CN112190515A

CN112190515A - 黑米萃取发酵物及其制备与应用

Info

Publication number: CN112190515A
Application number: CN202010515362.XA
Authority: CN
Inventors: 黄琡涵; 钟钰旻; 林咏翔
Original assignee: TCI Co Ltd
Current assignee: TCI Co Ltd
Priority date: 2019-07-08
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2040-06-08
Also published as: US20210007986A1; EP3763392A1; TWI743769B; TWI814972B; TWI711458B; TW202102250A; CN112190714A; CN112190515B; CN112190644A; TW202102203A; TW202102244A; CN112190714B; TWI779296B; CN112190616A; TW202102247A

Abstract

一种包含黑米萃取发酵物的组成物、该发酵物及其活性成分的应用、以及制备该发酵物的方法。其中，该黑米萃取发酵物包含以下式(I)至式(V)化合物的至少一种：

及

Description

黑米萃取发酵物及其制备与应用

技术领域

本发明关于一种包含一含有下述式(I)至式(V)化合物的至少一种的黑米萃取发酵物的组成物、以及制备该黑米萃取发酵物的方法：

及

本发明也关于式(I)至式(V)化合物及黑米萃取发酵物的至少一种的应用，尤其是关于那些在抗肌肤老化、保湿、抗皱、提升肌肤弹力、紧致皮肤、抑制高度醣化终产物(advanced glycation end product，AGEs)生成、抗氧化、提升水通道蛋白表现、提升胶原蛋白分泌量、及提升弹力蛋白表现量的应用。

背景技术

皮肤是人体最大的组织，也是抵抗外物侵入及外在环境刺激的第一道防线，具有保水、保暖及感觉等功能。当皮肤受到紫外线、辐射、环境中的微生物及悬浮粒子的影响，皆可能使皮肤的含水量降低并加速皮肤细胞老化，导致皮肤发生角质增厚、皮肤干燥脱屑、产生细纹及斑点、皮肤松弛、以及蛋白质分解与流失等现象，甚至会损害皮肤细胞中DNA，而引发细胞毒性、造成皮肤细胞变异而导致皮肤病变。

已知水通道蛋白的表现提升有助于提升皮肤的保湿能力，因此，若能提升水通道蛋白表现量，即可达到保湿的效果。此外，胶原蛋白也为增加皮肤含水量的重要物质，除具有保水功能以外，还可赋予皮肤韧性及弹性；皮肤真皮层中的弹力蛋白则具有支撑皮肤细胞结构的功能。因此，若可提升胶原蛋白与弹力蛋白在皮肤中的含量，即可达到提升肌肤弹力、紧致皮肤、以及抗皱的目的。

醣基化反应是指葡萄糖附着到蛋白质的化学反应过程，此反应会产生高度醣化终产物(advanced glycation end product，AGEs)。堆积于皮肤细胞中的高度醣化终产物不仅容易引起蛋白质变性、使蛋白质失去弹性，进而导致皮肤皱纹产生、皮肤老化，也会造成皮肤细胞DNA损伤、影响皮肤细胞DNA正常功能，甚至导致皮肤病变。因此，若可抑制AGEs，也可达到紧致皮肤、提升肌肤弹力、抗皱、以及抗肌肤老化的目的。

近年来，人们越来越重视皮肤保养，且讲究使用天然且安全的原料，因此，业界仍持续开发可通过天然且安全的原料的使用以有效保养皮肤的手段。本发明的发明人研究发现，通过萃取黑米、并进一步发酵所得到的萃取物而提供的黑米萃取发酵物，可抑制AGEs生成、抗氧化、提升水通道蛋白表现、提升胶原蛋白分泌量、及提升弹力蛋白表现量，故可应用于皮肤保养，以抗肌肤老化、保湿、抗皱、提升肌肤弹力、及/或紧致皮肤。

发明内容

因此，本发明的一目的，在于提供一种制备黑米萃取发酵物的方法，其包含以下步骤：(a)以一极性溶剂萃取黑米以提供一黑米萃取物；(b)使用一酿酒酵母菌发酵该萃取物，以获得一中间发酵物；以及(c)使用一胚芽乳酸杆菌发酵该中间发酵物，以获得一黑米萃取发酵物。较佳地，该方法还在步骤(a)使用一淀粉酶，且该酿酒酵母菌是酿酒酵母菌BCRC20271，该胚芽乳酸杆菌是胚芽乳酸杆菌BCRC 910805。

本发明的另一目的，在于提供一种组成物，其包含一由上述方法所提供的黑米萃取发酵物。较佳地，该黑米萃取发酵物含有以下式(I)至式(V)化合物的至少一种：

及

较佳地，该组成物是一医药组成物、食品组成物或保养品组成物。

本发明的再一目的，在于提供一种使用一活性成分于抗肌肤老化、保湿、抗皱、提升肌肤弹力、及/或紧致皮肤的用途，其中该活性成分是上述的式(I)至式(V)化合物、以及由如上所述方法所提供的黑米萃取发酵物的至少一种。较佳地，该活性成分以食品组成物或保养品组成物的形式使用。

本发明的又一目的，在于提供一种使用一活性成分于制备一用于抑制AGEs生成、抗氧化、提升水通道蛋白表现、提升胶原蛋白分泌量、及提升弹力蛋白表现量的至少一种的医药组成物的用途，其中该活性成分是上述的式(I)至式(V)化合物、以及如上所述方法所提供的黑米萃取发酵物的至少一种。

本发明的又再一目的，在于提供一种用于抗肌肤老化、保湿、抗皱、提升肌肤弹力、紧致皮肤、抑制AGEs生成、抗氧化、提升水通道蛋白表现、提升胶原蛋白分泌量、及/或提升弹力蛋白表现量的组合物，其中，该组成物包含一有效量的活性成分，该活性成分是如上述的式(I)至式(V)化合物、以及如上述方法所提供的黑米萃取发酵物的至少一种。较佳地，该组成物是一医药组成物、食品组成物或保养品组成物。

附图说明

图1A至图1E所示分别为式(I)至式(V)化合物的NMR图谱；

图2所示为“黑米萃取物组”及“黑米发酵物组”的SOD活性，其中“黑米萃取物组”的反应溶液含有黑米萃取物，“黑米发酵物组”的反应溶液则含有黑米萃取发酵物；

图3所示为“白米发酵物组”及“黑米发酵物组”的SOD活性，其中“白米发酵物组”的反应溶液含有白米萃取发酵物，“黑米发酵物组”的反应溶液则含有黑米萃取发酵物；

图4所示为“黑米萃取物组”及“黑米发酵物组”的抗醣化活性，其中“黑米萃取物组”的反应溶液含有黑米萃取物，“黑米发酵物组”的反应溶液则含有黑米萃取发酵物；

图5所示为“白米发酵物组”及“黑米发酵物组”的抗醣化活性，其中“白米发酵物组”的反应溶液含有白米萃取发酵物，“黑米发酵物组”的反应溶液则含有黑米萃取发酵物；

图6所示为“黑米萃取物组”及“黑米发酵物组”的保湿多糖含量，其中“黑米萃取物组”的反应溶液含有黑米萃取物，“黑米发酵物组”的反应溶液则含有黑米萃取发酵物；

图7所示为“白米发酵物组”及“黑米发酵物组”的保湿多糖含量，其中“白米发酵物组”的反应溶液含有白米萃取发酵物，“黑米发酵物组”的反应溶液则含有黑米萃取发酵物；

图8所示为于显微镜下所拍摄的经染色的人类初代皮肤角质形成细胞(蓝色荧光部分为细胞核；绿色荧光部分为水通道蛋白；比例尺为100微米)，包括“控制组”、“黑米萃取物组”及“黑米发酵物组”的结果，其中“控制组”的人类初代皮肤角质形成细胞是培养于不含黑米萃取物及黑米萃取发酵物的培养基，“黑米萃取物组”的人类初代皮肤角质形成细胞是培养于含有黑米萃取物的培养基，“黑米发酵物组”的人类初代皮肤角质形成细胞则培养于含有黑米萃取发酵物的培养基；

