DE60206095T2

DE60206095T2 - Phlorizinreiche Phenolfraktion und ihre Verwendung in der Kosmetik oder als Nahrungsmittel

Info

Publication number: DE60206095T2
Application number: DE60206095T
Authority: DE
Inventors: David Gaudout; Denis Megard; Claude Inisan; Christian Esteve; Frederic Lejard
Original assignee: Diana Ingredients SAS
Current assignee: Diana Ingredients SAS
Priority date: 2001-03-23
Filing date: 2002-03-19
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2022-03-20
Also published as: US20030003120A1; JP2002322067A; ATE304538T1; US20060073223A1; ES2247279T3; EP1243586A1; FR2822466A1; EP1243586B1; DE60206095D1; US7427418B2; FR2822466B1; JP5192110B2; US7041322B2; DK1243586T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Phenolfraktion aus Früchten sowie das Verfahren zum Erhalten dieser Fraktion. Dieses an einer Antioxidans-Verbindung, dem Phlorizin, reiche Extrakt ist als kosmetisches Präparat oder als Präparat für Nahrungsmittel oder gesundheitsfördernde Nahrungsmittel verwendbar.
Es ist bekannt, dass Polyphenolverbindungen im Pflanzenreich in beträchtlichen Mengen ziemlich verbreitet sind. Insbesondere in der Familie der Rosaceae hat die Analyse von Polyphenolen im Apfel eine Identifizierung von mindestens 37 Phenolverbindungen ergeben, von denen die am stärksten vertretenen Chlorogensäure, die Procyanidine B1 und B2, Epicatechin, Phloretin, Phlorizin und p-Coumarinsäure sind. Einige dieser Verbindungen besitzen physiologische Eigenschaften, wie antioxidierende, antimutagene, antiallergische, antikanzeröse, antidiabetische und andere Eigenschaften.
Es gibt auf dem Markt zahlreiche andere polyphenolreiche Produkte, wobei die üblichsten aus Grüntee, Traubenkernen und Kieferrinde extrahiert werden (US A 4 698 360, EP A 348 781, EP A 283 349, FR A 1 427 100, FR A 2 092 743, FR A 2 643 073 und FR A 2 372 823). Die Extraktion einer Polyphenolfraktion aus unreifen Früchten (die 3 bis 10 Gramm wiegen) aus der Familie der Rosaceae wurde bereits in dem Patent EP A 0 657 169 beschrieben. Die so definierte Polyphenolfraktion ist durch einen hohen Gehalt an Derivaten der Familie der Hydroxyzimtsäuren (Chlorogensäure, Koffeinsäure, p-Coumarinsäure) und an Molekülen der Familie der Flavanole (Catechin, Epicatechin und Procyanidin) gekennzeichnet. Die Analyse eines Extraktes aus dem Saft von unreifen Früchten durch Hochdruckflüssigkeitchromatographie zeigt, dass das Phlorizin weniger als 7 Gew.-% der gesamten Phenolverbindungen und die Dihydrochalcone (Phlorizin und Phloretin) weniger als 9 Gew.-% betragen.
Von den Phenolverbindungen sind Phloretin und sein glycosiliertes Derivat, Phlorizin, typisch für den Apfel und die anderen Früchte der Familie der Rosaceae. Man findet insbesondere Phlorizin in beträchtlicher Menge in den Kernen, aber es ist auch im Saft und in der Schale des Apfels vorhanden. Phlorizin besitzt eine antioxidierende Aktivität, die einen kardiovaskulären Schutz ähnlich dem von Östrogenen bietet. Andererseits kann Phlorizin durch Aktivierung einer Kaskade von Enzymen, darunter die Tyrosinase, auf die Melanogenese wirken, wodurch der Schutz gegen ultraviolette Strahlen gesteigert werden kann. Phlorizin bietet auch eine antidiabetische Wirkung durch kompetitive Hemmung des natriumabhängigen Bluttransports von Metaboliten, wie Glucose, Galactose und anderen. Phlorizin wirkt sich auch durch Blockieren der Aktivität der Proteinkinase C auf die Hemmung des Tumorzellenwachstums aus.
Währenddessen sind in dem Apfel (zerkleinerte Masse oder Saft), Dihydrochalcone (Phloretin und Phlorizin) in geringerer Menge im Vergleich zu den anderen Polyphenolen vorhanden. Chlorogensäure und Procyanidine sind die überwiegenden Polyphenole in Äpfeln, ob es "Mostäpfel" oder "Schnittäpfel" sind, wobei Phlorizin und Phloretin nie mehr als 5 Gew.-% der Gesamtpolyphenole von reifen Mostäpfeln bilden (Analyse von 15 verschiedenen Sorten) (1 und 2).
In den bekannten Polyphenolextrakten bleiben die Proportionen zwischen den verschiedenen Phenolmolekülen in Bezug auf die Proportionen, die in den verschiedenen Ausgangsmaterialien vorliegen, erhalten, mit Ausnahme von polymeren Procyanidinen, die bei der Extraktion verloren gehen oder abgebaut werden:
Normalerweise erhält man also Polyphenolextrakte, die reich an Hydroxy-Zimtsäuren (Koffein-, Chlorogen- und Coumarinsäure) und an Flavanolen (Catechin, Epicatechin und Procyanidine) sind, und die arm an Dihydrochalconen (Phlorizin und Phloretin) sind (siehe 3).

