CN108634309B - 野生水麻叶提取物及其新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及野生水麻叶提取物,其是以野生水麻叶为原料经干燥、粉碎、超声波辅助溶剂萃取、过滤、离心、减压蒸馏、大孔树脂吸附和解吸附、减压蒸馏、真空冷冻干燥制得,本发明的野生水麻叶提取物中特定多酚含量高,富含绿原酸、咖啡酸等酚酸物质,尤其是绿原酸含量丰富,是一种具有较高生物活性的天然活性产物,可作为在制备抗氧化功能的保健食品和预防癌细胞增殖的保健食品的有效成分,可应用于食品及生物药物领域,并具有很好应用前景。

Description

野生水麻叶提取物及其新用途
技术领域
本发明属于食品与生物医药技术领域,特别涉及一种天然野生水麻叶提取物及其在抗氧化和预防癌细胞增殖等方面的新用途。
背景技术
水麻(Debregeasia orientalis C.J.Chen),别名:柳莓或水马桑、比满(苗族名)、水麻柳、水苏麻,荨麻科水麻属,沟边木、假密蒙、折骨藤、水细麻、水玄麻。药材基源为荨麻科植物大叶苎麻的全草,主以茎皮、叶入药。清热利湿,止血解毒,主治小儿急惊风,风湿关节痛,咳血,痈疖肿毒。水麻根或根皮名为冬里麻根,水麻根常入药,有祛风、透疹、活血、化癖的功能,药性微苦、辛,平。具有祛风除湿,活血消肿的功效;主治风湿痹痛,跌打骨折,疮痈肿毒等。水麻的叶子可以用做饲料,或者入药,民间将叶子晒干用做草药,具有解热、活血、止血、利湿等多种功效。水麻主要分布区在我国四川、云南,陕西南部等地山区,秦岭南坡是水麻分布的最北限,主要呈野生自然分别,未得到开发利用。
目前对水麻的研究很少。刘睿等人以长叶水麻的干燥茎皮为实验原料,分离出没食子酸、3,5-二甲氧基没食子酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和(-)-表儿茶素三个酚酸化合物,并测试了这三个化合物对小鼠乳腺癌tsFT210细胞的抗肿瘤活性,发现没食子酸在≧12.5μg/mL时对tsFT210细胞有抑制作用。肖艳华等人从水麻地上部分95%乙醇提取物中分离得到18个化合物,主要为酚酸类、三萜类、甾体、黄酮醇、黄酮醇苷及长链脂肪酸类化合物等,包括表儿茶素、儿茶素和槲皮素等,所得提取物具有较强的ACE抑制活性。
目前植物多酚的提取方法主要有有机溶剂萃取法、超临界流体萃取法和制备型高效液相色谱分离技术等,辅助提取技术主要有超声波及微波等方法的应用。对提取物的纯化方面,大孔树脂纯化技术已得到广泛应用。由于其成本低、选择性好、吸附容量大、易再生、吸附速度快、洗脱容易等优点,使其成为适合工业生产的分离纯化技术。但关于超声波辅助提取水麻叶多酚尚未见报道,也未见关于大孔树脂纯化水麻叶提取物的报道,更未见水麻叶提取物在抗氧化及抗癌方面新用途的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种野生水麻叶提取物及其在抗氧化及预防癌细胞增殖的保健食品中的新用途。
本发明所采用的技术方案是:
该野生水麻叶提取物在制备用于以下的组合物中的用途:
(1)抗氧化功能的保健食品;
(2)预防癌细胞增殖的保健食品。
进一步限定,所述野生水麻叶提取物包含没食子酸、原儿茶酸、表没食子儿茶素、(+)-儿茶素、咖啡酸、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯以及表儿茶素没食子酸酯中的至少一种或多种。
再进一步限定,所述野生水麻叶提取物中总酚含量不少于70%,以干重计,每100mg野生水麻叶提取物中绿原酸含量不少于20%,咖啡酸含量不少于10%,原儿茶酸含量不少于10%。
进一步限定,所述野生水麻叶提取物通过以下方法制备:
(1)水麻叶预处理
将新鲜的野生水麻叶于室温条件下阴干,用粉碎机粉碎,过80~120目筛,得到水麻叶粉末;