图9所示为以相机拍摄的胶原蛋白胶，包括“控制组”、“黑米萃取物组”及“黑米发酵物组”的结果(黄色线为“控制组”胶原蛋白胶的轮廓、蓝色线为“黑米萃取物组”胶原蛋白胶的轮廓、红色线为“黑米发酵物组”胶原蛋白胶的轮廓)，其中“控制组”的胶原蛋白胶是经不含黑米萃取物及黑米萃取发酵物的培养基处理，“黑米萃取物组”的胶原蛋白胶是经含有黑米萃取物的培养基处理，“黑米发酵物组”的胶原蛋白胶则是经含有黑米萃取发酵物的培养基处理；

图10所示为以上述“控制组”胶原蛋白胶的结果为基准，“黑米萃取物组”及“黑米发酵物组”的胶原蛋白胶的相对胶原蛋白密度(**表示相比于控制组的p值＜0.01)；

图11至图13分别显示以贴敷方式使用本发明黑米萃取发酵物于提升肌肤含水量、降低肌肤松弛度、及提升肌肤弹力的效果，包括“安慰剂(不含黑米萃取发酵物的面膜)”、及“黑米发酵物(含黑米萃取发酵物的面膜)”的结果；

图14至图17分别显示以口服方式使用本发明黑米萃取发酵物于提升肌肤含水量、提升肌肤弹力、降低肌肤松弛度、及降低肌肤皱纹的效果，包括“第0周(饮用含有本发明黑米萃取发酵物的饮料前)”及“第4周(饮用含有本发明黑米萃取发酵物的饮料后)”的结果(*表示相比于第0周的p值＜0.05)；

图18所示为以相机拍摄的两个受试者的肌肤皱纹照片图，包括“第0周(饮用含有本发明黑米萃取发酵物的饮料前)”及“第4周(饮用含有本发明黑米萃取发酵物的饮料后)”的结果；

图19所示为“控制组”、“第I组”、“第II组”、“第III组”、“第IV组”、及“第V组”的人类皮肤纤维母细胞的相对胶原蛋白分泌量，其中“控制组”细胞是培养于不含本发明化合物的培养基，“第I组”至“第V组”的细胞则是分别培养于含有式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物、式(IV)化合物、式(V)化合物的培养基(*表示相比于控制组的p值＜0.05；**表示相比于控制组的p值＜0.01)；

图20所示为“控制组”、“第I组”、“第II组”、“第III组”、“第IV组”、及“第V组”的人类皮肤纤维母的相对弹力蛋白表现量，其中“控制组”细胞是培养于不含本发明化合物的培养基，“第I组”至“第V组”的细胞是分别培养于含有式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物、式(IV)化合物、式(V)化合物的培养基(*表示相比于控制组的p值＜0.05；**表示相比于控制组的p值＜0.01)；

图21所示为“黑米萃取发酵物”及“黑米萃取物”的HPLC指纹图谱，其中，上方图显示黑米萃取发酵物的结果、下方图显示黑米萃取物的结果。

具体实施方式

以下将描述根据本发明的部分具体实施方案；但是，在不背离本发明精神下，本发明还可以多种不同形式的方案来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所具体陈述的内容或权利要求书保护范围所限定的内容。

除非文中有另外说明，于本说明书中(尤其是在权利要求书范围中)所使用的“一”、“该”及类似用语应理解为包含单数及复数形式；所谓“个体”是指人类或非人的哺乳动物(例如：狗、猫)。

黑米是在来米的一种，又称黑籼糙米，其外观呈黑紫色，富含花青素、钙、磷、铁、维生素B1等营养素，属于低GI(Glycemic index，升糖指数)食物，适合糖尿病患者食用。

本文中所述的“淀粉酶”可为任何适用于本发明的，包括一般大众可自商业获得的淀粉酶。此外，本文中所述的“酿酒酵母菌”及“胚芽乳酸杆菌”也可为任何适用于本发明的，包括一般大众可自商业获得的酿酒酵母菌、及胚芽乳酸杆菌(例如可购自国内或国外寄存机构的)，以及利用本技术领域所惯用的微生物分离方法从天然来源分离所得的酿酒酵母菌及胚芽乳酸杆菌。

本发明的发明人研究发现，黑米萃取物在酿酒酵母菌、及胚芽乳酸杆菌存在下进行发酵所提供的发酵物，相比于未经发酵的黑米萃取物，具有更佳的抑制AGEs生成、抗氧化、提升水通道蛋白表现、及紧致肌肤的能力，因此，根据本发明以黑米萃取物所提供的发酵物，即，黑米萃取发酵物可用于抗肌肤老化、保湿、抗皱、提升肌肤弹力、紧致皮肤等效果。

本发明的发明人进一步由上述黑米萃取发酵物得到以下五个活性成分(即，式(I)至式(V)化合物)，这些活性成分均具有提升胶原蛋白分泌量、及提升弹力蛋白表现量的能力：

及

因此，本发明关于一种制备黑米萃取发酵物的方法、一种包含式(I)至式(V)化合物及由前述方法所提供的黑米萃取发酵物的至少一种的组合物、一种使用式(I)至式(V)化合物及由前述黑米萃取发酵物的至少一种于抗肌肤老化、保湿、抗皱、提升肌肤弹力、及/或紧致皮肤的用途、以及一种使用式(I)至式(V)化合物及前述黑米萃取发酵物的至少一种于制备一医药组成物的用途，其中该医药组成物用于抑制AGEs生成、抗氧化、提升水通道蛋白表现、提升胶原蛋白分泌量、及提升弹力蛋白表现量的至少一种。

根据本发明的制备黑米萃取发酵物的方法包含以下步骤：(a)以一极性溶剂萃取黑米以提供一黑米萃取物；(b)使用一酿酒酵母菌发酵该萃取物，以获得一中间发酵物；以及(c)使用一胚芽乳酸杆菌发酵该中间发酵物，以获得一黑米萃取发酵物。