ε = nicht bestimmbare Menge
* Gesammelte Werte von Messungen an 15 Mostapfelsorten und 3 Schnittapfelsorten auf 3 Feldern.

Karadeniz F & Ekski A. "Phenolic compounds in apple juice from different varieties." Report – Scientific Technical Com. Int. Fed. Fruit Juice Producers, (1996), 24, S. 265–275.
Sanoner P., Guyot S., Marnet N. und Drilleau J.F. "Polyphenolic profiles of French cider apples varieties." In 'Polyphenols, wines and health', Symposium, Bordeaux, (14.–16. April 1999).
Sanoner P., Guyot S., Marnet N., Molle D. und Drilleau J.F. "Polyphenol profiles of French cider apples varieties." J. Agric. Food Chem. (1999), 47, S. 4847–4853.

Erst seit kurzem gibt es, wenn überhaupt, in Äpfeln natürlich vorkommende Koffeinsäure. Die Koffeinsäure ist in der Tat wahrscheinlich ein Zersetzungsprodukt von Chlorogensäure (Fiedler, 1954, Arzneimittel-Forsch, 4, 41).
Die Antragstellerin hat neue Phenolfraktionen entwickelt, die die Aufgabe der Erfindung bilden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist das Verfahren zum Erhalten dieser Fraktion.
Eine weitere Aufgabe besteht in den Anwendungen dieser Fraktion als Nahrungsergänzungsmittel, gesundheitsförderndes Nahrungsergänzungsmittel oder Schutzagens gegen ultraviolette Strahlen, oder als kosmetische Zusammensetzung.
Andere Aufgaben werden beim Lesen der folgenden Beschreibung und Beispiele deutlich.
Die Polyphenolfraktion gemäß der Erfindung umfasst mindestens 20 Gew.-% Polyphenole und vorzugsweise 50%, davon bestehen zumindest 10% aus Phlorizin, und vorzugsweise zwischen 10 und 70%. Dieses Extrakt kann auch in seiner Zusammensetzung Chlorogensäure, Epicatechin, Procyanidin B2, Quercitrin, p-Coumarinsäure sowie Phloretin umfassen.
Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung dieser Polyphenolfraktion ist eine solche, die in Gewichtsprozent enthält:

– mehr als 20% an Gesamtpolyphenolen, vorzugsweise mehr als 50%
– mindestens 30% an Phlorizin-Polyphenolen und vorzugsweise 30 bis 40 Gew.-%
– höchstens 11% an Chlorogensäure-Polyphenolen und vorzugsweise zwischen 2 und 11 Gew.-%
– höchstens 4% an Epicatechin-Polyphenolen
– höchstens 2% an Procyanidin-B2-Polyphenolen
– höchstens 1,5% an Quercitrin-Polyphenolen
– höchstens 0,4% an p-Coumarinsäure-Polyphenolen
– und weniger als 0,2% an Koffeinsäure-Polyphenolen

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, dass die Koffeinsäure in Gewichtsproportionen von weniger als 20% des Gewichts des vorliegenden Phlorizins vorhanden ist. Vorzugsweise stellt Koffeinsäure weniger als 1 Gew.-% der Gesamtpolyphenole der Extrakte dar. Der Anteil von Phlorizin liegt, bezogen auf das Gewicht, 9-fach über dem von Catechin. Die Menge an vorliegendem Phlorizin ist, bezogen auf das Gewicht, mindestens gleich derjenigen der Chlorogensäure.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist durch die Tatsache gekennzeichnet, dass sie Phloretin enthält. Durch eine schonende Säurehydrolyse kann man quasi die gesamte Menge an Phlorizin in Phloretin umwandeln, das in Wasser schlechter löslich ist.
Eine weitere Aufgabe ist durch die Tatsache gekennzeichnet, dass die Dihydrochalcone in Proportionen vorhanden sind, welche größer oder gleich 40 Gew.-% sind, verglichen mit den Hydroxyzimtsäuren.
Das Extraktionsverfahren, das die selektive Extraktion einer Polyphenolfraktion, die reich an Dihydrochalconen ist, aus reifen Äpfeln ermöglicht, ist durch die Tatsache gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:

