CN110392565A - 有机化合物中或与之相关的改进 - Google Patents

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Abstract

包含低分子量乙酰化透明质酸或其钠盐的护肤组合物，其具有小于50kDa的重均分子量和至少为3.6的平均乙酰化度，该组合物用于处理年龄对人体皮肤上的可见影响。

Description

有机化合物中或与之相关的改进
本发明涉及可用于减少人体皮肤上衰老的可见迹象的活性成分和方法。更特别地，本发明涉及乙酰化透明质酸或其钠盐用于抑制牵涉时间诱导和UV诱导的皮肤恶化的某些基质降解酶的用途。本发明还涉及用于减少衰老的可见迹象的新型乙酰化透明质酸以及制备它们的方法。
显然有吸引力的期望自然植根于现代消费者。即使吸引力的理想随着时间的推移而发生变化，但是普遍认为我们皮肤的状况和外观是富有吸引力的外观的重要贡献者。
为当今的消费者提供许多用于护理皮肤的化妆品。通常，这些产品是霜剂和洗剂的形式，其含有用于保湿皮肤的水，以及用于皮肤再润滑的脂肪和脂质，并且它们的作用施加在皮肤的最外层。
透明质酸的皮肤软化效果在本领域中是已知的。然而，还已知化妆品制剂中透明质酸的物理条件随时间退化。EP0725083中提出乙酰化透明质酸作为透明质酸的替代物，因为据报道它具有与透明质酸相同的皮肤软化功能，但是没有表现出与游离酸相同的物理退化。然而，EP0725083没有启示或暗示乙酰化透明质酸在处理衰老对皮肤的影响或其潜在原因中的用途。
存在低(EP0725083；和CN106176286)和中等(Saturnino等人，Biomed ResearchInternational，2014，921549：“Acetylated hyaluronic acid：enhancedbioavailability and biological studies”；和Oka等人，Polymer，41：“Differentialscanning calorimetry studies on the mechanism of skin-softening effect ofsodium acetylhyaluronate”)分子量乙酰化透明质酸和乙酰基透明质酸酯的几个公开文献，所述乙酰化透明质酸和乙酰基透明质酸酯具有不同的乙酰基取代度，它们可用于皮肤护理。但是，如下所示，与本发明的产品相比，这些产品存在大量缺点。
提供有效的可用于处理皮肤衰老原因的化妆品制剂且由此减少衰老的可见迹象仍然是未得到满足的需求。
皮肤的结构框架称为其细胞外基质。该内部框架包含多网格聚合物的网络结构，例如胶原蛋白和弹性蛋白，其内部包含皮肤细胞。它负责皮肤的机械性能，包括坚固性，强度，柔软性和弹性。皮肤衰老的物理迹象反映了皮肤基质的状况。更特别地，基质越弱且越不规则，则皮肤趋于具有更多的皱纹、粗糙度和下垂。
皮肤的细胞外基质是一种宝贵的资源，在健康和年轻的皮肤中生产和消耗。人体皮肤的光滑度、坚实度和年轻度在很大程度上取决于其基质的状况，而这又取决于基质合成和基质分解/再循环的平衡。皮肤的细胞外基质由胶原蛋白组成(I型胶原蛋白最常见)；弹性蛋白；和其他成分如糖胺聚糖(GAG)组成。基质由真皮中的成纤维细胞合成，并且通过某些特定的酶(基质金属蛋白酶或MMP)进行重塑。这些酶通常牵涉伤口愈合，但它们在时间和紫外线诱导的衰老过程中过度表达，因此它们促进强烈和不受控制的基质分解，这已知是造成衰老的明显迹象的原因，如皮肤塌陷和皱纹形成。根据其底物特异性，大约有20种MMP被分组成不同的类别。其中包括胶原酶，明胶酶，溶基质素和膜型MMP。MMP-1是最熟知的胶原酶，并且牵涉结构胶原蛋白的裂解，例如1型胶原蛋白。MMP-3是溶基质素，其牵涉基膜胶原蛋白的裂解，例如胶原蛋白IV。
基质蛋白是具有长半衰期(在弹性蛋白的情况下为70年左右)的大的结构分子。因此，这些材料在正常的人体寿命期间几乎不能得到补充或更新。因此，存在基质随着年龄的增长加速的进行性改变和降解，从而破坏和削弱皮肤的支架并产生衰老的可见迹象。
皮肤衰老是内在的时间衰老过程与环境因素叠加的结果，主要由暴露于紫外线辐射组成。在正常的时间衰老过程中MMP水平过度升高，并且环境因素进一步提高MMP水平。降低MMP酶的水平并使其恢复到正常、年轻的水平足以缓解基质降解，并保持健康的基质，这可能有助于减少或消除人体皮肤上衰老的可见迹象。
仍然需要提供用于皮肤应用的方法和化妆品制剂，其可以通过抑制升高的基质降解酶(例如MMP)水平或将其降至年轻或健康皮肤中发现的年轻或平衡水平来逆转或减少皮肤基质的降解。
本发明涉及乙酰化透明质酸或其钠盐(乙酰基透明质酸钠)用于控制皮肤细胞外基质中基质降解物质的平衡、减少必需基质蛋白质如胶原蛋白降解的程度以及减少衰老的可见迹象(时间诱导和环境诱导)、特别是预防或减少皮肤皱纹以及生产和保持年轻肌肤的用途。
因此，本发明包括以下方面和实施方案：
抑制与升高的基质降解酶水平相关的皮肤细胞外基质降解的方法，所述方法包括向皮肤施用有效量的乙酰化透明质酸或其钠盐的步骤，特别是以本发明的护肤组合物的形式。
上述方法，其为一种减少皮肤衰老的可见迹象的方法，更特别地说是一种预防或减少皱纹的方法。
上述方法，其中基质降解酶是基质金属蛋白酶，且更特别地为酶MMP-1或MMP-3。
上述方法，其中乙酰化透明质酸或其钠盐用于降低细胞外基质中胶原的降解程度，特别是通过金属蛋白酶的降解。
具有高乙酰化度的乙酰化透明质酸或其钠盐的低分子量级分，用于本文所述的方法。
上述乙酰化透明质酸或其钠盐，其具有的重均分子量为约50kDa或更小，更特别地为约35kDa或更小，且仍然更特别地为约30kDa或更小。
上述乙酰化透明质酸或其钠盐，其具有的重均分子量为约50kDa或更小，更特别地为约35kDa或更小，且仍然更特别地为约30kDa或更小，并且多分散性指数为小于2.3，更特别地为小于2.0，更特别地为小于1.8，更特别地为小于1.7，更特别地为小于1.6或更小，更特别地为小于1.5，更特别地为小于1.4，且更特别地为约1.3或更小。
上述乙酰化透明质酸或其钠盐，其具有的平均乙酰化度大于3.6，更特别地为3.7或更大，更特别地为3.8或更大，更特别地为3.9或更大，且仍然更特别地为4。
上述乙酰化透明质酸或其钠盐，其具有的使用定量2D NMR测定的平均乙酰化度大于3.6，更特别地为3.7或更大，更特别地为3.8或更大，更特别地为3.9或更大，且仍然更特别地为4。
制备具有的重均分子量为50kDa或更小且平均乙酰化度大于3.6的低分子量乙酰化透明质酸或其钠盐的方法，包括以下步骤：
(i)选择具有50kDa或更小、更特别地35kDa或更小或仍然更特别地30kDa或更小的分子量的低分子量透明质酸；
(ii)使其经历乙酰化条件，其中乙酰化条件优选包括使所述低分子量透明质酸与乙酸/乙酐混合物在强酸存在下反应的步骤；和
(iii)优选通过使用添加剂水的沉淀来分离所述低分子量乙酰化透明质酸。
化妆品制剂，包含有效量的上述乙酰化透明质酸或其钠盐。