于步骤(a)中，可采用极性溶剂来进行萃取，较佳地，该极性溶剂是水、醇(例如C1-C4醇)、或前述的组合。于本发明部分具体实施方案中，采用水做为萃取溶剂。一般而言，萃取溶剂的用量可视需要进行调整，并无特殊限制，只要可使原料均匀分散即可。举例言之，可于步骤(a)采用黑米与萃取溶剂的重量比为1∶3至1∶9的用量。此外，也可视所采用的萃取溶剂来选用适宜的萃取时间、以及萃取温度。以采用纯水作为萃取溶剂且黑米：萃取溶剂的重量比为1∶3至1∶9为例，通常于95℃下，萃取1.5小时即可。

于步骤(a)中，可视需要于进行萃取之前先添加一淀粉酶至萃取溶剂与黑米的混和物中。一般而言，淀粉酶的用量并无特殊限制，只要可将黑米中的淀粉分解为醣类即可。举例言之，可于步骤(a)采用“淀粉酶”与“黑米及萃取溶剂混合物”的重量比为1∶100至1∶200的用量。

于步骤(b)中，将酿酒酵母菌添加至步骤(a)所提供的萃取物中，以进行第一发酵反应。于本发明部分具体实施方案中，是以酿酒酵母菌BCRC20271对步骤(a)所提供的萃取物进行发酵。此外，可视所采用的酿酒酵母菌来选用适宜的发酵时间、以及发酵温度。以采用酿酒酵母菌BCRC 20271为例，通常于室温发酵20小时至24小时。一般而言，酿酒酵母菌的添加量并无特殊限制。举例言之，酿酒酵母菌的添加量可为每克萃取物添加8x10⁵至1.2x10⁶cfu。

于步骤(c)中，将胚芽乳酸杆菌添加至步骤(b)所提供的中间发酵物中，以进行第二发酵反应。于本发明部分具体实施方案中，是以胚芽乳酸杆菌BCRC 910805对步骤(b)所提供的中间发酵物进行发酵。此外，可视所采用的胚芽乳酸杆菌来选用适宜的发酵时间、以及发酵温度。以采用胚芽乳酸杆菌BCRC 910805为例，通常于室温发酵1天至3天。一般而言，胚芽乳酸杆菌的添加量并无特殊限制。举例言之，胚芽乳酸杆菌的添加量可为每克中间发酵物添加8x10⁶至5.0x10⁷cfu。

在不移除所添加的前述酿酒酵母菌及胚芽乳酸杆菌的情况下，步骤(c)所提供的黑米萃取发酵物通常可以符合糖度范围＜4°、pH值为2-4、酒精>5％的规格。

于上述步骤完成之后，可视需要进行例如减压浓缩、过滤、及灭菌操作，以提升黑米萃取发酵物的使用便利性。举例言之，可于45℃至70℃下对黑米萃取发酵物进行减压浓缩，以提供一浓缩发酵物；或者，可以200至400目(mesh)的网筛对黑米萃取发酵物或浓缩发酵物进行过滤，以移除残余固体物。另一方面，可于黑米萃取发酵物中添加40％至70％(重量/重量)的异麦芽寡糖、并于90℃至120℃下，灭菌70分钟至90分钟，以提供一饮品。

根据本发明所提供的医药组成物可用于全身性或局部性投药，且可通过各种药物传递系统(drug delivery system，DDS)进行传递，包括口服药物传递系统(oral drugdelivery system)、经皮药物传递系统(transdermal drug delivery system)、注射药物传递系统(injectable drug delivery system)等。举例言之，但不以此为限，该根据本发明所提供的医药组成物可以通过微脂体(liposome)、微胶囊(microcapsule)、奈米微粒(nanoparticle)、微针(microneedle)等系统进行传递，以达到提高生物利用率、控制药物释放速度、针对病灶精准投药、减少药物副作用等目的。

该根据本发明所提供的医药组成物可呈任何适宜的型式，并无特殊限制，端视所欲的用途而呈对应的适宜剂型；举例言之，但不以此为限，该医药组成物可以口服、静脉注射(包含点滴输注及快速注射)、肌肉注射、皮下注射、动脉注射、腹腔注射、经皮(例如贴片、软膏等)的投药方式施用至有需要的个体上。视使用形式及用途而定，可选用医药上可接受的载剂以提供该医药组成物，其中，该载剂为熟悉制药技术人员所熟知，包括赋形剂、稀释剂、辅助剂、安定剂、吸收促进剂、崩散剂、增溶剂、乳化剂、抗氧化剂、黏合剂、结合剂、增黏剂、分散剂、悬浮化剂、润滑剂、吸湿剂等。

以口服剂型为例，可利用任何适宜的方法，将该医药组成物以适于口服投药的剂型提供，其中，适于口服的液态剂型包括糖浆剂、口服液、悬浮液、酏剂等，适于口服的固态剂型则包括粉剂、颗粒剂、口含锭、糖衣锭、肠溶锭、咀嚼锭、发泡锭、膜衣锭、胶囊剂、长效缓释锭等。于根据本发明所提供的该医药组成物中可含有任何不会不利影响活性成分(即，式(I)至式(V)化合物及黑米萃取发酵物的至少一种)的所欲效益的医药上可接受的载剂。举例言之，但不以此为限，前述液态剂型的医药上可接受的载剂的例子包括：水、食盐水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其类似物、油(例如橄榄油、蓖麻油、棉籽油、花生油、玉米油、及胚芽油)、甘油、聚乙二醇、及前述的组合；前述固态剂型的医药上可接受的载剂的例子则包括：纤维素、淀粉、高岭土(kaolinite)、膨润土(bentonite)、柠檬酸钠、明胶、琼脂、羧甲基纤维素、阿拉伯胶、海藻胶、单硬脂酸甘油酯(glyceryl monostearate)、硬脂酸钙(calciumstearate)、及前述的组合。

也可于适于经皮投药的剂型中含有任何不会不利影响活性成分(即，式(I)至式(V)化合物及黑米萃取发酵物的至少一种)的所欲效益的医药上可接受的载剂，例如：水、矿物油、丙二醇、聚氧化乙烯、液体石蜡脂、去水山梨醇单硬脂酸酯、及聚山梨醇酯60。可利用任何适宜的方法，将该医药组成物以适于经皮投药的剂型提供，例如以乳液、乳霜、油状物、凝胶(例如水凝胶)、膏状物(例如分散膏、软膏)、洗剂、喷雾剂、及贴片(例如微针贴片)等形式提供，但不以此为限。

至于适于注射的针剂或点滴剂，则可于根据本发明所提供的医药组成物中含有一种或多种例如等张溶液、盐类缓冲液(如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液)、增溶剂、乳化剂、5％糖溶液、以及其他载剂等成分，以静脉输注液、乳剂静脉输注液、干粉注射剂、悬液注射剂、或干粉悬液注射剂等剂型提供该医药组成物。或者，可将该医药组成物制备成一注射前固体，并于投予至有需要的个体之前，将该注射前固体溶于其他溶液或悬浮液中或将其乳化，以提供所欲的注射剂。

根据本发明所提供的食品组成物可为饮品、固态食品、或半固态食品，且可以健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品或特殊营养食品的形式提供。举例言之，但不以此为限，该食品组成物可为乳制品、肉类加工品、面包类、面食品、饼干、冰品、口含锭、胶囊、果汁类、茶类、气泡水、酒精饮料、运动饮料、营养饮料等产品。较佳地，该食品组成物以健康食品或保健食品的形式提供。

