DE2830901A1

DE2830901A1 - Reaktionsprodukte von methotrexat und divinylaether-maleinsaeureanhydrid- copolymerisaten, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE2830901A1
Application number: DE19782830901
Authority: DE
Inventors: Michael Przybylski; Helmut Ringsdorf
Original assignee: Hercules LLC
Current assignee: Hercules LLC
Priority date: 1977-07-16
Filing date: 1978-07-13
Publication date: 1979-02-01
Also published as: IT1113088B; US4182800A; CA1142691A; JPS5440896A; DE2830901C2; IT7825733A0; JPS6330886B2

Description

Reaktionsprodukte von Methotrexat und Divinyläther-Maleinsäureanhydrid-copolymerisaten, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Die Erfindung betrifft Reaktionsprodukte von Methotrexat und cyclischen Copolymerisaten von Divinyläther und Maleinsäureanhydrid, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Hemmung des Wachstums von malignen Tumoren.

Aus Divinyläther und Maleinsäureanhydrid in Molverhältnissen von 1:2 hergestellte Copolymerisate sind auf dem Fachgebiet an sich bekannt und es wurde bereits beschrieben, daß sie das Wachstum von Tumoren hemmen, siehe US-Patentschrift 3 224 94-3» daß sie Maul- und Klauenseuche verhindern, siehe US-Patentschrift 3 74-9 771, und daß sie die Infektion durch Herpesviren verhindern, siehe US-Patentschrift 3 859 4-33· Ein bevorzugter Typ von Copolymerisaten mit schmalem Molekulargewichtsbereich ist in der US-Patentschrift 3 794- 622 beschrieben.

Vorausgegangene, pharmakologische Untersuchungen mit den Copolymerisaten zeigten, daß die Toxzität, die Antitumoraktivität und der die Immunität erhöhende Effekt von dem Molekulargewicht und der Molekulargewichtsverteilung des Polymerisates abhängig sind. Darüber hinaus zeigten Divinyläther-Maleinsäureanhydrid—copolymerisate Aktivität gegenüber verschiedenen transplantierbaren Tumoren bei zu Experimenten herangezogenen Tieren, z.B. bei Lewis-Lungen-Karzinom und Adeno-Karzinom 755» die partiell gegenüber Methotrexat resistent sind.

Methotrexat ist ein chemisch brauchbares, chemotherapeutisches Mittel gegen Krebs. Seine chemische Formel ist:

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-N-^ O /-CO-NH-CH-

COOH

Methotrexat, d. h. N-(p-C2,4—Diamino-6-pteridiny!methyl]-methylaminobenzoyl)-glutaminsäure, wurde für die Behandlung von verschiedenen malignen wie auch nicht-neoplastischen Leiden seit zahlreichen Jahren klinisch eingesetzt. Beträchtliche günstige Effekte werden mit Methotrexat entweder als einzelnes Mittel oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen erzielt, z. B. "bei der Behandlung von Choriocarcinoma, akuter Leukämie "bei Kindern, Burkitt's Lymphoma und Brustkrebs. Trotz seines breiten Bereiches der klinischen Anwendung sind jedoch große Probleme mit seiner Verwendung verbunden. Die Toxizität gegenüber normalen Geweben, insbesondere gegenüber Knochenmark und dem kleinen Intestinum ist oft lebensbedrohend. Die Entwicklung der Resistenz nach der anfänglichen Anwendung wird häufig beobachtet. Methotrexat zeigt eine nicht zufriedenstellende Aktivität bei Tieren gegenüber mehreren festen Tumoren wie Lewis-Lungen-Karzinom. Weiterhin zeigt es schwere immuno-unterdrückende Effekte, die typischerweise innerhalb der Klasse von antimetabolischen, cytotoxischen Mitteln beobachtet werden. Eine große Anzahl von Strukturanalogen von Methotrexat mit niedrigem Molekulargewicht wurden in den letzten Jahren synthetisiert und untersucht, jedoch war für keines dieser Derivate der therapeutische Index, d. h. die relative Antitumorwirkung zu der toxischen Wirkung,demjenigen von Methotrexat überlegen.

Es wurde nun gefunden, daß Methotrexat chemisch mit Divinyläther-Maleinsäureanhydrid-copolymerisaten umgesetzt werden kann, wahrscheinlich durch Bildung einer Amidbindung zwischen einer Amingruppe des Methotrexates und einer Säuregruppe des Copolymerisates. Das erhaltene Produkt und seine physiologisch tolerierten Salze besitzen eine niedrigere Toxizität als Methotrexat selbst und eine höhere Antitumoraktivität als

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ein Gemisch der beiden Materialien.

