2q 2 hurtigere end ethanol. Midlet kan indeholde kun et bestemt udvalgt aldehyd eller også aldehydblandinger. Anvendelsen af aldehyderne er ikke nødvendigvis forbundet tilstedeværelsen af de tilsvarende alkoholer. Også vandige aldehydopløsninger kan anvendes. I stedet for de frie aldehyder kan i henhold 25 til opfindelsen også anvendes sådanne aldehydderivater, som i stofskiftet hos den med det farmaceutiske middel ifølge opfindelsen behandlede, danner det frie aldehyd. Egnede aldehydderivater er eksempelvis acetalerne eller halvacetalerne eller kondensationsprodukter, som ligeledes kan anvendes som 3Q sådanne eller i opløst form (vand eller alkohol) eller også i blandinger med aldehyder og/eller alkoholer.

I en yderligere foretrukken udførelsesform for- opfindelsen indeholder hjælpemidlet ringe mængder (mindre end 0,05 vægt%) 35 af peroxider, hvorved især de her stofagtigt beslægtede per oxider kan komme i betragtning, især E^O og/eller aldehydper-oxidet eller hydroxyhydroperoxid^t samt peroxidet af den tilsvarende carboxylsyre. Ved hjælp af indholdet af peroxider bliver den antitumorale virkning yderligere forbedret.

DK 168755 B1 '13

Koncentrationen af aldehydet i det opfundne præparat er for det første bestemt af acceptabiliteten deraf og for det andet bestemt af den dosis, der skal indtages. For parret ethanol/ acetaldehyd er en acetaldehydkoncentration i alkohol under 2 x 10 ^ mol/ liter ofte virkningsmæssigt utilfredsstillende langsom. Virkningen stiger med stigende aldehydkoncentration, og den øvre grænse bestemmes i det enkelte tilfælde som regel af muligvis indtrædende manglende acceptabilitet af aldehydet.

I praksis har eksempelvis ethanol/acetaldehydopløsninger med 5 x 10~2 mol til 1 mol acetaldehyd pr. liter ethanol, hvor 10 3 denne blanding i en dosis af eksempelvis 10 til 150 cm pr.

dag fundet anvendelse.

Det foretrækkes, at hjælpemidlet indeholder 10 til 40 g aldehyd pr. 1000 g alkohol, og især foretrækkes 15 til 30 g aldehyd pr. 1000 g alkohol. Normalt bliver hjælpemidlet fortyndet 15 med vand forud for indgiften. Den alkoholholdige opløsning kan fortyndes vilkårligt med vand. Eksempelvis kan man fortynde 1 volumen af den alkoholholdige opløsning med fra 1 til 10 volumen, fortrinsvis 2 til 5 volumen vand.

Hjælpemidlet indgives fortrinsvis oralt i form af den vandige 20 » opløsning og drikkes af patienten. Hjælpemidlet kan dog også indgives parenteralt, f.eks. ved infusion. Tilberedning af infusionsopløsningen er for fagmanden velkendt og kan ske på enkel måde.

I præparatet ifølge opfindelsen kan begge bestanddelene være 25 kombineret på forskellig måde. Hjælpemidlet kan foreligge på en for oral indtagelse og/eller for parenteral indtagelse egnet form. Eksempelvis kan præparatet foreligge i form af drikkeampuller, eller det kan foreligge i form af drikkeampuller, der skal fortyndes med vand. Præparatet ifølge opfindel-30 sen, f.eks. immunmodulator-liposomer, kan foreligge i en for oral og/eller parenteral indgift egnet form. Kombinationen tilberedes, så den svarer til præparatets formål. Skal præparatet anvendes til terapi, indeholder præparatet 14 DK 168755 B1 det samme antal dosisenheder af hjælpemiddel og middel, f.eks. liposomer. Tallet kan dog også variere. Det er f.eks. muligt, _ at et præparat, som er tænkt anvendt til diagnose, indeholder flere dosisenheder af hjælpemiddel og kun én eller to dosisenheder af liposomerne. Det rigtige kombinationsvalg af forholdet mellem dosisenhederne af hjælpemiddel og liposomer er velkendt for fagmanden og retter sig efter den tilsigtede anvendelse.

10

Hjælpemidlet kan fremstilles på enkel vis ved enkel blanding af bestanddelene. Det valgte aldehyd blandes med farmakologisk acceptable bærerstoffer og/eller fortyndingsmidler, eventuelt sammen med alkoholen.

15

Det foretrækkes dog at fremstille hjælpemidlet ved, at man bestråler en alkohol med formlen II

RCH2OH (II) 20 hvor R er et hydrogenatom eller en ligekædet eller forgrenet hydrocarbongruppe med 1 til 4 carbonatomer, med energirig bestråling under tilførsel af oxygen.

Som energirig bestråling kan eksempelvis anvendes γ-, UV-, 2 5 røntgen- eller elektronbestråling. Derved kan de valgte alkoholer anvendes som sådanne eller også alkohol/vand-blandinger, idet højkoncentrerede alkohol/vand-blandinger kan være særlig foretrukne som udgangsmateriale. Bestrålingen sker under til-3Q førsel af oxygen, fortrinsvis ved tilførsel af luft.