– Die zerkleinerten Äpfel werden einer oder mehreren Fest/Flüssig-Extraktionen gegebenenfalls in Gegenwart von zugegebenem Wasser unterworfen.
– Das erhaltene feste feuchte Extrakt wird anschließend entweder getrocknet oder enzymatisch verflüssigt, um ein flüssiges Extrakt zu erhalten.
– Das feste trockene Extrakt durchläuft während einer Zeit zwischen 10 Minuten und 2 Stunden weitere Extraktionen durch ein organisches polares Lösungsmittel, vorzugsweise einen aliphatischen C1-C4-Alkohol, der rein oder mit Wasser gemischt ist, um ein organisches Extrakt zu erhalten.
– Dieses wird bei einer Temperatur unter oder gleich 60°C, vorzugsweise unter vermindertem Druck, trocken verdampft.
– Dieser Rückstand wird anschließend in Wasser aufgenommen, bevor er mehrmals, vorzugsweise viermal, durch ein Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar ist, vorzugsweise Ethylacetat oder Methyl- oder Propylacetat, abgereichert wird.
– Die erhaltenen organischen Lösungen werden gemischt und trocken bei einer Temperatur unter 60°C, vorzugsweise unter 50°C, verdampft, um die Polyphenolfraktion, die die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darstellt, zu erhalten.
– Auf einem anderen Weg wird das feuchte feste Extrakt in Gegenwart eines enzymatischen Gemisches während einer Zeit zwischen 1 und 4 Stunden bei einer Temperatur zwischen 30 und 50°C, vorzugsweise zwischen 40 und 45°C, mit Wasser gemischt, um ein flüssiges Extrakt zu erhalten.
– Dieses flüssige Extrakt wird durch Zentrifugieren oder durch Filtration, dann durch Ultrafiltration, gereinigt.
– Das Extrakt wird in eine Chromatographiesäule gegeben, die mit einem adsorbierenden Harz vom Styrol-Divinylbenzoltyp gefüllt ist. Das Harz wird mit angesäuertem Wasser gewaschen, um die Verunreinigungen und Restzucker zu entfernen. Die Polyphenole werden anschließend in einem Wasseralkoholgemisch eluiert, das zwischen 40 und 70% Ethanol, vorzugsweise zwischen 50 und 60 Gew.-%, enthält. Es können andere aliphatische C1-C4-Alkohole, wie Methanol oder Butanol, verwendet werden.
– Gegebenenfalls wird im Verlauf des Verfahrens ein Entwachsungsschritt eingeführt.
– Das durch Extraktion erhaltene Produkt wird ein letztes Mal in Wasser aufgenommen, bevor es vorzugsweise durch Atomisierung oder Lyophilisierung getrocknet wird, um ein beiges Puder zu erhalten, das mindestens 20 Gew.-% Polyphenole, vorzugsweise mehr als 50% Polyphenole enthält, wobei 10 Gew.-% und vorzugsweise zwischen 10 und 70% der Polyphenole Dihydrochalcone, vorzugsweise Phlorizin, sind.

Die Fraktionen werden durch das vorstehend beschriebene Verfahren vorzugsweise aus reifen Äpfeln der Familie der Rosaceae und insbesondere der Sorte Malus sylvestris Mill. erhalten.
Dieses essbare Apfelextrakt, das die genannten Merkmale besitzt und gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wurde, ist als Nahrungsergänzungsmittel oder gesundheitsförderndes Nahrungsergänzungsmittel verwendbar.
Die Phenolfraktion gemäß der Erfindung, die reich an Dihydrochalconen ist, bietet Eigenschaften als Schutzagens gegen ultraviolette Strahlen.
Die Phenolfraktion gemäß der Erfindung, die reich an Dihydrochalconen ist, bietet Eigenschaften als Antioxidans-Mittel.
Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung, eine kosmetische Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die unter anderem die vorstehend beschriebene Polyphenolfraktion, die reich an Dihydrochalconen ist, enthält.
Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können eingenommen oder auf die Haut aufgetragen werden. Je nach Verabreichungsart kann die Zusammensetzung gemäß der Erfindung in allen Formen dargeboten werden, die üblicherweise in der Kosmetik verwendet werden.
Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können insbesondere in Form von Kapseln, Milch, Lotionen, Cremes, Gelen oder Getränken dargeboten werden.
Die Nahrungsmittel-, gesundheitsfördernden Nahrungsmittel- oder kosmetischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden normalerweise gemäß den Anwendungen formuliert, für die sie bestimmt sind.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie in irgendeiner Weise zu begrenzen.
Beispiel 1: Protokoll Nr. 1 der Extraktion der Polyphenolfraktion vom Apfel
Äpfel der Sorte Malus sylvestris Mill. wurden der folgenden Extraktionsbehandlung unterworfen:

– die Äpfel werden zerkleinert und die Zerkleinerung wird in Gegenwart von etwa 20% Wasser gerührt.
– die Zerkleinerung wird aufeinanderfolgenden Fest/Flüssig-Extraktionen unterworfen, um die flüssigen zuckerreichen Fraktionen zu entfernen.
– das feste Extrakt, das noch vom zweiten Schritt feucht ist, wird getrocknet, dann während einer Dauer von 2 h in einem Methanol/Wasser-Gemisch im Verhältnis von 90/10, bezogen auf das Gewicht, behandelt.
– das organische Extrakt wird bei einer Temperatur von etwa 50°C unter vermindertem Druck trocken verdampft.
– der Verdampfungsrückstand wird in Wasser aufgenommen, dann wird die erhaltene wässrige Lösung viermal durch Ethylacetat, einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, abgereichert.
– die erhaltenen organischen Lösungen werden gemischt und bei einer Temperatur von etwa 45°C verdampft, um ein trockenes Extrakt zu erhalten.
– das trockene Extrakt wird ein letztes Mal in Wasser aufgenommen, um ein letztes Mal getrocknet zu werden, vorzugsweise durch Atomisierung oder Lyophilisierung, und ein feiner Puder von beiger Farbe, das teilweise in Wasser löslich ist, zu erhalten.

