CN1121924A - 水果多酚及其生产方法以及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过压榨和/或提取蔷薇科的未成熟果实，然后纯化所得的果汁或提取物而得到的水果多酚。本发明还提供了各自包含以经压榨和/或提取蔷薇科的未成熟果实，然后纯化所得的果汁或提取物而得到的水果多酚作为有效组分的抗氧化剂、降血压药剂、抗诱变剂、抗变态反应药剂和防龋药剂。本发明的水果多酚具有各种生理学活性，如抗氧化活性、ACE抑制活性、抗诱变活性、透明质酸酶抑制活性及GTase抑制活性。

Description

水果多酚及其生产方法以及其用途
本发明涉及水果多酚；其生产方法；和各自包含所述多酚作为有效组分的抗氧化剂、降血压药剂、抗诱变剂、抗变态反应药剂和防龋药剂。
在结出可食用果实如苹果、梨、桃等的蔷薇科树木的生长过程中，通常在五月中旬到七月中旬时，要进行多余果实的“蔬果”。在该蔬果时，除去成串或成簇的未成熟果实，而将其中的一部分留下。结果，大量未成熟果实经蔬果被处理掉而未被利用。这些未成熟果实与成熟果实相比非常苦，且每个未成熟果实的断面表面容易变成褐色。这种事实表明未成熟果实中存在大量的多酚化合物。
已经知道多酚化合物作为植物的次级代谢产物以众多的种类和巨大的数量存在于植物界。其中的某些多酚化合物因其多种多样的生理学活性，自过去在药物学领域到近年的食品化学领域均引起人们的关注。
其中，茶多酚(儿茶素类)特别引起注意并正在对其进行集中的研究。人们认识到这种茶多酚具有很广泛的生理学活性如抗菌活性、抗病毒活性、抗氧化活性、抗诱变活性、抗癌活性、抑制血小板凝结的活性、抑制血压升高的活性、抑制血糖升高的活性、降低血液胆固醇的活性、防龋活性、抗变态反应活性、改善肠内菌丛的活性、除臭活性等(日本专利申请公开Nos.214183/1988，6499/1990，178320/1992等)。
因此，已知例如从茶叶中提取的多酚具有广泛的生理学活性。
本发明的一个目的是提供具有各种生理学活性并不同于从茶叶中提取的多酚的水果多酚。
本发明的另一目的是提供有效且经济地生产上述水果多酚的方法。
根据本发明，提供了经压榨和/或提取蔷薇科的未成熟果实，特别是未成熟苹果、未成熟梨或未成熟桃，然后纯化所得的果汁或提取物而得到的水果多酚。
根据本发明，还提供了生产水果多酚的方法，包括，压榨和/或提取蔷薇科的未成熟果实，特别是未成熟的苹果、未成熟梨或未成熟的桃，然后纯化所得的果汁或提取物以得到多酚部分。
根据本发明，还提供了一种包含通过压榨和/或提取蔷薇科的未成熟果实，特别是未成熟苹果、未成熟梨或未成熟的桃，然后纯化所得的果汁或提取物而得到的水果多酚作为有效组分的抗氧化剂。
根据本发明，还提供了一种包含以具有血管紧张肽转化酶I抑制活性的水果多酚作为有效组分的降血压药剂，所述多酚是经压榨和/或提取蔷薇科的未成熟果实，特别是未成熟苹果、未成熟的梨或未成熟的桃，然后纯化所得的果汁或提取物而得到的。
根据本发明，还提供了一种包含以具有能够抑制致癌物质的诱变性的活性的水果多酚作为有效组分的抗诱变剂，所述多酚是经压榨和/或提取蔷薇科的未成熟果实，特别是未成熟的苹果、未成熟的梨或未成熟的桃，然后纯化所得的果汁或提取物而得到的。
根据本发明，还提供了一种包含以具有透明质酸酶抑制活性的水果多酚作为有效组分的抗变态反应药剂，所述多酚是经压榨和/或提取蔷薇科的未成熟果实，特别是未成熟的苹果、未成熟的梨或未成熟的桃，然后纯化所得的果汁或提取物而得到的。
根据本发明，还提供了一种包含以具有葡萄糖基转移酶抑制活性的水果多酚作为有效组分的防龋药剂，所述多酚是经压榨和/或提取蔷薇科的未成熟果实，特别是未成熟苹果、未成熟梨或未成熟桃，然后纯化所得的果汁或提取物而得到的。
图1是表示HPLC色谱和未成熟苹果多酚各峰的UV光谱比较图。
图2是分别表示将所述提取物加至反应系统中的一个星期之后，形成的过氧化类脂(peroxylipid)的量(在500nm处的吸收度)与未成熟或成熟“富士”(Fuji)苹果提取物的加入浓度之间的关系图。
图3是分别表示在将所述多酚部分加至反应系统中的一个星期后，形成的过氧化类脂的量(在500nm处的吸收度)与未成熟或成熟“富士”苹果的多酚部分的加入浓度之间的关系图。
图4是表示在将各种多酚化合物分别加至各反应系统中的一个星期后，形成的过氧化类脂类的量(在500nm处的吸收度)。
图5是分别表示在将所述多酚部分加至反应系统一个星期后，形成的过氧化类脂的量(在500nm处的吸收度)与每种未成熟苹果的多酚部分的加入浓度之间的关系图。
图6是分别表示在将所述多酚部分加至反应系统一个星期后，形成的过氧化类脂的量(在500nm处的吸收度)与每种未成熟果实的多酚部分的加入浓度之间的关系图。
