CN113801276A - 一种用于肿瘤放化疗协同治疗的纳米药物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于肿瘤放射性诊疗的纳米药物及其制备方法和应用，其由如通式(Ⅰ)所示的嵌段共聚物和前药组成，所述前药优选藤黄酸衍生物。其制备方法为：制备聚合所需大分子引发剂及单体，利用大分子引发剂引发单体进行聚合反应得到嵌段共聚物；通过酯化反应连接两个药物得到前药。所述共聚物负载前药后实现肿瘤的放化疗结合治疗。通过制备具有长循环时间以及极低正常组织摄取的聚合物体系，该嵌段共聚物可实现其在肿瘤内部的有效富集，结合所负载的前药，在肿瘤乏氧微环境中实现药物的有效释放及放疗增敏，有效抑制肿瘤生长。
Figure DDA0002537562710000011

Description

一种用于肿瘤放化疗协同治疗的纳米药物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种用于肿瘤放化疗协同治疗的纳米药物及其制备方法和应用，更具体涉及一种用于修饰药物的嵌段共聚物、藤黄酸药物的修饰方法及其用途等。
背景技术
癌症是由突变细胞产生的疾病，这种突变细胞具有无限增殖和逃避细胞凋亡的能力，最终导致肿瘤形成并侵入周围组织(也称为转移)。在当今社会，尽管大规模的金融和智力投资投入到预防和治疗癌症，癌症仍然是世界上威胁人类健康的疾病。因此，找到更好的癌症治疗方法来补充和改善目前的癌症治疗方法意义重大。
化疗是利用化学药物阻止癌细胞的增殖、浸润、转移，是一种全身性治疗手段。市场上现存的化疗药物可以分为烷化剂类、金属铂类、抗代谢类、抗生素类、植物提取类、激素类、单抗以及肿瘤辅助用药免疫刺激剂等。由于化疗药物的选择性不强，在杀灭癌细胞的同时也会不可避免地损伤人体的正常细胞，从而出现药物的不良反应。
放射疗法(RT)是一种有效的癌症治疗工具，并已广泛应用于当前的临床癌症治疗中。RT的治疗原理是高能电离辐射(如X射线和γ射线)直接与细胞DNA相互作用导致DNA损伤(DNA是决定放射生物学影响的主要目标)，或间接地，与水分子反应生成ROS(如超氧化物O2 ·-，过氧化氢H2O2，氢自由基H·，羟基自由基HO·和H2O·+)破坏DNA或其他细胞成分，诱导细胞凋亡和坏死。作为经典的癌症治疗方法，RT有其特定的优势，如无组织深度的限制。然而，RT的一些固有的缺点也限制了其长期的应用，它主要包括以下三个方面：1)用于杀死肿瘤的电离辐射可能会损害相邻正常组织，导致严重的毒副作用。2)在肿瘤微环境(TME)内的缺氧性质可能使肿瘤细胞耐辐射，最终导致肿瘤根除的失败。3)癌细胞内的抗氧化系统会通过淬灭过量的自由基起到破坏治疗的作用。以上这些缺陷降低了RT的效率。
高效放射增敏剂的开发已成为提高放化疗效果的最重要方法之一。小分子化学放射增敏剂中，亲电子化合物最有希望，因为辐射后选择性修复DNA损伤具有相对较高的生物安全性，例如尼莫拉唑、甘氨双唑钠(GS)和甲硝唑。硝基咪唑基官能化的纳米粒子已被广泛报道用于药物递送。由于低氧条件下的有效放射增敏能力和硝基咪唑化合物的缺氧触发结构转变，硝基咪唑修饰的纳米颗粒可同时实现放射增敏和将缺氧响应性药物递送至缺氧肿瘤。然而，由于生物利用度有限，特别是在肿瘤组织的缺氧区域，放疗的疗效仍需提高。
纳米药物应用了纳米技术协助治疗癌症，经过几十年的发展纳米粒子载药系统显示出了很多优点，包括：1)一般治疗药物为疏水性药物难溶于水只能低剂量进行输送，而纳米粒子可以以高剂量的状态输送治疗药物；2)在抵达靶向位点之前使药物保持其原有的药理活性，例如保护其免受胃酸或溶酶体等高酸性环境的破坏，从而延长药物在循环过程中的半衰期；3)可以针对细胞或组织以特定的方式递送药物，以便最大限度地提高治疗效果，减轻副作用；4)实现可控释放，包括释放量、释放时间，甚至可以实现按需释放来应对复杂的系统；5)可以同时递送多种类型的药物或诊断试剂进行联合治疗，具有克服多药耐药性和实时读出治疗效果的潜力。
发明内容
鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明的主要目的在于解决现有技术的缺陷，本发明提供一种用于肿瘤放化疗协同治疗的纳米药物及其制备方法和应用,嵌段共聚物用于前药的负载，应用于肿瘤放化疗协同治疗。通过制备具有长循环时间以及极低正常组织摄取的聚合物体系，该共聚物可实现其在肿瘤内部的有效富集，结合所负载的前药，该纳米药物具有高负载率，高放疗增敏率，从而实现放疗增敏，有效抑制肿瘤生长。
