PL128160B1 - Process for preparing polymeric immunocontrolling agents - Google Patents

Process for preparing polymeric immunocontrolling agents Download PDF

Info

Publication number
PL128160B1
PL128160B1 PL1980221495A PL22149580A PL128160B1 PL 128160 B1 PL128160 B1 PL 128160B1 PL 1980221495 A PL1980221495 A PL 1980221495A PL 22149580 A PL22149580 A PL 22149580A PL 128160 B1 PL128160 B1 PL 128160B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
tumor
ema
imide
days
polymer
Prior art date
Application number
PL1980221495A
Other languages
English (en)
Other versions
PL221495A1 (pl
Original Assignee
Monsanto Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Co filed Critical Monsanto Co
Publication of PL221495A1 publication Critical patent/PL221495A1/xx
Publication of PL128160B1 publication Critical patent/PL128160B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/44—Preparation of metal salts or ammonium salts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/785—Polymers containing nitrogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia polimerycznych czynników immunoregulacyj- nych, uzytecznych w leczeniu nowotworów.Leczenie nowotworów jest przedmiotem prowa¬ dzonych w szerokim zakresie badan, jednakze do¬ tychczas znaleziono bardzo niewiele skutecznych w tym stosowaniu zwiazków.W jednym ze sposobów podejscia do tego za¬ gadnienia czyni isiie próby sterowania ukladem odpornosciowym organizmu. Przykladowo, ogólnie przyjmuje sie, ze duze znaczenie w rozwoju i sta¬ rzeniu .sie odpornosci ma grasica. Róznymi me¬ chanizmami, jak sie przyjmuje, glównie hormo¬ nalnymi, grasica kontroluje czynnosc odpornoscio¬ wa za posrednictwem limfocytów T. Zbadano czyn¬ nosc stymulacyjna i/lub supresyjna szeregu pep- tydów pochodzenia naturalnego i syntetycznych w stosunku do tego ukladu odpornosciowego, otrzy¬ mujac rózne wyniki.Innymi adjuwantami odpornosciowymi sa przy¬ kladowo Bacillus Calnette-Guerin (BCG), Coryne- bacterium parvum, glukan, levamisole i tilorone.Niektóre z tych czynników zwiekszaja produkcje przeciwcial, a inne stymuluja lub inhibituja od¬ pornosc komórkowa.Jako uzyteczne czynniki przeciwnowotworowe proponowano równiez rózne biologicznie czynne, syntetyczne polielektrólity. Regelson i Holland, Na¬ ture {London) 181, 46 (1958) stwierdzili, ze sze¬ roki zakres przeciwnowotwoirowej czynnosci u my- 10 szy wykazuje polietylenosulfonian sodu. Podobna czynnosc przeciwnowotworawa wykazuja wysoko- czasteczkowe polimery kwasów karboksylowych, np. kwas polaakrylowy, kwas polimetakrylowy i kopolimery etylen-bezwodnik maleinowy (EMA), patrz Regelson i inni, Nature (London) 186, 778— 80 (19160); Regelson, „Watersoluble Polymers" w „Polymer Science and Technology", vol. 2 (wy¬ dawca N. K. Bikales) strony 161—I7T7, Plenum Press, New Yoirk 1973. Czynnosc przeciwnowoitworowa po¬ limerów typu EMA jest ujawniona równiez w kanadyjskim opisie patentowym nr 664 326. Uzy¬ tecznym zakresem ciezaru czasteczkowego tych polimerów jest 5100 do 1,5 miliona. Jeden z tych 15 polimerów, pól-amid, pól-sól amoniowa EMA wy¬ kazal (toksycznosc przewlekla u gryzoni i psów, Miihich i inni, Fed. Proceedings, vol, 19, nr. 1, czesc 1, marzec 1960. Przewlekla toksycznosc u psów wykazal równiez polimer o ciezarze czaste¬ czkowym 2000^3)0(M, Mihich i inni, Fed. Procee- dingsi, vol. 20-, nr 1, czesc 1, marzec 1961. Stwier¬ dzenie toksycznosci przemawialo przeciwko kli¬ nicznym badaniom tych polimerów.Kopolimer 1:2 eter dwuwinylowy-bezwodnik ma¬ leinowy wykazal czynnosc przeciwnowotwoirowa w badaniach prowadzonych przez National Cancer Institute, Breslow, Puire and Applied Chem., 46, 103—13 (1976). Kopolimer ten jest znany równiez jako kopolimer piranowy lub DIVEMA, a jed¬ na z dobrze znanych próbek jest oznaczona sym- 20 25 128 160128 160 bólem NSC 46 015. Stosowanie powyzszych kopo¬ limerów pisaniowych jako czynników przeciwnowo- tworowych ujawniono równiez w opisach paten¬ towych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 224 943 i 3 794 622, podajac jakio uzyteczny zakres cie¬ zaru czasteczkowego 5 000 — 30 000. Czynnosc prze- ciwnowotwotrowa kopolimeru piranowego przypi¬ sano wzmacnianiu odpornosci lub wplywowi na reakcje immunologiczna przez uklad siiateczkowo- -sródblonkowy (RES), przez zwiekszenie czynnosci makrofagowej, patrz np. Bneslow, Pure and Appl.Chem, 46, 103—13 (1976); Mohr i limni, Progr. Can- oer Res. Ther. 7, 415—26 (1978); Schultz i inni, tamze, 7, 459—67 (1976); Dean i inni, Cancer Tre- atment Reports 62, wrzesien 1978. .i Pomimo doniesien o przewleklej toksycznosci wykazywanej przez wysokioczasteczkowe polime¬ ry typu EMA, zglaszajacy niniejszy wynalazek, prowadzili badani^ nad czynnoscia immuooregu- lacyjna_ polimerów tego typu. Opracowano nowe podejscia i nowe sposoby oceny, dzieki którym uzyskano polimery wykazujace czynnosc immu- noregulacyjna przy braku cytotoksycznosci. Nie majac bezposredniej czynnosci cytotoksycznej, nie¬ które z nowych polimerów wykazaly nieoczekiwa¬ nie wysoka czynnosc wobec przerzutów nowotwo¬ rowych i nawrotów po wycieciu i usunieciu no¬ wotworu, co czyni je szczególnie uzytecznymi w leczeniu nowotworów mechanizmem immunologi¬ cznym. Sa- one uzyteczne w zapobieganiu nawro¬ tów nowotworu i przerzutów, przy podawaniu po wycieciu lub usunieciu nowotworu w drodze za¬ biegu chirurgicznego, naswietlania promieniowa¬ niem rentgenowskim lub chemoterapii cytotoksy- cznej.Wedlug wynalazku, zsyntetyzowano nowa gru¬ pe zwiazków typu EMA, skutecznych w zapobie¬ ganiu przerzutom i nawrotom nowotworowym u ssiaków, pomimo tego, ze nie maja silnej pier¬ wotnej czynnosci przeciwnowotworowej. Zwiazka¬ mi tymi isa kopolimery olefin o 2 do okolo 4 ato¬ mach wegla z bezwodnikami a,B-nienasyconych kwasów wielokarboksylowych o 4 do okolo 6 ato¬ mach wegla, o przecietnym ciezarze czasteczko¬ wym od okolo 300 do okolo 1900 i majacych funk¬ cje pól-amidu, pól-soli kairboksylanowej oraz funk¬ cje imidowa, te druga w ilosci okolo 5 do 40M sumy obu funkcji. Monomerami olefinowymi tych kopolimerów sa przykladowo etylen, propylen i izobutylen, a bezwodnikami kwasów wielokarbo¬ ksylowych np. bezwodnik maleinowy, bezwodnik cytrakonowy i bezwodnik akonitowy. Sposród po¬ wyzszych monomerów korzystny jest etylen i bez¬ wodnik maleinowy.Dla celów ilustracyjnych, korzystny kopolimer etylenu z bezwodnikiem maleinowym mozna przed¬ stawic jako majacy jednostki strukturalne lub gru¬ py przedstawione wzorami 1 (funkcja pól-ami¬ du, pól soli karboksylanowej) i 2 (funkcja imido¬ wa). W powyzszych wzorach X oznacza H lub rod¬ nik Ci_4 alkilowy, korzystnie H; Y oznacza H, jon amonowy lub kation dopuszczalnego w farma¬ cji metalu, korzystnie jon amonowy; a Z oznacza H, rodnik C1_4alkiloiwy, jon amonowy lub kation dopuszczalnego w farmacji metalu, korzystnie H.Jednostki lub grupy o wzorach 1 i 2 sa rozlo¬ zone w czasteczce wzdluz zasadniczo liniowego, ciaglego lancucha atomów wegla. Okolo 5 do 40l°/o sposród nich stanowia grupy imidowe, a pozosta- 5 losc ugrupowania pól-amidu, pól-soli karboksyla- nowej. Jednostki te moga byc umiejscowione przy¬ padkowo w lancuchu i/lub przypadkowo w poli¬ merze. Dopuszczalna jest obecnosc malej ilosci (po¬ nizej HOP/o) ugrupowania soli amonowej kwasu kar¬ lo boksylowego i/'lub grupy dwukarboksylowej, be¬ dacych wynikiem czesciowego przereagówania lub pozostaloscia nie przereagowanego bezwodnika z wytwarzania tych zwiazków.W ugrupowaniu pól-amidu, pól-soli karboksyla- 15 nowej o wzorze 1 kationem zwiazanym z jonem karboksylanowym jest korzystnie jon amonowy, a grupa imidowa w funkcji o wzorze 2 jest korzyst¬ nie imid nie podstawiony.Dla celów ilustracyjnych, korzystny kopolimer 20 etylenu z bezwodnikiem amleinowym mozna przed¬ stawic jako majacy jednostki sitrukturalme o wzo¬ rach 3 i 4. Równiez w tym przypadku jednostki te sa rozlozone wzdluz zasadniczo liniowego, cia¬ glego lancucha atomów wegla. Korzystnie, okolo 25 s do 40°/o sposród powyzszych jednostek stano¬ wia niepodstawione grupy imidowe, a pozostalosc zasadniczo jednosttki o wzorze 3. Jednostki te mo¬ ga byc rozmieszczone przypadkowo w lancuchu lub przypadkowo w polimerze. Mozliwa jest obecnosc 30 malej ilosci (ponizej lO0/*) grup monoamonowej so¬ li karboksylowej lub dwukarboksylowej, pocho¬ dzacych z czesciowo przereagowanego lub nie prze¬ reagowanego bezwodnika w trakcie wytwarzania tych zwiazków. 35 Sposób wedlug wynalazku wytwarzania polime- rycznych czynników immunoregulacyjnych — po¬ chodnych kopolimeru skladajacego sie z monome¬ ru olefinowiego o 2i—4 atomach wegla i bezwod¬ nika a,fi-nienasyconego kwasu wielokarboksylowe- 40 go o 4—6 atomach wegla, zawierajacego grupy pól-amidu i pól-soli amonowej oraz grupy imido¬ we, polega na tym, ze poliamid, pól-sól anionowa kopolimeru o ciezarze czasteczkowym 300—1500 poddaje sie reakcji z amoniakiem, dalej przekisztal- 45 cajac kopolimer talk, by zawieral grupy pól-ami¬ du, pól-soli amonowej, jak równiez grupy mii- dowe, przy czym stosunek ilosci grup imidowych do wszystkich grup funkcyjnych wynosi 5—40M wagowych, a nastepnie ewentualnie, grupy pól- 50 -soli amonowej przeksztalca sie w grupy innych farmaceutycznie dopuszczalnych soli.Polimeryczne czynniki immunoregulacyjne we¬ dlug wynalazku korzystnie sa rozpuszczalne w wo¬ dzie. 55 Wynalazek jest ilustrowany zalaczonymi rysun¬ kami, na których fig. 1 przedstawia przedzial dak¬ tyloskopowy widma absorpcji w podczerwieni re¬ prezentatywnego polimeru wedlug wynalazku, któ¬ ry w wyniku przeprowadzonej obróbki zawiera 20l°/o 80 grup imidowych; patrz przyklad III, tablica IV, próba 5. Fig. 2 przedstawia, dla porównania, prze¬ dzial daktyloskopowy widma absorpcji w podczer¬ wieni polimeru zawierajacego 0% grup imido¬ wych; patrz przyklad II (a). Fig. 3 przedstawia, W dla porównania, przedzial daktyloskopowy widma128 160 6 absorpcji w podczerwieni kopolimeru poddanego tafciej obróbce, ze zawartosc grup imidowych wy¬ nosi w nim 100%; patrz przyklad V.Wprawdzie kanadyjski opis patentowy nr 664 326 ujawnia stosowanie jako czynników prze- ciwnowotworowych kopolimerów typu EMA z u- grupowaniami poliamidu, pól-solii amonowej, jak równiez imidów lub czesciowo imidowanych po¬ chodnych kopolimerów typu EMA, jednakze sto¬ sowanie w tym celu polimerów wedlug wyna¬ lazku, majacych zarówno funkcje pól-amidu, pól- -soli karboksylanowej jak i funkcje imidowa, w podanym stosunku, a przy tym stosunkowo niski przecietny ciezar czasteczkowy, okolo 300 do 1500 korzystnie 850, jest nowoscia. Te nowe polimery wykazuja nieoczywiste, uzyteczne wlasciwosci im- munoregulacyjne, jakich nie wykazuja odpowied¬ nie polimery majace tylko jedna z funkcji o wzo¬ rach 1 i 2 lub wyzszy ciezar czasteczkowy. Rów¬ niez odpowiednie monomeryczne fragmenty tych polimerów, mianowicie sukcynimdd i sól amono¬ wa monoamidu kwasu bursztynowego (amoniówa- ny bezwodnik bursztjwiowy) opisano jako nie ma¬ jace znaczacej czynnosci inhibitowania nowotwo¬ rów; Regelson i inni, Nature (London) 186, 778—80 (1950). ;, Wyjsciowe niskoczasteczkowe kopolimery, stoso¬ wane do wytwarzania czynników immunoregula- cyjnych sposobem wedlug wynalazku mozna o- trzymac dobrze znanymi sposobami, rop. wedlug opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Amery¬ ki nr 2 857 365, 2 913 43T7, 2 9(38-016 lub 2 980 653. Ty¬ powo, olefine, np. etylen, poddaje sie reakcji z bezwodnikiem kv?asu wielokarboksyjowego, np. z bezwodnikiem maleinowym, w okolo 40 do okolo 100°C, w obecnosci katalizatora wolnorodnikowe- go i w cieklym rozpuszczalniku neagentów, nie rozpuszczajacym wytworzonego polimeru przej¬ sciowego. Odpowiednimi wolnorodnikowymi kata¬ lizatorami sa konwencjonalne katalizatory typu nadtlenków i zwiazki azowe. Przykladem zwiazku korzystnego jest nadtlenek benzoilu. Uzytecznymi rozpuszczalnikami reakcji polimeryzacji sa rozpu¬ szczalniki'obojetne, jak benzen, chloroweo-benze- ny i chlorowcowane parafiny. Jednakze, wedlug wynalazku przedstawionego opisem patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2 913 437, w celu ograniczenia ciezaru czasteczkowego kopoli¬ meru korzystnie jest stosowac alkilowany weglo¬ wodór aromatyczny, majacy co najmniej jeden a-atom wodoru, jak np. etylobenzen, izopropylo- benzen, dwuizopropylobenzen, toluen lub ksylen.Szczególnie korzystnym do tego celu rozpuszczal¬ nikiem jest etylobenzen. Korzystnie, kopolimer za¬ wiera rodniki olefinowe i bezwodnikowe w ilos¬ ciach zasadniczo irównomolowych, co uzyskuje sie stosujac mniej wdeoej równomolowe ilosci reagen¬ tów monomerycznych. Kopolimerowy produkt o- trzymuje sie w postaci stalej, latwej do odsacze¬ nia, odwirowania lub oddzielenia podobnym spo¬ sobem.Katalizator wolnorodnikowy,i zarówno przy ini¬ cjowaniu reakcji jak i przy jej zakonczeniu oraz telomeryzacja z cieklym alkilowanym weglowo¬ dorem aromatycznym wprowadzaja do struktury polimeru rozmaite ugrupowania organiczne. Pro¬ centowy udzial tych ugrupowan w sumarycznym skladzie polimeru zwieksza sie ze zmniejszeniem ciezaru czasteczkowego polimeru. Np. uzycie nad- 5 tlenku benzoilu jako katalizatora wolnorodniko- wegó i etylobenzenu jako cieklego srodowiska /re¬ akcji powoduje wprowadzenie do struktury poli¬ merowej ich grup aromatycznych. Grupy te beda stanowic wiekszy procent w polimerach o ciezarze 10 czasteczkowym okolo 300 niz w polimerach o cie¬ zarze czasteczkowym okolo 15O0.Przy wytwarzaniu powyzszych kopolimerów o niskim ciezarze czasteczkowym, do ich czasteczki moze zostac wprowadzona pewna ilosc* czynnika 15 sieciujacego, co spowoduje, ze otrzymany produkt bedzie nierozpuszczalny w wodzie. Przykladami czynników sieciujacych sa estry winylowe i alli¬ lowe, zwlaszcza akrylany i krotoniany, jak opisa¬ no w opisie patentowym Stantów Zjednoczonych 20 Ameryki nr 3165 486. Przeprowadzenia kopolime¬ rów w postac nierozpuszczalna mozna dokonac ró¬ wniez po przeksztalcenlLu ich w pochodne, róznymi sposobamd, np. przez sieciowanie z dwuamina, jak przedstawiono w opisie patentowym St. Zjedn. 25 Ameryki nr 3 954 985, lub przylaczenie do nosni¬ ków, takich jak bentonit, czasteczki lateksu lub erytrocyty.Wiadomym jest, ze pochodne amidowe kopoli¬ merów typu EMA mozna wytwarzac dzialajac na 30 kopolimer gazowym amoniakiem, w temperaturze normalnej lub podwyzszonej, jak przedstawiono w kanadyjskim opisie patentowym nr 664 326 i w o- pitsach patentowych Stanów Zjednoczonych Ame¬ ryki nr 2 803 287 i 3157 595. Wiadomo równiez, ze 33 reakcja w wyzszej temperaturze prowadzi do cmi- dów, natomiast stosowanie cieklych rozpuszczal¬ ników organicznych, takich jak benzen, pozwala regulowac temperature reakcji i hamuje tworze¬ nie grup imidowych. Innym znanym sposobem 40 tworzenia grup amidowych jest dzialanie na poli¬ mer cieklym amoniakiem, w —33°C.Wyzej podane sposoby sa ogólnie uzyteczne w wytwarzaniu pól-amidu, pól-soli amonowej, pro¬ dukcie stanowiacym etap przejsciowy w wytwa- 45 rzaniu pochodnych z grupa imidowa, jednakze nie ma w nich zaleznej od czasu dyfuzji amoniaku do wnetrza czastek EMA, co jest konieczne w spo¬ sobie wedlug wynalazku, jak opisano w przykla¬ dzie II ponizej. W korzystnym wykonaniu sposo- 60 bu wedlug wynalazku, kopolimer typu EMA wpierw rozpuszcza sie w acetonie, a na rozpu¬ szczony polimer dziala cieklym amoniakiem w acetonie. Zadany produkt — pol-amid, pól-sól amo¬ nowa wypada z roztworu i mozna go odsaczyc, M odwirowac lub w inny sposób wyodrebnic, jak opisano dalej w przykladzie II, czesci a, b i c. Fig. 2 na zalaczonych rysunkach przedstawia widmo w podczerwieni pól-»amidu, pól-soli amonowej — produktu z przykladu II 60 imidowych.Zadana pochodna zawierajaca grupy imidowe mozna otrzymac dzialajac na przejsciowy pól-amid, pól-sól amonowa amoniakiem, w taki sposób, by produkt zawieral zarówno ugrupowania pól-ami- W du, pól-soli iamonowej, jak i grupy imidowe i by7 zawartosc grup imidowych stanowila od okolo 5 do okolo 40j°/o wagowych sumy tych ugrupowan.W otrzymanym produkcie mozna ewentualnie gru¬ py pól-soli amonowej podac przeksztalceniu w grupy innych dopuszczalnych w farmacji soli. Re¬ akcje prowadzi sie w odpowiednich rozpuszczal¬ nikach organicznych, jak np. toluen luta ksylen, w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna, do wytworzenia, w zadanym procencie, pochod¬ nej imidowej, jak zilustrowano w przykladach III i IV. Temperatura reakcji moze zawierac sie w zakresie od okolo 60 do okolo 200°C, korzystnie od okolo 60 do okolo l!50°C, a najkorzystniej od 100 do l&OPC.Na zalaczonych rysunkach fig. 1 przedstawia widmo w podczerwieni reprezentatywnej próbki (przyklad IJJ, /tablica IV, próba 5) zadanego po¬ limeru, poddanego reakcji tak, ze zawiera zarów¬ no funkcje pól-aniidu, pól-soli amonowej, jak i funkcje imidowe, przy czym ilosc grup imido¬ wych stanowi 20% sumy obu funkcji. Polimer z tego przykladu ma przecietny ciezar czasteczkowy okolo 8(50, a 20P/» grup dmidofwyeh miesoi sie w korzystnym zakresie od okolo 10 do okolo 25fVo.Dla celów porównawczych, sporzadzono równiez pochodne kopolimeru EMA o W/o zawartosci grup imidowych; patrz przyklad V ponizej. Wid¬ mo w. podczerwieni tego polimeru przedstawiono na fig. 3.Szczególowy opis widma w podczerwieni wedlug fig. 1 do 3, identyfikujacy grupy funkcyjne, przed¬ stawiono w dalszej czesci opisu, po przykladzie I.W celu wykazania skutecznosci polimerów wy¬ twarzanych sposobem wedlug wynalazku w im- munoregulacyjnym leczeniu nowotworów, repre¬ zentatywne próbki polimerów poddano nizej opi¬ sanym badaniom.W jednej z senii prób, polimery badano w mo¬ delu wywolanego wirusem, nieprzerzutowego no¬ wotworu myszy. Zastosowanym modelem byl wy¬ wolany wirusem SV40 wlókniakomiesak (mKSA) pochodzacy z syngeneiczinej myszy EALB/c. Ten mysi nowotwór mKSA-TU5, opisany przez Kita i innych, Int. J. Cancer, 4, 384^392 (1969), nie ule¬ ga regresji u syngeneicznych myszy BALB/c. W tej serii prób obserwowana regresje nowotworu odnoszono do immunostymulacji i zmniejszenia la¬ dunku nowotworowego, zgodnie z Deanem i inny¬ mi, InJt, J. Cancer, 16, 465—4)7)5 (1075), którzy wy¬ kazali, ze nowotwór mKSA ma zwiazane z nim antygeny i ze u malych zwierzat z nowotworem istnieje dobra korelacja z odpornoscia komórko¬ wa. Myszy traktowano trzema róznymi dawkami badanego zwiazku, przed, po lub przed i po za¬ kazeniu zywymi komórkami nowotworowymi, w TD10o i TD50- Wzrost nowotworów u zwierzat pod¬ danych leczeniu polimerem oceniano w odniesie¬ niu do wzrosltu obserwowanego u nieleczonych myszy kontrolnych. W tej samej serii prób poli¬ mery wytworzone sposobem wedlug wynalazku majace przecietny ciezar czasteczkowy okolo B50 wykazaly znacznie wyzsza czynnosc regresji no¬ wotworu niz odpowiednie polimery o ciezarze cza¬ steczkowym 20O0i—3000 i 20 000—50 000. 