CN112190714B - 具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物。脂质体组成物包含：脂质体材料所形成的一壳体；以及结合在壳体表面的配体材料，其中配体材料为多个长链脂肪酸，脂质体组成物借由多个长链脂肪酸辨认且结合至脂肪细胞。本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物的功效在于：可专一性标靶至特定细胞并具有促进脂肪分解的能力，达到减脂的功效。

Description

具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物
技术领域
本发明是有关于一种脂质体组成物及其制备方法，更特别是一种具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物。
背景技术
脂肪为人体内的必要成分，但过度的脂肪成分对人体会造成损害。国家经济愈来愈起飞的国家，肥胖问题只增不减，因此以亚洲区来看，中国会是下一波肥胖问题增加幅度大幅上升的国家。
另外，中国台湾目前已成为为「亚洲第一胖」的地区，18岁以上人群中，男性体重过重的比例为51.1％，女性体重过重的比例为35.8％，且比例还在上升中，甚至体重过重的年龄层也是逐年下降，中小学生体重过重的比例已上升至25％以上，是全球排名第八高的区域。因此肥胖是目前亟需解决的问题。
然而，目前被用来减脂或促进脂肪分解的产品大多由化学成分所制成，长期使用不但对人体健康有害无益，且这些产品往往价格昂贵，并非为一般使用者所能负担。为了解决上述问题，本领域的技术人员亟需研发出具有促进脂肪分解以达成减脂功效的新颖医药品以造福有此需求的广大族群。
此外，脂质体(Liposome)主要是以磷脂质所制成，是由包括外露的亲水层以及内部的疏水层的脂双层结构所形成的球形囊泡。由于脂质体有着与生物体细胞膜相似的脂质结构，因此具有良好的生物兼容性(biocompatible)及生物降解性(biodegradable)，可广泛用作药物施用、释放或相关成份传递的载体。例如将有效成份包裹于脂质体载体中后施用，不但具有增加活性成份稳定度、减少毒性与适用多种成份运输等优点，也可借由其脂质特性与尺寸大小，减少过敏情形的产生、加速身体的代谢，并加强药物或有效成份的穿透性。
然而，传统的脂质体存在有标靶专一性不佳及稳定度不足的缺点，且脂质体中的成份容易因脂质体破裂而外漏，大幅降低脂质体传递与作用的效果。因此，如何提供一种标靶专一性高的脂质体组成物，亦是本领域的重要课题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的为提供一种具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物，包含脂质体材料所形成的壳体，以及结合在壳体表面的配体材料，其中配体材料为多个长链脂肪酸，脂质体组成物可借由多个长链脂肪酸辨认且结合至脂肪细胞。
在本发明的一实施例中，该多个长链脂肪酸包含二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)及ω-3脂肪酸其中之一者、其中二者或其中三者(亦简称为其中一者或其组合，以「其组合」表示前述二者以上元素的各种组合)。
在本发明的一实施例中，该多个长链脂肪酸借由亲水基与壳体结合，多个长链脂肪酸借由疏水基与脂肪细胞结合。
在本发明的一实施例中，具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物更包含蕊材，其中蕊材容纳于壳体内部，蕊材为具有促进脂肪代谢、或脂肪分解能力的材料。
在本发明的一实施例中，该脂质体材料包含磷脂质，磷脂质中所包含的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanol amine)与磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine) 的重量比为3～6：1。
在本发明的一实施例中，磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱的重量比为4： 1。
在本发明的一实施例中，以脂质体组成物为100重量％计，磷脂质为 0.5～1.5重量％。
在本发明的一实施例中，以脂质体组成物为100重量％计，配体材料为 0.01～0.06重量％。
在本发明的一实施例中，以脂质体组成物为100重量％计，蕊材为 0.1～0.6重量％。
在本发明的一实施例中，蕊材包括咖啡因、维生素C、维生素E、维生素B6、铁、镁、锌、钾、左旋肉碱、绿原酸、甲壳素及藤黄果其中之一者或其组合。
本发明的另一目的为提供一种用于制备一具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物的方法，包含以下步骤：(a)提供由脂质体材料所形成的壳体；以及(b) 将配体材料结合在壳体表面，其中配体材料为多个长链脂肪酸，而脂质体组成物能够通过多个长链脂肪酸辨认且结合至脂肪细胞。