本发明的目的主要通过以下技术方案来实现。
本发明提供式(I)所示的嵌段共聚物：；
Figure BDA0002537562690000031
其中，R、R1和R2相同或不同，彼此独立地选自氢、C1-40烷基、C1-40烷氧基、C3-20环烷基、C6-20芳基、5-20元杂芳基；m为2-500的整数，优选10-300，进一步优选为50-200；n为10-30的整数，优选15-30，进一步优选为25-30；X为氟、氯、溴或碘。
根据本发明的实施方案，R、R1和R2均为甲基；m为113；X为溴；
第二方面，本发明提供所述式(I)所示嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：
化合物1与化合物2反应得到式(I)的共聚物；
Figure BDA0002537562690000032
其中，R、R1、R2、m、n和X独立地具有上文所述的定义。
根据本发明的实施方案，所述反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、乙腈、二氧六环、二甲基亚砜、四氢呋喃中的至少一种；
根据本发明的实施方案，所述反应在催化剂作用下进行，所述催化剂可以为卤化亚铜/有机碱体系，所述卤化亚铜选自溴化亚铜、碘化亚铜、氯化亚铜中的至少一种；所述有机碱选自五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)、2,2'-联吡啶、三(2-二甲氨基乙基)胺(Me6-TREN)中的至少一种；
根据本发明的实施方案，所述卤化亚铜与所述有机碱的摩尔比1:0.5-5，例如为1:0.8-3，示例性为2:2.5；
根据本发明的实施方案，所述反应中化合物1与化合物2的质量比为1:0.5-5，例如为1:0.8-3，示例性为100:95.7；
根据本发明的实施方案，所述反应中化合物1与催化剂的总摩尔比为1:0.5-5，例如为1:0.8-3，示例性为1:1.5；
根据本发明的实施方案，所述反应在惰性气体下进行，所述惰性气体为对反应呈现惰性的气体，例如为氩气、氮气。
根据本发明的实施方案，所述化合物1的制备方法，包括：
化合物1-1与化合物1-2反应的到化合物1；
Figure BDA0002537562690000041
其中，X、R1、R2和m独立地具有上文所述的定义；X1为氟、氯、溴或碘。
根据本发明的实施方案，所述化合物2的制备方法，包括：
化合物2-1与甲硝唑反应得到化合物2；
Figure BDA0002537562690000042
其中，R具有上文所述的定义；X2为氟、氯、溴或碘。
根据本发明的实施方案，式(I)所示共聚物的制备方法包括：
步骤(1)：制备聚合单体
Figure BDA0002537562690000051
步骤(2)：由mPEG5k制备具有原子转移自由基聚合(ATRP)活性的链转移剂；
步骤(3)：利用链转移剂分子引发单体聚合；
根据本发明的实施方案，所述步骤(1)包括将甲硝唑和三倍当量的三乙胺加入到反应瓶中，加入二氯甲烷溶解，再加入1.1倍当量甲基丙烯酰氯发生酰化反应。
根据本发明的实施方案，所述步骤(2)包括用mPEG5k和三倍当量的三乙胺加入到反应瓶中，加入二氯甲烷溶解，再加入10倍当量2-溴异丁酰溴发生酰化反应，生成ATRP链转移剂。
根据本发明的实施方案，所述步骤(3)包括利用任意具有活性自由基聚合活性的链转移剂分子单体引发聚合。
根据本发明的实施方案，所述步骤(3)所述的大分子链转移剂与单体的质量比为1:(1-3)；所述聚合反应的反应温度为55-70℃，反应时间为24-48小时；
根据本发明的实施方案，所述步骤(3)的反应是在氩气或氮气气氛下的有机相介质中进行的；所述有机相介质优选为DMSO或DMF。
第三方面，本发明还提供式(I)所示共聚物作为药物载体的应用，例如作为抗肿瘤药物载体的应用。
本发明还提供一种包含式(I)所示共聚物作为载体的药物。根据本发明的实施方案，式(I)所示共聚物负载前药得到所述药物；
根据本发明的实施方案，所述药物的制备方法包括：将式(I)所述共聚物和前药混合，溶解于无水DMF中，搅拌滴加到水中，透析，即得所述药物。
根据本发明的实施方案，所述药物为纳米级，其粒径为30nm-100nm，例如50nm-80nm。
根据本发明的实施方案，所述前药可以选自藤黄酸衍生物，优选的，为用酯键将藤黄酸和甲硝唑连接到一起的前药，其结构如式(Ⅱ)所示：
