TWI761686B - 使用富勒烯衍生物來預防微粒物質-誘發的皮膚損害 - Google Patents

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賴千蕙
江耀璋
李慧君
李炘諭
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Abstract

本發明揭示富勒烯衍生物可被用來預防微粒物質-誘發的皮膚損害。

Description

使用富勒烯衍生物來預防微粒物質-誘發的皮膚損害
本發明是有關於使用富勒烯衍生物來預防微粒物質-誘發的皮膚損害。
大氣微粒物質(atmospheric particulate matter)[又被稱為微粒物質(particulate matter, PM)或微粒子(fine particle)]是一種主要的空氣汙染形式，意指懸浮在大氣環境中的微小固體顆粒以及液滴，其組成包括芳香烴(aromatic hydrocarbon)、金屬、礦物(mineral)以及有機毒素等，當人體吸入微粒物質時可能會促進人體的呼吸系統、心血管系統以及神經系統中的疾病之進展。此外，已有報導指出，微粒物質亦會造成皮膚損害(skin damage)[包括氧化性損害(oxidative damage)以及發炎性損害(inflammatory damage)]並且破壞皮膚屏障功能(skin barrier function)。
皮膚是保護人類個體的最大屏障，它具有對抗病原菌以及各種環境損害之功能，暴露於微粒物質時會促使皮膚生成活性氧族(reactive oxygen species, ROS)以及自由基(free radicals)。當活性氧族以及自由基的數量超過細胞或組織本身的抗氧化能力時，便會形成氧化性壓力(oxidative stress)。活性氧族以及自由基因不穩定的特性而容易與細胞內的組成物(包括DNA、蛋白質以及脂質等)相反應，進而導致細胞或組織的氧化性損害。此外，促發炎性因子(proinflammatory factors)及其它相關蛋白質[包括環加氧酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)以及血紅素氧化酵素-1 (heme oxygenase-1, HO-1)等]亦會被調控，進而誘發發炎反應。在長期的暴露下，甚至可能進一步發展出發炎性皮膚疾病(inflammatory skin diseases)[例如，異位性皮膚炎(atopic dermatitis)、痤瘡(acne)以及乾癬(psoriasis)]以及皮膚癌(skin cancer)[例如，黑色素瘤(melanoma)以及鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma)]。
富勒烯(fullerene)是由60至200個碳原子所構成之封閉的籠狀物(cage)，屬於碳的一種同素異形體(allotrope)。例如，富勒烯C60 是具有60個碳原子以及30個碳-碳雙鍵(carbon-carbon double bond)的截角二十面體(truncated icosahedron)。目前已知富勒烯具有細胞保護、抗氧化、抗菌以及抗病毒的活性。然而，由於富勒烯具有較低的水溶解度(water solubility)，限制了其生物可利用性。因此，本領域的相關研究人員已嘗試在富勒烯的表面上修飾以不同的親水性官能團(hydrophilic functional groups)[例如，羥基(hydroxyl group)以及糖類基團(sugar group)等]，並進一步探討所產生的富勒烯衍生物(fullerene derivative)所具有的生物活性。
在Djordjević A.et al . (2015),J. Nanomater ., doi: 10.1155/2015/567073中，Djordjević A.等人回顧與整理一系列具有抗氧化活性之被修飾以羥基的富勒烯衍生物[又被稱為富勒醇(fullerenol)]，其具有下列化學式(I)所示的結構：
Figure 02_image001
(I) 其中，n是一個從2到44的整數，n越大則具有越高的水溶解度。
在Cecioni S.et al . (2011),Chemistry , 17: 3252-3261中，Cecioni S.揭示一系列被修飾以糖類(包括半乳糖以及葡萄糖)的富勒烯衍生物[又被稱為以富勒烯為基礎的糖簇分子(fullerene-based glycocluster)]，其中，2種具有下列化學式(II)的糖簇分子被發現能夠結合至綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )的細菌凝集素(bacterial lectin)，而被預期具有抗綠膿桿菌的效用：
Figure 02_image003
(II) 其中R是
Figure 02_image005
(亦即糖簇分子8)或
Figure 02_image007
(亦即糖簇分子9)。 特別地，糖簇分子8結合至該細菌凝集素的能力是明顯優於糖簇分子9所具者。
在Luczkowiak J.et al . (2013),Biomacromolecules , 14: 431-437中，Luczkowiak J.等人揭示4種被修飾以糖類(包括甘露糖以及半乳糖)的富勒烯衍生物[又被稱為糖化富勒烯(glycofullerene)]，其亦具有上面化學式(II)所示的結構： 糖化富勒烯1，其中R是
Figure 02_image009
； 糖化富勒烯2，其中R是
Figure 02_image011
； 糖化富勒烯3，其中R是
Figure 02_image013