护肤组合物，包含低分子量乙酰化透明质酸或其钠盐，其特征在于所述低分子量乙酰化透明质酸或其钠盐具有50kDa或更小的重均分子量和大于3.6的平均乙酰化度。
上述化妆品制剂，且特别是护肤组合物，包含至少一种化妆品可接受的赋形剂。
根据以下对本发明的具体实施方案的详细描述，将更好地理解本发明的这些和其他方面。
皮肤衰老是涉及皮肤随年龄增长所经历的变化的术语，无论是通过时间衰老还是通过暴露在阳光下(光老化)或通过其他环境因素如烟草烟雾，极端的冷、热或风的气候条件，化学污染物或污染物质，且包括通过触摸产生的所有外部可见和/或可察觉的变化，例如但不限于皮肤上的不连续性的发展，例如皱纹，细纹，沟槽，不规则或粗糙，毛孔大小增加，弹性丧失，紧致度丧失，光滑度丧失，变形恢复能力丧失，皮肤下垂如脸颊下垂，眼袋外观或双下巴外观等，皮肤颜色的变化，如痕迹，变红，或过度色素沉着区域如老人斑或雀斑的出现等，异常分化，过度角化，弹性组织变性，角化病，胶原结构丧失，和角质层、真皮或表皮的其他组织学变化。
已知升高的基质金属蛋白酶(MMP)水平是皮肤衰老的关键因素。MMP，例如MMP-1和MMP-3牵涉基质降解，特别是I型胶原蛋白的降解，I型胶原蛋白是真皮中发现的最重要类型的胶原蛋白。在时间衰老过程中，以及作为UV暴露和暴露于其他环境因素的结果，MMP的产生增加，导致皮肤退化，皮肤塌陷，皱纹形成，并因此是皮肤衰老的第一个可见迹象。
令人惊讶的是，发现乙酰化透明质酸或其钠盐能够降低MMP的水平，特别是MMP-1和MMP-3的水平。尽管申请人不希望受理论束缚，但认为较低水平的MMP是减量调节编码这些酶的基因的结果。
已经在对皮肤中存在的三种主要细胞类型进行的某些基因表达研究中证明了本发明的乙酰化透明质酸或其钠盐的生物学效应：成纤维细胞，角质形成细胞和黑素细胞。乙酰化透明质酸或其钠盐的生物学影响也通过体外蛋白质和功能研究确定。我们发现，提供了一种新的抗衰老活性，其与限制基质降解和保护皮肤免受年龄迹象影响有关。以下在实施例中更详细地描述了这些研究。
相反，发现CN106176286中描述的乙酰化透明质酸(从Bloomage Freda BiopharmCo.，Ltd.获得)不诱导任何基因反应。
当施用于皮肤时，发现乙酰化透明质酸或其钠盐可以引起可观察到的生物效应，因为皮肤衰老的可见迹象的减少，例如皮肤皱纹的减少使得技术人员能够使本领域提供用于施用于人类受试者皮肤的化妆品制剂。
本发明的化妆品制剂，特别是护肤组合物含有化妆品可接受量的乙酰化透明质酸或其钠盐。
美容有效量的乙酰化透明质酸或其钠盐被理解为无毒但足够量的乙酰化透明质酸或钠盐以提供期望的效果。相对于化妆品制剂、特别是护肤组合物的总重，乙酰化透明质酸或其钠盐可以以约0.005至约5.0wt％，且更特别是约0.05至约0.5wt％的量存在。
本发明的化妆品制剂，特别是护肤组合物可含有一种或多种化妆品可接受的赋形剂。通常用于制备用于人体皮肤上的化妆品制剂的任何赋形剂均可用于本发明。适合的赋形剂包括但不限于可影响感官特性，皮肤渗透性和乙酰化透明质酸或其钠盐的生物利用度的成分。更特别地，它们包括液体，例如水，油或表面活性剂，包括石油，动物，植物或合成来源的液体，例如但不限于花生油，大豆油，矿物油，芝麻油，蓖麻油，聚山梨醇酯(polysorbates)，失水山梨醇酯，醚硫酸盐，硫酸盐，甜菜碱，糖苷，麦芽苷，脂肪醇，壬苯醇醚(nonoxynols)，泊洛沙姆，聚氧乙烯，聚乙二醇，右旋糖，甘油，毛地黄皂苷等。
化妆品制剂，特别是护肤组合物，可以是脂质体组合物，混合型脂质体，油质体，类脂质体(niosomes)，醇质体(ethosomes)，毫微型颗粒(milliparticles)，微粒，纳米颗粒和固体-脂质纳米颗粒，囊泡，胶束，表面活性剂的混合型胶束，表面活性剂-磷脂混合型胶束，毫微球，微球和纳米球，脂质球(liposphere)，毫微型胶囊(millicapsule)，微胶囊和纳米胶囊，以及微乳液和纳米乳液的形式，可以加入它们以实现乙酰化透明质酸或其钠盐的更大穿透力。
化妆品制剂，特别是护肤组合物，可以以任何固体，液体或半固体形式生产，可用于局部施用或通过透皮施用。因此，这些局部或透皮应用的制剂包括但不限于霜剂，多层乳剂，例如但不限于水包油和/或硅氧烷型乳剂，油包水和/或硅氧烷型乳剂，水/油/水或水/硅氧烷/水型乳剂，和油/水/油或硅氧烷/水/硅氧烷型乳剂，微乳，乳剂和/或溶液，液晶，无水组合物，水分散体，油，乳液，香脂，泡沫体，水性或油性洗剂，水性或油性凝胶，乳膏，水醇溶液，水-二醇溶液(hydro-glycolic solution)，水凝胶，搽剂，浆液，肥皂，面膜，浆液，多糖薄膜，软膏，摩丝，润发油，糊状物，粉末，棒形物，笔型物和喷雾剂或气雾剂(喷雾剂)，包括驻留型和冲洗型制品。
考虑到不可能使用未修饰的透明质酸或盐再现效果，乙酰化透明质酸或其钠盐引起生物效应的发现特别令人惊讶，从而证实该活性与游离酸形式或盐的乙酰化相关。
用于本发明的特别优选的乙酰化透明质酸或其钠盐形式的特征在于它们具有非常高的乙酰化度。更特别地，优选形式的乙酰化透明质酸的特征在于平均乙酰化度大于3.6，更特别地为3.7或更大，更特别地为3.8或更大，更特别地为3.9或更大，且仍然更特别地为4。
透明质酸是由含有N-乙酰基葡糖胺和葡糖醛酸的重复单元组成的多糖。它可以以游离酸或钠盐形式存在。在其乙酰化形式中，术语“乙酰化度”应理解为聚合物重复单元上被乙酰化的羟基数目的量度。天然透明质酸/盐聚合物的每个重复单元含有四个可被乙酰化的羟基，并且乙酰化度是这些基团中有多少被乙酰基取代的量度。
使用常规分析技术测量乙酰化度尤其具有挑战性。例如，我们发现传统的一维NMR是无效的，因为需要测量的质子的化学位移是一致的。
然而，申请人阐明了使用二维NMR的分析方法，其中透明质酸或其钠盐的葡糖胺部分上的N-乙酰基用作内标以定量乙酰化过程中引入的乙酰基官能度。
为了整合这两种信号(O-乙酰基和N-乙酰基)，申请人设计了一种2D-NMR方法。更特别地，所述2D-NMR方法是异核方法(异核单量子相干(HSQC)分析)，其在一个维度上测量质子信号，并且在第二维度上测量来自碳核的信号。
通过采用2D-NMR技术，申请人发现能够从与O-乙酰基相关的信号中清楚地分解出N-乙酰基信号，从而允许这些基团的整体整合(volume integration)，且由此能够定量确定乙酰化度。适合的HSQC实验的基本方案在以下段落中阐述：
通过梯度增强的1H-13C HSQC方法进行乙酰化度分析，该方法允许以定量方式对所述乙酰基进行整体整合。
1H-13C偶合常数提供有关分子中原子连接性的信息，在NMR光谱中，它负责光谱中许多信号的出现。HSQC实验中的交叉峰的积分体积由1H-13C偶合常数1JC,H调节。然而，由不同偶合常数引起的交叉峰通常不允许定量积分。然而，申请人有利地发现，在当前分析方法的情况下，1JC,H(N-乙酰基)基本上等于1JC,H(O-乙酰基)，从而允许定量分析。
如在标准1D-NMR定量中，可以提供足够的弛豫延迟以确保N-乙酰基和O-乙酰基质子均有时间从一次扫描到另一次扫描弛豫，以保持定量条件。另外，为了在该顺序期间限制感兴趣的N-和O-乙酰基种类之间的差别T2弛豫，将HSQC的INEPT(通过极化转移增强的不敏感核)转移中由(4X JC,H)-1产生的两个延迟尽可能短地保持，例如约1.5毫秒。
