DE69431423T2

DE69431423T2 - Polyphenolmischung aus unreifen Äpfeln; Verfahren zur Herstellung von Polyphenolmischungen aus unreifen Rosaceae Früchten

Info

Publication number: DE69431423T2
Application number: DE69431423T
Authority: DE
Inventors: Tomomasa Kanda; Masayuki Tanabe; Akio Yanagida
Original assignee: Nikka Whisky Distilling Co Ltd
Current assignee: Asahi Breweries Ltd
Priority date: 1993-12-06
Filing date: 1994-07-20
Publication date: 2003-08-07
Anticipated expiration: 2014-07-21
Also published as: US5994413A; EP0657169A1; CA2128293C; CA2128293A1; ATE224722T1; KR950016777A; CN1051089C; AU6899694A; AU683892B2; DE69431423D1; KR100302514B1; EP0657169B1; US5932623A; KR100305116B1; CN1121924A; NZ264067A

Description

Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gemisch, das im Wesentlichen aus Polyphenolen aus unreifen Äpfeln besteht und ein Verfahren zur Herstellung eines Gemisches von Polyphenolen aus unreifen Rosaceae-Früchten.
Während der Wachstumszeit von Rosaceae-Bäumen, die essbare Früchte wie Äpfel, Birnen, Pfirsiche etc. tragen, erfolgt in der Zeit von Mitte Mai bis Mitte Juli im Allgemeinen ein "Ausdünnen" von überschüssigen Früchten. Beim Ausdünnen werden unreife Früchte in Form von Bündeln oder Büscheln bis auf einige von ihnen entfernt. Entsprechend wird durch das Ausdünnen eine große Menge an unreifen Früchten beseitigt, ohne verwendet zu werden. Diese unreifen Früchte sind im Vergleich zu reifen Früchten sehr bitter und die Schnittfläche jeder unreifen Frucht wird leicht braun. Dies lässt auf die Anwesenheit einer großen Menge von Polyphenolverbindungen in unreifen Früchten schließen.
Es ist bekannt, dass im Pflanzenreich Polyphenolverbindungen als Sekundärmetaboliten von Pflanzen in vielfältigen Arten und in großen Mengen vorhanden sind. Einige dieser Polyphenolverbindungen haben in der Vergangenheit im Bereich der Pharmakologie und in den letzten Jahren im Bereich der Lebensmittelchemie aufgrund ihrer breiten physiologischen Aktivitäten Aufmerksamkeit auf sich gezogen.
Darunter sind Tee-Polyphenole (Catechine) von speziellem Interesse und Gegenstand intensiver Untersuchungen. Es wurde gefunden, dass diese Tee-Polyphenole sehr umfangreiche physiologische Aktivitäten, wie antibakterielle Aktivität, antivirale Aktivität, antioxidative Aktivität, antimutagene Aktivität, antikarzinogene Aktivität, Koagulation von Blutplättchen verhindernde Aktivität, bluthochdruckverhindernde Aktivität, blutzuckeranstiegverhindernde Aktivität, blutcholesterinverringernde Aktivität, kariesverhindernde Aktivität, antiallergene Aktivität, darmfloraverbessernde Aktivität, desodorierende Aktivität etc. aufweisen [Japanische Offenlegungsschriften (Kokai) 214183/1988, 6499/1990, 178320/1992, etc.].
Es ist daher bekannt, dass beispielsweise aus Tee extrahierte Polyphenole umfangreiche physiologische Aktivitäten aufweisen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Fruchtpolyphenolgemisch mit verschiedenen physiologischen Aktivitäten zur Verfügung zu stellen, das sich von den aus Tee extrahierten Polyphenolen unterscheidet.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines effektiven und ökonomischen Verfahrens zur Herstellung eines Polyphenolgemischs aus Rosaceae- Früchten, insbesondere das oben genannte Fruchtpolyphenolgemisch.
Dementsprechend wird ein Gemisch zur Verfügung gestellt, das im Wesentlichen aus Polyphenolen besteht und durch Auspressen oder Extraktion unreifer Äpfel unter Bildung eines Saftes oder Extraktes, Behandlung des Saftes oder Extraktes mit einem Adsorptionsmittel, welches selektiv die im Saft oder Extrakt enthaltenen Polyphenole adsorbiert, Eluieren der Polyphenole aus dem Adsorptionsmittel mittels eines Alkohols und Rückgewinnung des Polyphenolgemisches aus dem Eluat erhältlich ist; wobei das Polyphenolgemisch im Wesentlichen aus Kaffeesäure, Kaffeesäureestern, p-Cumarsäure, p-Cumarsäureestern, Phloretin, Phloretinglykosiden, Phloridzin, Quercetin, Quercetinglykosiden, Catechin, Epicatechin und kondensierten Tanninen besteht, wobei es sich bei den kondensierten Tanninen um regelmäßige Polymere aus n Catechinmonomeren handelt, wobei n einen Wert von 7 bis 10 aufweist.
Erfindungsgemäß wird des Weiteren ein Verfahren zur Herstellung eines Polyphenolgemisches aus unreifen Rosaceae-Früchten bereitgestellt, bei dem man unreife Rosaceae-Früchte, insbesondere unreife Äpfel, unreife Birnen oder unreife Pfirsiche auspresst und/oder extrahiert und den resultierenden Saft oder Extrakt reinigt, um eine Polyphenolfraktion zu erhalten.
Das erfindungsgemäße Gemisch ist ein Antioxidants.
Das erfindungsgemäße Gemisch ist weiterhin ein blutdrucksenkendes Mittel und ein antimutagenes Mittel.
Das erfindungsgemäße Gemisch ist weiterhin ein antiallergisches Mittel mit Hyaluronidase-inhibierender Aktivität.
Das erfindungsgemäße Gemisch ist weiterhin ein kariesverhinderndes Mittel.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 stellt Diagramme dar, die das HPLC-Chromatogramm und die UV- Spektren jedes Peaks der Polyphenole aus unreifen Äpfeln im Vergleich zeigen.
Fig. 2 stellt Kurven dar, die das jeweilige Verhältnis zwischen der Menge an gebildetem Peroxylipid (Extinktion bei 500 nm) und der zugegebenen Konzentration eines Extraktes unreifer oder reifer Äpfel der Sorte "Fuji" innerhalb einer Woche nach Zugabe des Extrakts zu einem Reaktionssystem zeigen.
Fig. 3 stellt Kurven dar, die den jeweiligen Zusammenhang zwischen der Menge an gebildetem Peroxylipid (Extinktion bei 500 nm) und der zugegebenen Konzentration von Polyphenolfraktionen von unreifen oder reifen Äpfeln der Sorte "Fuji" innerhalb einer Woche nach Zugabe der Fraktion zu einem Reaktionssystem zeigen.
Fig. 4 stellt Kurven dar, die die Menge an gebildeten Peroxylipiden (Extinktion bei 500 nm) innerhalb einer Woche nach Zugabe verschiedener Polyphenolverbindungen zu den entsprechenden Reaktionssystemen zeigen.
Fig. 5 stellt Kurven dar, die den Zusammenhang zwischen der Menge an gebildetem Peroxylipid (Extinktion bei 500 nm) und der jeweils zugegebenen Konzentration von Polyphenolfraktionen von unreifen Äpfeln innerhalb einer Woche nach Zugabe der Fraktionen zu einem Reaktionssystem zeigen.
Fig. 6 stellt Kurven dar, die den Zusammenhang zwischen der Menge an gebildetem Peroxylipid (Extinktion bei 500 nm) und der jeweils zugegebenen Konzentration von Polyphenolfraktionen unreifer Rosaceae-Früchte innerhalb einer Woche nach Zugabe der Fraktion zu einem Reaktionssystem zeigen.
Fig. 7 stellt Kurven dar, die die jeweilige Angiotensin-1-Konversionsenzym (im Folgenden als ACE bezeichnet) -inhibierende Aktivität von Polyphenolfraktionen von unreifen oder reifen Äpfeln der Sorte "Fuji" zeigen.
Fig. 8 stellt Kurven dar, die die ACE-inhibierende Aktivitäten von verschiedenen Polyphenolfraktionen B zeigen, wenn jede Polyphenolfraktion B in unterschiedlichen Mengen zu einem Reaktionssystem gegeben wurde.
Fig. 9 stellt Kurven dar, die die ACE-inhibierende Aktivitäten von verschiedenen Polyphenolverbindungen zeigen, wenn jede Polyphenolverbindung in unterschiedlichen Mengen zu einem Reaktionssystem gegeben wurde.
Fig. 10 ist ein Diagramm, welches das mit einem Spektrophotometer gemessene Absorptionsspektrum einer isolierten Polyphenolfraktion zeigt.
Fig. 11 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse der GPC-Messung der Molekulargewichte von kondensiertem Tannin zeigt.
Fig. 12 ist die Strukturformel der ACE-inhibierenden Substanz, die in dem erfindungsgemäßen Polyphenolgemisch aus unreifen Äpfeln enthalten ist.
Fig. 13 stellt Kurven dar, die die antimutagene Aktivität verschiedener Polyphenole gegenüber Trp-P-2 zeigen.
Fig. 14 stellt Kurven dar, die die antimutagene Aktivität von Apfeltannin und Epigallocatechingallat gegenüber Benz[a]pyren zeigen.
Fig. 15 stellt Kurven dar, die die Hyaluronidase-inhibierenden Aktivitäten von verschiedenen Rosaceae-Fruchtextrakten zeigen.
Fig. 16 stellt Kurven dar, die die Hyaluronidase-inhibierenden Aktivitäten eines antiallergischen Mittels (Natriumcromoglicat) und von Apfeltannin zeigen.
Fig. 17 stellt Kurven dar, die den Zusammenhang zwischen der Menge an gebildetem unlöslichen Glucan und der Menge an zugegebenen Rosaceae-Fruchtpolyphenolfraktionen zeigen, wenn verschiedene Rosaceae-Fruchtpolyphenolfraktionen zu den entsprechenden Reaktionssystemen gegeben werden.
Fig. 18 stellt Kurven dar, die den Zusammenhang zwischen der Menge an gebildetem unlöslichen Glucan und der Menge an zugegebenen Polyphenolverbindungen zeigen, wenn verschiedene Polyphenolverbindungen zu den entsprechenden Reaktionssystemen gegeben werden.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Das erfindungsgemäße Fruchtpolyphenolgemisch ist ein Polyphenolgemisch und wird erhalten, indem man unreife Äpfel auspresst oder extrahiert und den erhaltenen Saft oder Extrakt reinigt. Die Reinigung wird durchgeführt, indem man den Saft oder Extrakt mit einem Adsorptionsmittel behandelt, wobei die von dem Adsorptionsmittel adsorbierte Saft- oder Extraktfraktion (im Folgenden als "adsorbierte Fraktion" bezeichnet) ein Fruchtpolyphenol enthält. Die adsorbierte Fraktion wird mit einem wasserfreien Alkohol (z. B. Ethanol) eluiert, wobei eine gereinigte Polyphenolfraktion erhalten wird.
Diese Polyphenolfraktion wird dann aufkonzentriert, wobei ein flüssiges Polyphenolprodukt erhalten wird.