Die Umsetzung von Methotrexat mit einem Copolymerisat von Divinyläther und Maleinsäur eaniiydr id soll in einem inerten Kolösungsmittel durchgeführt werden, besonders bevorzugt durch langsame Zugabe des Methotrexates zu einem Überschuß der Anhydridform des Copolymerisates. Typische inerte Kolösungsmittel, die bei der Herstellung gemäß der Erfindung brauchbar sind, sind Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Aceton, SuIfolan, Tetrahydrofuran, etc.. Wie zuvor beschrieben, wird besonders bevorzugt ein Überschuß des Copolymerisates, d. h. wenigstens 1,2 : 1 Anhydridgruppen zu Methotrexat, aufrechterhalten. Die Zeit und die Temperatur sind keine kritischen Bedingungen für die Reaktion und stellen für den Fachmann keine Schwierigkeiten dar. Im allgemeinen wird die Reaktion bei einer Temperatur oberhalb O ⁰C durchgeführt, und sie erfordert mehrere Stunden bis zum Abschluß.

Das Verhältnis von Methotrexat zu Copolymerisat in dem Reaktionsprodukt variiert in Abhängigkeit von dem Anhydridgehalt des Copolymerisates und der Reaktionszeit. Relativ höhere Mengen an Methotrexat können an ein Copolymerisat gebunden werden, wenn das verwendete Copolymerisat fast 100 % Anhydrid aufweist. Die Reinigung des erfindungsgemäßen Reaktionsproduktes kann nach üblichen Arbeitsweisen durchgeführt werden, beispielsweise durch Lösungsmittelextraktion und/oder Ausfällung aus Lösungsmitteln.Es wird angenommen, daß die Bindung von Methotrexat an die Copolymerisate an entweder der 2-Aminogruppe oder der 4-Aminogruppe des Pteridinringes auftreten kann, da, falls überhaupt, nur ein geringer Unterschied in ihrer chemischen Reaktionsfähigkeit vorliegt. Ebenso ist es wahrscheinlich, daß Methotrexat willkürlich mit den unterschiedlichen Typen von in den Copolymerisaten

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vorliegenden Anhydridgruppen reagiert. Jedoch, wurde keine Vernetzung als Reaktion von beiden Aminogruppen des Methotrexates während der Herstellung der erfindungsgemäßen Reaktionsprodukte beobachtet.

Die Reaktionsprodukte von Methotrexat und Copolymerisaten von Divinyläther und Maleinsäureanhydrid sind bei der Behandlung von allen Tumoren brauchbar, die mit Methotrexat und den Copolymerisaten jeweils getrennt behandelt werden können. Tatsächlich haben Untersuchungen der Antitumoraktivität der erfindungsgemäßen Reaktionsprodukte gezeigt, daß ihre Aktivität größer als diejenige von entweder Methotrexat oder den Copolymerisaten alleine oder von Mischungen von Methotrexat und dem Copolymerisat ist.

Beispiele der physiologisch tolerierten Salze der Reaktionsprodukte, welche gemäß der Erfindung vorteilhaft sind, sind wasserlösliche Salze von Alkalimetallsalzen wie z. B. von Natrium, Kalium, usw., Ammoniumsalze, Salze von Aminen wie Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin, Äthylamin, Diäthylamin, Tetraäthylammonium, Butylamin, Methoxyamin, Piperidin, Morpholin, usw., sowie gemischte Salze, welche -Ammoniak und ein anderes Amin enthalten.

Obwohl die Reaktionsprodukte eine Effektivität bei der Applikation entweder auf oralem oder parenteralem Weg zeigen, wird im allgemeinen die Behandlung auf parenteralem Weg bevorzugt. Die Copolymerisate können als wäßrige Lösung oder in physiologischer Salzlösung aufgelöst verwendet werden. Zusätzlich können verschiedene pharmazeutische Präparationen vorteilhafterweise zusammengestellt werden, welche die aktive Substanz zusammen mit flüssigen oder festen Verdünnungsmitteln enthalten. Feste Präparationen für eine zum Zeitpunkt der Anwendung durchzuführenden Verdünnung können unter

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Verwendung von verschiedenen Puffermitteln wie auch, lokalen Anaesthetika oder anderen medizinischen Wirkstoffen wie Antibiotika, Hypnotika, Analgetika usw. und anorganischen Salzen zur Erzielung der gewünschten, pharmakologischen Eigenschaften der Zusammensetzung formuliert werden.