；以及 糖化富勒烯4，其中R是
Figure 02_image015
。 糖化富勒烯1至3皆被發現具有抗伊波拉病毒的活性，特別地，糖化富勒烯2的活性幾乎是糖化富勒烯1所具者的200倍。相對地，糖化富勒烯4則不具有抗伊波拉病毒活性。
就申請人所知，迄今尚無任何文獻或專利前案曾經揭示富勒烯衍生物可被用來預防微粒物質-誘發的皮膚損害。經研究，申請人意外地發現富勒烯衍生物可以有效地保護皮膚細胞對抗微粒物質-誘發的氧化性壓力、發炎反應以及細胞凋亡，並且改善與皮膚屏障功能相關的蛋白質(skin barrier function-related protein)的表現。因此，依據本發明之富勒烯衍生物被預期可供用來預防微粒物質-誘發的皮膚損害。
發明概要
於是，在第一個方面，本發明提供一種富勒烯衍生物供應用於製備一用來預防微粒物質-誘發的皮膚損害之醫藥品的用途，其中該富勒烯衍生物是下列的至少一者： (i)
Figure 02_image017
以及 (ii)
Figure 02_image019
， 其中，R是選自於由下列所構成的群組：
Figure 02_image021
、
Figure 02_image023
以及
Figure 02_image025
。
在第二個方面，本發明提供一種用於預防微粒物質-誘發的皮膚損害的方法，其包括對一需要預防微粒物質-誘發的皮膚損害的個體投予(administering)一如上所述的富勒烯衍生物。
在第三個方面，本發明提供一如上所述的富勒烯衍生物作為化妝品的用途。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
在開發可用於預防微粒物質-誘發的皮膚損害(particulate matter-induced skin damage)的藥物上，申請人意外地發現到：富勒烯衍生物(fullerene derivative)可以有效地保護皮膚細胞對抗微粒物質-誘發的氧化性壓力、發炎反應以及細胞凋亡，並且亦可以改善與皮膚屏障功能相關的蛋白質(skin barrier function-related protein)的表現，進而達到預防微粒物質-誘發的皮膚損害的效用。
因此，本發明提供一種富勒烯衍生物供應用於製備一用來預防微粒物質-誘發的皮膚損害之醫藥品的用途，其中該富勒烯衍生物是下列的至少一者： (i)
Figure 02_image017
以及 (ii)
Figure 02_image019
， 其中，R是選自於由下列所構成的群組：
Figure 02_image021
、
Figure 02_image023
以及
Figure 02_image025
。
如本文中所使用的，術語“預防(preventing)”或“預防(prevention)”微粒物質-誘發的皮膚損害意指一個體在還沒有被診斷具有該皮膚損害時，消除(eliminate)或減少(reduce)該皮膚損害的發生率(incidence)，以及減緩(slow)、延遲(delay)、控制(control)或減少(decrease)該皮膚損害的可能性(likelihood)或機率(probability)。
如本文中所使用的，術語“微粒物質-誘發的皮膚損害”意指生物體的皮膚在經過微粒物質暴露之後所造成的損傷(injury)或損害(damage)。
較佳地，該皮膚損害是下列的至少一者：氧化性損害(oxidative damage)、發炎性損害(inflammatory damage)以及皮膚屏障功能的降低。
依據本發明，該富勒烯衍生物可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術而被製得。在此方面，可以參考，例如，Djordjević A.et al . (2015)(同上述)、Cecioni S.et al . (2011)(同上述)以及Luczkowiak J.et al . (2013)(同上述)。
依據本發明，該醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部投藥(topical administration)之劑型(dosage form)。
依據本發明，該醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、肥皂(soap)、油膏(salve)、繃帶(bandage)以及類似之物。
依據本發明，該外部製劑是藉由將本發明的醫藥品與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而被製備。
依據本發明，該基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)[諸如卡波普® 941 (carbopol® 941)、微結晶纖維素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纖維素(carboxymethylcellulose)]、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、螯合劑(chelating agents)、乳化劑(emulsifiers)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)以及推進劑(propellants)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
本發明亦提供一種用於預防微粒物質-誘發的皮膚損害的方法，其包括對一需要預防微粒物質-誘發的皮膚損害的個體投予一如上所述的富勒烯衍生物。
