JP4142859B2 - 果実ポリフェノール、酸化防止剤、血圧降下剤、抗変異原性作用剤、アレルギー抑制剤、抗う蝕剤及び消臭剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は果実ポリフェノールに係り、さらにはポリフェノール画分を有効成分とする酸化防止剤、血圧降下剤、抗変異原性作用剤、アレルギー抑制剤、抗う蝕剤及び消臭剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バラ科食用果実、特にリンゴ、ナシ、モモなどの果樹栽培過程において、通常５月中旬〜７月中旬にかけて「摘果（みすぐり）」と呼ばれる作業が行われる。作業内容は、受粉後房状に結実した果実がまだ未熟の段階のうちに、一部の果実を残し他を摘果廃棄するというものであるが、この作業により多量の未熟果実が未利用のまま廃棄処分されている。この未熟果実は成熟果実と比較して極めて苦く、また果実切断面は容易に褐変する。この事実は、未熟果実中にポリフェノール化合物が大量に存在することを示唆するものである。
【０００３】
ポリフェノール化合物は植物の二次代謝産物として植物界に普遍的かつ多種・多量に存在することで知られているが、これらのあるものは非常に多様な生理活性を示す点で古くより薬学の分野において、また近年の食品化学の分野において注目を集めている。
【０００４】
そのなかで、特に最近研究の集中している茶のポリフェノール（カテキン類）においては、抗菌、抗ウイルス、抗酸化、抗突然変異、抗癌、血小板凝集抑制、血圧上昇抑制、血糖上昇抑制、血中コレステロール低下、抗う蝕、抗アレルギー、腸内フローラ改善、消臭など非常に広範な生理作用を有することが認知されつつある。（特開昭６３−２１４１８３号公報、特開平２−６４９９号公報、特開平４−１７８３２０号公報等を参照）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このように、例えば茶から抽出したポリフェノールが広範な生理作用を有することが知られているが、本発明者は別の観点から検討を進め、より効率良く、しかも経済的にポリフェノールを製造するための原料の検索および製造方法、更には当該ポリフェノールの生理作用等を検討、確認した。
その結果、バラ科果実、特にリンゴ、ナシ、モモ等の未熟果実を原料とし、かつ特定の処理を施すことにより、各種の生理作用を備えたポリフェノールを効率よく製造できることを見出し、本発明に到達した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明によれば、摘果作業が行われる時期に採取されるリンゴの未熟果実より搾汁および／または抽出された画分の精製物から成り、その成分組成が、カフェー酸、カフェー酸エステル、ｐ−クマル酸、ｐ−クマル酸エステル、フロレチン、フロレチン配糖体、ケルセチン、ケルセチン配糖体、カテキン、エピカテキン及び高分子ポリフェノール化合物としてカテキン類の規則的な重合体である縮合型タンニン類を含み、以下に述べるような各種の生理活性を示すポリフェノール混合物が提供される。
【０００８】
また、本発明によれば、摘果作業が行われる時期に採取されるリンゴの未熟果実より搾汁および／または抽出された画分の精製物から成り、その成分組成が、単純ポリフェノール化合物としてカフェー酸誘導体、ｐ−クマル酸誘導体、フラバン−３−オール類、フラボノール類、ジヒドロカルコン類、及び高分子ポリフェノール化合物としてカテキン類の規則的な重合体である縮合型タンニン類を含む、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害作用を有するポリフェノール画分を有効成分とする血圧降下剤が提供される。
【０００９】
さらにまた、本発明によれば、摘果作業が行われる時期に採取されるリンゴの未熟果実より搾汁および／または抽出された画分の精製物から成り、その成分組成が、単純ポリフェノール化合物としてカフェー酸誘導体、ｐ−クマル酸誘導体、フラバン−３−オール類、フラボノール類、ジヒドロカルコン類、及び高分子ポリフェノール化合物としてカテキン類の規則的な重合体である縮合型タンニン類を含む、ヒアルロニダーゼ阻害作用ならびにヒスタミン遊離抑制作用を有するポリフェノール画分を有効成分とするアレルギー抑制剤が提供される。
さらにまた、本発明によれば、摘果作業が行われる時期に採取されるリンゴの未熟果実より搾汁および／または抽出された画分の精製物から成り、その成分組成が、単純ポリフェノール化合物としてカフェー酸誘導体、ｐ−クマル酸誘導体、フラバン−３−オール類、フラボノール類、ジヒドロカルコン類、及び高分子ポリフェノール化合物としてカテキン類の規則的な重合体である縮合型タンニン類を含む、グルコシルトランスフェラーゼ阻害活性を有するポリフェノール画分を有効成分とする抗う蝕剤が提供される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明における果実ポリフェノールは、上記のように、バラ科に属する果実、特にリンゴ、ナシ、モモの未熟果実の搾汁果汁、抽出液より精製されたポリフェノール画分からなるものであるが、このポリフェノール画分の精製は、搾汁果汁、抽出液を吸着剤で処理することにより行われ、吸着剤に吸着する画分（以下、吸着画分という）にポリフェノールは含有されている。そして吸着画分を含水アルコール（エタノール等）で溶出させることにより、ポリフェノール画分が精製される。
【００１２】
このポリフェノール画分は、次いで濃縮処理することにより液体製剤を得ることができる。
さらに、ポリフェノール画分の濃縮液を噴霧乾燥もしくは凍結乾燥処理することにより粉末製剤を得ることもできる。
【００１３】
本発明で用いる原料としては、バラ科に属する果実であるリンゴ、ナシまたはモモが挙げられ、特にリンゴが好ましい。また、果実としては、より多くのポリフェノール化合物を含有すること、および広範な生理作用を有する各種活性成分を多量に含むことから、リンゴ、ナシまたはモモの未熟果実を用いる。
【００１４】
搾汁方法としては原料を洗浄し、そのまま、または亜硫酸を添加しながら破砕、圧搾により搾汁果汁を得、好ましくはペクチン分解酵素を添加する。次いで遠心分離、濾過等の手段により清澄果汁を得る方法を挙げることができる。
また抽出方法としては、洗浄した原料をアルコール（エタノール、メタノール等）と混合して破砕し、そのまま浸漬及び圧搾、または加熱還流しながら抽出し、次いで減圧濃縮によりアルコールを留去した後、遠心分離及び濾過、または有機溶媒（ヘキサン、クロロホルム等）による分配及び濾過を行い、清澄抽出液を得る方法を挙げることができる。
【００１５】
精製方法としては、ポリフェノール類を選択的に吸着且つ溶離できる吸着剤、例えばスチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂、陰イオン交換樹脂、オクタデシル基化学結合型シリカゲル（ＯＤＳ）等を充填したカラムに、上記の清澄果汁又は清澄抽出液を通すことによりポリフェノール画分を吸着させる。次いで、蒸留水を通すことにより洗浄した後、２０〜１００％アルコール（例えばエタノール）溶液、好ましくは約５０％アルコール溶液をカラムに通すことによりポリフェノール画分が溶出、回収できる。得られたポリフェノール溶液を減圧濃縮することによりアルコールを留去し、果実ポリフェノール液体製剤（好ましくはリンゴ酸等の有機酸を添加）を得ることができる。さらに、液体製剤をそのままもしくはデキストリン等の粉末助剤を添加し、噴霧乾燥又は凍結乾燥を行い、果実ポリフェノール粉末製剤を得ることができる。
【００１６】
本発明で得られる果実ポリフェノールの組成としては、単純ポリフェノール化合物としてカフェー酸誘導体、ｐ−クマル酸誘導体、フラバン−３−オール類（カテキン類）、フラボノール類（ケルセチン配糖体類）、ジヒドロカルコン類（フロレチン配糖体類）など、また高分子ポリフェノール化合物として縮合型タンニン類など、により大部分が占められることを本発明者は確認している。
【００１７】
従って、本発明で得られる果実ポリフェノールは種々の生理機能を有する可能性があると考えられるが、本発明者が鋭意検討した結果、第一に、このポリフェノールには、植物油脂であるリノール酸の酸化を防止する作用を有する成分が多量に含まれていることを見出した。即ち、本発明で得られる果実ポリフェノールは酸化防止剤として極めて有効なものである。
【００１８】
また第二に、このポリフェノールには、血圧上昇に関連する酵素であるアンジオテンシンＩ変換酵素（以下、ＡＣＥという）の働きを阻害する作用を有する成分が多量に含まれていることを見出した。従って、本発明で得られる果実ポリフェノールは血圧降下剤としても極めて有効なものである。
【００１９】
そして、さらに本発明者は検討を進めて、果実ポリフェノール中のＡＣＥ阻害活性物質が何かを検索したところ、図１２の構造式で示される縮合型タンニンであることを確認した。
また、近年の多くの研究結果より発ガン性物質と変異原性物質に高い相関が認められ、発ガン性と変異原性は深い関連があるとされている。すなわち変異原性を抑制する物質は発ガン性を予防することが期待できる。そこで、本発明で得られる果実ポリフェノールが抗変異原性作用があるかどうかを確認したところ、その作用効果があることが判明した。従って、本発明で得られる果実ポリフェノールは抗変異原性作用剤としても極めて有効なものである。
【００２０】
さらに、ヒスタミンは様々なアレルギー症状を引き起こす生体内ケミカルメディエーターとして知られており、主に肥満細胞や好塩基球から脱顆粒によって遊離する。
ヒアルロニダアーゼは結合組織再構築における細胞活動の一貫を形成していると考えられている酵素であるが、近年の研究（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３３．ｐ６４２．１９８５、同．３３．１９８５，同．３３．ｐ３７８７．１９８５，同．３３．ｐ５０７９．１９８５，同．４０．１４３９．１９９２）によりヒアルロニダーゼ阻害活性と、肥満細胞からのヒスタミン遊離抑制活性が合成抗アレルギー剤（クロモグリク酸ナトリウムやトラニラスト）に於いて高い相関性を示し、これらの活性を測定することで天然物から数種の抗アレルギー物質が検索されている。そこで、本発明で得られる果実ポリフェノールがヒアルロニダーゼ阻害活性ならびにヒスタミン遊離抑制活性があるかどうかを確認したところ、その作用効果があることが判明した。従って、本発明で得られる果実ポリフェノールはアレルギー抑制剤としても極めて有効なものである。
【００２１】
さらにまた、今日では、う蝕（虫歯）はStreptococcus mutansを中心とする口腔連鎖球菌による細菌感染症の一種であることが確認されているが、う蝕発生過程の中でも歯垢形成は特に重要な要因と考えられている。
すなわち、食物中に含まれるショ糖から、う蝕菌の産生酵素グルコシルトランスフェラーゼ（以下、ＧＴａｓｅと略す）の作用により粘着性の不溶性グルカンが合成され、これを介して細菌が歯牙表面に付着し、生じた歯垢がう蝕の原因となる。
【００２２】
このことより、ＧＴａｓｅ活性を阻害する物質は効果的な抗う蝕剤として適用できることが期待されている（Appl.Env.Microbiol.,59(4),968-973,1993、Biosci.Biotech.Biochem.,56(5),766-768,1992、Agric.Biol.Chem.,54(11),2925-2929,1990、Chem.Pharm.Bull.,38(3),717-720,1990）。
そこで本発明においては、う蝕菌の代表種のひとつであるS.sobrinusが産生する、不溶性グルカン生成ＧＴａｓｅに対する果実ポリフェノールの阻害能について検討したところ、その作用効果があることが判明した。従って、本発明で得られる果実ポリフェノールは抗う蝕剤としても極めて有効なものである。
【００２３】