(2)超声波提取
将步骤(1)的水麻叶粉末装入容器内,加入提取溶剂,水麻叶粉末与提取溶剂的质量比为1:20~35,升温至30~70℃,用超声波发生器功率为50~250W的超声波处理20~50分钟,收集提取液;
(3)提取物浓缩、纯化
将提取液用纱布过滤,离心机1500~4000转/分钟离心处理10~30分钟,40~50℃减压蒸馏,再用大孔树脂纯化,得到纯化的野生水麻叶提取物。
一种野生水麻叶提取物的制备方法,包括以下步骤:
(1)水麻叶预处理
将新鲜的野生水麻叶于室温条件下阴干,用粉碎机粉碎,过80~120目筛,得到水麻叶粉末;
(2)超声波提取
水麻叶粉末装入容器内,加入提取溶剂,水麻叶粉末与提取溶剂的质量比为1:20~35,升温至30~70℃,用超声波发生器功率为50~250W的超声波处理20~50分钟,收集提取液;
(3)提取物浓缩
步骤(2)的提取液过100~250目纱布过滤,收集滤液,用离心机1500~4000转/分钟离心10~30分钟,收集上清液,在40~50℃减压蒸馏回收提取溶剂,得水麻叶提取物浓缩液;
(4)提取物纯化
将步骤(3)的水麻叶提取物浓缩液过大孔树脂纯化,真空冷冻干燥,得到纯化的野生水麻叶提取物。
进一步限定,所述步骤(2)的提取溶剂为水或体积浓度为30~100%乙醇或体积浓度为30~100%甲醇或丙酮或水与乙醇的混合液或水与甲醇的混合液。
进一步限定,所述步骤(4)具体为:将步骤(3)的水麻叶提取物浓缩液过型号为D160或HP-10或D101B或LSA-10或X-5或XDA-6或LSA-5B的大孔树脂进行纯化,吸附条件为:上样液总酚浓度为0.5~2.5mg/mL、上样液pH值为2.5~8.5、上样温度25~35℃、上样流速为1~6BV/h;解吸附条件为:30~100%乙醇溶液作脱附剂,洗脱流速1~3BV/h,将所得解吸附液浓缩回收乙醇后进行真空冷冻干燥,得到水麻叶提取物纯化产品。
一种通过上述的方法所制备的野生水麻叶提取物。
进一步限定,该野生水麻叶提取物包含没食子酸、原儿茶酸、表没食子儿茶素、(+)-儿茶素、咖啡酸、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯以及表儿茶素没食子酸酯中的至少一种或多种。
再进一步限定,所述野生水麻叶提取物中总酚含量不少于70%,以干重计,每100mg野生水麻叶提取物中绿原酸含量不少于20%,咖啡酸含量不少于10%,原儿茶酸含量不少于10%。
本发明的野生水麻叶提取物是以野生水麻叶为原料利用超声提取、减压蒸馏浓缩、大孔树脂纯化的方法制得,其制备工艺步骤简便、提取率高、产品纯度高、提取时间短、生产成本低,而且所得产品中绿原酸、咖啡酸、原儿茶酸等酚酸物质含量高,具有较强的生物活性,可作为抗氧化功能的保健食品和预防癌细胞增殖的保健食品的有效成分,具有良好的抗氧化及抑制癌细胞活性,可应用于食品及生物药物领域,该技术首次提出对野生水麻叶进行开发利用,可促进野生植物资源的开发和利用,使农业、林业及药业等增值增效,具有很好应用前景。
附图说明
图1为野生水麻叶提取物中多酚类化合物的HPLC色谱图,(图1中A为水麻叶提取物色谱图,B为多酚标准品色谱图,1代表没食子酸;2代表原儿茶酸;3代表表没食子儿茶素;4代表(+)-儿茶素;5代表咖啡酸;6代表绿原酸;7代表表没食子儿茶素没食子酸酯;8代表表儿茶素;9代表没食子儿茶素没食子酸酯;10代表表儿茶素没食子酸酯)。
图2为不同浓度的野生水麻叶提取物使A549肺癌细胞的凋亡形态与对照。
图3为不同浓度的野生水麻叶提取物使Hela宫颈癌细胞的凋亡形态与对照。
具体实施方式
现结合实施例和附图对本发明的技术方案进行进一步说明。
新鲜水麻叶:采摘自陕西省略阳山区,水麻种属由陕西师范大学生命科学学院植物分类学教授田先华鉴定。