2D-NMR测量可以在本领域可用的任何高场仪器上进行。适合仪器的一个例子是配备有Cryoprobe探头的高场NMR仪器，更特别地为Bruker Avance III 600MHz，MicroCryoprode TCI 1.7mm。
可以将用于分析的样品制备成1.2mg乙酰化透明质酸或其钠盐，将其溶解在50mlD2O 99.96％D中。可以将样品溶液转入NMR管(1.7mm，Bruker)中用于测量。典型的测量参数包括：T＝60℃；扫描次数＝4；虚拟扫描＝32；恢复延迟＝10s；采集时间＝177ms；光谱宽度(1H)＝6.0ppm；光谱宽度(13C)＝110ppm；1H-脉冲偏移＝3.5ppm；13C-脉冲偏移＝60ppm；时域(1H)＝1272；时域(13C)＝256。用于数据采集和处理的软件，包括交叉峰积分，是TopSpin3.0(Bruker)。
特别地，该2D-NMR技术允许将本发明的乙酰化透明质酸或钠盐与EP0725083中描述的和资生堂(Shiseido)出售的产品区分开：资生堂的乙酰基透明质酸酯具有仅为约3.6的平均乙酰化度。这一点很重要，因为资生堂的产品在抗衰老活性方面也被证明不如本发明的产品，如下面的实施例5所示。
用于本发明的方法和化妆品制剂，特别是护肤组合物中的乙酰化透明质酸或钠盐是低分子量乙酰化透明质酸或其钠盐。术语“低分子量”是指具有为50kDa或更小，更特别地为35kDa或更小，更特别地为约30kDa或更小，更特别地为25kDa或更小，更特别地为20kDa或更小，更特别地为15kDa或更小，且仍然更特别地为约10kDa至15kDa，例如13kDa+/-1kDa的重均分子量(Mw)的聚合物材料。
乙酰化透明质酸或其钠盐聚合物部分的分子量应该相当窄地分散。优选地，乙酰化透明质酸或其钠盐具有的多分散性指数(Mw/Mn)小于2.0，更特别地小于1.8，更特别地小于1.7，更特别地小于1.6或更小，更特别地小于1.5，且仍然更特别为约1.4或更小。
为了比较，使用光散射检测通过SEC-HPLC(尺寸排阻色谱法和高效液相色谱法)分析EP0725083(从资生堂获得)和CN106176286(从福瑞达(Freda)获得)中描述的产物。获得了以下结果：
重均分子量(Mw) 多分散性指数(Mw/Mn)
资生堂产品 34’958Da 1.560
福瑞达产品 45’676Da 1.580
本发明的产品 11’721Da 1.485
乙酰化透明质酸或其钠盐的特性粘度优选小于0.3dl/g(30cm3/g)，且更特别地为0.245dl/g(24.5cm3/g)+/-0.01dl/g(1cm3/g)。
上述物理参数可通过HPLC尺寸排阻色谱法测量。一种适合的仪器是Viscotek GPCmax VE2001，其配备三重检测参数(Viscotek TDA305)：折射计、毛细管粘度计和光散射。
光散射测量通过测量当激光束通过分散的颗粒样品时散射的光强度的角度变化来表征粒度分布。大颗粒相对于激光束以相对较小的角度散射光，而小颗粒以相对较大的角度散射光。然后使用Mie光散射理论分析角散射强度数据以计算负责产生散射图案的粒子的尺寸。将粒径报告为体积等价球体直径。尺寸排阻色谱(SEC)是一种分析技术，其可以基于从填充多孔凝胶的柱上的洗脱分离溶解的大分子。当SEC与光散射、粘度计和浓度检测器(称为三重检测)结合时，可以测量分子量、分子大小和特性粘度。
在典型的测量方案中，通过在45℃下搅拌1h将乙酰化透明质酸或其钠盐(0.2g)溶解在TBS缓冲液(100ml)中，然后在室温下将溶液再储存2h。搅拌使聚合物完全水合。将溶液通过0.2μm尼龙注射器过滤器过滤。然后将溶液注入HPLC SEC LALS(100μl)中。用TBS缓冲液pH 7在35℃以0.35ml/min进行分析。典型的运行时间为90分钟，典型的注射体积为100μl。
低分子量乙酰化透明质酸或其钠盐是用于本发明方法和化妆品制剂，特别是护肤组合物的优选材料。低分子量材料的应用被认为是有利的，因为与具有较高分子量的级分相比，其具有优异的皮肤穿透特性。
根据本领域已知的技术，可以将透明质酸或其钠盐乙酰化。
在适合的方法中，将透明质酸溶解在乙酐和乙酸的混合物中。此后，向溶液中加入强酸如硫酸，以实现乙酰化。在EP0725083B1中描述了这种方法。
在本发明的一个实施方案中，乙酸与乙酐的混合比(wt/wt)可以在1:4至1:1的范围内变化。强酸与透明质酸的混合比(wt/wt)可以为1:5至1:1。
申请人以令人惊讶的方式发现，如果使用低分子量透明质酸作为原料进行乙酰化反应，则可以实现特别高的乙酰化度。不希望受理论束缚，据信低分子量透明质酸比高分子量原料更容易和更广泛地乙酰化，因为羟基在低分子量原料中的空间位阻较小，因此更容易乙酰化。因此，优选使用低分子量透明质酸或钠盐作为起始底物制备本发明的乙酰化透明质酸或其钠盐。
因此，在本发明的另一个方面，提供了一种使透明质酸乙酰化的方法，其中透明质酸原料是具有重均分子量为约50kDa或更小，更特别地为约35kDa或更小，更特别地为约30kDa或更小的低分子量部分。
通过使用具有上述低分子量的透明质酸底物，可以制备具有为50kDa或更小，更特别地为35kDa或更小，更特别地为约30kDa或更小，更特别地为25kDa或更小，更特别地为20kDa或更小，更特别地为15kDa或更小，且仍然更特别地为约10kDa-15kDa，例如13kDa+/-1kDa的重均分子量(Mw)的高度乙酰化的透明质酸或其钠盐。这些低分子量形式的乙酰化透明质酸和乙酰基透明质酸钠构成本发明的另外方面。
一种制备低分子量乙酰化透明质酸或其钠盐的方法构成本发明的另一个方面，所述方法包括选择具有为约50kDa或更小、更特别地为约35kDa或更小且仍然更特别地为约30kDa或更小的重均分子量的低分子量透明质酸并且在乙酰化条件下使其反应的步骤，例如，本文所述的那些条件。
通过上述合成方法，得到含有期望的乙酰化透明质酸的粗反应混合物，优选从中分离和纯化乙酰化透明质酸。
因此，本发明在其另一方面提供了从溶液中含有低分子量乙酰化透明质酸的粗反应混合物中分离低分子量乙酰化透明质酸的方法。
在本发明的一个具体实施方案中，分离低分子量乙酰化透明质酸的方法包括使用添加剂水将其从溶液中沉淀的步骤。
乙酰化透明质酸的特征性低分子量使得沉淀步骤能够使用添加剂水而不是添加剂挥发性有机溶剂进行。这与使用添加剂挥发性有机溶剂(例如丙酮)从粗反应混合物中沉淀出乙酰化透明质酸的钠盐的现有技术方法形成对比。
考虑到在后处理期间难以除去所有有机溶剂，根据现有技术方法形成的透明质酸的钠盐可能含有挥发性溶剂的残余物，这是不希望的。本发明的显著优点在于可以获得低分子量乙酰化透明质酸，其不含挥发性有机溶剂，例如丙酮。
不含挥发性有机溶剂残余物的低分子量乙酰化透明质酸构成本发明的另一方面。
此外，根据下文所述的方法，可以将不含挥发性有机溶剂的低分子量乙酰化透明质酸进一步转化为其钠盐，且不含挥发性有机溶剂的低分子量乙酰化透明质酸的钠盐构成本发明的另一方面。