さらにまた、食品由来の悪臭成分の中で、口臭の強さと含有量が比例するのは、硫化水素、メチルメルカプタン、硫化ジメチル等揮発性硫黄化合物であるとされている（日歯周誌、17,233-245,1975）。なかでも、メチルメルカプタン濃度との間に強い相関が認められている（日歯周誌、18,1-12,1976及び歯学会報、76,1923,1976）。そこで、本発明で得られる果実ポリフェノールのメチルメルカプタン、硫化ジメチルに対する消臭効果を測定したところ、その作用効果があることが判明した。さらに、果実ポリフェノールのメチルメルカプタン、硫化ジメチルおよび二硫化ジメチルに対する産生抑制効果を測定したところ、その作用効果があることも判明した。従って、本発明で得られる果実ポリフェノールは消臭剤としても極めて有効なものである。
【００２４】
【実施例】
次に、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２５】
（実施例１）
［リンゴ未熟果果汁の成分分析］
以下の試料について一般成分分析を行った。
−試料 リンゴ（ふじ）成熟果：市販品（無袋栽培品）
リンゴ（ふじ）未熟果：６月中旬に採取
−試料処理法
果実試料に対し酸化防止剤として適量のメタ重亜硫酸カリウムを添加しながら、ミキサーで破砕・搾汁した。搾汁液は遠心分離・濾過により清澄果汁として、以下の測定に供した。
【００２６】
−測定項目（および方法）
−一個体平均重量（ｎ＝５０）
−搾汁率（％）
−ｐＨ
−酸度（リンゴ酸換算ｇ／ｌ）
−Ｂｒｉｘ
−総フェノール（クロロゲン酸換算、ｐｐｍ）
−総アスコルビン酸
−有機酸組成
−糖組成
−金属イオン組成
−遊離アミノ酸組成
測定結果を表１に示した。
【００２７】
【表１】
【００２８】
表１よりわかるように、リンゴ未熟果果汁は成熟果果汁と比較すると成分的に大きな差異が見られた。特に強調すべき点として、フェノール成分、アスコルビン酸、有機酸（特にキナ酸）、金属イオン、遊離アミノ酸（特にアスパラギン、フェニルアラニン、γ−アミノ酪酸）に富んでいるといえる。一方、糖類は非常に少なかった。
【００２９】
次にリンゴ未熟果のポリフェノール成分組成について、高速液体クロマトグラフ法により調べた。
測定試料は果実抽出液からポリフェノール成分を固相抽出法により精製したもの（実施例２を参照）を使用した。
測定結果を図１に示す。
【００３０】
これより、リンゴ未熟果の単純ポリフェノール化合物組成は、カフェー酸誘導体（クロロゲン酸他）、ｐ−クマル酸誘導体、フラバン−３−オール類（カテキン、エピカテキン、他）、フラボノール類（ケルセチン配糖体類）、ジヒドロカルコン類（フロレチン配糖体、特にフロリジン）で大半を占めることが判明した。量的にはクロロゲン酸、カテキン、エピカテキン、フロリジンが高含量であると推定された。
【００３１】
（実施例２）
［果実未熟果ポリフェノールの抗酸化作用］
−原料 原料素材としては以下の果実を使用した。
リンゴ成熟果：市販品（無袋栽培品）
リンゴ未熟果：６月中旬に採取
「ふじ」 − 平均重量 ４．９７ ｇ（ｎ＝５０）
「津軽」 − 平均重量 ７．８０ ｇ（ｎ＝５０）
「ジョナゴールド」− 平均重量 ３．８６ ｇ（ｎ＝５０）
「北斗」 − 平均重量 ３．３２ ｇ（ｎ＝５０）
「王林」 − 平均重量 １０．３４ ｇ（ｎ＝５０）
【００３２】
ナシ未熟果：６月上旬に採取
「豊水」−平均重量 ８．９８ｇ（ｎ＝５０）
モモ未熟果：６月上旬に採取。
「あかつき」−平均重量 ５．０３ｇ（ｎ＝５０）
【００３３】
−試料調製
果汁試料−実施例１と同様の処理により清澄果汁を得た。
抽出試料−抽出方法としては、原料４００ｇを１％塩酸酸性メタノールと共にホモジナイズした後、加熱還流しながら抽出し（３回）、抽出液を減圧濃縮してメタノールを留去後、クロロホルムを加えて分配し（２回）、水層を回収し、濾過後蒸留水で２００ｍｌにメスアップして抽出試料とした。
なお、必要に応じ、果汁試料、抽出試料からポリフェノール成分をSep-pak C18 を用いた固相抽出法により精製した。
【００３４】
−抗酸化試験法
抗酸化試験法は以下の通りとした。
即ち、基質溶液（４％リノール酸含有エタノール）５ｍｌにリン酸緩衝液(pH7.0) ４ｍｌと試験液１ｍｌを密栓試験管中で混和した後、５０℃の恒温槽中に遮光保存した。この際、コントロールとして基質の代わりにエタノールを添加したもの、またブランクとして試料溶媒を試料の代わりに添加したものを、同条件下で保存した。
【００３５】
保存期間中、反応液を経時的にサンプリングし、生成した過酸化物をイソチオシアネート法（ロダン鉄法）により定量した。
【００３６】
−測定結果
リンゴ（ふじ）の未熟果と成熟果の抽出物について抗酸化性の有無を調べた。「ふじ」未熟果と成熟果の抽出液を1-1000μl/gLA の範囲で反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）と添加濃度のグラフを図２に示した。
これより、「ふじ」未熟果と成熟果のいずれの抽出物においてもリノール酸に対する抗酸化作用が認められたが、特に未熟果抽出物に強力な作用が認められた。
【００３７】
続いて、この強力な活性成分がどのような物質であるか探る目的で、未熟果と成熟果の抽出物をSep-pak C18 によりおおまかに２つに分画した（画分Ａ：Sep-pak C18 非吸着画分。画分Ｂ：Sep-pak C18 吸着画分（ポリフェノール画分））。抽出物ならびに各画分を1 −1000μl/gLA の範囲で反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値) と添加濃度のグラフを図３に示した。
【００３８】
この結果、成熟果抽出物の抗酸化性は画分Ｂの成分に由来するものであることが判明した。未熟果抽出物では画分Ａ，Ｂ共に抗酸化作用が見られたが画分Ｂのほうが強力な作用を示した。
以上の結果から、両抽出物において観察される抗酸化性は主として画分Ｂの成分、すなわちポリフェノール化合物の存在に起因することが強く示唆された。
【００３９】
さらにリンゴに含まれる単純ポリフェノール化合物のうち、純品が入手できるものについて抗酸化性の有無を検討した。各物質２μmol/gLA を反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）の比較グラフを図４に示した。
図４ではポリフェノール化合物以外にも、比較物質として既知抗酸化剤のBHA、BHT、ビタミンＥの３種類について、また先の画分Ａ中の代表的な成分としてキナ酸、リンゴ酸、γ−アミノ酪酸(GABA)についても検討した。
【００４０】
その結果、ポリフェノール化合物のうちカフェー酸、クロロゲン酸、(+)-カテキン、(-)-エピカテキン、ケルセチン、ルチン(quercetin-3-glu-rha) の６種類は、BHA やBHT に匹敵する抗酸化力を有していた。しかし同じポリフェノール化合物でもｐ−クマル酸やフロレチン、フロリジンには全く抗酸化作用が見られなかった。また画分Ａ中の諸成分にも抗酸化作用を有するものは見られなかった。なお、リンゴにおける各成分の含有量と抗酸化力の比較より、リンゴ未熟果の抽出液及び果汁液の発揮する強い抗酸化作用は、主としてクロロゲン酸、(+)-カテキン、(-)-エピカテキンの存在によるものと推定できた。
【００４１】
これまでの結果より、リンゴ（ふじ）の未熟果には強い抗酸化作用があること、およびその活性成分を明らかにした。
続いて「ふじ」以外のリンゴの未熟果も同様の作用を有するかどうかについて検討した。
各種リンゴ未熟果（「ふじ」「津軽」「ジョナゴールド」「北斗」「王林」）の抽出液の画分Ｂ（ポリフェノール画分）について、各画分を1-500 μl/gLA の範囲で反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）と添加濃度のグラフを図５に示した。
【００４２】
図５には対照として「ふじ」の成熟果の結果も加えて示した。
その結果、いずれのリンゴ品種においても強い抗酸化性が認められ、品種の違いによる抗酸化力の差はほとんど見られなかった。
【００４３】
さらに、リンゴ以外の果実未熟果の抗酸化作用についても検討した。
各種果実未熟果（リンゴ「ふじ」、ナシ「豊水」、モモ「あかつき」）の抽出液の画分Ｂ（ポリフェノール画分）について、各画分を1-500 μl/gLA の範囲で反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）と添加濃度のグラフを図６に示した。
【００４４】
その結果、モモ未熟果はリンゴ未熟果とほぼ同等の抗酸化力を有すること、またナシ未熟果はリンゴ程ではないがかなり強い抗酸化力を有することが判明した。
【００４５】
（実施例３）
［果実未熟果ポリフェノールのアンジオテンシンＩ変換酵素(ACE) 阻害作用］−原料 原料素材としては以下の果実を使用した。
リンゴ未熟果：実施例２と同様
−試料調製：実施例２と同様に「抽出試料」と「ポリフェノール画分」を調製した。
【００４６】
−ＡＣＥ阻害試験法
ＡＣＥ阻害試験は常法に従って行った。
すなわち市販ＡＣＥ溶液に試料溶液を加え、プレインキュベーション後、基質としてBz-Gly-His-Leuを添加し反応させた。反応により生じたHis 断片をオルトフタルジアルデヒドで蛍光ラベル化した後、蛍光強度（Ex.360nm、Em.490nm) を測定した。
【００４７】
この時、被験液の蛍光強度をＳ、試料の代わりに水を加えたときの値をＣ、Ｓの酵素ブランク（酵素の代わりに水を加えたもの）の値をＳB、Ｃの酵素ブランクの値をＣB とし、｛１−（Ｓ−ＳB)/(C-CB)}×100(%)としてＡＣＥ阻害活性度を表わした。
【００４８】
−測定結果−
リンゴ未熟果と成熟果（いずれも「ふじ」）の抽出物を、Sep-pak C18 を用いて、非吸着画分（→画分Ａ）とポリフェノール画分（→画分Ｂ）に分画した。各画分のＡＣＥ阻害活性を調べた。結果を図７に示した。
その結果、未熟果・成熟果のいずれにおいても画分Ｂに強いＡＣＥ阻害活性が見られた。特に未熟果の画分Ｂでは１００％阻害が観察されたが、両者の阻害活性の強さをさらに詳しく比較するために、反応系へ添加する両者の画分Ｂの添加量を変化させた場合のＡＣＥ阻害活性の変動を調べた。結果を図８に示した。
【００４９】
その結果、成熟果の画分ＢのＡＣＥに対する５０％阻害濃度(IC50)が約３ulであったのに対し、未熟果の画分Ｂは０．１ul以下と非常に強い活性を示した。
未熟果におけるこの強い阻害活性は「ふじ」以外の栽培品種においても同様に観察された。
以上の結果より、リンゴ未熟果にはＡＣＥに対する強力な阻害物質が存在し、その活性本体はポリフェノール化合物であることが強く示唆された。なお、ナシとモモ未熟果のＡＣＥ阻害活性はリンゴに比べて弱いものであった。
【００５０】
次に、リンゴ未熟果中より見出され、かつ純品が入手可能な単純ポリフェノール化合物について、ＡＣＥの阻害活性の有無を検討した。具体的には、物質間の活性の強さを比較できるように、反応系へ添加する各物質の添加濃度を変化させた場合のＡＣＥ阻害活性の変動を調べた。結果を図９に示した。
【００５１】
図９では比較のため、既にＡＣＥ阻害活性を有することが知られている茶のカテキン類についても測定を行った。その結果、(-)-エピガロカテキンガレート(EGCg)と(-)-エピカテキンガレート(ECg) のIC50値がそれぞれ0.3mM、2mM であり、強い阻害活性を示した。また加工により茶葉中のGABA濃度を高めた「ギャバロン茶」が高血圧自然発症ラットを用いた実験で血圧降下作用を示したという報告があるが、本実験においてはGABAにはＡＣＥ阻害活性は全く見られなかった。
【００５２】
肝心のリンゴフェノール類は、いずれも高濃度では阻害活性を有していたものの、IC50値は低く、最も活性の強かったケルセチンでも約5mM であり、EGCgやECg よりも阻害活性ははるかに弱いものであった。
【００５３】