160 8 W innej serii prób, reprezentatywne polimer^ wytworzone sposobem wedlug wynalazku bada¬ no w modelu wywolanego chemicznie nowotworu z przerzutami, u szczura. Jako model zastosowa- 5 no wywolany 3-meltylocholantrenem nowotwór pe¬ cherza (BLCA) u szczurów szczepu Fischer 344; Pirehn R. T. i inni, J. Nat. Can. Inst. 18, 769 (1997) i Falk, R. i inni, Surgery, pazdziernik 1978.Komórki nowotworowe pasazowano w hodowli ko- io mórkowej w ciagu 15 lat. Po podskórnej implan- tacji w ciagu tygodnia przerzucaja sie one do pluc. Czas przezycia po podskórnej implantacji nowotworu wynosi zwykle ia tygodnie lub mniej.W czestdi prób na modelu przerzutowego nowo- 15 tworu u iszczura, badany polimer podawano okre¬ sowo, w okolo tygodniowych odstepach, w ciagu itrzech tygodni po implantacji nowotworu. Przezy- walnosc zwierzat traktowanych byla trzykrotnie wieksza niz nie traktowanych zwierzat kontrol- 20 nych, a w czasie szesciotygodniowej obserwacji nie zauwazono przerzutów.W innej serii prób na modelu przerzutowego nowotworu u szczura, badany polimer podawano przy wycieciu nowotworu, 7—10 dni po wszcze- 25 pieniu. Obserwowano nawrót nawotworu po wy¬ cieciu, porównujac zwierzeta traktowane z kontrol¬ nymi. U zwierzat kontrolnych nawrót nowotworu wynosil lOOP/o w ciagu 6 tygodni po resekcji, przy czasie przecietnym ®2 dni, natomiast u zwierzat 30 traktowanych korzystnym polimerem wytworzo¬ nym sposobem wedlug wynalazku* w dawce 30 mg|/kg, nie obserwowano nawrotów w ciagu pier¬ wszych 6 tygodni, a po 10 tygodniach nawrót no¬ wotworu obserwowano jedynie u 13i°/» zwierzat. 35 |W innej serii prób, reprezentamtywne polimery wytworzone sposobem wedlug wynalazku badano na normalnych szczurach szczepu Lewis, stwier¬ dzajac, ze stymuluja one reakcje odpornosciowa, ma co wskazuje wzrost produkcji przeciwcial. 40 Inne próby na normalnych szczurach szczepu Lewis wykazaly aktywacje komórek B przez re¬ prezentatywne polimery wytworzone sposobem wedlug wynalazku, bez obecnosci komórek T, co wskazuje na mozliwosc uzycia tych polimerów dla 45 zastapienia czynnosci grasicy. Komórki T sa lim¬ focytami wytwarzanymi przez grasice, naitomiast komórki B sa limfocytami wytwarzanymi w szpi¬ ku kostnym.Dalsze, przeprowadzone na normalnych szczu- 50 rach szczepu Lewis badania na wzrost liczby ma- krofagów otrzewnowych i czynnosc fagocytozy la¬ teksu wykazaly, ze wplyw immunoregulacyjny tych polimerów na czynnosc komórek B nie jest wy¬ wolany stymulacja czynnosci makrofagowej. Tak w wiec polimery wytworzone sposobem wedlug wy¬ nalazku okazuja sie dzialac inaczej niz zblizone kopolimery piranowe wedlug dotychczasowego sta¬ nu techniki, które dzialaja poprzez RES, zwiek¬ szajac czynnosc makrofagowa. 80 Szczególowy opis powyzszych i innych prób oraz ich wyniki sa przedstawione ponizej, w przykla¬ dach VIII do XXIII.Ogólnie, polimery wytworzone sposobem wedlug wynalazku mozna stosowac, w ilosci efektywnej w immunoregulacyjnie, lacznie z chemoterapia Wp»128 160 10 terapia radiacyjna ntwotworów i/lub z wycieciem nowotworów. Podawanie zwiazków moze byc rów¬ noczesnie z terapia lub ja poprzedzac lub byc sto¬ sowane po niej. Ogólnie, zwiazki podaje sie na 2 dni przed i w ciagu miesiaca po terapii. Badania wykazaly, ze eliminacja korzystnego, rozpuszczal¬ nego w wodzie polimeru nastepuje w ciagu 30— 60 dni, a wiec mozna oczekiwac, ze dawki uderze¬ niowe polimeru mozna podawac co mniej wiecej 6 tygodni Polimery mozna podawac pozajelitowo lub do¬ ustnie, w ilosci od okolo 1 do okolo 100 mgi/kg wagi ciala. Mozna je podawac dozylnie i dootrzew- nowo, korzystnie w wodnym roztworze, np. w sterylnej wodzie lub w solance. Doustnie mozna je podawac w postaci tabletek, proszków, kapsu¬ lek, eliksirów i podobnych postaci dawkowych, w mieszaninie ze zwyklymi, sttalymi lub cieklymi roz¬ cienczalnikami, nosnikami, czynnikami zawiesino- twórczymi i adjuwantami, jak np. skrobia kuku¬ rydziana, laktoza, talk, kwas stearynowy, steary¬ nian magnezu, zelatyna, guma arabska;" alkohol, woda, dwumetylosulfotlenek (DMSO), oleje roslin¬ ne i podobne materialy. Korzystna forma doustna jest maiterial staly, przeprowadzony w roztwór w odpowiedniej mieszaninie rozpuszczalników tuz przed podaniem, co pozwala utrzymac stabilnosc ugrupowania pól-amidu, pól-soli karboksylanowej i imidowego. Inne odpowiednie dawkowania poli¬ merów; dajace zadany efekt immunoregulaeyjny, mozna okreslic na podstawie nizej przedstawio¬ nych przykladów. Korzystna forma dawkowa poli¬ meru jest roztwór w fizjologicznym roztworze chlorku sodu.Wynalazek jest ilustrowany ponizszymi przy¬ kladami. We wszystkich przykladach wydajnosc procentowa oznacza wydajnosc produktu uzyska¬ nego odniesiona do teoretycznej.Przyklad I. Wytwarzanie EMA.Wyjsciowy kopolimer etylen/bezwodnik maleino¬ wy (EMA) sporzadzono w 3,785 litrowym reakto¬ rze z nierdzewnej stali, wyposazonym w ogrzewa¬ nie, wewnetrzna spirale wody chlodzacej, magne¬ tyczne mieszadlo, pracujace optymalnie z szyb¬ koscia 1000—2000 obrotów na minute, instalacje do doprowadzania etylenu i instalacje, która moze byc podawany dodatkowy katalizator, w roztwo¬ rze, pod cisnieniem etylenu. Do poboru próbek i oprózniania reaktora sluzy otwór spustowy w je¬ go dnie. Reaktor wyposazono w dodatkowe urza¬ dzenia do regulacji ogrzewania i chlodzenia. W typowej próbie wsad reaktora skladal sie z 1625 g (1875 ml) etylobenzenu, 190 g (1,94 mola) bezwod¬ nika maleinowego i 14,1 g (0,05*8 mola) nadtlenku benzoilu, rozpuszczonego w 80 g (92 ml) etyloben- zenu. Naczynie z katalizatorem plukano dodatko¬ wa objetoscia 20,0 ml etylobenzenu, wlewajac po¬ pluczyny do reaktora. Reaktor zamknieto i pod cisnieniem, w temperaturze pokojowej, dwukrot¬ nie przeplukano etylenem, wypierajac z ukladu powietrze. Nastepnie reaktor doprowadzono do 7'OPC i utrzymywano w tej temperaturze w czasie polimeryzacji, doprowadzajac etylen pod cisnieniem 1380 KPa. Po 3 godzinach polimeryzacji w 70°C i pod cisnieniem etylenu li380 kPa, poprzez prze¬ wód do doprowadzania katalizatora dodano 9,4 g {0,039 mola) nadtlenku benzoilu w 60 g (70 ml) etylobenzenu oraz 20 ml etylobenzenu popluczyn.Polimeryzacje zakonczono 14 godzinnym ogrze- 5 waniem w 70°C, przy mieszaniu, z doprowadza¬ niem etylenu pod cisnieniem 13i80 kPa. Po zakon¬ czeniu próby reaktor oziebiono i rozprezono. Za¬ wartosc reaktora stanowila zawiesina kopolimeru etylen/bezwodnik maleinowy (EMA) w etyloben- 10 zenie; mala czesc produktu przywierala do mie¬ szadla, wezownic chlodniczych i powierzchni reak¬ tora. Zawiesine przesaczono, po dodaniu do Ulej zeskrobanego materialu zeszklonego. Konwersje bezwodnika maleinowego oznaczono przez mia- 15 reczkowamie przesaczu za pomoca NaOH, wobec fenolftaleiny.Przerób produktu EMA obejmowal saczenie, eks¬ trakcje zawiesiny (w temperaturze pokojowej, trzykrotnie po godzinie 2 litrami ksylenu i trzy- 20 krotnie po godzinie 2 litrami heksanu) oraz kon¬ cowe saczenie. Saczono równiez miedzy wszystki¬ mi etapami ekstrakcji. Koncowy produkt EMA suszono w ciagu nocy pod zmniejszonym cisnie¬ niem, jakie uzyskano przy pomocy pompy olejowej, 25 w temperaturze 5i5-^60°C. Wysuszony produkt EMA w ciagu 5 minut proszkowano w mieszalniku Waringa, rozcierajac mala ilosc zeszklonego ma¬ terialu do konsystencji proszku. W tablicy I zsu¬ mowano wyniki uzyskane w 7 kolejnych polime- * ryzacjach EMA.Ciezar czasteczkowy produktu EMA oznaczono przyjmujac jako produkt typowy preparat F z ta^ blicy I. Material suszono w ciagu 24 godzin w 100°C, pod cisnieniem obnizonym olejowa pompa M prózniowa. Oznaczenia dokonano w suchym dwu- metyloformamidzie (DMF). D^preparatu^F licz¬ bowy przecietny ciezar czasteczkowy (Mn) wyniósl 3152, z oznaczenia preznosci pary DMF w 120°C, za pomoca osmometru Knauera. Wagowy przeciet- 40 ny ciezar czasteczkowy (Mw) oznaczono jako-5730, równiez w DMF, stosujac rozproszone waskokato^ we swiatlo laserowe, za pomoca aparatu Chroma- tix KMX-6. Lepkosc istotna w DMF, w 25°C, mierzono metoda wiskozymetru tapiiarnej, za po- 45 moca wiskozymetru rozcienczeniowego Cannon Ubblehode (wielkosc 75), stosujac ekstrapolacja czterech róznych stezen do stezenia zerowego. Lep¬ kosc istotna preparatu F wyniosla 0,0607 dl/g.Podobne oznaczenia Mn, Mw i lepkosci istotnej 50 przeprowadzono w identyczny sposób dlp-prepa* ratu EMA o wyzszej lepkosci wlasciwej (0,11, l*/t DMF, 25°C). W tym przypadku wartosc lepkosci istotnej wyniosla 0,1227 dl/g, Mn = 2264, a, I£w 129710. 55 Na podstawie powyzszych wartosci dla dwóch produktów EMA o róznej lepkosci obliczono sta* le K i a w równaniu wdlazacym lepkosc istotnej (Irj]) z ciezarem czasteczkowym, [17] = KMa.Zna-f leziono nastepujace zaleznosci: 60 iftlg^ = 4,71 X 10-*MnM* oraz [^F = 3J51 X 10-«Mww Terminem „przecietny ciezar czasteczkowy" o-r znacza sie w niniejszym opisie i zastrzezeniach 65 przecietny liczbowy ciezar czasteczkowy.11 128 160 Tablica I 12 (Próba A B P D E F 0 Konwersja bezwodnika maleinowego 9^,5 98,6 38,3 98,3 9T7,9 917,9 98,6 Wydajnosc produktu EMA g (°/o) 185 (68,8) 227 (83,6) /223 (82,1) 219 ^81,1) 223 (81,7) 225( (81,9) ^24 <82,4) Wodór p/4 a) 4,08 ao-3 6,10 5-,04 15,10 5,12 5,11 Wegiel P/o|(i 57,34 68,11 58,15 58,24 57,80 (58„14 158,05 Lepkosc wlasciwa 1% DMF w fc5°C <2 10,064 10,068 K,063 0/)66 0,063 0,061 0,064 Ekwiwalent wagolwy (8) 138,5 1|39,9 1 140,0 (139,1 140,6 141,5 140,1 G Wartosc przecietna z dwóch oznaczen W Zasadniczo wedlug ASTM D-2515-74, wiskozymetr Ostwalda W Waga w gramach produktu zawierajacego 1 mol bezwodnika, oznaczenie droga miareczkowania wodnego roztworu za pomoca mianowanego roztworu NaOH potencjometrycznego Identyfikacja grup funkcyjnych. Identyfikacji róznych grup funkcyjnych dla wszystkich przy¬ kladów pochodnych polimerów, jakosciowej i ilo¬ sciowej, dokonano na podstawie analizy widm w 25 podczerwieni, uzyskanych, za pomoca spektrofo¬ tometru - Beckman IR-12. Przygotowanie próbek, przydzial czestotliwosci absorpcji i sposób ozna¬ czenia stosunku grup imidowych do amidowych wedlug „The Infra-red Spectra of Complex Mo- 30 lecules", Bellamy, John Wiley and Sons, 1960 lub ^Piractioal Infra-red Spectroscopy", Cross, Butter- worth, 1964. Jako próbki stosowano we wszystkich przypadkach pastylki sprasowane z mieszaniny 2 mg polimeru i 250 mg suchego KBr, waga pastyl¬ ki 70 mg. Polozenie pasm absorpcji podano w jednostkach liczby falowej, odwrotnosci centyme¬ tra (cm-1), co jest ogólnie przyjetym sposobem.Dla jakosciowego oznaczania w podczerwieni pro¬ duktu poslugiwano sie stwierdzaniem obecnosci lub nieobecnosci pasm absorpcji charakterystycz¬ nych dla danych grup (Tablica la) 1. 5-czlonowy pierscien bezwodnika dublet: 2. Niezdysocjonowany alifatyczny kwas (COOH) 3. Polimeryczny imid, 5-czlonowy pierscien dublet: 4. Polimeryczny amid pierwszorzedo- wy I pasmo amidowe 5. Jon karboksylanowy, CO^— 6. Grupa metylenowa —CH2— 7. Sól amonowa (NH4+) grupy karboksylowej (intensywnosc zalezna od natury kationu) 8. Polimery o wysokim stezeniu grup imidowych (powyzej SOtyo) oprócz absorpcji 3. wykazuja dublet: Tablica la Liczba falowa (cm-1), 11870^-^1830 slabe 1800—1760, silne 1725—1700 1715, silne 1770, slabe 1670, silne 1620, slabe 15Q0(—1570 1470—1450 1405—1400 1180—1200, silne 1370—1350, slabe Funkcja drgania rozciagajace C=0 drgania rozciagajace C=0 drgania rozciagajace C=0 drgania rozciagajace C=0, drgania deformacyjne NH i drgania ^rozciagajace C—N asymetryczne drgania rozcia¬ gajace drgania deformacyjne C—H symetryczne drgania rozcia¬ gajace drgania rozciagajace C—N13 W celu ilosciowej oceny zawartosci imidu/amidu w polimerze zawierajacym obie grupy, oprócz so¬ li amonowej grupy karboksylowej oznaczano sto¬ sunek intensywnosci absorpcji glównego pasma imidowego 1715 cm-1 do intensywnosci absorpcji glównego pasma amidowego przy 1670 cm_1i Za¬ wartosc grup imidowych obliczano przez odniesie¬ nie zmierzonego, stosunku imid/amid (powyzej) do standardowej krzywej zaleznosci procentowej ilo¬ sci imidu od stosunku absorpcji imidYamid, wy¬ kreslonej na podstawie danych absorpcji w pod¬ czerwieni dla serii mieszanin czystego (okolo 100*/*) imidu (opisanego w przykladzie V) z poli¬ merem nie zawierajacym imidu i nie zjonizowanej grupy COOH, lecz jedynie amid i zjonóowana gru¬ pe karboksylowa (patrz przyklad II).Przy oznaczaniu stosunku imid/amid nieobec¬ nosc nie zjonizowanej grupy karboksylowej, absor¬ bujacej przy 1736 cm-1, stwierdzano rozpuszcza¬ jac próbke w wodzie, doprowadzajac roztwór wo¬ dorotlenkiem amonu do pH 1*0,0 i liofilizujac go, co powoduje konwersje *iiezjonizowanej grupy COOH do kartoóksylanu amonu. Procedura ta wprawdzie zwieksza intensywnosc pasm karboksy- lanowych przy 15610 i 1400 cm"1 lecz daje pew¬ nosc, ze pozostale pasmo przy 1715 cm-* jest rze¬ czywiscie pochodzenia imidowego.We wszystkich ponizszych przykladach obec¬ nosc lub nieobecnosc grup funkcyjnych oraz za¬ wartosc imidu w polimerach zawierajacych te gru^ pe stwierdzano na podstawie wyzej podanej iden¬ tyfikacji grup funkcyjnych i sposobu ilosciowej o- ceny stosunku intensywnosci pasm imid/amid.Przyklad II. Wytwarzanie pól-amidu, pól-so- li amonowej CÓO* EMA (AEMA) Dotychczasowe sposoby amonifikacji polimerów EMA do pól-amidu, pól-soli amonowej (ujawnio¬ ne w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 187 5915 i w kanadyjskim opisie pa¬ tentowym nr 664 326) polegaja na (1) amonifikacji na sucho gazowym amoniakiem, przez przepusz¬ czanie amoniaku przez energicznie mieszany su¬ chy proszek EMA, (2) przepuszczanie amoniaku przez mieszana zawiesine proszku EMA w benze¬ nie lub neksanie lub (3) bezposrednie dodawanie stalego proszku. EMA do mieszanego nadmiaru cieklego amoniaku okazaly sie nieprzydatne w sposobie wedlug wynalazku. Nieprzydatnosc ta wy¬ nika z powolnej dyfuzji1 amoniaku do wnetrza rdzenia czastek EMA, nawet bardzo drobno zmie¬ lonych. Nawet przy dlugim czasie reakcji, tak otrzymany produkt amid-sól amonowa zawsze za¬ wiera w szczatkowej ilosci, do 5*/a, nieprzereago- wany bezwodnik, którego obecnosc wykazuja pa- 55 sma absorpcji przy 1780 i 185fr cm-1.Dla skrócenia czasu reakcji i polepszenia regu¬ lacji temperaturowej w procesie wytwarzania pro¬ duktów nie zawierajacych funkcji bezwodnika o- pracowano nastepujaca procedure postepowania. w (ay Polfimear EMA z przykladu I—F (80 g) roz¬ puszczono w 000 ml acetonu (jakosci AR = cz. d. a), a otrzymany roztwór w ciagu 20 minut doda¬ no do mieszanego roztworu 100 ml cieklego amo¬ niaku w 3 litrach acetonu, w —70°C (laznia' su- <5 160 14 chy lód-aceton). Po 20 minutowym okresie doda¬ wania cala mieszanine stopniowo (w ciagu 4 go¬ dzin) doprowadzono do temperatury pokojowej, w którym to czasie barwa wytraconego produktu a zmienila sie z poczatkowej zóltej na biala. Pro¬ dukt odsaczono i kolejno mieszano z 2 litrami ace¬ tonu i dwukrotnie z porcjami po 1,5 litra miesza¬ niny 5(01/50 aceton/heksan. Kazde mieszanie prowa¬ dzono w ciagu 30 minut. Koncowy produkt odsa- 10 czono i suszono w ciagu nocy w 45°C, pod cis¬ nieniem obnizonym do 2666—3333 Pa. Wysuszony produkt rozpuszczono w 900 ml wody, przesaczo¬ no przez saczek o porach 0,45 mikrometrów i lio¬ filizowano, otrzymujac 