Wenn das, wie zuvor beschrieben, erhaltene Konzentrat einer Sprühtrocknung oder Gefriertrocknung unterzogen wird, erhält man ein pulverförmiges Polyphenolprodukt. Das in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Ausgangsmaterial sind Rosaceae-Früchte. Dabei sind unreife Äpfel, Birnen, Pfirsiche, etc. bevorzugt, wobei Äpfel besonders bevorzugt sind. Unreife Früchte enthalten in größeren Men gen Polyphenolverbindungen und zudem in großen Mengen verschiedene Polyphenolverbindungen mit unterschiedlichen physiologischen Aktivitäten.
Im Folgenden wird das Auspressen beschrieben. Nach einem geeigneten Auspressverfahren wird das Ausgangsmaterial gewaschen; das gewaschene Material wird mit oder ohne Zugabe von schwefliger Säure zerkleinert und gepresst, wobei ein Saft erhalten wird; vorzugsweise wird ein pectolytisches Enzym zugegeben und das resultierende Gemisch einer Zentrifugation, Filtration oder vergleichbarem unterzogen, wobei ein klarer Saft erhalten wird.
Im Folgenden wird die Extraktion beschrieben. Nach einem geeigneten Extraktionsverfahren wird das gewaschene Material mit einem Alkohol (z. B. Ethanol oder Methanol) gemischt; das Gemisch wird zerquetscht, das erhaltene Material wird, während es eingetaucht und gepresst oder unter Rückfluss erhitzt wird, extrahiert; der Extrakt wird unter verringertem Druck zur Entfernung des Alkohols aufkonzentriert und das Konzentrat wird einer Zentrifugation und Filtration oder einer Verteilung mit einem organischen Lösungsmittel (z. B. Hexan oder Chloroform) und Filtration unterzogen, wobei ein klarer Extrakt erhalten wird.
Im Folgenden wird die Reinigung des wie zuvor beschrieben erhaltenen Safts oder Extrakts beschrieben. Der, wie zuvor beschrieben, erhaltene klare Saft oder klare Extrakt wird auf eine Säule gegeben, die mit einem Adsorptionsmittel gefüllt ist, welches befähigt ist, das in dem Saft oder Extrakt enthaltene Fruchtpolyphenol selektiv zu adsorbieren und das adsorbierte Polyphenol bei Auftrag eines Elutionsmittels freizugeben, wobei eine Poylphenolfraktion adsorbiert wird. [Beispiele für Adsorptionsmittel sind Syntheseharze vom Styrol-Divinylbenzol-Typ, Anionenaustauscherharze und Kieselgel mit chemisch gebundenen Octadecylgruppen (ODS)]. Dann wird zum Waschen destilliertes Wasser auf die Säule gegeben. Danach wird eine 20 bis 100%-ige Alkohollösung (z. B. Ethanol), vorzugsweise eine etwa 50%-ige Alkohollösung, auf die Säule gegeben, wodurch eine Polyphenolfraktion eluiert und gewonnen wird. Die resultierende Polyphenollösung wird unter reduziertem Druck zur Entfernung des Alkohols aufkonzentriert, wobei ein flüssiges Fruchtpolyphenolprodukt (vorzugsweise wird eine organische Säure wie Äpfelsäure oder vergleichbares dazugegeben) erhalten wird. Dieses flüssige Produkt wird nach oder ohne Zugabe eines Pulverhilfsmittels, wie Dextrin oder vergleichbares, einer Sprühtrocknung oder Gefriertrocknung unterzogen, wobei ein pulverförmiges Polyphenolprodukt erhalten wird.
Wie der Erfinder bestätigt hat, setzt sich das erfindungsgemäß erhaltene Polyphenolgemisch aus unreifen Äpfeln und das gemäß dem Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 10 erhaltene Polyphenolgemisch aus unreifen Rosaceae-Früchten im Wesentlichen aus (1) einfachen Polyphenolverbindungen wie Kaffeesäure-Derivate, p-Cumarsäure-Derivate, Flavan-3-ole (Catechine), Flavonole (Quercetinglykoside), Dihydrochalcone (Phloretinglykoside) und dergleichen und (2) hochmolekularen Polyphenolverbindungen wie kondensierte Tannine und dergleichen, die zum Beispiel die in Fig. 12 angegebene Formel aufweisen, zusammen.
Daher ist davon auszugehen, dass das erfindungsgemäße Polyphenolgemisch aus unreifen Äpfeln und das gemäß dem Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 10 erhaltene Polyphenolgemisch aus unreifen Rosaceae-Früchten umfangreiche physiologische Funktionen haben und der Erfinder führte eine ausgiebige Studie durch. Folglich fand er zunächst, dass das erfindungsgemäße Polyphenolgemisch aus unreifen Äpfeln und das gemäß dem Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 10 erhaltene Polyphenolgemisch aus unreifen Rosaceae-Früchten einen hohen Gehalt einer Verbindung aufweisen, welche die Oxidation von Linolsäure (ein pflanzliches Öl) zu inhibieren vermag. Das Polyphenolgemisch aus unreifen Äpfeln und das gemäß dem Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 10 erhaltene Polyphenolgemisch aus unreifen Rosaceae-Früchten sind daher sehr wirksame Antioxidantien.
Danach fand er, dass das erfindungsgemäße Polyphenolgemisch aus unreifen Äpfeln und das gemäß dem Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 10 erhaltene Polyphenolgemisch aus unreifen Rosaceae-Früchten einen hohen Gehalt einer Verbindung aufweisen, die die Wirkungsweise von ACE (ein Enzym, das mit der Steigerung des Blutdrucks im Zusammenhang steht) zu inhibieren vermag. Das erfindungsgemäße Polyphenolgemisch aus unreifen Äpfeln und das gemäß dem Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 10 erhaltene Polyphenolgemisch aus unreifen Rosaceae- Früchten sind daher sehr wirksame blutdrucksenkende Mittel.
Man führte eine weitere Studie durch, um den ACE-inhibierenden Bestandteil, der in dem erfindungsgemäßen Polyphenolgemisch aus unreifen Äpfeln und dem gemäß den Ansprüchen 3 bis 10 erhaltenen Polyphenolgemisch aus unreifen Rosaceae-Früchten enthalten ist, zu identifizieren. Folglich fand man, dass die ACE-inhibierende Verbindung ein kondensiertes Tannin der Strukturformel in Fig. 12 ist.
Viele der in den letzten Jahren durchgeführten Untersuchungen ließen erkennen, dass ein enger Zusammenhang zwischen einer karzinogenen Substanz und einer mutagenen Substanz besteht und somit auch ein enger Zusammenhang zwi schen Karzinogenität und Mutagenizität. Folglich sollte eine Substanz, welche die Mutagenität zu inhibieren vermag, auch der Karzinogenität vorbeugen. Der Erfinder untersuchte, ob das erfindungsgemäße Polyphenolgemisch aus unreifen Äpfeln und das gemäß dem Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 10 erhaltene Polyphenolgemisch aus unreifen Rosaceae-Früchten eine antimutagene Aktivität haben und bestätigte, dass das Polyphenolgemisch diese Aktivität hat. Daher sind das erfindungsgemäße Polyphenolgemisch aus unreifen Äpfeln und das gemäß dem Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 10 erhaltene Polyphenolgemisch aus unreifen Rosaceae-Früchten sehr wirksame antimutagene Mittel.
Hyaluronidase ist ein Enzym, bei dem man eine bestimmte Zellaktivität bei der Rekonstruktion von Bindegewebe in Betracht zieht. In den letzten Jahren durchgeführte Untersuchungen (Chem. Pharm. Bull., 33, S. 642, 1985; ibid., 33, S. 5079, 1985; ibid., 33, S. 3787, 1985; ibid 33, S. 5079, 1985; und ibid., 40, S. 1439, 1992) ließen erkennen, dass bei synthetisch gewonnenen Antiallergika (z. B. Natriumcromoglikat und Tranilast) ein enger Zusammenhang zwischen der Hyaluronidaseinhibierenden Aktivität und der Aktivität bezüglich der Unterdrückung der Histaminfreisetzung aus Mastzellen besteht. Unter Ausnützung dieses engen Zusammenhangs fand man verschiedene antiallergische Substanzen in Naturprodukten, wobei man bei den Produkten Messungen auf die Hyaluronidase inhibierende Aktivität vornahm. Folglich untersuchte der Erfinder, ob das erfindungsgemäße Polyphenolgemisch aus unreifen Äpfeln und das gemäß dem Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 10 erhaltene Polyphenolgemisch aus unreifen Rosaceae-Früchten eine Hyaluronidase inhibierende Aktivität haben und er bestätigte, dass das Polyphenolgemisch diese Aktivität hat. Deshalb sind das erfindungsgemäße Polyphenolgemisch aus unreifen Äpfeln und das gemäß dem Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 10 erhaltene Polyphenolgemisch aus unreifen Rosaceae-Früchten sehr wirksame antiallergische Mittel.
Es hat sich jetzt bestätigt, dass Zahnkaries (Zahnfäule) eine bakterielle Erkrankung ist, die durch oralen Streptococcus, einschließlich Streptococcus mutans, hervorgerufen wird. Im Verlauf der Zahnkariesbildung kommt der Bildung eines Belages eine ganz besondere Bedeutung zu.
Das heißt, aus der in der Nahrung enthaltenen Saccharose wird durch die Wirkung der Glucosyltransferase (im Folgenden als "GTase" bezeichnet), die ein von karieserzeugenden Bakterien hergestelltes Enzym ist, klebriges und unlösliches Glu can synthetisiert; Bakterien haften über Glucan am Dentin; und der erhaltene Belag verursacht Zahnkaries.
Daher sollten Substanzen, welche die Wirkung von GTasen zu inhibieren vermögen, ein wirksames karieshemmendes Mittel [Appl. Env. Microbiol., 59 (4), SS. 968-973, 1993; Biosci. Biotech. Biochem., 56 (5), SS. 766-768, 1992; Agric. Biol. Chem., 54 (11), SS. 2925-2929, 1990; und Chem. Pharm. Bull., 38 (3), SS. 717- 720, 1990] sein.
Der Erfinder untersuchte daher, ob das erfindungsgemäße Polyphenolgemisch aus unreifen Äpfeln und das gemäß dem Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 10 erhaltene Polyphenolgemisch aus unreifen Rosaceae-Früchten eine inhibierende Aktivität auf unlösliches Glucan herstellende GTase, die durch S. sobrinus (typische karieserzeugende Bakterien) erzeugt wird, haben und er fand, dass das Polyphenolgemisch diese Aktivität hat. Daher sind das erfindungsgemäße Polyphenolgemisch aus unreifen Äpfeln und das gemäß dem Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 10 erhaltene Polyphenolgemisch aus unreifen Rosaceae-Früchten sehr wirksame karieshemmende Mittel.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung ausführlich unter Bezug auf die Beispiele beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Beispiele beschränkt.