ここでリンゴ未熟果画分Ｂ中のポリフェノールが全てEGCgであると仮定し、EGCgの検量線により画分Ｂ中の総フェノール量を算出したところ、約15000ppmであり、画分Ｂのポリフェノール濃度はEGCg換算で33.82mM 相当であると計算された。この計算値を使用し、図９上に画分Ｂの活性曲線をプロットしたところ、EGCgを上回る(IC50=0.2 mM) 強力な阻害活性が認められた。実際上は画分Ｂ中にEGCgやECg は存在しておらず、また上述のとおり他の単純ポリフェノール類には顕著な阻害活性が見られない。図９において観察される未熟画分Ｂの強力なＡＣＥ阻害活性は、混在する他の未同定ポリフェノールの存在によるものであることが強く示唆された。
【００５４】
（実施例４）
［リンゴ未熟果ポリフェノール中のＡＣＥ阻害物質の同定］
−試料 実施例３と同様に、リンゴ「ふじ」未熟果より抽出試料を得て、さらに固相抽出法によりポリフェノール画分を精製し、以下の試料とした。
−実験方法
試料溶液をSephadex LH-20カラムに負荷した。カラムを蒸留水で洗浄後、２０％〜６０％メタノール（塩酸酸性）、７０％アセトン（塩酸酸性）を順時用いて、ポリフェノールを溶出・分画した。
得られた画分について、HPLC組成分析、総フェノール測定、ＡＣＥ阻害試験を行った。また必要に応じて、吸収スペクトル測定、ゲル浸透クロマトグラフィーを行った。
【００５５】
−実験結果
試料中のＡＣＥ阻害活性本体を他のポリフェノールから単離するための具体的手段としてSephadex LH-20 column による分画を試みた。実験により得られた溶出画分について、HPLCによる単純ポリフェノール分析とACE 阻害試験を行ったところ、６０％メタノール溶出時点で全ての単純ポリフェノール類が完全に溶出されたことを確認した。
【００５６】
ＡＣＥ阻害活性は次の溶出溶媒である７０％アセトン溶出画分に集中していた。
単離した画分は、溶媒を留去後、凍結乾燥し粉末化した。活性本体は水に易溶（水溶液はオレンジ色）であり画分Ｂ100ml から約０．７ｇ得られた。
次に得られた粉末を水に溶解し、分光光度計により吸収スペクトルを測定した。結果を図１０に示した。
【００５７】
得られたスペクトルは２８０ nm に極大吸収を示し、その形状は(+)-カテキンや(-)-エピカテキンと酷似していた。また同水溶液を120 ℃、１０分間オートクレープ処理したところ、液は赤色を呈し、アントシアニジンが生成したものと思われた。これらの結果より活性本体は、縮合型タンニンとして知られるプロシアニジン類（カテキン類の規則的な重合体）であることが強く示唆された。しかし先のSephadex LH-20における溶出挙動ならびにシリカゲル HPTLCにおける溶出挙動などから、本物質はプロシアニジンＢ2 のような二量体程度の重合度ではなく、より高次のポリマー物質であることが推定された。
【００５８】
そこで本物質につき、GPC による分子量測定を試みた。一般にポリフェノール化合物は疎水結合や水素結合によるカラム充填剤との親和性が強いため、通常タンパク質等で使用される水系でのGFC(Gel Filtration Chromatography)による分子量測定は困難とされる。そこで活性本体のフェノール性水酸基をピリジン／無水酢酸によりアセチル化して有機溶媒に可溶とした後、有機溶媒(THF) 中でのGPC 分析を試みた。結果を図１１に示した。
【００５９】
その結果、クロマトグラム上にブロードな単一ピークが現れ、同時に作成したポリスチレンによる分子量較正曲線より、本物質の平均分子量は約2000であると算出された。
なお、ここでは示さないが他の実験（トルエン−α−チオールによる部分分解、FAB-MS測定など）結果も加味した上で、現時点において推定されるＡＣＥ阻害活性物質の構造式を図１２に示した。
これより本物質は縮合型タンニンの一種であると判定された。
【００６０】
また、精製ポリフェノール画分をSephadex LH-20で分画する際に、分画前（すなわち精製ポリフェノール画分）と分画後（７０％アセトン溶出画分：すなわち縮合型タンニン画分）について総フェノール量を測定し、値を比較した。結果を表２に示した。
【００６１】
【表２】
【００６２】
これより、リンゴ未熟果中の全ポリフェノールの約半分が、この縮合型タンニンであり量的に最も多い成分であることが判明した。
なお、本物質のＡＣＥに対するIC50を算出したところ、重量比較でEGCgのIC50の約1/10以下と非常に低い値であり、すなわち本物質が非常に強力なＡＣＥ阻害活性物質であることが確認できた。
以上の結果より、リンゴ未熟果ポリフェノールが強力なＡＣＥ阻害活性剤になりうると判断できた。
【００６３】
（実施例５）
［未熟果実ポリフェノールの製造例］
リンゴ未熟果実（５〜１０ｇ／個）約５０ｋｇにSO2 を適量添加しながら破砕機にて破砕し、オイルプレスで圧搾した。得られた果汁にペクチン分解酵素を約５０ｐｐｍ添加し、遠心分離またはケイソウ土濾過を施し、さらに精密濾過を施すことにより清澄果汁３５Ｌを得た。次いで、この清澄果汁をスチレン−ジビニルベンゼン系の工業用合成吸着樹脂（６Ｌ）を充填したカラムに通液した。さらに０．１％ＨＣｌ含有水を６Ｌ通して糖類を除去した後、０．１％ＨＣｌ含有５０％エタノールで溶出させ、主要なポリフェノール画分３Ｌを得た。
【００６４】
得られた画分をエバポレーターで減圧濃縮して濃縮画分１．５Ｌとし、噴霧乾燥機にて乾燥させ、リンゴ未熟果実ポリフェノール粉末製剤２２８．２ｇを得た。
回収率に関するデータを以下に記した。
【００６５】
カラム回収率；９５．６％
噴霧乾燥回収率；９３．０％
果汁からの回収率；０．６５％
果汁中ポリフェノールからの粉末回収率；８８．９％
【００６６】
（実施例６）
［果実未熟果ポリフェノールの抗変異原性作用］
本実施例に於いて、抗変異原性の測定はエイムス法（Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３１，ｐ３４７、１９７５年）の改変法で行った。
−原料ならびに試料調製
実施例２、３、４と同様。ただし実施例４で得られた「縮合型タンニン」を以下「リンゴタンニン」と略す。
【００６７】
−抗変異原性測定法
変異原生物質（ベンゾ（ａ）ピレン、Ｔｒｐ−Ｐ−２）溶液にリン酸緩衝液、試料溶液、Ｓ９−ｍｉｘ、サルモネラ菌（Salmonella typhimurium ＴＡ９８またはＴＡ１００）一晩培養液を混和し、３７℃で２日間培養後、出現したコロニー数をカウントした。各ポリフェノールは１〜３００（μｇ／plate ）の間で等比級数的濃度勾配をとり、変異原性抑制活性率は、以下の式で算出した。
【００６８】
変異原性抑制活性率＝｛（Ｃ−Ｂ）−（Ｓ−Ｂ）｝／（Ｃ−Ｂ）×１００（％）
【００６９】
この時、被検液のコロニー数をＳ、試料の代わりに水を加えたコントロールをＣ、試料と変異原の代わりに水を加えたブランクをＢとした。
【００７０】
−結果
各種ポリフェノールとリンゴタンニンに関して、Ｔｒｐ−Ｐ−２に対する変異原性抑制活性率を図１３に、ベンゾ（ａ）ピレンに対する変異原性抑制活性率を図１４に示した。縦軸は変異原性抑制活性率で、自然復帰（ブランク）と同等にまで抑制したものを１００％とした。横軸は、プレート１枚当たりのサンプル量を示した。
【００７１】
その結果、リンゴタンニンは各変異原に対し濃度依存的にその変異原性を抑制し、またエピガロカテキンガレートと同等かより低濃度領域で抑制効果を示した。本実験の条件ではＴｒｐ−Ｐ−２、１μｇに対してリンゴタンニンは約１７μｇ（エピガロカテキンガレートは約５１μｇ）、ベンゾ（ａ）ピレン５μｇに対しては約３７μｇ（同約５６μｇ）で、５０％の変異原性抑制活性を示した。 すなわちこのポリフェノールには、変異原性物質（発ガン性物質）に作用させると、その変異原性を強く抑制する成分が多量に含まれていた。従って、本発明で得られる果実ポリフェノールは抗変異原性作用剤としても極めて有効である。
【００７２】
（実施例７）
［果実未熟果ポリフェノールのヒアルロニダーゼ阻害作用ならびにヒスタミン遊離抑制作用］
本実施例に於いて、アレルギー抑制作用は、ヒアルロニダーゼ阻害活性度ならびに動物細胞を用いたヒスタミン遊離抑制作用を指標とすることで測定した。
−原料 リンゴ未熟果、ナシ未熟果、モモ未熟果、リンゴ成熟果
−試料調製
実施例２と同様に各果実抽出物を調製し、さらに「ポリフェノール画分」をセファデックス(Sephadex) LH-20で精製したものをリンゴタンニンとした。
【００７３】
−ヒアルロニダーゼ阻害活性測定法
ヒアルロニダーゼ阻害活性測定法は基本的にＪ．Ｂｉｏｌ．，vol.２５０，ｐ７９，１９７５年の改変法で行った。すなわち市販ヒアルロニダーゼ溶液に試料溶液を加え、プレインキュベーション後、ヒスタミン遊離剤のコンパウンド４８／８０溶液を加え、３７℃でヒアルロニダーゼの活性化を行い、基質としてヒアルロン酸溶液を添加し反応させた。
反応で生じたＮ−アセチルグルコサミンをモルガン・エルソン法により発色させ、吸光度（５８６ｎｍ）で測定し、以下の式でヒアルロニダーゼ阻害活性率を算出した。
【００７４】
ヒアルロニダーゼ阻害活性率＝｛（Ｃ−ＣB）−（Ｓ−ＳB）｝／（Ｃ−ＣB）×１００（％）
【００７５】
この時、被検液の吸光度をＳ、試料の代わりに緩衝液を加えたものをＣ、Ｓの酵素ブランクをＳB、Ｃの酵素ブランクをＣBとした。
【００７６】
−ヒスタミン遊離抑制活性測定法
ヒスタミン遊離抑制活性測定法はJ.Food Hyg. Soc.Japan,vol.35,p497,1994年の方法で行った。即ち、ラット好塩基球白血病細胞ＲＢＬ−２Ｈ３を１０％ＦＢＳ，α−ＭＥＭ培地で培養（３７℃、５％ＣＯ2）し、抗体ＤＮＰ−ｌｇＥを９０分間作用させ、ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、抗原ＤＮＰ−ＢＳＡを３５分間作用させる。リンゴの成分は抗体あるいは抗原作用時に添加する。反応停止のため氷冷ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒを加え、細胞外液をとり、過塩素酸を添加、冷却後遠心分離した後、０．４５μ濾過したものをＨＰＬＣで分析し、細胞から遊離されたヒスタミン量を測定した。ヒスタミン遊離抑制活性は以下の式で算出した。
【００７７】
ヒスタミン遊離抑制活性率＝｛（Ｃ−Ｂ）−（Ｓ−Ｂ）｝／（Ｃ−Ｂ）×１００（％）
【００７８】
この時、被検液のヒスタミン量をＳ、試料の代わりにＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒを加えたものをＣ、抗体あるいは抗原を加えないブランクをＢとした。
【００７９】
−結果
各果実エキスおよびクロモグリク酸ナトリウムとリンゴタンニンに関してヒアルロニダーゼ阻害活性率を図１５および図１６に示した。
その結果、各果実エキスおよびリンゴタンニンは濃度依存的にヒアルロニダーゼを阻害しその活性が認められた。対照とした合成抗アレルギー剤のクロモグリク酸ナトリウムと比較したところ、５０％活性を阻害する濃度であるＩＣ５０値に関してはクロモグリク酸ナトリウムが約０．０５１ｍｇ／ｍｌであるのに対し、リンゴタンニンは約０．０８６ｍｇ／ｍｌと近い値であった。
【００８０】
又、各果実エキスおよびリンゴタンニンに関する抗原ＤＮＰ−ＢＳＡ作用時、抗体ＤＮＰ−ｌｇＥ作用時のヒスタミン遊離抑制活性率を図１７および図１８に示した。これらの結果から明らかなように、ポリフェノール画分に含まれるリンゴタンニンは濃度依存的にヒスタミン遊離抑制活性が認められた。
以上のことから、このポリフェノールには、Ｉ型アレルギーに関する酵素であるヒアルロニダーゼの働きを阻害する作用を有する成分、ならびにヒスタミン遊離抑制作用を有する成分が多量に含まれていた。従って、本発明で得られる果実ポリフェノールはアレルギー抑制剤としても極めて有効である。
【００８１】
（実施例８）
［果実未熟果ポリフェノールのグルコシルトランスフェラーゼ阻害作用］
本実施例においては、う蝕菌の代表種のひとつであるS.sobrinusが産生する、不溶性グルカン生成ＧＴａｓｅに対する果実ポリフェノールの阻害能について検討した。
−原料および試料調製
実施例６、７と同様
−使用菌体；Streptococcus sobrinus ＡＴＣＣ ３３４７８