98,7 g, wydajnosc VMJfUt w pól-amidu, pól-soli amonowej. (b) Powtórzono procedure (a) powyzej, stosujac polimer EMA z przykladu I—F, z tym, ze do pier¬ wotnego roztworu EMA w acetonie dodano wody.EMA (60 g) rozpuszczono w 500 ml acetonu, do- 20 dano 2,32 g wody i w ciagu 2 godzin utrzymy¬ wano roztwór we wrzeniu pod chlodnica zwrot¬ na. Oziebiony acetonowy roztwór EMA dodano w ciagu 10 minut, przy mieszaniu, do 2 litrów ace¬ tonu zawierajacych 3 mole cieklego amoniaku, w 25 —60°C. Jak poprzednio, zawiesine reakcyjna do¬ prowadzono do temperatury pokojowej i przetwo¬ rzono jak wyzej, mieszajac z dwiema porcjami po 1,5 Litra acetonu i z 1 litrem heksanu. Odsa¬ czono i w ciagu nocy suszono w 40°C, pod cis- 30 mieniem obnizonym do 2666—3333 Pa. Po wysu¬ szeniu otrzymano 84 g produktu, co odpowiada wydajnosci ponad 100P/*. '' * (c) W trzecim preparacie stosowano polimery EMA z przykladu I-^& 100 g 00,714 mola) EMA utrzymywano w ciagu 2 godzin we wrzeniu w 700 ml acetonu zawierajacego 3,85 g wody. Ozie¬ biony roztwór acetonowy w ciagu 10 minut doda¬ no do mieszanego roztworu 3,3 litra acetonu, za¬ wierajacego 60 ml cieklego amoniaku, w —50°C.Po godzinie utrzymywania w —50PC zawiesine re¬ akcyjna doprowadzono do temperatury pokojowej (w ciagu 2 godzin). Odsaczony produkt dwukrot¬ nie mieszano w 2 litrach acetonu (po 30 miriut) i dwukrotnie w 2 litrach heksanu (po 30 minut), odsaczono i w ciagli nocy suszono w dO°C ?pod pelna próznia pompy: olejowej. Otrzymano 1L5,U g (wydajnosc' Q3Ph) pól-amidu, pól-soli amonowej.Sklad powyzszych trzech preparatów przedsta¬ wiono w tablicy II.Przyklad III. Wytwarzanie czesciowej imi- dowej pochodnej, w ksylenie |10 g próbke pól-amidu, pól-soli amonowej z przykladu Ha zawieszono w 250 ml ksylenu, w 1 litrowej kolbie, wyposazonej w mieszadlo, ter¬ mometr, separator wody i doprowadzenie amonia¬ ku. Zawiesine utrzymywano w ciagu 12 godzin w stanie wrzenia pod chlodnica zwrotna, utrzy¬ mujac ciagly doplyw gazowego amoniaku. W o- okreslonych odstepach czasu (patrz tablica III) pobierano próbki zawiesiny, w celu okreslenia przebiegu konwersji do! imidu w czasie. Kazda próbke poddawano oczyszczeniu przez trzykrotne mieszalnie w 160 ml heksanu, saczenie i suszenie w 50°C, pod risnrietiiem obnizonym do 2660—3333 Pa.Mierzono pH 21% wodnego roztworu przed i po128 160 15 Tablica II 16 Preparat azot, l°/o< (wartosc STednia z 2 ozna¬ czen) Grupy funkcyjne z podczerwieni bezwodnik niezdysocjonowana grupa COOH imid pierwszorzedowy amid zjonizowana grupa coo— grupa metylenowa —CH2- \ —COO-NH4+ la 13,40 brak brak brak silne silne tak silne Ib 14,18 brak brak brak silne silne tak silne c 14,19 brak brak brak 1 silne silne tak silne | Tablica III Czas* wrze¬ nia w ksy¬ lenie przy pobieraniu próbki 15 minut i30 miinut 45 minut 1 godzina 1,5 godziny 2 godziny 3 godziny 4 godziny 6 godzin 7,5 godzin 12 godzin pH-l<* 6,25 6,010 5,91 5,78 5,4!3 5,27 4,94 4,78 4,73 4,73 — pH-2 7,20 5,86 5,76 5,53 5,43 5,76 5,72 5,38 5,76 5,60 — I/A 0,723 0,858 10,999 il,lli3 1,398 1,»1 1,871 — —< — — Imid f/o wa¬ gowych 13,8 118,5 23,3 27,4 36,8 40,2 50,0 — — — — | (a) pij 2P/o roztworu wodnego przed doprowadze¬ niem pH (to) pH 2P/o roztworu wodnego po doprowadzeniu do pH 10 i liofilizacji Stosunek intensywnosci pasm absorpcji w IR przy liczbie falowej 1715 cm_1/1670 cm-1 Obliczono z krzywej wzorcowej zaleznosci skla¬ du od stosunku I/A 10 15 20 25 30 35 40 45 dalszym rozpuszczeniu w wodzie, doprowadzeniu do pH 10,0 (NH4OH) i liofilizacji. Dla wszystkich próbek sporzadzono widma w podczerwieni, w ce¬ lu okreslenia stosunku imidu do amidu, a stad procentowej zawartosci imidu. Wyniik zestawiono w tablicy III.Przeprowadzono dalsza serie 9 prób, stosujac pól- -amid, pól-sól amonowa z przykladu IIb. W kaz¬ dym przypadku zawiesine w ksylenie utrzymy¬ wano we wrzeniu pod chlodnica zwrotna w cza^ sie podanym w tablicy IV.Suche produkty z przemywania heksanem indy¬ widualnie rozpuszczano) w 150 ml wody, za pomo¬ ca NH4OH doprowadzano roztwór do pH 10, prze¬ saczono przez saczek o porach 0,210 mikrometra i liofilizowano bezposrednio w sterylnych fiolkach, w celu badania in vivo na zwierzetach. Wydaj¬ nosc i sklad w poszczególnych próbach opisano w itablicy IV.Przyklad IV. Wytwarzanie czesciowej imi- dowej pochodnej, w toluenie Czesciowe imidy pól-amidu, pól-soli, amonowej polimeru EMA sporzadzono zasadniczo jak w przy¬ kladzie III, z tym, ze zmieniono szybkosc formo¬ wania imildu, prowadzac reakcje we wrzacym — pod chlodnica zwrotna toluenie (1I10°C), a nie w ksylenie, jak w przykladzie III.Jako EMA zastosowano produkt z przykladu I—F, a pól-amid, pól-sól amonowa wytworzono jak w przykladzie Ha, nie dodajac wody. Produkt wykazywal silne pasma absorpcji IR pierwszorze- dowego amidu, zjonizowanej grupy karboksylowej i karboksylanu amonu, nie wykazujac pasm bez¬ wodnika i imidu. 28 g produktu zawieszono w 1 litrze toluenu i ogrzewano w temperaturze wrze¬ nia pod chlodnica zwrotna. Pobrano 3 próbki, po 2, 13,5 i 5 (koniec próby) godzinach ogrzewania, Produkty wyodrebniono przez saczenie, trzykrot¬ ne mieszanie w 11510 ml toluenu i trzykrotne mie¬ szanie w eterze naftowym i suszenie w ciagu 17 godzin pod cisnieniem obnizonym do 3333 Pa, w temperaturze pokojowej. Suche produkty rozpu¬ szczano w 1100 ml wody, za pomoca NH4OH dopro¬ wadzano roztwór do pH 9,0, przesaczono przez saczek o porach 0,2(0' mikrometra i bezposrednio liofilizowano w sterylnych ampulkach, w celu ba¬ dania in vivo na zwierzetach. Otrzymano naste¬ pujace wyniki: (Tablica IVa) IPró- b{a mir 1 • 1 '2 13 14 5 6 Czas reakcji we wrzacym ksylenie 2 2 min. 4 min. 10 min. (20 min. 30 min. 45 min.Wydajnosc pro¬ duktu (1) lg (•/#) Si 4,45 (90,1) 3,|92 (92,6) 7,87 (80,5) 6,28 i(81,l) M5 (80,1) 6/30 (82,7) 1 Tablica pH-l<* 4 6,08 4r,85 4,43 4,52; R99 4,60 IV !pH-20» 5 17,08 6,93 ?7,12 6,74 !6,39 6,69 . Azot 6 1 14,27 |1.428 14,48 13,82 U3,67 13,71 ;I/A 7 0,489 0,559 0,6^1 0,798 0,911 1,4)20 Imid 8 5,3 7,9 . 11,5 J 16,5 J £0,4 '24,1,^ |128 160 17 18 1 7 8 9 & 1 godz. 1,5. godz. 3^0 godz. 3 6,30 (83,4) 6,15 (82,6) 15,9(0 <81,9) 4 | 4,70 4,37 [4,33 5 6,22 6,00 5,81 6 III c ' 1 1,139 1,333 1,828 .d. tablicy IV 6 | 128,2 64,7 50,1 W próbie 1 uzyto 5,0 g AEMA, w próbie 2, 4, 3 g,(c) z produktu po doprowadzeniu pH i liofilizacji w próbie 3, 10, 0 g, w pozostalych 8,(0 g patrz odnosnik (c) tablica III — produkt liofilizo (a) pH 2t°/o roztworu wodnego przed doprowadzeniewany mpH patrz odnosnik (d) tablica HI — produkt liofilizo H 10, 10 i liofilizacji Tablica IVa Tablica IV b Czas wrze¬ nia w to¬ luenie, gadzin 5,5 5 Pro¬ dukt Azot I/A Imid 6,15 13,78 0,531 6,5 7,7Q 13,41 0,6100 9,5 9,24 13,82 0,647 11,0 patrz odnosnik (c) tablica III — produkt liofi¬ lizowany patrz odnosnik (d) Tablica III — produkt liofi¬ lizowany Przyklad V. Wytwarzanie pelnego imidu EMA Lepkosc wlasciwa EMA = 0,061 Pelen imid EMA wytworzono przez utrzymywa¬ nie w ciagu 18,5 godizn w fazie wrzenia pod chlodnica zwrotna, zawiesiny -20 g produktu z przykladu Ha w 250 ml ksylenu, przy ciaglym doplywie amoniaku i odprowadzaniu wody reakcyj¬ nej przez przystawke Dean-Starka. W przystawce zebrano 2*7 ml wody. Produkt odsaczono, trzykrot¬ nie wymieszano z heksanem i suszono w ciagu nocy w temperaturze pokojowej, pod cisnieniem 33813 Pa. Waga suchego produktu 13,5 g, wydaj¬ nosc 84,31°/*. 3 g produktu mieszano w ciagu no¬ cy w 150 ml wody, odsaczono, przemyto woda i liofilizowano. Zawartosc azotu w produkcie wy¬ niosla 9,53*/o, a widmo IR wykazalo pasma ab¬ sorpcji jedynie przy 119»0, 1360 i 1770 cm-1, typo¬ we dla funkcji imidowej.Powyzszy produkt — pelen imid mieszano w róznym stosunku z nie zawierajacym ugrupowan imidowych pól-amidem, pól-sola amonowa z przy¬ kladu Ha, w celu wykreslenia wzorcowej krzywej absorpcji w podczerwieni w zaleznosci od stosun¬ ku imidt/amid, jak opisano w przykladzie I. Przy¬ jeto nastepujacy sposób postepowania: okreslone ilosci, odwazone na wadze analitycznej, mieszano w stalowym mieszalniku Wigglebury. 2 mg mie¬ szaniny mieszano z 250 mg suchego KBr, a z mie¬ szaniny1 sprasowywano tabletki o wadze 70 mg, które poddano spektroskopii w podczerwieni. Za¬ leznosc stosunku absorpcji imidj/amid od skladu mieszaniny polimerów przedstawia sie nastepuja¬ co: (Tablica IVb) i. 20 25 30 40 45 50 55 60 Pelen imid z przykladu V, 'mg 3 6 10 20 30 40 50 .60 70 | 80 Polimer z ^przykladu £Ia 0°/» imidu mjg 97 94 90 80 70 60 50 40 30 S0 Stosunek ab¬ sorpcji imid/ j/amid 0,427 0,509 o,6ai 0,843 1,1G1 1,319 1,871 2,090 2,564 3,008 Przyklad V-A. Wytwarzanie pelnego imidu EMA Lepkosc wlasciwa EMA = 0,66 Pelen imid EMA o ciezarze czasteczkowym wyz¬ szym niz w przypadku uzytego w przykladzie V sporzadzono z EMA o lepkosci wlasciwej 0,66 (l*/o, DMF, 2S5°C), co odpowiada ciezarowi czasteczko¬ wemu 20—30(000. W tym przypadku amonowany EMA sporzadzono jak w przykladzie VI(a), przez przepuszczenie suchego, gazowego amoniaku przez mieszany proszek EMA, w temperaturze ponizej 70°C. Otrzymany proszek pól-amidu, pól-sóli amo¬ nowej E]VIA (lepkosc wlasciwa = 0,66) dalej ogrze¬ wano w podwyzszonej temperaturze, przez odwod¬ nienie przeprowadzajac pól-amid, w imid. 6215 g pól-amidu, pól-soli amonowej EMA o lepkosci wlasciwej 0,66 energicznie mieszano w zbiorniku o pojemnosci 11,355 litra, wyposazonym w odprowadzenie wody, przepuszczajac w sposób ciagly gazowy amoniak. Po podwyzszeniu tempe¬ ratury do 122°C w odprowadzeniu wody zaczela zbierac sie woda. Po uplywie godziny tempera¬ tura doszla do 152PC i odprowadzono 24 ml wody.Ogrzewanie przy mieszaniu i przeplywie amonia¬ ku kontynuowano w ciagu dalszych 5 godzin (lacz¬ nie 6 godzin), zbierajac lacznie 54 ml wody. Po oziebieniu otrzymano produkt w postaci bialej barwy proszku o konsysitencji maki. Zawartosc N ll,lVh (teoretycznie ll,20°/o).Ten lOKf/tt imid EMA o wyzszym ciezarze czaste-128160 19 20 czkowym byl badany w 1803 r. na czynnosc hamo¬ wania wzrostu nowotworów, w niezaleznym labo¬ ratorium, nie wykazujac takiej czynnosci (patrz przyklad XXII).Przyklad VI. Wytwarzanie pól-amidu, pól-so- 5 li amonowej COO~ EMA wedlug dotychczasowe¬ go stanu techniki, z woda i bez wody (a) Kolbe czteroszyjna o pojemnoscia 500 ml wy¬ posazono w /teflonowe mieszadlo, termometr, roz¬ praszajace doprowadzenie gazu i wylotowa belko- io tke gazu. Gazowy amoniak doprowadzano przez miernik przeplywu, dajacy jedynie jakosciowa o- cene przeplywu. Do kolby zaladowano 25 g EMA z przykladu ID, a proszek mieszano z szybkoscia 500 obrotów na minute. Amoniak doprowadzano z 15 taka szybkoscia, by wychodzac z temperatury po¬ kojowej dojsc do 70°C nie stosujac plaszcza grzej¬ nego. Temperature te uzyskano w ciagu 9 minut, po czym zmniejszono doplyw amoniaku, by ja utrzymac. Temperature 710ioC utrzymywano w cia- 2& gu 1^5 godziny, po czym odcieto doplyw amonia¬ ku i oziebiono mieszanine pod azotem. Otrzyma¬ no 30,8 g isuchego amonowanego EMA w postaci pól-amidu, pól-soli amonowej z wydajnoscia 98,8%.Zawartosc azotu 14,01%, 14,18%, a pH 2% roztwo- 25 ru wodnego 6,07. W widmie IR wystepuja pasma absorpcji nie przereagowanego bez- przy 1780 i 1850 wodnika (oceniono na ponizej 5%) 30 pierszorzedowego amidu przy 1670 i 1620 (silne) jonu karboksylanowego przy 1565 (silne) NH4+COÓ- przy 1405 (silne) imidu brak (b) Drugie amonowanie EMA z przykladu ID 35 przeprowadzono jak w (a), z tym, ze EMA wpierw potraktowano woda, jak opisano ponizej, dla ula¬ twienia reakcji z amoniakiem i obnizenia zawar¬ tosci bezwodnika w produkcie. 25 g EMA mie¬ szano z szybkoscia 600 obrotów na minute w 40 40°C (plaszcz grzejny), w ciagu 6 godzin, w obec¬ nosci 0„53 g (17 mol %) wody, która wkroplono w ciagu poczatkowych 20 minut za pomoca 1,0 ml strzykawki. Po uplywie 6 godzin proszek oziebiono do temperatury pokojowej i prowadzono amonifi- 45 kacje jak w (a), doprowadzajac temperature w oiagu 10 minut do 70°C. Amoniiikacje w 70°C prowadzono w ciagu godziny, po czym produkt oziebiono pod azotem. Wydajnosc wyniosla 31,4 g, 100,81%; zawantosc azotu 14,02)%, 13,914%, a pH 2% w roztworu wodnego 6,45. W widmie IR wystepuja pasma absorpcji nie przereagowanego bez obecne, lecz znacznie wodnika slabsze niz w (a) pierwszorzedowego amidu silniejsze niz w (a) 55 jonu karboksylanowego NH4+COO" silniejsze niz w (a) imidu nieobecne P,rzyklad VII. Charakterystyka produktów wytworzonych uprzednio, zasadniczo jak w przy- <° kladzie VI W czasie od lipca 1956 do lutego 196(0 sporza¬ dzono i zbadano szereg pól-amidów, pól-soli amo¬ nowych EMA o róznej lepkosci (ciezarze czastecz¬ kowym). Lepkosc produktów, wyrazona lepkoscia 65 wlasciwa 1*0% wagowo roztworu w DMF, w 25°C, wynosila od 1,19, 0,60, 0,1.1 do 0,060, a szacunkowa wartosc ciezaru czasteczkowego (Mn) odpowiednio 510—60 000, 210—30 000, 2—3 000 i 1000. Pierwsze trzy produkty EMA, tj. o lepkosci 0,11, 0,60 i 1,19 amo- nifikowano w duzej instalacji pilotowej, w ilosci po 272—(316(3 kg. EMA o mniejszej lepkosci (0,060) amonifikowano w mniejszym urzadzeniu labora¬ toryjnym, w ilosci 20|0—300 g. Ponizej opisano spo¬ sób postepowania i charakterystyke otrzymanego w tym czasie produktu.Skala pilotowa (dla EMA o lepkosci wlasciwej 1,19, 0,60 i 0,11): Amonifikacje przeprowadzono w wyposazonej w plaszcz suszarce obrotowej z nier¬ dzewnej stali Stokes, model 59AB, wyposazonej w urzadzenie do wprowadzania ponad powierzchnie zawartosci suchej pary wodnej i bezwodnego amo¬ niaku, mieszadlo pracujace z szybkoscia 5,7 obro¬ tów na minute i zawór obrotowy zamykajacy spust i odprowadzajacy koncowy produkt. „Pel¬ na" objetosc aparatu 1.132,64 litra, objetosc „ro¬ bocza" 764,53 litra. W typowej próbie, do zam¬ knietego od dolu reaktora wprowadzano 272—363 kg EMA o odpowiedniej lepkosci, przy pracujacym mieszadle. EMA podgrzewano do 55°C, po czym wstepnie hydrolizowano woda w ilosci 0,15—0,20 moli na mol EMA, wprowadzajac „ponad powierz¬ chnie" sucha pare wodna, w ilosci 0,007 kg na kg EMA, w ciagu 3 godzin. W tym okresie tempe¬ rature utrzymywano w zakresie 55—70°C, prze¬ puszczajac przez plaszcz wode chlodzaca. Nastep¬ nie do reaktora wprowadzano bezwodny, gazowy amoniak (nad powierzchnie czesciowo zhydrolizo- wanego EMA), z taka szybkoscia, by utrzymac temperature w zakresie 610 do 70°C (okolo 2,27 do 3,63 kg na godzine), do dodania 2,0 mola amonia¬ ku na mol EMA% Po dodaniu calosci amoniaku produkt oziebiono do ponizej 50°C i zsypano do pojemników magazynujacych.Skala laboratoryjna (dla EMA o lepkosci wla¬ sciwej 0,06): Wyjsciowy EMA sporzadzono w spo¬ sób podobny jak w przykladzie I, z tym, ze wsad do reaktora obejmowal 267 g bezwodnika ma¬ leinowego, 2039 ml etylobenzenu, 45,8 ml aldehydu maslowego i 13,20 g nadtlenku benzoilu; wszyst¬ kie skladniki dodano na poczatku. Cisnienie ety¬ lenu utrzymywano w ciagu 24 godzin na pozio¬ mie 13(80 kPa, temperature 7I0°C. Po oczyszczeniu otrzymano 279 g produktu koncowego, — wydaj¬ nosc 713,3%, lepkosc wlasciwa 0,060 (1% w DMF, 25°C). Do 5 litrowej kolby czteroszyjnej zalado¬ wano 24© g proszku stalego EMA o lepkosci wla¬ sciwej 0,060 i energicznie mieszano go w ciagu 6 godzin w 45^56°C, po wkropleniu 5,3 g wody (15 mol % w odniesieniu do EMA), w celu cze¬ sciowego zhydrolizowania. Rozpoczeto amonifika¬ cje, wprowadzajac do energicznie mieszanego pro¬ szku EMA suchy, bezwodny, gazowy amoniak, u- trzymujac w ciagu 18 godzin temperature 31— 32°C. W tym czasie obserwowano powolne lecz sta¬ le pochlanianie amoniaku. Otrzymano 320 g pro¬ duktu koncowego; wydajnosc 10|3,3%.Charakterystyke wszystkich otrzymanych pro¬ duktów przedstawiono w tablicy V.21 128 160 Tablica V 22 Oznaczenie próby: 1 Wyjsciowy EMA, lepkosc wlasciwa(1) Zakres ciezaru czasteczkowego Produkt amonowy, kod CRD: Rok wytworzenia: azot, •/• Charakterystyka w podczerwieni data próby: bezwodnik kwas karboksylowy (COOH) imid pierwszorzedowy amid jon karboksylanowy (C02_) karboksylan amonu D 1,19 £0—60,000* S-24 1957 15,83 i — — — — '— ' C 0,60 (20—eo,ooox 1334 /1957 16,86 I22/5|/159 nieobecny nieobecny nieobecny jobecny obecny B 0,11 ;2300xx 333 11956 14,80 8l/i6i/59 nieobecny nieobecny nieobecny obecny obecny A 0,060 1060** 837 19610 13,83 mm nieobecny /nieobecny nieobecny obecny obecny 1% DMF, 25°C x Mn oceniony z krzywej zaleznosci lepkosc — Mn xx Oznaczono w grudnliu 1960 metoda ebuliometry- czna wzroizit temperatury wrzenia w acetonie Próbki pól-amidu, pól-soli amonowej EMA spo¬ rzadzone w latach 1957—1960 i scharakteryzowa¬ ne w tym czasie, jak opisano w tablicy V, prze¬ chowywano w szklanych slojach z zakrecana po¬ krywa (nie pod azotem lub innego rodzaju usz¬ czelnieniem) do poczatku roku 1977, w normalnym pomieszczeniu magazynowym. W tym czasie (rok 1977) pobrano je do dalszej oceny (patrz przy¬ klady IX i X). Przed uzyciem materialy ponow¬ nie scharakteryzowano, otrzymujac wyniki przed¬ stawione w tablicy VI.Otrzymane wyniki wskazuja, ze produkty poli¬ merowe badane w latach 1959—1960 (przyklad VIII), które w tym czasie nie zawieraly grup imi- dowych, utracily amoniak i wode, i w czasie dlu¬ gotrwalego magazynowania ulegly przemianie w produkt polimerowy zawierajacy grupy imidowe.Badanie produktów przeksztalconych, w przy¬ kladach IX i X, nieoczekiwanie dalo wyniki róz¬ niace sie od poprzednich.Ocena produktów, przyklady VIII—XXI Przyklad VIII. Trzy pól-amidy, pól-sole amo¬ nowe EMA (nie zawierajace funkcji imidowej) z przykladów VII A, B i C oceniono w niezalez- 25 nym laboratorium badawczym w latach 1959—60, wedlug urzedowych przepisów dla * transplantÓw stalego Sarcoma-180, opracowanych przez Cancer Chemotherapy National Service Center (CCNSC).Nowotwór otrzymano z National Institute of He- 30 alth. W stosowanej procedurze granica toksycz¬ nosci sa 2 padniecia na 6 zwierzat. Wartosci T/C dla prób obliczono jako stosunek przecietnej wa¬ gi nowotworu u zwierzat traktowanych do prze¬ cietnej wagi nowotworu u zwierzat kontrolnych. 