Et i praksis særlig vigtigt og virksomt antitumormidde1 kan f.eks. fremstilles ved, at man i nærværelse af pxygen udsætter 96% ethanol for energirig bestråling af nævnte slags, indtil den ønskede mængde acetaldehyd er dannet. Opløsningen indeholder

«5 O

da i alt væsentligt foruden meget ethanol acetaldehydet sammen med peroxider, såsom H202 eller acetoperoxid, eller spor af pereddikesyre og som eddikesyre. De sidstnævnte stoffer forbedrer virkningen af de immunmodulatorovertrukne liposomer 15 DK 168755 B1 væsentligt. Overraskende viste det sig, at en for ethanol/ acetaldehyd typisk forøgelse af makrofager, T-celler, T-hjælpe-5 celler og dræberceller blev fundet, og denne effekt vender immunmodulatorens virkningsretning fra en overvejende B-cellestimulation, som den kendes, til en forøgelse af makrofager, T-, T-hjælper- og naturlige dræber-celler, således at et hidtil ukendt stort antal af disse celler frembringes i mennesket.

1Q Dette er ikke beskrevet af U. Ehrenfeld i den førnævnte litte ratur, og det lå heller ikke nær.

Til immunologisk medikamentel behandling indgives fortrinsvis lipiderede immunmodulatorer, fortrinsvis i liposomer, sterilt suspenderet i fysiologisk kogsaltopløsning, per inhalering, efter forudgående oral indgift af en cocktail af fortrinsvis ethanol/ acetaldehyd i vand. Derved sker der en entydigt konstaterbar formindskelse af kræftmassen uden uheldige bivirkninger.

20 Såfremt immunmodulatoren som ovenfor nævnt markeres med en radioaktiv emitter, kan synliggøreIsen af Orfan- fordelingen af det 99mTechnetium-markerede lipiderede immunmodulatormolekyle fastholdes i billedet, fortrinsvis under anvendelse af et 25 eksternt γ-kamera.

Såfremt oxygenafgivelsen i vævet under udstrålerens virkningstid nedsættes ved hjælp af et egnet middel, lader virkningen af tidligere behandlinger sig fastslå med det eksterne γ-kamera.

30

Ifølge en særlig foretrukken udførelsesform for opfindelsen indgives sammen med cocktailen og den strålemarkerede immun-modulator-liposomer "SmIL" et middel, som forøger oxygenafgivelsen i de maligne tumorers område. Herved øges samtidigt den 35 terapeutiske strålingsvirkning. Som sådanne midler, der øger oxygenafgivelsen i de maligne tumorer, kan man anvende alle sådanne midler, som allerede er kendt for denne virkning.

16 DK 168755 B1 denne virkning. Eksempler herpå er inositolhexaphosphat, gly-ceroldiphosphat og andre stoffer, som er kendt for at kun-5 ne findes i blodet og dér have denne effekt. Strålebehandlingen bliver begrænset til bestemmelsesstedet, og strålingen bliver individuelt doserbar.

Mellemfaser eller afbrydelser af strålebehandlingen udfyldes lø ved behandling med lipiderede immunmodulatorer.

Det var overraskende og ikke nærliggende, at SmIL samler sig i en sådan mængde ved og i maligne tumorer. Herved bliver en behandling af talrige forskellige tumorer mulig, og det 15 bliver også muligt at eftervise og diagnosticere de allermindste tumorer i legemer på pattedyr og i særdeleshed mennesker.

Ifølge den foreliggende opfindelse er det hermed for første gang muligt i pattedyr og i særdeleshed i mennesker at diagno-20 sticere og også at helbrede maligne tumorer på enkel måde, uden at patienten bliver belastet. Ifølge opfindelsen er det muligt målrettet at bestråle tumoren, næsten uden at det nabovævet beskadiges, og yderligere kan man ifølge opfindelsen bringe medikamenter, f.eks. cytostatika eller immunmodulatorer, 25 til det sted, hvor de faktisk skal virke.

Til test og behandling er en ernæring med vidtgående glucose-og stivelsesfri kost nødvendig. Lokalt ophæves effekten af virkstofkombinationen som følge af glucose, sukker, stivelse, 30 vitamin C i høje doser og vitamin , i almindelighed som følge af cortison og antihistaminika.

Hver behandlingsdag inhaleres en halv til en hel dosis af aerosolen og drikkes en dosis af cocktailen. Angivelserne 35 for aerosolen og for cocktailen betegner en dagsdosis.

DK 168755 Bl 17

Aerosolen: Liposomerne er enkeltvise unilamellare blærer, som består af phosphatidylcholin:phosphatidylserin:cholesterol i det molære forhold 8:2:10 og har radier under 300 Å, og 5 5 mg deraf er suspenderet i 5 ml fysiologisk kogsaltopløsning til inhalering. Liposomerne bærer en immunmodulator, f.eks.

fra Nocardia opaca 6 pg/ml, hvoraf 1 til 2% befinder sig inden i og 98 til 99% befinder sig uden for liposomerne. Til scin- tigrafisk diagnostik og til stråleterapi bærer immunmodulatoren en markering fra 25 til 50 mCi af 99m Technetium-Pertechnetat, til farvediagnostik af kræft udelukkende eller sammen med emitteren et egnet farvestof. Til immunbehandling af maligne tumorsygdomme og til terapi af svækkelsestilstande i det cel^- lulære ©g humorale immunforsvar bærer immunmodulatoren ingen 15 emitter.