在沉淀步骤之前，可能期望从反应混合物中至少部分地除去未消耗的乙酸和乙酐。乙酸是低分子量乙酰化透明质酸的溶剂，其与乙酐一起的部分去除通过使沉淀步骤以相对小体积的添加剂水来进行有利于低分子量乙酰化透明质酸的沉淀。
乙酸/乙酐混合物可通过蒸馏除去，使粗反应混合物呈粘性糊状，其主要由期望的低分子量乙酰化透明质酸组成。然后将水加入该粗混合物中以进行沉淀。可以收集蒸馏的乙酸/乙酐混合物并再循环。
在本发明的一个优选实施方案中，添加剂水的量为每份含有期望的乙酰化透明质酸的粗反应混合物的1至5重量当量，更特别地为2至4重量当量。当将水加入反应混合物中时，任何残留的乙酐都将水解。强烈放热水解优选以反应物料的温度不超过40℃的方式进行。
可以通过蒸馏除去乙酸/乙酐。在蒸馏步骤之前，可能期望中和反应混合物中的任何强酸以避免乙酰化透明质酸与强酸在回流条件下接触，这可能导致出现不期望的变色。因此，在沉淀之前调节粗反应混合物的pH是本发明的分离和纯化方法中的优选工艺步骤。
因此，在本发明的另一个方面，提供了从溶液中含有低分子量乙酰化透明质酸的反应混合物中分离低分子量乙酰化透明质酸的方法，所述方法包括使用添加剂水在pH为5至8下从该溶液中沉淀低分子量乙酰化的步骤。
在本发明的一个具体实施方案中，提供了从溶液中含有低分子量乙酰化透明质酸的反应混合物中分离低分子量乙酰化透明质酸的方法，所述方法包括将反应混合物的pH调节至pH值为5至8并且使用添加剂水从该溶液中沉淀出低分子量乙酰化透明质酸的步骤。
为了本发明的目的，可以使用适合的缓冲剂进行pH调节，例如已知用于此目的的磷酸盐，乙酸盐和柠檬酸盐，更特别地，通过加入有效量的乙酸盐进行缓冲。
沉淀的乙酰化透明质酸可以通过在适合的过滤器上过滤而与反应混合物的其它组分分开和分离，所述过滤器例如是已知用于此目的的任何细筛网织物过滤器。
沉淀的低分子量乙酰化透明质酸可在沉淀后进行另外的后处理程序。例如，可以用水洗涤以除去任何痕量的水溶性杂质，然后干燥沉淀的物质，得到低分子量乙酰化透明质酸，其形式为明亮的白色自由流动的粉末，其没有或实际上没有偏黄的色调。
低分子量乙酰化透明质酸可以这种形式用于本发明的方法和化妆品制剂，特别是护肤组合物中。
在此阶段，还可能需要对乙酰化透明质酸进行进一步的后处理程序，例如漂白或抛光步骤，以使用例如活性炭除去任何不需要的黄色着色。然后可以任选地真空干燥纯化的乙酰化透明质酸，得到适用于本发明的方法和化妆品制剂的形式的乙酰化透明质酸，而无需进一步修饰。
或者，可能期望将低分子量乙酰化透明质酸转化为其钠盐。
可以通过中和步骤将本发明的乙酰化透明质酸转化为其相应的钠盐。
中和可以通过向低分子量乙酰化透明质酸的水溶液或悬浮液中加入钠离子源水溶液如氢氧化钠，乙酸钠或任何其它适合的含钠离子的碱来进行。
中和步骤可以在0至30℃的温度下进行，反应时间可以在0.5至12小时的范围内变化。
在中和过程中，期望将碱(例如氢氧化钠)缓慢加入低分子量乙酰化透明质酸的溶液或悬浮液中，以使碱的可估计的浓度不会积聚，并且pH值不超过约9，更特别地约8，更特别地约7.5，更特别地约7，更特别地约6.5。以这种方式，不会产生不期望的副产物，并且避免了不期望的变色的发生。
中和反应的过程可以方便地跟随反应混合物的pH，并且当pH达到6.5+/-0.5时，获得相应的低分子量乙酰基透明质酸钠的中和溶液。
形成本发明另一方面的低分子量乙酰基透明质酸钠溶液可以这种形式用于本发明的方法和化妆品制剂，特别是护肤组合物中，无需进一步修饰。然而，如果期望在所述组合物和方法中使用乙酰基透明质酸钠溶液作为原料，则期望在溶液中加入适合的抗微生物剂，这些试剂是本领域熟知的。
或者，可以进一步加工所述低分子量乙酰基透明质酸钠以使其呈固体形式，更特别是粉末形式。
用于分离固体形式的乙酰基透明质酸钠的现有技术方法包括使用纯丙酮将其从丙酮水溶液中沉淀的步骤。但是，以这种方式分离和纯化它会在成品中留下挥发性有机溶剂的残留物，并且通常应尽可能避免这些溶剂(或在适当的情况下去除)，以符合产品规格和其他质量特性，它们是用于化妆品工业的原料典型地要求的。
此外，由于低分子量乙酰基透明质酸钠在水中、在挥发性有机溶剂中以及在其混合物中的高溶解度，因此，它不能通过沉淀以固体形式提供。
因此，本发明的另一方面基于提供一种生产固体形式且优选粉末形式的无挥发性有机溶剂的低分子量乙酰基透明质酸钠的方法的目的，其为亮白色、自由流动的并且易于处理。
申请人实现了这些目的并提供了将低分子量乙酰基透明质酸钠水溶液转化成粉末形式的方法，所述方法包括使低分子量乙酰基透明质酸钠溶液脱水的步骤。脱水步骤可以通过已知技术进行，例如冻干。然而，更优选地，脱水步骤通过喷雾干燥进行。
因此，本发明在另一方面提供了一种使液体水性介质特别是溶液脱水的方法，所述液体水性介质包含乙酰基透明质酸钠，特别是根据本文所述方法形成的乙酰基透明质酸钠。
在本发明的一个实施方案中，提供了上述方法，其中所述方法包括以下步骤：将液体水性介质作为液滴雾化到干燥室中，所述干燥室保持在导致液体水性介质蒸发以形成乙酰基透明质酸钠颗粒的条件下。
在一个更特别的实施方案中，喷雾干燥室的入口温度为约150℃，并且喷雾干燥室的出口温度为约70℃或更小。
在一个仍然更特别的实施方案中，将空气泵入干燥室，使得干燥室出口温度降低至约40至50℃。
喷雾干燥的乙酰基透明质酸钠形成本发明的另一个方面，其显示出期望的特性，例如高堆积密度、形状和流动性，这使得产品易于运输和使用。避免使用低密度和多尘的产品是喷雾干燥的乙酰基透明质酸钠的特定优点。
喷雾干燥形成具有足够的白度和透明度的乙酰基透明质酸钠，因此非常适用于预期用于化妆品应用的产品，特别是用于护肤组合物。
根据上述方法形成的喷雾干燥产品构成本发明的另一个方面。
低分子量乙酰化透明质酸和低分子量乙酰基透明质酸钠均易于掺入化妆品制剂，特别是护肤组合物中。由于它们非常低的分子量和它们的粉末物理形式，它们不是粘稠或块状的，并且可以容易地溶解或悬浮在水性介质中并混合到化妆品基质中。
此外，由于高度着色的成分作为化妆品制剂制造商的原料可能是不可接受的，因此非常有利的是低分子量乙酰化透明质酸和低分子量乙酰基透明质酸钠都可以制备成白色粉末，没有或基本上没有黄色调，并且不改变或损害它们可能掺入的任何化妆品制剂的色调，而与化妆品制剂中使用的材料的量无关。
当完成乙酰化透明质酸或其钠盐的后处理时，可以采用漂白或抛光步骤，使用适合的漂白剂，例如粘土或活性炭形式，除去轻微的变色。然而，如果这些产品由于合成方法已经高度变色，则这些步骤对于脱色这些产品并不是特别有效。
本发明的一个特征是本文所述的制备和分离方法提供低分子量乙酰化透明质酸和低分子量乙酰基透明质酸钠作为产品，所述产品为具有足够亮度和透明度的白色粉末形式，如果要进行漂白或抛光步骤，它能够有效地使产品脱色。
更特别地，本文描述的制备和分离方法提供低分子量乙酰化透明质酸和低分子量乙酰基透明质酸钠作为白色粉末形式的产物，它们各自具有90或更大的L*值；和小于8的b*值，其中L*和b*值代表CIELAB系统的色品坐标。
