CZ241397A3 - Method of cryogenic preservation of mammal tissues and apparatus for making the same - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká kryokonzervace

kultivovaných tkáňových ekvivalentů, které se připravují za použití technologie in vitro. Dále vynález popisuje soupravu (zařízení) pro kryokonzervaci získaných tkání a kultivovaných tkáňových ekvivalentů. Toto zařízení je ekonomicky efektivní, snadno se s ním pracuje a umožňuje maximální životaschopnost tkání nebo tkáňových ekvivalentů, které se kryokonzervuji. Při použití technologie kryokonzervace je možné před použitím uchovávat kryokonzervované získané tkáně nebo kryokonzervované kultivované tkáně po neomezenou dobu. Kultivovaná tkáň, která je in vitro modelem ekvivalentu lidské tkáně, se po ukončení skladování může použít pro transplantaci nebo implantaci in vivo nebo pro testování látek in vitro.

Dosavadní stav techniky

Technologií in vitro byly vyvinuty ekvivalenty tkání, které se používají pro testování in vitro nebo pro transplantaci tkáně in vivo po poraněni. Způsoby přípravy takových tkáňových ekvivalentů popisují patenty USA č.4,485,096, 4,604,346, 4,835,102 a 5,374,515 a patentové přihlášky USA č. 08/193,809 a 08/337,830.

Skladovatelnost živých tkání je omezená, a v důsledku toho je jejich doba použití krátká a vzniká velké množství odpadu. Za účelem přepravy a uchovávání je nutné takové tkáně konzervovat na delší časové úseky, až do doby jejich použití. Vyvinutí kryokonzervační metody a zařízení pro kryokonzervaci a uchovávání umožňuje použití těchto tkání po neomezenou dobu, jednoduchou přepravu a uchovávání zásob tkání. Žádoucí je rovněž umožnění vytvoření zásoby tkání (tkáňových bank) na ·· ··. .··.···: .··.··*:

• ·· · i , · .·· .· .··. · ; : · ··: :

* * * ·»· · ·· · odděleních popálenin a v nemocnicí ch*.‘*t>aíe je výhodné, že se v různých fázích výrobního cyklu mohou odebírat vzorky za účelem uchování pro kontrolu kvality a mohou se připravit velké objemy kultur, protože se mohou uchovávat ve zmrazeném stavu.

V současné době se doba skladovatelnosti buněčných biologických materiálů prodlužuje zchlazením na kryogenní teploty. Přechod z kapalného stavu na pevný pomocí snížení teploty systému probíhá buď jako krystalizace (vytváření ledu), při které dochází k pravidelnému upořádání molekul vody, nebo jako vitrifikace nebo amorfizace (vytváření skla), kdy k takovémuto pravidelnému uspořádání krystalické fáze nedochází. Úkolem pro kryobiology je ochladit buňky na kryogenní teploty a pak je přivést zpět do fyziologického stavu bez jejich poškození.

Existují dva základní postupy pro kryokonzervaci buněk a tkání: metoda zmrazení a rozmražení a vitrifikace (zeskelnění) . Při použití postupů zmrazení a rozmražení se zmrazí extracelulární roztok (do krystalické formy), ale provádějí se opatření k minimalizaci tvoření ledu uvnitř buňky. U vitrifikačních postupů je snaha zabránit tvorbě ledu v celém vzorku. Postup uvedený jako první je problematický v tom, že pokud se vytvoří krystaly uvnitř buněk, narušují životaschopnost buňky po rozmražení. Buňky však mohou přežít cyklus zmrazení a rozmražení pokud se chladí řízenou rychlostí za přítomnosti kryogenních ochranných činidel (kryoprotektantů) v množství, které není toxické. Později uvedený postup - vitrifikace - se snaží předejít potenciálnímu ničivému účinku intracelulárního a extracelulárního ledu tím, že potlačuje tvorbu ledu použitím velmi vysokých koncentrací rozpuštěných látek a/nebo polymerů. Avšak k poškození buňky může dojít, jestliže je vystavena dlouhodobému působení toxických koncentrací těchto aditiv nutných pro vitrifikaci.

·· ····

Kryogenní ochranná činidla chrání živé buňky před stresem, který způsobuje jejich zmrazení. Jedním z mechanismů chránění buněk kryogenními ochrannými činidly je naředění soli, jejíž koncentrace v nezmraženém roztoku se zvyšuje, jak se voda přeměňuje na led. Množství ledu je dáno teplotou a počátečním složením roztoku; zatímco množství nezmražené frakce je pouze funkcí teploty. Kryogenní ochranná činidla mají několik dalších funkcí. Jedna z důležitých funkcí je, že obvykle snižují teploty, při kterých dochází k tvorbě ledu uvnitř buňky. Další funkcí je stabilizace membrán a proteinů.

Všechny roztoky se podchlazují pod jejich teplotu tuhnutí až najdou náhodné nukleační jádro pro vytvoření krystalu. V případě, že probíhá kryokonzervace způsobem zmrazení a rozmražení, tvoření ledu v mimobuněčném prostředí se záměrně zahájí nukleací (vytvořením nukleačních jader) při nízkých stupních podchlazení. Pokud se tvorba ledu nevyvolá nukleací, led se bude tvořit spontánně, jestliže se roztok ochladí dostatečně nízko pod jeho rovnovážnou teplotu tuhnutí. Protože je tento postup v přírodě náhodný, led se bude tvořit při náhodných nepředpovídatelných teplotách; v důsledku toho bude míra přežití při opakovaných pokusech velmi rozdílná, i když postup mrazení bude stejný. Kromě toho extrémně rychlá krystalizace, ke které dochází při tvorbě ledu ve vysoce podchlazeném roztoku, může poškodit buňky a tkáně. Dále bylo zjištěno, že pokud je tvorba mimobuněčného ledu zahájena při vysokých stupních podchlazení, je pravděpodobnost tvorby ledu uvnitř buňky výrazně zvýšená. K tomuto jevu dochází, jestliže začátek dehydratace buňky vyvolané mrazením se opozdí, což vede ke zvýšenému zadržování vnitrobuněčné vody a tím k vyšší pravděpodobnosti tvoření ledu v buňce.

Jakmile je naočkován mimobuněčný led a vzorek je obklopen ledem, je nutné ochladit vzorek do kryokonzervovaného stavu. Tento stupeň chlazení je v postupu zmrazení ·· ·· ···· ·· ···· ···· ·· · ·· · ··· ··· ♦·· ·· ··· ·· · ··· · «····· ·· a rozmražení ne j klíčově j ší . V důsledíál* Výtvořbni lečfu, *což je čistá voda, je částečně zmrazený mimobuněčný roztok je koncentrovanější než vnitrobuněčný. V důsledku toho se buňka dehydratuje, protože ztrácí vodu ve snaze vyrovnat termodynamickou rovnováhu. Jak se systém chladí, tvoři se více mimobuněčného ledu a koncentrace rozpuštěných látek se zvyšuje, což nutí buňku dále dehydratovat. Existují tři vlastnosti buněk, které řídí rychlost jejich dehydratace. Jednou je permeabilita buněčné membrány pro vodu; čím je nižší permeabilita pro vodu, tím déle trvá dehydratace buněk. Další je teplotní závislost permeability buněčně membrány pro vodu; permeabilita pro vodu se u všech buněk snižuje se snižující se teplotou. Poslední vlastností je velikost buňky; dehydratace větších buněk trvá déle než dehydratace menších buněk. Vzhledem k tomu, že různé typy buněk mají výrazně rozdílné vlastnosti, mohou se optimální podmínky kryokonzervace různých typů buněk řádově lišit.

Ačkoli přesné mechanismy poškození buňky během kryokonzervace nejsou ještě zcela známé, zdá se, že charakteristické křivky přežití získané měřením přeživších buněk, jako funkce rychlosti chlazení, jsou kvalitativně podobné u všech typů buněk a tvoří křivku tvaru obráceného U. Přežití buněk je nízké, jestliže rychlosti chlazení jsou velmi nízké nebo velmi vysoké. Existuje střední rychlost chlazení, která umožňuje optimální přežití. Ačkoli se optimální rychlost chlazení a šířka křivky pro různé typy buněk může výrazně lišit, zdá se, že kvalitativní chování je všeobecně platné. Vyšší rychlosti chlazení neposkytnou buňkám dostatek času k dehydrataci a uvnitř buněk se tvoří led. Poškození buněk při vysokých rychlostech chlazení se připisuje tvorbě vnitrobuněčného ledu. Při nízkých rychlostech chlazení se má za to, že se buňky poškodí v důsledku toho, že jsou vystavenypůsobení vysoce koncentrovaných roztoků vnitro- a mimobuněčné soli a kryogenních ochraných činidel nebo v důsledku mechanických interakcí mezi ·» ·· » · · ¹ • ·· ·· ···· ·· ···· buňkami a mímobunščným ledem.

Je nutné dosáhnout maximální dehydratace buněk dříve než překročí křivku vnitrobuněčné ledové nukleace. V tom okamžiku prakticky veškerá voda, která zbývá v buňce, vytváří jádra a mění se v led. Není možné určit přesnou teplotu, při které k tomuto jevu dojde, ale je to přibližně -40° C až -50° C, pokud se buňky pomalu mrazí za přítomnosti kryogenních ochranných činidel v koncentraci 1M až 2M. Je důležité poznamenat, že množství vody, které se v tomto okamžiku uvnitř buňky přemění v led, může být po zmrazení neškodné, ale jestliže neroztaje dostatečně rychle, bude expandovat a při rozmražení buňku zabije. (The Biophysics of Organ Cryopreservation, str. 117-140, vyd. David E. Pegg a Armand M. Karow, Jr. NATO ASI Series A: Life Sciences svazek 147 1987 Plenům Press, New York 233 Spring St. , New York, NY 10013).

Dříve než byly vyvinuty komerčně využitelné ekvivalenty kůže, byla pro účely transplantace používána kůže z mrtvých dárců. Byly vyvinuty postupy kryokonzervace, takže centra popálenin a nemocnice mohou vytvářet tkáňové banky. Byla vyvinuta řada různých způsobů kryokonzervace, které využívají odlišná krogenní ochranná činidla, rychlosti chlazení, způsoby zabalení a podmínky uchovávání. Většina výzkumníků se přiklání k rychlému rozmražení. Úspěšnost nebo neúspěšnost způsobu kryokonzervace je hodnocena buď z hlediska uchycení štěpu na poranění nebo testem životaschopnosti buněk.