Cocktailen: 25 til 50 ml af en kombination af 96% ethanol : rent acetaldehyd i forholdet 1000 ml : 40 ml fortyndes med 250 til 500 ml ledningsvand.

20

Det er muligt eksakt at påvise de mindste tumormængder. Tumorstørrelsen af et malignom er uden betydning for resultatet af påvisningen. Phosphatidylcholin (lecithin) forekommer fysiologisk i lungerne mættet med fedtsyrer. Det tjener til stabi-25 lisering af alveolevæggene. Som lipid for immunmodulatormole- kylerne tjener det frem for alt til lettelse af passagen for disse; ethanol og acetaldehyd er kendt for at være poreåbnere i membraner i levende væv og understøtter denne effekt af lecithin.

30

Efter passagen af lungens alveolevæg bringes den lipiderede immunmodulator via blod- og lymfekar til den maligne tumor, hvor den hovedsagelig ved en aktiv proces i den levende kræftcellevæg bindes hertil. Immunmodulatoren kan med sædvanlige 35 farvemetoder påvises i arten af granula, idet gængse lipid- farvninger kun viser minimale sporadiske tegn på lipid. Li-piderne går formodentlig vidtgående tabt ved passagen af cellevæggene.

18 DK 168755 B1

Fluoresceinisothiocyanat eller 99mTc forbliver bundet til immunmodulatoren indtil kræftcellevæggen og kan dér påvises fluorescensmikroskopisk eller autoradiografisk.

Den i de efterfølgende beskrevne forsøg anvendte ekstrakt af 5 Nocardia opaca med handelsbetegnelsen JOMOL fremstilles som følger: 1. Opformering af Nocardia opaca (Rhodococcus rhodochrous) (DSM 43202 henholdsvis ATCC nr. 21953) på pepton/gærekstrakt/-10 glucose-næringsagarplader ved inkubation i 8-10 dage ved 32°C.

De afhøstede Nocardia-bakterier lagres ved -20°C.

2. Udvinding af cellevægsfragmenter

De atter optøede Nocardia-bakterier suspenderes vandigt sammen 15 med fine glasperler og oplukkes i en cellemølle under isvand afkøling. Glasperlerne fraskilles ved bundfældning, og cellevægsfragmenterne sedimenteres i en ultracentrifuge og vaskes en gang med vand.

20 3. Udvinding af råekstrakten ved enzymfordøjelse

De vandigt suspenderede cellevægsfragmenter inkuberes med pro-teolytiske og murolytiske enzymer to gange over 4 timer ved 37°C. Derefter sedimenteres cellevægsfragmenterne i ultracen-trifuge. Supernatanten indeholder råekstrakten, hvori for-25 døj elsesenzymerne inaktiveres ved varmebehandling. Der gennem føres en protein- og sukkerbestemmelse på råekstrakten. Endvidere foretages en forundersøgelse af toksiciteten (ifølge Turner, 100 gange overdoseret) og af pyrogeniteten (60 gange overdoseret) i overensstemmelse med EP, bind II.

30 4. Kemisk modifikation af råekstrakten

Diethylentriaminpentaeddikesyreanhydrid (DTPAA) bringes sammen med råekstrakten i et forhold på 1,3 mg DTPAA pr. 15 mg protein og ultralydbehandles.

35 Fluoresceinisothiocyanat (Fitc) inkuberes og behandles med ultralyd efter kobling af DTPA sammen med råekstrakt-DTPA i et forhold på 1 mg Fitc pr. 15 mg protein.

19 DK 168755 B1

5. Fraktionering og oprensning af JOMOL

Frit DTPA og Fite fraskilles over en molekylsigte-søjle (Se-phadex G75, løbemiddel: fysiologisk kogsaltopløsning) fra ekstrakten. Definerede fraktioner af søjleeluatet forenes. Det 5 samlede volumen centrifugeres i en ultracentrifuge i 20 min. Denne pool er den cellevægsekstrakt, der betegnes JOMOL. Efter en proteinbestemmelse undersøges endnu en gang JOMOL's toksicitet og pyrogenitet.

Sammensætningen på vægtbasis kan groft angives som protein 40% lipider 40% polysaccharider 10-15% muropeptider 5-10%.

På denne måde kan der også ud fra andre mikroorganismer udvindes immunmodulatorisk aktive ekstrakter, hvis sammensætning i et vist omfang kan variere.

20

Ved hjælp af det eksterne y-kamera blev der ved forsøget vist forskellige melanosarkomer, pladeepithelcarcinomer og adeno-carcinomer i det kvindelige bryst. Forsøgene blev foruden på universitetsklinikken gentaget i et sygehus med enkle metoder 25 og var uden problemer reducerbare med de samme resultater for de dér afprøvede immunmodulatorer fra BCG og Nocardia.

Knogleomgivne metastaser kunne ikke påvises ved forsøget, men ved delvis udtagning fra knoglerne var afbildningen mulig.