根据本领域已知的比色法，可以通过CIELAB色品坐标L*a*b*表征粉末的亮度和色调。L*值是指定物质亮度的值，由0到100之间的值表示。L*值为100表示最亮状态(完全白)，L*值为0表示最暗状态(完全黑)。b*值指定物质的蓝黄色调。b*值越大，则黄度越高。b*值越小，则蓝度越高。
L*值和b*值都可以使用任何适合的市售分光光度计测量，例如Minolta CM3500d。在进行测量之前，分光光度计应至少通电一小时。为此提供的玻璃容器应该用待测量的固体产品填充一半，注意确保容器的底部完全被产品覆盖。此后，应将填充的容器放入为其提供的样品架中。应按下仪器上的样品键，并从显示面板上读取L*和b*值。在读取任何读数之前，应通过在仪器光学传感器的窗口上放置黑色和白色物体来校准仪器的零和100％反射。
目前下面是进一步示例本发明的一系列实施例。
实施例1：用于制备乙酰基透明质酸钠的方法
用氮气吹扫5升反应器并装入透明质酸(素莲丝(Soliance)制造的RenovhyalTM，分子量10-50kDa；300g，0.7mol)。加入商品级乙酐(2160g，21.2mol)和乙酸(525g，8.7mol)，将悬浮液的温度设定为25℃。在10分钟期限内加入96％硫酸(194g，1.9mol)。通过内部控制将温度维持在25℃。继续搅拌15小时。关闭内部控制并在搅拌下加入乙酸钠(154g，1.9mol)。使温度升至35℃并继续搅拌30分钟。将反应器抽真空至40mbar，将夹套温度设定为50℃。在5小时内，通过蒸馏除去乙酐和乙酸的混合物(1343g)。将剩余的略微糊状但仍可搅拌的反应器内容物冷却至室温，并加入水(5500ml)(首先非常小心)，始终维持混合物的温度低于50℃。逐渐形成精细的白色悬浮液。通过过滤分离固体并用水(10升)洗涤。然后将固体重新悬浮在水(700ml)中并通过加入1M NaOH(600ml)中和混合物(pH 6.5)，得到乙酰基透明质酸钠溶液(1520g，c＝0.11g/g)。将溶液进行喷雾干燥，得到乙酰基透明质酸钠(175g，0.3mol，44％收率)，为精细的自由流动的粉末。通过HSQC-NMR实验分析表明乙酰化度为3.9。
实施例2：通过喷雾干燥技术分离乙酰基透明质酸钠的方法
使用配备有旋转雾化器的GEA VERSATILE-SDTM 6.3喷雾干燥器，使用以下参数进行11％乙酰基透明质酸钠水溶液的喷雾干燥：
-进料温度：15℃
-入口温度：150℃
-出口温度：70℃
-进料速率：20kg/h
-风扇速度：400kg空气/h
-轮速：12000rpm
获得白色、自由流动的乙酰基透明质酸钠粉末。
实施例3：细胞毒性
通过MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)测定试验进行乙酰基透明质酸钠对成纤维细胞和黑素细胞的初步细胞毒性评价。简言之，将细胞接种在96-孔培养板中，并分别用不同浓度的10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01和0.005mg/ml的乙酰基透明质酸钠处理24h和48h。通过MTT溶液(5mg/ml，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以1/6稀释)评价细胞毒性。将板在37℃下温育4小时，避光。将不溶的紫色甲(formazan)产物溶解在50μlDMSO中，用微量板读出器(TECAN)在560nm处读取光密度。
表1：通过MTT试验对成纤维细胞和黑素细胞进行的细胞毒性评价
关于细胞毒性方面乙酰基透明质酸钠对成纤维细胞的影响，它仅在10和5mg/ml的浓度下诱导细胞毒性。低于这些剂量，未观察到任何作用。
关于其对黑素细胞的影响，仅10mg/ml乙酰基透明质酸钠的浓度显示出细胞毒性作用。低于该剂量，对黑素细胞没有影响(表1)。
可以使用而不对每种细胞类型诱导毒性作用的最佳浓度被确定为成纤维细胞为0.1mg/ml，黑素细胞为0.5mg/ml。在生物学研究期间使用这些浓度。
实施例4：转录组学评价
为了鉴定乙酰基透明质酸钠的潜在生物活性，对存在于皮肤中的两种细胞类型(包括黑素细胞和成纤维细胞)进行转录组学体外分析。对在两个转录组平板上分布的128个基因进行研究。第一个板对真皮功能具有特异性，其中许多基因牵涉细胞外基质，基质重塑，氧化防御，应激反应，伤口愈合和其他生物学功能。第二个板对皮肤色素沉着功能具有特异性，其中最重要的基因牵涉黑色素合成，黑素体形成和成熟以及与黑素细胞相关的其他功能。
对于每种细胞类型，通过Rt-qPCR(实时定量聚合链反应)使用TaqMan测定一式三份进行转录组学分析。简言之，在对成纤维细胞为0.1mg/ml、对黑素细胞为0.5mg/ml的细胞刺激24h小时后，通过Trizol方法提取总RNA。通过光谱仪定量总RNA，并将浓度调节至400ng/μl。通过琼脂糖凝胶上的迁移验证RNA的质量。使用cDNA Verso试剂盒，根据供应商的建议将总RNA逆转录成cDNA。通过经典PCR靶向管家基因：RPL32基因验证逆转录。然后使用cDNA进行RT-qPCR，其中使用TaqMan测定法每孔沉积10ng cDNA。
获得的结果表示在下表2中。与未处理的条件相比，诱导超过1.3倍(正或负)被认为是生物学改性的指示。
表2：在成纤维细胞(真皮)和黑素细胞(色素沉着)上被乙酰基透明质酸钠显著调节的基因。p<0.05*
实施例5：乙酰基透明质酸钠对成纤维细胞(真皮)的影响
关于涉及真皮的结果，MMP-1和MMP-3是牵涉基质降解的两种基质金属蛋白酶，如I型胶原蛋白，其为真皮中存在的最重要的胶原蛋白。
在衰老期间，MMP的产生增加，导致皮内基质降解，这促进皮肤塌陷和皱纹形成。它们代表了皮肤衰老的第一个可见迹象。
紫外线照射等外部因素可以加速这种现象。实际上，UV诱导皮肤中的氧化应激，这是MMP释放显著增加的原因，这反过来促进了严重基质降解导致的皮肤过早衰老。
转录组学结果启示，乙酰基透明质酸钠可以通过减量调节MMP-1和MMP-3来限制这种作用(表2)。
开发了一种特异性的体外衰老模型，该模型能够通过氧化应激(H2O2 100μM至200μM 2h)在成纤维细胞上超表达MMP-1和MMP-3。简言之，在诱导氧化应激之前，将基础培养基中的成纤维细胞用乙酰基透明质酸钠(0.1mg/ml)预处理2h。在氧化应激后，将成纤维细胞在基础培养基中于37℃温育48h，使MMP在培养基中积累。然后使用Luminex技术(珠子上的ELISA原理)通过多重方法估计从上清液释放的MMP-1和MMP-3的量。
MMP-1释放：
表3：乙酰基透明质酸钠对体外氧化应激诱导的成纤维细胞释放的MMP-1释放的影响(以任意单位表示)。*＝p<0.05；ns＝无显著性。括号中显示的百分比值反映了乙酰基透明质酸钠或透明质酸钠相对于无活性成分存在诱导的抑制量。
已证实乙酰基透明质酸钠显著降低蛋白质水平的氧化应激介导的MMP-1分泌。相反，发现透明质酸钠不能再现这种效果，从而证实观察到的效果是由于乙酰化修饰导致(表3)。
有关MMP-1释放的对比研究：