Dosierungen in der Größenordnung von etwa 0,5 bis 80 mg/kg des Reaktionsproduktes sind zur Hemmung von Tumoren bei Tieren und bei Menschen erwünscht, wobei dies von dem Applikationsweg und der Behandlungsdauer abhängt. Da die Reaktionsprodukte stabil und in großem Maße verträglich sind, können sie in Lösung oder Suspension in einer Vielzahl von pharmakologisch annehmbaren Trägern einschließlich Wasser, Propylenglykol, Diäthylcarbonat, Glyzerin oder ölen wie Erdnußöl, Sesamöl, Olivenöl usw. appliziert werden.

Zusätzlich zu den konventionellen Wegen der oralen, intramuskulären, subkutanen, intravenösen und intraperitonealen Applikation können die erfindungsgemäßen Reaktionsprodukte ebenfalls in Verbindung mit Profusionsmethoden angewandt werden, wobei der Ort des Tumors von dem Hauptzirkulationssystem für die Behandlung isoliert wird.

In einigen Fällen kann es erwünscht sein, die Reaktionsprodukte in Kombinanation mit einem oder mehreren anderen carcinostatischen Mitteln anzuwenden. Für diesen Zweck sind Zusammensetzungen, welche etwa 10 bis 90 % der Produkte enthalten, vorteilhaft. Carcinostatische Mittel, die in solchen Kombinationen verwendet werden können, sind auf dem Fachgebiet an sich bekannt.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert, wobei alle Angaben in Teilen und Prozentsätzen, falls nichts anderes angegeben ist, in Gewicht ausgedrückt sind. Das in den Beispielen verwendete Methotrexat war ein

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handelsübliches Produkt (erhalten von Drug Development Branch, National Cancer Institute, NIH, Bethesda, Maryland, USA). Die Probe enthielt etwa 10 % Wasser, dieses wurde durch starkes Trocknen bei 50 ⁰C im Vakuum über Fp^5 ^ⁿ ^^er Dunkelheit entfernt. Falls nichts anderes angegeben ist, waren die in den Beispielen verwendeten Divinyläther-Maleinsäureanhydridcopolymerisate entsprechend der in den US-Patentschriften 3 224 94-3 und 3 794- 622 beschriebenen Arbeitsweisen hergestellt worden.

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung eines typischen Reaktionsproduktes von Methotrexat und Divinyläther-Maleinsäureanhydrid-copolymerisat.

Ein Polymerisationsbehälter wurde mit 10,3 Teilen Maleinsäureanhydrid, 200 Teilen trockenem Benzol und 7*4-5 Teilen Kohlenstofftetrachlorid beladen. Nach der Auflösung des Maleinsäureanhydrids wurde die Lösung mit Stickstoff gespült, dann wurden 3,7 Teile frisch destillierterDivinyläther in 60 Teilen Benzol zugesetzt. Der Reaktionsbehälter wurde auf 80 ⁰G erhitzt, und es wurde eine Lösung von 0,073 Teilen Benzoylperoxid in 5,6 Teilen Benzol unter Rühren zugesetzt. Die Reaktion wurde für 4 Stunden bei 80 - 90 ⁰C aufrechterhalten. Die erhaltene Aufschlämmung wurde auf 25 - 30 °C abgekühlt, und das gequollene Copolymerisat wurde entfernt. Das Produkt wurde wiederholt mit einem Gemisch aus 7i5 Teilen Benzol und 10 Teilen Hexan extrahiert, filtriert und im Vakuum getrocknet.

Das erhaltene Produkt war ein 2:1-Copolymerisat von Maleinsäureanhydrid-Divinylather, das eine grundmolare Viskositätszahl von 1,65₅ ein Zahlendurchschnittsmolekulargewicht von annähernd 36000 und ein Verhältnis M /M von annähernd 7 besaß.