30 Hjernemetastaser kan afbildes, dog må man her give afkald på cocktailindgift, da denne straks inducerer en omfangsrig kollikvationsnekrose ved hjernemetastaser. Tumorer og metastaser uden for hudens basale membran kan ikke afbildes.

__ Ved intratumoral indgift af SmIL skete der kun en diffusions-o 5 afbildning i det sunde væv, og i ondartet væv fremkom den DK 168755 Bl 20 samme langtidsbinding og afbildelighedhed som efter inhalering -af SmlL.

Den lokale nekrotiseringsproces i tumorvæv efter inhalering ^ af SmlL med lokal "betændelse" og resorptiv temperaturstigning til 38,5°C var altid reproducerbar med Nocardia og BCG ved indgift af cocktailen og flere timers oxygeninsufflation under finnål-biopsikontrol.

1Q I anledning af SmlL-indgiften i testen med γ-kameraet forekom der som ved den ovenfor nævnte immunbehandling altid leuko-zytoser med en stigning i antallet af makrofager, Rieder-, T-, T-hjælper- og naturlige Killer-celler og de lymfatiske plasmaceller. Hos en ung kvinde førte inhaleringen af SmlL 15 (efter cocktailindgift, som i de tidligere nævnte tilfælde) til en stigning i antallet af leukocytter i blod fra 6000 til 25000/μ1 uden temperaturstigning eller andre sygdomstegn.

Ved svækkelse af det cellulære og det humorale immunforsvar stiqer frem for alt antallet og aktiviteten af makrofagerne, 20 T- og T-hjælper-cellerne til det dobbelte af det normale efter indgift af cocktailen og til det seksdobbelte efter supplerende inhalering af den lipiderede immunmodulator ved forskydning af kvotienten T-hjælper-/T-suppressor-celler til fordel for T-hjælper-celler; B-celler og immunglobulinproduktion 25 stiger ligeledes. Disse effekter optræder i samme omfang hos raske og hos kræftpatienter. Antallet ifølge normen på 140/μ1 af Rieder-cellerne og monocytter steg efter indgift af cock tailen bestående af ethanol/acetaldehyd/vand til det dobbelte; når der til cocktailen blev inhaleret MDP i liposomer (30 30 μg i 5 mg), steg tallet til 900/μ1, og når der til cocktailen blev inhaleret immunmodulator fra Nocardia (ImmL) i liposomer (30 μg i 5 mg) steg antallet til værdier omkring og over 2000/ μΐ; hos ældre og levercirrhosesyge mennesker ligger værdierne ca. på halvdelen af værdien hos unge.

35 21 DK 168755 B1

Immunsvaret i de således behandlede tilfælde er konstant i henseende til den cellulært og humoralt forøgede reaktion.

En udmattelse af immunsystemet blev ikke observeret lige så 5 lidt som overreaktionen eller degenerationstegn. Acceptabili teten synes at være fortrinlig.

Den efter anvendelse af det omhandlede middel skete degeneration af levermetastaser inden for dage eller uger førte stadig hurtigere til en tydelig forbedring i patientens almene tilstand.

Efter indgift af acetaldehyd sker der som bekendt på celleoverfladen tværbindinger af Nl^-grupper, lejlighedsvis en sænkning af blodsukker spe jlet, og der indtræder altid en /3-oxidation af fedtsyrer. De ved lipolysen dannede stofskifteprodukter virker for en dels vedkommende på en lignende måde som acetaldehyd.

2ø Makrofagernes phagocytosevirkning ved tilintetgørelse af malig ne tumorceller forøges signifikant ved anvendelse af acetaldehyd og ImmL på nævnte vis. Svindet i hudmetastaser, levermetastaser og omdannelsen af lungemetastaser til luftholdige strukturer blev iagttaget. På overfladen af maligne tumorer 25 viste der sig en signifikant makrofag bulnen i histologien.

Effekten af røntgenbestråling af tumorvæv blev forbedret med acetaldehyd/ethanol. Virkningen af acetaldehyd og ImmL på den ovenfor nævnte anvendelsesmåde er mængdeafhængig, hurtigt-voksende ondartede tumorer ytrer sig bedre end langsomt vok-3q sende. Virkningen af den ifølge opfindelsen foretrukne kombi nation ethanol/acetaldehyd i vandig opløsning sammen med lipo-somer, som er markerede og/eller overtrukket med medikamenter, fortrinsvis immunmodulatorer, bliver i det følgende eksempelvis forklaret ved beskrivelsen af kræftpatienters pathofysiologiske g,. billede. Afvigelserne ved anvendelse af præparatet ifølge^ opfindelsen til erkendelse og behandling til forskel fra ubehandlede kræftpatienter lader sig sammenfatte som følger: 22 DK 168755 B1 « »

Erkendelse:

Markeringen angår malignt tumorvæv.