为了比较，根据以下方法研究(a)本发明的产品、(b)单乙酸透明质酸酯和(c)根据EP0725083的乙酰化透明质酸酯(来自资生堂；平均乙酰化度为约3.6；MW约100kDa)对MMP-1的作用：
将来自白种人女性(26岁)的腹部活组织检查的成纤维细胞以200,000个细胞/孔接种在12-孔板中的1ml完全培养基(ZenBio，ref.DF-1)中。铺板后24h，将完全培养基替换为不含血清的基础培养基(Zen-Bio，ref.DF-2)。在基础培养基中培养24h后，将细胞与0.1mg/ml的测试产品在37℃预温育2小时，然后在37℃下暴露于氧化应激(H2O2 200μM)2h。用基础培养基替换培养基，并将细胞在37℃下再温育48h。收集上清液并储存在-80℃直至分析。
使用人MMP-1ELISA试剂盒进行MMP-1定量，该试剂盒是用于定量测量血清、血浆和细胞培养上清液中人MMP-1pro和活性形式的体外酶联免疫吸附试验。该测定使用涂覆在96-孔板上的对人MMP-1具有特异性的抗体。将标准品和样品移液到孔中，样品中存在的MMP-1通过固定化抗体与孔结合。洗涤孔并加入生物素化的抗人MMP-1抗体。在洗去未结合的生物素化抗体后，将HRP缀合的链霉抗生物素蛋白移液到孔中。再次洗涤孔，向孔中加入TMB(3,3',5'5'-四甲基联苯胺)底物溶液，并且颜色与结合的MMP-1的量成比例地显现。终止溶液将颜色从蓝色变为黄色，并且在450nm处测量颜色的强度。
在1/100稀释样品后测量MMP-1，一式三份。标准曲线一式两份进行。根据18'000、6'000、2'000、666.7、222.2、74.07和24.69pg/ml的MMP-1标准浓度，计算四参数逻辑回归。
结果如图1中所示。
在基础条件下，发现仅本发明的乙酰化透明质酸钠(a)诱导了MMP-1产生的显著抑制(～23％)。单乙酸透明质酸酯(b)不能再现该效果，甚至表现出与MMP-1产生增加相反的效果(+44％)。来自资生堂(Sisheido)的乙酰化透明质酸(c)在该实验条件下对MMP-1释放没有显著影响(+3％)。
在由H2O2(未经乙酰化透明质酸盐处理)介导的氧化应激下以再现衰老的影响，观察到MMP-1的显著过量产生(+103％)，这验证了本实验。
用本发明的乙酰化透明质酸钠(a)预温育诱导应激介导的MMP-1产生显著减少，而其他两种产品单乙酸透明质酸酯(b)和来自资生堂的乙酰化透明质酸(c)分别显示出+63％和+12％的反作用。
总之，只有本发明的乙酰化透明质酸钠(a)在基础和存在氧化应激(衰老样)的情况下对抑制MMP-1释放具有有效活性。
MMP-3释放：
表4：乙酰基透明质酸钠对体外氧化应激诱导的成纤维细胞释放的MMP-3的影响(以任意单位表示)。*＝p<0.05；ns＝不显著性。括号中显示的百分比值反映了乙酰基透明质酸钠相对于无活性成分(无乙酰基透明质酸钠)诱导的抑制量。
已证实乙酰基透明质酸钠显著降低蛋白质水平的氧化应激介导的MMP-3分泌。相反，发现透明质酸钠不能再现这种效果，证实观察到的效果是由于乙酰化修饰导致(表4)。
荧光测定
MMP以两种形式释放，包括无活性前体形式(pro-MMP)和活性形式，其中前肽裂解(MMP)。只有活性的MMP才能诱导胶原蛋白降解。使用DQ-型I型胶原蛋白，其是与猝灭剂相关的I型胶原蛋白荧光。当它降解时，它促进猝灭剂释放和荧光发射。最后，测量与胶原蛋白降解成正比的发射荧光。本实验完全在用于定量MMP-1和MMP-3分泌的相同实验条件下进行。简言之，将上清液与DQ-胶原蛋白在室温下温育4h，并通过微孔板读出器(TECAN)测量荧光，激发波长为495nm，发射波长为515nm。
表5：乙酰基透明质酸钠对体外氧化应激后成纤维细胞的I型胶原蛋白降解的影响(以任意单位表示)。*＝p<0.05；ns＝无显著性。括号中显示的百分比值反映了乙酰基透明质酸钠或透明质酸钠相对于不存在活性成分诱导的抑制量。
观察到乙酰基透明质酸钠降低了DQ-胶原蛋白降解，如通过荧光水平的降低所观察到的(表5)。这些结果表明，乙酰基透明质酸钠限制了负责DQ-胶原蛋白降解的MMP-1和MMP-3的活性形式的释放。总体而言，这些体外结果证明乙酰基透明质酸钠通过对基质重塑的影响而具有抗衰老活性，所述基质重塑牵涉皮肤衰老的可见迹象。实际上，它通过控制基质降解的MMP-1和MMP-3的减量调节来限制这一点，例如I型胶原蛋白。此外，透明质酸钠不能促进相同的结果，证实生物活性与乙酰化修饰有关(表5)。
实施例6：乙酰基透明质酸钠对黑素细胞的影响(黑素细胞)
色素沉着功能
关于色素沉着功能，发现乙酰基透明质酸钠在转录组水平上诱导HPS4、MITF和ENDR6基因表达的显著增加。这些结果启示它可以具有着色特性。在基础条件下和在加入L-酪氨酸底物介导的刺激条件下，对黑素细胞分析乙酰基透明质酸钠对体外黑色素合成的影响。简言之，关于基础条件，将黑素细胞在24-孔板中温育进行24h培养。然后用含有或不含浓度分别为0.1、0.25、0.5和1mg/ml的乙酰基透明质酸钠或未修饰的透明质酸钠或参比物(L-酪氨酸1mM)的培养基替换培养基。将细胞温育10天，其中在温育3和7天后再处理两次。
表6：乙酰基透明质酸钠对基础条件下黑素细胞体外黑色素合成的影响(以对照条件的％表示)。**＝p<0.01**；***＝p<0.001；ns＝无显著性。括号中的百分比值反映了测试化合物(L-酪氨酸、乙酰基透明质酸钠和透明质酸钠相对于没有测试化合物(对照)的性能)所发挥的作用。
结果显示乙酰基透明质酸钠在基础条件下诱导黑色素合成减少，其效果取决于剂量(0.1mg/ml时+2％，1mg/ml时为-9％)。未修饰的透明质酸钠效有效性较低，表明乙酰化改善了透明质酸钠的生物活性。
刺激
关于刺激的条件，将黑素细胞在24-孔板中温育进行24h培养。然后将培养基替换为含有L-酪氨酸(1mM)的培养基，其中补充有乙酰基透明质酸钠或未修饰的透明质酸钠，浓度分别为0.1、0.25、0.5和1mg/ml，或参比物(硫辛酸5μg/ml)。将细胞温育10天，其中在温育3和7天后再处理两次。
表7：乙酰基透明质酸钠对受刺激条件下黑素细胞体外黑色素合成的影响(以对照L-酪氨酸1mM条件的％表示)。*＝p<0.05；**＝p<0.01；***＝p<0.001；ns＝无显著性。括号中的百分比值反映了测试化合物(硫辛酸、乙酰基透明质酸钠和透明质酸钠相对于没有测试化合物(对照)的性能)所发挥的作用。
结果显示，乙酰基透明质酸钠诱导黑色素合成增加，并且根据剂量具有相反的效果(在0.1mg/ml，+11％，而在1mg/ml，-7％)。未修饰的透明质酸钠效率较低，表明乙酰化改善了透明质酸钠的生物活性。

Claims (14)

1.护肤组合物，包含低分子量乙酰化透明质酸或其钠盐，其特征在于所述低分子量乙酰化透明质酸或其钠盐具有50kDa或更小的重均分子量和大于3.6的平均乙酰化度。
2.权利要求1的护肤组合物，其特征在于所述低分子量乙酰化透明质酸或其钠盐具有3.7或更大、更特别地为3.8或更大、更特别地为3.9或更大且仍然更特别地为4.0的平均乙酰化度。