此外，视使用形式及需求而定，可于根据本发明所提供的食品组成物中含有任何适宜的食品添加物。举例言之，包括但不限于，防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、漂白剂、保色剂、膨胀剂、营养添加剂、着色剂、调味剂(例如：甜味剂)、黏稠剂、结着剂、食品工业用化学药品、乳化剂、以及质量改良用、酿造用及食品制造用剂。

可于根据本发明所提供的健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充食品或特殊营养食品的外包装上标示建议使用量、特定族群(例如：孕妇、儿童等)的使用标准及条件、或与其他食品或医药共同服用的建议事项，以利用户在无医师、药师或相关执事人员指导下自行服用而无安全疑虑。

可将根据本发明所提供的保养品组成物调配成任何适宜的产品形式。举例言之，但不以此为限，该保养品组成物可为柔肤化妆水、收敛化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华液、眼霜、眼部精华液、面膜、贴片、喷雾、身体乳液、身体霜、身体油、及身体精华液等护理产品；妆前乳、粉底、蜜粉，腮红、眼影、眉粉、睫毛膏、口红等彩妆产品；或洁肤油、洁肤霜、洁肤水、眼唇卸妆液、香皂、沐浴露等清洁产品。此外，该保养品组成物还可以泡沫(foam)形态或进一步含有压缩推进剂的气雾(aerosol)形态来使用。

视产品的形式及需求而定，可于根据本发明所提供的保养品组成物中含有任何不会不利影响活性成分(即，式(I)至式(V)化合物及黑米萃取发酵物的至少一种)的所欲效益的化妆品学或皮肤科学上可接受的媒剂。举例言之，但不以此为限，当该保养品组合物为一乳液状、霜状或凝胶状产品时，可使用蜡、石蜡、淀粉、黄耆胶、纤维素衍生物、动物油、植物油、矿物油、聚乙二醇、膨润土、氧化硅、滑石、氧化锌等成分作为媒剂；当该保养品组成物为一粉状或气雾产品时，可使用例如乳糖、滑石、氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺等成分作为媒剂；当该保养品组成物为一溶液或乳浊液状产品时，则可使用例如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、聚乙二醇等成分作为媒剂。

当该保养品组成物以清洁产品的形式提供时，可进一步包含任何不会不利影响活性成分(即，式(I)至式(V)化合物及黑米萃取发酵物的至少一种)的所欲效益的界面活性剂作为媒剂。其中，该界面活性剂的例子包括，但不限于：脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐(alkylbenzene sulfonate，ABS)、脂肪醇硫酸盐(fatty alcohol sulfate，FAS)、脂肪醇聚氧乙烯硫酸盐(alcohol ether sulfate，AES)、脂肪醇聚氧乙烯羧酸盐(fatty alcoholpolyoxyethylene ether carboxylate，AEC)、脂肪酸甲酯磺酸盐(fatty acid methylester sulfonate，MES)、脂肪醇聚氧乙烯醚(fatty alcohol ethoxylates，AE)、烷基糖苷(alkyl polyglycoside，APG)、甜菜碱型界面活性剂(Betaine type surfactant)、及前述之组合。

视需要地，也可于根据本发明所提供的医药组成物、食品组成物或保养品组成物中进一步含有适宜用量的添加物，例如可提高该组成物于使用时感受的调色剂、着色剂等，以及可改善该组成物的稳定性及储存性的缓冲剂、保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等。

根据本发明所提供的医药组成物、食品组成物或保养品组成物可视需要另外含一种或多种其他活性成分(例如：胶原蛋白、玻尿酸、胺基酸、维他命A、甘油、乳酸)，以进一步加强该组成物的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度，只要该其他活性成分对本发明活性成分(即，式(I)至式(V)化合物及黑米萃取发酵物的至少一种)的效益没有不利的影响即可。

根据本发明所提供的医药组成物、食品组成物或保养品组成物中含有以该组成物的总重量计，至少约0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.001、0.0015、0.002、0.0025、0.003、0.0035、0.004、0.0045、0.005、0.0055、0.006、0.0065、0.007、0.0075、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100重量％的活性成分(即，式(I)至式(V)化合物及黑米萃取发酵物的至少一种)，且可自前述数值的任意两者选择有用的范围，例如：约0.0001重量％至约90重量％、约0.001重量％至约25重量％、约0.01重量％至约10重量％、约0.01重量％至约5重量％、约0.05重量％至约1重量％、及约0.05重量％至约0.5重量％。

根据本发明所提供的医药组成物、食品组成物或保养品组成物可以一日一次、一日多次、或多日一次等不同频率施用，端视投与个体的需求、年龄、体重、及健康状况及施用目的而异。也可视实际应用需求调整根据本发明所提供的医药组成物、食品组成物或保养品组成物中黑米萃取发酵物、及式(I)至式(V)化合物的至少一种的含量，例如：调整至每日应服用或外用的量。一般而言，当以医药组成物的形式使用时，建议服用量为5至10克(或5至10毫升)的黑米萃取发酵物；或者，每日0.001毫克/公斤体重的本发明化合物(式(I)至式(V)化合物的至少一种)。当以食品组成物的形式使用时，建议服用量为每日5毫升的黑米萃取发酵物；或者，每日0.001毫克/公斤体重的本发明化合物。此外，当以保养品组成物的形式使用时，保养品中的黑米萃取发酵物建议含量为1％。

现以下列实施例进一步例示说明本发明。其中这些实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明的保护范围。本发明保护范围如权利要求书所示。

实施例

[制备实施例]

于以下实施例中，所使用的物料及器材如下：

1.核磁共振光谱仪(Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer，NMR)：1D与2D光谱使用400MHz Varian 400FT-NMR；以δ表示化学位移(chemical shift)，单位为ppm。

2.质谱仪(Mass Spectrometer，MS)：串联质谱-二维离子阱串联傅立叶变换质谱，使用Bruker amaZon SL system测定，单位为m/z。

3.中压液相层析仪(Medium pressure liquid chromatography，MPLC)：

Rf+，Teledyne ISCO，Lincoln，NE。

4.高效能液相层析仪(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)：

(1)帮浦系统：Hitachi L-2310 series pump；

(2)侦测器：Hitachi L-2420 UV-VIS detector，侦测波长为200至380nm；

(3)资料处理软件：D-2000 Elite软件；

(4)分析管柱：

HS C18(SUPELCO，250x4.6mm，5μm)；

(5)分析管柱：Mightysil RP-18 GP 250(Kanto，250x 4.6mm，5μm)；

(6)半制备管柱：

HS C18(SUPELCO，250x 10.0mm，5μm)；以及

(7)制备级管柱：

HS C18(SUPELCO，250x 21.0mm，5μm)。

5.管柱层析(Column Chromatography)填充材料：

(1)Sephadex LH-20(Amersham Biosciences)；

(2)Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical)；

(3)Merck Kieselgel 60(40-63μm，Art.9385)；以及

(4)Merck

RP-18(40-63μm，Art.0250)。

6.薄层色层分析(Thin-Layer Chromatography，TLC)：TLC aluminium sheets(silica gel 60F254，0.25mm，购自Merck，Germany)。