Figure BDA0002537562690000061
本发明提供式(II)所示前药的制备方法，包括：将藤黄酸与甲硝唑混合发生酯化反应。
根据本发明的实施方案，所述反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二氧六环、2-甲基四氢呋喃中的至少一种；
根据本发明的实施方案，所述反应可以在缩合剂存在下进行，所述缩合剂选自N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)中的至少一种；
根据本发明的实施方案，所述反应可以在催化剂存在下进行，所述催化剂选自4-二甲氨基吡啶(DMAP)。
本发明提供式(I)所示共聚物在制备药物中的用途；所述药物优选为抗肿瘤药物。
本发明还提供式(I)所示共聚物、式(II)所示前药在放疗增敏及化学治疗中的应用，例如用于抑制肿瘤生长。
有益效果
1、本发明所得到的聚合物属于一种纳米治疗试剂，其在体内具有长循环特性且具有X射线增强能力，能够有效用于放疗增敏；该共聚物能够有效负载前药，实现放化疗结合，有效杀死肿瘤。该纳米粒子可以通过自身结构特点以及利用其本身的增强的渗透与滞留效应(EPR)能特实现异性富集于肿瘤组织部位，并且该纳米粒子能够在乏氧环境下有效释放药物，同时在乏氧环境中选择性增强放疗，从而多方面地加强放化疗协同效果同时减少全身性毒性。
2、本发明针对嵌段共聚物设计了一种共聚物的制备方法，该方法设计巧妙、条件温和、操作简单、产率较高，能够扩大量生产，可有效应用于工业生产中。
3、本发明所得到的共聚物有效应用于肿瘤领域，尤其适用于于肿瘤的放化疗协同治疗。
附图说明
附图1为本发明实施例所述的单体的核磁谱图；
附图2为本发明实施例所述的链转移剂的核磁谱图；
附图3为本发明实施例所述的嵌段聚合物的核磁谱图；
附图4为本发明实施例所述的嵌段聚合物5k-b-1.2k的GPC流出曲线
附图5为本发明实施例所示的前药的核磁谱图；
附图6为本发明实施例所述的载药纳米粒子的粒径分布图；
附图7为本发明实施例所述的前药GM的HPLC校准曲线；
附图8为本发明实施例所述的不同给药组在常氧条件下的细胞存活曲线；
附图9为本发明实施例所述的不同给药组在乏氧条件下的细胞存活曲线；
附图10为本发明实施例所述的不同给药组在不同条件下的IC50值；
附图11为本发明实施例所述的不同给药组在常氧条件下的放疗增敏曲线；
附图12为本发明实施例所述的不同给药组在乏氧条件下的放疗增敏曲线；
附图13为本发明实施例所述的不同给药组放疗治疗后的肿瘤生长曲线；
附图14为本发明实施例所述的不同给药组放疗治疗后的体重变化曲线；
术语定义与说明
术语“C1-40烷基”应理解为优选表示具有1～40个碳原子的直连或支链饱和一价烃基，优选为C1-10烷基和C1-6烷基。“C1-10烷基”应理解为优选表示具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的直连或支链饱和一价烃基。“C1-6烷基”应理解为优选表示具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直连或支链饱和一价烃基。所述烷基是例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基等或它们的异构体。特别地，所述基团具有1、2、3、4、5或6个碳原子(即，C1-6烷基)，例如甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基，更特别地，所述基团具有1、2或3个碳原子(即，C1-3烷基)，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。
术语“C1-40烷氧基”指基团-OR，其中R为取代或未取代的C1-40烷基，其中“C1-40烷基”具有上文给出的定义。类似地，术语“C1-10烷氧基”指基团-OC1-10烷基，“C1-6烷氧基”指基团-OC1-6烷基，“C1-3烷氧基”指基团-OC1-3烷基，其中“C1-10烷基”、“C1-6烷基”和“C1-3烷基”具有上文给出的定义。具体的所述烷氧基包括但不限于：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基和1,2-二甲基丁氧基。