Beispiel 1

Analyse der Zusammensetzung des Saftes aus unreifen Äpfeln

Die folgenden Proben wurden einer allgemeinen Analyse der Zusammensetzung unterworfen.
- Proben
Reifer Apfel der Sorte "Fuji": im Handel erhältliches Produkt, das ohne Verwendung eines Beutels gewachsen war
Unreifer Apfel der Sorte "Fuji": Mitte Juni geerntet
- Behandlung der Proben
Man zerkleinerte jede Fruchtprobe mit einem Mixer und gab eine geeignete Menge Kaliummetabisulfit (ein Antioxidans) hinzu. Man zentrifugierte den erhaltenen Saft und filtrierte, wobei man einen klaren Saft erhielt. Bei jedem Saft maß man die folgenden Punkte:
- Gemessen wurde (Vorgehensweise)
- durchschnittliches Gewicht der einzelnen Früchte (n = 50)
- Anteil des erhaltenen Saftes (%)
- pH
- Acidität (g/l berechnet als Äpfelsäure)
- Brix-Grade
- gesamter Phenolgehalt (berechnet als Chlorogensäure)
- gesamter Ascorbinsäuregehalt
- Analyse der organischen Säuren
- Analyse der Saccharide
- Analyse der Metallionen
- Analyse der freien Aminosäuren
Die Messergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass die Zusammensetzung eines Saftes aus unreifen Äpfeln sich deutlich von der Zusammensetzung eines Saftes aus reifen Äpfeln unterscheidet. Der Saft unreifer Äpfel war insbesondere reich an Gesamtphenolen, Gesamtascorbinsäure, organischen Säuren (insbesondere Chinasäure), Metallionen und freien Aminosäuren (insbesondere Asparagin, Phenylalanin und γ-Aminobuttersäure). Im Gegensatz dazu enthielt der Saft unreifer Äpfel sehr wenig Saccharide.
Danach unterzog man das in unreifen Äpfeln enthaltene Polyphenol mittels HPLC einer Zusammensetzungsanalyse.
Als Polyphenol-Probe setzte man ein gereinigtes Polyphenol ein, das man durch Feststoffextraktion eines Extraktes aus unreifen Äpfeln erhalten hatte (siehe Beispiel 2).
Die Analysenergebnisse kann man der Fig. 1 entnehmen.
Aus Fig. 1 ist ersichtlich, dass das in unreifem Apfel enthaltene Polyphenol im Wesentlichen aus Kaffeesäure-Derivaten (Chlorogensäure usw.), p-Cumarsäure- Derivaten, Flavan-3-olen (Catechin, Epicatechin, usw.), Flavanolen (Quercetinglykosiden) und Dihydrochalconen (Phloretinglykoside, insbesondere Phloridzin) besteht. Hiervon waren Chlorogensäure, Catechin, Epicatechin und Phloridzin in großen Mengen enthalten.

