CS222781B1 - Mysi lymfoeytární hybridem - Google Patents

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného buněčnou fúzí myší myelomové buněčné linie F3-X6>-Ag8.65> a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti prasečímu transferinu.

Dosud ee protilátky proti transferinu vyrábějí tak jako protilátky proti jiným plasmatickým bílkovinám, tj. transferin je injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejČastěji králíkům, prasatům nebo ovcím. Sérum těchto zvířat, odebrané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek užívaných v diagnostice, zejména při kvantitativní analyse koncentrace transferinu v plasmě nebo jiných tělních tekutinách. Tento postup, nazývaný konvenční imunisací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se projevuje značně heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří vedle protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu i ty je nutné se sér odstraňovat složitým způsobem, zvaným vysycování. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvalit y.

toho plyne nutnost srovnávání výsledků s velkým počtem standardů antigenu v diagnostických metodách, postavených na konvenčních sérech. Pro výrobu každé šarže séra je třeba připravit značně čistý imunizační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám.

Uvedené nedostatky výše zmíněného dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti prasečímu transferinu, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská ul.

- 2 222 781

Č. 1083 pod označením IMGOWS PTF-03.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury /Fazekas de, St., Groth, S·, Scheidigger, D.: Production . of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. I.’eth., 35:1-21, 1960; Galfré, G., Iíows, S.C., Milstein, C., Butoher,

G.W., Koward, J.C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266:550, 1977/ klonováním souboru hybridních bunék, vzniklých fúzí myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene balb/c, imunizovaných prasečím transferinem.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku, tzv, protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s prasečím transferinem. Hybridom PTF-03 je možné kultivovat in vitro v mediích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene Balb/c. S konserv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem PTF-03, je specifická výhradně pro transferin a není třeba se zbavovat protilátek balastních.

Příklad provedení

Za účelem pomnožení buněk hybridomu PTF-03 in vivo a získání protilátky, jím produkované bylo aplikováno 1,4 x 10 buněk hybridovu do peritoneální dutiny myši kmene Balb/c, která byla 12 dní před injikovéním buněk hybridomuiritována 0,5 ml parafinového oleje podaného intraperitoneálně. Po 16 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš zabita a z peritoneální dutiny odebráno celkem 3,5 ml ascitické tekutiny. Ascitická tekutina obsahovala podle elektroforetické analýzy 11 mg/ml imunoglobulinu nesoucího protilátkovou aktivitu. Aktivita protilátky byla měřena enzymoimunologickým testem s prasečím transferinem v pevné fázi a prasečí anti-myší protilátkou značenou křenovou peroxidézou. Positivní reakce byla pozorována až do ředění ascitické tekutiny 1:10^. Využitelnost protilátky produkované hybridomem PTF-03 pro imunoprccipitacní reakce byla dále testována tak, že ascitická tekutina hybridomu PTF-05 byla smísena ve stejných

222 781 objemech s ascitickými tekutinami hybridomů PIF-01 a PTF-03.

Směs těchto tří tekutin obsahujících jednotlivé monoklonální protilátky proti prasečímu transferinu poskytovala precipitát s prasečím transferinem ve dvojité imunodifuzi v agarovém gelu.

Buňky hybridomů PTF-03 mají ultrastrukturální obraz typických myelomových buněk, kde převažující organelou jsou volné a na membrány vázané polyribosomy. In v; > rostou jako polosupenzní kultury. Základním kultivačním mediem je Eaglovo minimální esenciální medium s Hanksovou solnou směsí a doplněné o neesenciólní aminokyseliny, L-glutamin /3 πώί/, pyruvát sodný /1 mil/. Toto me*dium /označované jako M-LIBUd, Ústav molekulární genetiky ČSAV/, je pro kultivace hybridomů PTF-03 doplněno penicilinem, streptomy činem, gen tamy činem, 2-merkaptoe tandem /0,05 mil/ pufrem IIEPES /10 mli/ a inaktivovaným bovinním sérem /Bioveta, Ivanovice na Hané, 10 %/. Hybridom je kultivován při -37°C. Střední generační čas je 17.1 hod. a půl roku po sestrojení byl modélní počet chromosomů 90. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgGl.

, Specifičnost protilátky byla ověřena křížovou reakcí s transferiny člověka, koně a ovce metodou enzymoimunologické analysy. Reakce protilátky, produkované hybridomem PTF-03 byla nulová. Podobně bylo ověřeno, že protilátka nereaguje s transferinem myším.

Pro sestrojení hybridomů PTF-03 byl použit známý postup, spočívající ve fúzi myelomových buněk s buňkami z ‘imunní sleziny pod vlivem polyethylenglykotu o molekulové hmotnosti 1500 s následnou selekcí v mediu, obsahujícím hypoxanthin, aminopterin a thymidin. Po identifikaci protilátky produkujících populací hybridních buněk byly tyto populace opakovaně klonovány v polotekutém agaru a testovány na produkci specifické protilátky.

Hybridom PTF-03 může být průmyslově využíván jako zdroj protilátky proti prasečímu transferinu v metodách analytických nebo preparativních. Samotná monoklonální protilátka hybridomů PTF-03 je vhodné pro použití v radioimunoanalyse nebo enzymoimunoanalyse.

-4 121 781

Pro svou jednoduchost je výhodná metoda radiální imunodifúze v gelu. V této metodě se protilátka hybridomu PTP-O3 dá po užít ve spojení s protilátkami hybridomů PTP-O1 a PTF-O2. Směs těchto tří monoklonálních protilátek poskytuje s prasečím trans ferinem typický iraunní precipitát. Precipitační linie nebo prstence získané v gelu jsou ostřejší než linie a prstence, získané pomocí konvenčního séra proti prasečímu trnnsťerinu.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZ U

   22Ϊ 78

   Myší lymfocytární hybridom IUGC2AS PTF-03, produkující monoklonální protilátku podtřídy IgGl proti prasečímu transfe řinu.