Die Polyphenolzusammensetzung dieses Extraktes, erhalten durch Messen der Konzentration jedes Moleküls im Vergleich zu seinem reinen Standard durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie, ist folgendermaßen (4).
In jedem Extrakt wurden so folgende Konzentrationen gemessen:
Man stellt fest, dass die Phenolfraktion, die durch dieses Extraktionsverfahren erhalten wurde, besonders reich an Phlorizin ist. Sie weist das Merkmal auf, dass sie arm an Säuren der Familie der Hydroxyzimtsäuren und insbesondere an Chlorogensäure ist. Sie ist auch arm an Säuren der Familie der Flavanole (Catechine, Epicatechine, Procyanidine B1, B2 ...), was zu einem ursprünglichen Phenolprofil führt, das sich völlig von denjenigen unterscheidet, die für den Apfel beschrieben werden, und das sich völlig von einem Phenolprofil unterscheidet, das durch ein klassisches Verfahren aus reifen Äpfeln erhalten wird.
Der erhaltene Puder hat einen Gehalt von 55% an Gesamtpolyphenolen, bezogen auf das Gewicht, gemessen durch das kolorimetrische Verfahren von Folin-Ciocalteu unter Verwendung von Chlorogensäure als Standard. Bei diesem Verfahren wird das Folin-Ciocalteu-Reagenz verwendet (Referenz 9001, Merck). Kurz gesagt besteht dieses Reagenz aus einem Gemisch aus Phosphorwolframsäure und Phosphormolybdänsäure, das bei der Oxidation von Phenolen zu einem Gemisch von blauen Oxiden von Wolfram und Molybdän reduziert wird. Die entstehende Farbe ist proportional zur Rate der vorliegenden Phenolverbindungen.
Wie es durch das Chromatographieverfahren und die Integration des durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie erhaltenen Profils festgestellt wurde, hat sie einen Gehalt zwischen 49 und 67% an Gesamtpolyphenolen, bezogen auf das Gewicht, je nachdem, ob der Wert als Phlorizinäquivalent oder Chlorogensäureäquivalent ausgedrückt wird.
Beispiel 2: Protokoll Nr. 2 der Extraktion der Polyphenolfraktion vom Apfel
Äpfel der Sorte Malus sylvestris Mill. wurden der folgenden Extraktionsbehandlung unterworfen:

– die Äpfel werden zerkleinert und die Zerkleinerung wird in Gegenwart von etwa 20% Wasser gerührt.
– die Zerkleinerung wird aufeinanderfolgenden Fest/Flüssig-Extraktionen unterworfen, um die flüssigen, mit Zucker angereicherten Fraktionen zu entfernen.
– das feuchte feste Extrakt wird in Gegenwart eines enzymatischen Gemisches, das reich an pektolytischen, hemicellulosen und cellulosen Aktivitäten ist, während etwa 2 Stunden bei einer Temperatur von etwa 45°C mit Wasser gemischt, um ein flüssiges Extrakt zu erhalten.
– das flüssige Extrakt wird durch Zentrifugieren oder Filtration, dann durch Ultrafiltration, gereinigt.
– das flüssige durchsichtige Extrakt wird dann in eine Chromatographiesäule gegeben, die mit einem adsorbierenden Harz vom Styrol-Divinylbenzoltyp gefüllt ist.
– das Harz wird mit angesäuertem Wasser gewaschen, um die Verunreinigungen und Restzucker zu entfernen.
– die Polyphenole werden anschließend in einem Wasseralkoholgemisch eluiert, das 60 Gew.-% Ethanol enthält.
– die erhaltene Polyphenollösung wird konzentriert und anschließend durch Atomisierung oder Lyophilisierung getrocknet, um einen feinen beigen Puder zu erhalten.