本发明的野生水麻叶提取物通过下述的方法制得:
(1)水麻叶预处理
将新鲜野生水麻叶置于室温(25~28℃)条件下阴干,用粉碎机粉碎,过80~120目筛,得到水麻叶粉末。
(2)超声波提取
水麻叶粉末装入容器内,加入提取溶剂,升温至30~70℃,利用超声波发生器超声处理一定时间,收集提取液。
(3)提取物浓缩
将提取液用3~5层100~250目纱布过滤,收集滤液,用离心机离心一定时间,收集上清液,在一定温度下减压蒸馏回收提取溶剂,得水麻叶提取物浓缩液。
(4)提取物纯化
将水麻叶提取物浓缩液过大孔树脂纯化,吸附:上样液总酚浓度为0.5~2.5mg/mL、上样液pH值为2.5~8.5、上样温度25~35℃、上样流速为1~6BV/h;解吸附:30~100%乙醇溶液作脱附剂,洗脱流速1~3BV/h,将所得解吸附液浓缩回收乙醇后进行真空冷冻干燥,得到水麻叶提取物纯化产品。
用上述方法的各实施例的工艺条件及所得产率如表1所示。
表1为各实施例的工艺条件及对应野生水麻叶提取物的产率
Figure BDA0001628306440000061
Figure BDA0001628306440000071
从表1的可以看出,本发明各实施例的野生水麻叶提取物的得率在10%以上,且野生水麻叶提取物中的总酚含量均在70%以上。
上述各实施例只是示例,并非穷举,在步骤(2)中,超声提取所用提取溶剂可以是上述的水或体积浓度为30~100%乙醇或体积浓度为30~100%甲醇或丙酮,任意一种均可,还可以是水与体积浓度为30~100%乙醇的混合液或水与体积浓度为30~100%甲醇的混合液,对于提取液的选择,甲醇提取为效果最佳。
此外,对于步骤(4)所用的大孔树脂,除了上述实施例列举的D160、HP-10、D101B、LSA-10、LSA-5B型号之外,还可以采用X-5、XDA-6型号的大孔树脂,只是不同树脂型号的吸附、解吸特性不同,对纯化物的总多酚含量会产生影响,参见下表2。
表2七种大孔树脂静态吸附和解吸特性及其提取纯化物总多酚含量分析
Figure BDA0001628306440000081
由表2可见,以D101B、D160、LSA-5B、HP-10、X-5、LSA-10和XDA-6七种大孔树脂纯化水麻叶提取物多酚,水麻叶提取纯化物中总酚含量相对较高,其中LSA-5B大孔树脂对水麻叶提取物多酚有最大吸附率和最大解吸附率,所得提取纯化物总酚含量最高。
为了了解本发明的野生水麻叶提取纯化物的主要成分,进行了HPLC分析检测。
材料:没食子酸、原儿茶酸、表没食子儿茶素、(+)-儿茶素、咖啡酸、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯标准品:购自Sigma公司,纯度>98%。
试剂:甲醇、乙腈、三氟乙酸等色谱用试剂为色谱纯,其他试剂均为分析纯。
进一步分析,用高效液相色谱法对本发明制备所得水麻叶提取物中多酚组成进行了分析。色谱条件:色谱系统为LC-20AR高效液相色谱系统;色谱柱为InertSustain C18柱(4.6mm i.d.×250mm,5mm,岛津,日本);用0.1%TFA(三氟乙酸)和20%甲醇作为流动相A,乙腈作为流动相B,流速为0.8mL/min。梯度程序设定如下:0~30min,0~3%B;30~60min,3~5%B;60~80min,5~7%B,80~90min,7~10%B,在278nm处检测吸收峰。每个样品和标准品溶液的进样量为10μL,柱温为30℃。结果参见图1。
由图1可见,野生水麻叶提取物中多酚的组成成分包括:没食子酸、原儿茶酸、表没食子儿茶素、(+)-儿茶素、咖啡酸、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯等,其中绿原酸是水麻叶提取物中含量最高的活性成分,其次是咖啡酸,再次是原儿茶酸。可见水麻叶提取物富含多种酚酸物质,具有较强的生物活性。