35 Wartosci T/C obliczano z serii 3 prób, jezeli mie¬ scily sie one w dopuszczalnym zakresie. Mate¬ rial uznawano za dopuszczalny, jezeli po konco¬ wej próbie wartosc iloczynu (Tl/C)! X (T/C)2 X X (T/Os byla mniejsza niz OfiS. Próby kontynuo- 4P wano, gdy wartosc (T/C)i byla mniejsza niz 0,54 i gdy wartosc iloczynu (T/C)! X (T/C)2 byla mniejsza niz 0,20. Jako zwierzeta doswiadczalne stosowano myszy szczepu Swjss (CCNSC, opis XIV), lek podawano dootrzewnowo (opis III), a 45 oznaczenia dawki dokonywano wedlug opisu XII.Wyniki zsumowano w tablicy VII.Produkt amonowy Ifcod identyfikacyjny: Odpowiada oznaczeniu w ta¬ blicy V Azot, f/o Charakterystyka w podczerwieni data próby: bezwodnik kwas karboksylowy (COOH) imid ' pierwszorzedowy amid jon karboksylanowy (CO"2) karboksylan amonu stosunek absorpcji imid/amid imid, I1/* Tablica VI S-24, D 14,02 1977 nieobecny nieobecny obecny obecny obecny obecny 0,890 19*5 834 C 12,46 1978 nieobecny nieobecny obecny obecny obecny obecny 0,922 20,7 333 B /1(2,53 19177 nieobecny bieobecny obecny obecny obecny oibecny 1,180 129,5 [ 337 1 A 12,62 J977 ^nieobecny nieobecny obecny obecny obecny obecny 0,950 21,723 128 160 T a b 1 i c a VII 21 Zwiazek (tablica V, przyklad VII) Lepkosc wlasciwa EMA Oznaczenie produktu Próba 1: dawka mg/kg padla/suma (T/C)! komentarz Próba 2: dawka mg/kg padle/suma (WC)i (T/C)iX(T/C)2 komentarz Próba 3: dawka mg/kg padlei/suma (T/Os .(T/C)iX(T/C)2X komentarz —i* — U-1104x 500 '2je 0,89 odrzucic r— — — — v •— i— •— — — 1— Axx 0,060 CRD 3i37xx 600 W 0,45 kontynuowac 500 2/6 ,0,29 0,1® kontynuowac 5010 li/6 0,77 0,10 odrzucic fc 0,11 CRD 333 375 0/7 0,3317 kontynuowac 375 1/7 0,159 0,053 kontynuowac 375 1/6 0,15 0,008 akceptowac C 0,60 CRD 334 60 1/7 0,180 kontynuowac tfO (2/6 10,51 ' "0,093 'kontynuowac 60 vl,/6 0,50 •0,046 akceptowac x U-1104 jest amonowa sola monoaimidu kwasu bursztynowego, monomerycznej jednostki funkcyj¬ nej polimerów A, B i C Z otrzymanych danych wynika, ze w tej serii prób ze zmniejszeniem ciezaru czasteczkowego po¬ chodnej polepsza sie toksycznosc, natomiast za¬ nika aktywnosc, ze zblizaniem sie do nieaktywnej 30 jednostki monomerycznej. W tym czasie (1959— —il960) nie sporzadzono i nie poddano ocenie we¬ dlug CCNSC podobnych pochodnych zawieraja¬ cych funkcje czesciowego imidu. Przy ocenie we¬ dlug CCNSC wobec Carcinoma 755 i Leukemia 35 1210 wszystkie 3 polimery (A, B i C) odrzucono.Przyklad IX. Kompozycje polimerów (A, B, D) jak opisano w przykladzie VII, tablica VI, spo¬ rzadzone z trzech surowców EMA o róznej lepkos¬ ci wlasdiwej i trzech znaczmie rózniacych sie, 40 wartosciach ciezaru czasteczkowego podano my¬ szom BALBi/c wedlug trzech róznych terminarzy dawkowania: (a) przed (dzien 9 i 1), (b) po (dzien 1 i 9) inokulacji komórkami transformowanego nowotworu SV40 (oznaczenie: mKSA-TU5) i (c) « przed (dzien 9 i 1) i po (dzien 1 i 9) inokulacji.Zwiazek podawano dootrzewnowo (IP) w 3 daw¬ kach, odpowiednio 62,5, 125,0 i 2150,0 mg/kg. Ko¬ mórki nowotworowe inokulowano podskórnie (SC) w ilosci 1X104 jednej i w ilosci 1X108 drugiej 50 grupie zwierzat. Nastepnie oceniano wzrost nowo¬ tworu u myszy traktowanych, porównujac go ze xx Badano dwuktrotnlie, Za drugim razem odrzuco¬ no w próbie 1: 500 mg/kg, padle/suma = 1/6, (T/C)i = 1,39 wzrostem u nie traktowanych mj^szy kontrolnych.Uzyskane dane zsumowano w tablicach VIII-A, VIII-B i VIII-D. Wedlug tablicy VIII-A, przy sto¬ sowaniu polimeru z przykladu VII, tablica VI-A, zgodnie z terminarzem dawkowania (a), 48*/o (17/ /36) myszy zakazonych nowotworem pozostalo zdro¬ we i wolne od nowotworu w 58 dniowym okresie obserwacji. 61 dnia zwierzeta wolne od nowotwo¬ ru ponownie zakazono zywymi komórkami no¬ wotworowymi (mKSA-TU5), 1X!104, SC); w 37 dni po zakazeniu 82j°/o (14/17) zwierzat bylo wolnych od nowotworu (tj. uodpornionych).Przy podawaniu po zakozeniu nowotworem po¬ limeru z tablicy VI-A wedlug terminarza (b), 42°/o (15i/36) zwierzat pozostalo oporne na nowotwór po 58 dniach obserwacji. Po ponownym zakazeniu (dzien 61) zywymi komórkami nowotworowymi, w ilosci 1X104, 8I0I0/© (12/15) zwierzat bylo wolne od nowotworu po uplywie 37 dni.Przy podawaniu polimeru z przykladu VII, ta¬ blica VI-A wedlug teirminarza (c), przed i po za¬ kazeniu nowotworem, 28I0/* (10/36) zwierzat po¬ zostalo oporne do 58 dnia, a wszystkie z tych wol¬ nych od nowotworu zwierzat byly oporne na dru¬ gie zakazenie nowotworem.Tablica VIII-A Nowoltwór mKSA-TU5 1X10+4 SC Badany zwiazek ;2 kontrola Polimer z przykladu VII, tablica VI-A (oznaczenie próby) Dawka mg/kg 3 250 Terminarz podawania 4 i— dnie -^9 i —1 Wzrost nowotwo¬ ru u bior¬ ców dnia 58 5 6/6 6/6 Wolne od nowotwo¬ ru dnia 58 6 0 o 125 128 160 26 c.d. (tablicy VIII-A 1 1 " »» $t n »» $t " »f (ix+» SC il ii n il il ii :» M 2 " i» % ii ii t» M » • kontrola Polimer z przykladu VII, tablica VI-A (oznaczenie próby) a M il i ii \i Hi IM Ht G 125 62,5 250 125 62,5 250 125 62,5 i— 2150 125 62,5 250 125 62,5 250 125 62,5 dmie —9 i —1 •»# dnie +1 i +9 < a dnie —9 i —1 -hi i +9 Iw l»» H- dnie —9 i —1 a n dnie +9 i +1 ni dnie —<9 i —1 +9 i +1 L m 5 4/6 2/6 176 ty6 4/6 3/6 4/6 4/6 a/6 B/8 4/6 3/6 W6 5/6 q/6 5/16 4/6 6 2 4 5 4 2 3 2 2 0 15 '4 2 3 0 1 10 1 2 1 Nowotwór mKSA-TU5 1X10* SC " tt M » »» »» l ii IX10* Tablica Badany zwiazek Kontrola Polimer z przykladu VII, tablica VI-B (oznaczenie próby) a „ » i? » VIII-B Dawka mg/kg t— 250 125 62,5 250 125 62,5 250 125 . 62,5 Terminarz podawania ___ dnie —9 i —1 a a dnie +11 +9 k \» dnie —9 i —1, + 1 i +9 h Im Wzrost nowotwo¬ ru u bior¬ ców dnia 51 5|/6 G/|6 3(fó 5i/0 $/6 4/S ty6 a/6 51/6 a/je Wolne od npwotwo- tru dnia 51 l1 0 ' 3 0 Nowotwór mKSA-TU5 1 1X10+* SC ii ii Tablica Badany zwiazek 2 kontrola Polimer z przykladu VII, tablica VI-D (oznaczenie próby) ii VIII-D Dawka mgj/kg 3 75 150 25 Terminarz podawania 4 dnie —9 i —1 Wzrost nowotwo¬ ru u biorców dnia 36 5 W 61/6 8/S 6t/6 Wolne od nowotwo¬ ru dnia 36 6 01 01 ¦ ¦» 1128 160 27 28 cxl tablicy VIII-D 1 1 1 ii i» 1 a , ii ti ii ix:io+» SC i » » »' » ii ii i 2 » a » , »» ,» kontrola Polimer z przykladu VII, tablica VI (oznaczenie próby) 9) ii &i ij 9i « Jl 3 75 50 25 75 50 25 ^. 75 50 125 75 50 25 75 •50 25 4 dnie +1 i +9 pi \» dnie —9 i —1, + 1 i +9 ii ]H -^ dnie —& i —1 „ „ dnie +9 i +1 a ,, dnie ^—9 i —1, + 1 i +9 l 5 m 6/6 5/6 a/6 61/6 $/6 6/6 6/6 4/6 5/6 (V6 6/6 4/6 6/6 5/e 2/6 6 0 0 i •0 1 0 0 0 0 2 1 0 0 2 0 1 4 Polimer z przykladu VII, tablica VI-B byl ba¬ dany tylko na myszach inokulowanych (SC) zy¬ wymi komórkami mKSA-TU5 w ilosci 1X104 (patrz tablica VIII-B). Przy dawkowaniu wedlug ter¬ minarza (a), 221% (4/18) myszy pozostalo Wolne od nowotworu w ciagu 51 dni obserwacji. Przy sto¬ sowaniu terminarza dawkowania (b), wolne od nowotworu w ciagu 51 dni pozostawalo 22|% (4/18) zakazonych myszy, natomiast w grupie (c) w cia¬ gu 51 pozostalo wolne od nowotworu jedynie 11% (2/18) tewierzat. W 54 diniu wszystkie myszy wolne od nowotworu (10/54) ponownie zakazono SC zy¬ wymi komórkami mKSA-TU5, w ilosci 1X104; po uplywie 37 dni wsyzstkie 110 zwierzat pozostalo wolne od nowotworu (tj. uodpornione).Polimer z przykladu VII, tablica VI-D badano przy dwóch poziomach zakazenia nowotworem, jak polimer z przykladu VII, tablica VI-A powyzej (patrz tablica VIII-D). Poniewaz badany polimer mial znacznie wyzszy ciezar czasteczkowy niz po¬ limery z przykladów VII A lub VII B, podano go (IP) w dawce 75, 50 i 25 mg/kg, jak odnotowano.W przypadku terminarza (a) 11% W3I6) zakazonych myszy pozostalo wolne od nowotworu w ciagu 36 dni obserwacji. Sposród nich 751% (3t/4) pozo¬ stalo wolne od nowotworu w 37 dni po powtórnym zakazeniu. W przypadku terminarza dawkowaniaN (b) 81% (3/36) zwierzat bylo wolne od nowotworu 36 dni po pierwszym zakazeniu, a jedynie - jed¬ no z nich bylo oporne Ina drugie zakazenie. We¬ dlug (terminarza (c), gdzie polimer z przykladu VII, tablica; VI-D podawano przed i po zakazeniu, 14% (5/36) pozostalo wolne od nowotworu w ciagu 35 40 45 50 55 60 65 3(6 dni, a 4 sposród tych 5 (80%) bylo oporne na drugie zakazenie nowotworem.Podane w tablicach VIII-A, B i D liczby wol¬ nych od nowotworu zwierzat po zakonczeniu ob¬ serwacji sa suma liczby (a) zwierzat wolnych od nowotworu w okresie obserwacyjnym oraz (b) zwierzat u których w okresie obserwacji rozwinal sie mierzalny nowotwór lecz przed zakonczeniem tego okresu ulegl regresji i zanikl.Stosunek liczby zwierzat z regresja nowotworu do liczby zwierzat, które pozostawaly calkowicie wolne od nowotworu wykazuje zaleznosc od la¬ dunku nowotworu i zastosowanego polimeru. Od¬ powiednie dane zestawiono w tablicy VIII-E.Przyklad X. Kompozycje polimerowe z przy¬ kladu VII, tablica VI-A zbadano ponownie, jak w przykladzie IX, z tym, ze stosowano po 10 myszy w grupie i jedynie terminarze dawkowania (a) i (b). Uzyskane dane zsumowano w tablicy IX.Przy stosowaniu terminarza dawkowania (a), gdzie polimer podaje sie dnia 9 i dnia 1 przed zakazeniem nowotworowym, 37% (22/60) zakazonych myszy pozostalo wolne od nowotworu w 61 dnio¬ wym okresie obserwacji. 62 dnia 21 sposród wol¬ nych od nowotworu zwierzat ponownie zakazono komórkami nowotworowymi mKSA-TU5 (SC), w liczbie 1X104. Po uplywie dalszych 30 dni 90% (19/21) zwlierzat pozostalo wolne od nowotworu (uodpornione).W terminarzu dawkowania (b), gdzie polimer daje sie dnia 1 i 9 po zakazeniu nowotworem, 47% (218/60) myszy pozostalo wolne od nowotworu w ciagu 61 dniowego okresu obserwacji. 64% (18/28)128 160 Tablica VIII-E 30 Dane z tablicy nr VIII-A VtII-B VIII-D Polimer przyklad VII, tablica VI-A (oznaczenie próby) przyklad VII, tablica VI-B (oznaczenie próby) przyklad VII, tablica VI-D (oznaczenie próby) Dawka nowo¬ tworu 1X10* 1X104 Suma 1X10* 1X10* Suma 1X10* 1X10* Suma liczba zwierzat wolnych od nowo- tworu^ 8 iv 0 jB NT<« 1 1 do 0 10 Liczba zwierzat z iregresji nowotwo- ru<* 10 n 34 NT 9 0 1 0 2 2 Suma 18 24 42 NT 10 10 • Ho 2 12 */d zwie¬ rzat z re¬ gresja no¬ wotworu 56 100 81 tfr 90 90 0 100 17' <* Wolne od nowotworu w okresie obserwacyjnym — bez regresji <* Rozwój nowotworu z regresja do zera w okresie obserwacyjnym <* Nie badano bylo uodpornione w ciagu dodatkowych 30 dni, po drugim zakazeniu nowotworem.Przyklad XL Kompozycje polimerowa z przy¬ kladu Via, EMA amonowany gazowym amonia¬ kiem w fazie stalej, bez dodawania wody, poda¬ no myszom BALB/c, w dawkach i wedlug termi¬ narza z przykladu X, stosujac grupy po 10 myszy.W tablicy X zestawiono dane uzyskane po 61 dniach obserwacji. W przypadku terminarza (a), gdzie polimer Via podawano dnia 9 i 1 przed za¬ kazeniem komórkami nowotworu mKSA-TU5, 4(P/o (24/60) myszy pozostalo wolne od nowotworu po uplywie 61 dni. W przypadku terminarza (b), gdzie polimer Via podawano dnia 1 i 9 po inoku- lacji nowotworu, 32*/t (19/60) zakazonych myszy pozostalo wolne od nowotworu po 61 dniach. Z sumy 43 wolnych od nowotworu po 61 dniach myszy z grup (a) i (b), 36 (87%) bylo uodpornio¬ ne w ciagu 30 dni na powtórne zakazenie nowo¬ tworem (1X104 komórek).Przyklad XII. Kompozycje polimerowa z przykladu VIb, EMA amonowany gazowym amo¬ niakiem w fazie stalej, z dodaniem wody, podano myszom BALB/c w dawkach i wedlug termina¬ rza z przykladu X, stosujac grupy po 10 myszy.W tablicy XI zestawiono dane uzyskane po 61 dniach obserwacji. W przypadku terminarza (a), gdzie polimer VIb podawano dnia 9 i 1 przed zakazeniem komórkami nowotworu mKSA-TU5, 30Vt (16/60) myszy po uplywie 61 dni pozostalo wolne od nowotworu. W przypadku terminarza (b), gdzie polimer.Ylb podawano dnia 1 i dnia 9 po ino^ulacji; nowotworu, 17*/t (llOi/60) zakazonych myszy pozostalo wolne od nowotworu po 61 dniach.Z sumy 28 myszy wolnych od nowotworu po 61 dniach, z grup (a) i 35 40 45 60 65 od nowotworu w ciagu 30 dni po powtórnym za¬ kazeniu nowotworem w ilosci IX HO4 komórek.Przyklad XIII. Ocene opisana w przykladach IX do XII rozszerzono na drugi model nowotwo¬ ru — przeszczepiamy nowotwór pecherzy u szczu¬ ra szczepu Fischer (F344), wywolany 3-metylocho- lantrenem. Nowotwór ten po wszczepieniu nor¬ malnym szczurom szczepu Fischer wzrasta w miej¬ scu wszczepienia i samorzutnie przerzuca sie na pluca. Ponadto, po chirurgicznym usunieciu pier¬ wotnego nowotworu zawsze obserwuje sie nawro- : W pierwszych badaniach oceniono wplyw poli^ meru z przykladu VII, tablica VI-A na przezy- walnosc szczurów z nowotworem i zdolnosc zwiaz¬ ku do zapobiegania przerzutom.Szczurom szczepu Fischer, o wadze okolo 250 g, podskórnie wszczepiono 2X2 mm odcinek nowo¬ tworu. 5, 12 i 18 dnia po wszczepieniu nowotwo¬ ru, do jamy otrzewnej wstrzyknieto polimer, w dawce 62 mg/kg. W taki sposób potraktowano lacznie 6 zwierzat. Wszystkie zwierzeta kontrolne padly w ciagu 3 tygodni, przecietnie 15 dnia po wszczepieniu nowotworu. Dwa ze zwierzat trakto¬ wanych padly 37 dnia. Cztery pozostale zwierzeta usmiercono 42 dnia po implantacji. Badania wyka- ; zaly znaczny wzrost nowotworu pierwotnego, lecz brak przerzutów do pluc.Przyklad XIV. Drugie badanie przeprowa¬ dzono dla powtórzenia przykladu XIII i oceny . efektu nizszej dawki i zmniejszonej czestotliwosci traktowania. Szczury szczepu Fischer (grupy po 4) otrzymaly implant nowotworu tego samego ty¬ pu, a 8 dni po implantacji potraktowano je poli¬ merem przykladu VII, tablica VI-A, w dawce 65 mg/kg i 30 mg/kg (injekcja dootrzewnowa). Ob-128 160 31 32 Tablica IX Nowotwór mKSA-TU5 1X104 SC " » a »j " I^IO1 SC " »l l» i » »» Badany zwiazek kontrola iPolimer z przykladu VII, tablica VI-A (oznaczenie próby) j j kontrola Polimer z przykladu VII, tablica VI—A (oznaczenie próby) » „ » » » Dawka mjg|/kg i— 2510 125 62 J5 250 1.25 (6)2,5 — 1250 125 £2,5 250 125 62,5 Terminarz podawania dnie f-^9 i, —1 )) * dnie i+1 i + 9 »» » —t dinie .^-9 i —1 in jdnie L+il. i +9 tf *¦ Wzrost nowotwo¬ ru u ibiiorców dnia 61 ioy;io 9/10 WIO 7,/10 6/10 Q/10 7i/li0 S/10 7/10 4(/10 01/10 7/10 5*/10 1/10 (Wolne od nowoftwo- ru 'dnia 61 t) 2 0 : 3 4 1 4 i* ,5 ,'? 0 8 3 3 9 Tablica X Nowotwór mKSA-TU5 1X10* SC »t te i ,»] 1X)10' SC w M w M M kontrola polimer z kontrola polimer z Badany zwiazek przykladu Via », » » »j przykladu Via » » M »» ?i (Dawka ,mgj/kg 'i— 25i0 125 )62 £50 25 62 — , 250 (125 '02 (250 125 62 Terminarz podawania Vinie (-h9 i —jl il* / dnie + 1, i +9 ,» „ / dnie -^9 i —1 » j? dnie H-l, i +9 » » Wzrost nowotwo¬ ru u biorców dnia 61 *9|/10 Wio Wio &/10 WIO i6i/10 91/10 (8/10 £)/10 syjio 31/10 •71/10 7i/10 5/10 Wolne od •nowotwo¬ ru Idnia 61 ' ! 2 1 1 3 4 1 2 8 5 7 3 3 533 128 160 Tablica XI 34 Nowotwór mKSA- P"U5 1X104 SC " " » » i* 1X10* SC H » » '¦ » » Badany zwiazek kontrola polimer z przykladu VI-b tt *f ot 9i F .ii kontrola polimer z przykladu VI-b » .-..»»