综上所述，本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物的功效在于：可专一性标靶至特定细胞并具有促进脂肪分解的能力，达到减脂的功效。
以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何本领域普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
图1是本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物的结构示意图。
图2A是本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物在标靶OP9-衍生的脂肪细胞上的效用的示意图。
图2B是本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物在标靶小鼠骨骼肌细胞C2C12上的效用的示意图。
图2C是本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物不易进入人类皮肤纤维母细胞CCD966sk的示意图。
图3A是本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物在促进脂肪分解上的功效的示意图。
图3B是本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物在促进脂肪分解上的功效的数据图，其中*表示p<0.05；**表示p<0.01。
图4A至图4B是本发明实施例1的脂质体组成物所使用的卵磷脂其所含的部分成分，图4A为磷脂酰胆碱化学结构式、图4B为磷脂酰乙醇胺的化学结构式。
图4C为试验组(实施例1的脂质体组成物)所使用的卵磷脂的核磁共振氢谱图；以及
图4D为比较组所使用的卵磷脂的核磁共振氢谱图。
其中，附图标记：
11：长链脂肪酸
111：二十二碳六烯酸(DHA)
112：二十碳五烯酸(EPA)
12：蕊材
13：微脂体
21：脂肪细胞
211：脂肪液滴
212：细胞核
213：脂肪酸运输蛋白(FATP)
具体实施方式
定义
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在±20％的范围内，较佳为在±10％的范围内，最佳为在±5％的范围内。
使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(standard deviation,STDEV)表示，个此之间的差异以学生t检验(student's t-test)分析。
实施例1.具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物的制备
首先准备适当量的用于制备脂质体组成物的组份，包含脂质体材料、抗氧化剂、配体材料、蕊材、植物胶以及溶剂。其中脂质体材料为可组成微脂体的脂单层或脂双层的结构材料，以形成脂质体的壳体。脂质体材料可例如为磷脂质(较佳为卵磷脂(lecithin)，例如可为大豆卵磷脂)。抗氧化剂可包含维生素C、维生素E(即生育醇)及茶多酚的其中之一者或其组合。请参照图1，配体材料指可用于辨认且结合至标的(例如脂肪细胞)的材料，本发明使用长链脂肪酸(long chain fatty acids,LCFA)11作为辨认脂肪细胞的配体材料，长链脂肪酸11包含碳数大于12的脂肪酸，如ω-3脂肪酸、二十二碳六烯酸的DHA(docosahexaenoic acid)111及二十碳五烯酸的EPA (Eicosapentaenoic acid)112的其中之一者或其组合。蕊材12指包覆在微脂体 13内部的材料。在一些实施例中，蕊材12可在微脂体13结合至标的或进入标的后被释放出来。于本发明的较佳实施例中，蕊材12选自具有促进脂肪分解能力的材料，例如咖啡因(caffeine)、维生素C、维生素E、维生素 B6、铁、镁、锌、钾、左旋肉碱、绿原酸、甲壳素及藤黄果的其中之一者或其组合。植物胶可包含阿拉伯胶(Arabic gum)、三仙胶(xanthan gum)、关华豆胶(Guar gum)的其中之一者或其组合。溶剂可为水或其他与各组分无明显化学反应而可适当地悬浮各组份以形成脂质体的液体。
如前所述，蕊材12为具有促进脂肪分解能力的材料。部分蕊材12的促进脂肪分解或其他功能将进一步说明如下。举例而言，咖啡因可促进新陈代谢且增加脂肪燃烧；维生素C可降低皮质醇水平，剧烈训练产生一种压力荷尔蒙，会使身体进入分解代谢状态，燃烧肌肉；维生素E能促进人体新陈代谢，改善血液循环，促进食物的消化吸收，清除体内废物，避免毒素在肠胃堆积；维生素B6可以转化变为一种酶，帮助人体吸收代谢氨基酸，利用糖原能量，也有利于在训练时促进生长激素的释放；铁参与血红蛋白、细胞色素及各种酶的合成，激发辅酶A等多种酶的活性，能促进造血、能量代谢、生长发育及杀菌的功能，多补充铁元素能有效促进腰腹的血液循环；镁促进肌肉生长，防止肌肉抽筋，还能缓和消化不良，帮助脂肪燃烧并产生热量；锌帮助合成体内的睪丸酮及类胰岛素生长因子(Insulin-like growthfactor,IGF)，这两个重要的荷尔蒙可以促进肌肉生长，是增肌的关键；此外，锌能够促进人体的新陈代谢，有助于消除体内胆固醇，而缺锌会影响食欲，降低消化功能；钾对肌肉内的体液平衡非常重要，保持良好的体液平衡使肌肉更容易进入合成代谢的状态；此外，钾能使身体不吸收废物，在适量摄取下帮助减肥；左旋肉碱可促进脂肪的燃烧，同时能在健身时候增强表现力，提高恢复能力；绿原酸可减少葡萄糖的吸收，降低血糖浓度、抑制脂肪的吸收，间接促进三酸甘油酯的分解，达到协助控制体重的作用；甲壳素能在胃酸的反应下形成带正电的食物纤维，可与带负电的胆汁酸结合后排出体外，能够减少胆汁对脂肪的乳化，降低人体对脂肪的吸收；藤黄果可与体内代谢循环中的柠檬酸竞争，减少脂肪酸的合成，以达到降低体脂肪的目的。此外，维生素C及维生素E可使用作为抗氧化剂或蕊材12。