Beispiel 2 (nicht erfindungsgemäß)

Antioxidative Aktivitäten von Polyphenolen in unreifen Rosaceae-Früchten

- Ausgangsmaterialien: man verwendete die folgenden Ausgangsmaterialien.
Reifer Apfel: im Handel erhältliches Produkt, das ohne Verwendung eines Beutels gewachsen war.
Unreifer Apfel: Mitte Juni geerntet
Sorte "Fuji": durchschnittliches Gewicht = 4,97 g (n = 50)
Sorte "Tugaru": durchschnittliches Gewicht = 7,80 g (n = 50)
Sorte "Jonagold": durchschnittliches Gewicht = 3,86 g (n = 50)
Sorte "Hokuto": durchschnittliches Gewicht = 3,32 g (n = 50)
Sorte "Ohrin": durchschnittliches Gewicht = 10,34 g (n = 50)
Unreife Birne: Anfang Juni geerntet
Sorte "Hohsui": durchschnittliches Gewicht = 8,98 g (n = 50)
Unreifer Pfirsich: Anfang Juni geerntet
Sorte "Akatuki": durchschnittliches Gewicht = 5,03 g (n = 50)

Herstellung der Proben

Saftproben: man wiederholte das Verfahren aus Beispiel 1, wobei man klare Säfte erhielt.
Extraktproben: zur Gewinnung jeder Extraktprobe homogenisierte man 400 g Ausgangsmaterial mit 1% HCl-haltigem Methanol und extrahierte (dreimal) das erhaltene Material unter Erhitzen am Rückfluss, konzentrierte den Extrakt unter vermindertem Druck zur Entfernung des Methanols auf, gab Chloroform zu, um eine Verteilung zu bewirken (zweimal), gewann die wässrige Schicht zurück, filtrierte die wässrige Schicht und gab danach destilliertes Wasser zum Filtrat, um auf ein Gesamtvolumen von 200 ml aufzufüllen.
Sofern erforderlich unterwarf man die Fruchtproben und die Extraktproben mittels Sep-pack C18 einer Feststoffextraktion, wobei man die Polyphenolfraktionen erhielt.
- Prüfverfahren auf antioxidative Aktivität
Mit dem folgenden Verfahren prüfte man auf antioxidative Aktivität:
In einem fest verschlossenen Reagenzglas mischte man 5 ml einer Ausgangslosung (Ethanol mit 4% Linolsäure) mit 4 ml Phosphatpuffer-Lösung (pH = 7,0) und 1 ml der Probenlösung. Unter Lichtausschluss hielt man das Reagenzglas in einem 50ºC Thermostat. Unter den gleichen Bedingungen hielt man auch ein Reagenzglas (Kontrolle) mit Ethanol anstellte von Linolsäure und ein Reagenzglas (Blindwert) mit dem Lösungsmittel der Probe anstelle der Probe.
Während der Lagerung entnahm man im Verlauf der Zeit dem Reaktionsgemisch Proben, um die gebildete Peroxidmenge mit dem Isothiocyanat-Verfahren (Eisenrhodanid-Verfahren) quantitativ zu bestimmen.
- Messergebnisse
Die antioxidative Aktivität wurde an dem Extrakt aus unreifen Äpfeln der Sorte "Fuji" und dem Extrakt aus reifen Äpfeln der Sorte "Fuji" untersucht.
Man gab die zwei vorstehend genannten Extrakte in einem Konzentrationsbereich von 1-1000 ul/g (Linolsäure) zu einem Reaktionssystem. Eine Woche nach der Zugabe bestimmte man die Menge an gebildetem Peroxylipid (Extinktion bei 500 nm). Dessen Zusammenhang mit der zugegebenen Konzentration des Extraktes zeigt Fig. 2.
Wie man Fig. 2 entnehmen kann, zeigen sowohl der Extrakt aus unreifen Äpfeln der Sorte "Fuji" wie der Extrakt aus reifen Äpfeln der Sorte "Fuji" eine antioxidative Aktivität gegenüber Linolsäure, aber der Extrakt aus unreifem "Fuji" weist eine höhere Aktivität auf.
Um zu untersuchen, welche Substanzen die antioxidative Aktivität aufwiesen, teilte man danach den Extrakt unreifer Äpfel der Sorte "Fuji" und den Extrakt reifer Äpfel der Sorte "Fuji" mittels Sep-pack C18 hauptsächlich in zwei Fraktionen, d. h. eine Fraktion A (eine nicht-adsorbierte Fraktion) und eine Fraktion B (eine adsorbierte Fraktion, eine Polyphenol-Fraktion). Man gab unabhängig jeden Extrakt, jede Fraktion A und jede Fraktion B in einem Konzentrationsbereich von 1-1000 ul/g (Linolsäure) zu einem Reaktionssystem. Eine Woche nach der Zugabe bestimmte man die Menge an gebildetem Peroxylipid (Extinktion bei 500 nm). Dessen Zusammenhang mit der zugegebenen Konzentration des Extraktes oder der Fraktion A oder B zeigt Fig. 3.
Wie man Fig. 3 entnehmen kann beruht die antioxidative Aktivität des Extraktes reifer Äpfel der Sorte "Fuji" auf Fraktion B des Extraktes. Bei dem Extrakt aus unreifen Äpfeln der Sorte "Fuji" zeigten beide Fraktionen A und B eine antioxidative Aktivität, aber die Aktivität der Fraktion B ist höher.
Aus dem voranstehenden lässt sich schließen, dass die antioxidativen Aktivitäten der Extrakte aus reifen und unreifen Äpfeln der Sorte "Fuji" weitestgehend auf den in den Fraktionen B enthaltenen Verbindungen beruhen, d. h. auf den in den Fraktionen B vorhandenen Polyphenol-Verbindungen.
Bei den einfachen, in Äpfeln enthaltenen Polyphenolverbindungen, die im Handel erhältlich sind, maß man die antioxidative Aktivität. Man gab jede dieser Verbindungen in einer Konzentration von 2 uM/g (Linolsäure) zu einem Reaktionssystem. Eine Woche nach der Zugabe bestimmte man die Menge an gebildetem Per oxylipid (Extinktion bei 500 nm). Die Extinktionen innerhalb einer Woche nach Zugabe verschiedener Polyphenolverbindungen sind in Fig. 4 gezeigt.
Fig. 4 umfasst neben den voranstehend erwähnten Polyphenolen Vergleichssubstanzen, d. h. drei bekannte Antioxidantien (BMA, BHT und Vitamin E) und typische, in den voranstehend erwähnten Fraktionen A vorkommenden Verbindungen [Chinasäure, Äpfelsäure und γ-Aminobuttersäure (GABA)].
Demzufolge hatten unter den Polyphenolverbindungen sechs Verbindungen [Kaffeesäure, Chlorogensäure, (+)-Catechin, (-)-Epicatechin, Quercetin und Rutin (Quercetin-3-rha) antioxidative Aktivitäten, die denen von BHA und BHT gleichwertig waren. Polyphenole wie p-Cumarsäure, Phloretin und Phloridzin hatten jedoch keine antioxidative Aktivität. Außerdem hatte keine der in den Fraktionen A enthaltenen Verbindungen eine antioxidative Aktivität.
Vergleicht man (1) die Mengen der in Äpfeln vorhandenen Verbindungen und (2) deren antioxidativen Aktivitäten, so könnte man urteilen, dass die hohe antioxidative Aktivität des Extraktes unreifer Äpfel und des Safts unreifer Äpfel weitestgehend von Chlorogensäure, (+)-Catechin und (-)-Epicatechin hervorgerufen wird.
Aus dem voranstehenden bestätigte sich, dass unreife Äpfel der Sorte "Fuji" eine hohe antioxidative Aktivität hatten. Des Weiteren wurden die in unreifen Äpfeln der Sorte "Fuji" vorkommenden Verbindungen, die diese Aktivität zeigen, identifiziert.
Nacheinander untersuchte man, ob andere unreife Äpfel als die der Sorte "Fuji" diegleiche antioxidative Aktivität hatten.
Man stellte aus den Extrakten verschiedener unreifer Äpfel (Sorten "Fuji", "Tugaru", "Jonagold", "Hokuto" und "Ohrin") die entsprechenden Fraktionen B (Polyphenol-Fraktionen) her. Man gab jede Fraktion in einem Konzentrationsbereich von 1 bis 500 ul/g (Linolsäure) zu einem Reaktionssystem. Eine Woche nach der Zugabe bestimmte man die Menge an gebildetem Peroxylipid (Extinktion bei 500 nm). Dessen Zusammenhang mit der zugegebenen Konzentration der Fraktion zeigt Fig. 5. Fig. 5 umfasst zu Vergleichszwecken auch das Ergebnis mit unreifem "Fuji".
Danach zeigte jede Apfelsorte eine hohe Aktivität und es gab im Wesentlichen keinen Unterschied zwischen den Apfelsorten im Hinblick auf die antioxidative Aktivität.
Außerdem wurden die antioxidativen Aktivitäten anderer unreifer Früchte als unreife Äpfel untersucht.
Aus den Extrakten verschiedener unreifer Rosaceae-Früchte (Äpfel der Sorte "Fuji", Birnen der Sorte "Hohsui" und Pfirsiche der Sorte "Akatuki") stellte man die entsprechenden Fraktionen B (Polyphenolfraktionen) her. Man gab jede Fraktion in einem Konzentrationsbereich von 1 bis 500 ul/g (Linolsäure) zu einem Reaktionssystem. Eine Woche nach der Zugabe bestimmte man die Menge an gebildetem Peroxylipid (Extinktion bei 500 nm). Fig. 6 zeigt dessen Zusammenhang mit der zugegebenen Konzentration der Fraktion.
Demzufolge hatte der unreife Pfirsich eine antioxidative Aktivität, die etwa der des unreifen Apfels entsprach und die unreife Birne hatte eine ziemlich hohe antioxidative Aktivität, wenn auch die Aktivität geringer war als des unreifen Apfels.