¦ *t i» » Dawka mg/kg , £50 12$ 62 50 125 62 — 2150 125 62 250 11)25 62 Terminarz podawania cu¬ dnie—9 i -—1 » » dnie +1 i +9 »i »» i— dnie —9 i —1 »• fi dnie +1 i +9 « » Wzrost nowo¬ tworu u biorców dnia 61 JlO/10 a/io a/io 7/10 6^10 7/10 10/10 4/10 8/10 4/10 6/10 8/10 10/10, 7/10 Wolne od nowo¬ tworu 'dnia 61 0 ' ' 1 2 1 (3 2 3 0 fe 2 6 4 2 0 3 serwacje prowadzono w ciagu 6 tygodni. Po uply¬ wie tego czasu zwierzeta które przezyly zbadano na obecnosc * przerzutów w plucach. Piec zwierzat z implantowanym nowotworem ¦ • nie poddano za¬ biegom, traktujac je jako kontrole. Wszystkie zwie¬ rzeta kontrolne padly w ciagu przecietnie '23 dni po implantacji nowotworu. Grupa 4 zwierzat z pojedyncza dawka leku 65 mg/kg przezyla i/40 dnia zostala usmiercona. Badanie wykazalo brak przerzutów. Z grupy która otrzymala 16 dniaJdaw¬ ke (30 mg/kg 2 zwierzeta padly 35 i 36 dnia, a po¬ zostale usmiercono 40 dnia. Równiez i w tym przy¬ padku badanie nie wykazalo przerzutów. Dluzsza przezywalnosc w obu grupach w stosunku do zwie¬ rzat kontrolnych jest oczywista.Przyklad XV. W trzeciej próbie oceniono zdolnosc polimeru z przykladu VII, tablica VI-A do zapobiegania nawrotom nowotworu u szczurów szczepu Fischer z chirurgicznie wycietym nowo¬ tworem pierwotnym. Implantacji odcinków nowo¬ tworu 2X2 mm dokonano jak w przykladach XIII i XIV. Po dojsciu nowotworu do srednicy 2—3 cm (6 dni po dmplantacji) nowotwór usuwano chirurgicznie i równoczesnie traktowano szczury pojedyncza dawka polimeru wielkosci 455 mg/kg lub 30 mg/kg (injekcja dootrzewnowa), w 2 gru¬ pach po 4 zwierzeta. W ciagu 7 tygodni prowa¬ dzono obserwacje przezywalnosci i nawrotu no¬ wotworów. Z grupy otrzymujacej po resekcji no¬ wotworu polimer w dawce 3K mg/kg wszystkie byly zywe po 47 dniach i nie wykazaly objawów nawrotu nowotworów. Z grupy otrzymujacej 65 mg/kg w pojedynczej dawce jedno padlo 16 dnia w wyniku nawrotu nowotworu, natomiast pozosta¬ le 3 byly po 4?T dniach zywe i nie wykazywaly ob* jawów nawrota nowotworu.Przyklad XVI. Druga próbe zapobiegania nawrotom nowotworu przeprowadzono na szczu¬ rach szczepu Fischer, podobnie jak w przykla- 30 35 40 dzie XV, z tym, ze zastosowano 3 polimery o róz¬ nej zawartosci imidu, mianowicie 0, 5 i 21,7^/t.Implantacji nowotworu dokonano jak w przykla¬ dzie XIII, XIV i XV. Wszystkie nowotwory wy¬ cieto 14 dni po implantacji.Jedna grupa 4 zwierzat, traktowana jako kon¬ trolna nie otrzymala w czasie wyciecia nowotwo¬ ru badanego zwiazku. W tej grupie obserwowano lOOtyt nawrotów, w dniach 21, 33, 40 i ^(przeciet¬ nie 34) po wycieciu. W tej grupie 2 szczury padly dnia 44, a 2 pozostaly w tym czasie zywe i zo¬ staly usmiercone. U wszystkich 4 zaobserwowano objawy przerzutów.Druga grupa pieciu szczurów otrzymala w cza¬ sie resekcji nowotworu pojedyncza dootrzelonowa dawke 30 mgAtg polimeru z przykladu Ila (OP/t imi¬ du). W tej grupie nawrót nowotworu wystapil u 2 szczurów 33 dnia po resekcji, a u trzeciego 40 43 dnia Po 55 dniach 3 z 5 szczurów (63(V#) mialo na¬ wrót nowotworów. Trzecia grupa 6 szczurów otrzy¬ mala w czasie resekcji pojedyncza dootrzewnowa dawke 30 mg/kg polimeru z przykladu VII, tablica.VI-1, zawierajacego 5tyo funkcji amidowej. Dmca 55 50 dwa sposród tych szczurów padly (bez nowotworu), a badania nde wykazaly objawów przerzutu.Czwarta grupa 6 szczurów otrzymala w czasie resekcji nowotworu pojedyncza dootrzewnowa daw¬ ke 30 imgi/kg polimeru z przykladu VII, tablica w VI-a, zawierajacego 2H,7l% imidu. W tej grupte je¬ dno zwierze, mialo nawrót nowotworu 21 dnia, a drugie 43 dnia. Wszystkie byly zywe po 55 dniach.Tak wiec nawrót wystapil u 2 na 6, co stanowi 33Vt. 60 Przyklad XVII. W przykladach XIII—XVI stosowano polimery dawkowane przez injekcje do jamy otrzewnowej. Niniejszy przyklad ilustruje u- zytecznosc kompozycji zawierajacej Amid w zapo¬ bieganiu lub opóznianiu wystapienia nawrotu przy w podawaniu doustnym w czasie resekcji. W przy-128 1«0 35 kladzie XVI odnotowano, ze u zwierzat kontrol¬ nych, nie otrzymujacych leku w czasie resekcji nowotworu, przecietny czas nawrotu nowotworu wynosi 34 dni.Grupa 10 szczurów szczepu Fischer otrzymala * implant'nowotworu jak w przykladzie XIII. Roz¬ winiete nowotwory usunieto chirurgicznie 13 dni po implantacji i równoczesnie kazdego szczura in- tubowano dootrzewnowo 1 ml sterylnej wody z dawka 30 mgykg zawierajacego imid (21,7*/d) poli- 10 meru z przykladu VII, tablica VI-A. Obserwacje v nawrotu nowotworu prowadzono w ciagu 10 ty¬ godni. Jeden szczur padl w trakcie chirurgicznego usuwania nowotworu. W grupie pozostalych 9 ma¬ le nawroty nowotworu obserwowano u 7 zwierzat, dnia 42, 42, 42, 43, 46, 50 i 59 po wycieciu nowo¬ tworu. Dwa szczury byly wolne od nowotworu po 70 dniach.Przyklad XVIIL Celem badania bylo okre¬ slenie, czy wystawienie komórek nowotworu na dzialanie polimeru z przykladu VII, tablica VI-A zmienia ich antygenicznosc i/lub ma bezposrednie dzialanie cytotoksyczne na komórki nowotworu.Komórki nowotworu spreparowano z nowotwo¬ ru BLCa, opisanego w przykladzie XIII, przez wy¬ ciecie masy podskórnego nowotworu. Komórki przeprowadzono w zawiesine, przez lagodna tryp- syriizacje skrawków nowotworu. Oddzielone ko¬ mórki trzykrotnie przemyto zrównowazonym roz¬ tworem soli (BSS) i obliczono stosunek zywe/mar¬ twe. W tym punkcie uzyskano 90—95^/0 popula¬ cje komórek.Komórki nowotworu w stezeniu lXlWml w Ea- glesa minimalnej pozywce zasadniczej w Eearla BSS + 10*/t osocza plodu krowiego inkubowano polimerem z przykladu VII, tablica VI-A, w ilosci 30 mg/ml. Inkubacje prowadzono w 37°C w cia¬ gu 90 minut, po czym komórki odwirowano z za* wiesiny. Wirowanie prowadzono w ciagu 6 minut z szybkoscia odpowiadajaca 3100 g. Komórki po¬ nownie zbadano na zywotnosc, stwierdzajac, ze jej poziom pozostal taki sam, jak przed inkubacja.Procedure powtórzono w trzech oddzielnych ope¬ racjach.Komórki z tej próby wstrzyknieto podskórnie samcom szczura szczepu Fischer, w dawce IX10*.Pieciu zwierzetom wstrzyknieto komórki potrakto¬ wane polhnerem, dla porównania z próba na pie¬ ciu zwierzetach, które otrzymaly komórki nowo¬ tworu potraktowane jak powyzej, lecz bez dodat¬ ku polimeru. Wyniki zestawiono w tablicy XII.W czasie rozwoju nowotworu nie obserwowano róznlic miedzy zwierzetami. Równiez wzrost no¬ wotworu w obu grupach byl porównywalny. Z powyzszych prób wyplywa wniosek, ze w stoso¬ wanej ?dawce polimer z przykladu VII, tablica VI-A ¦Zl,7t/« imidu) nie ma bezposredniego wply¬ wu cytotoksycznego na komórki nowotworu BLCa.Ponadto, wstepna inkubacja komórek nowotworu z polimerem nie zmienia ich antygenicznosci. * Przyklad XIX. Bezposrednia toksycznosc za¬ wierajacego imid polimeru z przykladu VII, tablica VI-A oznaczono na normalnych samcach szczura szczepu Fischer. Iniekcje IP i IV polime¬ ru obejmowaly okolo 1 ml fizjologicznego roztwo- « 36 Tablica XII 15 20 29 30 35 40 45 50 55 Szczur nr 1 i 2 3 4 15 Kontrola i1) Dni do rozwinie¬ cia 2—3, cm nowotworu Ul u: 13 u 13! Zwierzeta testowe Dni do rozwinie¬ cia 2—3 cm nowotworu 1)1 : U J13 11 11 | 0) 1X108, komórki nowotworu nie inkubowane po¬ limerem, inokulacja SC (2) 1X106, komórki nowotworu wstepnie inkubowa¬ ne polimerem z przykladu VII, tablica VI-A, inokulacja SC ru NaCl, zawierajacego odpowiednia ilosc polime¬ ru. W celu oznaczenia toksycznosci, polimer po¬ dawano w dawce od 100 mg/kg do 1000 mg/kg, z przyrostem co 100 mgi/kg, kazda dawke grupie 5 zwierzat. Polimer podawano zarówno dootrzew¬ nowo, jak i dozylnie. Nie zaobserwowano toksy¬ cznosci i padania zwierzat przy stosowaniu poda¬ wania dootrzewnowego, do 30 dnia obserwacji na w sumie 50 szczurach. Jednakze zaobserwowano toksycznosc przy podawaniu polimeru w dawkach 890 mg/kg (droga dozylna) i wyzszych. U jednego z 5 zwierzat w dawce 800 mgi/kg, dwóch z 5 zwie¬ rzat w dawce 900 mgl/kg i czterech z 5 zwierzat w dawce 1000 mgi/kg, podanych dozylnie, wystapily drgawki i zwierzeta padly. Nie zanotowano tok¬ sycznosci lub padania zwierzat przy IV dawce 7100 mg/kg lub mniejszej w ciagu 30 dni obserwacji (35 zwierzat).Po 310 dniach obserwacji 85 szczurów, które przezyly zwierzeta próbne usmiercono i przepro¬ wadzono badanie zmian patologicznych, wizualnie i mikroskopowo, mózgu, pluc, serca, watroby, ne¬ rek i sledziony. Nie stwierdzono zwiazanych z le¬ kiem odchylen od normy w tkankach zadnego z tych narzadów.W innej próbie, toksycznosc powyzszego polime¬ ru, podawanego dootrzewnowo porównano z tok¬ sycznoscia w przypadku podawania doustnego. Po¬ limer z przykladu VII, tablica VI-A podawano w dawce 100 mg/kg, 500 mg/kg d 1000 mg/kg, mjek- cyjnie (IP) lub zglebnikiem (PO), kazda dawke grupie pieciu szczurów szczepu Fischer. Szczury obserwowano w ciagu 14 dni, nie odnotowujac pa¬ dniec lub objawów toksycznosci. Po 14 dniach wszystkie zwierzeta usmiercono, zarówno z grup otrzymujacych lek dootrzewnowo, jak i z grup otrzymujacych lek doustnie i poddano badaniom wizualnym i mikroskopowym pluca, mózg, serc*? watrobe, nerkiJ sledzione. Równiez iw tych ba¬ daniach nie zaobserwownao odchylen od normy w tkankach zadnego z organów.Przyklad XX. Polimery wytworzone sposo¬ bem wedlug wynalazku, opisane w przykladach III i IV, poddano ocenie na normalnych szczu¬ rach szczepu Lewis, na zdolnosc stymulowania od¬ powiedzi odpornosciowej, wyrazonej wzrostem li¬ czby komórek wytwarzajacych przeciwcialo 19-S37 128 160 38 (IgM) heterologicznych erytrocytów (czerwone ko¬ mórki krwi owcy, SRBC), standardowym sposobem Jerne Piaaue, patrz „Textbook of Immunology,,, J. T. Barret, C. V. Mosby Company, 1978 oraz ,,,1]™™!™)!©^", H. N. Eisen, Medical Department, Harper and Row Publishens Irtc, 1974. W typowej próbie, zwierze, w tym przypadku szczura szcze¬ pu Lewis immunizuje sie 1 ml rozcienczenia 1:5 przemytych. komórek SRBC w fizjologicznej so¬ lance, poprzez zyle ogonowa. Równoczesnie zwie¬ rzetom podaje sie dootrzewnowe injekcje wska¬ zanego polimeru w fizjologicznej solance. Po 4 dniach komórki sledziony immunizowanych zwie¬ rzat przenosi sie na plytki hodowli tkankowej, uklad agarozy z SRBC. Pozywka hodowli tkanko¬ wej podtrzymuje wzrost i wydzielanie przeciw¬ cial przez komórki syntetyzujace przeciwciala.Przeciwciala dyfunduja z komórek i lacza sie z sasiadujacymi erytrocytami. Dodaniem osocza nor¬ malnych swinek morskich wywoluje sie lize RBC które nie zostaly pokryte przeciwcialami, powo¬ dujac utworzenie 'klarownego obszaru (tarczki) wo¬ kól komórki tworzacej przeciwciala. Takie tarczki (PFC) liczy sie i wyraza liczba PFC na IX106 ko¬ mórek sledziony. Wyniki zsumowano w tablicy XIII. Wszystkie kompozycje polimerowe z tablicy XIII badano w dawkach 30 mgi/kg.Tablica XIII Polimer z przykla¬ du nr (kontrola) Ha III, IV-1 IV III, IV-3 III, IV-4 — iii, ivV <— .t III, IV-7V t— III, IV-8 III, IV-9 Procent imjldu ze sto- sjunku absor¬ pcji w IR imid/ yajmid u_ 0 W P$ ,11,5 16*5 16,0 PM 24,1 28,2 22,6 ,34,7 50,1 (Liczba zwie¬ rzat w ^prze¬ cietnej (16 10 ;e 16 ,10 ,10 6 10 6 10 6 10 10 IgM PFC/ ,1X10" komór¬ ki sle¬ dziony 568 1564 1446 , ,1478 ^620 (1770 1866 1968 1964 1992 1268 1664 926 wskaz- tfiik sty- Imula- fcji kon¬ trola = 1,00 1,00 %15 2,54 2,60 ,2y86 3,12 0,28 ft46 3,49 3,51 ,2,23 2,93 il,63 Przyklad XXTA. W dalszej serii prób oceniono wplyw .polimeru z przykladu VII, tablica VI-A na wytwarzanie przeciwcial IgM antygenu SRBC (metoda Jerne Piaaue, jak w przykladzie XX) (1) u i irt&rmakotch szczurów szczepu Lewis, któ¬ rym polimer podawano dootrzewnowo lub doust¬ nie oraz (2) u szczurów szczepu Lewis jako za*- stapienie funkcji grasicy. W przypadku (1) poste- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 53 60 powano jak w przykladzie XX, natomiast w przy¬ padku (2) na doroslych zwierzetach, w wieku 8 do 12 tygodni, przeprowadzono chirurgiczne wy¬ ciecie grasicy (Tx), polaczone z napromieniowa¬ niem calego ciala, (TBI), z nastepna repopulacja komórek szpiku kostnego (BM). Wyciecie grasicy, napromieniowywanie calego ciala i repopulacje ko¬ mórek szpiku kostnego przeprowadzano sposoba¬ mi standardowymi, jak opisano w publikacjach Falk, R. E. i inni, Surgery, pazdziernik 1958; Falk, R. C. i inni, Abstract, Canadian Society for Cli- nical Investigation, styczen 24—'27, 1978, Vancou- ver; oraz Falk, R. E. i inni, Abstract, Royal Col¬ lege of Physicians and Surgeons, styczen 25—28, 1978, Vancouver.TBI i repopulacje komórek szpiku kostnego przeprowadzano nastepnego dnia po wycieciu gra¬ sicy. Zwierzeta napromieniowywano zródlem 187Cs (Atomie Energy of Canada). Dawka radiacji jest w tym aparacie kalibrowana przez dostawce i roz¬ prowadzana równomiernie na calej powierzchni ciala zwierzecia umieszczonego w pojemniku. W celu repopulacji BM sporzadzano zawiesine poje¬ dynczych komórek szpiku kostnego, przez przemy¬ cie dlugich kosci udowej i piszczelowej szczura zrównowazonym roztworem soli, w 4°C. Komór¬ ki trzykrotnie przemyto w BSS i przeliczono w hemocytometrze, dla oznaczenia zywotnosci i od¬ powiedniego rozcienczenia. Komórki podawano dozylnie, stosujac prepararty o zywotnosci powy¬ zej 90°/o. Repopulacje BM przeprowadzano daw¬ ka IX108 komórek na szczura.Smiertelnosc zwierzat w sumarycznej procedu¬ rze Tx + TBI + BM byla mniejsza niz 10M. Ba¬ dania odpowiedzi przeciwcial IgM na SRBC prze¬ prowadzano po uplywie 6 tygodni od powyzszego zabiegu.Polimer z przykladu VII, tablica VI-A i SRBC podawano jak w przykladzie XX. Wyniki calosci próby przedstawiono w tablicy XIII-A.Przyklad XXI. Dziewiec polimerów o róz¬ nej zawartosci imidu (0 do 351%), identycznych z wieloma opisanymi w przykladzie XX, tablica XIII, poddano badaniom zaleznosci zdolnosci zapo¬ biegania nawrotom pierwotnego nowotworu, BLCa, po jego wycieciu, od procentowej zawartosci imi¬ du. Badania przeprowadzono na szczurach szcze¬ pu Fischer. Postepowano jak w przykladach XV, XVI i XVII, z tym, ze we wszystkich grupach dawkowych i w grupie kontrolnej stosowano po 10 szczurów, a kompozycje imidowe podawano w dawkach 3fo mg/kg i 15 mg/kg, injekcja dootrzew¬ nowa w 1 ml solanki. Grupa kontrolna otrzymala jedynie dootrzewnowo 1 ml solanki. Jedna grupa 10 zwierzat otrzymala doustnie, w dawce 30 mg/kg, polimer z przykladu VII, tablica VI-A (21/F/t imt- du), jak odnotowano. Wszystkie nowotwory usu¬ nieto chirurgicznie 11 dni po implantacji, a leki podawano w pojedynczej dawce nastepnego dnia PP. wycieciu nowotworu. Wyniki zsumowano w tablicy XIV. Interesujace, jest to, ze srednia licz¬ ba dni do nawrotu dla 10 zwierzat 'kontrolnych wyniosla 32,3, wobec sredniej dla kontroli (4 szczu¬ ry) z przykladu XVI 34 dni.128 160 39 40 Tablica XIII-A Produkcja przeciwciala IgM u szczurów szczepu Lewis Polimer Brak Przyklad VII, tablica VI-A Przyklad VII, tablica VI-A Brak Przyklad VII, tablica VI-A Przyklad VII, tablica VI-A Traktowanie zwierzat normalna nie traktowana kontrola normalne normalne Tx, 950R, BM kontrola ** Tx, 950R, BM Tx, 950R, BM Liczba Zwie¬ rzat 10 10 10 10 10 10 Dawka mg/kg sposób podania •— 30*) dootrzewnowo 30 *) doustnie •— 30*) dootrzewnowa 30 *) doustnie 'Przecietna pro- idukcja IgM IPFCV1X10« komórek sle¬ dziony 17!4,2 '836,0 865,6 73,6 '740,4 474,0 Wskaznik stymulacji kontrola = 1,00 w- 4,78 4,96 — 10,10 6,42 ? Podobne wyniki uzyskano z dawka 15 mg/kg ** Tx = Wyciecie grasicy R — Napromieniowanie calego ciala, w radach BM = Rekonstytucja iszpiku kostnego "Nr 1 2 3 4 5 6* 17 1 8 9 ao Zródlo polimeru, przyklad kontrola Ha III, IV-1 IV III, IV-4 VII, VI-A III, IV-6 — III, IV-7 III, IV-8 Procent irrridu . 10 5,3 6,5 16,5 £1,7 124,1 24,4 28,2 34,7 Dawkaf mg/kg , ?o 16 .30 15 ,30 ,15 30 ,15 j30 fto 15 \ 30 i 15 (30 ,'' 15 \ 30 16 Tabl X = 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ica XIV Liczba zwierzat z godni po wycieciu 2 3i 4 5 12 3 5 0 2 3 3 0 2 3 5 0 0 0 0 0 2 2 2 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13 0 13 5 0 10 1 2 0 0 2 2 0 112 nawrotem nowotworu w 6 7 8 10 — — 3 3/4 5 5 6 1 1 1 2 2 2 0 0 0 3 3 3 0 0 0 2 2 2 0 12 1 1 1 1 1 2 0 0 0 5 5 6 5 5 5 3 3 4 3 3 3 3 3 3 9 4 6 2 2 1 5 0 2 4 1 2 1 6 6 6 3 3 X ty- 10 5 7 i <3 3 2 5 0 3 4 1 2 3 6 6 7 4 4 * W próbie 6 dawkowanie doustne, w pozostalych dootrzewnowo. Kazda dawka podawana grupie 10 szczurów Przyklad XXII. 100°/o imid EMA (lepkosc wlasciwa = 0,66) z przykladu V-A oceniono na hamowanie wzrostu nowotworu, w niezaleznym laboratorium badawczym, stosujac nastepujaca procedure. srednicy) w pachwine samcom myszy szczepu Swisa. Injekcja dootrzewnowa w 0,5 ml solanki, we wskazanej dawce, w ciagu kolejnych 6 dni po implantacji nowotworu podawano polimer z przy¬ kladu V-A, we wskazanej dawce. Grupy po 5 my- Staly Sarcoma 180 implantowano trokarem (2 mm €5 Szy otrzymaly dawke 25, 50 i 1(00 mgi/kg, jak opi-41 128160 Tablica XV 42 Dawka leku mg/kgW . 