术语“C3-20环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，可以是螺环或桥环，其具有3～20个碳原子，优选“C3-10环烷基”。例如，术语“C3-10环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，可以是螺环或桥环，其具有3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。所述C3-10环烷基可以是单环烃基，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基或环癸基，或者是双环烃基如十氢化萘环。例如，术语“C3-6环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，可以是螺环或桥环，其具有3、4、5或6个碳原子。所述C3-6环烷基可以是，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、双环[1.1.0]丁基、螺戊基、螺[2.3]己基、双环[1.1.1]戊基、双环[2.1.0]戊基、双环[2.1.1]己基或双环[3.1.0]己基。
术语“C6-20芳基”应理解为优选表示具有6～20个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环，优选“C6-14芳基”。术语“C6-14芳基”应理解为优选表示具有6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环(“C6-14芳基”)，特别是具有6个碳原子的环(“C6芳基”)，例如苯基；或联苯基，或者是具有9个碳原子的环(“C9芳基”)，例如茚满基或茚基，或者是具有10个碳原子的环(“C10芳基”)，例如四氢化萘基、二氢萘基或萘基，或者是具有13个碳原子的环(“C13芳基”)，例如芴基，或者是具有14个碳原子的环(“C14芳基”)，例如蒽基。
术语“5-20元杂芳基”应理解为包括这样的一价单环、双环或三环芳族环系：其具有5～20个环原子且包含1-5个独立选自N、O和S的杂原子，例如“5-14元杂芳基”。术语“5-14元杂芳基”应理解为包括这样的一价单环、双环或三环芳族环系：其具有5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个环原子，特别是5或6或9或10个碳原子，且其包含1-5个，优选1-3各独立选自N、O和S的杂原子并且，另外在每一种情况下可为苯并稠合的。术语“5-6元杂芳基”应理解为具有5或6个环原子的一价单环芳族环系，其包含1-3各独立选自N、O和S的杂原子，并且其在每一种情况下可为苯并稠合的。特别地，杂芳基选自噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、噻-4H-吡唑基等以及它们的苯并衍生物，例如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基等；或吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基等，以及它们的苯并衍生物，例如喹啉基、喹唑啉基、异喹啉基等；或吖辛因基、吲嗪基、嘌呤基等以及它们的苯并衍生物；或噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基、蝶啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基等。
除非另有说明，杂芳基或亚杂芳基包括其所有可能的异构形式，例如其位置异构体。因此，对于一些说明性的非限制性实例，吡啶基或亚吡啶基包括吡啶-2-基、亚吡啶-2-基、吡啶-3-基、亚吡啶-3-基、吡啶-4-基和亚吡啶-4-基；噻吩基或亚噻吩基包括噻吩-2-基、亚噻吩-2-基、噻吩-3-基和亚噻吩-3-基。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1
嵌段共聚物PEG5k-b-PMN的制备和表征
反应步骤如下：
Figure BDA0002537562690000101
其中，x范围为10-40；
(1)单体的合成