Behandling: 5 a) subjektiv (patientbedømmelse): Smertefrihed, velbefindende, b) klinisk: Ved delvis mindre størrelsestilvækst, men også størrelsesaftagen af tumorområdet, ofte i løbet af timer, 10 ofte efter dage, delvis også fuldstændig forsvinden af tumorer og deres metastaser efter måneder: Genvindelse af råstyrken, normalisering af oxygenoptagelsen og -udnyttelsen, synligt sundt udseende, normalisering af leverfunktionen (laboratorieværdi), forhøjet temperatur i tumorens 15 område ved iøvrigt normal kropstemperatur, typisk svedeture, tilbagevenden af nervefunktionen i nerver, som var bortfaldet som følge af tumoren, svind i betændelsesreaktionen i tumorernes omgivelser efter ufrivilligt placeboforsøg (20 dage), i løbet af hvilket der skete en øget vækst i metastasestør-20 reisen i lungen og opstod svær åndenød, efter fornyet højere- doseret indgift af midlet urinudskillelse af tripelphosphat i størrelsesordenen gram, hvorefter der igen skete en tydelig forbedring i åndedrættet og almentilstanden.

25 De enkelte faser af diagnostikken og behandlingen lader sig i et enkelt tilfælde beskrive som følger: 1. fase: 30 Patienten Η. A. var 67 år gammel. I januar 1981 blev stillet diagnosen "Carcinom i den Retrolinguale-Tonsillære-region".

Den histologiske skøn lød: Pladeepithelkarcinom, moderat forhornet og moderat differentieret. Det' kliniske stadium var T3N2M0* dage senere fulgte den typiske operation med tumor-35 resektion, delvis fjernelse af underkæbeknoglen og radikal "neck-dissection" i den venstre side. Resektionen nåede ikke 23 DK 168755 B1 « overalt sundt væv. Derefter modtog patienten den typiske bestrålingsbehandling med en middeldosis på i alt 60 Gy. Én uge efter afslutningen af radioterapien skete en blødning fra spiserørsåreknuder, Grad IV, som blev behandlet konserva-5 tivt. I februar 1982 gennemførtes en en-blok-efterresektion af en lokal tumorresiduum med submental lymfeektomi. Den histologiske diagnose var uændret. Derefter anvendes en lokal røntgenbestrålingsbehandling med en udgangsdosis på 30 Gy.

10 I marts 1982 blev på grund af en udpræget svulmen af tunge stumpen indgivet en oral adjuvans-cocktail af ethanol 96%:ren acetaldehyd i forholdet 1000 ml : 40 ml i en daglig mængde af 50 ml i vand. Samtidig blev en glucosefattig diæt overholdt. Det bragte den ønskede lettelse. Leukocytantallet -15 tidligere mellem 3000 og 4000/μ1 - steg under denne behand ling til 4000 til 5000/μ1. Der blev fundet umodne lymfocytformer (Lymphocyten-reizformen [Rieder]), lymfatiske plasmaceller og unge monocytter i op til 4% ved differentialtælling af de hvide blodlegemer.

20 2. fase: I juli 1982 blev en kirsebærstor tumorknude følelig i den venstre submentalregion. Patienten inhalerede i tre uger dag-25 ligt til immunstimulation en suspension af liposomer med MDP.

Leukocytantallet steg til antal på 5000 pr. μΐ.

Ved differentialtællingen af de hvide blodlegemer steg Rieder— cellerne og de unge monocytter til 6%. Efter disse tre uger 30 blev tumorknuden fjernet. Den histologiske diagnose viste foruden det kendte carcinom en signifikant makrofag-bulnen.

3. fase: 35 Efter 14 dage uden behandling blev der for første gang i det månedlige kontrolrøntgenbillede af lungen observeret tumor- 24 DK 168755 B1 metastaser på størrelse med et vagteløje. Sonografisk blev levermetastaser og en miltforstørrelse konstateret. Herefter indledtes straks en cytostatisk kemoterapi over fem dage.

En anden serie, to måneder senere, måtte efter den første 5 behandlingsdag afbrydes på grund af livstruende komplikationer. Imellem kemoterapiserierne og derefter blev diskontinuerligt indgivet den ovenfor nævnte adjuvans-cocktail samt immunstimuler ende inhalation.

10 4. fase:

Siden februar 1983 anvendtes dagligt cocktailen, den sukkerfattige diæt og en inhalering af liposomer, som indeholder et andet derivat af MDP. Leukocytantallet steg til gennemsnit-15 ligt 6000/μ1. Det hvide differentialblodbillede viste Rieder-lymfocytter og unge monocytter omkring 15%. Disse to celletyper faldt relativt i antal, efter at leukocytantallet til 9000/μ1, og formerede sig, når leukocytantallet lå omkring 4000/μ1.

20

Der blev fundet en daglig rate af Rieder-lymfocytter og unge monocytter på 900/μ1 blod. En blommestor metastase, som i januar 1983 havde udviklet sig i det horisontale ar på venstre side af halsen, forsvandt i april 1983 uden at udvikle yder-25 ligere ar. Materien indeholdt makrofager. Det samme blev fastslået for en anden hud- og lymfeknudemetastase. De runde skygger i lungerøntgenbillederne blev kontinuerligt større fra februar 1983 til udgangen af maj 1983.

3 0

Patienten gav i samme tidsrum udtryk for at være smertefri og føle sig veltilpas. På grund af den kontinuerligt producerede makrofagmængde førte forøgelsen af lungemetastaserne uden dannelse af nye metastaser til den tanke, at væksten kunne være delvis betinget af en kapseldannelse via makrofager 35 omkring metastaserne.