如本文中所用的，術語“投予(administering)”與“投藥”以及“施用(application)”可被交換地使用。
依據本發明，該富勒烯衍生物的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被改善的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被改善的個體之體重、年齡、身體狀況與反應。而有關投藥劑量與投藥次數的選擇是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
特別地，該富勒烯衍生物亦被預期可供應用於作為化妝品。
依據本發明，該化妝品可進一步包含有一被廣泛地使用於化妝品製造技術之化妝品上可接受的佐劑(cosmetically acceptable adjuvant)。例如，該化妝品上可接受的佐劑可包含有一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、膠凝劑、活性劑、防腐劑(preservative)、抗氧化劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、介面活性劑、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料以及氣味吸收劑。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該化妝品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的形式，這包括，但不限於：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜(mask)、貼片、貼布(pack)、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯(mousse)、防曬油(sunblock)、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)、眼影(eyeshadow)、卸妝產品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身體清潔產品(body cleansing products)等。
依據本發明，該化妝品亦可與一或多種選自於下列之已知活性的外用劑(external use agents)一起合併使用：美白劑(whitening agents)[諸如維生素A酸(tretinoin)、兒茶素(catechin)、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、抗發炎劑(anti-inflammatory agents)、殺菌劑(bactericides)、紫外線吸收劑(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[諸如蘆薈萃取物(aloe extract)]、皮膚營養劑(skin nutrients)、麻醉劑(anesthetics)、抗痘劑(anti-acne agent)、止癢劑(antipruritic)、止痛劑(analgesic)、抗皮膚炎劑(antidermatitis agents)、抗過角化劑(antihyperkeratolytic agents)、抗乾皮膚劑(anti-dry skin agents)、抗乾癬劑(antipsoriatic agents)、抗老化劑(antiaging agents)、抗皺劑(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出劑(antiseborrheic agents)、傷口治療劑(wound-healing agents)、皮質類固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。實施例 一般實驗材料： 1.  富勒烯(fullerene)的儲備溶液(stock solution)：
將適量的富勒烯(購自於SES Research Inc.，Cat. No. 600-9999)溶於純水中，而得到一濃度為1 μM的儲備溶液。 2.  富勒烯衍生物(fullerene derivative)的儲備溶液：
在下面實施例中所使用的4種富勒烯衍生物(亦即富勒烯衍生物1至4)被顯示於下面表1與表2中，並且皆是由國立中興大學生醫工程研究所(Institute of Biomedical Engineering, National Chung Hsing University)的賴千蕙教授所提供。 表1. 富勒烯衍生物1的化學式及其簡式
1 簡式
Figure 02_image017
 C60 (OH)36
表2. 富勒烯衍生物2至4的化學式及其簡式
Figure 02_image019
  R 簡式
2
Figure 02_image021
 C60 (Glc)12
3
Figure 02_image023
 C60 (Gal)12
4
Figure 02_image025
 C60 (Man)12
將適量的富勒烯衍生物1至4分別溶於二次去離子水中，而得到濃度為10 mM的儲備溶液。 3.  人類角質細胞細胞株(human keratinocyte cell line) HaCaT的來源與培養：
在下面實施例中所使用的人類角質細胞細胞株HaCaT是由高雄醫學大學生物科技學系(Department of Biotechnology, Kaohsiung Medical University)的陳逸夫教授所提供。