V patentu USA č. 3,842,831 (Beisang) se popisuje způsob kryokonzervace štěpů kůže z mrtvých dárců. Tento způsob zahrnuje přiložení kůže mrtvého dárce na řídkou podkladovou tkaninu nebo jiný vhodný podklad, který je spolu se štěpem před zamrazením srolován. Kryogenní ochranné činidlo se nepoužívá, ačkoli vynálezci navrhují použití buď glycerinu nebo dimethylsulfoxidu (DMSO). Rychlost mrazení je vysoká a není řízena (konstantní teplota). Tkáň se zmrazí na kryogenní ·· ·· ·· ···· ·· ···· ······ · · · · « ·· · · · · · · ······· · ··· · teplotu -70° C. .i..·..’......

May SR a FA DeClement (Skin Banking Methodology, 17, 33-45 (1980)) na dermatomu mrtvého dárce zhodnotili geometrii balení, rychlost chlazení a zahřívání. Výsledky naznačují, že štěp kůže by měl být spíše rovný než srolovaný a měla by se použít řízená pomalejší rychlost mrazení.

Patent USA č. 5,040,677 (Tubo) popisuje neprodyšně pro plyn uzavíratelnou nádobu pro jednotlivé štěpy vrstev epiteliálních buněk. V případě této nádoby se vrstva epiteliálních buněk musí přichytit sponkami adhezivní podkladovou vrstvu nebo podložku.

Patent USA č. 5,145,770 (Tubo) popisuje způsob kryokonzervace vrstev keratinocytů, při kterém se používá kryogenní ochranné činidlo, jež neproniká do buňky, jako je dextran, a činidlo pronikající do buňky, jako je glycerol. Rychlost chlazení je přibližně -1° C/min. Podobně evropský patent č. 0 364 306 (Chao a kol.) popisuje způsob kryokonzervace vrstvy živých kultivovaných epiteliálních buněk za použití dimethylsulfoxidu (DMSO) a glycerolu jako kryogenních ochranných činidel, přičemž rychlost mrazení činí výhodně -1° C/min.

Patent USA č. 5,298,417 (Cancedda a kol.) popisuje způsob kryokonzervace vyvinutý pro jednovrstvé konstrukty, jako jsou vrstvy epiteliálních buněk, jejichž přípravu popisují patenty USA č. 4,016,036, 4,304,866 a 4,456,687. Vrstvy epidermálních buněk se inkubuji s kryogenním ochranným činidlem, kterým je buď 8 až 15% glycerol nebo dimethylsulf oxid (DMSO) a poté se buňky kryokonzervuji za použití postupu s řízenou rychlostí chlazení, kde rychlost chlazení je na počátku pomalejší než na konci postupu, a vyznačuje se tím, že teplota vzroste před kulminací mrazení.

Teasdale a kol., Burns, 19 (5) 406-410 (1993), zkoumali způsob kryokonzervace dermálních fibroblastů v kolagenním ·· ·« ΦΦ ΦΦΦΦ ·· 9999 ΦΦΦΦ·· ··· ·

Φ ΦΦ ΦΦΦ φ·Φ φφΦΦΦΦ· · ··· * • ΦΦ ΦΦΦ · · gelu. Teasdale stanovil, že optimální *ž*i*votascfiopnosti buněk lze dosáhnout mrazením rychlostí -0,5° C/min, za použití dimethylsulfoxidu jako kryogenního ochranného činidla.

Nanchahal a kol., Cultured composite skin grafts: Biological skin equivalents permitting massive expansion, The Lancet, 2 (8565), 191-193 (22. července, 1989), rozebírají způsob uchovávání kompozitních štěpů kultivované tkáně, při kterém se používá jako kryogenní ochranné činidlo 15% glycerol alO % fetální telecí sérum (FCS) v médiu 199. Štěpy a kryogenní ochranné činidlo se inkubují po dobu dvou hodin při teplotě 37° C, mrazí se rychlostí -1° C/min na teplotu -70° C a poté se uchovávají v kapalném dusíku. Životaschopnost štěpů po rychlém rozmražení byla určena dvoutýdenní kultivací a transplantací štěpu lysým myším. Konečné zhodnocení bylo provedeno po transplantaci štěpů třem pacientům po odstranění tetování.

Práce, kterou publikovali Johnstone a kol., Cryopreservation of Rabbit and Cat Corneas at -18 to -24° C, Cornea, 11(3): 211-220 (1992), se věnuje jednoduchému postupu kryokonzervace králičích a kočičích rohovek, při kterém se místo kapalného dusíku nebo mrazících zařízení s velmi nízkými teplotami používá domácí mrazák. Prostoupení kryogenního ochranného činidla se dosáhne postupným umísťováním rohovek do roztoků 50% fetálního telecího sera a McCarey-Kaufmanova media se zvyšujícím se obsahem glycerolu a glukosy.

Metody známé z dosavadního stavu techniky nelze použít ke kryokonzervaci kultivovaných tkáňových ekvivalentů, zčásti proto, že jsou relativně tlusté a jsou složeny z vrstev heterogenních buněk. Jedna z funkcí těchto tkání in vivo je vytvořit neprostupnou barieru. Funkce tkání je nutné brát v úvahu při vývoji způsobu kryokonzervace.

Nyní byl nalezen způsob kryokonzervace a zvláště ·· • · · • · • · ···· ·· ····

·· ···· • · · • · · ··· · • · tt · soupravu pro kryokonzervaci, jež je použitelná pro řadu kultivovaných tkáňových ekvivalentů a pro kůži savců. Jedná se o překvapivě účinné a komerčně praktické balení pro kryokonzervaci kultivovaných tkáňových ekvivalentů.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje způsob úspěšné kryokonzervace kultivovaných tkáňových ekvivalentů při velmi nízkých teplotách, při kterém nedochází k vytváření škodlivých ledových krystalů uvnitř buňky, minimalizuje se účinná koncentrace potencionálně škodlivých chemikálií a je umožněno rychlé vnesení a odstranění kryogenních ochranných činidel při vhodných teplotách, za použití programovatelného mrazícího zařízení.

Vynález také zahrnuje novou soupravu vyvinutou prom kryokonzervaci, uchovávání a přepravu kultivovaných tkáňových ekvivalentů. Nová souprava nabízí mnohé výhody ve srovnání se stávajícími soupravami. V současné době nejsou komerčně dostupné žádné kryokonzervované kultivované tkáňové ekvivalenty, a proto nejsou dostupné ani vhodné soupravy. Uspořádání nové soupravy umožňuje vzhledem k účinejŠímu přestupu tepla lepší sladění teploty uvnitř soupravy s vnější teplotou mrazící komory. Zlepšená rychlost přestupu tepla dovoluje lepší řízení postupu; stejnoměrné rychlosti chlazení a ohřívání kultivovaných tkáňových ekvivalentů tím snižují variabilitu v životaschopnosti buněk.

Byl nalezen způsob kryokonzervace kultivovaných tkáňových ekvivalentů připravených postupem in vitro, při kterém si tkáně uchovávají svou životaschopnost a použitelnost jako ekvivalenty lidských tkání. Vynález zahrnuje použití míchání pro zvýšení penetrace účinného množství kryogenního ochranného činidla. Tento způsob je vhodný ke kryokonzervaci jak získaných tkání tak i kultivovaných tkáňových ekvivalentů

tak, že je chráněna strukturní integrita a životaschopnost buněk.

Způsob podle vynálezu zahrnuje následující stupně:

1) získaná tkáň nebo kultivovaný tkáňový ekvivalent se ponoří do roztoku kryogenního ochranného činidla a roztok kryogenního ochranného činidla a ponořená tkáň se míchají za účelem dosažení účinné penetrace roztoku kryogenního ochranného činidla do tkáně (perfuze tkáně); a

2) po perfuzi roztoku kryogenního ochranného činidla do tkáně se provádí chlazení na teplotní rozmezí rovnováhy pevné a kapalné fáze kryogenního ochranného činidla,· dále se provede nukleace mimobuněčného ledu a chlazení do kryokonzervovaného stavu mrazením tkáně nízkou rychlostí na teplotu nejméně přibližně -70° C nebo pod ní, výhodněji na teplotu -120° C nebo pod ní, ještě výhodněji na teplotu -140° C a nejvýhodněji na teplotu -196° C.

Jakmile je kryokonzervovaná tkáň zmrazená, může se uchovávat po neomezenou dobu při teplotách mezi přibližně -120° C až přibližně -196° C, což je teplota kapalného dusíku.

Rozmražení kryokonzervované tkáně se provádí zahřátím zmrazené tkáně vysokou rychlostí, během zhruba jedné až dvou minut. Zmrazená tkáň může být rozmražena přímo přidáním ohřátého kultivačního media nebo fyziologického pufrovaného roztoku nebo jiným způsobem rychlého zahřátí. Souprava umožňuje rozmražení tkáně ponořením soupravy do vodní lázně, jelikož souprava zajišúuje jak vysokou rychlost zahřátí tak řízenou rovnoměrnost teploty za zachování sterility během klíčového postupu rozmražení.

Před použitím jako ekvivalent lidské tkáně, pro transplantaci nebo pro testování in vitro, se rozmražený kultivovaný tkáňový ekvivalent promyje pro odstranění roztoku kryogenního ochranného činidla. Roztok* k*řyogénního ochranného činidla lze odstranit promytím například izotonickým roztokem pufru při fyziologickém pH. Kultivované tkáňové ekvivalenty se mohou pak dočasně uchovávat v takovém roztoku pufru nebo se před použitím rekultivují ve vhodném mediu pro kultivaci buněk.

Popis obrázků na výkresech

Na obrázcích 1A a 1B je znázorněno víko 10; obruba 11 víka; boční stěna 12 víka; a povrch dna 13 . Obruba 11 víka, boční stěna 12 víka a povrch dna 13 tvoří souvislý povrch.

Na obrázku 2 je pohled shora na prstencově těsnění 20 a jeho úchytku 21.

Na obrázcích 3A a 3B je vyobrazené těsnění 20 umístěné na víku 10 . Těsnění 20 se před použitím umístí na obrubě 11 víka 10., pro usnadnění správného umístění těsnění při uzavírání.

Na obrázcích 4A a 4B je znázorněn nosič. Je na nich vidět nosič 3 0 ; lem nosiče 31; prostupná membrána 32; a trubicová podpěra 33 . Kultury tkáňového ekvivalentu se umístují na prostupnou membránu 32 a jsou ohraničeny trubicovítou podpěrou 33. Nosič 30 umožňuje přenos tkáňového ekvivalentu, aniž musí dojít ke kontaktu nebo odstranění tkáňového ekvivalentu během procesu kryokonzervace.

Na obrázcích 5A a 5B je znázorněna miska soupravy. Je na nich vidět miska 4 0 ; povrch dna 41 misky; boční stěna 4 2 misky; obruba 43 misky; a podpěry 44 nosiče. Povrch dna 41 misky, boční stěna 42 misky, obruba 43 misky a podpěry 44 nosiče tvoří souvislý povrch. Podpěry 44 nosiče se dotýkají a podpírají nosič uložený v misce.