图7是分别表示未成熟或成熟“富士”苹果多酚部分的血管紧张肽转化酶I(下文称为ACE)抑制活性图。
图8是表示以各种数量将每种多酚部分B加至反应系统后，各种多酚部分B的ACE抑制活性图。
图9是表示以各种数量将每种多酚化合物加至反应系统后，各种多酚化合物的ACE抑制活性图。
图10是表示用分光光度计测量的，所分离多酚部分的吸收光谱图。
图11是表示缩合鞣质分子量的GPC测量结果图。
图12是本发明水果多酚所含的ACE抑制物质的结构式。
图13是表示各种多酚对Trp-P-2的抗诱变活性图。
图14是表示苹果鞣酸和棓酸表棓儿茶素对苯并[a]芘的抗诱变活性图。
图15是表示各种水果提取物的透明质酸酶抑制活性图。
图16是表示抗变态反应药剂(色甘酸钠)和苹果鞣酸的透明质酸酶抑制活性图。
图17是表示当将各种水果多酚部分分别加至各反应系统后，形成的不可溶葡聚糖的量与加入的水果多酚部分的量之间的关系图。
图18是表示当将各种多酚化合物加至各反应系统后，形成的不可溶葡聚糖的量与加入的多酚化合物的量之间的关系图。
根据本发明的水果多酚是一种经压榨或提取蔷薇科的未成熟果实，特别是未成熟苹果、未成熟梨或未成熟桃，然后将所得的果汁或提取物纯化而得到的多酚。纯化的进行是通过用吸附剂处理果汁或提取物，由吸附剂所吸附的果汁或提取物部分(下文将该部分称为“吸附部分”)含有水果多酚。用无水醇(如乙醇)洗脱吸附部分，从而得到纯化的多酚部分。
然后将该多酚部分浓缩，从而可得到液体的多酚产物。
若使上述得到的浓缩物经喷雾干燥或冷冻干燥，则可得到粉末状多酚产物。
本发明中所用的起始材料是蔷薇科的果实。具体地讲，苹果、梨、桃等是优选的，而苹果是特别优选的。所述果实可以是成熟或未成熟的，但未成熟果实是特别优选的，因为它们含有较大总量的多酚化合物，也因为它们含有大量具有各种生理学活性的各种多酚化合物。
下面针对压榨方法进行描述。在一种压榨方法中，先洗涤起始材料；然后在加入或不加入亚硫酸的情况下，压碎并压榨洗涤过的材料，得到果汁；优选的是，向其中加入果胶溶解酶；然后使所得的混合物经离心、过滤等以得到澄清的果汁。
下面描述提取方法。在一种提取方法中，将洗涤过的材料与醇(如乙醇或甲醇)混合；将混合物压碎；将所得材料浸渍并压榨，或回流，以对其进行提取；将提取物减压浓缩以除去醇；然后将浓缩物离心并过滤，或者用有机溶剂(如己烷或氯仿)分配并过滤以得到澄清的提取物。
下面描述纯化上面得到的果汁或提取物的方法。使上面得到的澄清果汁或澄清提取物通过装有吸附剂的柱子，由此吸附剂吸附多酚部分，所述吸附剂能选择性地吸附所述果汁或提取物中所含的水果多酚，并且通过洗脱剂的使用能释放所吸附的多酚。[吸附剂的实例是苯乙烯-二乙烯基苯型的合成树脂、阴离子交换树脂和十八烷基-化学键合的硅胶(ODS)]。然后使蒸馏水通过该柱进行洗涤，然后使20-100％醇(如乙醇)溶液，优选约50％醇溶液通过该柱，由此洗脱并回收多酚部分。减压浓缩所得的多酚溶液以除去醇，由此可得到水果多酚的液体产物(优选向其中加入有机酸如苹果酸等)。在加入或不加入粉化辅助剂如糊精等的情况下，使该液体产物经喷雾干燥或冷冻干燥，由此可得水果多酚的粉末产品。
由本发明人证实，本发明得到的水果多酚绝大多数由(1)简单的多酚化合物如咖啡酸衍生物、对香豆酸衍生物、黄烷-3-醇类(儿茶素类)、黄酮醇类(五羟黄酮苷类)、二氢查耳酮类(根皮素苷类)等和(2)高分子多酚化合物如缩合鞣质等组成。
因此，认为本发明中得到的水果多酚具有各种生理学功能，本发明人已进行了广泛的研究。结果，首先发现，本发明的水果多酚含有大量能抑制亚油酸(一种植物油)氧化的成分。因此，本发明的水果多酚作为一种抗氧化剂是非常有效的。
接着发现，本发明的水果多酚含有大量能抑制ACE(这是一种与血压升高有关的酶)功能的成分。因此，本发明的水果多酚作为降血压药剂也是非常有效的。
进行了进一步的研究以鉴定本发明水果多酚中所含的ACE抑制成分。结果证实，ACE抑制成分是由图12所示的结构式所代表的缩合鞣质。
近年来进行的许多研究表明，致癌物质和诱变物质之间有密切的联系，因此，致癌性和诱变性之间有密不可分的联系。因而，期望能抑制诱变性的物质能够预防致癌性。本发明人对本发明水果多酚是否具有抗诱变活性作了检测，证明该多酚有所述活性。因此，本发明的水果多酚作为抗诱变药剂是非常有效的。