Beispiel 3 (nicht erfindungsgemäß)

ACE (Angiotensin-1-Konversionsenzym)-inhibierende Aktivität von Polyphenolen, die in unreifen Äpfeln enthalten sind

- Ausgangsmaterialien: Man verwendete die folgenden Ausgangsmaterialien.
Unreife Äpfel: Man verwendete die gleichen wie im Beispiel 2.
- Herstellung der Proben: Man stellte die "Extraktproben" und die "Polyphenolfraktionen" auf die im Beispiel 2 beschriebene Weise her.
- Prüfverfahren auf ACE-inhibierende Aktivität
Man führte die Untersuchung auf ACE-inhibierende Aktivität nach einem üblichen Verfahren durch.
Das heißt, man gab eine Probenlösung zu einer im Handel erhältlichen ACE- Lösung, um eine Vorinkubation durchzuführen; anschließend gab man Bz-Gly-His- Leu als Substrat zu, um eine Reaktion in Gang zu setzen; das durch die Reaktion gebildete His-Fragment wurde mit Orthophthaldialdehyd markiert; anschließend bestimmte man die Fluoreszenzintensität (Ex, 360 nm, Em. 490) der erhaltenen Lösung.
Die folgende Formel gibt die ACE-inhibierende Aktivität der Probenlösung wieder:
{1 - (S - SB)/(C - CB)} · 100(%)
worin S: für die Fluroeszenzintensität der Testlösung steht,
C: für die Fluoreszenzintensität der Vergleichslösung steht, wobei man Wasser anstelle der Probe verwendete,
SB: für die Fluoreszenzintensität des Blindwertes für S (der Blindwert enthielt Wasser anstelle des Enzyms) steht und
CB: für die Fluoreszenzintensität des Blindwertes für C (der Blindwert enthielt Wasser anstelle des Enzyms) steht.
- Messergebnisse
Der Extrakt aus unreifen Äpfeln der Sorte "Fuji" und aus reifen Äpfeln der Sorte "Fuji" wurden mittels Sep-pak C18 in die jeweiligen nichtadsorbierten Fraktionen (Fraktionen A) und Polyphenolfraktionen (Fraktionen B) fraktioniert. Man maß für jede Fraktion die ACE-inhibierende Aktivität. Die Ergebnisse kann man Fig. 7 entnehmen.
Demzufolge zeigten die Fraktionen B der unreifen und der reifen Äpfel eine hohe ACE-inhibierende Aktivität. Insbesondere zeigte die Fraktion B aus unreifen Äpfeln eine 100%ige Inhibitation. Um die ACE-inhibierende Aktivität der Fraktionen aus unreifen und reifen Äpfeln genauer vergleichen zu können, untersuchte man die Veränderungen der ACE-inhibierenden Aktivitäten zweier Fraktionen B, wenn jede Fraktion B in unterschiedlichen Mengen zu dem voranstehend erwähnten Reaktionssystem gegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 dargestellt.
Demzufolge betrug die Konzentration bei 50%iger Inhibition, d. h. der IC&sub5;&sub0;- Wert der Fraktion B aus reifen Äpfeln etwa 3 ul. Im Gegensatz dazu betrug der IC&sub5;&sub0;- Wert der Fraktion B aus unreifen Äpfeln 0,1 ul oder weniger. Die Fraktion B aus unreifen Äpfeln zeigte somit eine sehr hohe ACE-inhibierende Aktivität.
Man maß diese hohe ACE-inhibierende Aktivität unreifer Äpfel ebenfalls bei anderen, von der Sorte "Fuji" verschiedenen, Apfelsorten.
Aus dem voranstehenden folgt, dass unreife Äpfel Verbindungen mit hoher ACE-inhibierender Aktivität enthalten und dass diese Verbindungen Polyphenole sind. Die ACE-inhibierende Aktivität unreifer Pfirsiche und unreifer Birnen ist übrigens geringer als die unreifer Äpfel.
Danach wurde die ACE-inhibierende Aktivität einfacher Polyphenole, die in unreifen Äpfeln enthalten sind und ohne weiteres als reine Produkte im Handel erhältlich sind, gemessen. Insbesondere untersuchte man die Änderungen der ACE- verbessernden Aktivitäten von Polyphenolen, wenn man jedes Polyphenol in unterschiedlichen Mengen zu einem Reaktionssystem gab. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 dargestellt.
Fig. 9 enthält zu Vergleichszwecken die ACE-inhibierenden Aktivitäten von Tee-Catechinen (bekanntlich haben Tee-Catechine ACE-inhibierende Aktivitäten). In Fig. 9 betragen die IC&sub5;&sub0;-Werte von (-)-Epigallocatechingallat (EGCg) beziehungsweise (-)-Epicatechingallat (ECg) 0,3 mM beziehungsweise 2 mM und sie weisen hohe ACE-inhibierende Aktivitäten auf. Es wurde berichtet, dass GABALONG-Tee (eine Handelsmarke von japanischen Teemarkthändlern), bei dem die GABA-Konzentration durch Verarbeitung erhöht ist, in einem Test an SHRs (Ratten mit spontan erhöhtem Blutdruck) eine blutdrucksenkende Aktivität zeigten, aber in dem vorliegenden Test zeigte GABA keine ACE-inhibierende Aktivität.
Unterdessen zeigten die in unreifen Äpfeln enthaltenen Polyphenole bei hohen Konzentrationen ACE-inhibierende Aktivitäten. Ihre IC&sub5;&sub0;-Werte waren jedoch niedrig, und selbst Quercetin mit der höchsten Aktivität hatte einen niedrigen IC&sub5;&sub0;-Wert von etwa 5 mM. Somit zeigten die in unreifen Äpfeln enthaltenen Polyphenole weit niedrigere ACE-inhibierende Aktivitäten als EGC und ECg.
Unterstellt, dass alle Polyphenole in der Fraktion B aus unreifen Äpfeln EGCg sind, wurde die Gesamtphenolmenge in der Fraktion B unter Verwendung der Eichkurve von EGCg berechnet. Sie betrug etwa 15000 ppm und der Polyphenolgehalt in der Fraktion B wurde auf 33,82 mM, berechnet als EGCg, berechnet. Mit diesem berechneten Wert zeichnete man in Fig. 9 die Aktivitätskurve der Fraktion B, die belegte, dass die Fraktion B eine höhere ACE-inhibierende Aktivität (IC&sub5;&sub0;-Wert = 0,2 mM) als EGCg hatte. Tatsächlich enthält die Fraktion B weder EGCg noch ECg und, die einfachen Polyphenole in unreifen Äpfeln zeigen, wie zuvor erwähnt, keine auffallende ACE-inhibierende Aktivität. Man nimmt an, dass die hohe ACE-inhibierende Aktivität der Fraktion B aus unreifen Äpfeln in Fig. 9 mit dem Vorhandensein anderer, nicht identifizierter Polyphenole in der Fraktion B im Zusammenhang steht.