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2 Teile des zuvor hergestellten. Copolymerisates wurden in 20 Teilen frisch destilliertem Dimethylformamid aufgelöst, und es wurde 1 Teil des Methotrexatdinatriumsalzes, aufgelöst in 16 Teilen Dimethylformamid, zu der Lösung "bei 20 ⁰C zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde "bei Zimmertemperatur für 24 Stunden gerührt, dann wurde es für 3 Stunden auf 50 ⁰C erwärmt. Das Produkt wurde durch Zugabe der Lösung zu 500 Teilen MethylendiChlorid ausgefällt, durch Filtration gewonnen und unter Vakuum während 20 Stunden getrocknet. Das Produkt wurde durch Membrandialyse des hydrolysierten Produktes gereinigt. Das Produkt wurde in 400 Teilen 0,05N NaOH aufgelöst und bei einem Druck von 3i1 har gegen eine Membran mit einer ein Molgewicht von 1000 ausschließenden Größe dialysiert. Diese Arbeitsweise wurde viermal nach der Zugabe von 2 Teilen 0,05N NaOH in jedem Falle wiederholt, danach wurden nur Spurenmengen von Methotrexat in dem Filtrat festgestellt. Das Produkt wurde aus der alkalischen Lösung durch Zugabe hiervon zu einem Überschuß von Aceton, Filtrieren des Niederschlages und Trocknen hiervon unter Vakuum bei 4-0 ⁰C gewonnen. Es wurden 2,2 Teile Produkt erhalten. Bei der Analyse mittels UV wurde ein Methotrexatgehalt von 11 % gefunden.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt eine weitere typische Darstellung eines Reaktionsproduktes von Methotrexat und Divinyläther-Maleinsäureanhydrid-copolymerisat

Ein Polymerisationsbehälter wurde mit 3*2 Teilen Maleinsäureanhydrid beschickt und mit Stickstoff gespült. Dann wurden 26,2 Teile trocknes Aceton und 1,67 Teile frisch destilliertes, trocknes Tetrahydrofuran zugegeben, wobei die Lösungsmittel zuvor mit Stickstoff gespült und unter einer Stickstoffatmosphäre gehalten worden waren. Nach der Auflösung des Maleinsäureanhydrids wurden 1,14 Teile Divinyläther in

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1,58 Teilen Aceton zugegeben. Die Reaktionsbehälter wurden auf 45 ⁰C erwärmt, und es wurde eine Lösung von 0,080 Teilen Azo-bis-(isobutyronitril) in 0,48 Teilen Aceton unter Rühren zugesetzt. Die Reaktion wurde bei 45 ⁰C für 8,75 Stunden aufrechterhalten. Die erhaltene, klare Lösung wurde filtriert. Das Copolymerisat wurde durch Zugabe von 27,0 Teilen Hexan ausgefällt, abgetrennt, wiederholt mit einem Gemisch aus 9,4 Teilen Benzol und 2,84 Teilen Hexan extrahiert, filtriert und im Vakuum getrocknet.

Das erhaltene Produkt war ein 2:1-Copolymerisat von Maleinsäureanhydrid-Divinyläther mit einer grundmolaren Viskositätszahl von 1,32 und einem Verhältnis M /M von annähernd 2.

2 Teile des zuvor hergestellten Copolymerisates wurden in 40 Teilen frisch destilliertem Aceton aufgelöst. Eine Lösung von 1 Teil Methotrexat, aufgelöst in 30 Teilen Dimethylsulfoxid, wurden zu dieser Lösung langsam bei 20 ⁰C zugesetzt. Das klare, rote Reaktionsgemisch wurde für 4 Stunden auf 45 C erwärmt, dann 72 Stunden gerührt, nachdem es sich auf 20 ⁰C hatte abkühlen können. Das Produkt wurde durch Zugabe der Lösung zu 600 Teilen Methylenchlorid ausgefällt, dann in Aceton erneut aufgelöst und wieder mit Methylenchlorid ausgefällt.

Das Produkt wurde dann weiter in einem Soxhlet-Extraktionsapparat mit zwei gewechselten Anteilen von 800 Teilen Methylenchlorid gereinigt. Es wurde dann dreimal durch Auflösen in Aceton und Zugabe zu Methylenchlorid umgefällt, danach wurde kein freies Methotrexat in dem Ausfällungslösungsmittel nachgewiesen. Bei der Elementaranalyse wurden 44,36 % C, 4,78 % H und 5,01 % N gefunden.

Der durch UV-Analyse angezeigte Methotrexatgehalt lag bei 25,2 %. Das Produkt war in Wasser, Aceton, Methanol,

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Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid löslich. Es war in Methylenchlorid und Diäthyläther unlöslich.

Beispiele 3 bis 5

Diese Beispiele zeigen typische Herstellungen von Reaktionsprodukten von Methotrexat und Divinyläther-Maleinsäureanhydridcopolymerisat.