透明质酸酶是一种被认为在结缔组织重建中表现出某种细胞活性的酶。近年来完成的研究(Chem.Pharm.Bull.，33，p.642，1985；ibid.，33，p.5079，1985；ibid.，33，p.3787，1985；ibid.，33，p.5079，1985；和ibid.，40，p.1439，1992)表明，在合成的抗变态反应药剂(如，色甘酸钠和tranilast)中，透明质酸酶抑制活性与抑制组胺从肥大细胞中释放的活性之间有密切的联系。利用这种联系，通过检测天然产物的透明质酸酶抑制活性而在所述产物中发现了数种抗变态反应物质。因此，本发明人对本发明的水果多酚是否具有透明质酸酶抑制活性作了检测，确证，该多酚具有此活性。因此，本发明的水果多酚作为抗变态反应药剂也是很有效的。
目前已证实，龋齿(被腐蚀的牙)是由口腔链球菌属包括链球菌突变体引起的与细菌有关的疾病。在龋齿的发展过程中，认为沉积物的形成是特别重要的因素。
这就是说由葡萄糖基转移酶(下文称之为“GTase”)(该酶是一种由生龋菌产生的酶)的作用从食物中所含的蔗糖合成了粘性的且不可溶的葡聚糖；细菌经所述的葡聚糖粘附在牙本质上；所产生的沉积物引起龋齿。
因此，期望能够抑制GTase作用的物质可作为有效的防龋药剂[Appl.Env.Microbiol.，59(4)，pp.968-973，1993；Biosci.Biotech.Biochem.，56(5)，pp.766-768，1992；Agric.Biol.Chem.，54(11)；pp.2925-2929，1990；和Chem.Pharm.Bull.，38(3)，pp，717-720，1990]。
因此，本发明人对于本发明的水果多酚是否具有对由S.sobrinus(典型的生龋菌)产生的产生不可溶的葡聚糖的GTase的抑制活性作了检测，发现所述多酚有此活性。因此，本发明的水果多酚作为一种防龋剂也是很有效的。
下面，用更详细的有关实施例描述本发明。然而，本发明并不限于这些实施例。实施例1未成熟的苹果汁的组分分析
使下列样品进行常规的组分分析。
样品：
成熟的“富士”苹果：不用口袋生长的市售产品。
未成熟的“富士”苹果：在六月中旬采摘的
样品的处理：
用混合器将每种水果样品压碎，加入适量的偏亚硫酸氢钾(一种抗氧化剂)。将所得的果汁离心并过滤以得到澄清的果汁。
测量项目和方法：
×每种果实的平均重量(n＝50)
×得到的果汁率(％)
×pH
×酸度(g/l，以苹果酸汁)
×白利糖度(Brix)
×总酚(ppm，以绿原酸汁)
×总抗坏血酸
×有机酸分析
×糖类分析
×金属离子分析×游离氨基酸分析表1中列出了测量结果。
                      表1
各种果实的平均重量(g) 得到的果汁率(％)     pH     酸度(g/l，以苹果酸计) 白利糖度 总酚(ppm，以绿原酸计) 总抗坏血酸(ppm)
成熟“富士”果汁     287.2     66.1     3.88     2.73     11.6     720     —
未成熟“富士”果汁 5.1 51.0 3.78 6.83 5.2 6,200 254
                                                                                     金属离子    (ppm)
    K     Ca     Mg     Fe     Na
成熟“富士”果汁     1,430     15     16     0     9
未成熟“富士”果汁     3,050     250     130     13     28
                                                                                     有机酸(％)    糖类(％)
    苹果酸    奎尼酸     (总量)    葡萄糖    果糖     蔗糖 山梨糖醇 (总量)
成熟“富士”果汁     0.39    0.02     (0.41)    2.12     6.72     2.52     0.31 (11.67)
未成熟“富士”果汁     0.49    1.17     (1.65)    0.70     0.49     0.03     0.44 (1.66)
                                                                                       游离氨基酸
ASP  THR  SER     ASN  GLU  GLN  GLY ALA CIT  VAL MET  ILEU  LFU  TYR  PHE  α-ABA γ-ABA MEA  HYLYS  IM-BIS  BIS LIS ARG
成熟“富士”果汁 211  2  10    207   29  2 4 3  2  7     3