将三口烧瓶放在120℃烘箱中烘干。在三口烧瓶中加入2g甲硝唑和50mL二氯甲烷，在冰浴的条件下搅拌使其溶解，再加入3.24mL三乙胺。在恒压滴液漏斗中加入5～10mL二氯甲烷和1.08mL 2-甲基丙烯酰氯，在冰浴条件下，缓慢滴入三口烧瓶中。滴加完毕后，搅拌1h。用蒸馏水萃取，旋蒸，除去有机溶剂，得到粗产物。用正己烷作流动相，过硅胶柱纯化产物。最终得到的产物真空干燥保存。D6-DMSO溶解10mg产物，1H NMR测定分析，结果如图1所示，核磁氢谱中的峰，全都成功归属，表明单体的成功合成。
(2)大分子链转移剂的合成
将100mL圆底烧瓶放在120℃烘箱中烘干，除水。在圆底烧瓶中加入2g(1mmol)mPEG5k和10mL二氯甲烷，搅拌使其溶解。在冰浴的条件下，加入417μL(3mmol)三乙胺，搅拌15min，快速加入378μL(3mmol)2-溴异丁酰溴，用塑封膜密封，反应2h，于室温下继续反应24h。
将反应液进行过滤，除去三乙胺，旋蒸除去滤液中的有机溶剂，残余物倒入冰乙醚中，静置沉淀，抽滤，滤饼于37℃真空干燥，得到所需产物PEG5k-Br。CDCl3溶解10mg产物，1HNMR测定分析，结果如图2所示，核磁氢谱中的峰，全都成功归属，表明大分子链转移剂的成功合成。
(3)嵌段聚合物的合成
基于ATRP反应机理，利用PEG5k-Br作大分子引发剂，引发含有甲硝唑的单体聚合，将洗净的Schlink管置于120℃烘箱中烘干。称取100mg PEG5k-Br，95.70mg甲硝唑的单体，4.333mg五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)加入到Schlink管，加入500μL二甲基甲酰胺(DMF)溶解。利用抽排装置“液氮冷冻-抽真空-通氩气-解冻”2次后，在氩气保护下迅速加入2.87mgCuBr，再经过1次“液氮冷冻-抽真空-通氩气-解冻”后，在氩气的保护下70℃水浴反应24h。
反应结束后，将反应液过硅胶柱纯化(用二氯甲烷作为流动相)，除去其中的CuBr及其氧化产物CuBr2。旋蒸浓缩后，用石油醚使聚合物沉淀，离心收集沉淀。最终得到聚合物PEG5k-b-PMN，真空干燥保存。
称10mg产物用D6-DMSO溶解，1H NMR测定分析，结果如图3所示，核磁氢谱中的峰，全都成功归属，表明聚合物的成功合成。并称取3mg产物，用1mL GPC流动相(流动相为DMF)溶解，用0.45μm滤膜过滤后用于GPC检测，结果如图4所示，峰型及定量结果均表示成功合成了分布较窄的聚合物。
实施例2
前药分子(GM)的合成与表征
反应步骤如下：
Figure BDA0002537562690000121
预先将50mL圆底烧瓶放入120℃烘箱中烘干，除净水分。四氢呋喃中加入金属钠、二苯甲酮指示剂，精馏除水2h，溶液呈现蓝色即为无水四氢呋喃。称取125.75mg(0.2mmol)藤黄酸(GA)，342.3mg(2mmol)甲硝唑(MN)，76.68mg(0.4mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)，48.84mg(0.4mmol)4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于5mL无水四氢呋喃(THF)，室温下反应24h。
反应结束后，将所得反应液转移至分液漏斗中，加入10mL去离子水，用10mL乙酸乙酯萃取3次，收集有机相。边搅拌边加入无水硫酸钠除水，抽滤除去固体，旋蒸得到粗产物。用乙酸乙酯：二氯甲烷(1:2，V/V)作流动相，过硅胶柱纯化产物。最终得到的产物为黄色固体，低温避光保存。CDCl3溶解5mg产物，1H NMR测定分析，结果如图5所示。核磁氢谱中的峰，全都成功归属，表明前药的成功合成。
实施例3
负载前药的纳米粒子的制备及表征
分别称取10mg聚合物PEG5k-b-PMN，5mg藤黄酸前药GM于1.5mL离心管中，再加入1mLN,N’-二甲基甲酰胺(DMF)使其充分溶解。2.5mL的注射器将配置好的溶液从离心管中吸出，利用恒流注射泵将溶液注入到快速搅拌状态下的5mL超纯水中，流速1.5mL/h。注射完毕后搅拌4小时，随后将溶液装入3500KD透析袋在超纯水中透析，除去有机溶剂N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)，每隔12h换一次超纯水，透析48h。透析结束后，用0.45μm滤膜过滤，4℃冰箱冷藏保存。
胶束的粒径大小通过DLS进行测定。DLS的测试方法为：取聚合物胶束样品1-1.5mL放入比色皿中，选择测试项目后在测试温度25℃下预热2min，然后进行测试，每个样品测量5次选取平均值，结果如图6所示。载药胶束PMNGM粒径为70-100nm，随着疏水链段分子量的增加，粒径减小，粒径分散指数PDI较小，说明胶束粒径分布较为均一。