【００８２】
−ＧＴａｓｅの調製；S.sobrinusのＧＴａｓｅは以下の方法にて調製した。
S.sobrinusをＴＴＹ培地（Agric.Biol.Chem.,54(11),2925-2929,1990）で３７℃、１８時間培養後、遠心分離により菌体を除き上清を得た。この上清に５０％飽和まで硫酸アンモニウムを添加した後、遠心分離により生じた沈澱を回収した。沈澱は０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で再溶解した後、同緩衝液で透析した。透析液中のＧＴａｓｅはヒドロキシルアパタイトクロマトグラフ法により精製、回収した。このとき約０．４Ｍのリン酸緩衝液濃度で不溶性グルカン生成ＧＴａｓｅは溶出した。溶出画分を回収し、以下の実験に供した。
【００８３】
−ＧＴａｓｅ阻害活性測定法
１ｍｌの基質溶液（２％ショ糖、０．１％アジ化ナトリウム、４０μＭデキストランＴ１０含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５））に精製ＧＴａｓｅ溶液と試料溶液を添加し、水で全量２ｍｌに希釈した後、３７℃で１８時間反応させた。反応により生じた不溶性グルカン量を５５０ｎｍの吸光度で示される濁度として測定し、下記の式より生成率を算出した。
不溶性グルカン生成率＝（ＳＳ−ＳＢ）／（ＣＳ−ＣＢ）×１００（％）
ＳＳ：サンプル
ＳＢ：サンプルの酵素ブランク
ＣＳ：コントロール
ＣＢ：コントロールの酵素ブランク
【００８４】
−結果
各果実抽出物のポリフェノール画分、ならびに各ポリフェノール成分のＧＴａｓｅ阻害活性を図１９、２０に示した。縦軸は不溶性グルカンの生成率で、試料無添加のコントロールにおける生成量を１００％として算出した。横軸は反応系への試料もしくはポリフェノールの添加量を容量もしくは濃度で示した。
図１９に示したとおり、各種果実抽出物のポリフェノール画分のうち、特に「ふじ」未熟果と「新高」未熟果のポリフェノール画分に顕著なＧＴａｓｅ阻害活性が見られた。この時、「ふじ」成熟果のＧＴａｓｅに対する５０％阻害量が約５０μｌであるのに対して「ふじ」未熟果のそれは約０．７μｌであることから、リンゴの未熟果は成熟果よりも約７０倍強力なＧＴａｓｅ阻害活性を有していることが判明した。
【００８５】
次にリンゴに含まれる成分を中心に各種ポリフェノール成分のＧＴａｓｅ阻害活性について検討した。図２０に示したとおり、リンゴ中の成分のうち、クロロゲン酸とフロリジンのＧＴａｓｅ阻害活性はごく弱いものであった。一方、各種カテキン類のうち、エピカテキンモノマーの阻害活性は微弱であったのに対し、図１２の推定化学構造式で示される高分子エピカテキン重合体（図２０ではリンゴタンニンと表記）は強力なＧＴａｓｅ阻害活性を有していることが判明した。図２０では対照として、既にＧＴａｓｅ阻害物質であることが知られている緑茶の代表的カテキン類であるエピカテキンガレート（Agric.Biol.Chem.,5(11),2925-2929,1990,Chem.Pharm.Bull.,38(39,717-720,1990)の結果も同時に示したが、エピカテキンガレートのＧＴａｓｅに対する５０％阻害濃度が約２００ｐｐｍであるのに対して、リンゴタンニンのそれは約２ｐｐｍと約１００倍程度強力であると算出された。これらの結果よりまた、図１９で見られた「ふじ」未熟果の強力なＧＴａｓｅ阻害活性は本物質の存在によるものと推定された。
以上の結果より、本発明で得られる果実ポリフェノールは強力なＧＴａｓｅ阻害活性成分を有することから、抗う蝕剤としても極めて有効であると考えられる。
【００８６】
（実施例９）
［果実未熟果ポリフェノールの消臭効果］
本実施例における消臭効果試験は、宇井らの方法（日食工誌、38,1098-1102,1991）の改変法で行った。
−試料
実施例２に記載のリンゴ未熟果実果汁より精製したポリフェノール画分の噴霧乾燥品（リンゴポリフェノール粉末製剤）を使用した。さらに比較対照として、既知消臭物質である市販緑茶ポリフェノール製剤と銅クロロフィリンナトリウムを使用した。
【００８７】
−消臭効果試験法
予め氷冷下で１ｐｐｍメチルメルカプタン溶液および１ｐｐｍ硫化ジメチル溶液を調製した。内容量３０ｍｌのバイアル瓶中に各濃度の試料を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌを入れ（比較対照は試料無添加）、これに１ｐｐｍメチルメルカプタン溶液１ｍｌ、または１ｐｐｍ硫化ジメチル溶液１ｍｌを加え、直ちに栓をして撹拌した。これを３７℃で５分間インキュベートした後、ヘッドスペースガス５ｍｌをＧＣに注入し、メチルメルカプタンもしくは硫化ジメチルのピーク高を測定した。
【００８８】
−測定結果
各試料について悪臭成分に対する消臭効果の有無を調べた。
試料を０．０５−０．５％もしくは０．０５−５％の範囲で反応系に添加したときのヘッドスペースガス中のメチルメルカプタンもしくは硫化ジメチル濃度と試料添加濃度との関係を図２１、図２２に示した。
この結果から明らかなように、リンゴポリフェノール粉末製剤は濃度依存的にメチルメルカプタン、硫化ジメチルに対する消臭効果を有することが認められた。
【００８９】
（実施例１０）
［果実未熟果ポリフェノールの悪臭物質産生抑制効果］
本実施例における悪臭物質産生抑制効果試験は、宇井らの方法（日食工誌、38,1098-1102,1991）の改変法で行った。
−試料
実施例９と同様にリンゴポリフェノール粉末製剤、市販緑茶ポリフェノール製剤および銅クロロフィリンナトリウムを使用した。
【００９０】
−悪臭物質産生抑制効果試験法
予め唾液採集２時間前からの飲食を禁じた者から自然流出唾液を採取した。内容量３０ｍｌのバイアル瓶中に各濃度の試料および４０ｍＭのＬ−メチオニンを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌを入れ（比較対照は試料無添加）、これに予め採取した唾液１ｍｌを加え、直ちに栓をして撹拌した。これを３７℃で２４時間インキュベートした後、ヘッドスペースガス５ｍｌをＧＣに注入し、反応により産生したメチルメルカプタン、硫化ジメチルおよび二硫化ジメチルのピーク高を測定した。
【００９１】
−測定結果
各試料について悪臭物質産生抑制効果の有無を調べた。
試料を０．００１５−０．５％の範囲で反応系に添加したときのヘッドスペースガス中のメチルメルカプタン、硫化ジメチルおよび二硫化ジメチル濃度と試料添加濃度との関係を図２３〜図２５に示した。
この結果から明らかなように、リンゴポリフェノール粉末製剤は濃度依存的にメチルメルカプタン、硫化ジメチル、二硫化ジメチルに対する産生抑制効果を有することが認められた。
【００９２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、摘果作業が行われる時期に採取されるリンゴの未熟果実を原料とし、かつ特定の処理を施しているため、各種の生理作用、特に抗酸化性およびACE阻害活性を備えた果実ポリフェノールを提供することができる。
【００９３】
さらに、本発明によれば、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害作用を有するポリフェノール画分を有効成分とする血圧降下剤を提供することができる。
また、本発明によれば、変異原性抑制作用を有するポリフェノール画分を有効成分とする抗変異原性作用剤を提供することができる。
さらにまた、本発明によれば、ヒアルロニダーゼ阻害作用ならびにヒスタミン遊離抑制作用を有するポリフェノール画分を有効成分とするアレルギー抑制剤を提供することができる。
【００９４】
さらに、本発明によれば、グルコシルトランスフェラーゼ阻害活性を有するポリフェノール画分を有効成分とする抗う蝕剤を提供することができる。
さらにまた、本発明によれば、悪臭物質に対する消臭および悪臭物質産生抑制作用を有するポリフェノール画分を有効成分とする消臭剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】リンゴ未熟果ポリフェノールの波長可変クロマトグラムと各ピークの紫外部吸収スペクトルの比較を示すグラフ。
【図２】リンゴ「ふじ」抽出液を反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）と添加濃度の関係を示すグラフ。
【図３】リンゴ「ふじ」各画分を反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）と添加濃度の関係を示すグラフ。
【図４】ポリフェノール化合物を反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）の比較を示すグラフ。
【図５】各リンゴポリフェノール画分を反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）と添加濃度の関係を示すグラフ。
【図６】各未熟果ポリフェノール画分を反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）と添加濃度の関係を示すグラフ。
【図７】各画分のACE 阻害活性を示すグラフ。
【図８】画分Ｂの添加量を変化させた場合の ACE阻害活性を示すグラフ。
【図９】反応系へ添加する各物質の添加濃度を変化させた場合のACE 阻害活性を示すグラフ。
【図１０】単離した画分について分光光度計により測定した吸収スペクトルを示すグラフ。
【図１１】 GPC による分子量測定結果を示すグラフ。
【図１２】推定されるACE 阻害活性物質の構造式。
【図１３】Ｔｒｐ−Ｐ−２に対するポリフェノールの変異原性抑制活性を示すグラフ。
【図１４】ベンゾ（ａ）ピレンに対するポリフェノールの変異原性抑制活性を示すグラフ。
【図１５】各種果実抽出物のヒアルロニダーゼ阻害活性を示すグラフ。
【図１６】抗アレルギー剤とリンゴタンニンのヒアルロニダーゼ阻害活性を示すグラフ。
【図１７】各果実エキスおよびリンゴタンニンに関する抗原ＤＮＰ−ＢＳＡ作用時、抗体ＤＮＰ−ｌｇＥ作用時のヒスタミン遊離抑制活性率を示すグラフ。
【図１８】リンゴタンニンに関する抗原ＤＮＰ−ＢＳＡ作用時、抗体ＤＮＰ−ｌｇＥ作用時のヒスタミン遊離抑制活性率を示すグラフ。
【図１９】各果実ポリフェノール画分を反応系に添加したときの、不溶性グルカン生成量と添加量の関係を示すグラフ。
【図２０】各ポリフェノール化合物を反応系に添加したときの、不溶性グルカン生成量と添加濃度の関係を示すグラフ。
【図２１】リンゴポリフェノール、緑茶ポリフェノール、銅クロロフィリンナトリウムを反応系に添加したときの、メチルメルカプタン残存量を示すグラフ。
【図２２】リンゴポリフェノール、緑茶ポリフェノール、銅クロロフィリンナトリウムを反応系に添加したときの、硫化ジメチル残存量を示すグラフ。
【図２３】リンゴポリフェノール、緑茶ポリフェノール、銅クロロフィリンナトリウムを反応系に添加したときの、メチルメルカプタン発生量を示すグラフ。
【図２４】リンゴポリフェノール、緑茶ポリフェノール、銅クロロフィリンナトリウムを反応系に添加したときの、硫化ジメチル発生量を示すグラフ。
【図２５】リンゴポリフェノール、緑茶ポリフェノール、銅クロロフィリンナトリウムを反応系に添加したときの、二硫化ジメチル発生量を示すグラフ。
【発明の属する技術分野】
本発明は果実ポリフェノールに係り、さらにはポリフェノール画分を有効成分とする酸化防止剤、血圧降下剤、抗変異原性作用剤、アレルギー抑制剤、抗う蝕剤及び消臭剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バラ科食用果実、特にリンゴ、ナシ、モモなどの果樹栽培過程において、通常５月中旬〜７月中旬にかけて「摘果（みすぐり）」と呼ばれる作業が行われる。作業内容は、受粉後房状に結実した果実がまだ未熟の段階のうちに、一部の果実を残し他を摘果廃棄するというものであるが、この作業により多量の未熟果実が未利用のまま廃棄処分されている。この未熟果実は成熟果実と比較して極めて苦く、また果実切断面は容易に褐変する。この事実は、未熟果実中にポリフェノール化合物が大量に存在することを示唆するものである。