Na obrázcích 6A a 6B jsou vyobrazeny boční pohledy na soupravu, rozloženou a sestavenou. Je zde vidět těsnění 20;

víko 10 ; nosič 3 0; a miska 40. Nosič 3.0/ na kterém je umístěn tkáňový ekvivalent, je zavěšen v misce 40. Víko 10 s těsněním 20 je umístěno nad nosičem 30 a je zavěšen přes nosič.

Na obrázku 7 je pohled z blízka na sestavenou soupravu. Je zde znázorněno těsnění 20 ; obruba víka 11; víko 10; nosič 3 0; okraj 31 nosiče; podpory 44 nosiče; a miska (40) . Nosič 30 nesoucí tkáňový ekvivalent je umístěn v misce 40 a je v ní zavěšen tím, že se spodní povrch okraje 31 nosiče dotýká horních povrchů podpor 44 nosiče. Víko 10 s těsněním 20 překrývá nosič 30 a je zavěšeno přes nosič tak, že spodní povrch obruby 11 víka se dotýká vrchního povrchu okraje 31 nosiče. Horní povrchy jak obruby 11 víka tak obruby 43 misky tvoří rovný povrch pro těsnění 20.

Na obrázku 8 je znázorněn pohled ze shora na sestavenou soupravu.

Na obrázku 9 je vyobrazen graf životaschopnosti kryokonzervovaných kultivovaných tkání v porovnání s kultivovanými tkáněmi, které nebyly kryokonzervovány. V grafu je znázorněna životaschopnost kryokonzervovaných kultivovaných tkání měřená pomocí MTT-testu (test metabolické mitochondriální aktivity). Živý ekvivalent kůže (Living Skin Equivalent; LSE) byl dále měřen LDH-testem (test na dehydrogenasuu laktosy). Všechny kultivované tkáně se srovnávají se stejně starými kontrolami, které nebyly kryokonzervovány a výsledky se v grafu vynášejí na osu y jako procento kontroly. Na ose x jsou jednotlivé kultivované tkáně. Ve sloupci 1 jsou výsledky pro štěp kůže při měření MTT-testem (n = 9); ve sloupci 2 jsou výsledky pro štěp kůže při měření LDH-testem (n = 9); ve sloupci 3 jsou výsledky pro kůži ATS při měření MTT-testem (n = 2) , ve sloupci 4 jsou výsledky pro dermální ekvivalent při měření MTT-testem (n = 2) , ve sloupci 5 jsou výsledky pro epidermis při měření MTT-testem (n = 2) a ve sloupci 6 jsou výsledky pro ·· ·· • · · « • ·· ·· ···· »· ···· • · • · ·· · ekvivalent rohovky při měření MTT-testem (n = 2) .

Tkáňové inženýrství je nová oblast, která využívá kultivované tkáňové buňky k vytvoření tkáňových ekvivalentů použitelných pro testování odezvy na poškození chemickými činidly nebo farmaceuticky účinnými sloučeninami. Kultivovaná tkáň se může také použít pro vytvoření transplantovatelné lidské tkáně.

Tkáňové ekvivalenty se rozsáhle popisují v mnoha patentech, například v patentech USA č. 4,485,096; 4,485,097; 4,539,716; 4,546,500; 4,604,346; 4,837,379; a 5,374,515. Jedna úspěšná aplikace tkáňového ekvivalentu se nazývá živý ekvivalent kůže, (Living Skin Equivalent; LSE) jehož morfologie je podobná morfologii opravdové lidské kůže. Živý ekvivalent kůže (LSE) se skládá ze dvou vrstev: horní část tvoří diferenciované a vrstvené lidské epidermální keratinocyty, které překrývají spodní vrstvu lidských dermálních fibroblastů uložených v kolagenní matrix. (Parenteau a kol., Epidermis Generated In Vitro Practical Considerations and Applications, J. of Cellular Biochemistry, 45:245-251 (1991); Parenteau a kol., The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibrblasts to achieve form and function, Cy to technology, 9:163-171 (1992); a Bell a kol., The Living Skin Equivalent: Its Manufacture, Its Organotypic Properties and Its Responses to Irritants, Toxic. in Vitro, 5:591-596 (1991)). Živý ekvivalent kůže (LSE) použitelný pro transplantace je v současné době ve fázi klinických zkoušek pro indikace týkající se poranění, kdy je poškozena část nebo celá tlouštíka kůže, jako je vyříznutí při chirurgických operacích, popáleniny, městnavé vředy žil, diabetické vředy, proleženinové vředy a chronické zánětlivé vředy. Živý ekvivalent kůže (LSE) je dvouvrstvá, stejně silná, in vitro vytvořená kožní tkáň o plné tlouštice.

In vitro ekvivalent rohovky oka byl vyvinut jak je • 9 99 ·· ···· ·· ···· • · · · ·· · ·· ·

99 · · · · · · «9····· · ··· · ······ · * • 9 9 9 9 9 ·· · ·· · popsáno v patentu USA č. 5,374,515. Ekvivalent tkáně rohovky má tři rozdílné buněčné vrstvy. Vnější vrstvu tvoří vrstvený epitel z plochých buněk; střední vrstvu tvoří kolagenní vlákna a buňky stromatu; a vnitřní vrstvu tvoří jednoduchý epitel z plochých buněk, který se také nazývá rohovkový endotel. In vitro ekvivalent rohovky se může používat pro testy toxicity in vitro, kdy slouží jako přesný, levný, nezvířecí model pro testování očního a kožního iritačního potenciálu mnoha typů výrobků a surovin.

Cílem kryokonzervace je zachovat strukturní integritu a životaschopnost biologických materiálů po neomezenou dobu, což umožňuje, aby tyto materiály mohly být dostupné a použitelné v okamžiku potřeby. V případě složitých tkání s omezenou délkou života je kryokonzervace nutná pro rozšíření doby využitelnosti produktu. Historie kryokonzervace bilogického materiálu však svědčí o tom, že optimalizace postupu kryokonzervace pro určitou buňku nezbytně nevede k dobrým výsledkům, jestliže se tento postup použije pro jiný typ buňky nebo pro j iné buňky v tkáni. Je nutné vyvinout specializovanější způsoby kryokonzervace v důsledku rozdílů v hustotě buněk, v obsahu vody a v strukturní organizaci tkáňových ekvivalentů o plné tloušúce. Způsob kryokonzervace podle vynálezu je překvapivě použitelný v případech samotných jednovrstvých epidermálních a dermálních vrstev, dvouvrstvých tkáňových ekvivalentů, třívrstvých ekvivalentů rohovky a získané kůže savců. Vývoj soupravy umožňuje využít kryokonzervaci těchto tkání ve výrobních postupech.

Termín kultivované tkáňové ekvivalenty, jak je zde používán, označuje tkáňové ekvivalenty tkáni savců, kteréžto tkáňové ekvivalenty se připravují způsoby in vitro a patří mezi ně jednovrstvé ekvivalenty kůže, jako je buď dermální ekvivalent nebo epidermální vrstva, dvouvrstvé ekvivalenty kůže, zvláště živý ekvivalent kůže (LSE), a třívrstvé ekvivalenty rohovky a ekvivalenty kůže. Morfologie kultivovaných ·· ··

I · · <

• ·· ·· ···· • · · 9 · ·

9 ·

9· ···· > 9 · » 9 ·

999 9

9

9 savců, typicky lze uvést, že vykazuje mnoho tkáňových ekvivalentů je podobná orgánům lidským orgánům in vivo. Pro ilustraci morfologie živého ekvivalentu kůže (LSE) podobností s lidskou kůží. Metabolicky a mitoticky aktivní lidské dermální fibroblasty (HDF) se nacházejí v celé dermální vrstvě konstruktu a bylo zjištěno, že do sítě vylučují kolagen a další komponenty matrix. Epidermis se skládá z bazální vrstvy, o které bylo zjištěno, že se dělí mitotickou rychlostí podobnou mitotické rychlosti lidské kůže. Suprabazální epidermis má stejné vrstvy jako kůže in vivo, s dobře definovanými trnovými a granulovými vrstvami, které obsahují keratohyalin a lamelární granule, které překrývá zrohovatělá vrstva. Imunohistochemicky se zjistí přítomnost složek mimobuněčné matrix, které se běžně nacházejí na dermo-epidermálním spojení normální lidké kůže, jako je laminin, kolagen typu IV a kalanin (GB3).

Kultivované tkáňové ekvivalenty získané kultivačními způsoby typickými pro jednotlivé orgány, jako je živý ekvivalent kůže (LSE), používají nosič jako kostru, na které se tvoří ekvivalenty. Kultivované tkáňové ekvivalenty se připravují na nosiči, který umožňuje manipulaci s konstruktem během přípravy, jeho přepravu a konečné použití bez přímého kontaktu s konstruktem. Způsoby přípravy kultivovaných tkáňových ekvivalentů se popisují v patentu USA č. 5,374,515 a v patentových přihláškách USA č. 08/193,809 a 08/337,830.

Nosič obsahuje rovnou prostupnou membránu, která je připevněna na jeden konec v podstatě trubicovíté podpěry. Druhý konec trubicové podpěry obsahuje směrem ven rozšířenou obrubu, která zase nese lem, který lze zavěsit na horní konec prohlubně misky pro kultivaci tkání a soupravy podle vynálezu. Velikost sestavy membrána-podpěra je upravena pro použití s kultivační miskou, která má nejméně jednu prohlubeň specifické velikosti, tak aby byl zajištěn potřebný volný prostor kolem podpěry a aby zapadala do horního konce ·· ·· ·· ···· ·· ···· ···· · · · · · · • ·· ♦ · · φ'· • · · · · · · · ··· · ······ · · prohlubně. Sestava membrána-podpěra se’muže vyrábět v*různých velikostech, tak aby se mohla použít s různými velikostmi jak kultivačních misek tak zařízení pro kryokonzervaci a uchovávání. Příkladem těchto nosičů je nosič produkovaný pod ochrannou známkou TRANSWELL (Costar), jak je popsán v patentu USA č. 5,466,602. Odborník může soupravu modifikovat pro umožnění použiti podobných nosičů, které používají odlišné prostředky podpírání a uchycení v kultivačních nádobách. Podobné nosiče jsou popsány v patentech USA č. 5,358,871 a 5,366,893 nebo v patentu USA č. 4,871,674.

Výhodná souprava podle vynálezu zahrnuje nosnou kostru a definuje prostředí kolem tkáňového ekvivalentu, které je možné řídit podle předem určených specifikací. Podle vynálezu se používají materiály, které jsou výhodně ve kvalitě pro použití v medicíně a jsou schopny odolat širokému rozmezí teplot. Tyto materiály se tvarují, aby tvořily misku a víko, které lze spolu uzavřít. Tato nová souprava obsahuje podpěru nosiče, na které se tvoří tkáňové ekvivalenty.