未成熟“富士”果汁 32  40  42    3,280  13  36  52 4  37 8  25  52  76  114     337 44     9     14     19 47   34
从表1中可以清楚地看出，未成熟苹果汁和成熟苹果汁之间在组成上有很大不同。在未成熟苹果汁中，特别是总酚、总抗坏血酸、有机酸(特别是奎尼酸)、金属离子和游离氨基酸(尤其是天冬酰胺、苯丙氨酸和γ-氨基丁酸)很丰富。同时，在未成熟苹果汁中，糖几乎没有。
接着，使未成熟苹果中所含的多酚经HPLC进行组分分析。
作为多酚样品，使用了使未成熟苹果提取物经固相提取(见实施例2)而得到的纯化多酚。
图1列出了分析结果。
从图1中可以清楚地看出，未成熟苹果中所含的样品多酚绝大多数由咖啡酸衍生物(绿原酸等)、对香豆酸衍生物、黄烷-3-醇类(儿茶素、表儿茶素等)、黄酮醇类(五羟黄酮苷类)和二氢查耳酮类(根皮素苷类，特别是根皮苷)组成。其中大量含有绿原酸、儿茶素、表儿茶素和根皮苷。实施例2未成熟果实中多酚的抗氧化活性起始材料：用下列起始材料。
成熟的苹果：不用袋子生长的市售产品
未成熟苹果：在六月中旬采集的。
“富士”：平均重量＝4.97g(n＝50)
“Tugaru”：平均重量＝7.80g(n＝50)
“Jonagold”：平均重量＝3.86g(n＝50)
“Hokuto”：平均重量＝3.32g(n＝50)
“Ohrin”：平均重量＝10.34g(n＝50)
未成熟的梨：在六月初采集的
“Hohsui”：平均重量＝8.98g(n＝50)
未成熟的桃：在六月初采集的
“Akatuki”：平均重量＝5.03g(n＝50)样品的制备
果汁样品：重复实施例1中的方法以得到澄清的果汁。
提取物样品：通过将400g起始材料与含1％HCl的甲醇一起匀浆，
            然后将所得的材料在回流条件下进行提取(三次)，
            减压浓缩提取物以除去甲醇，向其中加入氯仿以进
            行分配(两次)，回收水层，过滤水层，然后将蒸
            馏水加至滤液中，以达到200ml的总体积。
按需要，使果汁样品和提取物样品用Seppack C18进行固相提取，以得到多酚部分。抗氧化活性的检验方法
使用下列抗氧化活性的检验方法。
在一紧紧塞好的试管中，将5ml碱溶液(含4％亚油酸的乙醇)与4ml磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)和1ml样品溶液混合。在光屏蔽下，将试管保持于50℃恒温箱中。在相同条件下，也放置一含用乙醇代替亚油酸的试管(对照样)和含样品溶剂代替样品的试管(空白样)。
在贮存期间，随时间的流逝采集反应混合物的样品，以便用异硫氰酸盐方法(硫氰酸铁法)定量地测定所形成的过氧化物的量。
检测结果
检测未成熟富士苹果提取物和成熟富士苹果提取物的抗氧化活性。
将上述两种提取物以1-1,000μl/g(亚油酸)的浓度分别加到反应系统中。加入一星期后，测量形成的过氧化类脂的量(在500nm处的吸收度)。图2中列出了其与加入的提取物浓度的关系。
如图2所示，在未成熟的“富士”提取物和成熟的“富士”提取物中均可见到对亚油酸的抗氧化活性，但在未成熟“富士”提取物中，该活性更高。
接着，为了研究哪些物质具有抗氧化活性用Sep-pack C18将未成熟的“富士”提取物和成熟的“富士”提取物分别大致分成两部分，即部分A(非吸附的部分)和部分B(吸附的部分，多酚部分)。以1-1,000μl/g(亚油酸)的浓度，将提取物、部分A和部分B各自独立地加到反应系统中。加入一星期后，测量所形成的过氧化类脂的量(在500nm处的吸收度)。图3中列出了它与提取物或部分A或B的量的关系。
从图3中可以清楚地看出，成熟“富士”苹果提取物的抗氧化活性是以提取物的部分B为基础的。在未成熟“富士”苹果的提取物中，部分A和部分B均具有抗氧化活性，但部分B的活性更高。
上述情况表明，成熟和未成熟“富士”苹果提取物的抗氧化活性主要取决于存在于部分B中的化合物，即存在于部分B中的多酚化合物。
在苹果中所含的简单多酚化合物中，测量了市售的那些化合物的抗氧化活性。以0.2μM/g(亚油酸)的浓度将每种上述化合物加到反应系统中。加入一星期后，测量所形成的过氧化类脂的量(在500nm处的吸收度)。图4列出了各种多酚化合物加入一个星期后的吸收度。
图4中，除上述多酚外，还包括对比物质，即三种已知的抗氧化剂(BHA、BHT和维生素E)以及存在于上述部分A中的典型化合物(奎尼酸、苹果酸和γ-氨基丁酸(GABA)]。