Die Polyphenolzusammensetzung dieses Extraktes, erhalten durch Messen durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie der Konzentration jedes Moleküls im Vergleich zu seinem reinen Standard, ist folgendermaßen (5):
Der erhaltene Puder hat einen Gehalt von 50% an Gesamtpolyphenolen, bezogen auf das Gewicht, gemessen durch das kolorimetrische Verfahren von Folin-Ciocalteu unter Verwendung von Chlorogensäure als Standard.
Man stellt fest, dass die Phenolfraktion, die durch dieses Extraktionsverfahren erhalten wurde, besonders reich an Phlorizin ist. Wie das Extrakt aus Beispiel 1 weist diese Fraktion das Merkmal auf, dass es arm an Säuren der Familie der Hydroxyzimtsäuren und insbesondere an Chlorogensäure ist. Es weist auch das Merkmal auf, dass es arm an Flavanolen (Catechine, Epicatechine, Procyanidine B1, B2..) ist, was zu einem ursprünglichen Phenolprofil führt, das sich völlig von denjenigen unterscheidet, die für den Apfel beschrieben werden, und das sich völlig von einem Phenolprofil unterscheidet, das durch ein klassisches Verfahren aus reifen Äpfeln erhalten wird.
Im Gegensatz zu Beispiel 1 ist eine kleine Menge Koffeinsäure vorhanden, die nur 4 Gew.-% der Menge des vorliegenden Phlorizins darstellt.
Durch Integration des durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie erhaltenen Profils hat es einen Gehalt zwischen 29 und 40% an Gesamtpolyphenolen, bezogen auf das Gewicht, je nachdem, ob der Wert in Phlorizinäquivalent oder in Chlorogensäureäquivalent ausgedrückt wird.
Beispiel 3: Protokoll Nr. 3 der Extraktion der Polyphenolfraktion vom Apfel
Das phlorizinreiche Polyphenolextrakt gemäß der Erfindung kann vor dem Schritt der letzten Trocknung modifiziert werden. Das Verfahren besteht aus einer schonenden Säurehydrolyse in Gegenwart von Mineralsäure (verdünnt auf einen pH-Wert von etwa 3) des Phlorizins (Phloretin-2'-β-glucosid) in Phloretin. Der nach Trocknung erhaltene Puder ist schlecht löslich in Wasser (sehr schlechte Löslichkeit des Phloretins), weist aber eine interessante antioxidierende Aktivität auf.
Beispiel 4: Antioxidierende (oder antiradikalische) Aktivität der phlorizinreichen Polyphenolfraktion gemäß der Erfindung:
Die Messung der antiradikalischen Aktivität der Polyphenolextrakte wird durch das etwas modifizierte DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)-Verfahren, das von Brand-Williams et al. (1995) und Lu et Foo (2000) beschrieben wird, vorgenommen. Brand-Williams W., Cuvelier M.E. & Berset C. (1995) "Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity." Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie, 28, S. 25–30. Lu Y. & Foo L.Y. ((2000) Antioxidant and radical scavenging activities of polyphenols from apple pomace. Food Chemistry, 68, S. 81–85.
Das Prinzip besteht darin, die Restmenge von DPPH°, einem gefärbten Radikal, das unter den Betriebsbedingungen stabil ist und dessen Konzentration bei einer Inkubation in Gegenwart von antioxidierenden Extrakten unter Standardbedingungen abnimmt, zu messen. Die Extrakte, die eine antioxidierende Aktivität aufweisen, reduzieren nämlich das DPPH°-Radikal zu DPPH₂. Die antioxidierende Aktivität wird im Vergleich zur Aktivität eines Referenzmoleküls, des Trolox (wasserlösliches Analog zu Vitamin E), ausgedrückt.
6 mg DPPH° werden gründlich in 100 ml einer wässrigen Lösung von Methanol mit 75 Vol.-% aufgelöst. Parallel werden eine genaue, zu analysierende Probemenge und 18 mg Trolox in 25 ml 75%iger Methanollösung gelöst. Es werden 2 ml DPPH°-Lösung mit 25 μl zu messender Lösung bei einer Temperatur von 37 ± 0,5°C in dichten Kolben während 6 Stunden inkubiert. Die Abnahme der Farbintensität der Lösung wird bei einer Wellenlänge von 515 nm bei t = 0 min, t = 5 min und t = 6 Stunden gemessen. Die Aktivität wird in nMol-Äquivalent Trolox/kg des Produktes nach einer Inkubation von 6 h ausgedrückt.
Das DPPH-Verfahren wurde eingesetzt, um die antioxidierende Aktivität dieser Produkte zu bestimmen:

– Blutplasma
– Rotwein
– Konzentriertes Rotweinextrakt mit 5% an Gesamtpolyphenolen
– Rotweinpuder mit 55% an Gesamtpolyphenolen
– Apfelsaft
– Holunderextrakt mit 40% an Gesamtpolyphenolen (DO 280 nm)
– Blaubeerextrakt mit 30% an Gesamtpolyphenolen (DO 280 nm)
– Polyphenolextrakt mit 50% an phlorizinreichen Gesamtpolyphenolen gemäß dem Verfahren der Erfindung
– Polyphenolextrakt mit 90% an phlorizinreichen Gesamtpolyphenolen gemäß dem Verfahren der Erfindung
– Polyphenolextrakt mit 90% an phloretinreichen Gesamtpolyphenolen gemäß dem Verfahren der Erfindung