Nová souprava zahrnuje misku a víko, mezi něž se vkládá těsnění. Uspořádání misky a víka je takové, aby vyhovovalo existujícímu nosiči, který obsahuje přichycený tkáňový ekvivalent. Nosič s přichyceným tkáňovým ekvivalentem se umístí do misky a přidá se roztok kryogenního ochranného činidla. Na misku se poté umístí víko a tyto dvě části se uzavřou, aby vytvořily neprodyšné spojení mezi vnitřním a vnějším prostředím soupravy.

Souprava umožňuje rovnoměrnou distribuci kryogenního ochranného činidla pod nosič a nad povrch tkáňového ekvivalentu, přičemž se kryogenní ochranné činidlo udržuje v kontaktu s tkáňovým ekvivalentem, a jak s miskou tak s víkem. Uspořádání soupravy se zakládá na myšlence, že řízené rychlosti chlazení a mrazení lze udržovat se stejným objemem kryogenního ochranného činidla, které je uspořádáno s podobnou geometrií nad a pod kultivovanou tkání určenou ke ·· 44 44 ···· ·· ···· • 4 4 9 9 4 · · 4 · kryokonzervaci. Toto uspořádání zajistuje jednotnou vzdálenost, měřenou od horního a spodního povrchu kultivovaného tkáňového ekvivalentu k vnější stěně soupravy (pokud má souprava rovněž jednotnou tloušťku). Tato jednotnost by se měla projevit v rovnoměrné výměně tepla mezi tkáňovým ekvivalentem a mrazící komorou při chlazení, a mezi vnějším prostředím a tkáňovým ekvivalentam při rozmrazování.

Povrch dna misky přiléhá k postraní stěně a k obrubě. Obruba má rovný povrch pro uzavření misky víkem. Boční stěna misky má jednu spojitou nebo několik nespojitých podpěr, které z této stěny vybíhají směrem dovnitř a jsou její součástí. Horní hrana nosiče obsahující kultivovaný tkáňový ekvivalent je, pokud je nosič umístěn v misce, zavěšena na podpěrách na boční stěně misky. Prostor mezi zavěšeným nosičem a povrchem dna misky má tloušťku asi 1,0 mm a plochu odpovídající přibližně velikosti tkáňového ekvivalentu.

Víko má rovný povrch dna, které přiléhá k boční stěně s obrubou. Průměr obruby víka je mírně menší než je průměr obruby misky. Obruba víka, pokud je umístěno na misku obsahující nosič, se opírá o nosič tak, že horní povrchy obruby víka a obruby misky se vzájemně dotýkají a jsou ve stejné nebo přibližně stejné rovině. Druhý prostor mezi víkem a povrchem kultivovaného tkáňového ekvivalentu má tloušťku rovněž asi 1,0 mm a plochu odpovídající přibližně velikosti tkáňového ekvivalentu.

V soupravě je celkový prostor o výšce okolo 1 mm mezi miskou a dnem nosiče nesoucího tkáňový ekvivalent a okolo 1 mm mezi víkem a tkáňovým ekvivalentem, přičemž nad a pod tkáňovým ekvivalentem je kryogenní ochranné činidlo v kontaktu jak s víkem tak s miskou. Když se víko umístí do misky s mediem, víko vytlačí veškerý vzduch v soupravě do okolního prostoru, který obsahuje trubicovou podpěru nosiče.

Víko s miskou je uzavřeno podél exponované plochy ·· ·· ·· ···· ·· ···· 9··· 99 9 99 9

999 99 9 99 9 99 999 99 9 9999

999999 99 tvořené horními povrchy obrub misky *á”v*ka. Uzavření’*se* může provést působením tepla, lepidlem nebo jinými způsoby známými v oboru. Těsnění mezi víkem a miskou zabraňuje protékání kryogenního ochranného činidla a udržuje vnitřek jednotky sterilní. Výhodně je jak na obrubu víka tak na obrubu misky teplem připojena kruhová vrstva materiálu uzavíratelná působením tepla. Tato vrstva materiálu má výhodně úchytku pro odstranění víka stažením z misky, a tudíž otevření pro umožnění přístupu k tkáňovému ekvivalentu. Podle jiného provedení se víko s obrubou o zhruba stejném průměru jako má obruba misky umístí na misku, ve které je umístěn nosič, tak, že spodní povrch obruby víka těsně přiléhá na horní povrch obruby misky. Obruby se pak spojí.

Misky a víka lze vyrábět z materiálů, kterými jsou neohebné nebo částečně ohebné termoplastické materiály, které se po zahřátí tvarují bud' vakuově nebo vstřikováním, jako je polytetrafluorethylen (PTFE) nebo polyethylentereftalátglykol (PETG). Misky a víka soupravy se před použitím výhodně sterilizují pomocí postupů, které jsou v oboru známé. Způsob sterilizace, který je možné použít, je dán materiálem použitým na výrobu misky a víka. Pro sterilizaci polytetraf luorethylenu (PTFE) nebo polyethylentereftalátglykolu (PETG) je výhodné ozáření paprsky gamma od 2,5 do 3,0 megaradů. Alternativně se mohou používat elektrické a chemické způsoby sterilizace, které jsou odborníkovi známé.

Mezi kultivované tkáňové ekvivalenty patří dermální ekvivalent hydratované kolagenní sítě smrštěné určitým činidlem, výhodně se jedná o fibroblasty. Podle jednoho provedení se na povrchu dermálního ekvivalentu kultivuje vrstvená vrstva epidermálních buněk. Podle jiného provedení se hydratovaná smrštěná kolagenní síč, smrštěná působením keratocytů, umístí na vrstvu endoteliálních buněk rohovky s vrstvenou vrstvou epiteliálních buněk rohovky kultivovaných na povrchu sítě. Alternativně lze kultivovat samotné ·· • · · 4

44

4 4

4 4

4 • 4

4

4

4444

44

epidermální buňky a vyvolat j e j icK***zvřstvéfii * k \fýtv*ořen£ epidermální vrstvy. Kultivovaný tkáňový ekvivalent se tvoří bud' na porézní membráně nosiče nebo na kolagenním gelu, který lne k porézní membráně na povrchu dna nosiče. Kromě toho lze způsobem podle vynálezu kryokonzerovat tkáňové ekvivalenty, mezi které patří libovolné kultivované epidermální vrstvy, kultivované dermální ekvivalenty, kultivované ekvivalenty rohovky nebo získaná kůže savců, aniž by však šlo o omezující seznam.

Vynález bude dále popsán za použití tkáňových ekvivalentů a výhodné soupravy jako ilustrace. Odborníkovi je jasné, že může provést modifikace popsaného způsobu a přitom zůstat v rámci rozsahu vynálezu.

Perfuze tkáňového ekvivalentu roztokem kryogenního ochranného činidla se provádí ponořením tkáňového ekvivalentu s připojeným nosičem do roztoku kryogenního ochranného činidla v objemu, který je dostatečný k ponoření vzorku, při udržení stejného objemu roztoku kryogenního ochranného činidla nad a pod tkáňovým ekvivalentem. Do petriho misky o průměru 100 mm, která obsahuje tkáňový ekvivalent a nosič, se přidá 25 ml 2M glycerolu v Dulbeccovš modifikovaném Eaglově mediu (DMEM) na dobu dostatečnou k úplné perfuzi vzorku, výhodně na jednu až dvě hodiny, ale nejvýhodněji na přibližně jednu hodinu. Delší doba působení roztoku kryogenního ochranného činidla vede ke snížení životaschopnosti buněk v tkáni, zatímco příliš krátká doba působení nezajišťuje úplné proniknutí kryogenního ochranného činidla do tkáně. V případě jednovrstevných konstruktů je typicky nutná kratší doba perfuze, jelikož mají méně vrstev buněk a sníženou bariérovou funkci. Během této hodiny se pronikání roztoku kryogenního ochranného činidla zvýší mícháním vzorku a roztoku kryogenního ochranného činidla, což se typicky provádí třepáním petriho misky na třepačce s kruhovým pohybem (Bellco orbital shaker) při 70 otáčkách za minutu v prostředí 10% ·· ···· oxidu uhličitého. Prostředí 10% oxidu uhličitého, které je stejné jako kultivační prostředí, ve kterém se tkáňový ekvivalent připravuje, brání uvolnění plynů z média a tak udržuje pH základní složky média kryogenního ochranného činidla. Míchání umožňuje rychlejší a dokonalejší perfuzi kryogenního ochranného činidla do tkáňového ekvivalentu a lepší reprodukovatelnost výsledků u jednotlivých zmrazených tkáňových ekvivalentů. Třepačku s kruhovým pohybem lze nahradit zařízením, které provádí pohyb v jiných prostorových rovinách. Mezi další způsoby pro mechanické zvýšení perfuze zahrnují, aniž by se však jednalo o omezující výčet, kývání konstruktu s kryogenním ochranným činidlem v nádobě na plošině nebo centrifugace konstruktu s kryogenním ochranným činidlem a perfuze kryogenního ochranného činidla kolem konstruktu za použití pumpy.

Nosič a přichycený tkáňový ekvivalent se umístí do misky a přidá se celkem okolo 16,0 ml roztoku kryogenního ochranného činidla. Souprava umožňuje rovnoměrné rozdělení kryogenního ochranného činidla: přibližně 8,0 ml se dostane pod nosič a přibližně 8,0 ml se dostane nad povrch tkáňového ekvivalentu. Na misku se pak umístí víko a obě části se spojí a uzavřou teplem.

Takto zabalené tkáňové ekvivalenty se umístí do programovatelné mrazící komory (Cryomed nebo Planer) při počáteční teplotě odpovídající teplotě místnosti, výhodně 20,0° C. Mrazící komora obsahující zmíněné v soupravě uzavřené tkáňové ekvivalenty se chladí rychlostí -10,0° C/min na teplotní rozmezí rovnováhy pevné a kapalné fáze pro kryogenní ochranné činidlo, jejíž hodnota se v případě 2M glycerolu obsaženého v Dulbeccově modifikovaném Eaglově mediu (DMEM) pohybuje mezi přibližně -5,3° C až -6,0° C. Teplota rovnováhy pevné a kapalné fáze je teplota nutná pro vytvoření jader (nukleaci) ledu v kryogenním ochranném činidle. Teplota v komoře se udržuje po určitý čas za účelem vyrovnání vnitřní ·· · · · · ···· ·· ···· ···· · · · · · · ··· · · * ··· • · ··· · · · ··· · ······ · · teploty uzavřených tkáňových ekvivalent*ú”ná* teplotu komory. Rychlost chlazeni použitá k dosažení teploty pro tvoření jader ledu není rozhodující. Pro dosažení tepelné rovnováhy je dostatečná doba 40 minut, nicméně bude tato doba kolísat v závislosti na velikosti komory, cirkulaci vzduchu v komoře a počtu souprav, které se mrazí. Typicky je nutná doba alespoň 30 minut, nicméně pro zajištění dosažení rovnováhy může tato doba činit až jednu hodinu. Po této době se iniciuje tvorba mimobuněčného ledu nukleací.