Bei einem typischen Versuch wurden 1 Teil Divinyläther-Maleinsäureanhydrid-copolymerisat in 10 Teilen frisch destilliertem Dimethylformamid aufgelöst, und es wurden etwa 0,5 Teile Methotrexat, aufgelöst in 8 Teilen Dimethylformamid, tropfenweise unter Rühren bei Zimmertemperatur zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für 24 bis 48 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt und abschließend für 3 Stunden auf 50 °C erwärmt. In jedem Pail wurde das Produkt in 250 Teilen CH₂CIp ausgefällt, filtriert, mit Methanol gewaschen und über Nacht im Vakuum getrocknet. Das rohe Reaktionsprodukt wurde zu dem Polycarboxylat hydrolysiert und in 200 ml und anschließend 4 χ 100 ml 0,05M NaOH dialysiert (BM 10 Membran, Berghof, Tübingen, West-Deutschland, Ausschlußgröße 1000). Nur Spurenmengen von freiem Methotrexat waren dann im Filtrat nachweisbar. Das Reaktionsprodukt wurde in 150 ml Aceton ausgefällt, mit Aceton gewaschen und im Vakuum über PpO,- getrocknet. Das IR-Spektrum der Reaktionsprodukte zeigte Amid- und Anhydridschwingungen bei 1640 und 1775 cm

Das Maximum bei 303 nm im UV-Spektrum wurde zur spektroskopischen Bestimmung des Methotrexatgehaltes in den Reaktionsprodukten herangezogen. Das Molekulargewicht und den Anhydridgehalt der bei der Reaktion verwendeten Copolymerisate, das bei der Reaktion angewandte Molverhältnis von Copolymerisaten zu Methotrexat, die Reaktionszeit und der Methotrexatgehalt der Reaktionsprodukte sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

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cx> cn

ο co ay to

Bsp.

Copolymerisat

Molekulargewicht Anhydrid,

% der Theorie

Tabelle I

Molverhält- Reaktions- Methotre-

nis Copoly- zeit (h) xatgehalt

merisat/ des Pro-.

Methotrexat duktes W

Elementaranalyse
des Produktes

C H 1

3 Mn 20.000 Mw 83,500

4 Mn 9.100 Mw 34 .300

5 Mn 20-000 Mw 83,500

3,1:1
3,46:1
3,37:1

27
24
48

(a) %-Basis mol Methotrexat/Copolymerisat + Methotrexat

11
3
3_f5

46_;5

29,7

5,2

29,0 3,0

4_;3

4,4
0,3
0,3

OO GO CD CD O

Beispiel 6

Die Arbeitsweise der Beispiele 3 bis 5 wurden mit der Ausnahme wiederholt, daß Dimethylsulfoxid anstelle von Dimethylformamid als Lösungsmittel bei der Eeaktion verwendet wurd. Das "bei der Eeaktion verwendete Copolymerisat besaß Mn = 155OO, Nw = 3OOOO und enthielt etwa 82 % Anhydrid der Theorie. Das Copolymerisat wurde mit dem Methotrexat in einem Molverhältnis von 3»5:1 für 24 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsprodukt enthielt 6,1 % Methotrexat und zeigte eine Elementaranalyse von:
C = 37,1 H = 4,0 N = 1,7 %

Beispiele 7 bis 12

Bei einem typischen Versuch wurden 1 Teil Divinyläther-Maleinsäureanhydrid-copolymerisat in 20 Teilen Aceton aufgelöst, und es wurden etwa 0,55 Teile Methotrexat, aufgelöst in 15 Teilen Dimethylsulfoxid, tropfenweise unter Rühren bei Zimmertemperatur zugesetzt. Nach einem anfänglichen Erwärmen auf 4-5 ⁰C für 4 Stunden wurde das klare, orangerote Reaktionsgemisch 24 bis 96 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsprodukt wurde in 3OO Teilen CHpCl₂ ausgefällt, filtriert und mit Aceton-Dimethylformamid/CHpClp^ umgefällt. Es wurde dann 48 Stunden mit 2 χ 400 Teilen CH₂Cl₂ in einer Soxhlet-Extraktionsvorrichtung extrahiert. Die abschließende Reinigung wurde durch dreifaches Auflösen in Aceton (70 Teilen) , Entfernen des in Aceton unlöslichen Materials und Wiederausfällen in CH₂Cl₂ erreicht. Das Endprodukt zeigte kein freies Methotrexat bei der Dünnschichtchromatografie mit Ninhydrin-reaktionsfähigem Material. Es ist in H_?0 (nach der Hydrolyse zum PoIycarboxylat), Aceton, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid löslich und in CH₂Cl₂ und Äther unlöslich.