25 kontrola ,, 50 kontrola 100 kontrola aoo kontrola 400 ko^trpla aoo kontrola Myszy na po¬ czatku e (5 5 , © 6 6 5 5 5 5 15 6 na koncu 5 5 6 5 6 a t 5 3 i5 0 i5 Przecietna waga, g na poczatku 27,0 27,6 ^26,8 fc'7,6 126,8 fe9,0 1 ' 1 1 tna koncu 131,4 512,2 34,0 82,2 BU) 32,3 60°/o zwierzat padlo (29,0 32,3 1001% zwierzat padlo 127,6 32,2 4l0fVfr zwierzat padlo 127,6 (- Przecietna waga wycietego nowotworu, mg 1074,4 985,4 7|24,4 &85,4 587,6 505,8 505,8 985,4 — Hamowanie Próba-/kontrola. fh —9 — +26 — -nie — NC<* — NC« — —• —- W Samce myszy szczepu Swiss, S-180 trokarem SC, dawka podawana w ciagu 6 kolejnych dni po wszcze¬ pieniu nowotworu, dootrzewnowo w 0,5 ml solanki. Zwierzeta usmiercono nastepnego dnia po ostat¬ niej injekcji leku <2 Nie obliczono, z powodu ostrej toksycznosci sano. Wyzsze dawki, 200, 400 i 8I0O mg/kg okazaly sie toksyczne, jak wskazano. Nastepnego dnia po pstatniej dootrzewnowej injekcji leku zwierzeta usmiercono, wycieto nowotwór d zwazono go. Pro¬ centowe hamowanie nowotworu obliczono .dzielac wage nowotworu u zwierzat traktowanych przez wage/ nowotworu u zwierzat kontrolnych. Wyniki zestawione w tablicy XV wykazuja brak aktyw¬ nosci IOW* imidu EMA.Przyklad XXIII. Korzystny polimer wytwo¬ rzony sposobem wedlug wynalazku poddano oce¬ nie na normalnych samcach szczura szczepu Le¬ wis na ewentualna czynnosc zwiekszania liczby otrzewnowych makrofagów i ich czynnosc fago¬ cytozy czasteczek lateksu polistyrenowego, która wykazano dla pewnej liczby modulatorów ukladu odpornosciowego, takich jak Bacillus Calmette-Gue- rin (BCG), kopolimerów piranu i innych tego ro¬ dzaju czynników.Czterem grupom po 6 doroslych, mlodych (2—4 miesiecy) samców szczura i szczepu Lewis podano lek lub Toztwór solanki, jak nastepuje: grupa 1 •trzymala 1 ml solanki dootrzewnowo; grupa 2 otrzymala polimer z przykladu VII, tablica VI-A w dawce 3*0 mg/kg, dootrzewnowo w 1 ml solan¬ ki; grupa 3 otrzymala polimer z przykladu VII, tablica VI-A w dawce 30 mg/kg, dootrzewnowo w 1 ml solanki, a grupa 4 otrzymala 0,1 mg BCG, dootrzewnowo w 1 ml solanki.Dnia 1, 3 i 5 po podaniu, w kazdej z powyz¬ szych 4 grup usmiercono po 2 zwierzeta i pobra¬ no komórki z jamy otrzewnowej. Pobieranie prze¬ prowadzono w nastepujacy sposób: Dootrzewnowa injekcja wprowadzono 100 ml oziebionej pozywki RPMI 1^40 i po lagodnym masazu odprowadzono calosc rcieezy otrzewnowej., a komórki z kazdej po¬ jedynczej jamy otrzewnowej oddzielono przez od¬ wirowanie z 6#Ekoscia 1006 obrotów na minute, fcomórki zabarwiono NSE (niespecyficzna este- 30 40 45 90 55 60 65 raza) i trzykrotnie przemyto oziebiona (4°C) po^ zywka. Wreszcie komórki z kazdej pojedynczej ja¬ my zawieszono w 10 ml pozywki i przeliczono, uzyskujac przecietna liczbe komórek, które w 80»— 95*/t stanowily makrofagi otrzymane z kazdej ja*- my otrzewnowej, jako funkcje typu zabiegu i cza¬ su (dni), jaki uplynal od zabiegu.Czynnosc fagocytozy czasteczek lateksu kazdej partii komórek jamy otrzewnowej oznaczono jak nastepuje: Sporzadzono zawiesine powyzszych ko¬ mórek o stezeniu 40—QQ milionów komórek w 1 ml 50% osocza plodu krowiego + pozywka RPMI, w 5 ml probówce. Do zawiesiny dodano 100 lambda tj. 0,1 ml lateksu polistyrenowego (10^/t skladnika stalego, srednica czastki = 1 mikrometr, Dow Diagnostics, Indianapolis, Indiana), a miesza¬ nine inkubowano w ciagu godziny w 37°C. Na¬ stepnie komórki odwirowano, trzykrotnie prze¬ myto pozywka RPMI i ponownie • zawieszono w 0,5 ml solanki. Zawiesine naniesiono na plytki i zbadano pod mikroskopem, w celu okreslenia za¬ kresu fagocytozy czasteczek lateksu do komórki makrofagowej. Komórki które zawieraly 10 lub wieksza liczbe czasteczek lateksu uznano za do¬ datnie. Sumaryczna liczbe takich komórek (tj. zawierajacych 10 lub wiecej czasteczek lateksu) wyrazono jako procent sumarycznej liczby komó¬ rek w zawiesinie.Dane, uzyskane w próbie wykonanej podwójnie, przedstawiono w tablicy XVI. Z danych tych wy¬ nika, ze korzystny polimer wedlug wynalazku nie zwieksza liczby makrofagów otrzewnowych w sto¬ sunku do wartosci kontrolnej, przy podawaniu do¬ otrzewnowym lub doustnym i ze czynnosc fago¬ cytozy lateksu takich magrofagów otrzewnowych nie zwieksza sie w stosunku do normalnej czyn¬ nosci makrofagowej. Natomiast inne modulatory ukladu odpornosciowego, jak wykazuja dane uzy¬ skane dla BGG, znacznie zwiekszaja liczbe rriakro-128 160 43 44 fagów, a makrofagi wykazuja znacznie zwiekszo¬ na czynnosc fagocytozy lateksu. Ta wysoka czyn¬ nosc zmniejsza sie do wartosci normalnej po u- plywie 3 dni lub dluzszym czasie.Powyzsze dane wykazuja, ze polimery wedlug wynalazku nie zwiekszaja czynnosci makrofago- wej, natomiast wyniki uzyskane w przykladach XX i XX-A wykazuja, ze polimery te dzialaja jako modulatory komórek B u zwierzat normalnycn i stymuluja produkcje przeciwcial przez komór¬ ki B, przy podawaniu dootrzewnowym lub do¬ ustnym. Ponadto, powyzszy efekt obserwuje sie nawet przy braku czynnosci grasicy, co wskazuje, ze polimery wedlug wynalazku zastepuja czynnosc grasicy w aktywowaniu komórek B dla zwiek¬ szenia produkcji przeciwcial.Zastepujac materialy stosowane w poprzednich przykladach innymi materialami równowaznymi 10 13 mozna przeprowadzac dalsze próby ilustrujace wy¬ nalazek.Tak wiec etylen mozna zastapic równowazna iloscia propylenu, uzyskujac zasadniczo podobne wyniki. Z równiez podobnymi wynikami mozna zastapic bezwodnik maleinowy bezwodnikiem cy- trakonowym.Polimery o jeszcze nizszym ciezarze czasteczko¬ wym mozna otrzymac przez frakcjonowanie rozpu¬ szczalnikiem i inierozpuszczalnikiem polimeru EMA otrzymanego w przykladzie I. Polimerem o niz¬ szym ciezarze czasteczkowym mozna zastapic rów¬ nowazna ilosc polimeru z przykladu I, otrzymu¬ jac zasadniczo podobne wyniki.Inne dopuszczalne w farmacji sole imidów wy¬ tworzonych sposobem wedlug wynalazku mozna otrzymac przeprowadzajac sól amonowa np. w sól sodowa lub potasowa. Przykladowo, sól amo- Tablica XVI Liczba makrofagów otrzewnowych i ich aktywnosc, przy traktowaniu jak opisano w przykladzie XXIII Dzien usmiercenia 1 3 9 po podaniu leku Traktowanie kontrola (1,0 ml solanki) Przyklad VII, tablica VI-A /30 mg/kg, I/P.x 30 mg/kg, doustniex BCG, 0,1 mg, I.P. kontrola (1,i0 ml solanki) Przyklad VII, tablica VI-A 30 mg/kg I.PX 00 mg/kg doustniex BCG, 0,1 mg, I.P. kontrola (1,0 ml solanki) Przyklad VII, tablica VI-A 30 mg/kg, I.PX „ 30 mg/kg doustniex BCG, 0,1 mg, I.P Próba 1 iLiczba ko¬ mórek w /jamie ,(X 10«) 10 18 5 9 7 6 27 33 .; 5 6 3 6 6 J5 4 8 3 2 5 6 2 13 3 6 •Pobór la- teksu % ko¬ mórek za¬ wierajacych /ponad 10 czastek la- jteksu 25 31 27 27 27 31 97 97 8 11 11 8 20. 8 9 13 26 23 45 37 45 37 26 38 próba 2 Liczba ko¬ mórek w jamie (X 10«) 3 3 11 13 4 6 26 28 5 4 8 8 8 6 6 15 1 1 5 3 1 1 2 7 Pobór la¬ teksu »/» ko- miórek za¬ wierajacych | ponad 10 czastek lateksu 29 21 310 25 20 15 90 84 20 15 30 15 11 10 23 32 16 7 12 10 15 11 m 25 x Komórki typu limfocytów ekstrahowano ze sledziony, grasicy, wezlów chlonnych i szpiku kostnego wszystkich zwierzat traktowanych polimerem z przykladu VII, tablica VI-A. W zadnym przypadku nie zaobserwowano czynnosci fagocytozy lateksu wiekszej niz dla podobnych komórek otrzymanych ze szczurów kontrolnych45 128160 46 nowa z przykladu III, tablica IV, próba 4 mozna przeprowadzic w pól-amid, pól-wolny karboksyl, przez przepuszczenie 5*/* wodnego roztworu soli amonowej przez kolumne ze. slabo kwasnym ka- tionitem, np. jAmberlite IRC-84 (sieciowany ko¬ polimer akrylowy, Rohm and Haas Company).Otrzymany toztwór. polimeru z wolna grupa kar¬ boksylowa mozna nastepnie zobojetnic za pomoca NaOH lub KOH, a zobojetniony roztwór liofili¬ zowac, otrzymujac odpowiednia sól sodowa lub potasowa.Niskoczasteczkowy polimer z przykladu I mo¬ zna równiez przeprowadzic w pól-monometylowy, drugorzedowy. amid, pól-monometyloaminowa sól karboksylu, sposobem z przykladu Ha, dzialajac na acetonowy roztwór EMA acetonowym roztwo¬ rem me^yloaminy, a nie acetonowym roztworem amoniaku. Produkt mozna nastepnie poddac dzia¬ laniu wrzacego ksylenu, otrzymujac czesciowo N- -metylowany imid majacy oprócz funkcji imido- wejir funkcje drugorzedowego metyloamidu oraz funkcje zjonizowanej grupy COO" i funkcje kar- boksylanu aminy.Ponizej przedstawiono szczególowo dalsze przy¬ klady i uzyskane wyniki.Przyklad XXIV. W sposób podobny do opi¬ sanego w przykladzie I ©porzadzono niskoczastecz- kowy kopolimer propylenu z bezwodnikiem male- inowym. Reaktor zaladowano 196 g bezwodnika ma¬ leinowego, rozpuszczonego w 1600 ml etylobenzenu zawierajacego 7,30 g nadtlenku benzoilu. Tempe¬ rature doprowadzono do 276 kPa, przez wprowadzenie 42 g propylenu z butli zamontowanej na szali wagi. Cisnienie okolo 276 kPa i temperature reakcji 80°C utrzymywano w ciagu 19 godzin. Po zakonczeniu próby auto¬ klaw oziebiono i rozprezono, a zawiesine kopo¬ limeru propylen/bezwodnik maleinowy poddano obróbce jak opisano w przykladzie I, przez trzy¬ krotna ekstrakcje ksylenem i trzykrotna ekstrak¬ cje heksanem, przesaczenie i wysuszenie pod pel¬ na próznia pompy olejowej, w 6(0oC. Otrzymano 269 g produktu kpncowego (wydajnosc 87,3*/t), któ¬ rego 1!% roztwór w DMF mial w 25°C lepkosc wlasciwa 0,0590.Otrzymany produkt — kopolimer propylen/bez¬ wodnik maleinowy (I*MA) o malej lepkosci prze¬ prowadzono w pól-pierwszorzedowy amid, pól-sól amonowa, sposobem dokladnie jak opisano (dla EMA) w przykladzie Ha. Z 26,0 g PMA otrzy¬ mano 36,3 g (wydajnosc llS^/t) wysuszonego w suszarce (35°Ct 2606-^31333 Pa) produktu. Widmo w ^czerwieni wykazalo obecnosc jedynie pier- wszorzedowego amidu, zjonizowanej grupy karbo¬ ksylowej i grupy karboksylanu amonu. Brak bylo funlftjfi bitowej7 ' Pól-aniid, ^it-sól amonowa wytworzonego z PMA o lepkosci* wlalSciwSj *,0S9 przeprowadzono w kompozycje czesetowelo tólifd\i; sposobem opi¬ sanym w przykladzie III.'W%fiimowa próbk^ ami- du-^oli amonowej zawieszono w 400 ml ksylenu, a zawiesine utrzymywano w* clagtf" 3$ minut we wrzeniu pod chlodnica zwrotna ~ koncowa tem¬ peratura 139°C, zbierajac 1,1 ml wody. Miesza¬ nine przetworzono jak opisano powyzej, otrzymu- 10 15 20 25 40 45 jac 15,3 g produktu koncowego (wydajnosc 79,6°/o).Analiza w podczerwieni wykazala zawartosc imi- du 19,0*/», a ponadto obecnosc grup amidowych i karboksylanu amonu. Procent imidu okreslono 'na podstawie krzywej wzorcowej absorpcji imid/amid dla EMA, jak opisano w przykladzie V. Przed do¬ prowadzeniem i liofilizacja pH 2P/t roztworu wod¬ nego wynosila 5,43. Po doprowadzeniu do pH 9,5, przesaczeniu i liofilizacji wartosc pH wyniosla 5,50. Zawartosc azotu 10,26*/», a zawartosc imidu 19,0*/* wagowych, z oznaczenia w podczerwieni.Powyzszy zawierajacy' ugrupowanie imidowe po¬ limer PMA poddano ocenie na samcach szczura szczepu Fischer i stosujac nowotwór BLCa na wlasciwosci zapobiegania przerzutom i nawrotom nowotworu po wycieciu, jak opisano przykladach XIII i XV. 10 zwierzetom w grupie kontrolnej nie podano leku po wycieciu nowotworu (10 dni po implantacji), a 10 zwierzat otrzymalo dootrzew- nowo pojedyncza dawke 30 mg/kg w czasie wy¬ ciecia nowotworu. Wyniki zsumowano w tablicy XVII. kon¬ trola i Próbax n, W 10 Tablica XVII Przy- ipadki nawro¬ tu 10/10 ! Przy¬ padki padnie¬ cia Przy¬ padki prze¬ rzutów przy padnie¬ ciu 10/10 !10|/10 18—150 (nawroty) (nawroty) dni prze¬ cietnie 32,7 dni 3/10 48,67 Idni prze¬ cietnie 59 dni ' 3/fc 1/3 S|0—38 (nawroty) (nawroty) dni prze¬ cietnie 34,7 dni 61^70 dni prze¬ cietnie (66 dni Zwie¬ rzeta przezyj wajace w: 16 tygpd- tnau 1 is 7 50 * 30 mg/kg, pojedyncza dawka dootrzewnowa w dniu wyciecia nowotworu n = liczba zwierzat Przyklad XXV. W sposób podobny do opi¬ sanego w przykladzie I sporzadzono niskoczastecz- 65 kowy kopolimer etylenu z bezwodnikiem cytra- konowym. W tym przypadku reaktor zaladowano 228 g bezwodnika cytrakonowego, którym zasta¬ piono bezwodnik maleinowy; 1874 ml etyloben- zenu i 15,6 g nadtlenku benzoilu w 161 ml ety- •o lobenzenu. Cisnienie etylenu utrzymywano na po- poziomie okolo 1380 kPa, prowadzac reakcje w 70°C w ciagu 2i7,5 gddzin. Dalsze porcje kataliza¬ tora, po 10,4 g nadtlenku benzoilu w 108 ml ety- lobenzenu dodano w godzinie 3 i 20,5. Produkt — 85 kopolimer etylen/bezwodnik cytrakonowy przero-biono jak w przykladzie I, otrzymujac 73,5 g ma¬ terialu (wydajnosc 23,4%). Lepkosc wlasciwa ko¬ polimeru (1,0% w DMF, 25°C) = 0,042, 29,5 g, 0,21 mola kopolimeru etylen/bezwodnik cytrakonowy o malej lepkosci przeprowadzono w pól-amid, pól-sól amonowa, sposobem opisanym w przykladzie Ha. Otrzymano 37,0 g (wydajnosc 103%) produktu wysuszonego pod zmniejszonym cisnieniem. Analiza w podczerwieni wykazala obec¬ nosc grupy amidowej, zjonizowanej grupy karbo¬ ksylowej i grupy karboksylanu amonu, natomiast nie wykazala obecnosci .grupy imidowej. Czesciowy imid pochodnej sporzadzono sposobem wedlug przykladu IH, przez utrzymywanie w ciagu 30 mi¬ nut we wrzeniu pod chlodnica zwrotna zawiesiny 20 g powyzszego amidu-soli w 400 ml ksylenu. O- trzymano 115,7 g produktu (wydajnosc 83,0%) o sto¬ sunku absorpcji w podczerwieni l/A 1,21, co z po¬ równania z krzywa wzorcowa dla EMA, jak opi¬ sano w przykladzie III, odpowiada zawartosci imi- du 31,01%. Zawartosc azotu 0,24%, pH 9% roztwo¬ ru wodnego 5„3il.Powyzszy zawierajacy ugrupowanie imidowe ko¬ polimer etylen/bezwodnik cytrakonowy oceniono na samcach szczura szczepu Fischer, stosujac nowo¬ twór BLCa, na wlasciwosci przeciwdzialania nawrotom i przerzutom po wycieciu nawotwoiru, jak opisano w przykladach XIII i XV. Wyniki ze¬ stawiono w tablicy XVIII.Tablica XVIII n kontrola 10 Próba* 9™ / Przy¬ padki jinawro- *u wio IB—50 (prze¬ cietnie 132,7 dni 4/9 119^39 !dni •prze¬ cietnie 30 dni Przy- fpadki padnie- jcia 10/10 (na¬ wroty) AZ-&1 jdni Iprze- cietnie £9 dni m (na¬ wroty) 61—T78 dnji prze¬ cietnie »70,5 dni Przy¬ padki prze¬ rzutów pf/zy padnie¬ ciu |1 ((na¬ wroty) #4 (na- iwroty) Zwje- irzeta przezy¬ wajace w 16 tygod¬ niu !° 5 x 30 mg/kg, pojedyncza dawka dootrzewnowa, w dniu wyciecia nowotworu r KX jedno padniecie przy wycieciu nowotWoru ci = liczba zwierzat Przyklad XXVI. Przyklad opisuje wytwarza¬ nie kompozycji EMA o bardzo malym ciezarze czasteczkowym, przez frakcjonowanie rozpuszczal¬ nikiem i nierozpuszczalnikiem polimerów EMA z 160 48 przykladu I. Z osmiu róznych preparatów EMA zebrano lacznie 1264 g EMA, po suiszendoi w ciagu nocy w 80°C pod pelna próznia pompy olejowej.Lepkosc wlasciwa (11%, DMF, - 25?C) powyzszych 5 osmiu produktów EMA wahala si£ od 0,051 do 0;0l58 (przecietnie 0,053), a ekwiwalent wagowy przed frakcjonowaniem od 134 do 142. Kazda z osmiu prób rozpuszczono w 5010 ml acetonu i wy¬ tracono w 2,5 litrach toluenu, w 4 litrowej zlew- io ce, przy energicznym mieszaniu w ciagu 10 minut za pomoca mieszadla Lightning Stirrer. Wytraco¬ ny EMA odsaczono (zachowujac wszystkie 8 lugi macierzyste-przesacze do odzyskania rozpuszczone¬ go polimeru), a* material staly zawieszono jed- w nokrotnie w 2 litrach toluenu i dwukrotnie w 2 litrach heksanu, odsaczono i suszono w ciagu nocy w 50°C, pod pelna próznia pompy olejo¬ wej. Z osmiu indywidualnych prób otrzymano lacz¬ nie 1143 g nierozpuszczalnego w rozpuszczalnikach 20 EMA o przecietnej lepkosci wlasciwej 0,057 (prze¬ cietna z wartosci 0,053—0,0(6(0 dla 6 indywidual¬ nych prób).Frakcje polimeru uzyskanego przez rozpuszcza¬ nie go w acetonie i wytracenie toluenem, pola- 25 czome pierwotne lugi macierzyste-przesacze zate- zono do ciezkiego oleju, przez odparowanie ca¬ losci w obrotowej' wyparce prózniowej Rotavap, stosujac laznie z wrzaca woda i cisnienie obnizo¬ ne do 3333—3999 Pa. Pozostalosc rozpuszczono w 30 200 ml acetonu i wytracono do 1 litra toluenu, w temperaturze pokojowej, otrzymujac oleisto-gab- czasty produkt. Zdekantowano ciecz znad wytra¬ conego produktu, a sam produkt rozpuszczono w 200 ml acetonu i ponownie wytracono do 1,2 li- 35 tra ksylenu, w 0°C, otrzymujac material staly barwy bialej. Produkt odsaczono, dwukrotnie prze¬ myto 400 ml ksylenu i dwukrotnie 300 ml heksanu i suszono w ciagu nocy w 50°C, pod pelna próz¬ nia pompy olejowej. Otrzymano 159 g produktu o 40 lepkosci wlasciwej (1%, DMF, 26°C) 0,31, obliczo¬ nym ciezarze czasteczkowym 342 i ciezarze rów¬ nowaznikowym, oznaczonym przez miareczkowa¬ nie, 172,0. Zawartosc wegla 60,92, 60,61, zawartosc wodoru 6,03, 6,12%. i5 gramów powyzej frakcji EMA o lepkosci wla¬ sciwej 10,031 i ciezarze równowaznikowym 172 przeprowadzono w pól-amid, pól-sól amonowa, spo¬ sobem z przykladu Ila, otrzymujac po wysu$ze- 50 niu w suszarce (50°C, pompa prózniowa) 5,4 g produktu. 5 g poliamidu, pól-soli amonowej prze¬ prowadzono w czesciowy imid, sposobem z przy¬ kladu III, przez utrzymywanie w ciagu godziny we wrzacym ksylenie. Otrzymano 3,8 g suchego 55 (50°C, pompa prózniowa) produktu koncowego.Produkt rozpuszczono w 70 g wody (pH 4,87), a roztwór za pomoca NHapp doprowadzono do pH 9,4 przesaczono przez saczek o parach 20 mikro¬ metrów i liofilizowano. pH 2% wodnego roztworu w koncowego liofilizowanego produktu wynioslo 5,1 sumaryczna zawartosc azotu 12,27%, a zawartosc imidu 25,01% wagowych.Produkt poddano ocenie na czynnosc przedlu¬ zania przezywalnosci oraz zapobiegania nawrotom *5 i przerzutom po wycieciu nowotworu, jak opisa-128 160 49 no w przykladach XIII i XV. W badaniach za¬ stosowano szczury .szczepu Fischer 344 i nowotwór FBCa (Tablica XIX). kon- trolax Pró- bax-xx n Tablica XIX !Przy- ipa]dki nawro¬ tu1 10 ia/1'0 121—37 d!ni prze¬ cietnie 29,7 dni 10 Q/10 21^60 d!ni prze¬ cietnie '39,7 dni P-rzy- ipadki padnie¬ cia 10/10 (ina- wroty) <'45—64 !dni (prze- Icietnie /53',7 dni e/6 (na¬ wroty) 47—102 idni jprze- 7(1,7 dni (Przy- (padki \prze- |rzutów iprzy (padnie¬ niu ,10/10 ;(na- iwroty) !/6 (na- jwroty) Zwie¬ rzeta /przezy- iwajace I2i2< ty- igodnie 0 i 4 x Wyciecie nowotworu 11 dni po implantacji KX 3(0 mg/kg, pojedyncza dawka dootrzewnowa w dniu wyciecia nowotworu Produkt poddaino równiez ocenie na czynnosc stymulowania odpowiedzi immunologicznej, wy¬ razonej zwiekszeniem produkcji komórek wytwa¬ rzajacych przeciwcialo IgM czerwonych komórek krwi owcy (antygen), jako opisano w przykladzie XX, Otrzymano nastepujace wyniki (Tablica XX).Tablica XX Kontrola Próbax ^30 mg/kg, dootrzewnowo Liczba (szczu¬ rów w grupie ! 