3.权利要求1或2的护肤组合物，其特征在于所述低分子量乙酰化透明质酸或其钠盐具有35kDa或更小、更特别地为约30kDa或更小的重均分子量。
4.上述权利要求任一项的护肤组合物，其特征在于所述低分子量乙酰化透明质酸或其钠盐具有小于2.0、更特别地小于1.8、更特别地小于1.7、更特别地小于1.6或更小、更特别地小于1.5且仍然更特别为约1.4或更小的多分散性指数。
5.上述权利要求任一项的护肤组合物，其特征在于通过定量2D NMR测定乙酰化度。
6.制备具有50kDa或更小的重均分子量和大于3.6的平均乙酰化度的低分子量乙酰化透明质酸或其钠盐的方法，包括下列步骤：
(i)选择具有50kDa或更小、更特别地35kDa或更小或仍然更特别地30kDa或更小的分子量的低分子量透明质酸；
(ii)使其经历乙酰化条件，其中乙酰化条件优选包括使所述低分子量透明质酸与乙酸/乙酐混合物在强酸存在下反应的步骤；和
(iii)优选通过使用添加剂水的沉淀来分离所述低分子量乙酰化透明质酸。
7.权利要求6的方法，还包括下列步骤：
(iv)使低分子量乙酰化透明质酸与提供钠离子源的碱反应，得到乙酰基透明质酸钠溶液。
8.权利要求7的方法，其中将低分子量乙酰化透明质酸转化成乙酰基透明质酸钠在不超过9、更特别地不超过8、更特别地不超过7且仍然更特别地不超过6.5的pH下进行。
9.权利要求7或权利要求8的方法，还包括下列步骤：
(v)通过冻干或喷雾干燥使所述溶液脱水。
10.低分子量乙酰化透明质酸或其钠盐，具有50kDa或更小的重均分子量和大于3.6的平均乙酰化度，其特征在于其为具有约90或更大的L*值和小于约8的b*值的白色粉末形式。
11.抑制与升高的基质降解酶水平相关的皮肤细胞外基质降解的方法，该方法包括下列步骤：向皮肤施用有效量的权利要求1-5任一项的护肤组合物或权利要求10的低分子量乙酰化透明质酸或其钠盐。
12.权利要求11的方法，其为减少皮肤上衰老的可见迹象的方法。
13.权利要求11或权利要求12的方法，其中基质降解酶为金属蛋白酶，特别是MMP-1或MMP-3。
14.权利要求11-13任一项的方法，其中乙酰化透明质酸或其钠盐抑制细胞外基质中的胶原蛋白的降解。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113509442A (zh) * 2021-06-21 2021-10-19 浙江宜格企业管理集团有限公司 一种含补骨脂酚的脂质体及其制备方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3104987B1 (fr) 2019-12-18 2023-06-30 Lvmh Rech Composition cosmétique comprenant de l’acide 2-glucoside ascorbique et de l’acide hyaluronique acétylé ou l’un de ses sels
CN111297727A (zh) * 2019-12-25 2020-06-19 华熙生物科技股份有限公司 一种美塑治疗组合物及其应用
WO2021212267A1 (en) * 2020-04-20 2021-10-28 L'oreal Composition for caring for the skin
CN114191331B (zh) * 2021-12-10 2023-07-07 华熙生物科技股份有限公司 抗皮肤衰老组合物及其用途和抗皮肤衰老产品
FR3130138A1 (fr) 2021-12-10 2023-06-16 L V M H Recherche Composition de lissage de la peau et/ou des lèvres

Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH069707A (ja) * 1992-04-21 1994-01-18 Shiseido Co Ltd 高アセチル化率ヒアルロン酸及びその製造方法
JPH0853501A (ja) * 1994-08-11 1996-02-27 Shiseido Co Ltd アセチル化ヒアルロン酸の製造方法及び精製方法
US5679657A (en) * 1994-08-11 1997-10-21 Shiseido Co., Ltd. Low molecular weight acetylhyaluronate, skin-softening composition, method of manufacturing the same, and method of purifying the same
JPH10279425A (ja) * 1997-03-31 1998-10-20 Shiseido Co Ltd 皮膚外用剤
JPH10279426A (ja) * 1997-03-31 1998-10-20 Shiseido Co Ltd 皮膚外用剤
JPH10279419A (ja) * 1997-03-31 1998-10-20 Shiseido Co Ltd 皮膚外用剤
JPH10279418A (ja) * 1997-03-31 1998-10-20 Shiseido Co Ltd 皮膚外用剤
US6489467B1 (en) * 1999-01-28 2002-12-03 Chemedica S.A. Process for purifying high molecular weight hyaluronic acid
JP2005068073A (ja) * 2003-08-25 2005-03-17 Takashi Fukazawa 目元用化粧料
CN1753913A (zh) * 2003-02-27 2006-03-29 株式会社资生堂 含有乙酰化透明质酸的眼用药物组合物
JP2008280430A (ja) * 2007-05-10 2008-11-20 Mitsubishi Rayon Co Ltd ヒアルロン酸の製造方法
WO2009024350A2 (en) * 2007-08-22 2009-02-26 Italfarmacia S.R.L. Injectable dermatological composition for treatment of wrinkles
US20090068255A1 (en) * 2007-04-30 2009-03-12 Betty Yu Use of matrix metalloproteinase inhibitors in skin care
CN102470086A (zh) * 2009-12-21 2012-05-23 株式会社资生堂 片状化妆品
EP2644188A1 (en) * 2012-02-10 2013-10-02 Shiseido Company, Ltd. Oil-in-water-type emulsion skin cosmetic