Nukleace ledu (tvoření jader ledu) se definuje jako způsob vyvolání tvorby ledu v mimobuněčném kryogenním ochranném činidle. Jedním výhodným způsobem tvorby jader ledu je přiložení zchlazené sondy ke stěně misky obsahující tkáň, jako je ocelová tyčka chlazená kapalným dusíkem (-196° C) . Místo dotyku tyčky se soupravou musí být pod hladinou kryogenního ochranného mrazícího media. Dalším výhodným způsobem je přímé uvolnění expandujících plynů, jako je freon nebo oxid uhličitý, do prostoru vně soupravy. Tvorba ledu se může vyvolat dutým hřebem, kde se teplota snižuje a zvyšuje v rozmezí, které je dostatečné pro tvorbu krystalů ledu. Tvorba ledu se může vyvolat i dalšími způsoby, které jsou známy v oboru.

Jakmile u všech tkáňových ekvivalentů proběhlo vytvoření jader krystalů ledu, soupravy se uchovávají při což umožní dosažení zárodečných krystalů ochranného činidla, výše uvedené teplotě další hodinu, termodynamické rovnováhy a rozšíření ledu do celého objemu kryogenního

Chlazení pak pokračuje rychlostí výhodně mezi přibližně -0,02 až přibližně -0,3°C za minutu, výhodněji mezi přibližně -0,05° C až -0,1° C/min a nejvýhodněji -0,07° C/min, na konečnou teplotu nejméně -70,0° C nebo méně, výhodněji na výhodněji na teplotu -140° C a -196° C. Jak se konečná teplota teplotu -120° C, ještě nejvýhodněji na teplotu mrazení blíží teplotě skelného přechodu vody, tedy teplotě ·· ·· ·· ···· ·· ···· ······ · · · · ··· ·· · ·· · ·· ··· ·· · · · · · ······ ··

-120° C, snižuje se pravděpodobnost škodlivého* koli*sání teploty během přenosu do konečného místa uchovávání.

Kryokonzervované tkáňové ekvivalenty se přenesou z programovatelného mrazáku do skladovací nádoby s kapalným dusíkem, kde probíhá skladování v plynné fázi (Dewar) při teplotě mezi -120° C a -150° C, nebo do kapalného dusíku, kde probíhá skladování při teplotě -196° C, ke skladování do doby použití.

Za účelem rozmražení se kryokonzervované tkáňové ekvivalenty vyjmou ze skladovací nádoby s kapalným dusíkem, kde probíhá skladování v plynné fázi a přenesou se na suchý led, pro zvýšení teploty na přibližně -75° C. Po dosažení teploty -75° C se kultivované tkáňové ekvivalenty přenesou do prostředí, výhodně vodní lázně, o teplotě výhodně 37° C, výhodněji 4° C nebo nejvýhodněji o teplotě místnosti. Jakmile je vidět, že všechno kryogenní ochranné medium přešlo do kapalné fáze, výhodně se souprava s kultivovaným tkáňovým ekvivalentem přenese do sterilní nádoby nebo do jiného aseptického prostředí a sterilizuje se ethanolem. Víko se odstraní odtržením nebo odříznutím od dna jednotky. Každý nosič obsahující kultivované tkáňové ekvivalenty se pak přenese do petriho misky, přičemž se vylije nadbytek kryogenního ochranného činidla. Pro odstranění zbytku kryogenního ochranného činidla z kultivovaného tkáňového ekvivalentu se poté do petriho misky obsahující kultivovaný tkáňový ekvivalent na dobu zhruba 30 minut přidá 25 ml promývacího roztoku, výhodně Dulbeccovova modifikovaného Eaglova media (DMEM) při teplotě místnosti. Odborník může určit jiné vhodné promývací roztoky, výhodně roztoky s fyziologickou koncentrací, jako je medium pro kultivací buněk nebo fosfátem pufrovaný fyziologický roztok. Promývací roztok se vymění a kultivovaný tkáňový ekvivalent se promývá po dobu dalších 30 minut. Doba promývání se může lišit v závislosti na složitosti tkáně.

·· ·· ·· ···· ·· ···· ···· ·· · · · · ··· · · · · · · • · ··· · · · ···· ······ · ·

Kultivovaná tkáňový ekvivalent se ‘řffllžě* přďnésb zpět do jeho původní kultivační nádoby a rekultivovat v mediu pro udržování kultur při teplotě 37° C v prostředí 10% oxidu uhličitého. Alternativně lze ekvivalent aplikovat pacientovi nebo se může použít pro testování odezvy na kontakt s určitou látkou, jak popsáno v patentu USA č. 4,835,102.

Pro lepší ilustraci vynálezu jsou uvedeny následující příklady, jimiž se však rozsah vynálezu v žádném směru neomezuje. Odborníkovi je jasné, že zde popsané způsoby lze různě modifikovat, aniž by se přitom odchýlil od podstaty a rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklady 1 až 3

Příklady 1 až 3 popisují kryokonzervaci a rozmrazování podle vynálezu za použití výhodné soupravy.

Příklad 1

Kryokonzervace živého ekvivalentu kůže (LSE) za použití soupravy

Konstrukty živého ekvivalentu kůže (LSE) se připraví podle patentové přihlášky USA č. 08/193,809. Živé ekvivalenty kůže a 75 mm velké nosičové inzerty (TRANSWELL, Costar, Cambridge), 9 až 10 dnů po zpracování vzduchem (air-liftu), se umístí do petriho misek (Costar) o průměru 100 mm. Konstrukty živých ekvivalentů kůže se perfundují kryogenním ochranným činidlem tak, že se tyto konstrukty s nosičem TRANSWELL ponoří v petriho misce o průměru 100 mm na jednu hodinu do 25 ml kryogenního ochranného media, což je 2M glycerol v Dulbeccově modifikovaném Eaglově mediu (DMEM). Během perfuze se konstrukty míchají po dobu jedné hodiny na ·· ·· ·· ···· ·· ···· • · · · · · · ·· · • ·· ··· ··· • · ··· · · · ···· třepačce s kruhovým pohybem (Bellco) »při·· 70 •ctačkáct? 2a minutu v prostředí 10% oxidu uhličitého. Míchání umožňuje dokonalejší perfuzi a lepší reprodukovatelnost způsobu kryokonzervace. Po ukončení perfuze živého ekvivalentu kůže (LSE) se petriho misky obsahující živý ekvivalent kůže, nosičové inzerty a mimobuněčné mrazící medium (2M glycerol v DMEM) umístí do kryokonzervační soupravy, která se uzavře teplem. Soupravy pro kryokonzervaci jsou popsány v související patentové přihlášce USA č. --/---,---, podané stejný den jako tato přihláška vynálezu.

Komora programovatelného mrazáku (Planar) se vybaví zde popsaným způsobem podle vynálezu. V mrazáku se nastaví počáteční teplota na 20,0° C. Potrubí se profoukne freonem za jednu sekundu pro odstranění vzduchu v potrubí. Soupravy s živým ekvivalentem kůže se opatrně umístí do stojanů, z nichž každý pojme osm souprav. Stojany se umístí na místo určené čepy vedle zkrápěcích kolejnic. Dveře komory mrazáku se uzavřou, aby se komora izolovala od vnějšího prostředí.

Jednotky s živými ekvivalenty kůže se chladí rychlostí -10° C/min na teplotu -6° C a teplota -6° C se v mrazící komoře udržuje po dobu 40 minut, aby došlo k vyrovnání teploty kryogenního ochranného činidla a perfunodvaných konstruktů na teplotu komory. Po těchto 40 minutách se vyvolá tvorba mimobuněčného ledu přímým zavedením freonu po dobu 1 sekundy do bezprostřední blízkosti stěny soupravy. Freon se odpařuje z povrchu soupravy, což způsobuje na plochách soupravy, jež přišly do kontaktu s freonem, pokles teploty, který je dostatečný pro vyvolání tvorby mimobuněčného ledu.

Poté, co se ve všech jednotkách s živým ekvivalentem kůže vytvoří jádra krystalů ledu, teplota se udržuje na hodnotě -6° C po dobu jedné hodiny. Teplota mrazící komory se pak sníží rychlostí -0,07° C/min na konečnou teplotu -20° C. Komora se pak chladí rychlostí -0,5° C/min na konečnou teplotu -70° C. Po kryokonzervaci živého ekvivalentu kůže se • · · • · · ···· ·· ·· ·· • · · ·

jednotky přemístí do skladovací nádoby kde skladování probíhá v plynné fázi (Dewar), kde je teplota -120° C až -150° C.

Příklad 2

Rozmražení kryokonzervavaného živého ekvivalentu kůže (LSE)

Kryokonzervavaný živý ekvivalent kůže (LSE) se vyjme ze skladovací nádoby s kapalným dusíkem, kde probíhá skladování v plynné fázi, a přenese se na suchý led, aby se ohřál na teplotu okolo -75° C. Jakmile se teplota ustálí na -75° C, kultivovaný tkáňový ekvivalent se přenese do vodní lázně, jejíž teplota je výhodně 37° C, výhodněji 4° C a nejvýhodněji teplota místnosti. Když je vidět, že všechno kryogenní ochranné medium přešlo do kapalné fáze, výhodně se soupravy s kultivovanými tkáňovými ekvivalenty přenesou do sterilní nádoby nebo do jiného aseptického prostředí a sterilizují se ethanolem. Víko se odstraní odtržením nebo odříznutím od dna jednotky. Každý nosič obsahující kultivované tkáňové ekvivalenty se pak přenese do petriho misky, přičemž se vylije nadbytek kryogenního ochranného činidla. Pro odstranění zbytku kryogenního ochranného činidla z kultivovaného tkáňového ekvivalentu se poté do petriho misky obsahující kultivovaný tkáňový ekvivalent na dobu zhruba 30 minut přidá 25 ml promývacího roztoku, výhodně Dulbeccovova modifikovaného Eaglova media (DMEM), o teplotě místnosti. Odborník může určit jiné vhodné promývací roztoky, jako je jiné medium pro kultivaci buněk nebo fosfátem pufrovaný fyziologický roztok. Promývací roztok se vymění a kultivovaný tkáňový ekvivalent se promývá po dobu dalších 30 minut.