结果，在所述多酚化合物中，六种化合物(咖啡酸、绿原酸、(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素、五羟黄酮和芸香苷(五羟黄酮-3-rha)]具有与BHA和BHT相同的抗氧化活性。然而，象对香豆酸、根皮素和根皮苷这类多酚没有抗氧化活性。此外，存在于部分A中的化合物不具有任何抗氧化活性。
通过(1)苹果中存在的所述化合物的量和(2)其抗氧化活性之间的比较，可以判断，未成熟苹果提取物和未成熟苹果汁所表现出的高抗氧化活性主要来源于绿原酸、(＋)-儿茶素和(－)-表儿茶素。
通过上述可证实，未成熟“富士”苹果具有高抗氧化活性。此外，鉴定了表现所述活性，且存在于未成熟“富士”苹果中的化合物。
继而，还研究了除未成熟“富士”外的未成熟苹果是否具有相同的抗氧化活性。
从各种未成熟苹果(富士、Tugaru、Jonagold、Hokuto和Ohrin)的提取物分别制备部分B(多酚部分)。以1-500μl/g(亚油酸)的浓度将各部分加到反应系统中。加入一星期后，测量所形成的过氧化类脂的量(在500nm处的吸收度)。图5中列出了它与所加入部分的浓度的关系。图5中，也包括未成熟“富士”的结果以进行比较。
结果，每种苹果均表现出高抗氧化活性，并且在苹果种类之间在抗氧化活性方面基本上没有差别。
此外，还研究了除未成熟苹果外的其它未成熟果实的抗氧化活性。
从各种未成熟果实(富士苹果，Hohsui梨和Akatuki桃)的提取物分别制备部分B(多酚部分)。以1-500μl/g(亚油酸)的浓度将各部分加到反应系统中。加入一星期后，测量所形成的过氧化类脂的量(在500nm处的吸收度)。图6中列出了它与所加入部分的浓度的关系。
结果，未成熟桃具有与未成熟苹果大约相同的抗氧化活性，而未成熟梨具有相当高的抗氧化活性，尽管该活性低于未成熟苹果的活性。实施例3存在于未成熟果实中的多酚的ACE(血管紧张肽转化酶I)抑制活性
起始材料：使用下列起始材料。
未成熟苹果：与实施例2中所用的相同。
样品的制备：用与实施例2中相同的方法制备“提取样品”和“多
           酚部分”。ACE抑制活性的检验方法
用常规方法进行ACE抑制活性的检验。
将样品溶液加到市售的ACE溶液中以进行预培养；然后，加入Bz-Gly-His-Leu作为底物以引起反应；用邻苯二醛标记由该反应形成的His片段；然后测量所得溶液的荧光强度(Ex.360nm，Em.490nm)。
用下列公式表达样品溶液的ACE抑制活性：
{1－(S－SB)/(C－CB)}×100(％)
其中S：检验溶液的荧光强度，
    C：对比溶液的荧光强度，其中用水代替样品，
    SB：S空白样的荧光强度(空白样含有代替酶的水)，和CB：C空白样的荧光强度(空白样含有代替酶的水)。检测结果
用Sep-pak C18将未成熟“富士”苹果提取物和成熟“富士”苹果提取物分别分成未吸附的部分(部分A)和多酚部分(部分B)，测量每部分的ACE抑制活性。图7中列出了结果。
结果，在未成熟和成熟苹果中，部分B均表示出高的ACE抑制活性。特别是，未成熟苹果的部分B表现出100％的抑制作用。为了更详细地比较未成熟和成熟苹果的部分B的ACE抑制活性，在改变加到上述反应系统中的每种部分B的量时，检测两种部分B的ACE抑制活性的改变。结果列于图8。
结果，成熟苹果部分B的表现50％抑制作用的浓度，即IC50为约3μl。相反，未成熟苹果部分B的IC50为0.1μl或更低。因此，未成熟苹果的部分B表现出很高的ACE抑制活性。
在除富士的各种苹果中也观察到了未成熟苹果的高ACE抑制活性。
如上述所看到的那样，未成熟苹果含有具高ACE抑制活性的化合物，而该化合物是多酚。随便提一句，未成熟梨和未成熟桃的ACE抑制活性比未成熟苹果的低。
接着，测量存在于未成熟苹果中并且作为纯产品容易得到的各种简单多酚的ACE抑制活性，具体地说，以各种浓度将各多酚加到反应系统中，然后检测所述多酚的ACE改善活性的改变。结果列于图9。
图9包括茶儿茶素类(已知茶儿茶素类具有ACE抑制活性)的ACE抑制活性以用于比较。图9中，(-)-棓酸表棓儿茶素(EGCg)和(-)-棓酸表儿茶素(ECg)的IC50值分别为0.3mM和2mM，且它们有高的ACE抑制活性。据报道，GABALONG茶(日本茶商用的一个商标名)，其中，通过加工提高GABA浓度，在使用SHRs(自发性的高血压大鼠)的试验中表现出降血压活性，但在本试验中，GABA没有表现出ACE抑制活性。
同时，存在于未成熟苹果中的多酚在高浓度时，表现出ACE抑制活性。但其IC50值很低，并且甚至对于表现出最高活性的五羟黄酮，IC50也只有约5mM那样低。因此，未成熟苹果多酚表现出远低于EGCg和ECg的ACE抑制活性。