7.紫外光灯(UV Lamp)：UVP UVGL-25，波长为254nm及365nm。

8.溶剂(购自默克台湾)：正己烷(n-hexane)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)、乙醇(ethanol)、正丁醇(n-butanol)、乙腈(acetonitrile)、氯仿-d1(deuteration degree99.5％)、甲醇-d6(deuteration degree 99.5％)、重水(deuterium oxide，deuteration degree＞99.8％)、二甲基亚砜-d6(Dimethylsulfoxide-d6，deuteration degree＞99.9％)。

A.黑米萃取发酵物的制备

A-1.取黑米(购自：侨联食品)，并以1∶6(黑米∶水)的重量比将黑米与水混合，以提供一混合物。接着于该混合物中添加1％(重量/重量)的淀粉酶，并置于95℃下萃取1.5小时，以提供一黑米萃取物。将该黑米萃取物冷却至室温，待后续的发酵步骤使用。

A-2.取A-1所提供的黑米萃取物，于其中添加酿酒酵母菌BCRC 20271(添加量：每克萃取物添加1x10⁶cfu的酿酒酵母菌BCRC 20271)，并置于室温下发酵24小时，以提供一中间发酵物。

A-3.取A-2所提供的中间发酵物，于其中添加乳酸杆菌BCRC910805(添加量：每克中间发酵物添加5x10⁷cfu的乳酸杆菌BCRC910805)，并于室温下发酵1.5天，以提供一黑米萃取发酵物。

A-4.取A-3所提供的黑米萃取发酵物，在不移除所添加的前述酿酒酵母菌及胚芽乳酸杆菌的情况下，检验该发酵物是否符合糖度范围＜4°、pH值为2-4、酒精>5％的规格，若符合即表示发酵完成。确认符合前述规格后，将该发酵物置于60℃下进行减压浓缩，以提供一浓缩发酵物。接着，将该浓缩发酵物以200目的网筛过滤，以移除残余固体物。最后，置于95℃下加热90分钟进行灭菌。

B.白米萃取发酵物的制备

本制备实施例参照“制备实施例A”的方法步骤进行，其中，仅以白米(购自：侨联食品)取代黑米，以提供一白米萃取发酵物。

C.式(I)至式(V)化合物的制备

C-1.取10升A-4所提供的黑米萃取发酵物，使用等比例(1∶1)的正丁醇(n-BuOH)与水对该发酵物液相分配萃取(重复三次)，分别合并三次萃取所获得的正丁醇层萃取液、以及水层萃取液，并进行减压浓缩干燥，以提供正丁醇层萃取物(共10.4g)及水层萃取物(共1053.5g)。

C-2.取C-1所提供的正丁醇层萃取物(共10.4g)，以Diaion HP-20为层析材料进行层析(其中，起始冲提液为纯水，并逐渐增加冲提液中的甲醇比例以渐减极性)，得到第一划分层(F1)、第二划分层(F2)、及第三划分层(F3)。

C-3.取C-2所提供的第二划分层(F2)，以中压管柱层析仪(MPLC)进行层析(以水与甲醇的混合溶剂作为冲提液，水∶甲醇＝9∶1)后，以TLC点片(TLC aluminium sheets；silica gel 60F254，0.25mm)合并，得到F2-1至F2-5五个次划分层。取次划分层F2-3，以硅胶管柱层析法进行层析(以二氯甲烷与甲醇的混合溶剂作为冲提液，二氯甲烷∶甲醇＝9∶1)后，以TLC点片(TLC aluminium sheets；silica gel 60F254，0.25mm)合并，得到F2-3-1至F2-3-5五个次划分层，其中，F2-3-2为式(II)化合物(15.2mg)。另一方面，取次划分层F2-2，以硅胶管柱层析法进行层析(以二氯甲烷与甲醇的混合溶剂作为冲提液，二氯甲烷∶甲醇＝12∶1)，分离得到化合物式(III)化合物(10.3mg)。

C-4.取C-2所提供的第三划分层(F3)，以硅胶管柱层析法进行层析(以二氯甲烷与甲醇的混合溶剂作为冲提液，二氯甲烷∶甲醇＝12∶1)，得到F3-1至F3-6六个次划分层。取次划分层F3-1，以硅胶管柱层析法进行层析(以正己烷与乙酸乙酯的混合溶剂作为冲提液，正己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)后，以TLC点片(TLC aluminium sheets；silica gel 60F254，0.25mm)合并，得到式(V)化合物(5.2mg)。另一方面，取次划分层F3-2，以硅胶管柱层析进行层析(以正己烷与乙酸乙酯的混合溶剂作为冲提液，正己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)，得到式(I)化合物(3.5mg)与式(IV)化合物(6.8mg)。

C-5.以核磁共振光谱仪与质谱仪分析式(I)至式(V)化合物，并经文献比对确定其化学构造如下表1所示，其NMR图谱分别示于图1A至图1E。其中，式(I)至式(V)化合物的化学名称分别为香草酸、酪醇、邻苯二酚、苯甲酸和对羟基苯甲醛。

表1

实施例1：黑米萃取发酵物的SOD活性

研究已知，SOD的活性提升有助于提升细胞抗氧化能力，因此，若能提升SOD的活性，即可达到抗肌肤老化的效果。为了解为本发明黑米萃取发酵物的SOD活性，进行以下测试。

实验组：包括“黑米萃取物组”、“黑米发酵物组”及“白米发酵物组”，分别取20μL[制备实施例A-1]所提供的黑米萃取物、[制备实施例A-4]所提供的黑米萃取发酵物、以及[制备实施例B]所提供的白米萃取发酵物作为待测样品，接着，分别于各组待测样品依序添加2.35mL的A液(0.1M Tris-HCl与1mM EDTA)、1.8mL的H20、及0.15mL的B液(4.5mM磷苯三酚盐酸溶液)。

空白组：将2.35mL的A液、1.8mL的H20及0.15mL的B液依序混合。

添加完B液后，以紫外光-可见光光谱仪(UV/VIS Spectrophotometer)测试各组在第0秒、以及反应1分钟后的A325吸光值。

以下式(I)进行“黑米萃取物组”、“黑米发酵物组”及“白米发酵物组”的SOD活性的计算，结果示于图2及图3：

公式(I)：

其中，ΔA325是“空白组在第0秒的A325吸光值”与“空白组在反应1分钟后的A325吸光值”的差值；ΔA’325是“实验组(即，“黑米萃取物组”、“黑米发酵物组”或“白米发酵物组”)在第0秒的A325吸光值”与“实验组在反应1分钟后的A325吸光值”的差值；V是待测样品的体积，单位为毫升(mL)；D是待测样品的稀释倍数。

由图2及图3可知，无论是相比于“黑米萃取物组”或“白米发酵物组”，“黑米发酵物组”的SOD活性皆明显较高。前述结果显示，通过使用本发明发酵方法对黑米萃取物进行发酵，可有效提升SOD活性，另一方面，相比于以白米作为材料所提供的萃取发酵物，以黑米作为材料所提供的确实具有较佳的SOD活性。此说明，本发明黑米萃取发酵物有助于提升细胞抗氧化能力，可抗肌肤老化，且效果优于白米萃取发酵物。