本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物的组份显示于下表1。
表1
Figure BDA0002575428310000061
将表1所示的组份混合均匀之后，得到一混合溶液。接着，以3,000 rpm对混合溶液进行一般均质10分钟，然后以800bar进行高压均质一循环，得到本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物(实施例1的脂质体组成物)。
如图1所示，配体材料会嵌合于微脂体13的表面，于一较佳实施俐中，当配体材料中包含长链脂肪酸11时，长链脂肪酸11各自的亲水基会嵌合至微脂体13的表面，因此长链脂肪酸11各自的疏水基将会朝外。脂质体组成物透过长链脂肪酸11的疏水基作为锚，辨认并标靶(如箭头所示)脂肪细胞21(包括脂肪液滴211及细胞核212)。在一些实施例中，由于脂肪酸运输蛋白(fatty acid transport protein,FATP)213会穿透细胞膜，因此长链脂肪酸11的疏水基可辨认并标靶(如箭头所示)脂肪细胞21的FATP 213，且与 FATP 213结合，使蕊材12可以特定地释放在目标细胞。
实施例2.具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物在标靶脂肪细胞上的专一性效用评估
首先，准备小鼠骨髓基质细胞OP9(bone marrow stromal cell)，其购自美国典型培养物保藏中心(美国
Figure BDA0002575428310000071
)，编号CRL-2749TM，并将100， 000颗/2mL OP9细胞接种于培养盘中，且每3天换一次培养基(最低必需培养基Alpha培养基，α-MEM(购自Gibco，美国)，其中含有10vol％的胎牛血清(购自Gibco，美国)及1vol％的青霉素/链霉素溶液(购自Gibco，美国))，两周后细胞分化为脂肪细胞。另外，准备人类皮肤纤维母细胞 CCD966sk，其购自财团法人食品工业发展研究所，编号BCRC No.60153，及小鼠骨骼肌细胞C2C12，其购自美国
Figure BDA0002575428310000072
编号CRL-1772，并分别将100,000颗/2mL CCD966sk细胞及100,000颗/2mLC2C12细胞接种于培养盘中(不同种类的细胞接种于不同孔中)，然后培养隔夜。之后，将三种细胞(包括OP9、CCD966sk及C2C12)每格更换1.9mL新的培养基(CCD966sk 细胞所使用的培养基为含有10vol％胎牛血清(购自Gibco，美国)的最低必需培养基(Minimum essentialmedium in Earle's BSS)生长培养基；C2C12细胞所使用的培养基为DMEM(Dulbecco'smodified minimal essential medium)，并额外添加使其含有1vol％青霉素-链霉素及10vol％胎牛血清(购自Gibco，美国))。对于每种细胞，其中一孔加入100μL的实施例1的脂质体组成物 (溶于2mL的对应培养基中)，培养4小时。另一孔则加入100μL的脂质体组成物(由表1中的成分所形成，但不含配体材料及蕊材)作为对照组并培养 4小时，以及再于另一孔中加入100μL的脂质体组成物(由表1中的成分所形成，但不含配体材料)作为比较组并培养4小时。接着，去除各孔的培养基，然后以1mL的PBS清洗一次，并加入0.2mL的1X胰蛋白酶，于 37℃下培养3分钟。之后，加入0.8mL的对应培养基至各孔来中和胰蛋白酶，并将培养基与细胞收集至1.5mL微量离心管。接着，以400g离心5分钟，去除上清液，然后以1mL的PBS清洗一次，接而以400g离心5分钟。之后，去除上清液，加入200μL的PBS打散细胞。接着，使用流式细胞仪分析收集细胞的荧光表现量。需了解的是，当每种脂质体制备完成时，每1ml脂质体组成物将会再额外加入亲脂性膜染料，其中亲脂性膜染料会与微脂体的脂层结合，作为流式细胞仪分析时的发光基团以进行荧光成像分析，本发明采用每1ml脂质体组成物中加入0.05mg/ml Dil(1,1’-Dioctadecyl- 3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanineperchlorate)作为亲脂性膜染料，以对制作好的脂质体组成物添加红色荧光剂。三类细胞的检测结果分别显示于图 2A至图2C。