因此，以存在于未成熟苹果部分B中的所有多酚均为EGCg这一假设为基础，用EGCg的校准曲线计算存在于部分B中的总多酚量。该量约为15,000ppm，计算出部分B中的多酚浓度以EGCg计为33.82mM。用该计算值，在图9中描制出部分B的活性曲线，该曲线表明部分B具有比EGCg高的ACE抑制活性(IC50＝0.2mM)。实际上，部分B既不含EGCg也不含ECg，且如上所述，未成熟苹果中的简单多酚没有显著的ACE抑制活性。图9中观察到的未成熟苹果部分B的高ACE抑制活性被认为是由于部分B中共存有其它未鉴定的多酚。实施例4鉴定存在于未成熟苹果多酚中的ACE抑制化合物样品
用与实施例3中相同的方法得到未成熟“富士”苹果提取物，然后使该提取物经固相提取以得到多酚部分。用该多酚部分作为下列的样品。检验方法
将样品溶液装入Sephadex LH-20柱。用蒸馏水洗涤该柱。然后，以先用20-60％甲醇(用HCl酸化)，然后用70％丙酮(用HCl酸化)这样的顺序进行洗脱以得到多酚部分。
使所得的多酚部分分别经HPLC进行组分分析，测量总酚并检验ACE抑制活性。按需要也可测量吸收光谱并进行凝胶渗透色谱(gelpermeation chromato graphy)。检验结果
用Sephadex LH-20柱进行分级分离，以便分离其它多酚样品中具有ACE抑制作用的化合物。使由洗脱得到的各部分经HPLC进行简单多酚的组分分析及ACE抑制试验。若60％甲醇作为洗脱液通过该柱时，可洗脱所有的简单多酚。同时，所有的具有ACE抑制作用的化合物均在下一种洗脱液，即70％丙酮中。
将上面得到的具有ACE抑制作用的化合物进行蒸馏以除去溶剂。将剩余物冷冻干燥以得到粉末状的具有ACE抑制作用的化合物。所述化合物易溶于水(溶液为橙色)且100ml多酚部分(部分B)的产量为约0.7g。
将上述粉末溶解于水中，并用分光光度计测量溶液的吸收光谱。结果示于图10。
所得光谱在280nm处具有最大的吸收度，且形状与(+)-儿茶素或(-)-表儿茶素的相似。将上述溶液在120℃高压灭菌处理10分钟。处理过程中，溶液变红，认为花色素已形成。这些结果有力地说明上述具有ACE抑制作用的化合物是已知为缩合鞣质的原花青素类(procyanidins)(儿茶素类的规则聚合物)。从Sephadex LH-20柱的洗脱情况和HPLC的洗脱情况看，估计所述化合物不是二聚物之类(如原花青素B2)的聚合物而是更高的聚合物。
因此，用GPC测量具ACE抑制作用的化合物的分子量。一般认为用GFC(凝胶过滤色谱法)在含水系统(在含水系统中GFC通常用于蛋白质等)中测量多酚化合物的分子量很困难，因为多酚化合物以疏水键或氢键的形式，与柱中的填料有很强的亲和力。因此，用吡啶/乙酐将每个具有ACE抑制作用的化合物中的酚羟基乙酰化以便使每个所得物质溶于有机溶剂中，并在有机溶剂(THF)中，使所得物质进行GPC分析。结果示于图11。
在图11中，色谱上有一个单宽的峰。通过使用聚苯乙烯同时制备的分子量校准曲线，计算出具有ACE抑制作用的化合物的平均分子量为约2,000。
还鉴于本文没有解释的其它试验的结果(如用甲苯-α-硫醇的部分分解、FAB-MS测量)，试验性地估计出具有ACE抑制作用的化合物的结构式，并示于图12。
从上文可以判断出，所述具有ACE抑制活性的化合物属于缩合鞣质类。
测量多酚部分和70％丙酮洗脱液，即使多酚部分经Sephadex LH-20分级分离得到的缩合鞣质类部分的总酚量，并将两个量进行比较。结果列于表2。
表2
                总酚量(ppm以儿茶素计)
                分级分离前    分级分离后    分级分离前
                                                      (％)
                (总多酚)      (缩合鞣质类)  分级分离后未成熟的苹果提取物  22,800        10,800        47.3成熟的苹果提取物    1,340    770    57.5
从表2中清楚地看出，所述缩合鞣质类约占存在于未成熟苹果中的总多酚的一半，并且是存在于所述多酚中占最大量的组分。
计算所述缩合鞣质类对ACE的IC50，该值很低(以重量计，约为EGCg的IC50值的1/10或更低)。因此，本发明的具有ACE抑制作用化合物有很高的ACE抑制活性。
从上述结果判断出，可以用未成熟苹果的多酚作为有效的ACE抑制药剂。实施例5生产未成熟果实的多酚
用压碎机将约50Kg的未成熟苹果(5-10g/苹果)压碎，同时加入适量的SO2，然后用油压机压榨。将约50ppm的果胶溶解酶加到所得的果汁中，将混合物离心或用硅藻土过滤，并进一步进行精细微过滤以得到35l的澄清果汁。使澄清的果汁通过用苯乙烯-二乙烯基苯型的工业用合成吸附剂树脂(6l)填充的柱子。然后，使6l含0.1％HCl的水通过该柱以除去糖类。此后，使含0.1％HCl的50％的乙醇通过柱子以得到3l含主要多酚的部分。