实施例4
载药胶束载药量的测定
1)载药量的测定需用高效液相色谱仪(HPLC)，色谱级甲醇作流动相，需提前用孔径0.45μm的有机膜进行抽滤，超声2h脱气后方可使用。
2)前药GM标准曲线的测定：
称取2mg前药GM，加入2mL色谱级甲醇使其溶解，配置成1mg/mL的前药溶液。随后再逐级稀释至50μg/mL，40μg/mL，30μg/mL，20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL的浓度。用HPLC进行检测，制作前药GM标准曲线，图7所示。GM的标准曲线方程式如下：
峰面积＝-14102.08378+17415.04674×浓度(μg/mL)…………式(1)
式(1)拟合的线性曲线相关系数R值为0.99906，拟合度较高。
3)载药胶束前药GM载药量的测定：
将制备好的载药胶束水溶液放入冻干机中，冷冻干燥。称取1mg冻干的载药胶束溶于1mL色谱级甲醇，配成1mg/mL(其中包裹的前药浓度理论值为0.333mg/mL)的载药胶束。将1mg/mL的载药胶束稀释至10μg/mL(其中包裹的前药浓度理论值为3.33μg/mL)，用HPLC测定前药GM的浓度，通过前药GM标准曲线计算出载药胶束所包埋的前药质量。
4)计算载药率，药物载药率的计算公式如下：
载药率(％)＝m1/m2×100％...............式(2)
式(2)中，m1为载药胶束实际包埋前药的质量，m2为载药胶束理论包埋前药的质量。
经HPLC测得10μg/mL载药胶束(其中包裹的前药浓度理论值为3.33μg/mL)峰面积为27861，根据式(1)算得载药胶束中包埋的前药为2.41μg/mL，载药率为72.37％。
实施例5
MTT法细胞毒性检测
方法
将4T1细胞培养至生长对数期，用0.25％胰酶-EDTA将细胞全部消化下来，血细胞计数板计算细胞数量后，以5000细胞/孔的密度铺板，置于二氧化碳培养箱中培养24h。24h后，以培养基作溶剂配置浓度梯度为128μmol/L，64μmol/L，32μmol/L，16μmol/L，8μmol/L，4μmol/L，2μmol/L，1μmol/L，0.5μmol/L，0μmol/L的前药GM、藤黄酸、载药胶束及空载胶束溶液，按从低到高的浓度每孔加入100μL含药培养液，每种药物做6个平行组，给药24h。
按照MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说明书中的使用方法，进行后续处理。用酶联免疫检测仪在570nm处测定吸光度OD值，计算细胞存活率，并计算IC50值。细胞存活率公式见式(3)：
细胞存活率(％)＝(ODx–OD0)/(OD1–OD0)×100％...........式(3)
式(3)中，OD0：调零组的吸光值；OD1：阴性对照组的吸光值；ODx：各种样品的吸光值。
常氧条件下的细胞毒性按上述测定，乏氧条件下由于细胞不易生长，因此每孔铺15000～20000个细胞，在给药前6小时放入乏氧培养箱(1％O2，5％CO2，37℃)内培养，制造乏氧的环境后给药，给药后放入乏氧培养箱24小时，进行MTT细胞毒性测定。
结果
为了评估在不同条件下各种制剂的细胞毒性，进行MTT测定以测试4T1细胞活力。本实验分别测定了藤黄酸(GA)、前药藤黄酸-甲硝唑(GM)、载药胶束PMNGM以及空载胶束PMN的常氧及乏氧下的细胞毒性。根据实验所得结果显示，常氧条件下对应的的IC50值分别为1.808μmol/L、2.628μmol/L、6.006μmol/L、305.6μmol/L。GA、GM、PMNGM的细胞毒性相差不大，初步说明了通过酯键将甲硝唑与藤黄酸相连并没有破坏藤黄酸的药效，聚合物PEG5-b-PMN将前药包埋也可以在胞内有效地释放从而杀伤细胞。而空载胶束也对细胞有一定的抑制效果，生物相容性很好，但毒性并不明显。图8为四种药物的细胞存活曲线。
乏氧条件下GA、GM、PMNGM对应的IC50值分别为1.823μmol/L、1.232μmol/L、2.504μmol/L。可以看出在乏氧条件下前药和载药胶束的毒性都有所增大，主要原因可能是硝基在乏氧条件下被还原为氨基，一方面氨基带正电，促进了细胞的吞药，另一方面氨基亲水加快了纳米粒子的崩解而释放药物。空载胶束在给药剂量为128μM时仍然具有较高细胞存活量，因此基本认为载体无毒。图9为四种药物的细胞存活曲线。图10为常氧及乏氧条件下GA、GM、PMNGM对4T1的细胞毒性(IC50)比较。