图2A是本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物在标靶OP9-衍生的脂肪细胞上的效用的示意图，其中OP9-衍生的脂肪细胞具有脂肪酸运输蛋白(fatty acidtransport protein,FATP)的高表现量，而脂质体组成物所含有的配体材料对FATP具识别性。图2B是本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物在标靶小鼠骨骼肌细胞C2C12上的效用的示意图，其中C2C12细胞具有FATP的高表现量。图2C是本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物不易进入人类皮肤纤维母细胞CCD966sk的示意图，其中CCD966sk细胞具有FATP的低表现量。由图2A至图2C可见，本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物可专一性标靶至具有高FATP表现量的OP9-衍生的脂肪细胞及小鼠骨骼肌细胞C2C12，但不易进入具有低FATP表现量的人类皮肤纤维母细胞CCD966sk，其中图2A～图2C中，Y轴单位为细胞数×荧光量。由图2A和2B可知，相较于图2C，有较多的微脂体(即实施例1的脂质体组成物)进入细胞(图2A和2B中的M1区域，其信号强度高于图2C中的M1区域)。本实施例的结果证实，本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物确实具有专一性标靶脂肪细胞的功效。
实施例3.具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物在促进脂肪分解上的效用评估
本实施例以小鼠骨髓基质细胞进行本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物于促进脂肪分解的功效测试。该小鼠骨髓基质细胞OP9系购自美国典型培养物保藏中心(美国
Figure BDA0002575428310000081
)，编号CRL-2749TM。该细胞于分化前系培养于前脂肪细胞扩增培养液(Pre-adipocyte Expansion Medium)，其中包含79vol％的最低必需培养基Alpha培养基(minimum essential medium alpha medium，购自Gibco，美国，12100-046)、20vol％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，购自Gibco，美国)，以及1％的青霉素/链霉素(Penicillin-streptomycin，购自Gibco，美国)；并使用分化培养液(Differentiation Medium)使小鼠骨髓基质细胞进行分化，其中包含79vol％最低必需培养基 Alpha培养基、20％的胎牛血清，以及1％的青霉素/链霉素。
为证实本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物具有促进脂肪分解的功效，首先将小鼠骨髓基质细胞分化成脂肪细胞(adipocyte)，做法为将 8×104小鼠骨髓基质细胞OP9与500μL的前脂肪细胞扩增培养液(Pre- adipocyte Expansion medium)接种于24孔培养盘中，并于37℃下培养7天，每3天更换新鲜的分化培养基。接着，使用显微镜(ZEISS)观察脂滴(lipid droplet)的形成，确保细胞已完全分化。
之后，将OP9细胞分成4组，其中包括1个对照组、2个比较组(亦即比较组1及比较组2)及1个实验组。分属于比较组1的细胞(咖啡因组)将加入表1中的材料的混合物100μL(但不含脂质体材料，其中咖啡因占0.5 重量％，且表1中的材料先彼此混合后再加入至细胞)。分属于比较组2的细胞(咖啡因脂质体组)将加入表1中的材料的混合物100μL(但不含配体材料，其中咖啡因占0.5重量％，且表1中的材料先彼此混合后再加入至细胞)。分属于实验组的细胞(带有配体的咖啡因脂质体组)将加入表1中的材料的混合物100μL，其中咖啡因占0.5重量％，且表1中的材料先彼此混合后再加入至细胞。脂质体脂质体至于对照组的细胞则不做任何处理。接着，将各组细胞培养7～10天，每3天更换培养基。之后，参照Cayman的以甘油细胞为基础的分析套组(Glycerol cell-based assay kit)以及其所附的用户操作指南，对各组细胞进行甘油分析(glycerol assay)。
从各孔培养盘中收集细胞培养物上清液，然后取25μL的细胞培养物上清液及甘油标准物(standard)至新的96孔培养盘中。之后，于每孔添加100 μL的改制游离甘油分析试剂(reconstituted Free Glycerol Assay Reagent)，然后于室温下反应15分钟。接着，以ELISA读取仪(BioTek)读取各组之 OD540nm以获得吸光值。