用蒸发器减压浓缩该部分，以得到1.5l浓缩的部分。用喷雾干燥器干燥浓缩的部分以得到228.2g未成熟苹果的多酚粉末产物。
回收率(％)数据如下：
柱中的回收率：95.6％
喷雾干燥的回收率：93.0％
果汁的回收率：0.65％
果汁多酚的粉末回收率：88.9％实施例6未成熟果实多酚的抗诱变活性
在该实施例中，用改进的ames方法(Mutation Research，Vol.31，p.347，1975)测量抗诱变活性。起始材料和样品的制备
与实施例2、3和4中所用的相同。下文将实施例4中得到的缩合鞣质类称为“苹果鞣酸”。抗诱变活性的检验方法
将抗诱变化合物[苯并(a)芘或Trp-P-2]溶液与磷酸盐缓冲液、样品溶液、S9-mix和沙门氏菌(通过过夜培养鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)TA98或TA100而得到的溶液)混合。将混合物于37℃培养2天。计数所得的菌落数。基于以几何级数表达的换算法，每种多酚的用量为1和300μg/板。用下列公式计算抗诱变活性：
抗诱变活性(％)＝{(C－B)－(S－B)}÷(C－B)×100其中S：检测溶液的菌落数
C：对照样的菌落数，其中用水代替样品，和
B：空白样的菌落数，其中用水代替样品和诱变化合物。结果
图13和图14中，分别列出了各种多酚和苹果鞣酸对Trp-P-2和苯并[a]芘的抗诱变活性。在图13和图14中，纵坐标轴表示抗诱变活性(％)，以与空白样所表现的相同的抗诱变性为100％。横坐标轴表示每板的样品量。
结果，苹果鞣酸抑制各诱变剂的诱变性依赖于苹果鞣酸的诱变性，且该抑制效果等于或高于棓酸表棓儿茶素的抑制效果。在本实施例的试验中，约17μg(约合51μg棓酸表棓儿茶素)的苹果鞣酸对1μgTrp-P-2，约37μg(约合56μg棓酸表棓儿茶素)的苹果鞣酸对5μg苯并[a]芘均表现出50％的抗诱变活性。即，苹果鞣酸含有大量强烈抑制诱变剂(致癌剂)的诱变性的化合物。因此，本发明所得到的水果多酚也是一种很有效的抗诱变药剂。实施例7存在于未成熟果实中的多酚的透明质酸酶抑制活性
在本实施例中，测量了透明质酸酶抑制活性，以用其作为抗变态反应活性的指示剂。起始材料和样品的制备
与实施例6中所用的相同。透明质酸酶抑制活性的检验方法
以改进的J.Biol.，Vol.250，p.79，1975中描述的方法为基础，进行透明质酸酶抑制活性的测量。即，将样品溶液加到市售的透明质酸酶溶液中，并进行预培养。向其中加入一种化合物48/80(组胺释放剂(histamine releasant))溶液，在37℃将透明质酸酶活化。然后加入透明质酸溶液作为底物，并进行反应。
使由上述反应产生的N-乙酰基葡糖胺经Elson-Morgan方法显色。在586nm处测量该颜色的吸收度。用下列公式计算透明质酸酶抑制活性(％)：
透明质酸酶抑制活性(％)＝{(C－CB)－(S－SB)}÷(C－CB)×100其中S：检测溶液的吸收度
C：对照样的吸收度，其中用缓冲液代替样品
SB：S空白样的吸收度(空白样不含酶)，和
CB：C空白样的吸收度(空白样既不含样品也不含酶)。结果
图15列出了各种水果提取物的透明质酸酶抑制活性，图16列出了色甘酸钠和苹果鞣酸的透明质酸酶抑制活性。
结果，各种水果提取物和苹果鞣酸均表现出其浓度依赖性的透明质酸酶抑制活性。图16中，列出了色甘酸钠的透明质酸酶抑制活性作为对比。色甘酸钠的IC50(表现出50％抑制作用的浓度)约为0.051mg/ml，而苹果鞣酸的IC50为约0.086mg/ml并与色甘酸钠的IC50相近。
因此，该多酚(苹果鞣酸)含有大量抑制透明质酸酶(与I型变态反应有关的酶)活性的化合物。因此，本发明所得到的水果多酚也是一种非常有效的抗变态反应药剂。实施例8存在于未成熟水果中的多酚的葡萄糖基转移酶抑制活性
在本实施例中研究了水果多酚对GTase[该酶由蔗糖产生不可溶的葡聚糖，且是由S.sobrinus(一种典型的防龋菌)产生的]的抑制活性。起始材料和样品的制备
与实施例6和7中所用的相同。所用的细菌：Streptococcus sobrinus ATCC 33478GTase的制备
按如下制备S.sobrinus的GTase。