实施例2：黑米萃取发酵物于抑制AGEs生成效果试验

于以下实施例中，所使用的物料及器材如下：

200mM磷酸盐缓冲液(Sodium phosphate buffer，pH 7.4)

以200mM磷酸盐缓冲液配置含有0.06％NaN₃的60毫克/毫升的胶原蛋白

以200mM磷酸盐缓冲液配置1.5M D-果糖

ELISA读盘机

实验组：

I.对[制备实施例A-1]所提供的黑米萃取物、[制备实施例A-4]所提供的黑米萃取发酵物、以及[制备实施例B]所提供的白米萃取发酵物各取0.4毫升，分别作为“黑米萃取物组”、“黑米发酵物组”及“白米发酵物组”的待测样品，并分别与胶原蛋白溶液(0.4毫升)、及果糖溶液(0.4毫升)均匀混合，以提供三种混合溶液；

II.取0.1毫升步骤I提供的的混合溶液，并检测其于激发光波长360nm及放射光波长460nm的荧光强度，各组皆重复进行三次前述荧光检测步骤，并将所获得的荧光强度分别进行平均，以获得平均荧光值(此称为“实验组0小时的荧光值”)；

III.将步骤I提供的混合溶液置于50℃下反应24小时，使溶液中的胶原蛋白发生醣化反应，以提供三种醣化反应溶液；以及

IV.取0.1毫升步骤III提供的的醣化反应溶液，并检测其于激发光波长360nm及放射光波长460nm的荧光强度，各组皆重复进行三次前述荧光检测步骤，并将所获得的荧光强度分别进行平均，以获得平均荧光值(此称为“实验组24小时的荧光值”)。

B.控制组：

i.取0.4毫升的水，与胶原蛋白溶液(0.4毫升)及果糖溶液(0.4毫升)均匀混合，以提供一混合溶液；

ii.取0.1毫升步骤i提供的混合溶液，并检测其于激发光波长360nm及放射光波长460nm的荧光强度，重复进行三次前述荧光检测步骤，并将所获得的荧光强度分别进行平均，以获得平均荧光值(此称为“控制组0小时的荧光值”)；

iii.将步骤i提供的混合溶液置于50℃下反应24小时，使溶液中的胶原蛋白发生醣化反应，以提供一醣化反应溶液；以及

iv.取0.1毫升步骤iii提供的醣化反应溶液，并检测其于激发光波长360nm及放射光波长460nm的荧光强度，重复进行三次前述荧光检测步骤，并将所获得的荧光强度分别进行平均，以获得平均荧光值(此称为“控制组24小时的荧光值”)。

其后，经由下式(II)计算各实验组的抗醣化活性(％)，结果示于图4及图5。

由图4及图5可知，无论是相比于“黑米萃取物组”或“白米发酵物组”，“黑米发酵物组”的抗醣化效果皆显著较佳。前述结果显示，通过使用本发明发酵方法对黑米萃取物进行发酵，可有效提升其于抗醣化(抑制AGEs生成)的效果，另一方面，相比于以白米作为材料所提供的萃取发酵物，以黑米作为材料所提供的确实具有较佳的抗醣化(抑制AGEs生成)效果。此说明，本发明黑米萃取发酵物可通过抑制AGEs生成，达到紧致皮肤、提升肌肤弹力、抗皱、抗肌肤老化的目的，且效果优于白米萃取发酵物。

实施例3：黑米萃取发酵物的保湿多糖含量试验

已知保湿多糖具有保持肌肤水分的效果，为了解本发明黑米萃取发酵物是否具有较高的保湿多糖含量，进行以下保湿多糖含量测试。

标准曲线绘制：

I.取10毫克葡萄糖置于10毫升的容器中，并以ddH₂0将其配置为1毫克/毫升葡萄糖溶液；

II.以ddH₂0将步骤I提供的葡萄糖溶液系列稀释为0、20、50、100、150、200微克/毫升的葡萄糖溶液；

III.取步骤II所提供的葡萄糖溶液(各浓度取100微升)，分别置于玻璃试管中；

IV.于各玻璃试管中加入500微升的5％苯酚溶液、以及2.5毫升硫酸溶液(95.5％)，漩涡混合后静置20分钟，以提供六组混合溶液；

V.取步骤IV所提供的各组混合溶液(各组取200微升)，置于96孔盘中，测量在490nm下的吸光值，并绘制标准曲线。

实验组：

i.对[制备实施例A-1]所提供的黑米萃取物、[制备实施例A-4]所提供的黑米萃取发酵物、以及[制备实施例B]所提供的白米萃取发酵物各取100微升，分别作为“黑米萃取物组”、“黑米发酵物组”及“白米发酵物组”的待测样品，并分别置于玻璃试管中；

ii.于各玻璃试管中分别加入500微升的5％苯酚溶液、以及2.5毫升硫酸溶液(95.5％)，漩涡混合后静置20分钟，以提供三组混合溶液；

iii.取步骤ii所提供的各组混合溶液(各取200微升)，置于96孔盘中，以ELISA读盘机测量在490nm下的吸光值，并经由内差法计算[制备实施例A-1]所提供的黑米萃取物、[制备实施例A-4]所提供的黑米萃取发酵物、以及[制备实施例B]所提供的白米萃取发酵物的保湿多糖含量，结果示于图6及图7。

由图6及图7可知，无论相比于“黑米萃取物组”或“白米发酵物组”，“黑米发酵物组”的保湿多糖含量皆明显较高。前述结果显示，通过使用本发明发酵方法对黑米萃取物进行发酵，可有效提升保湿多糖含量，另一方面，相比于以白米作为材料所提供的萃取发酵物，以黑米作为材料所提供的确实具有较高的保湿多糖含量、有助于提升皮肤的保湿能力。此说明，本发明黑米萃取发酵物可用于保湿，且效果优于白米萃取发酵物。

实施例4：黑米萃取发酵物于提升皮肤水通道蛋白表现的效果试验

水通道蛋白为皮肤细胞的细胞膜上负责主动运输水分的通道，相比于一般的水分扩散作用，水通道蛋白可以更快速的补充皮肤细胞的水分。为了解本发明黑米萃取发酵物是否可提升皮肤细胞中水通道蛋白的表现，进行以下的水通道蛋白荧光染色实验。