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Das Maximum im UV-Spektrum bei 303 nm wurde für die spektroskopische Bestimmung des Methotrexatgehaltes in den Reaktionsprodukten verwendet.

Das Molekulargewicht und der Anhydridgehalt der bei der Reaktion verwendeten Copolymerisate, das bei der Reaktion angewandte Molverhältnis von Copolymerisat zu Methotrexat, die Reaktionszeit und der Methotrexatgehalt der Reaktionsprodukte sind in der folgenden Tabelle II angegeben.

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Tabelle II

Bsp.

Copolymerisat

Mo1ekulargewicht

Molverhält~ Reaktions- Methotre- Elementaranalyse

_H ·, nis Copoly- zeit (h) xatgehalt des Produktes

% der merisat/ des Pro-.

Theorie Methotrexat

duktes

7 Mn 9.600 Mw 18.100

8 Mn 4.400 Mw 9.300

9 Mn 24.000 Mw 53.000

10 Mn 24-000 Mw 53,000

11 Mn 24-000 Mw 53.000

12 Mn 15.500 Mw 30.000

3,55:1

3,5:1

3,1:1

1,9:1

3,5:1

24
24
72
72
96
72

3,5

25,2
20

42,6
16,6

34,9
33,7
44,4
45,8
46,1
47,4

3,7
3,8
4,8

5,1
5,2
5,2

(a) %-Basis mol Methotrexat/Copolymerisat + Methotrexat

OO GO CD CO CD

Beispiele zur Tumortransplantation und Chemotherapie Das in Beispiel 9 "beschriebene Reaktionsprodukt und Divinyläther-Maleinsäureanhydrid-copolymerisat wurden in allen folgenden Beispielen eingesetzt.

6 "bis 8 Wochen alte, männliche CO2F^-Mäuse (BaIb/C weiblich X DBA/2 männlich) mit einem Gewicht von 20 - 25 g wurden bei Untersuchungen gegen Leukämie L1210 und bei den anderen in-vivo-Experimenten eingesetzt. Männliche B6D2E^ (C56BL/6 χ DBA/2} Mäuse mit einem Gewicht von 20 - 25 g wurden bei den Versuchen zur Chemotherapie gegenüber Lewis-Lungen-Karzinom verwendet. Die L1210-Leukämie wurde durch kontinuierliche, intraperitoneale Passage aufrechterhalten, und sie wurde durch intraperitoneale Injektion von 0,1 ml Bauchwassersuchtflüssigkeit, welche 10 lebensfähige Zellen/ml enthielt, eingeimpft. Die Behandlung von 10 Mäusen pro Gruppe wurde 24 Stunden nach der Tumoreinimpfung begonnen. Die Wirkstoffe wurden intraperitoneal mit 0,01 mg/g Körpergewicht in 2 %iger NaHCO^-Lösung appliziert. Die Antitumoraktivität wurde durch Vergleich der mittleren Überlebensζext der behandelten Gruppe (T) mit derjenigen der Kontrollgruppe (C) bestimmt, und sie wurde als Prozentsatz der Steigerung der mittleren Lebensspanne (ILS)

100 Gt -1) ausgedrückt.

Lewis-Lungen-Karzinom wurde subkutan bei gleichaltrigen C57BL/6 männlichen Mäusen entsprechend den Standardprotokollen des Programms von Drug Research and Development, National Cancer Institute übertragen und subkutan bei 10 lebensfähigen Zellen im rechten Oberschenkel von B6D2F^- Mäusen implantiert. Die Wirkstoffbehandlung begann 24 Stunden später unter intraperitonealer Applikation bei 0,01 mg/g Körpergewicht. 8 Mäuse pro behandelter Gruppe und wenigstens 16 Mäuse pro Kontrollgruppe wurden bei jedem Experiment eingesetzt. Das Tumorwachstum wurde durch Messung der senkrechten Tumordurchmesser mit einer Schublehre mit Nonius bestimmt.

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Die Tumormessungen wurden jeden zweiten Tag nach, der Entwicklung von abtastbaren Tumoren von annähernd 50 mg durchgeführt. Das Tumorgewicht in mg wurde abgeschätzt, wobei die Formel für das Volumen eines gestreckten Ellipsoids unter Annahme einer Einh.eitsdich.te herangezogen wurde; mm größerer Durchmesser χ (mm kleinerer Durchmesser) χ 1/2.