HaCaT細胞被培養於含有DMEM/F-12培養基(Thermo Fisher Scientific)[添加有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)以及1%盤尼西林(penicillin)-鏈黴素(streptomycin)]的培養皿(petri dish)中，接著在培養條件被設定為37℃與5% CO2 的培養箱中進行培養。之後，大約每隔2-3天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約80-90%匯聚(confluence)時，移除培養基並以磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)來洗滌細胞共計2次，接著加入胰蛋白酶-EDTA (trypsin-EDTA)以使細胞自培養皿的底部脫離。之後，加入新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性並以量吸管(pipette)反覆地吸沖培養基以充分打散細胞，然後將所形成的細胞懸浮液分配到新的培養皿中，並在培養條件被設定為37℃與5% CO2 的培養箱中進行培養。 4.  製備微粒物質(particulate matter, PM)的懸浮液：
將適量之得自於美國國家標準技術研究所(National Institute of Standards and Technology, NIST)的標準參考材料(Standard Reference Material, SBM) 1649b添加至PBS中，並且進行超音波處理歷時30分鐘以避免顆粒的聚集，藉此而得到PM懸浮液。PM懸浮液是在製得後的1個小時內被拿來進行下面實施例中的實驗，以避免組成產生變化。 一般實驗方法： 1.  統計學分析(statistical analysis)：
在下面的實施例中，各組的實驗被重複至少3次，而實驗數據是以平均值±平均值的標準誤差(standard error of the mean, SEM)來表示。所有的數據是藉由單因子變異數分析(one-way analysis of variance, ANOVA)，繼而以Tukey事後檢定(Tukey’s post hoc test)來作分析，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是p ＜0.05，這表示有統計學顯著性(statistical significance)。實施例 1. 富勒烯衍生物 (fullerene derivative) 的預處理在對抗 PM- 誘發的氧化性壓力 (PM-induced oxidative stress) 上的效用評估
在本實施例中，申請人藉由測定在PM處理後細胞中(特別是粒線體中)所生成的活性氧族(reactive oxygen species, ROS)來評估富勒烯衍生物的預處理在對抗PM-誘發的氧化性壓力上的效用。 實驗方法： A、 細胞 ROS (cellular ROS) 的相對產量的測定：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第3項「人類角質細胞細胞株HaCaT的來源與培養」來進行繼代培養的HaCaT細胞分成4組，其中包括1個正常對照組、1個病理對照組、1個富勒烯衍生物1組以及1個富勒烯組。將各組細胞分別以一為2×105 細胞/井的數量培養於含有1,000 μL的DMEM/F-12培養基(添加有10%胎牛血清)的12-井培養盤(12-well plate)中，並在培養箱(37℃、5% CO2 )中進行培養歷時24小時。
接著，將各組的細胞培養物分別更換以新鮮的培養基，繼而將適量之富勒烯的儲備溶液添加至富勒烯組的細胞培養物中，而使得它具有一最終濃度為1 μM的富勒烯，以及將適量之富勒烯衍生物1的儲備溶液添加至富勒烯衍生物1組的細胞培養物中，而使得它具有一最終濃度為1 μM的富勒烯衍生物1。另外，正常對照組以及病理對照組的細胞培養物則不作任何處理。各組細胞培養物在培養箱(37℃，5% CO2 )中進行培養歷時1小時後，將適量之PM懸浮液添加至病理對照組、富勒烯衍生物1組以及富勒烯組的細胞培養物中，而使得各組具有一最終濃度為50 μg/cm2 的PM。另外，正常對照組的細胞培養物被添加以等體積的PBS。接著，將各組細胞培養物置於培養箱(37℃，5% CO2 )中進行培養歷時2小時。
之後，將各組的細胞培養物分別更換以新鮮的培養基，繼而將適量之2’,7’-二氯螢光黃二乙酸酯(2’,7’-dichlorofluorescin diacetate, DCFDA)(Sigma-Aldrich Co.)添加至各組的細胞培養物中，而使得各組具有一最終濃度為10 μM的DCFDA，並且於37℃下進行避光反應歷時30分鐘。接著，收取各組的細胞培養物並以PBS予以清洗，繼而加入300 mL的胰蛋白酶-EDTA並予以混合均勻，然後使用一Fluoroskan Ascent FL螢光培養盤讀取儀(Fluoroskan Ascent FL fluorescent plate reader)並於488 nm的激發波長(excitation wavelength)以及530 nm的放射波長(emission wavelength)下來測量各組的螢光強度(fluorescence intensity)。
各組的ROS的相對產量(relative production)(倍數)是藉由將各組所測得的螢光強度分別除以正常對照組所測得的螢光強度而被計算出。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