Beispiel 4 (nicht erfindungsgemäß)

Identifizierung von ACE-inhibierenden Verbindungen von Polyphenolen in unreifen Äpfeln

- Probe
Man erhielt einen Extrakt aus unreifen Äpfeln der Sorte "Fuji" auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise und unterwarf den Extrakt einer Feststoffextraktion, wo bei man eine Polyphenolfraktion erhielt. Im Folgenden verwendete man diese Polyphenolfraktion als Probe.
- Prüfverfahren
Man füllte eine Probenlösung in eine Sephadex LH-20-Säule. Man wusch die Säule mit destilliertem Wasser. Anschließend eluierte man zunächst mit 20 bis 60%igem Methanol (mit HCl angesäuert) und anschließend mit 70%igem Aceton (mit HCl angesäuert), wobei man die Polyphenolfraktionen erhielt.
Die erhaltenen Polyphenolfraktionen wurden jeweils mit HPLC einer Analyse ihrer Zusammensetzung, einer Messung der Gesamtphenole und einem Test auf ACE-inhibierende Aktivität unterworfen. Sofern erforderlich nahm man auch Absorptionsspektren auf und führte Gelpermeationchromatographie durch.
- Testergebnisse
Man versuchte eine Fraktionierung mit eine Sephadex LH-20 Säule, um die in der Probe enthaltenen ACE-inhibierenden Verbindungen von den übrigen Polyphenolen zu trennen. Man unterzog die durch Eluieren erhaltenen Fraktionen mit HPLC einer Zusammensetzungsanalyse auf einfache Polyphenole sowie dem ACE- inhibierenden Test. Alle einfachen Polyphenole wurden eluiert, wenn 60%iges Methanol als Eluierungsmittel auf die Säule gegeben wurde. Trotzdem waren alle ACE-inhibierenden Verbindungen in dem nachfolgenden Eluat, d. h. im 70%igen Aceton. Man destillierte die voranstehend erhaltene Fraktion an ACE-inhibierenden Verbindungen, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde gefriergetrocknet, wobei man ACE-inhibierenden Verbindungen als Pulver erhielt. Die Verbindungen waren problemlos in Wasser löslich (die Lösung war orange) und die Ausbeute aus 100 ml Polyphenolfraktion (Fraktion B) betrug etwa 0,7 g.
Man löste das voranstehende Pulver in Wasser und nahm das Absorptionsspektrum der Lösung mit einem Spektrometer auf. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 gezeigt.
Das erhaltene Spektrum zeigte ein Maximum bei 280 m und ähnelte dem von (+)-Catechin oder (-)-Epicatechin. Man behandelte die voranstehende Lösung 10 Minuten bei 120ºC in einem Autoklaven. Während der Behandlung wurde die Lösung rot und man geht davon aus, dass Anthocyanidin gebildet wurde. Diese Ergebnisse lassen sehr stark vermuten, dass die voranstehenden ACE-inhibierenden Verbindungen Procyanidine (regelmäßige Polymere des Catechins) sind, die als kon densierte Tannine bezeichnet werden. Im Hinblick auf das Eluationsverhalten an der Sephadex LH-20 Säule und dem Eluationsverhalten bei der HPLC nimmt man an, dass diese Verbindungen keine Polymere von Dimeren oder dergleichen (z. B. Procyanidin B&sub2;) sondern höhere Polymere sind.
Also unterwarf man die ACE-inhibierenden Verbindungen einer Molekulargewichtsbestimmung mit GPC. Es ist gängige Meinung, dass die Molekulargewichtsbestimmung von Polyphenolen mit GFC (Gelfiltrationschromatographie) in einem wässrigen System (GFC in einem wässrigen System wird im Allgemeinen für Proteine usw. verwendet) schwierig ist, da die Polyphenolverbindungen eine starke Affinität zu einem Füllmaterial in der Säule in Form hydrophober Bindung oder Wasserstoffbrückenbindung haben. Daher acetylierte man die phenolische Hydroxygruppe in jeder ACE-inhibierenden Verbindung mit Pyridin/Acetanhydrid, so dass sich das erhaltene Material in organischen Lösungsmitteln löste und unterwarf die erhaltenen Materialien in einem organischen Lösungsmittel (THF) einer GPC-Analyse. Die Ergebnisse sind in Fig. 11 gezeigt.
In Fig. 11 erscheint im Chromatogramm ein einziger breiter Peak. Unter Verwendung der Molekulargewichtseichkurve, die man gleichzeitig unter Verwendung von Polystyrol erstellte, wurde das durchschnittliche Molekulargewicht der ACE- inhibierenden Verbindungen auf etwa 2000 berechnet.
Die Strukturformel der ACE-inhibierenden Verbindungen wurde versuchsweise aufgestellt, wobei man auch die Ergebnisse aus anderen Tests, die hierin nicht erörtert sind (z. B. partielle Zersetzung unter Verwendung von Toluol-α-thiol, FAB-MS Messung) berücksichtigte und Fig. 12 zeigt die Formel.
Aus dem voranstehenden urteilt man, dass die ACE-inhibierenden Verbindungen zu den kondensierten Tanninen gehören.
Man maß bei der Phenolfraktion und dem 70%ige Acetoneluat, d. h. die Fraktion mit kondensierten Tanninen, die man durch Fraktionierung der Polyphenolfraktion an Sepahdex LH-20 erhalten hatte, die Gesamtphenolmenge und verglich die zwei Mengen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Menge aller Phenole (ppm, berechnet als Catechin)
Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, dass die kondensierten Tannine etwa die Hälfte der in unreifen Äpfeln vorhandenen Gesamtphenole ausmachen und dass sie die Komponenten mit dem höchsten Anteil in den Polyphenolen sind.
Man berechnete den IC&sub5;&sub0;-Wert der kondensieren Tannine gegenüber ACE und er war sehr niedrig (etwa 1/10 oder weniger als der von EGCg auf Gewichtsbasis). Somit hatten die erfindungsgemäßen ACE-inhibierenden Verbindungen eine sehr hohe ACE-inhibierende Aktivität.
Daraus folgerte man, dass das Polyphenolgemisch aus unreifen Äpfeln als wirksames ACE-inhibierendes Mittel verwendet werden kann.

Beispiel 5

Herstellung eines Polyphenolgemisches aus unreifen Äpfeln

Mit einer Zerkleinerungsmaschine zerkleinerte man etwa 50 kg unreife Äpfel (5 bis 10 g/Apfel) und gab gleichzeitig eine geeignete Menge SO&sub2; zu und presste anschließend mit einer Ölpresse. Zu dem erhaltenen Saft gab man etwa 50 ppm Pectolyse-Enzym und unterwarf das Gemisch einer Zentrifugation oder Filtration an Diatomeenerde und außerdem einer Präzisionsmikrofiltration, wobei man 35 l eines klaren Saftes erhielt. Man gab den Saft auf eine mit einem industriell verwendeten synthetischen Adsorbtionsharz (6 l) vom Styrol-Divinylbenzol-Typ gefüllte Säule. Anschließend gab man zur Entfernung der Saccharide 6 l 0,1%ige Salzsäure enthaltenes Wasser auf die Säule. Anschließend gab man 50%iges Ethanol, das 0,1% HCl enthielt, auf, wobei man 3 l einer Fraktion mit den Hauptpolyphenolen erhielt.
Man engte die Fraktion unter vermindertem Druck mit einem Verdampfer ein, wobei man 1,5 l einer konzentrierten Fraktion erhielt. Die konzentrierte Fraktion wurde mit einem Sprühtrockner getrocknet, wobei man 228,2 g eines pulverförmigen Polyphenolproduktes unreifer Äpfel erhielt.
Die Rückgewinnungsdaten waren wie folgt:
Rückgewinnung an Säule: 95,6%
Rückgewinnung beim Sprühtrocknen: 93,0%
Rückgewinnung von Saft: 0,65%
Pulverrückgewinnung von Polyphenolen im Saft: 88,9%

Beispiel 6 (nicht erfindungsgemäß)