Kulturen von L1210-Leukämiezellen wurden von Tumoren in CD2I\- Mäusen, die wie zuvor beschrieben gehalten wurden, initiiert. Die L1210-Zellen wurden wachsen gelassen und in Falcon-Kulturkolben (Falcon Plastics Ltd., Oxnard, Ca.) in RMPI-1630-Medium, ergänzt mit 10 %igem fetalem Kalbsserum (Grand Island Biological Co., Grand Island, N.Y., USA) geprüft. Die Zellzahlen in der Kultur wurden mit einem Coulter-Zähler (Coulter Electronics Inc., Fl., USA) durch Entfernung von Teilmengen von 0,5 ml aus den Kulturkolben bestimmt. Ausgangskulturen wurden ausgezählt und auf eine Konzentration von 10^ lebensfähigen (Trypan-Blau) Zellen/ml bei einer Gesamtmenge von 10 ml in jedem Kolben verdünnt. Die Wirkstoffe bzw. Arzneimittel wurden unmittelbar vor jedem Experiment in steriler 2 Gew.-%iger NaHCO^-Lösung zur Herstellung von Ausgangslösungen aufgelöst. Angemessene Verdünnungen wurden mit Kulturmedium hergestellt", so daß die Endkonzentration von NaHCO^ in der Zellenkultur nicht größer als 1 % war. Die den Wirkstoffen bei verschiedenen Konzentrationen ausgesetzten Zellen wurden nach 48 Stunden ausgezählt. Die Hemmeinflüsse jedes Wirkstoffes auf das Wachstum wurden wenigstens zweimal bestimmt, wobei eine Verdreifachung bei jeder Konzentration durchgeführt wurde, und die Ergebnisse wurden als Mittelwert - S.E. der prozentualen Hemmung, im Vergleich zu nicht behandelten Kontrollversuchen, ausgedrückt.

Die Ergebnisse der Untersuchungen gegen Leukämie L1210 in vivo sind in der Tabelle III angegeben. Die Ergebnisse der Untersuchungen gegen Leukämie L12010 in vitro sind in der Tabelle IV aufgeführt. Die Ergebnisse der Untersuchungen gegen Lewis-Lungenkarzinom in vivo sind in der Tabelle V zusammengestellt.

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Tabelle III

Antitumoraktivität in MTX*, DIVEMA** + MTX -und DIVEMA-MT^X gegen Mulrine L1210-Leukämie

Wirk- Dosis (mg/kg)^^c stoff Tag

MTX DIVEMA

Programm
(Tage)

max.
Gew.-Ver-
lust(%)

Üb er 1 eb ens ζ e it (Tage) Mittelwert Bereich

% ILS

Langzeit-/,-ν üb erleb en ^v '

unb ehande1-te Kontrolle

8,5

8-10

MTX

OO OO cn

CD OO O

DIVEMA

MTX +
DIVEMA

DIVEMA-MTX

5 8

10 15 20 30

5 8

10 15 20 10 20 30

5 8

10 20

19,6 39,2 78,4

14,5 23,4 29,2 43_r8 58,4 14,6 14,6 14,6

14.6 23,4 29,2 58,4

1,5,9,13
1,5,9,13
1,5,9,13,17

1,5,9,13
1,5,9

1,5,9,13
1,5,9,13,17

1,5,9,13,17

1,5,9
1,5,9,13,17

1,5,9

1,0

¹J⁵

2 8

12 3 16,0 27,0

.4,2

7,0

11,0

3,4

4,8

4,6

15,1

16_;6

4,2 10,0 13,0 27i4

ie;8^c

17,5^C

22,'5^C 13,5

9,5 9,8 10,5

2o;o^a

20,6^d 20, 0^d 20,5 20,0 11,5

20,5^d 26,0^d 18, 0^a 13,5

11-17	46	0/20	I	\	!S3
16-22	98	0/20	O	CO
16-23	106	0/20	¹	CO CD
18-26	133	0/20		CD
15-28	165	0/20		CD
9-24	toxic	0/20
9-11	12	0/10
9-12	15	0/10
2-12	24	0/10
12-20	94	0/20
12-26	124	0/20
17-25	135	0/20
17-27	142	0/20
17-25	135	0/20
17-30	141	0/10
13-29	135	0/10
9-27	toxic	0/10
17->30	141	2/20
18->3u	206	5/20
12->30	112	3/20
9-17	toxic	0/10

* Methotrexat
* * Divinyläther-Maleinsäureaiihydrid-copolymerisat

(^a'Dosen von DIVEMA-MTX, angegeben als MTX- und DIVEMA-Äquivalente. Die Summe dieser Zahlen ergibt die Gesamtdosis von DIVEMA-MTX.