Nach den vorstehenden Ergebnissen besitzen die Phenolextrakte, die aus dem Apfel Malus sylvestris Mill. gemäß dem Verfahren der Erfindung extrahiert wurden, eine antiradikalische oder antioxidierende Aktivität, die weit über derjenigen der Produkte liegt, die für ihre antioxidierende Aktivität, die als Referenz getestet wurde, bekannt sind.
Beispiel 5: Antiradikalische Wirkungen der Polyphenolfraktionen als Puder
Die Gentoxizität einer Substanz wird als die Fähigkeit dieser definiert, Schädigungen auf der Genom- oder Plasmid-DNA zu erzeugen. Die gentoxischen Mittel können exogener Natur (ultraviolette Strahlen, ionisierende Strahlung, chemische Substanzen ...) oder endogener Natur sein (freie Radikale, die durch Zellstoffwechsel erzeugt werden ...).
Die antiradikalischen Wirkungen der phlorizinreichen Polyphenolfraktionen, die gemäß dem Verfahren der Erfindung erhalten wurden, werden in vitro durch den "3D"-Test (Damaged DNA Detection, Analytical Biochemistry, (1995), S. 37–42) gemessen.
Das Prinzip basiert auf der Reparatur der DNA-Schädigungen, wobei die beschädigte DNA als Marker für die Schutzwirkung der zu testenden Moleküle gegen freie Radikale OH° verwendet werden: die Abnahme der beobachteten Schädigungen auf der DNA wird mit dem Abfangen von freien Radikalen in Beziehung gesetzt. Im Verlauf des Regenerationsschrittes wird ein Marker (Nukleotid, das mit Biotin markiert ist) in die DNA inkorporiert, und diese Inkorporation, die die Anzahl der reparierten Schädigungen quantitativ wiederspiegelt, wird anschließend durch Chemilumineszenz sichtbar gemacht.
Dieser Test, der an Plasmid-DNA durchgeführt wird, ermöglicht den frühzeitigen Nachweis von gentoxischen Mitteln vor dem Vorgang der Schädigung – Mutation – Krebsbildung. Die Moleküle oder Gemische, die antioxidierende oder antiradikalische Eigenschaften aufweisen und somit eine menschliche Zelle vor oxidativen Schäden auf Grund von reaktiven Sauerstoffspezies (EOR) schützen können, können so nachgewiesen werden.
Es ergibt sich folgendes Protokoll:

– Die Ziel-DNA wird in sensibilisierten Vertiefungen adsorbiert, dann mit gentoxischen Mitteln entweder in Gegenwart des zu testenden Polyphenolextraktes (gelöst in einer 2%igen Ethanollösung oder in DMSO) oder in Gegenwart von Catechin (Kontrolle) inkubiert. In diesem Test wird das OH°-Radikal, das durch homolytische Spaltung von sauerstoffhaltigem Wasser erzeugt wird, als gentoxisches Mittel, das die DNA schädigt, verwendet. Das sauerstoffhaltige Wasser wird in die Vertiefungen gegeben, die anschließend mit UVB-Strahlen (700 J/m²) bestrahlt werden. Außerdem wird eine positive Reparaturkontrolle, die aus einer Plasmid-DNA, die zuvor mit ultravioletten C-Strahlen beschädigt wurde, zugegeben.
– Ein Schritt des Waschens mit ultrareinem Wasser, anschließend mit einer 20%igen Dioxanlösung in ultrareinem Wasser während 5 min. bei 30°C unter sanftem Rühren ermöglicht es, die nicht spezifischen Interaktionen zwischen der Probe und dem Test, die auf die Anwesenheit von Makromolekülen, wie Proteinen, zurückzuführen sind, die das Reparatursignal stören können, zu entfernen.
– Ein Reparaturschritt wird in Gegenwart von gereinigten Zellextrakten (die die aktiven Enzyme der verschiedenen Wege der Reparatur von DNA-Schädigungen enthalten) und modifizierten Nukleotiden (dUTP), die an das Biotin gekoppelt sind, durchgeführt. Die Reparatur der Schädigungen umfasst, eine Exzisionsphase der Schädigungen und anschließend eine Resynthese des DNA-Fragments oder von entfernten Basen. Beim reparierenden Syntheseschritt werden so die modifizierten Nukleotide in die DNA inkorporiert.
– Ein Schritt zum Wiedererkennen der Bindungsstellen der Nukleotide an der DNA durch Bindung eines Avidinmoleküls, das an ein Peroxydasemolekül gekoppelt ist, auf dem von den Nukleotiden getragenen Biotin.
– Ein Schritt zum Anzeigen der Reaktion durch Zugabe eines chemilumineszenten Substrats der Peroxydase. Das beobachtete leuchtende Signal, das auf dem Luminometer ausgelesen wurde, ist proportional zur Menge der reparierten Schädigungen. Es wird bei den meisten Schädigungen eine Dosiswirkung im Bereich von 1 bis 15 Schädigungen pro 6 Kilobasen beobachtet.