以实施例5所得产品为例,进一步确定中野生水麻叶提取物中多酚的组成成分各物质含量如下表3所示。
表3水麻叶提取物多酚组成成分及含量分析结果
Figure BDA0001628306440000091
Figure BDA0001628306440000101
用同样的方法对上述实施例1~4的野生水麻叶提取物进行分析,其多酚的组成成分跟上述结果相似。在本发明的野生水麻叶提取物中,包含有没食子酸、原儿茶酸、表没食子儿茶素、(+)-儿茶素、咖啡酸、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯以及表儿茶素没食子酸酯中的至少一种或多种的组合,此外,以干重计,每100mg本发明的野生水麻叶提取物中包含:绿原酸不少于20%,咖啡酸不少于10%,原儿茶酸不少于10%。可见水麻叶提取物富含多种酚酸物质,其是绿原酸含量丰富,是一种具有较高生物活性的天然活性产物,在食品及生物医药领域具有良好的应用前景。
进一步对本发明的野生水麻叶提取物(简称水麻叶提取物)进行了功能活性测试,各种测试如下:
1、野生水麻叶提取物抗氧化及清除自由基作用
表4水麻叶提取物总还原力测定
Figure BDA0001628306440000102
表5水麻叶提取物清除羟基自由基能力测定
Figure BDA0001628306440000103
Figure BDA0001628306440000111
表6水麻叶提取物清除DPPH自由基能力测定
Figure BDA0001628306440000112
表7水麻叶提取物清除ABTS自由基能力测定
Figure BDA0001628306440000113
由表4、5、6、7可见,本发明的野生水麻叶提取物的总还原力强于维生素C,虽然野生水麻叶提取物的清除羟基自由基的能力要弱于维生素C,但野生水麻叶提取物的清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力要强于维生素C。由此可见,本发明的野生水麻叶提取物具有较强的抗氧化和清除自由基活性,可作为抗氧化功能的保健食品的有效成分之一,制备抗氧化功能的保健食品。
2、野生水麻叶提取物对人非小肺癌A549细胞及人宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用,参见下表8和图2和图3,图2为不同浓度水麻叶提取物对A549肺癌细胞的凋亡形态,图3为不同浓度水麻叶提取物对Hela宫颈癌细胞的凋亡形态。
表8水麻叶提取物对A549细胞、Hela细胞的增殖抑制作用
Figure BDA0001628306440000114
结合表8与图2、3可见,水麻叶提取物在100-400μg/mL浓度范围内可有效诱导人非小肺癌A549细胞、人宫颈癌Hela细胞凋亡,且诱导凋亡作用呈剂量依赖性。此外,水麻叶提取物可导致A549人肺癌细胞和Hela人宫颈癌细胞形态发生明显的凋亡变化,出现细胞变形、细胞核深染、缩小、染色质边聚等癌细胞凋亡特征,因此本发明的野生水麻叶提取物还可在制备预防和抑制癌细胞增殖的保健食品中作为有效成分,起到预防和抑制癌细胞增殖的作用。

Claims (5)

1.野生水麻叶提取物在制备预防癌细胞增殖的药物方面的应用;
所述野生水麻叶提取物通过以下方法提取:
(1)水麻叶预处理
将新鲜的野生水麻叶于室温条件下阴干,用粉碎机粉碎,过80~120目筛,得到水麻叶粉末;
(2)超声波提取
将步骤(1)的水麻叶粉末装入容器内,加入提取溶剂,该提取溶剂为水或体积浓度为30~100%乙醇或体积浓度为30~100%甲醇或丙酮,水麻叶粉末与提取溶剂的质量比为1:20~35,升温至30~70℃,用超声波发生器功率为50~250 W的超声波处理20~50分钟,收集提取液;