将S.sobrinus在TTY培养基[Agric.Biol.Chem.，54(11)，PP.2925-2929，1990]中于37℃培养18小时。进行离心以除去细菌细胞并得到上层清液。向该上层清液中加入硫酸铵至50％饱和。然后，进行离心以回收所得的沉淀。将沉淀再溶于0.05M磷酸盐缓冲液(pH6.5)中。用相同的缓冲液将所得溶液渗析。渗析液中的GTase用羟磷灰石色谱法纯化并分离。用约0.4M磷酸盐缓冲液洗脱该GTase(能形成不可溶的葡聚糖)。用含GTase的洗脱液进行下列试验。检验GTase抑制活性的方法
将纯化的GTase溶液和样品溶液加到1ml底物溶液(含2％蔗糖、0.1％叠氮化钠和40μM葡聚糖T10的0.1M磷酸盐缓冲液)中。加水稀释以达到2ml的总体积。使所得溶液在37℃反应18小时。按在550nm处的吸收度所表达的浊度，测量由该反应形成的不可溶葡聚糖的量，并用下列公式计算不可溶葡聚糖的形成率(％)。
不可溶葡聚糖的形成率(％)＝(SS－SB)÷(CS－CB)×100其中SS：样品的吸收度
SB：样品空白样的吸收度(该空白样不含酶)，
CS：对照样的吸收度(不含样品)，和
CB：对照样的空白样的吸收度(该空白样不含样品且不含酶)。结果
图17列出了各水果提取物的多酚部分的GTase抑制活性，图18列出了各多酚化合物的GTase抑制活性。在图17和18中，纵坐标轴表示不可溶葡聚糖的形成率(％)，认为对照样(不含样品)的形成率(％)为100％。横坐标轴表示加到反应系统中的样品或多酚的量(体积或浓度)。
如图17所示，各种水果提取物的多酚部分，特别是未成熟“富士”苹果和未成熟“Niitaka”梨的多酚部分表现出显著的GTase抑制活性。成熟“富士”苹果对GTase的IC50为约50μl，而未成熟“富士”苹果对GTase的IC50为约0.7μl。因此，未成熟苹果具有比成熟苹果高约70倍的GTase抑制活性。
接着研究包括苹果中所存在的各种多酚化合物的GTase抑制活性。如图18所示，在苹果中所存在的多酚化合物中，绿原酸和根皮苷各自具有很低的GTase抑制活性。同时，儿茶素类，表儿茶素单体具有很低的GTase抑制活性，但由估计的图12的结构式所代表的高分子表儿茶素聚合物(表明为图18中的苹果鞣酸)有高的GTase抑制活性。图18中也列出了棓酸表儿茶素(一种绿茶中所存在的典型的儿茶素并已知为一种GTase抑制物质)[Agric.Biol.Chem.，5(11)，pp.2925-2929，1990；Chem.Pharm，Bull.，38(39)，pp，717-720，1990]的结果。用图18所作的计算，棓酸表儿茶素对GTase的IC50为约200ppm，而苹果鞣酸对GTase的IC50为约2ppm。因此，苹果鞣酸有比棓酸表儿茶素高约100倍的GTase抑制活性。从这些结果，认为图17中所看到的未成熟“富士”苹果的高GTase抑制活性是归因于苹果鞣酸的存在。
因此，本发明所得到的水果多酚含有高GTase抑制活性的化合物，因而也是一种很有效的防龋药剂。

Claims (14)

1.一种经压榨和/或提取蔷薇科的未成熟果实，然后纯化所得的果汁或提取物而得到的水果多酚。
2.根据权利要求1的水果多酚，其中蔷薇科的未成熟果实是苹果、梨或桃。
3.一种生产水果多酚的方法，该方法包含压榨和/或提取蔷薇科的未成熟果实，然后纯化所得的果汁或提取物以得到多酚部分。
4.根据权利要求3的方法，其中蔷薇科的未成熟果实是苹果、梨或桃。
5.一种抗氧化剂，它包含作为有效组分的通过压榨和/或提取蔷薇科的未成熟果实，然后纯化所得的果汁或提取物而得到的水果多酚。
6.根据权利要求5的抗氧化剂，其中蔷薇科的未成熟果实是苹果、梨或桃。
7.一种降血压药剂，它包含作为有效组分的具有血管紧张肽转化酶I抑制活性的水果多酚，该多酚是通过压榨和/或提取蔷薇科的未成熟果实，然后纯化所得的果汁或提取物而得到的。
8.根据权利要求7的降血压药剂，其中蔷薇科的未成熟果实是苹果、梨或桃。
9.一种抗诱变剂，它包含作为有效组分的具有突变抑制活性的水果多酚，该多酚是通过压榨和/或提取蔷薇科的未成熟果实，然后纯化所得的果汁或提取物而得到的。
10.根据权利要求9的抗诱变剂，其中蔷薇科的未成熟果实为苹果、梨或桃。
11.一种抗变态反应药剂，它包含作为有效组分的具有透明质酸酶抑制活性的水果多酚，该多酚是通过压榨和/或提取蔷薇科的未成熟果实，然后纯化所得的果汁或提取物而得到的。
12.根据权利要求11的抗变态反应药剂，其中蔷薇科的未成熟果实为苹果、梨或桃。
13.一种防龋药剂，它包含作为有效组分的具有葡萄糖基转移酶抑制活性的水果多酚，该多酚是通过压榨和/或提取蔷薇科的未成熟果实，然后纯化所得的果汁或提取物而得到的。
14.根据权利要求13的防龋药剂，其中蔷薇科的未成熟果实为苹果、梨或桃。
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