【０００３】
ポリフェノール化合物は植物の二次代謝産物として植物界に普遍的かつ多種・多量に存在することで知られているが、これらのあるものは非常に多様な生理活性を示す点で古くより薬学の分野において、また近年の食品化学の分野において注目を集めている。
【０００４】
そのなかで、特に最近研究の集中している茶のポリフェノール（カテキン類）においては、抗菌、抗ウイルス、抗酸化、抗突然変異、抗癌、血小板凝集抑制、血圧上昇抑制、血糖上昇抑制、血中コレステロール低下、抗う蝕、抗アレルギー、腸内フローラ改善、消臭など非常に広範な生理作用を有することが認知されつつある。（特開昭６３−２１４１８３号公報、特開平２−６４９９号公報、特開平４−１７８３２０号公報等を参照）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このように、例えば茶から抽出したポリフェノールが広範な生理作用を有することが知られているが、本発明者は別の観点から検討を進め、より効率良く、しかも経済的にポリフェノールを製造するための原料の検索および製造方法、更には当該ポリフェノールの生理作用等を検討、確認した。
その結果、バラ科果実、特にリンゴ、ナシ、モモ等の未熟果実を原料とし、かつ特定の処理を施すことにより、各種の生理作用を備えたポリフェノールを効率よく製造できることを見出し、本発明に到達した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明によれば、摘果作業が行われる時期に採取されるリンゴの未熟果実より搾汁および／または抽出された画分の精製物から成り、その成分組成が、カフェー酸、カフェー酸エステル、ｐ−クマル酸、ｐ−クマル酸エステル、フロレチン、フロレチン配糖体、ケルセチン、ケルセチン配糖体、カテキン、エピカテキン及び高分子ポリフェノール化合物としてカテキン類の規則的な重合体である縮合型タンニン類を含み、以下に述べるような各種の生理活性を示すポリフェノール混合物が提供される。
【０００８】
また、本発明によれば、摘果作業が行われる時期に採取されるリンゴの未熟果実より搾汁および／または抽出された画分の精製物から成り、その成分組成が、単純ポリフェノール化合物としてカフェー酸誘導体、ｐ−クマル酸誘導体、フラバン−３−オール類、フラボノール類、ジヒドロカルコン類、及び高分子ポリフェノール化合物としてカテキン類の規則的な重合体である縮合型タンニン類を含む、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害作用を有するポリフェノール画分を有効成分とする血圧降下剤が提供される。
【０００９】
さらにまた、本発明によれば、摘果作業が行われる時期に採取されるリンゴの未熟果実より搾汁および／または抽出された画分の精製物から成り、その成分組成が、単純ポリフェノール化合物としてカフェー酸誘導体、ｐ−クマル酸誘導体、フラバン−３−オール類、フラボノール類、ジヒドロカルコン類、及び高分子ポリフェノール化合物としてカテキン類の規則的な重合体である縮合型タンニン類を含む、ヒアルロニダーゼ阻害作用ならびにヒスタミン遊離抑制作用を有するポリフェノール画分を有効成分とするアレルギー抑制剤が提供される。
さらにまた、本発明によれば、摘果作業が行われる時期に採取されるリンゴの未熟果実より搾汁および／または抽出された画分の精製物から成り、その成分組成が、単純ポリフェノール化合物としてカフェー酸誘導体、ｐ−クマル酸誘導体、フラバン−３−オール類、フラボノール類、ジヒドロカルコン類、及び高分子ポリフェノール化合物としてカテキン類の規則的な重合体である縮合型タンニン類を含む、グルコシルトランスフェラーゼ阻害活性を有するポリフェノール画分を有効成分とする抗う蝕剤が提供される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明における果実ポリフェノールは、上記のように、バラ科に属する果実、特にリンゴ、ナシ、モモの未熟果実の搾汁果汁、抽出液より精製されたポリフェノール画分からなるものであるが、このポリフェノール画分の精製は、搾汁果汁、抽出液を吸着剤で処理することにより行われ、吸着剤に吸着する画分（以下、吸着画分という）にポリフェノールは含有されている。そして吸着画分を含水アルコール（エタノール等）で溶出させることにより、ポリフェノール画分が精製される。
【００１２】
このポリフェノール画分は、次いで濃縮処理することにより液体製剤を得ることができる。
さらに、ポリフェノール画分の濃縮液を噴霧乾燥もしくは凍結乾燥処理することにより粉末製剤を得ることもできる。
【００１３】
本発明で用いる原料としては、バラ科に属する果実であるリンゴ、ナシまたはモモが挙げられ、特にリンゴが好ましい。また、果実としては、より多くのポリフェノール化合物を含有すること、および広範な生理作用を有する各種活性成分を多量に含むことから、リンゴ、ナシまたはモモの未熟果実を用いる。
【００１４】
搾汁方法としては原料を洗浄し、そのまま、または亜硫酸を添加しながら破砕、圧搾により搾汁果汁を得、好ましくはペクチン分解酵素を添加する。次いで遠心分離、濾過等の手段により清澄果汁を得る方法を挙げることができる。
また抽出方法としては、洗浄した原料をアルコール（エタノール、メタノール等）と混合して破砕し、そのまま浸漬及び圧搾、または加熱還流しながら抽出し、次いで減圧濃縮によりアルコールを留去した後、遠心分離及び濾過、または有機溶媒（ヘキサン、クロロホルム等）による分配及び濾過を行い、清澄抽出液を得る方法を挙げることができる。
【００１５】
精製方法としては、ポリフェノール類を選択的に吸着且つ溶離できる吸着剤、例えばスチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂、陰イオン交換樹脂、オクタデシル基化学結合型シリカゲル（ＯＤＳ）等を充填したカラムに、上記の清澄果汁又は清澄抽出液を通すことによりポリフェノール画分を吸着させる。次いで、蒸留水を通すことにより洗浄した後、２０〜１００％アルコール（例えばエタノール）溶液、好ましくは約５０％アルコール溶液をカラムに通すことによりポリフェノール画分が溶出、回収できる。得られたポリフェノール溶液を減圧濃縮することによりアルコールを留去し、果実ポリフェノール液体製剤（好ましくはリンゴ酸等の有機酸を添加）を得ることができる。さらに、液体製剤をそのままもしくはデキストリン等の粉末助剤を添加し、噴霧乾燥又は凍結乾燥を行い、果実ポリフェノール粉末製剤を得ることができる。
【００１６】
本発明で得られる果実ポリフェノールの組成としては、単純ポリフェノール化合物としてカフェー酸誘導体、ｐ−クマル酸誘導体、フラバン−３−オール類（カテキン類）、フラボノール類（ケルセチン配糖体類）、ジヒドロカルコン類（フロレチン配糖体類）など、また高分子ポリフェノール化合物として縮合型タンニン類など、により大部分が占められることを本発明者は確認している。
【００１７】
従って、本発明で得られる果実ポリフェノールは種々の生理機能を有する可能性があると考えられるが、本発明者が鋭意検討した結果、第一に、このポリフェノールには、植物油脂であるリノール酸の酸化を防止する作用を有する成分が多量に含まれていることを見出した。即ち、本発明で得られる果実ポリフェノールは酸化防止剤として極めて有効なものである。
【００１８】
また第二に、このポリフェノールには、血圧上昇に関連する酵素であるアンジオテンシンＩ変換酵素（以下、ＡＣＥという）の働きを阻害する作用を有する成分が多量に含まれていることを見出した。従って、本発明で得られる果実ポリフェノールは血圧降下剤としても極めて有効なものである。
【００１９】
そして、さらに本発明者は検討を進めて、果実ポリフェノール中のＡＣＥ阻害活性物質が何かを検索したところ、図１２の構造式で示される縮合型タンニンであることを確認した。
また、近年の多くの研究結果より発ガン性物質と変異原性物質に高い相関が認められ、発ガン性と変異原性は深い関連があるとされている。すなわち変異原性を抑制する物質は発ガン性を予防することが期待できる。そこで、本発明で得られる果実ポリフェノールが抗変異原性作用があるかどうかを確認したところ、その作用効果があることが判明した。従って、本発明で得られる果実ポリフェノールは抗変異原性作用剤としても極めて有効なものである。
【００２０】
さらに、ヒスタミンは様々なアレルギー症状を引き起こす生体内ケミカルメディエーターとして知られており、主に肥満細胞や好塩基球から脱顆粒によって遊離する。
ヒアルロニダアーゼは結合組織再構築における細胞活動の一貫を形成していると考えられている酵素であるが、近年の研究（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３３．ｐ６４２．１９８５、同．３３．１９８５，同．３３．ｐ３７８７．１９８５，同．３３．ｐ５０７９．１９８５，同．４０．１４３９．１９９２）によりヒアルロニダーゼ阻害活性と、肥満細胞からのヒスタミン遊離抑制活性が合成抗アレルギー剤（クロモグリク酸ナトリウムやトラニラスト）に於いて高い相関性を示し、これらの活性を測定することで天然物から数種の抗アレルギー物質が検索されている。そこで、本発明で得られる果実ポリフェノールがヒアルロニダーゼ阻害活性ならびにヒスタミン遊離抑制活性があるかどうかを確認したところ、その作用効果があることが判明した。従って、本発明で得られる果実ポリフェノールはアレルギー抑制剤としても極めて有効なものである。
【００２１】
さらにまた、今日では、う蝕（虫歯）はStreptococcus mutansを中心とする口腔連鎖球菌による細菌感染症の一種であることが確認されているが、う蝕発生過程の中でも歯垢形成は特に重要な要因と考えられている。
すなわち、食物中に含まれるショ糖から、う蝕菌の産生酵素グルコシルトランスフェラーゼ（以下、ＧＴａｓｅと略す）の作用により粘着性の不溶性グルカンが合成され、これを介して細菌が歯牙表面に付着し、生じた歯垢がう蝕の原因となる。
【００２２】
このことより、ＧＴａｓｅ活性を阻害する物質は効果的な抗う蝕剤として適用できることが期待されている（Appl.Env.Microbiol.,59(4),968-973,1993、Biosci.Biotech.Biochem.,56(5),766-768,1992、Agric.Biol.Chem.,54(11),2925-2929,1990、Chem.Pharm.Bull.,38(3),717-720,1990）。
そこで本発明においては、う蝕菌の代表種のひとつであるS.sobrinusが産生する、不溶性グルカン生成ＧＴａｓｅに対する果実ポリフェノールの阻害能について検討したところ、その作用効果があることが判明した。従って、本発明で得られる果実ポリフェノールは抗う蝕剤としても極めて有効なものである。
【００２３】
さらにまた、食品由来の悪臭成分の中で、口臭の強さと含有量が比例するのは、硫化水素、メチルメルカプタン、硫化ジメチル等揮発性硫黄化合物であるとされている（日歯周誌、17,233-245,1975）。なかでも、メチルメルカプタン濃度との間に強い相関が認められている（日歯周誌、18,1-12,1976及び歯学会報、76,1923,1976）。そこで、本発明で得られる果実ポリフェノールのメチルメルカプタン、硫化ジメチルに対する消臭効果を測定したところ、その作用効果があることが判明した。さらに、果実ポリフェノールのメチルメルカプタン、硫化ジメチルおよび二硫化ジメチルに対する産生抑制効果を測定したところ、その作用効果があることも判明した。従って、本発明で得られる果実ポリフェノールは消臭剤としても極めて有効なものである。
【００２４】
【実施例】
次に、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２５】
（実施例１）
［リンゴ未熟果果汁の成分分析］
以下の試料について一般成分分析を行った。