* 25 DK 168755 B1

Den 3. maj 1983 underkastede patienten sig en scintigrafisk test efter inhalering af med immunmodulatorer belagte lipo-somer, markeret med 99mTc. Aerosolen indeholdt 50 mCi. Patienten blev registreret med et Nuclear-Chicago-y-kamera, 5 som er udstyret med en high-resolution-140 KeV-parallel-colli- mator og et Simis-3-data-system (Informatek, Birmingham, Alabama, USA). 10-sekunder-dynamiske registreringer blev kontinuerligt udført i en time.

10 Af de fremkomne billeder blev lokaliseringen af radioaktivitet til det interessante område bestemt. En time efter anvendelsen af de 99mTc-liposomer pr. aerosol blev 1,5% af radioaktiviteten fundet i lungen. Resten blev fundet i de øvre luftveje og i Larynx. Computersubtraktionen af baggrundsaktiviteten tillader en klar synliggørelse af metastaserne. Liposomspor-s tof fet er fremherskende til stede i den præbronchiale region. Det viser en fordelingsasymmetri, som svarer meget nøje til røntgenbillederne.

2Q På dette tidspunkt befandt sig ca. 5% af lungeradioaktivi teten i kredsløbet, hvilket γ-kamera-undersøgelse af patientens ben viste. 4 timer efter inhaleringen af 99mTc-liposom-suspen-sionen fandtes en forøget radioaktivitet i kredsløbet og i fordøjelseskanalen. Det kan være betinget af dissociationen af 99mTc og binding af disse sporstoffer til molekyler, der

4 O

er i stand til at trænge igennem kapil lærvægge. På intet tidspunkt befandt der sig en koncentration af radioaktivitet i leveren. I juni 1983 kunne levermetastaser ikke konstateres sonografisk.

30 5. fase: I september 1983 skete der et udpræget skub i den allerede før kræftsygdommen erkendte levercirrhose. Efter en deraf 3g betinget 14 dages behandlingsafbrydelse viste der sig sono grafisk en levermetastase på noget under 3 cm i diameter.

26 DK 168755 B1 På røntgenkontrolbilledet af lungen befandt sig foruden luftfyldte strukturer i gamle lungemetastaser under nedbrydning nogle få bønnestore nye metastaser.

5 Til en behandling udelukkende med eksempelvis ethanol/acet- aldehyd i vandig opløsning og immunmodulator-belagte liposome r (f.eks. med muramilsyredipeptidderivater MDP), kan en ondartet tumormasse, f.eks. melanosarkom, på i alt 150 g helbredes ved god immunreaktion hos patienten og en varighed 10 af behandlingen på et halvt år, ifald tumoren ikke udvikler beskyttelsesmekanismer mod den nye situation.

På grund af fri 99 mTc skete der i en skjoldbruskkirteladenom en koncentrering, som kunne elimineres. Efter elimineringen 15 af det frie 99 mTc viste der sig i denne skjoldbruskkirteladenom en metastase af en melanosarkom.

Diagnostikken blev i det følgende førstnævnte tilfælde gennemført med 40 mCi- og i andet angivne tilfælde med 25 mCi-20 markering.

I ét tilfælde blev der hos en kvindelig patient med en melanosarkom ved den scintigrafiske test fundet en kendt bønnestor melanomknude i muskulaturen i den venstre nakkedel, en yder-25 ligere kendt melanomknude i en adenom i den højre skjoldbrusk kirtel og en ca. bygkornsstor melanomknude i det prævertebrale fedtvæv i Thoraxmidten. Ved behandlingen skete der i dette tilfælde et svind af melanomets lokalmetastaser i det højre lår, af lyskelymfeknudemetastaser i begge sider og af para- 30 aortale lymfeknudemetastaser.

Hos denne kvindelige patient afbildedes scintigrafisk indersiden af livmoderen ved bestående menstruation og de brystvortenære ender af mælkegangene, hvor der dog ikke var nogen pathologisk 35 tilstand til stede. I tilfælde af en anden kvindelig patient, hos hvem der nogle uger .før teste'n histologisk i det sunde * 27 DK 168755 B1 var bortopereret en melanosarkom i højre fod og en lymfeknude-ansamling med metastaser på højre lår, fandt man i den scin-tigrafiske test i højre og i venstre lår i hele lymfeområdet helt små celleansamlinger af sarkomer foruden sarkomcelleaf-5 lejringer i arthroseområdet i begge knæ. En afbildning af karrene viste ingen sammenhæng mellem blodkarrene og tumorcel lemængden. Sarkom-bortoperationsstedernes resorptionsområder viste trods stadig tilstedeværende ødemer ingen stråling.

Lige så lidt afbildedes en frisk betændelse fra venepunkturen fra dagen før, en resorptiv betændelse omkring trådmateriale i bunden af den venstre hule hånd og de to arthrotiske hofteled. Efter 2 timers oxygenindgift om aftenen efter scintigrafien havde der til næste dags morgen udviklet sig en betændelsesreaktion i de strålemarkerede steders område i stil med en ^5 bestrålingsoverreaktion.