Antimutagene Aktivitäten von Polyphenolen aus unreifen Rosaceae-Früchten

In diesem Beispiel maß man die antimutagene Aktivität, wobei man das Ames- Verfahren modifizierte (Mutation Reasearch, Bd. 31, S. 347, 1975).
- Ausgangsmaterialien und Herstellung der Proben
Die gleichen wie in den Beispielen 2, 3 und 4. Die im Beispiel 4 erhaltenen kondensierten Tannine werden im Folgenden als "Apfeltannin" bezeichnet.
- Prüfverfahren auf antimutagene Aktivität
Man mischte die Lösung einer mutagenen Verbindung [Benz(a)pyren oder Trp-P-2] mit einer Phosphatpufferlösung, einer Probenlösung, S9-Mischung und Salmonellen (dadurch erhaltene Lösung, dass man Salmonella typhimurium TA 98 oder TA 100 über Nacht kultivierte]. Man kultivierte das Gemisch 2 Tage bei 37ºC. Man zählte die Anzahl der erhaltenen Kolonien. Die Menge an verwendeten Polyphenolen lag zwischen 1 und 300 ug/Platte und ist auf der Basis eines geometrisch progressiven Maßstabes gezeigt. Man berechnete die antimutagene Aktivität gemäß der folgenden Formel:
antimutagene Aktivität (%) = {(C - B) - (S - B)} ÷ (C - B) · 100
worin S: für die Anzahl der Kolonien der Testlösung steht,
C: für Anzahl der Kolonien der Kontrolllösung steht, wobei man Wasser anstelle der Probe verwendet,
B: für die Anzahl der Kolonien des Blindwertes steht, wobei man Wasser anstelle der Probe und der mutagenen Verbindung verwendet.
- Ergebnisse
Fig. 13 beziehungsweise Fig. 14 zeigen die antimutagenen Aktivitäten (%) verschiedener Polyphenole und von Apfeltannin gegenüber Trp-P-2 und Benz[a]pyren. In Fig. 13 und Fig. 14 gibt die Ordinate jeweils die antimutagene Aktivität (%) wieder und man setzte die gezeigte Antimutagenität des Blindwertes auf 100%. Die Abszisse gibt die Menge an Probe pro Platte an.
Demzufolge inhibierte Apfeltannin die Mutagenizität jedes Mutagens in Abhängigkeit von der Konzentration des Apfeltannins und seine inhibierende Wirkung entsprach oder war sogar höher als die von Epigallocatechingallat. In der Untersuchung des vorliegenden Beispiels zeigte Apfeltannin eine 50%ige antimutagene Akti vität gegenüber 1 ug Trp-P-2 bei einer Menge von etwa 17 ug (etwa 51 ug im Falle von Epigallocatechingallat) und gegenüber 5 ug Benz[a]pyren bei einer Menge von etwa 37 ug (etwa 56 ug im Falle von Epigallocatechingallat). Folglich enthielt Apfeltannin eine große Menge an Verbindungen, die stark die Mutagenität des Mutagens (Karzinogens) inhibierten. Somit sind die erfindungsgemäßen Polyphenolgemische aus Rosaceae-Füchten ebenfalls sehr wirksame antimutagene Mittel.

Beispiel 7 (nicht erfindungsgemäß)

Hyaluronidase inhibierende Aktivitäten von Polyphenolen in unreifen Rosaceae- Früchten

In diesem Beispiel maß man die Hyaluronidase inhibierende Aktivität, um sie als Indikator für eine antiallergische Aktivität zu verwenden.
- Ausgangsmaterialien und Herstellung der Proben
Es wurden die gleichen wie in Beispiel 6 verwendet.
- Testverfahren auf Hyaluronidase inhibierende Aktivität
Für die Messung der Hyaluronidase-inhibierenden Aktivität modifizierte man das in J. Biol., Bd. 250, S. 79, 1975, beschriebene Verfahren. Das heißt, man gab eine Probelösung zu einer kommerziellen Hyaluronidase-Lösung und führte eine Vorinkubation durch. Hierzu gab man eine Lösung der Verbindung 48/80 (Histamin- Releaser) und aktivierte die Hyaluronidase bei 37ºC. Danach gab man eine Hyaluronsäure-Lösung als Substrat zu und ließ die Reaktion fortschreiten.
Das in der voranstehenden Reaktion hergestellte N-Acetylglucosamin wurde dem Elson-Morgan-Verfahren unterworfen, wobei sich eine Farbe entwickelte. Die Farbe wurde als Extinktion bei 586 nm gemessen. Die Hyaluronidase inhibierende Aktivität (%) berechnete sich wie folgt:
Hyaluronidase inhibierende Aktivität (%)
= {(C - CB) - (S - SB)} ÷ (C - CB) · 100
worin S: für die Absorption der Testlösung steht,
C: für die Absorption der Kontroll-Lösung steht, wobei man eine Pufferlösung anstelle der Probe verwendete,
SB: für die Absorption des Blindwertes für S steht (der Blindwert enthielt kein Enzym) und
CB: für die Absorption des Blindwertes für C steht (der Blindwert enthielt weder Probe noch Enzym).
- Ergebnisse
Die Hyaluronidase-inhibierenden Aktivitäten verschiedener Rosaceae-Früchte sind in Fig. 15 dargestellt und die Hyaluronidase-inhibierenden Aktivitäten von Natriumcromoglicat und Apfeltannin sind in Fig. 16 dargestellt.
Demgemäß zeigte jeder Fruchtextrakt und Apfeltannin in Abhängigkeit von ihrer Konzentration Hyaluronidase inhibierende Aktivitäten. In Fig. 16 ist zu Vergleichszwecken die Hyaluronidase inhibierende Aktivität von Natriumcromoglicat gezeigt. Der IC&sub5;&sub0;-Wert (Konzentration bei 50%iger Inhibierung) von Natriumcromoglicat betrug etwa 0,051 mg/ml, während der IC&sub5;&sub0;-Wert von Apfeltannin etwa 0,086 mg/ml betrug und nahe dem von Natriumcromoglicat lag.
Dieses Polyphenol (Apfeltannin) enthielt somit einen hohen Anteil an Verbindungen, die die Aktivität von Hyaluronidase (ein Enzym, das mit dem Allergie-Typ I assoziert ist) inhibieren. Daher ist das erfindungsgemäß erhaltene Polyphenolgemisch aus Rosaceae-Früchten ebenfalls ein sehr wirksames antiallergisches Mittel.

Beispiel 8 (nicht erfindungsgemäß)

Glycosyltransferase-inhibierende Aktivitäten von Polyphenolen unreifer Rosaceae- Früchte