有關富勒烯衍生物2至4對於PM-誘發的細胞ROS生成的影響大體上是參照上面針對富勒烯衍生物1所描述的操作程序來進行分析，不同之處在於：以富勒烯衍生物2至4的儲備溶液來代替富勒烯衍生物1的儲備溶液。B、 粒線體 ROS (mitochondrial ROS) 的相對產量的測定：
有關富勒烯衍生物1至4對於PM-誘發的粒線體ROS生成的影響大體上是參照上面第A項「細胞ROS的相對產量的測定」所描述的操作程序來進行分析，不同之處在於：以MitoSOXTM 紅色粒線體過氧化物指示劑(MitoSOXTM Red mitochondrial superoxide indicator)(Molecular Probes)來代替DCFDA，並於488 nm的激發波長以及585 nm的放射波長下來測量各組的螢光強度。 結果： A、 細胞 ROS 的相對產量的測定：
圖1與圖2顯示各組細胞培養物所測得的細胞ROS的相對產量。從圖1與圖2可見，與正常對照組的細胞相較之下，病理對照組的細胞會大量地表現ROS，這表示PM成功地誘發HaCaT細胞產生氧化性壓力。而與病理對照組的細胞相較之下，富勒烯組的細胞ROS的相對產量沒有明顯的變化，至於富勒烯衍生物1組至富勒烯衍生物4組的細胞ROS的相對產量皆呈現顯著下降的情形。B、 粒線體 ROS 的相對產量的測定：
圖3與圖4顯示各組細胞培養物所測得的粒線體ROS的相對產量。從圖3與圖4可見，與正常對照組的細胞相較之下，病理對照組的粒線體會大量地表現ROS，這表示PM成功地誘發HaCaT細胞產生氧化性壓力。而與病理對照組的細胞相較之下，富勒烯組的粒線體ROS的相對產量沒有明顯的變化，至於富勒烯衍生物1組至富勒烯衍生物4組的粒線體ROS的相對產量皆呈現顯著下降的情形。
綜合上面第A項與第B項的實驗結果可知，富勒烯衍生物1至4的預處理皆能夠有效地保護皮膚細胞對抗PM-誘發的氧化性壓力。實施例 2. 富勒烯衍生物的預處理在對抗 PM- 誘發的發炎 (PM-induced inflammation) 上的效用評估
在本實施例中，申請人以環加氧酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)、血紅素氧化酵素-1 (heme oxygenase-1, HO-1)、基質金屬蛋白酶-9 (matrix metalloproteinase-9, MMP-9)、細胞間黏著分子-1 (Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)以及細胞溶質磷脂酶A2 (cytosolic phospholipase A2, cPLA2)的蛋白質表現量來作為發炎的指標，俾以評估富勒烯衍生物的預處理在對抗PM-誘發的發炎上的效用。 實驗方法：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第3項「人類角質細胞細胞株HaCaT的來源與培養」來進行繼代培養的HaCaT細胞分成4組，其中包括1個正常對照組、1個病理對照組、1個富勒烯衍生物1組以及1個富勒烯組。將各組細胞分別以一為2×105 細胞/井的數量培養於含有1,000 μL的DMEM/F-12培養基(添加有10%胎牛血清)的12-井培養盤中，並在培養箱(37℃、5% CO2 )中進行培養歷時24小時。
接著，將各組的細胞培養物分別更換以新鮮的培養基，繼而將適量之富勒烯的儲備溶液添加至富勒烯組的細胞培養物中，而使得它具有一最終濃度為1 μM的富勒烯，以及將適量之富勒烯衍生物1的儲備溶液添加至富勒烯衍生物1組的細胞培養物中，而使得它具有一最終濃度為1 μM的富勒烯衍生物1。另外，正常對照組以及病理對照組的細胞培養物則不作任何處理。各組細胞培養物在培養箱(37℃，5% CO2 )中進行培養歷時1小時後，將適量之PM懸浮液添加至病理對照組、富勒烯衍生物1組以及富勒烯組的細胞培養物中，而使得各組具有一最終濃度為50 μg/cm2 的PM。另外，正常對照組的細胞培養物被添加以等體積的PBS。接著，將各組細胞培養物置於培養箱(37℃，5% CO2 )中進行培養歷時24小時。
之後，收取各組的細胞培養物，並且分別加入500 μL的溶解緩衝液(lysis buffer)並予以混合均勻。將所形成的細胞混合物置於微量離心管中，並於4℃下以2,000 rpm進行離心歷時2分鐘，然後收集上澄液並以此作為總蛋白質樣品，接著藉由Bio-Rad蛋白質分析套組(Bio-Rad Protein Assay Kit)(廠牌為Bio-Rad，貨號為500-0006)來測定總蛋白質濃度。
之後，各組細胞的總蛋白質樣品是採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析，以及COX-2、HO-1、MMP-9、ICAM-1以及cPLA2的西方墨點分析(Western Blotting)，並且選用GAPDH作為內部對照組(internal control)。而所使用的儀器與試劑分別如下所述： (1)   SDS-PAGE分析是使用一垂直電泳槽(Buffer Tank and Lid #1658040, Bio-Rad)來進行。 (2)   蛋白質轉印(protein transfer)是使用轉漬電泳槽(TE 42 Standard Transfer Tank, Hoefer)以及聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride membrane)(Millipore)來進行。 (3)   在西方墨點分析中，針對各個蛋白質所使用的一次抗體(primary antibody)以及二次抗體(secondary antibody)分別被顯示於下面表3中。 表3. 用於進行西方墨點分析的一次抗體與二次抗體