Rozmražené kryokonzervované a kontrolní vzorky se zpracují histologickými metodami a pomocí světelného mikroskopu se hodnotí jejich morfologie a životaschopnost. Životaschopnost rozmražených kryokonzervovaných vzorků se blíží 100 % a jsou skoro neodlišitelné očf*RolítroT?

·· ·· ·· ···· ·· ···· ······ · · · · • ·* ··· · · · ·· · · · · · · ··· · ······ · · »· ·

Příklad 3

Hodnocení soupravy pro kryokonzervaci z hlediska rychlosti zahřívání a teplotní rovnoměrnosti

Souprava pro kryokonzervaci podle vynálezu se hodnotí z hlediska stejnoměrného přenosu tepla. Na nosnou membránu bez kultivovaného tkáňového ekvivalentu se umístí 5 termočlánků, přičemž jeden se umístí do středu a další čtyři se rovnoměrně rozmístí 1,0 mm od periférní stěny nosiče. Kabely termočlánků vystupují ze soupravy na straně mezi obrubami víka a misky a vedou k zařízení zaznamenávajícímu teplotu (Azonix Scanner Plus) . Souprava se naplní 17 ml kryogenního ochranného činidla a uzavře se teplem. Teplota soupravy se rovnovážně ustaví na teplotě -70° C a pak se souprava přenese do vodní lázně o teplotě 20° C. Během zahřívání záznamové zařízení zaznamenává teplotu každého termočlánku každou 1 až 2 sekundy. Souprava se zahřívá nejprve rychlostí 700° C/min, a tato rychlost se snižuje v okamžiku, kdy se teplota blíží teplotě tání roztoku kryogenního ochranného činidla. Teplotní rovnoměrnost se pohybuje mezi 2° C až 6° C průměrné teploty termočlánku během nejvyšší rychlosti zahřívání a dosahuje 8° C v okamžiku, kdy teplota dosáhne teploty tání roztoku.

Příklady 4 až 12 popisují způsob kryokonzervace různých druhů tkání podle vynálezu.

Příklad 4

Kryokonzervace epidermálních vrstev

Epidermální vrstva se vytvoří z maturovaného živého ekvivalentu kůže (LSE) 12 dnů po zpracování vzduchem ·· 44 » 4 4 « • 4 4 (air-liftu) . Odejmutí epidermální vrstvy’šě provádí odtržením dermální substrátové vrstvy od epidermální vrstvy pinzetou a odstraněním dermální vrstvy. Každá vrstva se nařeže na tři stejné kusy. Jeden kus z každé vrstvy se uschová jako kontrola. Zbývající dva kusy každé vrstvy se umístí na 75 mm velkou polykarbonátovou membránu TRANSWELL (Costar) do kultivačních misek o průměru 100 mm (Costar). Provádí se perfuze každého kusu vrstvy 25 ml DMEM a 2M glycerolem po dobu jedné hodiny. Misky obsahující konstrukty se míchají na třepačce s kruhovým pohybem (Bellco) při 70 otáčkách za minutu po dobu 1 hodiny v prostředí 10% oxidu uhličitého. Po perfuzi epidermální vrstvy se petriho miska obsahující nosič TRANSWELL a mimobuněčně mrazící a DMEM) umístí do sáčku a vakuově se uzavře pomocí zařízení Audiovox naprogramovaného na pět sekund tvoření vakua a 3,9 sekund utěsňování.

epidermální vrstvu, medium (2M glycerol

Takto uzavřené epidermální vrstvy se umístí do programovatelného mrazáku (Planer) s počáteční teplotou 20,0° C. Epidermální vrstvy se chladí rychlostí -10,0° C/min na teplotu -6,0° C. Teplota se drží na hodnotě -6,0° C po dalších 20 minut za účelem vyrovnání teploty tkáně na teplotu komory. Po uplynutí těchto 20 minut se iniciuje vytváření mimobuněčného ledu tak, že se ze zevní strany sáčku pod hladinu mrazícího media přiloží sonda chlazená kapalným dusíkem. Poté, co ve všech epidermálních vrstvách dojde k vytvoření jader krystalů ledu, se teplota udržuje po dobu dalších 5 minut na hodnotě -6,0° C. Komora se pak chladí rychlostí -1,0° C/min na teplotu -8,0° C. Teplota se potě udržuje po dobu 30 minut na hodnotě -8,0° C pro umožnění stejnoměrného rozmístění ledu ve vzorku. Komora se potom chladí rychlostí -0,1° C/min na konečnou teplotu -70,0° C.

Kryokonzervované epidermální vrstvy se vyjmou z mrazáku, sáčky se rozstřihnou a z petriho misek se odstraní víko. Pro rozmražení se do každé petriho misky asepticky ·· ·· ·· ·· • · · ' · · • ·· · · • · · · · · · • · · · · * ···· · · · · · nalije 40 ml Dulbeccova modifikovaného Eaglova media (DMEM) zahřátého na teplotu 37° C. Po 45 sekundách se z misek odstraní veškerá kapalina a do každé misky se přidá dalších 40 ml media na 2 minuty. Po roztáni veškerého ledu se epidermální vrstvy promývaj í po dobu 3 0 minut 25 ml media DMEM. Medium se vymění a vzorek se znovu promývá po dobu 3 0 minut. Epidermální vrstvy se poté inkubují v mediu pro uchovávání kultur při teplotě 37° C v prostředí 10% oxidu uhličitého po dobu 24 hodin před analýzou. Inkubační doba je dlouhá jako interval, který typicky potřebují zmrzlé buňky pro zpětné ustanovení podmínek stabilního stavu.

Jedna ze dvou částí každé epidermální vrstvy se zkoumá histologicky, a druhá část se testuje MTT-testem. Srovnání fotomikrografu epidermální vrstvy, která nebyla kryokonzervována, a kryokonzervované epidermální vrstvy z příkladu 4 ukazuje, že všechny tři základní vrstvy epidermis, což je bazální vrstva epidermis, suprabazální vrstva epidermis a zrohovatělá vrstva epidermis, se uvedeným způsobem konzervují. Všechny vrstvy jsou neporušené a celková morfologie kryokonzervované epidermální vrstvy je stejná jako morfologie epídermálních vrstev, které nebyly kryokonzervovány.

Příklad 5

Kryokonzervace dermálních ekvivalentů

Dermálními ekvivalenty použitými v tomto příkladu jsou neepidermalizované složky živého ekvivalentu kůže (LSE). Dermální ekvivalenty se zmrazí 8 dní po otisku. Perfuze dermálních ekvivalentů kryogenním ochranným činidlem se provede ponořením dermálních ekvivalentů přichycených na 75 mm velké nosiče TRANSWELL (Costar) umístěných v petriho miskách (Costar) o průměru 100 mm do 25 ml Dulbeccova modifikovaného Eaglova media (DMEM) s 2M glycerolem na 1 hodinu. Petriho misky se míchají na třepačce s kruhovým ···<· • · · · • ·· • · • ·

• · · • ♦ · • ··· · • ·

pohybem (Bellco) při 70 otáčkách za minutu v prostředí 10% oxidu uhličitého. Po perfuzi dermálních ekvivalentů se petriho misky, dermální ekvivalenty, nosiče a mimobuněčné mrazicí medium umístí do programovatelného mrazáku (Planer) s počáteční teplotou 20,0° C. Komora se poté chladí rychlostí -10,0° C/min na teplotu -6,0° C. Teplota se udržuje na této hodnotě po dobu 20 minut za účelem vyrovnání teploty tkáně na teplotu komory. Po uplynutí těchto 20 minut se iniciuje vytváření mimobuněčného ledu tak, že se ze zevní strany misek pod hladinu mrazícího media přiloží sonda chlazená kapalným dusíkem. Poté, co ve všech dermálních ekvivalentech dojde k vytvoření jader krystalů ledu, se teplota udržuje po dobu dalších 5 minut na hodnotě -6,0° C. Komora se pak chladí rychlostí -1,0° C/min na teplotu -8,0° C. Teplota se znovu udržuje po dobu 30 minut na hodnotě -8,0° C pro umožněni stejnoměrného rozmístění ledu ve vzorku. Dermální ekvivalenty se potom chladí rychlostí -0,1° C/min na konečnou teplotu -70,0° C.

Kryokonzervované dermální ekvivalenty se vyjmou z mrazáku a z petriho misek se odstraní víko. Pro rozmražení se do každé petriho misky asepticky nalije 40 ml Dulbeccova modifikovaného Eaglova media (DMEM) zahřátého na teplotu 37° C. Po 45 sekundách se z misek odstraní veškerá kapalina a do každé misky se přidá dalších 40 ml media na 2 minuty. Po roztáni veškerého ledu se dermální ekvivalenty promývají po dobu 30 minut 25 ml media DMEM. Medium se vymění a vzorek se znovu promývá po dobu 30 minut. Dermální ekvivalenty, stále připojené k nosiči TRANSWELL, se poté přenesou zpátky do kultivačních misek a inkubují se v mediu pro uchovávání kultur při teplotě 37° C v prostředí 10% oxidu uhličitého po dobu 24 hodin před analýzou. Inkubační doba je dlouhá jako interval, který typicky potřebuji zmrzlé buňky pro zpětné ustanovení podmínek stabilního stavu. Vzorky se testují MTT-testem.

·· ·· » · · <

• ·· ·· ···· » · · » · · » · ··· na 24 mm velkých 9 dnů do zoracování

Příklad 6

Kryokonzervace ekvivalentů rohovky

Ekvivalenty rohovky přichycené nosičích TRANSWELL (Costar) se umístí vlhkým vzduchem do misky s šesti jamkami (Costar). Perfuze ekvivalentů rohovky kryogenním ochranným činidlem se provede ponořením každého ekvivalentu rohovky a nosiče do 4 ml mimobuněčného mrazícího media (2M glycerol v mediu DMEM) v miskách s šesti jamkami na 1 hodinu. Misky s šesti jamkami obsahující konstrukty rohovky se třepou na třepačce s kruhovým pohybem (Bellco) při 70 otáčkách za minutu v prostředí 10% oxidu uhličitého. Po perfuzi ekvivalentů rohovky se petriho misky obsahující ekvivalenty rohovky, nosič a mimobunščné mrazící medium umístí do programovatelného mrazáku (Planer) s počáteční teplotou 20,0° C. Ekvivalenty rohovky se poté chladí rychlostí -10,0° C/min na teplotu -6,0° C. Teplota se udržuje na této hodnotě po dobu 20 minut za účelem vyrovnání teploty tkáně na teplotu komory. Po uplynutí těchto 20 minut se iniciuje vytváření mimobuněčného ledu tak, že se ze zevní strany každé jamky pod hladinu mrazícího media přiloží sonda chlazená kapalným dusíkem. Poté, co ve všech ekvivalentech rohovky dojde k vytvoření jader krystalů ledu, se teplota udržuje po dobu dalších 5 minut na hodnotě -6,0° C. Komora se pak chladí rychlostí -1,0° C/min na teplotu -8,0° C. Teplota se znovu udržuje po dobu 30 minut na hodnotě -8,0° C pro umožnění stejnoměrného rozmístění ledu ve vzorku. Dermální ekvivalenty se potom chladí rychlostí -0,1° C/min na konečnou teplotu -70,0° C.