KR20150015209A (ko) * 2013-07-31 2015-02-10 주식회사 피코테라 저분자 아세틸화 히알루론산의 제조방법 및 이의 용도
CN104662158A (zh) * 2012-07-05 2015-05-27 阿尔特刚意大利有限公司 生产具有可控分子量的高纯度透明质酸钠(hana)的方法
CN106109296A (zh) * 2016-06-30 2016-11-16 彭燕辉 一种保湿精华水及其制备方法
CN106176286A (zh) * 2016-08-30 2016-12-07 华熙福瑞达生物医药有限公司 透明质酸皮肤护理膜及制备方法和应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3557044B2 (ja) * 1995-06-29 2004-08-25 株式会社資生堂 皮膚柔軟化剤
JPH10265332A (ja) * 1997-03-26 1998-10-06 Shiseido Co Ltd 水中油型乳化組成物
JP3634112B2 (ja) * 1997-03-31 2005-03-30 株式会社資生堂 皮膚外用剤
JP3634113B2 (ja) * 1997-03-31 2005-03-30 株式会社資生堂 皮膚外用剤
JP3667490B2 (ja) * 1997-03-31 2005-07-06 株式会社資生堂 皮膚外用剤
JP2006306842A (ja) * 2005-03-30 2006-11-09 Kose Corp 二層型紫外線防御化粧料

Patent Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH069707A (ja) * 1992-04-21 1994-01-18 Shiseido Co Ltd 高アセチル化率ヒアルロン酸及びその製造方法
JPH0853501A (ja) * 1994-08-11 1996-02-27 Shiseido Co Ltd アセチル化ヒアルロン酸の製造方法及び精製方法
US5679657A (en) * 1994-08-11 1997-10-21 Shiseido Co., Ltd. Low molecular weight acetylhyaluronate, skin-softening composition, method of manufacturing the same, and method of purifying the same
JPH10279425A (ja) * 1997-03-31 1998-10-20 Shiseido Co Ltd 皮膚外用剤
JPH10279426A (ja) * 1997-03-31 1998-10-20 Shiseido Co Ltd 皮膚外用剤
JPH10279419A (ja) * 1997-03-31 1998-10-20 Shiseido Co Ltd 皮膚外用剤
JPH10279418A (ja) * 1997-03-31 1998-10-20 Shiseido Co Ltd 皮膚外用剤
US6489467B1 (en) * 1999-01-28 2002-12-03 Chemedica S.A. Process for purifying high molecular weight hyaluronic acid
CN1753913A (zh) * 2003-02-27 2006-03-29 株式会社资生堂 含有乙酰化透明质酸的眼用药物组合物
JP2005068073A (ja) * 2003-08-25 2005-03-17 Takashi Fukazawa 目元用化粧料
US20090068255A1 (en) * 2007-04-30 2009-03-12 Betty Yu Use of matrix metalloproteinase inhibitors in skin care
JP2008280430A (ja) * 2007-05-10 2008-11-20 Mitsubishi Rayon Co Ltd ヒアルロン酸の製造方法
WO2009024350A2 (en) * 2007-08-22 2009-02-26 Italfarmacia S.R.L. Injectable dermatological composition for treatment of wrinkles
CN102470086A (zh) * 2009-12-21 2012-05-23 株式会社资生堂 片状化妆品
EP2644188A1 (en) * 2012-02-10 2013-10-02 Shiseido Company, Ltd. Oil-in-water-type emulsion skin cosmetic
CN104662158A (zh) * 2012-07-05 2015-05-27 阿尔特刚意大利有限公司 生产具有可控分子量的高纯度透明质酸钠(hana)的方法
KR20150015209A (ko) * 2013-07-31 2015-02-10 주식회사 피코테라 저분자 아세틸화 히알루론산의 제조방법 및 이의 용도
CN106109296A (zh) * 2016-06-30 2016-11-16 彭燕辉 一种保湿精华水及其制备方法
CN106176286A (zh) * 2016-08-30 2016-12-07 华熙福瑞达生物医药有限公司 透明质酸皮肤护理膜及制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
顾其胜等: "《透明质酸与临床医学》", 30 November 2003 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113509442A (zh) * 2021-06-21 2021-10-19 浙江宜格企业管理集团有限公司 一种含补骨脂酚的脂质体及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3592330A1 (en) 2020-01-15
US20210128442A1 (en) 2021-05-06
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MX2019009711A (es) 2019-10-02
AU2018232835B2 (en) 2024-01-18
CO2019008987A2 (es) 2020-01-17
US11766393B2 (en) 2023-09-26
IL268682B (en) 2022-07-01
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JP2023156270A (ja) 2023-10-24

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