(3)提取物浓缩、纯化
将提取液用纱布过滤,离心机1500~4000转/分钟离心处理10~30分钟,40~50℃减压蒸馏,再用大孔树脂纯化,得到纯化的野生水麻叶提取物;
所述用大孔树脂纯化的步骤具体为:用型号为D160或HP-10或D101B或LSA-10或X-5或XDA-6或LSA-5B的大孔树脂进行纯化,吸附条件为:上样液总酚浓度为0.5~2.5mg/mL、上样液pH值为2.5~8.5、上样温度25~35℃、上样流速为1~6BV/h;解吸附条件为:30~100%乙醇溶液作脱附剂,洗脱流速1~3BV/h,将所得解吸附液浓缩回收乙醇后进行真空冷冻干燥。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述野生水麻叶提取物包含原儿茶酸、表没食子儿茶素、咖啡酸、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯以及表儿茶素没食子酸酯中的至少一种或多种。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述野生水麻叶提取物中总酚含量不少于70%,以干重计,每100mg野生水麻叶提取物中绿原酸含量不少于20%,咖啡酸含量不少于10%,原儿茶酸含量不少于10%。
4.一种野生水麻叶提取物,其特征在于:该提取物包含原儿茶酸、表没食子儿茶素、咖啡酸、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯以及表儿茶素没食子酸酯中的至少一种或多种;
所述野生水麻叶提取物通过以下步骤提取:
(1)水麻叶预处理
将新鲜的野生水麻叶于室温条件下阴干,用粉碎机粉碎,过80~120目筛,得到水麻叶粉末;
(2)超声波提取
水麻叶粉末装入容器内,加入提取溶剂,该提取溶剂为水或体积浓度为30~100%乙醇或体积浓度为30~100%甲醇或丙酮,水麻叶粉末与提取溶剂的质量比为1:20~35,升温至30~70℃,用超声波发生器功率为50~250 W的超声波处理20~50分钟,收集提取液;
(3)提取物浓缩
步骤(2)的提取液过100~250目纱布过滤,收集滤液,用离心机1500~4000转/分钟离心10~30分钟,收集上清液,在40~50℃减压蒸馏回收提取溶剂,得水麻叶提取物浓缩液;
(4)提取物纯化
将步骤(3)的水麻叶提取物浓缩液过大孔树脂纯化,真空冷冻干燥,得到纯化的野生水麻叶提取物;
所述大孔树脂纯化的步骤具体为:用型号为D160或HP-10或D101B或LSA-10或X-5或XDA-6或LSA-5B的大孔树脂进行纯化,吸附条件为:上样液总酚浓度为0.5~2.5mg/mL、上样液pH值为2.5~8.5、上样温度25~35℃、上样流速为1~6BV/h;解吸附条件为:30~100%乙醇溶液作脱附剂,洗脱流速1~3BV/h,将所得解吸附液浓缩回收乙醇。
5.根据权利要求4所述的野生水麻叶提取物,其特征在于,所述野生水麻叶提取物中总酚含量不少于70%,以干重计,每100mg野生水麻叶提取物中绿原酸含量不少于20%,咖啡酸含量不少于10%,原儿茶酸含量不少于10%。
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尼泊尔水东哥、水麻、木姜冬青和青荚叶的化学成分研究;肖艳华;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 医药卫生科技辑》;20070415(第4期);E057-16 *
长叶水麻的三个酚酸类化学成分及其抗肿瘤活性;刘睿等;《中国药物化学杂志》;20040831;第14卷(第4期);第193-196页 *

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