Hos den på foregående side som første beskrevne kvindelige patient blev der efter testen gennemført en tre måneders behandling med cocktail og ImmL dagligt, hvorefter der på ny 2q blev gennemført en test med SmIL efter cocktailindgift, som dog kun tydeligt mindre viste melanomknuden i skjoldbruskkir-teladenomen. Skjoldbruskkirteladenomen med melanomknuden og lymfeknuderne i venstre nakkemuskulatur blev efter testen fjernet kirurgisk. Histologien kunne kun fastslå nogle få 25 melanomceller i knuden i skjoldbruskkirtel og i knuden i nakken ingen melanomceller. Autoradiografien var for knuden i skjoldbruskkirteladenomen tydelig positiv, og i knuden i venstre nakkedel svagt positiv. De markerede celler forekom morfologisk at være delvis normale.

30

Samme normalisering af formen af melanomceller var blevet observeret histologisk ved randen af en melanom efter cocktailindgift før en anden operativ fjernelse (klinisk og histologisk) . Der var det melanotisk farvede område blevet mar-3g keret før cocktailindgiften, og 12 timer senere lå det mela notisk farvede område næsten 1 cm- inden for markeringen.

28 DK 168755 B1

Denne kvindelige patient har nu i fem måneder været recidivfrie uden ImmL. Cocktailbehandlingen og diæt blev hos hende påbegyndt i terminalstadiet for 9 år siden. Patienten har i otte år igen været erhversaktiv.

5

Hos den på foregående side som anden beskrevne kvindelige patient skete der fem måneder efter bestrålingsoverreaktionen et recidiv i det kirsebærstore lyskear på højre lår. Inden for en måned voksede knuden til den tredobbelte størrelse.

10 Den blev fjernet delvis kirurgisk. I løbet af tre uger skete der et lokalrecidiv af samme størrelse som forud for operationen og i en afstand af 5 til 10 cm derfra dannede sig to metastaser på størrelse med kirsebær.

25 Computertomogrammet viste yderligere en fortætning i højre side af det lille bækken. Den kvindelige patient viste kliniske tegn på en standsning af gallevejene i leveren.

Ved test med cocktail og SmIL viste der sig scintigrafisk 20 en tydelig ansamling i højre lår og i højre side af det lille bækken.

Ved histologisk og autoradiografisk kontrol ved finnålsbiopsi og sugbiopsi kunne der efter oxygeninsufflation gennem flere timer allerede efter få dage som følge af strålingens binding til kræftcellevæggene ved hjælp af immunmodulatoren observeres et stadigt stigende antal af beskadigede og nekrotiske melanomceller og en stigning i de lokalt tilstedeværende lymfocytter, makrofager og granulocytter. Effekten viser sig ved lokal hypertermi, almen temperaturstigning til 38,5°C

w U

med en varighed af to dage og subjektivt ved "lettere influen-zafornemmelse". Efter en sådan terapi fire gange i 14 dage begyndte de klinisk synlige metastaser at undergå fibrosering, og den intraheptiske gallevejsstandsning var ophævet.

35 29 DK 168755 B1

Eksempel 1.

Fremstilling af en markeret immunmodulator:

Til 30 μ g af en i handelen tilgængelig -immunmodulator (JOMOL), der sammen med zinkchlorid foreligger i lyofiliseret form under 5 nitrogen i et lille overskud i forhold til antallet af lmmun-modulatorens aminogrupper, tilsættes ved stuetemperatur 100 mCi 99mTc i fysiologisk kogsaltopløsning. Reaktionsblandingen lades henstå i 5 minutter.

10 Under nitrogen (^):

Adskilt anbringes 30 μg af immunmodul atoren pr. 5 mg liposom suspenderet i 2,5 ml fysiologisk kogsaltopløsning. De to blandinger bringes sammen, blandes og lades henstå i 10 minutter.

15 Det opnåede produkt kan direkte anvendes til diagnose og terapi.

Eksempel 2.

2Q Fremstilling af immunmodulator, der er markeret med et farve stof:

Fremstilling af 1000 doser til farvediagnostik af malignt tumorvæv.

25 1,947 mg fluoresceinisothiocyanat (molekylvægt 389,4) opløses i 50 ml ren ethanol og blandes med 30 mg immunmodulator fra Nocardia opaca (molekylvægt 60000), opløst i 5000 ml vand, og lades henstå ved 37°C i 1 time. For at adskille det farvede 30 produkt fra ikke omsat farvestof, sætter man det til en adskil lelsessøjle med et tværsnit på 18 mm, som indeholder 50 g Sephadex G-50. Med fysiologisk kogsaltopløsning, indstillet med puffer til pH 8, elueret således, at det ikke omsatte farvestof tilbageholdes i skillesøjlen. Derefter lyofiliseres eluatet, og det giver ca. 1000 doser.