−試料 リンゴ（ふじ）成熟果：市販品（無袋栽培品）
リンゴ（ふじ）未熟果：６月中旬に採取
−試料処理法
果実試料に対し酸化防止剤として適量のメタ重亜硫酸カリウムを添加しながら、ミキサーで破砕・搾汁した。搾汁液は遠心分離・濾過により清澄果汁として、以下の測定に供した。
【００２６】
−測定項目（および方法）
−一個体平均重量（ｎ＝５０）
−搾汁率（％）
−ｐＨ
−酸度（リンゴ酸換算ｇ／ｌ）
−Ｂｒｉｘ
−総フェノール（クロロゲン酸換算、ｐｐｍ）
−総アスコルビン酸
−有機酸組成
−糖組成
−金属イオン組成
−遊離アミノ酸組成
測定結果を表１に示した。
【００２７】
【表１】
表１よりわかるように、リンゴ未熟果果汁は成熟果果汁と比較すると成分的に大きな差異が見られた。特に強調すべき点として、フェノール成分、アスコルビン酸、有機酸（特にキナ酸）、金属イオン、遊離アミノ酸（特にアスパラギン、フェニルアラニン、γ−アミノ酪酸）に富んでいるといえる。一方、糖類は非常に少なかった。
【００２９】
次にリンゴ未熟果のポリフェノール成分組成について、高速液体クロマトグラフ法により調べた。
測定試料は果実抽出液からポリフェノール成分を固相抽出法により精製したもの（実施例２を参照）を使用した。
測定結果を図１に示す。
【００３０】
これより、リンゴ未熟果の単純ポリフェノール化合物組成は、カフェー酸誘導体（クロロゲン酸他）、ｐ−クマル酸誘導体、フラバン−３−オール類（カテキン、エピカテキン、他）、フラボノール類（ケルセチン配糖体類）、ジヒドロカルコン類（フロレチン配糖体、特にフロリジン）で大半を占めることが判明した。量的にはクロロゲン酸、カテキン、エピカテキン、フロリジンが高含量であると推定された。
【００３１】
（実施例２）
［果実未熟果ポリフェノールの抗酸化作用］
−原料 原料素材としては以下の果実を使用した。
リンゴ成熟果：市販品（無袋栽培品）
リンゴ未熟果：６月中旬に採取
「ふじ」 − 平均重量 ４．９７ ｇ（ｎ＝５０）
「津軽」 − 平均重量 ７．８０ ｇ（ｎ＝５０）
「ジョナゴールド」− 平均重量 ３．８６ ｇ（ｎ＝５０）
「北斗」 − 平均重量 ３．３２ ｇ（ｎ＝５０）
「王林」 − 平均重量 １０．３４ ｇ（ｎ＝５０）
【００３２】
ナシ未熟果：６月上旬に採取
「豊水」−平均重量 ８．９８ｇ（ｎ＝５０）
モモ未熟果：６月上旬に採取。
「あかつき」−平均重量 ５．０３ｇ（ｎ＝５０）
【００３３】
−試料調製
果汁試料−実施例１と同様の処理により清澄果汁を得た。
抽出試料−抽出方法としては、原料４００ｇを１％塩酸酸性メタノールと共にホモジナイズした後、加熱還流しながら抽出し（３回）、抽出液を減圧濃縮してメタノールを留去後、クロロホルムを加えて分配し（２回）、水層を回収し、濾過後蒸留水で２００ｍｌにメスアップして抽出試料とした。
なお、必要に応じ、果汁試料、抽出試料からポリフェノール成分をSep-pak C18 を用いた固相抽出法により精製した。
【００３４】
−抗酸化試験法
抗酸化試験法は以下の通りとした。
即ち、基質溶液（４％リノール酸含有エタノール）５ｍｌにリン酸緩衝液(pH7.0) ４ｍｌと試験液１ｍｌを密栓試験管中で混和した後、５０℃の恒温槽中に遮光保存した。この際、コントロールとして基質の代わりにエタノールを添加したもの、またブランクとして試料溶媒を試料の代わりに添加したものを、同条件下で保存した。
【００３５】
保存期間中、反応液を経時的にサンプリングし、生成した過酸化物をイソチオシアネート法（ロダン鉄法）により定量した。
【００３６】
−測定結果
リンゴ（ふじ）の未熟果と成熟果の抽出物について抗酸化性の有無を調べた。「ふじ」未熟果と成熟果の抽出液を1-1000μl/gLA の範囲で反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）と添加濃度のグラフを図２に示した。
これより、「ふじ」未熟果と成熟果のいずれの抽出物においてもリノール酸に対する抗酸化作用が認められたが、特に未熟果抽出物に強力な作用が認められた。
【００３７】
続いて、この強力な活性成分がどのような物質であるか探る目的で、未熟果と成熟果の抽出物をSep-pak C18 によりおおまかに２つに分画した（画分Ａ：Sep-pak C18 非吸着画分。画分Ｂ：Sep-pak C18 吸着画分（ポリフェノール画分））。抽出物ならびに各画分を1 −1000μl/gLA の範囲で反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値) と添加濃度のグラフを図３に示した。
【００３８】
この結果、成熟果抽出物の抗酸化性は画分Ｂの成分に由来するものであることが判明した。未熟果抽出物では画分Ａ，Ｂ共に抗酸化作用が見られたが画分Ｂのほうが強力な作用を示した。
以上の結果から、両抽出物において観察される抗酸化性は主として画分Ｂの成分、すなわちポリフェノール化合物の存在に起因することが強く示唆された。
【００３９】
さらにリンゴに含まれる単純ポリフェノール化合物のうち、純品が入手できるものについて抗酸化性の有無を検討した。各物質２μmol/gLA を反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）の比較グラフを図４に示した。
図４ではポリフェノール化合物以外にも、比較物質として既知抗酸化剤のBHA、BHT、ビタミンＥの３種類について、また先の画分Ａ中の代表的な成分としてキナ酸、リンゴ酸、γ−アミノ酪酸(GABA)についても検討した。
【００４０】
その結果、ポリフェノール化合物のうちカフェー酸、クロロゲン酸、(+)-カテキン、(-)-エピカテキン、ケルセチン、ルチン(quercetin-3-glu-rha) の６種類は、BHA やBHT に匹敵する抗酸化力を有していた。しかし同じポリフェノール化合物でもｐ−クマル酸やフロレチン、フロリジンには全く抗酸化作用が見られなかった。また画分Ａ中の諸成分にも抗酸化作用を有するものは見られなかった。なお、リンゴにおける各成分の含有量と抗酸化力の比較より、リンゴ未熟果の抽出液及び果汁液の発揮する強い抗酸化作用は、主としてクロロゲン酸、(+)-カテキン、(-)-エピカテキンの存在によるものと推定できた。
【００４１】
これまでの結果より、リンゴ（ふじ）の未熟果には強い抗酸化作用があること、およびその活性成分を明らかにした。
続いて「ふじ」以外のリンゴの未熟果も同様の作用を有するかどうかについて検討した。
各種リンゴ未熟果（「ふじ」「津軽」「ジョナゴールド」「北斗」「王林」）の抽出液の画分Ｂ（ポリフェノール画分）について、各画分を1-500 μl/gLA の範囲で反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）と添加濃度のグラフを図５に示した。
【００４２】
図５には対照として「ふじ」の成熟果の結果も加えて示した。
その結果、いずれのリンゴ品種においても強い抗酸化性が認められ、品種の違いによる抗酸化力の差はほとんど見られなかった。
【００４３】
さらに、リンゴ以外の果実未熟果の抗酸化作用についても検討した。
各種果実未熟果（リンゴ「ふじ」、ナシ「豊水」、モモ「あかつき」）の抽出液の画分Ｂ（ポリフェノール画分）について、各画分を1-500 μl/gLA の範囲で反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）と添加濃度のグラフを図６に示した。
【００４４】
その結果、モモ未熟果はリンゴ未熟果とほぼ同等の抗酸化力を有すること、またナシ未熟果はリンゴ程ではないがかなり強い抗酸化力を有することが判明した。
【００４５】
（実施例３）
［果実未熟果ポリフェノールのアンジオテンシンＩ変換酵素(ACE) 阻害作用］−原料 原料素材としては以下の果実を使用した。
リンゴ未熟果：実施例２と同様
−試料調製：実施例２と同様に「抽出試料」と「ポリフェノール画分」を調製した。
【００４６】
−ＡＣＥ阻害試験法
ＡＣＥ阻害試験は常法に従って行った。
すなわち市販ＡＣＥ溶液に試料溶液を加え、プレインキュベーション後、基質としてBz-Gly-His-Leuを添加し反応させた。反応により生じたHis 断片をオルトフタルジアルデヒドで蛍光ラベル化した後、蛍光強度（Ex.360nm、Em.490nm) を測定した。
【００４７】
この時、被験液の蛍光強度をＳ、試料の代わりに水を加えたときの値をＣ、Ｓの酵素ブランク（酵素の代わりに水を加えたもの）の値をＳB、Ｃの酵素ブランクの値をＣB とし、｛１−（Ｓ−ＳB)/(C-CB)}×100(%)としてＡＣＥ阻害活性度を表わした。
【００４８】
−測定結果−
リンゴ未熟果と成熟果（いずれも「ふじ」）の抽出物を、Sep-pak C18 を用いて、非吸着画分（→画分Ａ）とポリフェノール画分（→画分Ｂ）に分画した。各画分のＡＣＥ阻害活性を調べた。結果を図７に示した。
その結果、未熟果・成熟果のいずれにおいても画分Ｂに強いＡＣＥ阻害活性が見られた。特に未熟果の画分Ｂでは１００％阻害が観察されたが、両者の阻害活性の強さをさらに詳しく比較するために、反応系へ添加する両者の画分Ｂの添加量を変化させた場合のＡＣＥ阻害活性の変動を調べた。結果を図８に示した。
【００４９】
その結果、成熟果の画分ＢのＡＣＥに対する５０％阻害濃度(IC50)が約３ulであったのに対し、未熟果の画分Ｂは０．１ul以下と非常に強い活性を示した。
未熟果におけるこの強い阻害活性は「ふじ」以外の栽培品種においても同様に観察された。
以上の結果より、リンゴ未熟果にはＡＣＥに対する強力な阻害物質が存在し、その活性本体はポリフェノール化合物であることが強く示唆された。なお、ナシとモモ未熟果のＡＣＥ阻害活性はリンゴに比べて弱いものであった。
【００５０】
次に、リンゴ未熟果中より見出され、かつ純品が入手可能な単純ポリフェノール化合物について、ＡＣＥの阻害活性の有無を検討した。具体的には、物質間の活性の強さを比較できるように、反応系へ添加する各物質の添加濃度を変化させた場合のＡＣＥ阻害活性の変動を調べた。結果を図９に示した。
【００５１】
図９では比較のため、既にＡＣＥ阻害活性を有することが知られている茶のカテキン類についても測定を行った。その結果、(-)-エピガロカテキンガレート(EGCg)と(-)-エピカテキンガレート(ECg) のIC50値がそれぞれ0.3mM、2mM であり、強い阻害活性を示した。また加工により茶葉中のGABA濃度を高めた「ギャバロン茶」が高血圧自然発症ラットを用いた実験で血圧降下作用を示したという報告があるが、本実験においてはGABAにはＡＣＥ阻害活性は全く見られなかった。
【００５２】
肝心のリンゴフェノール類は、いずれも高濃度では阻害活性を有していたものの、IC50値は低く、最も活性の強かったケルセチンでも約5mM であり、EGCgやECg よりも阻害活性ははるかに弱いものであった。
【００５３】
ここでリンゴ未熟果画分Ｂ中のポリフェノールが全てEGCgであると仮定し、EGCgの検量線により画分Ｂ中の総フェノール量を算出したところ、約15000ppmであり、画分Ｂのポリフェノール濃度はEGCg換算で33.82mM 相当であると計算された。この計算値を使用し、図９上に画分Ｂの活性曲線をプロットしたところ、EGCgを上回る(IC50=0.2 mM) 強力な阻害活性が認められた。実際上は画分Ｂ中にEGCgやECg は存在しておらず、また上述のとおり他の単純ポリフェノール類には顕著な阻害活性が見られない。図９において観察される未熟画分Ｂの強力なＡＣＥ阻害活性は、混在する他の未同定ポリフェノールの存在によるものであることが強く示唆された。
【００５４】
（実施例４）
［リンゴ未熟果ポリフェノール中のＡＣＥ阻害物質の同定］
−試料 実施例３と同様に、リンゴ「ふじ」未熟果より抽出試料を得て、さらに固相抽出法によりポリフェノール画分を精製し、以下の試料とした。
−実験方法
試料溶液をSephadex LH-20カラムに負荷した。カラムを蒸留水で洗浄後、２０％〜６０％メタノール（塩酸酸性）、７０％アセトン（塩酸酸性）を順時用いて、ポリフェノールを溶出・分画した。