实施例6
细胞放疗增敏实验
方法
将4T1细胞培养至生长对数期，用0.25％胰酶-EDTA将细胞全部消化下来，制成细胞悬液，取合适的细胞浓度接种于六孔板中，置于常氧培养箱培养24h左右。按照载药胶束的半数细胞致死浓度(IC50值)给药，在常氧或乏氧条件下培养24h后对4个六孔板细胞进行照射，照射剂量分别为0Gy，2Gy，4Gy，6Gy。照射完毕后，迅速将板放入4℃冰箱，防止肿瘤细胞的DNA自行修复。将照射后的4个六孔板以适当的稀释度接种于新的六孔板内。将接种好的六孔板置于常氧培养箱内培养，期间每隔2天更换一次培养基。在显微镜下观察六孔板内细胞状况，出现较为明显的菌落时，终止培养。用戊二醛(6.0％v/v)固定菌落，用结晶紫(0.5％w/v)染色，对菌落进行计数，分析辐射剂量-存活率曲线。
结果
为了定量阐明甲硝唑、载药胶束及空载胶束的放射增敏能力，我们测试了在常氧及乏氧条件下的不同辐射剂量下的细胞存活分数。对于形成的菌落数计数，计算出常氧和乏氧条件下，不同药物在当量浓度为2.0μmol/mL时在不同放疗辐射剂量下的细胞存活分数，得到图11、12。结果表明，不论是甲硝唑MN、前药GM还是载药胶束PMNGM在常氧环境下放射增敏效果不明显，放射增敏比(SER)均小于一。这与已报道的文献研究相符，甲硝唑在常氧下放疗增敏效果并不明显，其在缺氧条件下的增敏效果较为明显，这也说明了甲硝唑能够选择性的对常氧条件下的正常细胞不会起到增敏作用，从而提高了生物安全性。而在乏氧条件下，Control组明显表现出放疗抗性，尤其表现在细胞修复能力，这说明乏氧条件确实由于缺乏氧分子而使癌细胞的自我修复能力增强。而MN、GM、PMNGM、PMN都表现出明显的放疗增敏能力，其中前药与载药胶束的增敏能力最为明显，在2Gy时细胞存活分数分别降低至34.59％及42.68％，有文献报道2Gy时存活分数是代表细胞放射敏感性的重要指标，可能原因是藤黄酸在乏氧条件下可以将细胞周期阻滞在G2期，且有文献报道藤黄酸能够抑制一系列放疗耐性蛋白的表达，从而进一步发挥甲硝唑的放疗增敏能力，能够更多的与受损DNA结合，阻止DNA的修复。
实施例7
肿瘤生长抑制实验
方法
1)选用5周龄左右的BALB/C雌性小鼠，小鼠送到后在动物房饲养一周使其适应环境，然后将处于生长对数期的4T1细胞以1×107/100μL/只的浓度注射到小鼠后腿上方的皮下，建立皮下肿瘤模型，再饲养一周左右，待肿瘤长到250mm3左右进行实验。
2)将GA、GM、PMNGM、PMN和MN溶液以尾静脉注射方式给药，生理盐水作为空白组，每组设置五个平行组。每只小鼠每次注射100μL 5mg/kg藤黄酸浓度当量的各组药物，注射24h后给予3Gy放疗治疗。1、4、7、10天给药，每天称量小鼠体重并且测量小鼠肿瘤大小。给药结束后，依旧称量小鼠体重并且测量小鼠肿瘤大小。其中小鼠肿瘤体积计算公式如下：
V＝(L×W2)/2………………………………式(2-3)
上式中，L为肿瘤较长的边长，W为肿瘤较短的边长。
3)第15天对小鼠拍照，将小鼠眼球拔出取血，处死小鼠，解剖收集心、肝、脾、肺、肾、肿瘤等脏器，脏器放在多聚甲醛里储存。
结果
肿瘤生长曲线以及小鼠体重曲线如图13、14所示，从研究结果中我们观察到纳米药物PMNGM与单纯放疗组(RI)相比，抑瘤效果所具有的明显优势，肿瘤能够维持在较小的尺寸，证明所设计的纳米前药具有优异的放化疗协同作用。同时从体重曲线来看，副作用主要为放疗造成的全身损伤，说明纳米粒子有效减少了藤黄酸的副作用。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.式(I)所示的嵌段共聚物：
Figure FDA0002537562680000011
其中，R、R1和R2相同或不同，彼此独立地选自氢、C1-40烷基、C1-40烷氧基、C3-20环烷基、C6-20芳基、5-20元杂芳基；m为2-500的整数；n为10-30的整数；X为氟、氯、溴或碘；
优选地，m为10-300，进一步优选为50-200；n为15-30，进一步优选为25-30；
优选地，R、R1和R2均为甲基；m为113；X为溴。
2.权利要求1所述嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：
化合物1与化合物2反应得到式(I)的共聚物；