Der in Gegenwart von EOR beobachtete Schutzprozentsatz wird als das relative Absinken der Schädigungswirkung auf Grund der OH°-Stoffe berechnet, also:
RLU oxidierend – RLU (oxidierend + Probe)/RLU oxidierend
wobei RLU = relative Lichteinheiten (beliebige Einheiten der Lichtmenge).
Der Prozentsatz des spezifischen Schutzes wird mit dem Prozentsatz der nicht spezifischen Hemmung, der an den mit UVC vorgeschädigten Proben gemessen wurde, verglichen. Er spiegelt die antiradikalische Aktivität nur auf Grund der zugegebenen Extrakte dar.
IC50 ist die Konzentration des getesteten Produktes in mg/ml, die 50% schützende Aktivität des gentoxischen OH°-Mittels ergibt. Je geringer sie ist, desto besser ist das getestete Produkt in Bezug auf die antioxidierende Aktivität.
Die drei Proben weisen eine Schutzwirkung gegen die Bildung von Schädigungen auf der DNA durch die OH°-Radikale auf. Sie weisen so eine ausgezeichnete antiradikalische Aktivität auf, die der von Epicatechin überlegen und der von Catechin sehr überlegen ist, welches die beiden Referenzmoleküle sind, die selber für ihre gute antiradikalische Fähigkeit bekannt sind. Es ist eine Wirkung zwischen Dosis und Reaktion sichtbar.
Die Konzentrationen, die 50% Schutzwirkungen ergeben, sind niedrig: Es werden für das gleiche Schutzniveau etwa fünfmal weniger 50%iges Polyphenolextrakt als Catechin benötigt, und etwa 50 mal weniger 90%iges Extrakt von phlorizinreichen Polyphenolen. Geringe Konzentrationen in Polyphenolextrakten, wie sie in der Erfindung beschrieben sind, reichen aus, um eine deutliche Verringerung der schädigenden Wirkung der freien Radikale mit sich zu bringen. Die Polyphenolfraktionen gemäß der Erfindung sind also starke antiradikalische Mittel, die die DNA in vitro vor gentoxischen Wirkungen des OH°-Radikals schützen.
Beispiel 6: Antioxidierende Wirkungen der Polyphenolfraktionen als Puder
Die antioxidierenden Wirkungen der phlorizinreichen Polyphenolfraktionen, die gemäß dem Verfahren der Erfindung erhalten wurden, werden auf Plasmid-DNA nach dem Prinzip des "3D"-Testes gemessen, der vorstehend beschrieben wurde. Die Methodenlehre ist die gleiche, mit dem einzigen Unterschied, dass in diesem Test das gentoxische Mittel, das die DNA schädigt, Singulett-Sauerstoff ¹O₂ ist, das durch Bestrahlung von Methylenblau erzeugt wurde.
Das Prinzip basiert auf der Reparatur der DNA-Schädigungen, wobei die beschädigte DNA als Marker der Schutzwirkung der verschiedenen Moleküle gegen Singulett-Sauerstoff ¹O₂ verwendet wird.
Das so bestrahlte und zu 4 ng/ml in ultrareinem Wasser verdünnte Methylenblau wird in die Vertiefungen gegeben, die anschließend während 20 Minuten mit weißem Licht (2 × 75 W) bestrahlt werden. Das verwendete Referenzmolekül ist Silymarin oder Silibinin (SIGMA), ein Gemisch von antihepatoxischen Flavonolignanen, die aus Silybum marianum extrahiert und gereinigt wurden, das wegen seiner entgiftenden Aktivität gegenüber Sauerstoff bekannt ist.
Die Ergebnisse sind folgendermaßen:

PPT:: Gesamtpolyphenole

Die gemäß der Erfindung erhaltenen Extrakte weisen eine antioxidierende Aktivität auf, die etwa 100 mal über derjenigen von Apfelsaftkonzentrat liegt (das selber eine nicht zu vernachlässigende Aktivität aufweist).
Ihre Aktivität ist im Fall des Phenolextraktes mit 50 Gew.-% an gesamten phlorizinreichen Polyphenolen mit derjenigen von Silymarin vergleichbar, und sie ist im Fall des Phenolextraktes mit 90 Gew.-% an gesamten phlorizinreichen Polyphenolen gemäß dem Verfahren der Erfindung zehnmal höher als diejenige von Silymarin.
Die Polyphenolfraktionen gemäß der Erfindung sind also starke Antiradikale, die eine wichtige Rolle beim Schutz des Organismus spielen können, der der Wirkung von reaktiven Sauerstoffspezies, die durch Zellstoffwechsel gebildet werden, unterworfen ist.
Beispiel 8: Licht-Genschutzwirkung der Polyphenolfraktionen als Puder
Die Schutzrolle der phlorizinreichen Polyphenolfraktionen gemäß der Erfindung gegen ultraviolette Strahlungen wird auf Plasmid-DNA gemäß dem Prinzip des vorstehend beschriebenen "3D"-Testes in vitro gemessen.
Das Prinzip basiert auf dem Messen der Menge der Schädigungen, die die DNA erleidet, wobei die beschädigte DNA als Marker für die Schutzwirksamkeit der zu testenden Moleküle gegen ultraviolette Strahlen verwendet wird.
Die zu testenden, potentiell lichtschützenden Produkte werden in reinem Ethanol oder ultrareinem Wasser verdünnt und dann in einer transparenten Platte ultravioletten Strahlen ausgesetzt. Diese Platte wird anschließend auf diejenige gelegt, die die adsorbierte Plasmid-DNA enthält. Der Aufbau wird mit ultravioletten B-Strahlen mit einer Stärke von 50 KJ/m² bestrahlt. Das verwendete Referenzprodukt ist ein Handelsprodukt, welches wegen seiner Schutzwirkung gegen ultraviolette Strahlen bekannt ist, nämlich Parsol MCX der Firma Roche.
Eine nicht spezifische Hemmung (in Abwesenheit von ultravioletten Strahlen) des Reparatursignals ist in diesem Test nicht möglich, da das Testprodukt zu keiner Zeit in direktem Kontakt mit der adsorbierten DNA ist.
IC50 ist die Konzentration in mg/ml des getesteten Produktes, die 50% schützende Aktivität gegen ultraviolette B-Strahlen ergibt. Je kleiner sie ist, desto besser ist das getestete Produkt in Bezug auf die antioxidierende Aktivität.
Die Ergebnisse sind folgendermaßen:
Die Polyphenolextrakte weisen, obwohl sie weniger lichtschützend sind als Parsol, nichtsdestoweniger eine wichtige Wirkung gegen ultraviolette B-Strahlen auf.
Man kann also schließen, dass die Polyphenolextrakte, wie sie in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, eine wichtige lichtschützende Wirkung auf die Gene gegen ultraviolette B-Strahlen haben, die zwischen 30 und 80 mal über derjenigen eines bekannten industriellen Apfelsaftkonzentrats liegt.