得られた画分について、HPLC組成分析、総フェノール測定、ＡＣＥ阻害試験を行った。また必要に応じて、吸収スペクトル測定、ゲル浸透クロマトグラフィーを行った。
【００５５】
−実験結果
試料中のＡＣＥ阻害活性本体を他のポリフェノールから単離するための具体的手段としてSephadex LH-20 column による分画を試みた。実験により得られた溶出画分について、HPLCによる単純ポリフェノール分析とACE 阻害試験を行ったところ、６０％メタノール溶出時点で全ての単純ポリフェノール類が完全に溶出されたことを確認した。
【００５６】
ＡＣＥ阻害活性は次の溶出溶媒である７０％アセトン溶出画分に集中していた。
単離した画分は、溶媒を留去後、凍結乾燥し粉末化した。活性本体は水に易溶（水溶液はオレンジ色）であり画分Ｂ100ml から約０．７ｇ得られた。
次に得られた粉末を水に溶解し、分光光度計により吸収スペクトルを測定した。結果を図１０に示した。
【００５７】
得られたスペクトルは２８０ nm に極大吸収を示し、その形状は(+)-カテキンや(-)-エピカテキンと酷似していた。また同水溶液を120 ℃、１０分間オートクレープ処理したところ、液は赤色を呈し、アントシアニジンが生成したものと思われた。これらの結果より活性本体は、縮合型タンニンとして知られるプロシアニジン類（カテキン類の規則的な重合体）であることが強く示唆された。しかし先のSephadex LH-20における溶出挙動ならびにシリカゲル HPTLCにおける溶出挙動などから、本物質はプロシアニジンＢ2 のような二量体程度の重合度ではなく、より高次のポリマー物質であることが推定された。
【００５８】
そこで本物質につき、GPC による分子量測定を試みた。一般にポリフェノール化合物は疎水結合や水素結合によるカラム充填剤との親和性が強いため、通常タンパク質等で使用される水系でのGFC(Gel Filtration Chromatography)による分子量測定は困難とされる。そこで活性本体のフェノール性水酸基をピリジン／無水酢酸によりアセチル化して有機溶媒に可溶とした後、有機溶媒(THF) 中でのGPC 分析を試みた。結果を図１１に示した。
【００５９】
その結果、クロマトグラム上にブロードな単一ピークが現れ、同時に作成したポリスチレンによる分子量較正曲線より、本物質の平均分子量は約2000であると算出された。
なお、ここでは示さないが他の実験（トルエン−α−チオールによる部分分解、FAB-MS測定など）結果も加味した上で、現時点において推定されるＡＣＥ阻害活性物質の構造式を図１２に示した。
これより本物質は縮合型タンニンの一種であると判定された。
【００６０】
また、精製ポリフェノール画分をSephadex LH-20で分画する際に、分画前（すなわち精製ポリフェノール画分）と分画後（７０％アセトン溶出画分：すなわち縮合型タンニン画分）について総フェノール量を測定し、値を比較した。結果を表２に示した。
【００６１】
【表２】
これより、リンゴ未熟果中の全ポリフェノールの約半分が、この縮合型タンニンであり量的に最も多い成分であることが判明した。
なお、本物質のＡＣＥに対するIC50を算出したところ、重量比較でEGCgのIC50の約1/10以下と非常に低い値であり、すなわち本物質が非常に強力なＡＣＥ阻害活性物質であることが確認できた。
以上の結果より、リンゴ未熟果ポリフェノールが強力なＡＣＥ阻害活性剤になりうると判断できた。
【００６３】
（実施例５）
［未熟果実ポリフェノールの製造例］
リンゴ未熟果実（５〜１０ｇ／個）約５０ｋｇにSO2 を適量添加しながら破砕機にて破砕し、オイルプレスで圧搾した。得られた果汁にペクチン分解酵素を約５０ｐｐｍ添加し、遠心分離またはケイソウ土濾過を施し、さらに精密濾過を施すことにより清澄果汁３５Ｌを得た。次いで、この清澄果汁をスチレン−ジビニルベンゼン系の工業用合成吸着樹脂（６Ｌ）を充填したカラムに通液した。さらに０．１％ＨＣｌ含有水を６Ｌ通して糖類を除去した後、０．１％ＨＣｌ含有５０％エタノールで溶出させ、主要なポリフェノール画分３Ｌを得た。
【００６４】
得られた画分をエバポレーターで減圧濃縮して濃縮画分１．５Ｌとし、噴霧乾燥機にて乾燥させ、リンゴ未熟果実ポリフェノール粉末製剤２２８．２ｇを得た。
回収率に関するデータを以下に記した。
【００６５】
カラム回収率；９５．６％
噴霧乾燥回収率；９３．０％
果汁からの回収率；０．６５％
果汁中ポリフェノールからの粉末回収率；８８．９％
【００６６】
（実施例６）
［果実未熟果ポリフェノールの抗変異原性作用］
本実施例に於いて、抗変異原性の測定はエイムス法（Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３１，ｐ３４７、１９７５年）の改変法で行った。
−原料ならびに試料調製
実施例２、３、４と同様。ただし実施例４で得られた「縮合型タンニン」を以下「リンゴタンニン」と略す。
【００６７】
−抗変異原性測定法
変異原生物質（ベンゾ（ａ）ピレン、Ｔｒｐ−Ｐ−２）溶液にリン酸緩衝液、試料溶液、Ｓ９−ｍｉｘ、サルモネラ菌（Salmonella typhimurium ＴＡ９８またはＴＡ１００）一晩培養液を混和し、３７℃で２日間培養後、出現したコロニー数をカウントした。各ポリフェノールは１〜３００（μｇ／plate ）の間で等比級数的濃度勾配をとり、変異原性抑制活性率は、以下の式で算出した。
【００６８】
変異原性抑制活性率＝｛（Ｃ−Ｂ）−（Ｓ−Ｂ）｝／（Ｃ−Ｂ）×１００（％）
【００６９】
この時、被検液のコロニー数をＳ、試料の代わりに水を加えたコントロールをＣ、試料と変異原の代わりに水を加えたブランクをＢとした。
【００７０】
−結果
各種ポリフェノールとリンゴタンニンに関して、Ｔｒｐ−Ｐ−２に対する変異原性抑制活性率を図１３に、ベンゾ（ａ）ピレンに対する変異原性抑制活性率を図１４に示した。縦軸は変異原性抑制活性率で、自然復帰（ブランク）と同等にまで抑制したものを１００％とした。横軸は、プレート１枚当たりのサンプル量を示した。
【００７１】
その結果、リンゴタンニンは各変異原に対し濃度依存的にその変異原性を抑制し、またエピガロカテキンガレートと同等かより低濃度領域で抑制効果を示した。本実験の条件ではＴｒｐ−Ｐ−２、１μｇに対してリンゴタンニンは約１７μｇ（エピガロカテキンガレートは約５１μｇ）、ベンゾ（ａ）ピレン５μｇに対しては約３７μｇ（同約５６μｇ）で、５０％の変異原性抑制活性を示した。 すなわちこのポリフェノールには、変異原性物質（発ガン性物質）に作用させると、その変異原性を強く抑制する成分が多量に含まれていた。従って、本発明で得られる果実ポリフェノールは抗変異原性作用剤としても極めて有効である。
【００７２】
（実施例７）
［果実未熟果ポリフェノールのヒアルロニダーゼ阻害作用ならびにヒスタミン遊離抑制作用］
本実施例に於いて、アレルギー抑制作用は、ヒアルロニダーゼ阻害活性度ならびに動物細胞を用いたヒスタミン遊離抑制作用を指標とすることで測定した。
−原料 リンゴ未熟果、ナシ未熟果、モモ未熟果、リンゴ成熟果
−試料調製
実施例２と同様に各果実抽出物を調製し、さらに「ポリフェノール画分」をセファデックス(Sephadex) LH-20で精製したものをリンゴタンニンとした。
【００７３】
−ヒアルロニダーゼ阻害活性測定法
ヒアルロニダーゼ阻害活性測定法は基本的にＪ．Ｂｉｏｌ．，vol.２５０，ｐ７９，１９７５年の改変法で行った。すなわち市販ヒアルロニダーゼ溶液に試料溶液を加え、プレインキュベーション後、ヒスタミン遊離剤のコンパウンド４８／８０溶液を加え、３７℃でヒアルロニダーゼの活性化を行い、基質としてヒアルロン酸溶液を添加し反応させた。
反応で生じたＮ−アセチルグルコサミンをモルガン・エルソン法により発色させ、吸光度（５８６ｎｍ）で測定し、以下の式でヒアルロニダーゼ阻害活性率を算出した。
【００７４】
ヒアルロニダーゼ阻害活性率＝｛（Ｃ−ＣB）−（Ｓ−ＳB）｝／（Ｃ−ＣB）×１００（％）
【００７５】
この時、被検液の吸光度をＳ、試料の代わりに緩衝液を加えたものをＣ、Ｓの酵素ブランクをＳB、Ｃの酵素ブランクをＣBとした。
【００７６】
−ヒスタミン遊離抑制活性測定法
ヒスタミン遊離抑制活性測定法はJ.Food Hyg. Soc.Japan,vol.35,p497,1994年の方法で行った。即ち、ラット好塩基球白血病細胞ＲＢＬ−２Ｈ３を１０％ＦＢＳ，α−ＭＥＭ培地で培養（３７℃、５％ＣＯ2）し、抗体ＤＮＰ−ｌｇＥを９０分間作用させ、ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、抗原ＤＮＰ−ＢＳＡを３５分間作用させる。リンゴの成分は抗体あるいは抗原作用時に添加する。反応停止のため氷冷ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒを加え、細胞外液をとり、過塩素酸を添加、冷却後遠心分離した後、０．４５μ濾過したものをＨＰＬＣで分析し、細胞から遊離されたヒスタミン量を測定した。ヒスタミン遊離抑制活性は以下の式で算出した。
【００７７】
ヒスタミン遊離抑制活性率＝｛（Ｃ−Ｂ）−（Ｓ−Ｂ）｝／（Ｃ−Ｂ）×１００（％）
【００７８】
この時、被検液のヒスタミン量をＳ、試料の代わりにＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒを加えたものをＣ、抗体あるいは抗原を加えないブランクをＢとした。
【００７９】
−結果
各果実エキスおよびクロモグリク酸ナトリウムとリンゴタンニンに関してヒアルロニダーゼ阻害活性率を図１５および図１６に示した。
その結果、各果実エキスおよびリンゴタンニンは濃度依存的にヒアルロニダーゼを阻害しその活性が認められた。対照とした合成抗アレルギー剤のクロモグリク酸ナトリウムと比較したところ、５０％活性を阻害する濃度であるＩＣ５０値に関してはクロモグリク酸ナトリウムが約０．０５１ｍｇ／ｍｌであるのに対し、リンゴタンニンは約０．０８６ｍｇ／ｍｌと近い値であった。
【００８０】
又、各果実エキスおよびリンゴタンニンに関する抗原ＤＮＰ−ＢＳＡ作用時、抗体ＤＮＰ−ｌｇＥ作用時のヒスタミン遊離抑制活性率を図１７および図１８に示した。これらの結果から明らかなように、ポリフェノール画分に含まれるリンゴタンニンは濃度依存的にヒスタミン遊離抑制活性が認められた。
以上のことから、このポリフェノールには、Ｉ型アレルギーに関する酵素であるヒアルロニダーゼの働きを阻害する作用を有する成分、ならびにヒスタミン遊離抑制作用を有する成分が多量に含まれていた。従って、本発明で得られる果実ポリフェノールはアレルギー抑制剤としても極めて有効である。
【００８１】
（実施例８）
［果実未熟果ポリフェノールのグルコシルトランスフェラーゼ阻害作用］
本実施例においては、う蝕菌の代表種のひとつであるS.sobrinusが産生する、不溶性グルカン生成ＧＴａｓｅに対する果実ポリフェノールの阻害能について検討した。
−原料および試料調製
実施例６、７と同様
−使用菌体；Streptococcus sobrinus ＡＴＣＣ ３３４７８
【００８２】
−ＧＴａｓｅの調製；S.sobrinusのＧＴａｓｅは以下の方法にて調製した。
S.sobrinusをＴＴＹ培地（Agric.Biol.Chem.,54(11),2925-2929,1990）で３７℃、１８時間培養後、遠心分離により菌体を除き上清を得た。この上清に５０％飽和まで硫酸アンモニウムを添加した後、遠心分離により生じた沈澱を回収した。沈澱は０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で再溶解した後、同緩衝液で透析した。透析液中のＧＴａｓｅはヒドロキシルアパタイトクロマトグラフ法により精製、回収した。このとき約０．４Ｍのリン酸緩衝液濃度で不溶性グルカン生成ＧＴａｓｅは溶出した。溶出画分を回収し、以下の実験に供した。
【００８３】
−ＧＴａｓｅ阻害活性測定法