Kryokonzervované ekvivalenty rohovky se vyjmou z mrazáku a z misek se odstraní víko. Pro rozmražení se do každé jamky misky asepticky nalije 6 ml Dulbeccova modifikovaného Eaglova media (DMEM) zahřátého na teplotu

37° C. Po 45 sekundách se z misek odstraní veškerá kapalina a do každé misky se přidá dalších 6 ml media na 2 minuty. Za použití sterilních lékařských kleští se ekvivalenty rohovky a navázané nosiče TRANSWELL přenesou do nové misky. Pro promytí se do každé jamky vnesou 4 ml media DMEM na 30 minut. Medium se vymění a vzorek se znovu promývá po dobu 30 minut. Rohovky se poté přenesou zpátky do stejných kultivačních misek a inkubuji se v mediu pro uchovávání rohovky při teplotě 37° C v prostředí 10% oxidu uhličitého po dobu 24 hodin před analýzou. Inkubační doba je dlouhá jako interval, který typicky potřebují zmrzlé buňky pro zpětné ustanovení podmínek stabilního stavu. Vzorky se testují MTT-testem.

Příklad 7

Kryokonzervace získané myší kůže

Myši	divokého	typu,	kmen	B6CB6YF1, se usmrtí	předávko-
váním Nembutalem.	Kůže	se	odebere aseptickým	způsobem.
Nadbytečné	krevní	cévy,	tuk	a pojivá tkáň se	z dermu
odstraní.	Myší kůže se	upravila na pravoúhlý	kousek o

rozměrech 1 x 2 cm. Kousky myší kůže se pak umístí na 75 mm velký nosič TRANSWELL (Costar) do petriho misky o průměru 100 mm. Perfuze myší kůže kryogenním ochranným činidlem se provede ponořením do 25 ml 2M glycerolu v Dulbeecově modifikovaném Eaglově media (DMEM) v petriho miskách o průměru 100 mm na 1 hodinu. Během perfuze se petriho misky obsahující myší kůži a nosič třepou po dobu 1 hodiny na třepačce s kruhovým pohybem (Bellco) při 70 otáčkách za minutu v prostředí 10% oxidu uhličitého. Kontrolní myší kůže, u které se neprovádí kryokonzervace, se uchovává v živném mediu při teplotě 4° C pro dobu trvání kryokonzervace a rozmrazování (dva dny) před transplantací kůže.

Po perfuzi myší kůže se petriho misky obsahující myší kůži, nosiče TRANSWELL a mimobuněčné mrazící medium umístí do programovatelného mrazáku (Planer) s počáteční teplotou 20,0° C. Myší kůže se poté chladí rychlostí -10,0° C/min na teplotu -6,0° C. Teplota se udržuje na této hodnotě po dobu 20 minut za účelem vyrovnání teploty tkáně na teplotu komory. Po uplynutí těchto 20 minut se iniciuje vytváření mimobuněčného ledu tak, že se ze zevní strany misek přiloží sonda chlazená kapalným dusíkem. Místo přiložení musí být pod hladinou mrazícího media. Poté, co ve všech vzorcích myší kůže dojde k vytvoření jader krystalů ledu, se teplota udržuje po dobu dalších 5 minut na hodnotě -6,0° C. Komora se pak chladí rychlostí -1,0° C/min na teplotu -8,0° C. Teplota se znovu udržuje po dobu 3 0 minut na hodnotě -8,0° C pro umožnění stejnoměrného rozmístění ledu ve vzorku. Vzorky se potom chladí rychlostí -0,1° C/min na konečnou teplotu -70,0° C.

Kryokonzervovaná myší kůže se vyjme z mrazáku a z misky se odstraní víko. Pro rozmražení se do každé petriho misky asepticky nalije 40 ml Dulbeccova modifikovaného Eaglova media (DMEM) zahřátého na teplotu 37° C. Po 45 sekundách se z misek odstraní veškerá kapalina a do každé misky se přidá dalších 40 ml media na 2 minuty. Po roztáni veškerého ledu se myší kůže promývá v miskách po dobu 3 0 minut 25 ml media DMEM. Medium se vymění a vzorek se znovu promývá po dobu 3 0 minut.

Rozmražené kryokonzervované a kontrolní vzorky se histologicky vyhodnotí nebo se transplantují myším. Srovnání fotomikrografu myšší kůže, která nebyla kryokonzervována, a kryokonzervované myšší kůže svědčí o tom, že čtyři základní vrstvy myšší kůže, což je dermis s fibroblasty, bazální vrstva epidermis, suprabazální vrstvy epidermis a zrohovatělá vrstva epidermis, se uvedeným způsobem konzervují. Všechny vrstvy jsou neporušené a morfologie kryokonzervované myšší kůže je stejná jako morfologie myšší kůže, která nebyla kryokonzervována.

Kryokonzervace kůže ATS SKIN2

SKIN2, model ZK 1300 (Advanced Tissue Sciences, La Jolla, Kalifornie, USA) se vyjme po doručení z balíčku podle přiloženého návodu a umístí se do kultivačních misek (Costar). Inzerty nosiče TRANSWELL se umístí nad SKIN2, aby se kožní konstrukt udržoval ponořený. Perfuze kůže SKIN2 kryogenním ochranným činidlem se provádí ponořením na dobu 1 hodiny do 2M glycerolu v Dulbeccovš modifikovaném Eaglovš mediu (DMEM) v kultivační misce. Během perfuze se kultivační misky obsahující konstrukt a nosič třepou po dobu jedné hodiny na míchačce s kruhovým pohybem (Bellco) při 70 otáčkách za minutu v prostředí 10% oxidu uhličitého.

Po perfuzí kůže SKIN2 se vzorky umístí do programovatelného mrazáku (Planer) s počáteční teplotou 20,0° C. SKIN2 se poté chladí rychlostí -10,0° C/min na teplotu -6,0° C a udržují se při teplotě -6,0° C po dobu 20 minut za účelem vyrovnání teploty tkáně na teplotu komory. Po uplynutí těchto 20 minut se iniciuje vytváření mimobuněčného ledu tak, že se ze zevní strany misek přiloží pod hladinou mrazícího media sonda chlazená kapalným dusíkem. Poté, co ve všech vzorcích SKIN2 dojde k vytvoření jader krystalů ledu, se teplota udržuje po dobu dalších 5 minut na hodnotě -6,0° C. Komora se pak chladí rychlostí -1,0° C/min na teplotu -8,0° C. Teplota se pak udržuje po dobu 30 minut na hodnotě -8,0° C pro umožnění stejnoměrného rozmístění ledu ve vzorku. SKIN2 se potom chladí rychlostí -0,1° C/min na konečnou teplotu -70,0° C.

Kryokonzervovaná SKIN2 se vyjme z mrazáku, z misek se odstraní víka a do každé kultivační misky se asepticky nalije Dulbeccovo modifikované Eaglova medium (DMEM) zahřáté na teplotu 37° C. Po 45 sekundách se z misek odstraní veškerá ···:·:> ·. ·: · .::.:..-.3 : :/.:

kapalina a do každé misky se přidá další DMEM na 2 minuty. Po rozmražení se SKIN2 a navázaný nosič TRANSWELL přenesou za použití sterilních lékařských kleští do nových kultivačních misek. Pro vymytí kryogenního ochranného činidla ze SKIN2 se do každé kultivační misky obsahující SKIN2 přidá na 30 minut DMEM. Medium se vymění a vzorek se znovu promývá po dobu 3 0 minut. SKIN2 se poté přenese zpátky do stejného typu kultivačních misek a inkubují se v mediu pro uchovávání kultur při teplotě 37° C v prostředí 10% oxidu uhličitého po dobu 24 hodin před analýzou. Inkubační doba je opět dlouhá jako interval, který typicky potřebují zmrzlé buňky pro zpětné ustanovení podmínek stabilního stavu.

Kryokonzervované a kontrolní konstrukty se podrobí MTT-testu postupem připojeným k produktu SKIN2 model ZK1300 a vyhodnotí se rovněž histologicky. Srovnání fotomikrografů SKIN2, která nebyla kryokonzervována, a kryokonzervované SKIN2 svědčí o tom, že čtyři základní vrstvy SKIN2, což je kolagenová síť s fibroblasty, bazální vrstva epidermis, suprabazální vrstvy epidermis a zrohovatělá vrstva epidermis, se uvedeným způsobem konzervují. Všechny vrstvy jsou neporušené a celková morfologie kryokonzervované SKIN2 je podobná jako morfologie SKIN2, která nebyla kryokonzervována.

Příklad 9

Test metabolické mitochondriální aktivity (MTT-test)

Zmrazený a nezmražený (kontrola) živý ekvivalent kůže (LSE), epidermální vrstva, dermální ekvivalenty a ekvivalenty rohovky se testují MTT-testem. (Konstrukty SKIN2 se testují podle protokolu, který se přikládá k výrobku: MTT Assay Protocol for use with Model ZK1300). Životaschopnost buněk konstruktů se měří MTT-testem, což je kolorimetrický test konverze MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazolium-bromidu), který byl vyvinut za účelem měření buněčného růstu a životaschopnosti ····

popisují Gay a kol., v práci The Living Skin Equivalent as a Model In Vitro for Ranking the Toxic Potential of Dermal Irritants, Toxic. in Vitro, 6:303-315 (1992). Metabolická redukce rozpuštěné tetrazoliové soli na vysrážený modrý formazan závisí na přítomnosti životaschopných buněk s neporušenou mitochondriální funkcí. Tento test se používá pro kvantifikaci cytotoxicity u různých typů buněk, včetně kultivovaných lidských keratinocytů.

Do kultivačních misek obsahujících bud' živý ekvivalent kůže (LSE), epidermální vrstvu nebo dermální ekvivalent se přidá 40 ml testovacího a do jamek obsahujících ekvivalenty rohovky se přidá 1,5 ml testovacího media, které obsahuje 0,33 mg/ml MTT (3 -(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazolium-bromid; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) . Tkáňové ekvivalenty se inkubuji v tomto mediu po dobu 3 až 4 hodin. Na konci doby konverze se provede bíopsie tkáňového ekvivalentu za použití 8 mm silné jehly určené pro biopsie kůže. Bioptické vzorky se pak extrahují po dobu 2 až 3 hodin při teplotě místnosti v 0,3 ml isopropanolu okyseleného 0,04N kyselinou chlorovodíkovou. Na konci extrakce se 0,2 ml každého extraktu přenese do jamky desky s 96 jamkami. Změří se absorbance na přístroji pro měření absorbance desek (Dynatech) při vlnové délce 570 nm, přičemž se jako slepý vzorek se používá isopropanolové extrakční medium. Hodnoty MTT-testu získané pro rozmražené kryokonzervované vzorky se srovnají s odpovídajícími kontrolními vzorky a vyjadřují se jako procento kontroly (obrázek 4).