蛋白質 一次抗體 二次抗體
COX-2 兔子抗COX-2多株抗體(rabbit anti COX-2 polyclonal antibody)(Abcam, Cat. No. ab15191) 山羊抗兔子IgG-辣根過氧化氫酶(HRP)抗體[goat anti rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) antibody](Jackson Immunoresearch Laboratories Inc)
HO-1 兔子抗HO-1單株抗體(rabbit anti HO-1 monoclonal antibody)(Abcam, Cat. No. ab52947)
MMP-9 兔子抗MMP-9多株抗體(rabbit anti MMP-9 polyclonal antibody)(Proteintech Group Inc, Cat. No. 10375-2-AP)
ICAM-1 兔子抗ICAM-1多株抗體(rabbit anti ICAM-1 polyclonal antibody) (Santa Cruz Biotechnology, Cat. No. sc-7891)
cPLA2 小鼠抗cPLA2單株抗體(mouse anti cPLA2 monoclonal antibody)(Santa Cruz Biotechnology, Cat. No. sc-454) 山羊抗小鼠IgG-辣根過氧化氫酶(HRP)抗體[goat anti mouse IgG-horseradish peroxidase (HRP) antibody](Jackson Immunoresearch Laboratories Inc)
GAPDH 小鼠抗GAPDH單株抗體(mouse anti GAPDH monoclonal antibody)(Santa Cruz Biotechnology, Cat. No. Sc-32233)
(4)   化學發光染色(chemiluminescence staining)是使用增強化學發光偵測套組(enhanced chemiluminescence detection kit)(GE Healthcare Bio-Sciences AB)來進行，並使用一ChemiDocTM XRS+成像系統(ChemiDocTM XRS+ image system)(Bio-Rad)來偵測訊號。
之後，使用Image LabTM 軟體來進行分析，藉此蛋白質帶(protein band)能夠被半-定量地計算出所對應的蛋白質表現量，蛋白質表現量接而以其所對應的GAPDH表現量來予以標準化(normalized)，然後將各組之經標準化的COX-2、HO-1、MMP-9、ICAM-1以及cPLA2的表現量分別除以正常對照組所對應的蛋白質表現量，藉此而計算出其他各組相對於正常對照組的COX-2、HO-1、MMP-9、ICAM-1以及cPLA2的表現量的倍數。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
有關富勒烯衍生物2至4對於PM-誘發的COX-2、HO-1、MMP-9、ICAM-1以及cPLA2的表現量的影響大體上是參照上面針對富勒烯衍生物1所描述的操作程序來進行分析，不同之處在於：以富勒烯衍生物2至4的儲備溶液來代替富勒烯衍生物1的儲備溶液。 結果：
圖5至圖9分別顯示各組細胞培養物所測得的COX-2、HO-1、MMP-9、ICAM-1以及cPLA2的相對表現量。從圖5至圖9可見，與正常對照組的細胞相較之下，病理對照組的細胞會大量地表現COX-2、HO-1、MMP-9、ICAM-1以及cPLA2，這表示PM成功地誘發HaCaT細胞產生發炎反應。而與病理對照組的細胞相較之下，富勒烯組的細胞的COX-2、HO-1、MMP-9、ICAM-1以及cPLA2的相對表現量皆沒有明顯的變化，至於富勒烯衍生物1組的COX-2、HO-1、MMP-9、ICAM-1以及cPLA2的相對表現量皆呈現顯著下降的情形。
圖10至圖14分別顯示各組細胞培養物所測得的COX-2、HO-1、MMP-9、ICAM-1以及cPLA2的相對表現量。從圖10至圖14可見，與正常對照組的細胞相較之下，病理對照組的細胞會大量地表現COX-2、HO-1、MMP-9、ICAM-1以及cPLA2，這表示PM成功地誘發HaCaT細胞產生發炎反應。而與病理對照組的細胞相較之下，富勒烯組的細胞的COX-2、HO-1、MMP-9、ICAM-1以及cPLA2的相對表現量皆沒有明顯的變化，至於富勒烯衍生物2組至富勒烯衍生物4組的COX-2、HO-1、MMP-9、ICAM-1以及cPLA2的相對表現量皆呈現顯著下降的情形。
這些實驗結果顯示：富勒烯衍生物1至4的預處理能夠有效地抑制PM-誘發的發炎。實施例 3. 富勒烯衍生物的預處理對於 PM- 誘發的細胞凋亡 (PM-induced apoptosis) 的影響 實驗方法：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第3項「人類角質細胞細胞株HaCaT的來源與培養」來進行繼代培養的HaCaT細胞分成4組，其中包括1個正常對照組、1個病理對照組、1個富勒烯衍生物1組以及1個富勒烯組。將各組細胞分別以一為2×105 細胞/井的數量培養於含有1,000 μL的DMEM/F-12培養基(添加有10%胎牛血清)的12-井培養盤中，並在培養箱(37℃、5% CO2 )中進行培養歷時24小時。