In diesem Beispiel untersuchte man die inhibierenden Aktivitäten von Fruchtphenolen auf GTase [dieses Enzym bildet aus Saccharose unlösliches Glucan und wird durch S. sobrinus (typische karieserzeugende Bakterien) produziert]
- Ausgangsmaterialien und Herstellung der Proben
Man verwendete die gleichen wie in den Beispielen 6 und 7.
- Eingesetzte Bakterien: Streptococcus sobrinus ATCC 33478
- Herstellung von GTase
Man stellte folgendermaßen GTase von S. sobrinus her.
S. sobrinus wurde in einem TTY Medium [Agric. Biol. Chem., 54 (11), SS. 2925-2929, 1990] 18 Stunden bei 37ºC kultiviert. Zur Entfernung von Bakterienzellen zentrifugierte man und erhielt eine überstehende Flüssigkeit. Zu der überstehenden Flüssigkeit gab man Ammoniumsulfat bis zu 50%iger Sättigung. Anschließend zentrifugierte man, wobei man den entstandenen Niederschlag gewann. Man löste den Niederschlag in 0,05 M Phosphatpuffer-Lösung (pH 6,5) wieder auf. Man trennte mit derselben Pufferlösung die erhaltene Lösung durch Dialyse. Man reinigte GTase in dem Dialysat und trennte durch Chromatographie an Hydroxyapatit ab. Man eluierte GTase (vermag unlösliches Glucan zu bilden) mit einer etwa 0,4 M Phosphatpuffer-Lösung. Man verwendete das Gtase-haltige Eluat für den folgenden Test.
- Testverfahren auf GTase inhibierende Aktivität
Eine gereinigte GTAse-Lösung und eine Probenlösung wurden zu 1 ml Substratlösung [eine 0,1 M Phosphatpuffer-Lösung (pH 6,5) mit 2% Saccharose, 0,1% Natriumazid und 40 uM Dextran T10] gegeben. Zur Verdünnung gab man Wasser zu, wobei man ein Gesamtvolumen von 2 ml erhielt. Man unterwarf die erhaltene Lösung 18 Stunden bei 37ºC einer Reaktion. Man bestimmte den Anteil des in der Reaktion gebildeten unlöslichen Glucans als Trübung, gemessen als Extinktion bei 550 nm, und berechnete den Anteil (%) an gebildetem unlöslichen Glucan gemäß der folgenden Formel:
Anteil an gebildetem unlöslichen Glucan (%).
= (SS - SB) ÷ (CS - CB) · 100
worin S: für die Extinktion der Probe steht,
SB: für die Extinktion des Blindwertes für die Probe (der Blindwert enthielt kein Enzym) steht,
CS: für die Extinktion der Kontrolle (enthielt keine Probe) steht
und CB: für die Extinktion des Blindwertes für die Kontrolle (der Blindwert enthielt weder Probe noch Enzym).
- Ergebnisse
Die GTase inhibierenden Aktivitäten von Polyphenolfraktionen aus verschiedener Rosaceae-Fruchtextrakten sind in Fig. 17 gezeigt, und die GTase-inhibierenden Aktivitäten einzelner Polyphenolverbindungen sind in Fig. 18 gezeigt. In Fig. 17 und in Fig. 18 gibt die Ordinate jeweils den Anteil (%) an gebildetem unlöslichem Glucan wieder, wobei man den gebildeten Anteil (%) in der Kontrolle (enthielt keine Probe) auf 100% setzte. Die Abszisse gibt die zum Reaktionssystem zugegebene Menge (Volumen oder Konzentration) der Probe oder des Polyphenols wieder.
Aus Fig. 17 erkennt man, dass die Polyphenolfraktionen aus verschiedenen Rosaceae-Fruchtextrakten, insbesondere die Polyphenolfraktionen unreifer Äpfel der Sorte "Fuji" und unreifer Birnen der Sorte "Niitaka" bemerkenswerte GTase- inhibierende Aktivitäten hatten. Der IC&sub5;&sub0;-Wert reifer Äpfel der Sorte "Fuji" gegenüber GTase betrug etwa 50 ul, während der IC&sub5;&sub0;-Wert unreifer Äpfel der Sorte "Fuji" gegenüber GTase etwa 0,7 ul war. Somit hatte der unreife Apfel eine GTase- inhibierende Aktivität, die etwa 70 mal höher war als die des reifen Apfels.
Danach untersuchte man die GTase inhibierenden Aktivitäten verschiedener Polyphenolverbindungen, einschließlich der in Äpfeln vorhandenen. Wie man in Fig. 18 erkennt, hatten von den im Apfel enthaltenen Polyphenolverbindungen Chlorogensäure und Phloridzin jeweils eine sehr geringe GTase inhibierende Aktivität. Von den Catechinen hatte währenddessen das Epicatechin-Monomer eine sehr geringe GTase inhibierende Aktivität, aber die hochmolekularen Epicatechin-Polymeren (angegeben als Apfeltannin in Fig. 18) der angenommenen Strukturformel der Fig. 12 hatten eine sehr hoche GTase-inhibierende Aktivität. In Fig. 18 ist auch das Ergebnis mit Epicatechingallats (ein typisches Catechin, das in grünem Tee vorkommt und das eine GTase inhibierende Substanz ist) [Agric. Biol Chem., 5(11), SS. 2925-2929, 1990; Chem. Pharm. Bull., 38 (39) SS. 717-729, 1990] gezeigt. Mittels Fig. 18 berechnete man den IC&sub5;&sub0;-Wert von Epicatechingallat gegenüber GTase auf etwa 200 ppm, während der von Apfeltannin etwa 2 ppm war. Somit hatte Apfeltannin eine GTase inhibierende Aktivität, die etwa 100 mal höher war als die des Epicatechingallats. Demzufolge lässt sich die hohe GTase inhibierende Aktivität unreifer Äpfel der Sorte "Fuji" in Fig. 17 auf das Vorhandensein von Apfeltannin zurückführen.
Somit enthält das erfindungsgemäß erhaltene Polyphenolgemisch unreifer Rosaceae-Früchte Verbindungen mit hoher GTase-inhibierender Aktivität und ist daher ein sehr wirksames karieshemmendes Mittel.

Claims

1. Gemisch, im Wesentlichen bestehend aus Polyphenolen, erhältlich durch Auspressen oder Extraktion unreifer Äpfel unter Bitdung eines Saftes oder Extraktes, Behandlung des Saftes oder Extraktes mit einem Adsorptionsmittel, welches selektiv die im Saft oder Extrakt enthaltenen Polyphenole adsorbiert, Eluieren der Polyphenole aus dem Adsorptionsmittel mittels eines Alkohols und Rückgewinnung des Polyphenolgemisches aus dem Eluat; wobei das Polyphenolgemisch im Wesentlichen aus Kaffeesäure, Kaffeesäureestern, p-Cumarsäure, p-Cumarsäureestern, Phloretin, Phloretinglykosiden, Phloridzin, Quercetin, Quercetinglykosiden, Catechin, Epicatechin und kondensierten Tanninen besteht, wobei es sich bei den kondensierten Tanninen um regelmäßige Polymere aus n Catechinmonomeren handelt, wobei n einen Wert von 7 bis 10 aufweist.

2. Polyphenolgemisch nach Anspruch 1, wobei das Polyphenolgemisch aus dem Eluat entweder durch Sprühtrocknen oder Gefriertrocknen rückgewonnen wird, so dass man ein pulverförmiges Produkt erhält.

3. Verfahren zur Herstellung eines Polyphenolgemisches aus unreifen Rosaceae- Früchten, wobei man

- einen Saft aus unreifen Rosaceae-Früchten durch Auspressen oder Zerquetschen der Früchte herstellt;

- den Saft mit einem Adsorptionsmittel in Kontakt bringt, das befähigt ist selektiv die Polyphenole zu adsorbieren und die adsorbierten Polyphenole unter Verwendung eines Eluats freizusetzen; wobei das Adsorptionsmittel ausgewählt ist unter einem synthetischen Harz vom Styrol-Divinylbenzol-Typ, einem anionischen Harz und Kieselsäure mit chemisch gebundenen Octadecylgruppen, und

- die Polyphenole aus dem Adsorptionsmittel mit einem Alkohol eluiert.

4. Verfahren nach Anspruch 3 zur Herstellung eines Polyphenolgemisches aus unreifen Rosaceae-Früchten, welches als weiteren Schritt umfasst, dass man den Alkohol aus dem die Frucht-Polyphenole enthaltenden Alkoholeluat verdampft.

5. Verfahren nach Anspruch 3 zur Herstellung eines Polyphenolgemisches aus unreifen osaceae-Früchten, welches als weiteren Schritt umfasst, dass man das die Frucht- Polyphenole enthaltende Alkoholeluat sprühtrocknet oder gefriertrocknet.

6. Verfahren zur Herstellung eines Polyphenolgemisches aus unreifen Rosaceae- Früchten, wobei man

- zerquetschte unreife Rosaceae-Früchte mit einem Alkohol extrahiert,

- den Extrakt durch Verdampfen des Alkohols aus dem Extrakt konzentriert,

- die Feststoffe aus dem konzentrierten Extrakt abtrennt, um einen klaren Extrakt zu erhalten,

- den klaren Extrakt mit einem Adsorptionsmittel in Kontakt bringt, das befähigt ist selektiv die Polyphenole zu adsorbieren und die adsorbierten Polyphenole unter Verwendung eines Eluats freizusetzen; wobei das Adsorptionsmittel ausgewählt ist unter einem synthetischen Harz vom Styrol-Divinylbenzol-Typ, einem anionischen Harz und Kieselsäure mit chemisch gebundenen Octadecylgruppen, und

- die Polyphenole aus dem Adsorptionsmittel mit einem Alkohol eluiert.

7. Verfahren nach Anspruch 6 zur Herstellung eines Polyphenolgemischs aus unreifen Rosaceae-Früchten, welches als weiteren Schritt umfasst, dass man den Alkohol aus dem die Frucht-Polyphenole enthaltenden Alkoholeluat verdampft.

8. Verfahren nach Anspruch 6 zur Herstellung eines Polyphenolgemisches aus unreifen osaceae-Früchten, welches als weiteren Schritt umfasst, dass man das die Frucht- Polyphenole enthaltende Alkoholeluat sprühtrocknet oder gefriertrocknet.

9. Verfahren nach Anspruch 6 zur Herstellung eines Polyphenolgemisches aus unreifen Rosaceae-Früchten, wobei man die Feststoffe aus dem konzentrierten Extrakt durch Zentrifugieren oder Filtrieren abtrennt.

10. Verfahren nach Anspruch 6 zur Herstellung eines Polyphenolgemisches aus unreifen Rosaceae-Früchten, wobei man die Feststoffe durch Auflösen in Hexan oder Chloroform und durch Filtrieren abtrennt.