本实施例的结果显示于图3A及图3B。图3A是本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物在促进脂肪分解上的功效的示意图。图3B是本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物在促进脂肪分解上的功效的数据图。由图 3A及图3B可见，与对照组及比较组1与比较组2相较之下，实验组的油滴含量有显著的降低。其中，与对照组比较，实验组的油滴含量减少45％，与比较组2多减少11％。本实施例的结果显示，本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物具有促进脂肪分解的功效。此外，由于实施例1的脂质体组成物中的配体材料可标靶至脂肪细胞，故相较于不含配体材料的脂质体，实施例1的脂质体组成物可更有效地促进脂肪分解。
实施例4.卵磷脂内的组成比例对脂质体稳定性的影响脂质体
申请人发现由不同卵磷脂所形成的脂质体可以具有不同的稳定性。例如，实施例1中的脂质体组成物(其中卵磷脂是购自Solae，LLC；产品名称为SOLECTM F)比由相同材料(除了卵磷脂是购自Lucas Neyer Cosmetics；产品名称为EMULMETIK 900)所形成的比较组脂质体具有更高的稳定性。
为了解两者差异，将前述实施例1所使用的卵磷脂(购自Solae， LLC；产品名称为SOLECTM F)以及其他市售的卵磷脂(EMULMETIK 900，Lucas Neyer Cosmetics公司)进行1H-NMR光谱比对，其结果分别如图 4C与图4D所示。而图4A与图4B分别为卵磷脂中所含磷脂酰胆碱以及磷脂酰乙醇胺的化学结构式。由图4C可知，实施例1中所使用的卵磷脂中所含有的磷脂酰乙醇胺与磷脂酰胆碱的重量比例大约为4：1，而图4D则显示比较组的卵磷脂中所含有的磷脂酰乙醇胺与磷脂酰胆碱的重量比例约为1： 1。经推测，可能是因为磷脂酰胆碱的胺基较多，造成比较组中脂质体结构的不稳定。显示卵磷脂中所含有的磷脂酰乙醇胺与磷脂酰胆碱的重量比例与脂质体的稳定性可能具有关系。
综上所述，本发明具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物可专一性标靶至特定细胞(例如脂肪细胞及骨骼肌细胞)并具有促进脂肪分解的能力，达到减脂之功效。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物，其特征在于，包含：
一脂质体材料所形成的一壳体；以及
一结合在该壳体表面的配体材料，其中该配体材料为多个长链脂肪酸，该脂质体组成物能够通过该多个长链脂肪酸辨认且结合至一脂肪细胞；
其中该多个长链脂肪酸为二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)。
2.如权利要求1所述的具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物，其中该多个长链脂肪酸借由一亲水基与该壳体结合，该多个长链脂肪酸借由一疏水基与该脂肪细胞结合。
3.如权利要求1所述的具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物，更包含一蕊材，其中该蕊材容纳于该壳体内部，该蕊材为具有促进脂肪代谢、或脂肪分解能力的材料。
4.如权利要求1所述的具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物，其中该脂质体材料包含一磷脂质，该磷脂质中所包含的磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanol amine)与磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine)的重量比为3～6：1。
5.如权利要求4所述的具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物，其中该磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱的重量比为4：1。
6.如权利要求4所述的具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物，其中以该脂质体组成物为100重量％计，该磷脂质为0.5～1.5重量％。
7.如权利要求1所述的具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物，其中以该脂质体组成物为100重量％计，该配体材料为0.01～0.06重量％。
8.如权利要求3所述的具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物，其中以该脂质体组成物为100重量％计，该蕊材为0.1～0.6重量％。
9.如权利要求8所述的具有脂肪细胞专一性的脂质体组成物，其中该蕊材包括咖啡因、维生素C、维生素E、维生素B6、铁、镁、锌、钾、左旋肉碱、绿原酸、甲壳素及藤黄果其中之一者或其组合。
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