Příklad 10

Test na dehydogenasu laktosy (LDH-test)

Dehydrogenasa laktosy (LDH) je enzym, který se běžně vyskytuje uvnitř životaschopné buňky. Poškození buňky . .......... · ·!··*··* *··* · ·· · způsobuje uvolnění enzymu a odpovídající snížení enzymatické aktivity, která se detekuje tímto testem.

Z kontrolních a rozmražených kryokonzervovaných vzorků a kontrolních vzorků živého ekvivalentu kůže (LSE) se odebere jehlou o průměru 8 mm bioptický vzorek. Z každé jednotky živého ekvivalentu kůže (LSE) se odeberou tři vzorky. Tyto vzorky se umístí do 15 mm dlouhých zkumavek s 1 ml 0, ÍM triethanolaminového pufru (chladí se ledem) a homogenizují se elektrickým tkáňovým homogenizerem po dobu 1 minuty. Vzorky se pak centrifugují při 1000 g a teplotě 4° C. Supernatant se poté podrobí testu. Reakční činidlo pro LDH-test se připraví smícháním 3,00 ml fosfátového pufru (0,1 mol/1; pH 7,0), 0,1 ml sodné soli pyruvatu (2,5 mg/ml) a 0,05 ml sodné soli NADH (10 mg/ml) . 100 μΐ vzorku supernatantu se přidá ke

900 μ.1 uvedeného činidla a nechá se reagovat po dobu dvou minut. Během těchto dvou minut se zaznamenávají změny v absorbanci. Průměrná hodnota vypočtená ze tří vzorků z každé kryokonzervované jednotky živého ekvivalentu kůže (LSE) se srovná s nezmraženými kontrolami. Hodnoty získané pro dané vzorky se porovnají s odpovídajícími kontrolními hodnotami a vyjadřují se jako procento kontroly (obrázek 4).

Příklad 11

Bioekvivalence kryokonzervovaného živého ekvivalentu kůže a živého ekvivalentu kůže, který nebyl kryokonzervován

Za účelem prokázání bioekvivalence kryokonzervovaného živého ekvivalentu kůže (LSE) a LSE, který nebyl kryokonzervován, se provede transplantační test na athymických myších.

Živé ekvivalenty kůže kryokonzervované způsobem uvedeným v příkladu 1 se rozmrazí jeden den před transplantací a udržují se v mediu pro uchovávání tkání po dobu 24 hodin.

Provedou se 4 pokusy, ve kterých se celkem 66 ·· ···· • ·· • ··

• · · · • · athymickým myším kmene B6CB6YF1/G-nt?*· (ífaksótf fiarbor íabs) transplantuje buď kryokonzervovaný živý ekvivalent kůže (LSE) (celkem 43 myším) nebo živý ekvivalent kůže, který nebyl kryokonzervován (kontrola) (celkem 23 myším). Zvířata se anestetizují Nembutalem. Ze hřbetu každé myši se vyřízne kus kůže v plné tlouštice o velikosti 2 x 2 cm tak, aby se nepoškodil panicculus carnosus. Štěpy živého ekvivalentu kůže, ač už jde o kontrolu nebo o kryokonzervovanou tkáň, se umístí na ránu a upraví se, aby pasovaly. Všechny štěpy se překryjí jednou vrstvou vazelínou impregnované gázy a na ní se přiloží dvě vrstvy adhezivního obvazu. Gáza a obvaz se odstraní 7 dnů po transplantaci.

Čtrnáct dnů po transplantaci se všechny zvířata usmrtí a vyfotografují se. Místo obsahující transplantát se poté vyřízne za účelem histologické analýzy a hodnocení. Fotografie a mikrografy neukazují žádné rozdíly v uchycení štěpů mezi kontrolním a rozmraženým kryokonzervovaným živým ekvivalentam kůže. Mezi kontrolními a kryokonzervovanými štěpy nejsou pozorovány žádné podstatně rozdíly v rychlosti kontrakce rány.

Příklad 12

Syngenní transplantace kůže kryokonzervované a kontrolní myší kůže

Za účelem prokázání bioekvivalence kryokonzervované myší kůže a myší kůže, která nebyla kryokonzervována, se provede studie syngenní transplantace kůže.

Myši divokého typu kmene B6CB6YF1 se usmrtí předávkováním Nembutalem. Asepticky se odebere kůže. Při přípravě kůže pro transplantaci se z dermu odstraní krevní cévy, tuk a pojivová tkáň. Myší kůže se kryokonzervuj e a rozmrazí způsobem popsaným v příkladu 7. Kontrolní myší kůže, • ·· ···· • ·· · • · · · ·

• · · • · • ··· která nebyla kryokonzervována, se přát?· tVansjdlarftací *tidfžuj e v živném mediu při teplotě 4° C během celého průběhu kryokonzervace a rozmrazování, tedy celkem po dobu 2 dnů.

U šesti myší stejného kmene se provede transplantace kožních štěpů, přičemž dvěma myším se transplantuje kontrolní nezmražená myší kůže a čtyřem se transplantuje rozmražená kryokonzervovaná myší kůže. Myši se anestetizují Nembutalem. Ze hřbetu každé myši se vyřízne kus kůže v plné tloušťce o velikosti 2 x 2 cm tak, aby se nepoškodil panicculus carnosus. Štěpy myší kůže, ať už jde o kontrolu nebo o kryokonzervovanou tkáň, se umístí na ránu a upraví se, aby pasovaly. Všechny štěpy se překryjí jednou vrstvou vazelínou impregnované gázy a na ní se přiloží dvě vrstvy adhezivního obvazu. Gáza a obvaz se odstraní 7 dnů po transplantaci.

Třicet dnů po transplantaci se všechny zvířata usmrtí a vyfotografují se. Místo obsahující transplantát se poté vyřízne za účelem histologické analýzy a hodnocení. Fotografie a mikrografy neukazují žádné rozdíly v uchycení štěpů mezi kontrolní a rozmraženou kryokonzervovanou myší kůží. Mezi kontrolními a kryokonzervovánými štěpy nejsou pozorovány žádné podstatné rozdíly v rychlosti kontrakce rány.

Ačkoli byl vynález výše podrobně popsán pro ilustraci a jako příklad za účelem jasnějšího pochopení vynálezu, odborníkovi je jasné, že v rámci patentových nároků lze provést určité změny a modifikace.

Claims (11)

1. PATENTOVÉ

   N tf K Ϋ* ·· ·· ·· • · · · · · • ·· · · • · · · · ·

   1. Způsob kryokonzervace získané tkáně savců nebo kultivovaného tkáňového ekvivalentu, vyznačuj ící se t i m , že se

   a) uvedená tkáň ponoří do roztoku kryogenního ochranného činidla a uvedený roztok kryogenního ochranného činidla a uvedená ponořená tkáň se míchá k dosažení účinného průniku roztoku kryogenního ochranného činidla do uvedené tkáně a k dosažení perfuze tkáně,

   b) v uvedeném roztoku kryogenního ochranného činidla a v uvedené perfundované tkáni se vytvoří jádra mimobuněčného ledu,

   c) uvedená perfundovaná tkáň ze stupně b) se chladí do kryokonzervovaného stavu mrazením uvedené tkáně nízkou mrazící rychlostí na teplotu nejméně zhruba -70° C nebo nižší k získání kryokonzervované tkáně, a

   d) uvedená kryokonzervovaná tkáň se uchovává při teplotě nejméně zhruba -70° C nebo nižší.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , že se ponoření uvedené ve stupni a) provede při počáteční teplotě zhruba 20° C a pak během perfuze se provádí chlazení rychlostí zhruba -10° C/min na teplotu zhruba -6° C.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se mrazení ve stupni c) provádí rychlostí -1° C/min na teplotu zhruba -8° C a tato teplota se udržuje po dobu, která dostačuje k umožnění vytvoření fyzikální a biologické rovnováhy mezi uvedeným roztokem kryogenního ochranného činidla a uvedenou tkání.
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící ·· 91 ·· ···· ·· ···· ···· · · · · · · ··· · · · ··· ······· · ··· · ······ · · se t £ m , že se ve stupni c) tefflčťá udřžuje konstantní po dobu dostatečnou k umožněni vytvoření fyzikální a biologické rovnováhy mezi uvedeným roztokem kryogenního ochranného činidla a uvedenou tkání.
5. 5. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se v chlazeni pokračuje rychlosti zhruba -0,3° C až -0,02° C za minutu na teplotu zhruba -70° C nebo nižší.
6. 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t i m , že se jako uvedená získaná tkáň savců použije získaná kůže savců.
7. 7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím , že se jako uvedený kultivovaný tkáňový ekvivalent použije ekvivalent vybraný ze skupiny zahrnující kultivovaný epidermální ekvivalent, kultivovaný dermální ekvivalent a kultivovaný ekvivalent rohovky.
8. 8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t £ m , že se jako teplota uvedeného kryokonzervovaného stavu použije teplota v rozmezí -120° C nebo méně až -196° C nebo méně.
9. 9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím , že se jako uvedený roztok kryogenního ochranného činidla použije 1,5M až 2,5M glycerol v Dulbeccově modifikovaném Eaglově mediu (DMEM).
10. 10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t i m , že se uvedená vitrifikovaná tkáň dále rozmrazí, přičemž se uvedená tkáň rozmrazí během zhruba jedné až zhruba dvou minut.

    ·· ·· ) · · « • ·· ·· ····
11. 11. Zařízení ke kryokonzervaci kultivovaného tkáňového ekvivalentu se t i m , že zahrnuje ···· ·· ·· · ·· · získané tkáně savců nebo vyznačuj íci misku, která obsahuje povrch dna přiléhající k boční stěně, která přiléhá k obrubě, přičemž boční stěna má podpěry, které z této boční stěny vybíhají směrem dovnitř a jsou integrální součástí boční stěny, nosič, který obsahuje rovnou permeabilní membránu, připevněnou k jednomu konci v podstatě trubicovité podpěry, a lem na opačném konci uvedené trubicovité podpěry, přičemž uvedený lem se opírá o uvedené podpěry vybíhající směrem dovnitř uvedené misky, víko, které obsahuje rovný povrch dna přiléhající k boční stěně, která přiléhá k obrubě, přičemž uvedená obruba se těsně dotýká uvedené obruby misky, a těsnění mezi uvedenou miskou a uvedeným víkem.