JO Tage, ^c _mi-ttel ~ S*-D· aus sechs einzelnen Kontrollgruppen

^ ^Mittelwert von zwei einzelnen Behandlungsgruppen, der Variationskoeffizient war niemals größer als 6 %.

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Tabelle IV

Wachstumshemmung von L12iO-Zellen in der Kultur nach der Exposition gegenüber MTX*, DIVEMA**-MTX und DIVEMA + MTX

O CO OO

Wirkstoffkonzentration (jug/ml)(a)

MTX DIVEMA MTX allein

Prozent von Kontrollwachstum + S.E. DIVEMA-MTX- DIVEMA + MTX Reaktions- Kombination produkt

O	,00454	0	,01326	118	j	6 +	11	)⁶
O	_;0454	0	,1326	37	r	2 +	4	I⁵
O	,454	1	,326	28	T	2 +	4	,3
4	,54	13	,26	25	;	3 +	3

147,3 + 6,3
45,0 + 2,0
37_r0 + 2,4
30,0 + 3,1

107,6 +3,7

41,1 + 3_;2

24,4 + 1,1 21,3 + 0,8

nur DIVEMA

132,6

101.2 +

* Methotrexat
* * Divinyläther-Maleinsäureanhydrid-copolymerisat

^^Konzentrationen für DIVEMA-MTX, angegeben als MTX- und DIVEMA-Äquivalente

O CD O

Tabelle V

Effekt von DIVEMA*, DIVEMA-MTX** und DIVEMA + MTX gegen subkutanes Lewis-Lungen-Karzinom

CD OC*

Wirkstoff	Dosis MTX	(mg/kg Tag) DIVEMA	5_?84
unb ehandeIt e Kontrolle MTX	2	—	+ 5,84
DIVEMA		5,84
MTX + DIVEMA	2
DIVEMA-MTX	2

Programm Verzögerung Tumor, Gew.- Überlebenseeit
des Tumor- Hemmung^⁰)

g
(Tage)

Wachstums (%)

1-8

1,0

16 33

(Tage)

Mittelwert Bereich

26,0
28,0
27,0

26,5
36,5

22-36 20-36

21-46

18-45 30-43

* Divinyläther-Maleinsaureanhydrid-copolymerisat
* * Methotrexat

^^a ''Dosierung von DIVEMA-MTX sind angegeben in MTX- und DIVEMA-Äquivalenten

^ 'Der Unterschied zwischen der behandelten Gruppe im Vergleich zu der

nicht behandelten Kontrollgruppe zum Erreichen eines mittleren Tumor- rs> gewichtes von 3g· ^⁰

100 χ (1 - mittleres Tumorgewicht der behandelten Gruppe am 19· Tag/ O mittleres Tumorgewicht von Kontrolltieren am 19. Tag) g

Claims

DR. A. VAN DER WERTH DR. FRANZ LEDERER REINER F. MEYER DlPL-ING. (1934-1974) DIPL-CHEM. DIPL-ING. 8000 MÜNCHEN 80 LUCILE-GRAHN-STRASSE TELEFON: (089) 472947 TELEX: 524624 LEDER D TELEGR.: LEDERERPATENT 13. Juli 1978 Ringsdorf & Przybylski Case No. 1 Hercules Incorporated Market Street, Wilmington, Delaware, USA Patentansprüche

1. Reaktionsprodukt von Methotrexat und Divinyläther^Maleinsäureanhydrid-copolymerisat.

2. Physiologisch tolerierbare Salze des Reaktionsproduktes nach Anspruch 1.

3. Verfahren zur Herstellung des Reaktionsproduktes von Methotrexat und Divinyläther-Maleinsäureanhydrid-copolymerisat, dadurch gekennzeichnet , daß Methotrexat mit einem Überschuß von Anhydridgruppen in dem Copolymerisat in einem inerten Kolösungsmittel umgesetzt wird.

809885/0862

ORIGINAL INSPECTED

4. Verwendung des Reaktionsproduktes oder seiner Salze nach Anspruch 1 oder 2 zur Hemmung des Wachstums von malignen Tumoren.

80988 5/0862