于以下实施例中，所使用的物料及器材如下：

1.细胞株：人类初代皮肤角质形成细胞(human primary epidermalkeratinocytes HPEK-50，购自CELLnTEC)。

2.培养基：Keratinocyte-SFM(1X)，购自Thermo。

3.一级抗体：Polyclonal anti-AQP3 antibody，购自Boster immunoleader。

4.二级抗体：Anti-mouse-alexa 488 antibody，购自Thermo。

5.赫斯特(Hoechst)染剂：Hoechst 33342，购自Thermo。

6.Triton X-100：购自Sigma。

7.BSA：购自Bio Basic Inc.。

8.10％甲醛：购自ECHO。

将HPEK-50细胞株分为三组(每组2x10³个细胞)，分别植入不同的细胞培养玻片(Chamber Slide)中，并分别以如下培养基培养过夜：

1.控制组：培养基。

2.黑米萃取物组：含有4％[制备实施例A-1]所提供的黑米萃取物的培养基。

3.黑米发酵物组：含有4％[制备实施例A-4]所提供的黑米萃取发酵物的培养基。

对上述各组所提供的细胞进行以下处理：在室温下，以4％三聚甲醛固定细胞15分钟；以1xPBS润洗细胞三次后，再添加0.5％的Triton X-100以渗透细胞，并于室温下培养10分钟；添加1％BSA，并于室温下反应1小时以封闭(blocking)反应；以1xPBS润洗细胞三次后，再添加经1％BSA稀释的一级抗体，并于37℃下培养2小时；以1xPBS润洗细胞三次后，再添加经1％BSA稀释的二级抗体，并于37℃下培养1小时；以1xPBS润洗细胞三次后，再添加赫斯特(Hoechst)染剂，并于室温下培养3至5分钟；以1xPBS润洗细胞三次后，以封片胶封片，并于荧光显微镜下观察玻片及拍照。结果示于图8(蓝色荧光部分为细胞核；绿色荧光部分为水通道蛋白)。

由图8可知，无论是相比于“控制组”或“黑米萃取物组”，“黑米发酵物组”的细胞的水通道蛋白表现量皆明显较高。前述结果显示，本发明黑米萃取发酵物确实具有提升水通道蛋白表现量的效果、有助于提升皮肤的保湿能力。此再次说明，本发明黑米萃取发酵物可用于保湿。

实施例5：黑米萃取发酵物于紧致皮肤的效果试验

本实施例以细胞实验仿真皮肤组织生长的状况，其中，若一待测物可使皮肤组织生长得越紧密(即，使组织形成的面积变小、胶原蛋白密度提升)，代表该待测物具有越高的紧致皮肤效果。

于以下实施例中，所使用的物料及器材如下：

1.细胞株：人类皮肤纤维母细胞(Human skin fibroblast)CCD-966sk(BCRCNo.60153)。

2.培养基：90％Earle’s平衡盐溶液中的MEM培养基(Minimum essential medium(Eagle)in Earle’s BSS)，含0.1mM非必要胺基酸(non-essential amino acids)、1.5克/升碳酸氢钠及1mM丙酮酸钠、以及10％胎牛血清；购自Gibco。

3.PBS：购自Gibco。

4.第一型胶原蛋白(Collagen I)：购白Gibco。

5.NaOH。

将CCD-966sk细胞株分为三组(每组2x10⁵个细胞)，分别添加至不同的灭菌管中，并于各管添加浓度为3毫克/毫升的胶原蛋白溶液，以提供三组混合溶液(其中，各组的细胞悬浮液与胶原蛋白溶液的体积百分比为0.66∶0.33(细胞悬浮液：胶原蛋白溶液))。接着，快速于各组混合溶液中添加少量1莫耳浓度的NaOH(可将酚红培养基指示剂(phenol redmedia indicator)转变为淡粉红色的量)，并上下吸取混合。其后，取前述混和均匀的溶液(各组取500微升)置于24孔盘(每孔1.9平方公分)中，将孔覆盖后置于室温下20分钟，以获得胶原蛋白胶。

于前述孔中，分别加入500微升以下培养基：

1.控制组：培养基。

然后，以200微升移液管的尖端轻轻将胶原蛋白胶自孔中分离、并重新悬浮。将24孔盘置于37℃、加湿的5％C02下培养48小时。最后，将24孔盘置于光箱上，并以数字相机于该24孔盘的上方进行拍照。以ImageJ软件追踪各胶原蛋白胶的轮廓，并计算各胶原蛋白胶的表面积，照片图示于图9(其中，黄色线为“控制组”胶原蛋白胶的轮廓、蓝色线为“黑米萃取物组”胶原蛋白胶的轮廓、红色线则为“黑米发酵物组”胶原蛋白胶的轮廓)。最后，以“控制组”的结果为基准(即，将控制组的胶原蛋白密度设定为100％)，计算其他各组的相对胶原蛋白密度。数据使用Excel软件进行统计分析，以学生t(student’s t-test)检验是否达到统计学上的显著性。结果示于图10。

由图9及图10可知，无论是相比于“控制组”或“黑米萃取物组”，“黑米发酵物组”细胞的胶原蛋白胶表面积皆明显较小、胶原蛋白密度较高。前述结果显示，本发明黑米萃取发酵物确实具有紧致皮肤的效果。

实施例6：人体实验

(6-1)使用黑米萃取发酵物面膜的短期试验

本实验采自身对照方式进行，招集五位受试者(25至55岁的健康男性/女性)，将每位受试者的手臂内侧分成两区，分别贴敷黑米萃取发酵物面膜(以面膜中精华液的总重计，含有1％[制备实施例A-4]所提供的黑米萃取发酵物)、及安慰剂面膜(与黑米萃取发酵物面膜的差异仅在于，不含本发明黑米萃取发酵物)。贴敷20分钟后，将面膜取下、以指腹稍加按摩促进吸收，并于第0分钟(使用前)及第20分钟(使用后)，以

Combo SkinAnalyzer肌肤分析仪进行肌肤含水量、肌肤松弛度、及肌肤弹力测定并记录。接着，以第0分钟的结果作为基准(即，将第0分钟设定为100％)计算20分钟后的肌肤含水量、肌肤松弛度、及肌肤弹力。结果示于图11至图13。

由图11至图13可知，相比于使用安慰剂面膜，在使用黑米萃取发酵物面膜20分钟后，受试者的肌肤含水量、及肌肤弹力明显提升，且肌肤松弛度明显降低。前述结果显示，本发明的黑米萃取发酵物具有在短时间内达到提升肌肤含水量、提升肌肤弹性、及紧致肌肤的目的。

(6-2)食用黑米萃取发酵物的长期试验

本实验采自身对照方式进行，招集九位受试者(25至60岁的肌肤松弛的男性/女性)，每日饮用一瓶(5毫升)黑米萃取发酵物饮料(以饮料的总重计，含有10％[制备实施例A-4]所提供的黑米萃取发酵物)，持续4周。分别于第0周(饮用含有本发明黑米萃取发酵物的饮料前)及第4周(饮用含有本发明黑米萃取发酵物的饮料后)，以

ComboSkin Analyzer肌肤分析仪、及

Skin Analysis System全脸仪进行测定并记录。接着，以学生t检验(Student t-test)进行统计分析，并以第0周的结果作为基准(即，将第0周设定为100％)计算饮用含有本发明黑米萃取发酵物的饮料4周后的肌肤含水量、肌肤弹力、肌肤松弛度、及肌肤皱纹，结果示于图14至图17。图18所显示为其中两个受试者的肌肤皱纹照片图。

由图14至图18可知，在连续饮用含有本发明黑米萃取发酵物的饮料4周后，受试者的肌肤含水量、及肌肤弹力明显提升，且肌肤松弛度、及肌肤皱纹明显降低。前述结果显示，本发明的黑米萃取发酵物确实具有保湿、提升肌肤弹力、紧致肌肤、及抗皱的效果。