接著，將各組的細胞培養物分別更換以新鮮的培養基，繼而將適量之富勒烯的儲備溶液添加至富勒烯組的細胞培養物中，而使得它具有一最終濃度為1 μM的富勒烯，以及將適量之富勒烯衍生物1的儲備溶液添加至富勒烯衍生物1組的細胞培養物中，而使得它具有一最終濃度為1 μM的富勒烯衍生物1。另外，正常對照組以及病理對照組的細胞培養物則不作任何處理。各組細胞培養物在培養箱(37℃，5% CO2 )中進行培養歷時1小時後，將適量之PM懸浮液添加至病理對照組、富勒烯衍生物1組以及富勒烯組的細胞培養物中，而使得各組具有一最終濃度為50 μg/cm2 的PM。另外，正常對照組的細胞培養物被添加以等體積的PBS。接著，將各組細胞培養物置於培養箱(37℃，5% CO2 )中進行培養歷時24小時。
接著，對各組細胞培養物分別加入500 μL胰蛋白酶-EDTA以使細胞自培養皿的底部脫離，繼而加入200 μL新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性，然後以量吸管將所形成的細胞懸浮液吸取至離心管中並於2,000 rpm下進行離心歷時2分鐘。在移除上澄液之後，以冰冷的PBS (pH 7.4)來清洗細胞1次，然後於2,000 rpm下進行離心歷時2分鐘。接著，移除上澄液並加入1,000 μL冰冷的膜聯蛋白V結合緩衝液(Annexin V binding buffer)(Thermo Fisher Scientific)以充分散浮細胞沉澱物(cell pellet)，藉此而得到一細胞濃度為1×106 細胞/mL的細胞懸浮液，然後對所得到的細胞懸浮液分別加入50 μL的FITC膜聯蛋白V (FITC Annexin V)(Thermo Fisher Scientific)以及20 μL的碘化丙錠(PI)染色溶液[propidium iodide (PI) staining solution](Thermo Fisher Scientific)並予以充分混合均勻，繼而在4℃下進行避光作用歷時30分鐘。
之後，所得到之經染色的細胞是以BD Accuri™ C6流式細胞分析儀來進行分析，其中有被FITC膜聯蛋白V染色但無法被PI染色[亦即FITC膜聯蛋白V陽性(FITC Annexin V positive)以及PI陰性(PI negative)]的細胞即表示被誘發早期細胞凋亡(early apoptosis)的細胞，而無法被FITC膜聯蛋白V以及PI染色[亦即FITC膜聯蛋白V陰性(FITC Annexin V negative)以及PI陰性]的細胞則表示活細胞(viable cell)。有關被FITC膜聯蛋白V以及PI染色的細胞數目是藉由使用BD Accuri™ C6軟體而被計算出。
有關富勒烯衍生物2至4對於PM-誘發的細胞凋亡的影響大體上是參照上面針對富勒烯衍生物1所描述的操作程序來進行分析，不同之處在於：以富勒烯衍生物2至4的儲備溶液來代替富勒烯衍生物1的儲備溶液。
各組的細胞凋亡百分比(apoptosis percentage)(%)是藉由將所測得的細胞數目代入下列公式(I)而被計算出：A ＝ (B/C) × 100            (I) 其中：A＝細胞凋亡百分比(%) B＝被FITC膜聯蛋白V染色但無法被PI染色的細胞數目 C＝全部的細胞數目
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果：
圖15與圖16顯示各組細胞培養物所測得的細胞凋亡百分比。從圖15與圖16可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的細胞凋亡百分比有顯著的升高，這表示PM成功地誘發HaCaT細胞產生早期細胞凋亡。而與病理對照組的細胞凋亡百分比相較之下，富勒烯組的細胞凋亡百分比沒有明顯的變化，至於富勒烯衍生物1組至富勒烯衍生物4組的細胞凋亡百分比皆呈現顯著下降的情形。這個實驗結果顯示：富勒烯衍生物1至4的預處理能夠有效地保護皮膚細胞對抗PM-誘發的細胞凋亡。實施例 4. 富勒烯衍生物的預處理對於 PM- 誘發的皮膚屏障功能 (skin barrier function) 的降低之影響
在本實施例中，申請人藉由測定在PM處理後與皮膚屏障功能相關的蛋白質(skin barrier function-related protein)[包括纖聚蛋白(filaggrin)、皮膚屏障形成蛋白質(repetin, RPTN)、套膜蛋白(involucrin)以及兜甲蛋白(loricrin)]的表現量來評估富勒烯衍生物的預處理在保護皮膚對抗PM-誘發的皮膚屏障功能的降低上的效用。 實驗方法：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第3項「人類角質細胞細胞株HaCaT的來源與培養」來進行繼代培養的HaCaT細胞分成4組，其中包括1個正常對照組、1個病理對照組、1個富勒烯衍生物1組以及1個富勒烯組。將各組細胞分別以一為2×105 細胞/井的數量培養於含有1,000 μL的DMEM/F-12培養基(添加有10%胎牛血清)的12-井培養盤中，並在培養箱(37℃、5% CO2 )中進行培養歷時24小時。
接著，將各組的細胞培養物分別更換以新鮮的培養基，繼而將適量之富勒烯的儲備溶液添加至富勒烯組的細胞培養物中，而使得它具有一最終濃度為1 μM的富勒烯，以及將適量之富勒烯衍生物1的儲備溶液添加至富勒烯衍生物1組的細胞培養物中，而使得它具有一最終濃度為1 μM的富勒烯衍生物1。另外，正常對照組以及病理對照組的細胞培養物則不作任何處理。各組細胞培養物在培養箱(37℃，5% CO2 )中進行培養歷時1小時後，將適量之PM懸浮液添加至病理對照組、富勒烯衍生物1組以及富勒烯組的細胞培養物中，而使得各組具有一最終濃度為50 μg/cm2 的PM。另外，正常對照組的細胞培養物被添加以等體積的PBS。接著，將各組細胞培養物置於培養箱(37℃，5% CO2 )中進行培養歷時24小時。