Figure FDA0002537562680000012
其中，R、R1、R2、m、n和X独立地具有上文所述的定义；
优选地，所述反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、乙腈、二氧六环、二甲基亚砜、四氢呋喃中的至少一种；
优选地，所述反应在催化剂作用下进行，所述催化剂可以为卤化亚铜/有机碱体系，所述卤化亚铜选自溴化亚铜、碘化亚铜、氯化亚铜中的至少一种；所述有机碱选自五甲基二亚乙基三胺、2,2'-联吡啶、三(2-二甲氨基乙基)胺中的至少一种；
优选地，所述卤化亚铜与所述有机碱的摩尔比1:0.5-5，例如为1:0.8-3；
优选地，所述反应中化合物1与化合物2的质量比为1:0.5-5，例如为1:0.8-3；
优选地，所述反应中化合物1与催化剂的总摩尔比为1:0.5-5，例如为1:0.8-3；
优选地，所述反应在惰性气体下进行，所述惰性气体为对反应呈现惰性的气体，例如为氩气、氮气。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述化合物1的制备方法，包括：
化合物1-1与化合物1-2反应的到化合物1；
Figure FDA0002537562680000021
其中，X、R1、R2和m独立地具有上文所述的定义；X1为氟、氯、溴或碘；
优选地，所述化合物2的制备方法，包括：
化合物2-1与甲硝唑反应得到化合物2；
Figure FDA0002537562680000022
其中，R具有上文所述的定义；X2为氟、氯、溴或碘。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，式(I)所示共聚物的制备方法包括：
步骤(1)：制备聚合单体
Figure FDA0002537562680000031
步骤(2)：由mPEG5k制备具有原子转移自由基聚合活性的链转移剂；
步骤(3)：利用链转移剂分子引发单体聚合；
优选地，所述步骤(1)包括将甲硝唑和三倍当量的三乙胺加入到反应瓶中，加入二氯甲烷溶解，再加入1.1倍当量甲基丙烯酰氯发生酰化反应；
优选地，所述步骤(2)包括用mPEG和三倍当量的三乙胺加入到反应瓶中，加入二氯甲烷溶解，再加入10倍当量2-溴异丁酰溴发生酰化反应，生成ATRP链转移剂；
优选地，所述步骤(3)包括利用任意具有活性自由基聚合活性的链转移剂分子单体引发聚合；
优选地，所述步骤(3)所述的大分子链转移剂与单体的质量比为1:(1-3)；所述聚合反应的反应温度为55-70℃，反应时间为24-48小时；
优选地，所述步骤(3)的反应是在氩气或氮气气氛下的有机相介质中进行的；所述有机相介质选自DMSO或DMF。
5.权利要求1所示共聚物作为药物载体的应用，例如作为抗肿瘤药物载体的应用。
6.包含权利要求1所示共聚物作为载体的药物；
优选地，所述药物为权利要求1所示共聚物负载前药得到的药物；
优选地，所述药物的制备方法包括：将式(I)所述共聚物和前药混合，溶解于无水DMF中，搅拌滴加到水中，透析，即得所述药物；
优选地，所述药物为纳米级，其粒径为30nm-100nm，例如50nm-80nm。
7.根据权利要求6所述药物，其特征在于，所述前药可以选自藤黄酸衍生物；
优选地，所述藤黄酸衍生物为用酯键将藤黄酸和甲硝唑连接到一起的前药，其结构如式(Ⅱ)所示：
Figure FDA0002537562680000041
8.权利要求7所述式(II)所示前药的制备方法，包括：将藤黄酸与甲硝唑混合发生酯化反应；
优选地，所述反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二氧六环、2-甲基四氢呋喃中的至少一种；
优选地，所述反应可以在缩合剂存在下进行，所述缩合剂选自N,N’-二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三氮唑、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐中的至少一种；
优选地，所述反应可以在催化剂存在下进行，所述催化剂选自4-二甲氨基吡啶。
9.权利要求1所述共聚物在制备药物中的用途；优选地，所述药物为抗肿瘤药物。
10.权利要求1所述共聚物、权利要求7所述药物在放疗增敏及化学治疗中的应用，例如用于抑制肿瘤生长。
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