Claims

Fraktion aus der Frucht der Familie der Rosaceae, dadurch charakterisiert, dass sie mindestens 20% von Polyphenolen umfasst, umfassend mindestens 10 Gewichtsprozent von Phlorizin im Verhältnis zu den Gesamtpolyphenolen.
Fraktion nach Anspruch 1, dadurch charakterisiert, dass sie 10 bis 70 Gewichtsprozent von Phlorizin im Verhältnis zu den Gesamtpolyphenolen enthält.
Fraktion nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch charakterisiert, dass sie Chlorogensäure enthält.
Fraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Gewichtsverhältnis von Phlorizin im Verhältnis zum Gewicht der Chlorogensäure größer oder gleich 1 ist.
Fraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch charakterisiert, dass sie Epicatechin enthält.
Fraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch charakterisiert, dass sie Procyanidin B2 enthält.
Fraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Gewichtsverhältnis von Phlorizin im Verhältnis zum Gewicht von Epicatechin größer als 9 ist.
Fraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch charakterisiert, dass sie Quercitrin enthält.
Fraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch charakterisiert, dass sie p-Coumarinsäure enthält.
Fraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch charakterisiert, dass sie Koffeinsäure in solchen Mengen enthält, dass das Gewichtsverhältnis an Phlorizin im Verhältnis zum Gewicht der Koffeinsäure größer als 4 ist.
Fraktion nach Anspruch 10, wobei das Gewichtsverhältnis von Koffeinsäure weniger als 1 % der gesamten Polyphenole darstellt.
Fraktion nach einem der Ansprüche 3 bis 11, dadurch charakterisiert, dass sie Phloretin enthält.
Fraktion nach einem der Ansprüche 3 bis 11, dadurch charakterisiert, dass die Dihydrochalcone (Phlorizin und Phloretin) in Proportionen vorhanden sind, welche größer oder gleich 40 Gewichtsprozent sind, verglichen mit den Hydroxy-Zimtsäuren (Koffeinsäure, Chlorogensäure, p-Coumarinsäure).
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch charakterisiert, dass sie mindestens 20 Gewichtsprozent an Gesamtpolyphenolen enthält, davon zumindest 10% an Phlorizin, Chlorogensäure, Epicatechin, Procyanidin B2, Quercitrin, p-Coumarinsäure und Koffeinsäure.
Fraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch charakterisiert, dass sie mehr als 50 Gewichtsprozent an Gesamtpolyphenolen enthält.
Fraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch charakterisiert, dass sie als Puderform vorliegt.
Fraktion nach Anspruch 16, dadurch charakterisiert, dass sie mindestens 10% Phlorizin pro Gramm Puder enthält.
Fraktion nach Anspruch 16, dadurch charakterisiert, dass sie 10 bis 70% Phlorizin pro Gramm Puder enthält.
Verfahren zur Herstellung einer Fraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch charakterisiert, dass man, ausgehend von zerkleinerten Äpfeln, eine oder mehrere Fest/Flüssig-Extraktionen vornimmt, das solide Extrakt anschließend trocknet und dann weitere Extraktionen mit Hilfe von organischen Lösungsmitteln vornimmt, um die Polyphenolfraktion zu erhalten.
Verfahren zur Herstellung einer Fraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch charakterisiert, dass man, ausgehend von zerkleinerten Äpfeln, eine oder mehrere Fest/Flüssig-Extraktionen vornimmt, das feste Extrakt anschließend enzymatisch verflüssigt, um einen flüssigen Extrakt zu erhalten, welcher der Chromatographie unterzogen wird, um die Polyphenolfraktion zu erhalten.
Verfahren zur Herstellung einer Fraktion nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch charakterisiert, dass man nach der festen Extraktion einen Entwachsungsschritt vornimmt.
Verfahren zur Herstellung einer Fraktion nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch charakterisiert, dass man eine letzte Trocknung vornimmt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch charakterisiert, dass man eine Extraktion von reifen Äpfeln vornimmt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch charakterisiert, dass man eine Extraktion des Apfels Malus sylvestris Mill. vornimmt.
Fraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch charakterisiert, dass sie mit Hilfe des Verfahrens, wie definiert in einem der Ansprüche 19 bis 24, erhalten werden kann. umfassend eine Zusammensetzung wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 18 und 25.
Verwendung der Fraktion wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 18 und 25, als Schutzagens gegen ultraviolette Strahlen.
Verwendung der Fraktion wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 18 und 25 als Antioxidans-Mittel.
Kosmetische Zusammensetzung dadurch charakterisiert, dass sie eine Fraktion wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 18 und 25 enthält.