3 5 * 30 DK 168755 B1

Til fremstilling af farvediagnostikopløsningen udtages af for brugeren fra gennemstiksflasken, som indeholder 5 mg li-pidblanding svarende til ca. 1 mmol af en lipidblanding af phosphatidylcholin:phosphatidylserin:cholesterol i det molære forhold 8:2:10 i form af liposomer med radier under 300 Å, 5 suspenderet i 5 ml fysiologisk kogsaltopløsning, indholdet med en nål og fyldes på en gennemstiksflaske med 31,947 pg af den lyofiliserede fluoresceinisothiocyanat-markerede immun-modulator fra Nocardia opaca. Foruden de angivne stoffer befinder der sig i gennemstiksflasken nitrogen (ligesom i gennem-stiksflasken, der til diagnostik og terapi indeholder 30 pg immunmodulator til 5 mg liposomer af ovenfor nævnte sammensætning og størrelse, som er suspenderet i 5 ml fysiologisk kogsaltopløsning; som også i gennemstiksflasken, der indeholder tinchlorid og immunmodulatoren i lyofiliseret form). Den opnåede 15 opløsning lader man stå 10 til 20 minutter, og så er den fær dig til brug. Blandingen og henstanden finder sted i sort forsendelseskarton, - UV-lys nedsætter for tidligt effektiviteten af fluorescein! 20 ...

1 mol immunmodu lator binder mindst 10 mol Fitc.

Eksempel 3.

Forskellige anvendelsesformer: 25 (a) 30 pg immunmodulator fra Nocardia opaca lyofiliseret og tilgængelig i handelen.

(b) Der fremstilles 5 mg lipidblanding af phosphatidylcho-3 0 lin:phosphatidylserin:cholesterol i det molære forhold 8:2:10.

Denne lipidblanding foreligger fortrinsvis i form af liposomer med radier under 300 Å, suspenderet i 2,5 til 3 5 5 ml fysiologisk kogsaltopløsning.

Claims (8)

1. 5 Prøverne (a), (fa), (c) og (d) kan foreligge i gennemstiks-flasker, der indeholder stoffet sterilt under nitrogen (^). Substanserne (a) og (b) kan til terapi blandes med en dobbeltkanyle. Det er imidlertid også muligt forud at blande sub-10 stanserne og lagre disse i blandet tilstand og derpå anvende dan til terapien. Prøverne (a), (b) og (d) anvendes til den nuclearmedicinske test, idet man til prøven (d) tilsætter 100 mCi 99 mTc i 1 ml fysiologisk kogsaltopløsning, hvorefter prøverne (a) og 15 (b) enten blandes med dobbeltkanylen eller tages fra en for beredt blanding, og dernæst sættes denne blanding til opløsning (d) i dobbeltkanylen. Med en sådan kombination udføres også den lokale strålebehandling. 2Q Man kan yderligere med dobbeltkanylen blande prøverne (b) og (c) til farvetesten.
2. 1. Farmaceutisk præparat til diagnose og terapi af ondartede tumorer samt til terapi af svækkelser i det cellulære og det 25 humorale immunforsvar, kendetegnet ved, at det foruden sædvanlige bærermaterialer og/eller fortyndingsmidler indeholder mindst én bestanddel valgt blandt DK 168755 B1 (1) en immunmodulator, (2) en immunmodulator, a) i og/eller på liposomer eller b) lipideret, eller 5 (3) en med en radioaktiv emitter, et farvestof eller et cyto-statikum mærket immunmodulator eller en blanding af sådanne mærkede immunmodulatorer eller ^ (4) en med en radioaktiv emitter, et farvestof eller et cyto- tostatikum mærket immunmodulator eller en blanding af sådanne mærkede immunmodulatorer, a) i og/eller på liposomer eller b) lipideret, eller 15 (5) en blanding af to eller flere af de ovennævnte bestanddele samt indeholder et aldehyd med formlen I 20 RCHO (I) hvor R er et hydrogenatom eller en ligekædet eller forgrenet hydrocarbongruppe med 1 til 4 carbonatomer, og om ønsket en 25 alkohol med formlen II RCH20H (II) hvor R har den ovenfor angivne betydning. 30
3. 2. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det som immunmodulator indeholder muramilsyredipeptidderivater, peptidoglycaner, peptidoglycanfrie ekstrakter af bakterier, f.eks. fra Nocardia rubra, Nocardia opaca, Bacillus Calmette- · 35 Quérin (BCG) eller Salmonella, eller blandinger af disse. DK 168755 B1 Præparat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det indeholder en immunmodulator, son er fremstillet syntetisk eller halvsyntetisk.
4. 4. Præparat ifølge mindst ét af de foregående krav, kende-5 tegnet ved, at det yderligere indeholder endnu et reagens, som øger oxygenafgivelsen i maligne tumorers område under forøgelse af den terapeutiske bestrålingsvirkning.
5. 5. Præparat' ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det som reagens til forøgelse af oxygenafgivelsen indeholder ino- 10 sitolhexaphosphat, -pentaphosphat, -tetraphosphat eller -tri-phosphat eller glyceroldiphosphat i et præparat, som bevirker en indbygning af disse stoffer i erythrocytter.
6. 6. Præparat ifølge ethvert af de foregående krav, kende -tegnet ved, at hjælpemidlet indeholder alkoholen og 15 aldehydet i forholdet 1000 g alkohol til 15 til 40 g aldehyd.
7. 7. Præparat ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at hjælpemidlet foreligger i en til oral eller parenteral indgift egnet form, og bestanddelen valgt blandt (1) til (5) foreligger i en til oral eller parenteral 20 indgift egnet form.
8. 8. Præparat ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at hjælpemidlet foreligger i en til oral indgift egnet form, og bestanddelen valgt blandt (1) til (5) foreligger i en form, som er egnet til indgift ved inhalering. 25