之後，依照實施例2的“實驗方法”當中所述的方法來進行細胞總蛋白質樣品的製備、總蛋白質濃度的測定、SDS-PAGE分析以及西方墨點分析，不同之處在於：各組細胞的總蛋白質樣品是針對纖聚蛋白、RPTN、套膜蛋白以及兜甲蛋白來進行西方墨點分析，而所使用的抗體被顯示在下面表4中。 表4. 用於進行西方墨點分析的一次抗體與二次抗體
蛋白質 一次抗體 二次抗體
纖聚蛋白 兔子抗纖聚蛋白多株抗體(rabbit anti filaggrin polyclonal antibody)(Genetex, Cat. No. GTX37695) 山羊抗兔子IgG-辣根過氧化氫酶(HRP)抗體(Jackson Immunoresearch Laboratories Inc)
RPTN 兔子抗RUVBL2多株抗體(rabbit anti RUVBL2 polyclonal antibody)(Proteintech Group Inc, Cat. No. 10195-1-AP)
套膜蛋白 兔子抗套膜蛋白多株抗體(rabbit anti involucrin polyclonal antibody)(Proteintech Group Inc, Cat. No. 55328-1-AP)
兜甲蛋白 兔子抗兜甲蛋白多株抗體(rabbit anti loricrin polyclonal antibody) (Proteintech Group Inc, Cat. No. 55439-1-AP)
GAPDH 小鼠抗GAPDH單株抗體(Santa Cruz Biotechnology, Cat. No. Sc-32233) 山羊抗小鼠IgG-辣根過氧化氫酶(HRP)抗體(Jackson Immunoresearch Laboratories Inc)
有關富勒烯衍生物2至4對於與皮膚屏障功能相關的蛋白質的表現量的影響大體上是參照上面針對富勒烯衍生物1所描述的操作程序來進行分析，不同之處在於：以富勒烯衍生物2至4的儲備溶液來代替富勒烯衍生物1的儲備溶液。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果：
圖17至圖20分別顯示各組細胞培養物所測得的纖聚蛋白、RPTN、套膜蛋白以及兜甲蛋白的相對表現量。從圖17至圖20可見，與正常對照組的細胞相較之下，病理對照組的細胞的纖聚蛋白、RPTN、套膜蛋白以及兜甲蛋白的表現量會顯著地下降，這表示PM會誘發HaCaT細胞內與皮膚屏障功能相關的蛋白質的降解。而與病理對照組的細胞相較之下，富勒烯組的細胞的纖聚蛋白、RPTN、套膜蛋白以及兜甲蛋白的相對表現量皆沒有明顯的變化，至於富勒烯衍生物1組的纖聚蛋白、RPTN、套膜蛋白以及兜甲蛋白的相對表現量皆呈現顯著上升的情形。
圖21至圖24分別顯示各組細胞培養物所測得的纖聚蛋白、RPTN、套膜蛋白以及兜甲蛋白的相對表現量。從圖21至圖24可見，與正常對照組的細胞相較之下，病理對照組的細胞的纖聚蛋白、RPTN、套膜蛋白以及兜甲蛋白的相對表現量會顯著地下降，這表示PM會誘發HaCaT細胞內與皮膚屏障功能相關的蛋白質的降解。而與病理對照組的細胞相較之下，富勒烯組的細胞的纖聚蛋白、RPTN、套膜蛋白以及兜甲蛋白的相對表現量皆沒有明顯的變化，至於富勒烯衍生物2組至富勒烯衍生物4組的纖聚蛋白、RPTN、套膜蛋白以及兜甲蛋白的相對表現量皆呈現顯著上升的情形。
這些實驗結果顯示：對皮膚細胞進行富勒烯衍生物1至4的預處理可以對抗PM-誘發的皮膚屏障功能的降低。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中： 圖1與圖2分別顯示各組細胞培養物所測得的細胞ROS的相對產量，其中“*”表示：當與病理對照組作比較，p ＜0.05； 圖3與圖4分別顯示各組細胞培養物所測得的粒線體ROS的相對產量，其中“*”表示：當與病理對照組作比較，p ＜0.05； 圖5至圖14分別顯示各組細胞培養物所測得的發炎指標(亦即COX-2、HO-1、MMP-9、ICAM-1以及cPLA2)的相對表現量，其中“**”表示：當與病理對照組作比較，p ＜0.01； 圖15與圖16分別顯示各組細胞培養物所測得的細胞凋亡百分比，其中“*”表示：當與病理對照組作比較，p ＜0.05；以及 圖17至圖24分別顯示各組細胞培養物所測得的皮膚屏障功能相關的蛋白質(skin barrier function-related protein)(亦即纖聚蛋白、RPTN、套膜蛋白以及兜甲蛋白)的相對表現量，其中“**”表示：當與病理對照組作比較，p ＜0.01。

Claims (5)

  1. 一種富勒烯衍生物供應用於製備一用來預防微粒物質-誘發的皮膚損害之醫藥品或化妝品的用途，其中該富勒烯衍生物是
    Figure 108122854-A0305-02-0038-1
     其中，R是選自於由下列所構成的群組：
    Figure 108122854-A0305-02-0038-2
    、
    Figure 108122854-A0305-02-0038-3
    以及
    Figure 108122854-A0305-02-0038-4
    。
  2. 如請求項1的用途，其中該醫藥品進一步包含有一藥學上可接受的載劑。
  3. 如請求項1的用途，其中該醫藥品是呈一供局部施用的形式。
  4. 如請求項1的用途，其中該化妝品進一步包含有一化妝品上可接受的佐劑。
  5. 如請求項1的用途，其中該化妝品是呈一供局部施用的形式。
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