2 4 IgM- PFC7 1X'1 komó¬ rek isle- fdziany , €134 ,1173 Wskaz- niik tón- ,trola = 1,0 1,00 1,85 Przyklad XXVII. Wytwarzanie i wlasciwos¬ ci sodowych i potasowych soli imidów wytworzo¬ nych sposobem wedlug wynalazku.Sposobami wedlug przykladów I, Ila i III, ta¬ blica IV-5, sporzadzono sól amonowa o nastepu¬ jacych wlasciwosciach produktu liofilizowanego (Tablica XXI): 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 50 Tablica XXI Azot sumaryczny, °/o Azot w NH4+, p/t pH 2'°/» Toztworu wodnego Imid, °/e wagowych (z IR) NH4+, milirównowazników/g (elektroda NH3) 14,15, 6,16, 6,28 20,5 4,31 13,99 6,09 Sole sodowa i potasowa powyzszego imidu spo¬ rzadzono konwencjonalna technika wymiany jo¬ nów na jonicie Rohm and Haas, IRC-120, odpo¬ wiednio w postaci sodiowej i potasowej. Do odpo¬ wiedniej wielkosci kolumny zaladowano 400 ml IRC-120 (postac H+), a w postac Na+ przeprowa¬ dzono przepuszczajac 3,8 litra 1,0 M roztworu NaCl (lub 1,0 M KC1, w przypadku sporzadzania soli potasowej), a nastepnie 4 litry wody. Roztwo¬ ry soli NH4+ polimeru zawierajacego grupy imido- we sporzadzono rozpuszczajac 5,0 g polimeru w 200 ml wody. Powyzsze roztwory doprowadzano do pH 8,0, za pomoca rozcienczonego NaOH (lub KOH), po czym przepuszczano przez kolumny Na lub K, z szybkoscia przeplywu 15 ml/min, a na¬ stepnie przez kolumny przepuszczano wode, zbie¬ rajac w kazdym przypadku 500 ml wycieku. Wy¬ cieki za pomoca HC1 doprowadzano do pH 6,8— '7,0 i liofilizowano. Koncowe, suszone przez liofili¬ zacje sole mialy nastepujace wlasciwosci (Ta¬ blica XXII) Tablica XXII Postac soli: Wydajnosc, gx Azot sumarycz¬ ny, o/o NH4+, milirówno¬ wazników/g Konwersja soli NH4+, */o Chlor, °/a Na lub K, */o* NH4+ i !14,07 1 14,31 — — — Na+ ¦ 15,47 l 7,77 0,034 99,3 1,25 10,45 K+ 5,80 7,00 0,036 99,3 1,2.2 17,08 x z 5,00 g soli NH4+; zawiera NaCl lub KC1 z HC1 dodanego dla skorygowania pH Otrzymane sole poddano dwojakiego rodzaju o- cenie biologicznej, jak nizej opisano (a) Macierzysta sól NH4+ badano na szczurach szczepu Fischer 344, stosujac nowotwór FBCa; o- kreslano wplyw na przezywalnosc i wlasciwosci zapobiegania nawrotom i przerzutom nowotworu, jak opisano w przykladach XIII i XV. Otrzyma¬ no nastepujace wyniki zestawione w tablicy XXIII (b) Ocene stymulacji odpowiedzi odpornosciowej, wyrazonej zwiekszeniem liczby komórek wytwa¬ rzajacych przeciwcialo IgM heterologicznych ery¬ trocytów (SRCC, czerwone komórki krwi owcy) przeprowadzono jak opisano w przykladzie XX, otrzymujac nastepujace wyniki zestawione w ta¬ blicy XXIV.128 160 51 52 kon- trolax Pró- baxxx n Tabl Przy¬ padki nawro¬ tu 10 10/10 (3<0^h66 dni prze¬ cietnie 47,5 dni 10 3/10 $—59 dni prze¬ cietnie 49,3 dni ica XXIII Przy¬ padki padnie¬ cia 10/10 (na¬ wroty) 513—85 dni prze¬ cietnie 74,1 dni 3/3 (na¬ wroty) 56—86 dni prze¬ cietnie 75,0 dni Przy¬ padki prze¬ rzutów przy padnie¬ ciu 10/10 (na¬ wroty) 1/3 (na¬ wroty) Zwie¬ rzeta prze¬ zywa¬ jace 19 tygodni 0 7 x Wyciecie nowotworu 7 dni po implantacji k* 30 mg/kg, pojedyncza dawka dootrzewnowa, w dniu wyciecia nowotworu a = liczba zwierzat Tablica XXIV Typ soli polimeru Kontrola amonowa (NH4+) Kontrola sodowa (Na+)x potasowa (K+)x Kontrola sodowa (Na+)x potasowa (K+)x sodowa (Na+)xx potasowa (K+)xx Kontrola sodowa (Na+)x potasowa (K+)x sodowa (Na+)xx potasowa (K+)x* x 30" mg/kg podane dootrzewnowa xx 30 mg/kg podane doustnie /Liczba BZCfcU- trów w grupie 2 ,4 4 4 4 2 a 2 .3 3 6 5 5 6 6 IgM- PEC7 1X10« komó¬ rek isle- (dziony 500 1052 534 9710 1098 538 1373 996 11523 1058 541 1254 1044 1607 1003 •Wskaz¬ nik kontro¬ la- 1,0 1,00 2,10 1,00 1,82 2,06 1,00 2,55 1,85 2,83 1,97 1,00 2,32 1,93 2,97 1,85 Przyklad XXVIII. Ponizszym sposobem prze¬ prowadzono w pól-monometylo-drugorzedowy amid, pól-sól monometyloaminowa karboksylu niskocza- steczkowy EMA z przykladu I-E (lepkosc wlasci- 10 15 ao 35 40 49 50 55 60 wa = 0,06Q). Roztwór 43,9 g (0,312 mola) EMA w 440 ml acetonu cz.d.a. oziebiono do —78°C w mie¬ szaninie suchy lód-aceton. Do roztworu dodano 71 ml (54 g, 1,74 mola) skroplonej metyloaminy i 100 ml dodatkowego acetonu, dla umozliwienia skutecznego mieszania. Po doprowadzeniu zawie¬ siny metyloamidu-soli aminowej do temperatury pokojowej (w ciagu 2 godzin) mieszano ja w cia¬ gu nocy, przesaczono, a odsaczony material odmy¬ to od nadmiaru aminy przez mieszanie z trzema porcjami po 500 ml acetonu i suszono w ciagu nocy pod cisnieniem 2666—3333 Pa, w 35°C, otrzy¬ mujac 78,3 g (wydajnosc 123,9*°/©) pól-drugorzedo- wego metyloamidu, pól-metyloaminowej soli EMA.Produkt (210,10 g) zawieszono w 400 ml ksylenu i w ciagu 5 minut utrzymywano we wrzeniu pod chlodnica zwrotna, mieszajac i przepuszczajac przez zawiesine strumien metyloaminy i odprowa¬ dzajac w ten sposób 0,75 ml wody. Nierozpusz¬ czalny produkt odsaczono, mieszano jednokrotnie w 400 ml ksylenu i trzykrotnie w 400 ml heksa¬ nu, odsaczono i wysuszono w 400C, pod cisnieniem 2666^33133 Pa, otrzymujac 16,4 g (wydajnosc 85,2%) czesciowo N-metylowanej pochodnej imidowej.Widmo w podczerwieni wykazalo funkcje imido- wa przy 1700 cm-1 oraz obecnosc drugorzedowe- go metyloamidu przy 1645 cm-1,, zjonizowanej gru¬ py COO- i grupy karboksylanu aminy. Zawartosc imidu oznaczono na 17,0tyo, z krzywej wzorcowej absorpcji I/A dla niepodstawionego imidu-pier- wszorzedowego amidu, jak opisano w przykladzie V. Zawartosc azotu ll,41®/», a pH 2*/o roztworu wodnego 8,70.Powyzszy produkt z ugrupowaniem N-metylo- imidowym poddano badaniom na samcach szczu¬ ra szczepu Fischer 344, stosujac nowotwór FBCa.Oceniono wplyw na przezywalnosc i wlasciwosci zapobiegania nawrotom i przerzutom po wycieciu nowotworu, jak opisano w przykladach XIII i XV.Otirzymanfo nastepujace wyraitoL zestawione w ta¬ blicy XXV. n Tablica XXV Itu kon- 10 10/10 trola i8—50 (dni •prze¬ cietnie 3(2,7 dni Pró- 10 3/10 bax 35—40 1 idni 'prze¬ cietnie 37,3 dni 'Przy¬ padki pad¬ niecia 10/10 (na¬ wroty) prze¬ cietnie 59 dni 3/3 (na¬ wroty) prze¬ cietnie 72,7 dni Przy¬ padki prze¬ rzutów przy padnie¬ ciu 10/10 (na¬ wroty) ty3 (na¬ wroty) Zwie¬ rzeta prze¬ zywa¬ jace 16 tygodni 0 7 K 30 mg/kg, pojedyncza dawka dootrzewnowa, w dniu wyciecia nowotworu n = liczba zwierzat128 160 53 54 Wytwarzanie surowca EMA w instalacji piloto¬ wej W ponizszych dwóch przykladach opisano wy¬ twarzanie na wieksza skale surowca EMA i pro¬ duktu sposobem wedlug wynalazku.Przyklad XXIX. Wytwarzanie EMA. Zada¬ ny surowiec — kopolimer etylen/bezwodnik ma¬ leinowy (EMA) wytworzono w instalacji obejmu¬ jacej autoklaw z nierdzewnej stali o pojemnosci 578 litrów, 45,4 litrowy: pojemnik do wprowadza¬ nia pod cisnieniem, wylozony szklem mieszalnik z doprowadzeniem Na, w którym mieszano reagen¬ ty, mieszadlo turbinowe, 7,6 cm zawór wyladow¬ czy i plaszcz do ogrzewania lub chlodzenia. Przed zaladowaniem reagentów wszystkie trzy pojem¬ niki trzykrotnie przeplukiwano azotem. Do wy¬ lozonego szklem mieszalnika reagentów zaladowa¬ no 243,1 kg etylobenzenu i 29,9 kg bezwodnika ma¬ leinowego (MA). Mieszanine podgrzano do 50°C, do calkowitego rozpuszczenia materialu stalego.Do roztworu MA w etylobenzenie dodano roztwór 2340 g nadtlenku benzoilu w 20,9 kg etylobenze¬ nu, sporzadzony w oddzielnym pojemniku.Powyzszy etylobenzenowy roztwór reagentów do¬ dano do 578 litrowego autoklawu z nierdzewnej stali, utrzymywanego w 40°C, utrzymujac slaby przeplyw etylenu. Mieszadlo pracowalo z szybko¬ scia 125 obrotów na minute. Po dodaniu reagen¬ tów pojemnik splukano do autoklawu 2,27 kg ety¬ lobenzenu, odlaczono i zamknieto przewód doply¬ wowy. Po zaladowaniu zamknieto odpowietrzenie autoklawu i napelniono go etylenem do cisnienia okolo 414 kPa i utrzymywano pod tym cisnieniem w ciagu 5 minut. Cisnienie uszczelniajace utrzy¬ mywano na poziomie wyzszym o .172—345 kPa od cisnienia w reaktorze. Temperature wsadu dopro¬ wadzono do 75°C, przez utrzymywanie w ciagu 45 minut temperatury w plaszczu na poziomie 96°C, po czym reaktor napelniono etylenem do cisnie¬ nia okolo 10180 kPa. Czas zero odnotowano po do¬ prowadzeniu zawartosci reaktora do 75°C.Sporzadzono roztwór 1560 g nadtlenku benzoilu w 28,2 kg etylobenzenu i wlano do 45,4 litrowej cisnieniowej przystawki do dodawania katalizatora.Po 3 godzinach reakcji wsadu w 75°C, pod cis¬ nieniem etylenu okolo 1380 kPa, drugi raz dodano inicjator do autoklawu, a cisnieniowa przystawke przeplukano 1,8 kg etylobenzenu. Po drugim do¬ daniu nadtlenku benzoilu reaktor utrzymywano w 75° i pod cisnieniem okolo 1380 kPa w ciagu dal¬ szych 14 godzin, w sumie w ciagu 17 godzin. Po uplywie tego czasu reagenty oziebiono do 25°C, reaktor rozprezono i trzykrotnie przeplukano azo¬ tem.Zawiesine EMA w etylobenzenie wyladowano z reaktora przez zawór denny do ceramicznego fil¬ tra prózniowego Knutsche, wylozonego t bawelnia¬ na tkanina filtracyjna. Filtr nakryto plastikowym plaszczem i strumieniem azotu. "Wilgotny placek filtracyjny ponownie przeprowadzono w zawiesi¬ ne w 135,9 kg ksylenu, mieszano w ciagu 15 mi¬ nut i ponownie -praesaczomo. Mieszanie z ksyle¬ nem powtarEano trzykrotnie, a nastepnie trzykrot¬ nie mieszano prtedukt z (porcjami po 101,9 kg hek¬ sanu. Po ostatnim plukaniu heksanem wilgotny placek filtracyjny EMA rozlozono na tacach z nierdzewnej stali i pod zmniejszonym cisnieniem, w 50°C, suszono w ciagu 42—72 godzin w próz¬ niowej suszarce tacowej Devina, do zaniku za-' 8 pachu ksylenu. Kolcowy, wysuszony produkt uzy¬ skano w ilosci 35,3 kg, wydajnosc 82,8%. Lacznie przeprowadzono serie 4 prób ze wsadami róznej wielkosci Powyzszy opis dotyczy próby nr 3. (Ta¬ blica XXVI) Tablica XXVI Próba nr. 1 2 3 4 .Tempera¬ tura °C 70 75 75 75 Wydaj¬ nosc kg 1,1,3 22,6 35,3 11,3 Lepkosc wlasciwa l»/4-DMF- -25°C 0,063 0,053 0,051 0,052 Przyklad XXX. Wytwarzanie czesciowego 25 imidu amonowanego EMA Amonifikacje i imidyzacje EMA (produkt z przykladu XXIX) przeprowadzono w 378,5 litro¬ wym, wylozonym szklem reaktorze Pfaundlera, wyposazonym w mieszadlo lopatkowe i uklad prze¬ to grodowy oraz wezownice destylacyjna z nierdzew¬ nej stali i skraplacz, umozliwiajace calkowite od¬ prowadzanie skroplin i zawracanie dowolnej frak¬ cji destylatu do reaktora. Uklad wyposazono w dwa niezalezne przewody zasilajace, jeden do amo- 33 niaku, a drugi do cieczy, oba z wylotem ponizej powierzchni mieszanej mieszaniny reakcyjnej.Plaszcz reaktora jest dostosowany do ogrzewania sprezona para wodna lub chlodzenia. Przewód do¬ prowadzajacy cieczy polaczono z 04,6 litrowym, 40 wylozonym szklem reaktorem Pfaundlera, w któ¬ rym przed wprowadzeniem do 378,5 litrowego re¬ aktora amonowania wyjsciowy EMA rozpuszcza¬ no w acetonie. Koncowe produkty z 378,5 litro¬ wego reaktora odzyskiwano przez odprowadzanie, *s poprzez zawór dolowy, do zamknietego filtra próz¬ niowego z nierdzewnej stali, typu Knutszcha.Typowa sekwencja amonowania i czesciowego imidowania przedstawia sie nastepujaco: 378,5 li¬ trowy reaktor zaladowano 132,5 litrami (101,9 kg), so a 94,6 litrowy pojemnik roztwarzajacy 81,3 litra¬ mi (62,5 kg) przesaczonego acetonu, w obu przy¬ padkach pod azotem. Do 81,3 litra acetonu w po¬ jemniku roztwarzajacym dodano 21,3 kg kopoli¬ meru EMA (sporzadzonego jak w przykladzie w XXIX, próba 4) i mieszano w 20—30°C do calko¬ witego rozpuszczenia. Równoczesnie do 378,5 li¬ trowego reaktora wprowadzano w ciagu 5 minut, pod powierzchnie acetonu, bezwodny amoniak, z szybkoscia 0,158 kg na minute. Nastepnie pod 60 cisnieniem dodano acetonowy roztwór EMA, przez umieszczony w przewodzie filtr. Dodawanie pro¬ wadzono w ciagu 40 minut, z szybkoscia liniowa 2,08 kg/min, pod powierzchnie mieszanej w 378,5 litrowym reaktorze cieczy aceton-NHs. W czasie 85 dodawania EMA, w 378,5 litrowym reaktorze u- 1S128 166 55 56 trzymywano przeplyw amoniaku z szybkoscia i0,l'58 kg/min. Nie stosujac zewnetrznego chlodzenia, do¬ puszczono do wzrostu temperatury mieszaniny re¬ akcyjnej do 44—65°C. Przeplyw amoniaku z szyb¬ koscia 0,158 kg/min utrzymywano w ciagu 15 minut po dodaniu EMA. Zawiesine wytraconego, amonowanego EMA oziebiono do 2K°C i wylado¬ wano do filtru prózniowego, dla odzyskania sta¬ lego produktu amonowanego.Odsaczony produkt, pól-amid, pól-sól amonowa poddano dalszej obróbce, polegajacej na kolejnym mieszaniu (w ciagu 20 minut) trzykrotnie w 182 litrowych porcjach acetonu, z saczeniem miedzy kazda z operacji mieszania i dwukrotnie w 182 litrowych porcjach heksanu, uzyskujac na koncu wilgotny od heksanu placek filtracyjny. Próbka po¬ wyzszego produktu po wysuszeniu wykazala w IR obecnosc jedynie grupy amidowej i grupy soli amonowej. pH 2% wodnego roztworu = 5,88.Przeprowadzono lacznie 5 operacji amonifikacji, stosujac rózne ilosci EMA, jak podano ponizej.Powyzszy opis dotyczy próby nr 5 (Tablica XXVII). 10 15 20 w mieszaninie rozpuszczalników heksan-toluen- -ksylen ogrzewano do wrzenia, przy ciaglym prze¬ plywie bezwodnego amoniaku z szybkoscia 0,02 kg/rmiin. Wrzenie rozpoczelo sie w 82°C. Azeotro- powo odprowadzano calosc wody, a nastepnie hek¬ san, doprowadzajac temperature mieszaniny re¬ akcyjnej ,do 115°C. Temperature reakcji utrzymy¬ wano w 11*5—116°C, dodajac w miare potrzeby por¬ cjami mieszaniny 2 :1 toluen/ksylen w trakcie od¬ prowadzania wody powstajacej w procesie imido- wania w tej temperaturze. Ogrzewanie we wrze¬ niu kontynuowano w ciagu 7,5 godzin, azeotropo- wo odprowadzajac wóde i przepuszczajac amo¬ niak z szybkoscia 0,02 kg/min, do uzyskania za¬ danej konwersji do imidu, z oznaczenia analiza w podczerwieni (patrz tablica ponizej).Po uzyskaniu zadanej konwersji do imidu zawie¬ sine reakcyjna oziebiono, przesaczono jak wy¬ zej opisano, a wydzielony produkt z grupa imi- dowa poddano obróbce jak poprzednio, trzykrot¬ nie mieszajac w toluenie (154,4 kg, 20 minut) i dwukrotnie w heksanie (119,1 kg, 2i0 minut). Wil- Próba amonowa¬ nia nr Uzyty 'EMA ' kg Wilgotny placek po heksanie kg Tablica XXVII Sklad proszku suchego Bezwodnik Amid Sól NH4+ pH 2P/o roztworu wodnego azotu 1 i 4,44 NRX nieobecny obeany obecny 5y34 12,64 2 * 6,88 20,84 nieobecny obeany obecny 6,27 12,55 3 15.86 62,10 nieobecny obeany obecny 6,48 13,51 4 ,15,86 90,1 nieobecny obeany obecny 5,77 13,81 1 5 21,29 NR nieobecny obeany obecny 5,88 13,93 x Nr nie oznaczono Ponizszy wilgotny od heksanu placek amonowa¬ nego EMA uzyto bezposrednio w sekwencji imi- dowania procesu wedlug wynalazku. Ponizszy opis dotyczy imidowania' produktu uzyskanego w pró¬ bie amonowania nr. 5.Wilgotny od heksanu placek filtracyjny z próby 5 zaladowano do 378,5 litrowego reaktora zawie¬ rajacego 143,8 litra (124,5 kg) toluenu i 73,6 litra (62,5 kg) ksylenu. Zawiesine amonowanego EMA gotny placek po koncowym odsaczeniu hekaanu suszono na tacach z nierdzewnej stali, pod zmniej¬ szonym cisnieniem (pompa olejowa), w 50°C, w 45 ciagu 72 godzin lub do uzyskania cisnienia w suszarce ponizej 3 mm Hg w 50°C.W sumie przeprowadzono 4 próby wyzej opisa¬ nej sekwencji, oznaczone numeracja 1, 2, 4 i 5.Otrzymane wyniki zestawiono ponizej w tablicy 50 XXVIII.Tablica XXVIII Suszony w suszarce, zawierajace grupe imiidowa amonowany EMA Próba 1 2 3 5 Uzyty EMA kfe 4,44 6,88 15,86 21,29 Waga produktu kgx (»/t wyd.) 4,40 (67,6) 6,42 (77,1) 17,00 (89,8) 21,60 ,(84,0) f/t ^•ilmidu z IR 20,5 21,5 24,0 20,5 pH 2V«| roz¬ tworu wod¬ nego 5,3 5,4 5,3 15,26 Aj7-fit suma¬ ryczny Vt 13,26 13,33 13,12 13,26 jAzot NH4+ ' •/•¦ 5,11 5,22 5,01 4,94 Waga produktu isuszonego w suszarce w 50 C pod cisnieniem 3 mim Hg128 160 57 58 Wodne roztwory powyzszych suszonych w su¬ szarce produktów doprowadzano wodorotlenkiem amonu do pH 9,5, sterylizowano przez saczenie przez saczek o porach 0,2 mikrometra do ampu¬ lek i liofilizowano do koncowego uzycia. Ponizej przedstawiono koncowy sklad powyzszych czte¬ rech prób. Otrzymane wyniki róznia sie od wy¬ zej podanych, z powodu ponownego amonowania grup karboksylowych, które utracily amoniak w procesie suszenia w suszarce. (Tablica XXIX) Tablica XXIX Pró¬ ba 1 \2 * 15 tya imidu -4 IR 18,0 20,8 (18,5 |20,0 roztworu wodnego 5,96 16,00 ;6,69 16,46 iAzo«t J13,78 ,13,96 ,14,54 ,14,20 Azot w NH4+ i5,95 (5,74 •6,23 .6,13 1 Przyklad XXXI. Laboratoryjna synteza za¬ wierajacego grupe imidowa, amonowanego EMA, przez utrzymywanie we wrzacym ksylenie wilgot¬ nego po heksanie placka AEMA, bez uprzedniego suszenia Przy sporzadzaniu preparatów na skale labora¬ toryjna, rozpuszczony w acetonie EMA dodawano w róznej dlugosci czasie do acetonu, przez który z rózna szybkoscia przepuszczano gazowy amoniak, dopuszczajac do wzrostu temperatury z pokojo¬ wej (23^25°C) do 50—53°C. Wytracony amonowa¬ ny EMA odsaczono, wymieszano z acetonem, od¬ saczono, wymieszano z heksanem i odsaczono. Wil¬ gotny od heksanu placek amonowanego EMA roz- beltano w ksylenie, a zawiesine ogrzewano dla usuniecia wody w dwóch etapach, obejmujacych (a) azeotropowe odprowadzenie wody w 75—102°C, wzrost temperatury wynikajacy z reakcji NH3, oraz acetonu i (b) odprowadzenie wody powsta¬ jacej wskutek czesciowego imidowania amonowa¬ nego EMA w podwyzszonej temperaturze (122— 132°C), po usunieciu heksanu. Koncowy czescio¬ wy imid otrzymano przez odsaczenie i przemycie zawiesiny ksylenem i heksanem. Przeprowadzono 12 takich prób, a ich wyniki zsumowano w tabli¬ cy XXX. Powyzszy opis dotyczy próby nr 10., EMA z przykladu XXIX, próba 1 (280 g, 2,0 mola) rozpuszczono w 1,1 litra acetonu i przesa¬ czono przez bibule filtracyjna. Acetonowy roztwór EMA dodano w ciagu 4!5 minut, przy mieszaniu, 10 15 20 40 45 50 do 2,4 litra acetonu w 5 litrowej kolbie z chlod¬ nica zwrotna, wyposazonej w przystawke do aze- otropowego odprowadzania wody, naczynie do do¬ dawania odczynników i wlot amoniaku. Wlot amo¬ niaku i acetonowego roztworu EMA znajdowal sie ponizej poziomu cieczy w 5' litrowej kolbie. W ciagu 45 minut dodawania EMA i dalszych 10 mi¬ nut do zawiesiny reakcyjnej wprowadzono amo¬ niak, z szybkoscia 0,081 mola na minute, wpro¬ wadzajac lacznie 4,44 mola amoniaku. Dodawanie EMA rozpoczeto w temperaturze pokojowej (23°C i w ciagu calych 45 minut nie prowadzono chlo¬ dzenia, dopuszczajac do wzrostu temperatury. Kon¬ cowa temperatura zawiesiny amonowanego EMA w acetonie wynosila 53,5°C. Amonowany produkt odsaczono, dwukrotnie mieszano w 2 litrach ace¬ tonu (po 30 minut) i dwukrotnie w 2 litrach hek¬ sanu (po 30 minut) i odsaczono1. Wilgotny od hek¬ sanu placek ponownie zawieszono, bez suszenia, w 2,7 litrach ksylenu, dla usuniecia wody i cze¬ sciowego imidowania. Heksanowo-ksylenowa za¬ wiesine amonowanego EMA ogrzewano do wrze¬ nia pod chlodnica zwrotna, dla czesciowego usu¬ niecia wody w drodze azeotropowej destylacji.Operacje przeprowadzono dwuetapowo. W trakcie zabiegu przez caly czas w sposób ciagly przepusz¬ czano gazowy amoniak, z szybkoscia 0,|0i30 moli/ ,/min. Usuwanie wody rozpoczelo sie w 88°C i w ciagu 60 minut temperatura wzrosla do 101°C.Odprowadzono 9,1 ml wody. Kontynuowano ogrze¬ wanie z odpedzaniem heksanu, otrzymujac w 125°C wode powstajaca w wyniku tworzenia imi¬ du. Wode te odprowadzano azeotropowo w ciagu 60 minut, w temperaturze 125—132°C. Lacznie ze¬ brano 16,9 ml wody. Po imidowaniu zawiesine o- ziebiono do 100°C, przesaczono, przemyto przez mieszanie w ciagu 3i0 minut w 2 litrach ksylenu i nastepnie dwuklrotne mieszanie w 2 litrach hek¬ sanu (po 30 minut) i odsaczono. Odsaczony pro¬ dukt suszono w ciagu 15 godzin w 5i0°C, pod cis¬ nieniem obnizonym pompa olejowa do 400 Pa. U- zyskano 314 g produktu wysuszonego (wydajnosc 94,5%). W ponizszej tablicy przedstawiono- dane uzyskane w 12 takich próbach. Do koncowego uzy¬ cia wysuszony w suszarce produkt rozpuszczono w wodzie (2—5!