１ｍｌの基質溶液（２％ショ糖、０．１％アジ化ナトリウム、４０μＭデキストランＴ１０含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５））に精製ＧＴａｓｅ溶液と試料溶液を添加し、水で全量２ｍｌに希釈した後、３７℃で１８時間反応させた。反応により生じた不溶性グルカン量を５５０ｎｍの吸光度で示される濁度として測定し、下記の式より生成率を算出した。
不溶性グルカン生成率＝（ＳＳ−ＳＢ）／（ＣＳ−ＣＢ）×１００（％）
ＳＳ：サンプル
ＳＢ：サンプルの酵素ブランク
ＣＳ：コントロール
ＣＢ：コントロールの酵素ブランク
【００８４】
−結果
各果実抽出物のポリフェノール画分、ならびに各ポリフェノール成分のＧＴａｓｅ阻害活性を図１９、２０に示した。縦軸は不溶性グルカンの生成率で、試料無添加のコントロールにおける生成量を１００％として算出した。横軸は反応系への試料もしくはポリフェノールの添加量を容量もしくは濃度で示した。
図１９に示したとおり、各種果実抽出物のポリフェノール画分のうち、特に「ふじ」未熟果と「新高」未熟果のポリフェノール画分に顕著なＧＴａｓｅ阻害活性が見られた。この時、「ふじ」成熟果のＧＴａｓｅに対する５０％阻害量が約５０μｌであるのに対して「ふじ」未熟果のそれは約０．７μｌであることから、リンゴの未熟果は成熟果よりも約７０倍強力なＧＴａｓｅ阻害活性を有していることが判明した。
【００８５】
次にリンゴに含まれる成分を中心に各種ポリフェノール成分のＧＴａｓｅ阻害活性について検討した。図２０に示したとおり、リンゴ中の成分のうち、クロロゲン酸とフロリジンのＧＴａｓｅ阻害活性はごく弱いものであった。一方、各種カテキン類のうち、エピカテキンモノマーの阻害活性は微弱であったのに対し、図１２の推定化学構造式で示される高分子エピカテキン重合体（図２０ではリンゴタンニンと表記）は強力なＧＴａｓｅ阻害活性を有していることが判明した。図２０では対照として、既にＧＴａｓｅ阻害物質であることが知られている緑茶の代表的カテキン類であるエピカテキンガレート（Agric.Biol.Chem.,5(11),2925-2929,1990,Chem.Pharm.Bull.,38(39,717-720,1990)の結果も同時に示したが、エピカテキンガレートのＧＴａｓｅに対する５０％阻害濃度が約２００ｐｐｍであるのに対して、リンゴタンニンのそれは約２ｐｐｍと約１００倍程度強力であると算出された。これらの結果よりまた、図１９で見られた「ふじ」未熟果の強力なＧＴａｓｅ阻害活性は本物質の存在によるものと推定された。
以上の結果より、本発明で得られる果実ポリフェノールは強力なＧＴａｓｅ阻害活性成分を有することから、抗う蝕剤としても極めて有効であると考えられる。
【００８６】
（実施例９）
［果実未熟果ポリフェノールの消臭効果］
本実施例における消臭効果試験は、宇井らの方法（日食工誌、38,1098-1102,1991）の改変法で行った。
−試料
実施例２に記載のリンゴ未熟果実果汁より精製したポリフェノール画分の噴霧乾燥品（リンゴポリフェノール粉末製剤）を使用した。さらに比較対照として、既知消臭物質である市販緑茶ポリフェノール製剤と銅クロロフィリンナトリウムを使用した。
【００８７】
−消臭効果試験法
予め氷冷下で１ｐｐｍメチルメルカプタン溶液および１ｐｐｍ硫化ジメチル溶液を調製した。内容量３０ｍｌのバイアル瓶中に各濃度の試料を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌを入れ（比較対照は試料無添加）、これに１ｐｐｍメチルメルカプタン溶液１ｍｌ、または１ｐｐｍ硫化ジメチル溶液１ｍｌを加え、直ちに栓をして撹拌した。これを３７℃で５分間インキュベートした後、ヘッドスペースガス５ｍｌをＧＣに注入し、メチルメルカプタンもしくは硫化ジメチルのピーク高を測定した。
【００８８】
−測定結果
各試料について悪臭成分に対する消臭効果の有無を調べた。
試料を０．０５−０．５％もしくは０．０５−５％の範囲で反応系に添加したときのヘッドスペースガス中のメチルメルカプタンもしくは硫化ジメチル濃度と試料添加濃度との関係を図２１、図２２に示した。
この結果から明らかなように、リンゴポリフェノール粉末製剤は濃度依存的にメチルメルカプタン、硫化ジメチルに対する消臭効果を有することが認められた。
【００８９】
（実施例１０）
［果実未熟果ポリフェノールの悪臭物質産生抑制効果］
本実施例における悪臭物質産生抑制効果試験は、宇井らの方法（日食工誌、38,1098-1102,1991）の改変法で行った。
−試料
実施例９と同様にリンゴポリフェノール粉末製剤、市販緑茶ポリフェノール製剤および銅クロロフィリンナトリウムを使用した。
【００９０】
−悪臭物質産生抑制効果試験法
予め唾液採集２時間前からの飲食を禁じた者から自然流出唾液を採取した。内容量３０ｍｌのバイアル瓶中に各濃度の試料および４０ｍＭのＬ−メチオニンを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌを入れ（比較対照は試料無添加）、これに予め採取した唾液１ｍｌを加え、直ちに栓をして撹拌した。これを３７℃で２４時間インキュベートした後、ヘッドスペースガス５ｍｌをＧＣに注入し、反応により産生したメチルメルカプタン、硫化ジメチルおよび二硫化ジメチルのピーク高を測定した。
【００９１】
−測定結果
各試料について悪臭物質産生抑制効果の有無を調べた。
試料を０．００１５−０．５％の範囲で反応系に添加したときのヘッドスペースガス中のメチルメルカプタン、硫化ジメチルおよび二硫化ジメチル濃度と試料添加濃度との関係を図２３〜図２５に示した。
この結果から明らかなように、リンゴポリフェノール粉末製剤は濃度依存的にメチルメルカプタン、硫化ジメチル、二硫化ジメチルに対する産生抑制効果を有することが認められた。
【００９２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、摘果作業が行われる時期に採取されるリンゴの未熟果実を原料とし、かつ特定の処理を施しているため、各種の生理作用、特に抗酸化性およびACE阻害活性を備えた果実ポリフェノールを提供することができる。
【００９３】
さらに、本発明によれば、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害作用を有するポリフェノール画分を有効成分とする血圧降下剤を提供することができる。
また、本発明によれば、変異原性抑制作用を有するポリフェノール画分を有効成分とする抗変異原性作用剤を提供することができる。
さらにまた、本発明によれば、ヒアルロニダーゼ阻害作用ならびにヒスタミン遊離抑制作用を有するポリフェノール画分を有効成分とするアレルギー抑制剤を提供することができる。
【００９４】
さらに、本発明によれば、グルコシルトランスフェラーゼ阻害活性を有するポリフェノール画分を有効成分とする抗う蝕剤を提供することができる。
さらにまた、本発明によれば、悪臭物質に対する消臭および悪臭物質産生抑制作用を有するポリフェノール画分を有効成分とする消臭剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】リンゴ未熟果ポリフェノールの波長可変クロマトグラムと各ピークの紫外部吸収スペクトルの比較を示すグラフ。
【図２】リンゴ「ふじ」抽出液を反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）と添加濃度の関係を示すグラフ。
【図３】リンゴ「ふじ」各画分を反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）と添加濃度の関係を示すグラフ。
【図４】ポリフェノール化合物を反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）の比較を示すグラフ。
【図５】各リンゴポリフェノール画分を反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）と添加濃度の関係を示すグラフ。
【図６】各未熟果ポリフェノール画分を反応系に添加したときの、１週間後における生成過酸化脂質量 (吸光度500nm 値）と添加濃度の関係を示すグラフ。
【図７】各画分のACE 阻害活性を示すグラフ。
【図８】画分Ｂの添加量を変化させた場合の ACE阻害活性を示すグラフ。
【図９】反応系へ添加する各物質の添加濃度を変化させた場合のACE 阻害活性を示すグラフ。
【図１０】単離した画分について分光光度計により測定した吸収スペクトルを示すグラフ。
【図１１】 GPC による分子量測定結果を示すグラフ。
【図１２】推定されるACE 阻害活性物質の構造式。
【図１３】Ｔｒｐ−Ｐ−２に対するポリフェノールの変異原性抑制活性を示すグラフ。
【図１４】ベンゾ（ａ）ピレンに対するポリフェノールの変異原性抑制活性を示すグラフ。
【図１５】各種果実抽出物のヒアルロニダーゼ阻害活性を示すグラフ。
【図１６】抗アレルギー剤とリンゴタンニンのヒアルロニダーゼ阻害活性を示すグラフ。
【図１７】各果実エキスおよびリンゴタンニンに関する抗原ＤＮＰ−ＢＳＡ作用時、抗体ＤＮＰ−ｌｇＥ作用時のヒスタミン遊離抑制活性率を示すグラフ。
【図１８】リンゴタンニンに関する抗原ＤＮＰ−ＢＳＡ作用時、抗体ＤＮＰ−ｌｇＥ作用時のヒスタミン遊離抑制活性率を示すグラフ。
【図１９】各果実ポリフェノール画分を反応系に添加したときの、不溶性グルカン生成量と添加量の関係を示すグラフ。
【図２０】各ポリフェノール化合物を反応系に添加したときの、不溶性グルカン生成量と添加濃度の関係を示すグラフ。
【図２１】リンゴポリフェノール、緑茶ポリフェノール、銅クロロフィリンナトリウムを反応系に添加したときの、メチルメルカプタン残存量を示すグラフ。
【図２２】リンゴポリフェノール、緑茶ポリフェノール、銅クロロフィリンナトリウムを反応系に添加したときの、硫化ジメチル残存量を示すグラフ。
【図２３】リンゴポリフェノール、緑茶ポリフェノール、銅クロロフィリンナトリウムを反応系に添加したときの、メチルメルカプタン発生量を示すグラフ。
【図２４】リンゴポリフェノール、緑茶ポリフェノール、銅クロロフィリンナトリウムを反応系に添加したときの、硫化ジメチル発生量を示すグラフ。
【図２５】リンゴポリフェノール、緑茶ポリフェノール、銅クロロフィリンナトリウムを反応系に添加したときの、二硫化ジメチル発生量を示すグラフ。
Claims (3)
- 摘果作業が行われる時期に採取されるリンゴの未熟果実より搾汁および／または抽出された画分の精製物から成り、その成分組成が、単純ポリフェノール化合物としてカフェー酸誘導体、ｐ−クマル酸誘導体、フラバン−３−オール類、フラボノール類、ジヒドロカルコン類、及び高分子ポリフェノール化合物としてカテキン類の規則的な重合体である縮合型タンニン類を含む、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害作用を有するポリフェノール画分を有効成分とする血圧降下剤。
- 摘果作業が行われる時期に採取されるリンゴの未熟果実より搾汁および／または抽出された画分の精製物から成り、その成分組成が、単純ポリフェノール化合物としてカフェー酸誘導体、ｐ−クマル酸誘導体、フラバン−３−オール類、フラボノール類、ジヒドロカルコン類、及び高分子ポリフェノール化合物としてカテキン類の規則的な重合体である縮合型タンニン類を含む、ヒアルロニダーゼ阻害作用ならびにヒスタミン遊離抑制作用を有するポリフェノール画分を有効成分とするアレルギー抑制剤。
- 摘果作業が行われる時期に採取されるリンゴの未熟果実より搾汁および／または抽出された画分の精製物から成り、その成分組成が、単純ポリフェノール化合物としてカフェー酸誘導体、ｐ−クマル酸誘導体、フラバン−３−オール類、フラボノール類、ジヒドロカルコン類、及び高分子ポリフェノール化合物としてカテキン類の規則的な重合体である縮合型タンニン類を含む、グルコシルトランスフェラーゼ阻害活性を有するポリフェノール画分を有効成分とする抗う蝕剤。
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