实施例7：本发明化合物于促进胶原蛋白分泌的效果试验

于以下实施例中，所使用的物料及器材如下：

1.细胞株：人类皮肤纤维母细胞(Human skin fibroblast)CCD-966Sk，购自

，型号CRL-1881。

2.培养基：含有10％FBS、1％青霉素/链霉素、及1mM丙酮酸钠的MEM培养基，购自Gibco。

3.PBS：购自Gibco。

4.可溶性胶原蛋白检测套组(Sircol^TM Soluble Collagen Assay kit)：购自Biocolor。

5.ELISA读盘机：购自BioTek。

将CCD-966Sk细胞株分成六组(每组2x10⁴个细胞)，并分别植入24孔盘中(每孔中含有500微升的培养基)。于37℃下培养24小时后，以PBS清洗细胞，接着，将各组细胞分别于以下培养基中48小时：

1.控制组：培养基(共500微升)。

2.第I组：含有20微克/毫升[制备实施例C]所提供的式(I)化合物的培养基(共500微升)。

3.第II组：含有20微克/毫升[制备实施例C]所提供的式(II)化合物的培养基(共500微升)。

4.第III组：含有20微克/毫升[制备实施例C]所提供的式(III)化合物的培养基(共500微升)。

5.第IV组：含有20微克/毫升[制备实施例C]所提供的式(IV)化合物的培养基(共500微升)。

6.第V组：含有20微克/毫升[制备实施例C]所提供的式(V)化合物的培养基(共500微升)。

接着，对上述各组所提供的细胞进行以下处理：分别将各组的培养基移至1.5毫升的微离心管中；于各管中添加200微升的胶原蛋白分离及浓缩试剂(Collagen Isolation&Concentration Reagent)，并倒置这些离心管6-8次，然后将这些离心管置于4℃下过夜；之后，以12000rmp离心10分钟，并移除上清液；添加1000微升的Sircol染剂后，轻轻摇晃30分钟；再次以12000rmp离心10分钟，并移除上清液；然后，添加750微升的酸碱清洗剂(acid-salt washing reagent)，并以12000rmp离心10分钟；移除上清液后，将离心管倒置以排空液体，并以棉花棒移除剩余的液体；最后，添加250微升的碱剂(Alkali reagent)，并混和均匀，再以ELISA读盘机读取555nm的吸光值；以学生t检验(Student t-test)进行统计分析，并以“控制组”作为基准(即，将控制组的胶原蛋白分泌量设定为100％)计算“第I组”至“第V组”的相对胶原蛋白分泌量。结果示于图19。

由图19可知，相比于“控制组”，“第I组”至“第III组”、及“第V组”细胞的胶原蛋白分泌量皆明显提升。前述结果显示，式(I)至式(III)及式(V)化合物确实具有提升肌肤弹力、紧致皮肤、以及抗皱的效果。

实施例8：本发明化合物于促进弹力蛋白表现的效果试验

于以下实施例中，所使用的物料及器材如下：

型号CRL-1881。

3.PBS：购自Gibco。

4.弹力蛋白检测套组(Fastin^TM Elastin Assay kit)：购自Biocolor。

5.ELISA读盘机：购自BioTek。

将CCD-966Sk细胞株分成六组(每组1x10⁵个细胞)，分别植入6孔盘中后，于37℃下培养24小时。接着，将各组细胞分别于以下培养基中48小时：

1.控制组：培养基(共2毫升)。

2.第I组：含有20微克/毫升[制备实施例C]所提供的式(I)化合物的培养基(共2毫升)。

3.第II组：含有20微克/毫升[制备实施例C]所提供的式(II)化合物的培养基(共2毫升)。

4.第III组：含有20微克/毫升[制备实施例C]所提供的式(III)化合物的培养基(共2毫升)。

5.第IV组：含有20微克/毫升[制备实施例C]所提供的式(IV)化合物的培养基(共2毫升)。

6.第V组：含有20微克/毫升[制备实施例C]所提供的式(V)化合物的培养基(共2毫升)。

接着，对上述各组所提供的细胞进行以下处理：移除培养基，并以1xPBS清洗细胞一次；以胰蛋白酶处理细胞3分钟；接着，以培养基停止胰蛋白酶的活性；将经胰蛋白酶处理的细胞转移至1.5毫升的微离心管中，以300xg离心5分钟；以PBS润洗细胞后，再以300xg离心5分钟；之后，将细胞颗粒(pellet)保留在300微升的PBS中，并于其中添加100微升的1.0M草酸(oxalic acid)，再于100℃下培养1小时；添加等量弹性蛋白沉淀剂(ElastinPrecipitating Reagent)至各管，均匀混和后静置15分钟；以10，000xg离心10分钟，并将管中的液体排空；接着，添加1毫升染剂，混和均匀后于震荡器上培养90分钟；将未结合的染剂排空后，可见到弹性蛋白成红棕色，并沉淀于管底；于各管加入250微升的染剂解离剂(DyeDissociation Reagent)，并通过漩涡混合器将染剂释放至溶液中；将溶液移至96孔盘中，并以ELISA读盘机读取513nm的吸光值；最后，以学生t检验(Student t-test)进行统计分析，并以“控制组”作为基准(即，将控制组的弹力蛋白表现量设定为100％)计算“第I组”至“第V组”的相对弹力蛋白表现量。结果示于图20。

由图20可知，相比于“控制组”，“第I组”至“第V组”细胞的弹力蛋白表现量皆明显提升。前述结果显示，式(I)至式(V)化合物确实具有提升肌肤弹力、紧致皮肤、以及抗皱的效果。

实施例9：黑米萃取物发酵前后，本发明化合物的含量变化试验

取[制备实施例A-1]所提供的黑米萃取物、以及[制备实施例A-4]所提供的黑米萃取发酵物，分别配置成浓度为20毫克/毫升的样品溶液。接着，各取10微升的样品溶液，并以HPLC对其成分进行分析。其中，HPLC所使用的分析管柱为Octadecylsilyl，Mightysil RP-18 GP 250(250x 10毫米，5微米)，检测波长为280nm，以1.0毫升/分钟的流速冲提，冲提液的组成如下表2所示：

表2：

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	98	2
10	98	2
			40	30	70
50	0	100
			60	0	100
62	98	2
			70	98	2

*A：水+0.1％甲酸；B：甲醇+0.1％甲酸。

经上述步骤分析所得的HPLC指纹图谱示于图21，其中，上方图显示黑米萃取发酵物的HPLC指纹图谱、下方图显示黑米萃取物的HPLC指纹图谱。由图21可知，相比于黑米萃取物，以本发明发酵方法制得的黑米萃取发酵物具有黑米萃取物所没有的式(I)至式(III)化合物、且具有较高的式(IV)及式(V)化合物含量。前述结果显示，本发明制备黑米萃取发酵物的方法确实可以有效提升黑米萃取物中活性成分的含量。

如上述实施例所示，本发明黑米萃取发酵物、以及式(I)至式(V)化合物确实可有效抑制AGEs生成、抗氧化、提升水通道蛋白表现、紧致肌肤、提升胶原蛋白分泌量、及提升弹力蛋白表现量，故可用于抗肌肤老化、保湿、抗皱、提升肌肤弹力、及紧致皮肤。此外，本发明制备黑米萃取发酵物的方法确实可以有效提升黑米萃取物中活性成分的含量。