%), za pomoca NH4OH doprowa¬ dzono roztwór do pH 9,5, przesaczono przez sa¬ czek o porach ^,2 mikrometra i liofilizowano w ampulkach. Wlasciwosci koncowego produktu, su¬ szonego w suszarce i liofilizowanego, sa przedsta¬ wiane w tablicy XXXI.Tablica XXX Warunki prób preparatywnych z przykladu XXXI 1 Pr°- I ba 1 1 2 Dokia- Wanie JIMA czas- -minutx *' 30 40/ Dodawanie amoniaku Czas laczny imhiut 13 100 100 Szyb¬ kosc moli/ /min 4 O,O60i 0,1064 Suma moli 5 6,0 6,4 Usuwanie wody nr lxx Czas imiin 6 90 120 mi 7 24,4 26,5 (Usuwanie wody iczas, •mfcn a 85 95 ml 0 6,6 8,2 Ilosc produktu wysu¬ szonego w suszarce g (wydajnosc */•) 10 | 312 (93,7) 309 (93,1) |59 128 160 60 c.d. tablicy XXX 1 1 ? 4 5 ,6 . 7 8 9 10 V 12 2 40 40 45 45 45 45 45 45 45 45 3/, 90 80 70 65 60 55 55 55 55 55 1 4 0,066 0,069 0,072 0,075 0,077 0,081 0,081 10,081 0,081 0,081 1 s | 5,95 5,5 5,05 4,83 4,60 4,44 4,44 4,44 4,44 4,44 * 1 125 115 85 85 715 160 60 60 60 60 7 25,4 22,6 14,9 12,1 10,4 8,7 8,3 9,1 9,6 7,6 B | 95 85 77 75 , 60 63 65 60 158 55 9 | 7,7 7,1 7,5 7,1 7,0 6,8 6,7 6,9 6,8 6,7 10 305 (92,3) 311 (913,7) 305 (91,9)' 513 (94,4) .313 (94,3) ' 1319 (96,3) 1319 (96,2) \314 (94,5) 315 (94,6) 312 ((94/)) x We wszystkich próbach stosowano 2,0 mola EMA z przykladu XXIX próba 1 xx Zakres temperatury 80 do 102°C xxx Zakres temperatury 122-^13&°C Tablica XXXI Wlasciwosci produktów z przykladu XXXI Pró¬ ba hr iT" 2 3 4 l» 16 7 8 9 10 (U VH2 Produkt suszony w suszarce pH */• roztwo- (ru iwod- pego 5,28 4,89 ,4,92 4,98 15,01 5,10 6,02 5,12 5,12 5,07 4,99 4,96 . )% wa¬ gowych imidux 21,5 23,2 25,2 23,2 22,8 23,5 23,0 24,0 23,5 22,5 22,2 23,2 ^Produkt liofilizowany pH ¦*/• proz- tworu wob mego */o wa¬ gowych imidu* 6,20 17,9 1 6,12 21,6 6,09 22,2 6,23 16,9 6,16 21,5 6,22 20,8 6£5 19,5 6,14 1(9,3 6,18 il9,0 6,016 18,1 6,18 19,0 6,10 19,5 1 x 2 widma w podczerwieni Mieszanina wszytstkich powyzszych partii (oko¬ lo 4000 g) rtóiala nastepujacy sklad: PfOdfat suszony w pH 2Pk roztworu wodnego suszarce: ' 5^ •*/» wagowych imidu 23,5 Produkt liofilizowa- oH 21%' roztworu wodnego ny: 6#0 '/• wagowych imidu 19,5 Dwie partie po 2000 g doprowadzono za pomoca NH4OH do pH 9,5, sterylizowano przez Baczenie i liofilizowano w ampulkach, w ilosci po 0,5 g w ampulce, do koncowego (uzycia w badaniach na ludziach lub zwierzetach. W sumie otrzymano $000 ampulek.Sklad ampulkowanego materialu w powyzszej duzej partii byl nastepujacy: pH 2M roztworu wodnego 6,27 Stosunek absorpcji imid/amid^ z podczerwieni 0,888 •/• wagowychimidu 19,3 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Azot sumaryczny, \V* 14,49 Azot jakoNH4+ 6,27 Przyklad XXXII. Imidowane polimery we¬ dlug 'wynalazku poddano ocenie na zdolnosc zwie¬ kszania liczby komórek produkujacych przeciw¬ cialo IgM heterologicznych erytrocytów (czerwone komórki krwi owcy, SRRC). Badania przeprowa¬ dzono na normalnych szczurach szczepu Lewis, za¬ sadniczo jak w przykladzie XX, z tym, ze kom¬ pozycje wedlug wynalazku .podawano dozylnie, do zyly ogonowej, w 1 ml fizjologicznego roztworu soli. Wyniki uzyskane w dwóch próbach przed¬ stawiono w tablicy XXXII.Ooi- zyjl- na daw- kai *n(g/kg T ablica XXXII Polimer z przykla¬ du VII, tablica VI-A ttgM |PFCV ¦* |/IX10« kjomó- irek sle¬ dziony Wskaz- dik 4tymti- lafcji kontro¬ la,- 1 Polimer z przykladu III, (tablica IV-5 IgM PFC/ /1X10« (Momó- trek sle¬ dziony Wskaz¬ nik sty¬ mulacji kontro- fta-1 0 (kom- 962* 1,00 522*x 1,00 trolai) 32 1298 2,31 1406 2,69 16 1138 2,02 1282 2,46 ^8 1215 2,16 16814 3,23 4 4178 2,10 1882 3,61 \ 2 1144 2,04 1238 2,37 1 125T7 2,24 1100 2,11 0£ 1173 2,09 1844 3,53 0,1 1021 1,87 1022 1,96 x 5 zwierzat w grupie xx 2 zwierzeta w grupie Przyklad XXXIII. Badaniom na ludziach poddano korzystna kompozycje wedlug wynalaz¬ ku — kopolimer etylenu z bezwodnikiem maleino¬ wym o ciezarze czasteczkowym okolo 850, prze¬ prowadzony w pólamid, pól-^sól amonowa; a na¬ stepnie czesciowo w imid (zawartosc grup imido-61 wych okolo 20°/o wagowych sumy grup), o wid¬ mie IR zasadniczo jak przedstawione na fig. 1.W ciagu kilku miesiecy w pierwszej fazie ba¬ dan klinicznych na 72 pacjentach z nowotworem przewodu pokarmowego (zoladka, trzustki, okrez- nicy i odbytu) nie -stwierdzono znaczacej toksycz¬ nosci leku przy podawaniu dootrzewnowym, do¬ ustnym lub dozylnym, jak równiez przyspieszonego rozwoju choroby po podaniu Jeku.Przyklad XXXIV. Zasadniczo podobne wy¬ niki otrzymuje sie zastepujac w przykladzie XXIV propylen równowazna iloscia izobutylenu.Przyklad XXXV. Zasadniczo podobne wy¬ niki otrzymuje sie zastepujac w przykladzie XXV bezwodnik cytrakonowy równowazna iloscia bez¬ wodnika dwumetylomaleinowego.Przyklad XXXVI. Zasadniczo podobne wy¬ niki otrzymuje sie zastepujac w przykladzie XXVI EMA o obliczonym przecietnym ciezarze czastecz¬ kowym 042 przez EMA o obliczonym przeciet¬ nym ciezarze czasteczkowym 300.Przyklad XXXVII. Zasadniczo podobne wy¬ niki otrzymuje sie zastepujac w przykladzie XXVI EMA o obliczonym przecietnym ciezarze czastecz¬ kowym 342 przez EMA o obliczonym przecietnym ciezarze czasteczkowym 1500.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania polimerycznych czynni¬ ków immunoregulacyjnych-pochodnych kopolime¬ ru skladajacego sie z monomeru olefinowego o 2—4 atomach wegla i bezwodnika «,6-nienasycone- go (kwasu wielokarboksylowego o 4—6 atomach wegla, zawierajacego grupy pól-amidu i pól-soli amonowej oraz grupy imidowe, znamienny tym, ze pól-amid, pól-sól amonowa kopolimeru o cie¬ zarze czasteczkowym 300—1500 poddaje sie reakcji z amoniakiem, dalej przeksztalcajac kopolimer tak, by zawieral grupy pól-amidu, pól-soli amonowej, 8160 62 jak równiez grupy imidowe, przy czym stosunek ilosci grup imidowych do wszystkich grup funk¬ cyjnych wynosi 5—4(0p/o- wagowych, a nastepnie ewentualnie, grupy pól-soli amonowej przeksztal- 5 ca sie w grupy innych farmaceutycznie dopusz¬ czalnych soli. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze reakcje prowadzi sie w srodowisku organicz¬ nego rozpuszczalnika, w temperaturze wrzenia pod 10 chlodnica zwrotna. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze jako organiczny rozpuszczalnik stosuje sie ksy¬ len lub toluen. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, 15 ze stosuje sie kopolimer, zawierajacy etylen jako monomer olefinowy. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, .ze stosuje sie kopolimer, zawierajacy bezwodnik maleinowy jako bezwodnik wielokarboksylowego 20 kwasu. 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie kopolimer, zawierajacy jako mono¬ mer olefinowy etylen, a jako bezwodnik wielo¬ karboksylowego kwasu bezwodnik \maleinowy. 25 7. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze stosuje sie polimer o srednim ciezarze cza¬ steczkowym okolo 850. & Sposób wedlug zastrz. 1 albo 5, znamienny tym, ze korzystnie wytwarza sie kopolimer zawie- 30 rajacy grupe pól-amidu, pól-soli amonowej. 9. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 5, znamienny tym, ze reakcje prowadzi sie do zawartosci 10— 251% wagowych grup imidowych w stosunku do sumy grup funkcyjnych. 35 10. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze reakcje prowadzi sie w temperaturze 50—200°C. 11. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze reakcje prowadzi sie w temperaturze 60—150°C. 12. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, 40 ze reakcje prowadzi pie w temperaturze 100— 150°C.128 160 D fugosc foli w mikronach G 7 8 2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 i 100 Liczba talowa . cm FIG. 2.Dtugosc fali w mikronach 6 7 8 9 100 90 80 70 h 60 50 40 30 | 20 10 2000 1900 1800 i?00 i600 1500 1400 1300 1200 1100 r —!" n— \ V JL- 1 1 1 '! ' ' | ! i/ / tir" k _L J r / ' ! A , \ \ 1 1 i 1 \ V V ' 1' ^ 1 — 1 T-y 1 / /' 1 / — -ICZba iOvOWG , Ci rn-1 FIG. 3. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Claims (1)

1.
PL1980221495A 1979-01-22 1980-01-21 Process for preparing polymeric immunocontrolling agents PL128160B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/005,638 US4255537A (en) 1979-01-22 1979-01-22 Polymeric immunoregulatory agents containing half-amide/half carboxy/imide groups

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL221495A1 PL221495A1 (pl) 1980-12-01
PL128160B1 true PL128160B1 (en) 1984-01-31

Family

ID=21716914

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL1980221495A PL128160B1 (en) 1979-01-22 1980-01-21 Process for preparing polymeric immunocontrolling agents

Country Status (33)

Country Link
US (1) US4255537A (pl)
JP (1) JPS55100322A (pl)
AT (1) AT368172B (pl)
AU (1) AU533497B2 (pl)
BE (1) BE881264A (pl)
CA (1) CA1140852A (pl)
CH (1) CH644874A5 (pl)
DD (1) DD148780A5 (pl)
DE (1) DE3002047A1 (pl)
DK (1) DK23780A (pl)
EG (1) EG14805A (pl)
ES (1) ES8102153A1 (pl)
FI (1) FI68060C (pl)
FR (1) FR2446843A1 (pl)
GB (1) GB2040951B (pl)
GR (1) GR68103B (pl)
HU (1) HU184229B (pl)
IE (1) IE49366B1 (pl)
IL (1) IL59172A (pl)
IN (1) IN151745B (pl)
IT (1) IT1193367B (pl)
LU (1) LU82099A1 (pl)
MA (1) MA18705A1 (pl)
MW (1) MW580A1 (pl)
NL (1) NL184900C (pl)
NO (1) NO158807C (pl)
NZ (1) NZ192649A (pl)
OA (1) OA06425A (pl)
PL (1) PL128160B1 (pl)
PT (1) PT70717A (pl)
SE (1) SE449490B (pl)
ZA (1) ZA80330B (pl)
ZM (1) ZM480A1 (pl)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4309413A (en) * 1979-01-22 1982-01-05 Monsanto Company Method of producing immune response by administering polymeric composition
US4397995A (en) * 1980-12-29 1983-08-09 Monsanto Company Polymeric anti-tumor agent and method of preparation
US4517329A (en) * 1981-06-17 1985-05-14 Monsanto Company Polymeric antitumor agent
US4510285A (en) * 1981-06-17 1985-04-09 Monsanto Company Terpolymeric antitumor agent
US4508866A (en) * 1981-06-17 1985-04-02 Monsanto Company Polymeric antitumor agent
US4501847A (en) * 1981-07-09 1985-02-26 Monsanto Company Polymeric antitumor agent
US4514340A (en) * 1982-08-30 1985-04-30 Monsanto Company Cyano-polycarboxylates
US4521344A (en) * 1982-08-30 1985-06-04 Monsanto Company Cyano-dicarboxylate
US4442298A (en) * 1982-08-30 1984-04-10 Monsanto Company Chemical synthesis of ethylene/maleic anhydride dimer with phenylethyl end group
JPS6143124A (ja) * 1984-08-06 1986-03-01 Japan Synthetic Rubber Co Ltd 抗体の製造方法
PT93772A (pt) * 1989-04-17 1991-01-08 Searle & Co Processo para a preparacao de composicoes para o tratamento de neoplasias, contendo um agente anti-neoplastico, por exemplo doxorubicina e um agente protector para reduzir os efeitos secundarios, por exemplo carbetimer
CA2997422A1 (en) 2015-09-14 2017-03-23 Saudi Arabian Oil Company Pendant epoxide polymers and methods of treating subterranean formations
EP3350279B1 (en) * 2015-09-14 2020-04-01 Saudi Arabian Oil Company Maleic anhydride polymers and methods of treating subterranean formations
CA3041532A1 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Saudi Arabian Oil Company Compositions and methods for sealing off flow channels in contact with set cement

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA664326A (en) 1963-06-04 E. Fields Joseph Polymeric electrolyte-containing composition
US2883287A (en) * 1957-01-28 1959-04-21 Monsanto Chemicals Treatment of produce
US3157595A (en) * 1959-09-16 1964-11-17 Monsanto Co Clarification of water with copolymers containing half-amides of olefinic anhydrides
GB1363512A (en) * 1971-03-25 1974-08-14 Ethylene Plastique Sa Adhesives based on copolymer of ethylene and maleic anhydride

Also Published As

Publication number Publication date
GR68103B (pl) 1981-10-30
IL59172A0 (en) 1980-05-30
CH644874A5 (de) 1984-08-31
JPS55100322A (en) 1980-07-31
FI68060C (fi) 1985-07-10
NL8000334A (nl) 1980-07-24
NO158807B (no) 1988-07-25
ATA28480A (de) 1982-01-15
IE49366B1 (en) 1985-09-18
NL184900C (nl) 1989-12-01
CA1140852A (en) 1983-02-08
NO800137L (no) 1980-07-23
NO158807C (no) 1988-11-02
NZ192649A (en) 1985-02-28
ZA80330B (en) 1981-03-25
GB2040951B (en) 1983-01-26
LU82099A1 (fr) 1980-08-08
ES487819A0 (es) 1980-12-16
IT1193367B (it) 1988-06-15
IN151745B (pl) 1983-07-23
DK23780A (da) 1980-07-23
BE881264A (fr) 1980-07-22
AU533497B2 (en) 1983-12-01
FI800158A7 (fi) 1980-07-23
PL221495A1 (pl) 1980-12-01
MW580A1 (en) 1981-03-11
OA06425A (fr) 1981-07-31
FR2446843B1 (pl) 1984-03-16
SE449490B (sv) 1987-05-04
PT70717A (en) 1980-02-01
AU5477680A (en) 1980-08-07
AT368172B (de) 1982-09-27
FR2446843A1 (fr) 1980-08-14
SE8000466L (sv) 1980-09-12
IE800114L (en) 1980-07-22
MA18705A1 (fr) 1980-10-01
ZM480A1 (en) 1981-06-22
EG14805A (en) 1985-06-30
ES8102153A1 (es) 1980-12-16
HU184229B (en) 1984-07-30
DE3002047A1 (de) 1980-07-31
IT8019343A0 (it) 1980-01-21
IL59172A (en) 1982-12-31
NL184900B (nl) 1989-07-03
JPH0159250B2 (pl) 1989-12-15
US4255537A (en) 1981-03-10
GB2040951A (en) 1980-09-03
DD148780A5 (de) 1981-06-10
FI68060B (fi) 1985-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL128160B1 (en) Process for preparing polymeric immunocontrolling agents
KR101052581B1 (ko) 음이온 결합성 중합체 및 그 용도
Chen et al. Modulation of calcium oxalate crystal growth and protection from oxidatively damaged renal epithelial cells of corn silk polysaccharides with different molecular weights
CS126491A3 (en) Polymeric mixture, process for its preparation and a pharmaceutical containing said mixture
EP0606742B1 (en) Bile acid sequestrant
US4309413A (en) Method of producing immune response by administering polymeric composition
Hirano et al. Synthesis of antitumor‐active conjugates of Adriamycin or daunomycin with the copolymer of divinyl ether and maleic anhydride
CN104257887A (zh) 一种促进排铅的组合物及其应用
US5300288A (en) Composition and method for controlling cholesterol
EP0342544B1 (en) Anti-aids Virus agent
KR20010040236A (ko) 올리고당 유도체와 그 제조법
Abdel-Massih et al. The cytotoxic and anti-proliferative activity of high molecular weight pectin and modified citrus pectin
JP6251455B2 (ja) 関節リウマチ抑制剤，関節リウマチ予防剤，関節リウマチ治療剤及び関節リウマチ抑制用食品
Uglea et al. Biodistribution and antitumor activity induced by carboxymethylcellulose conjugates
RU2108797C1 (ru) Способ получения антивирусного препарата на основе днк
EP0066379A2 (en) Composition for combating herpes virus
EP0544321B1 (en) Use of substituted cinnamic acid polymers to treat AIDS
CN117402296A (zh) 一种治疗结肠炎的前药聚合物及制备方法与应用
EP1928247A2 (en) Composition and use of phyto-percolate for treatment of disease
KR100209180B1 (ko) 아세만난을 포함하는 약제학적 조성물
MXPA01002665A (en) Inhibition of toxic materials or substances using dendrimers
Lukić et al. Inhibition of prostaglandin synthesis potentiate in vivo immunostimulatory effects of splenic macrophages