TWI631954B - 澤蘭素遞送系統及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明揭示一種澤蘭素遞送系統，其包含有澤蘭素以及一遞送載體，該遞送載體含有甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物以及聚乙烯醇，其中，澤蘭素、甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物以及聚乙烯醇是呈一範圍落在1：5：5 (w/w/w)至1：10：10 (w/w/w)內的比例。該澤蘭素遞送系統可被用來預防微粒物質-誘發的皮膚損害。

Description

澤蘭素遞送系統及其用途

本發明是有關於一種澤蘭素遞送系統(eupafolin delivery system)，其包含有澤蘭素以及一遞送載體(delivery carrier)，該遞送載體含有甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物(aminoalkyl methacrylate copolymer)以及聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)，其中，澤蘭素、甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物以及聚乙烯醇是呈一範圍落在1：5：5 (w/w/w)至1：10：10 (w/w/w)內的比例。該澤蘭素遞送系統可被用來預防微粒物質-誘發的皮膚損害(particulate matter-induced skin damage)。

大氣微粒物質(atmospheric particulate matter)[又被稱為微粒物質(particulate matter, PM)]是一種主要的空氣汙染形式，意指懸浮在大氣環境中的微小固體顆粒以及液滴。微粒物質的組成包括芳香烴(aromatic hydrocarbon)、金屬、礦物以及有機毒素等，可能會促進在人體的呼吸系統、心血管系統以及神經系統中的疾病之進展。此外，已有報導指出，微粒物質亦會造成皮膚損害(skin damage)[包括氧化性損害(oxidative damage)以及發炎性損害(inflammatory damage)]並且破壞皮膚的屏障功能(barrier function)。

當皮膚暴露於微粒物質時，微粒物質會促進皮膚中的活性氧族(reactive oxygen species, ROS)以及自由基(free radicals)生成。當活性氧族以及自由基的數量超過細胞或組織本身的抗氧化能力時，氧化性壓力(oxidative stress)就會形成。活性氧族以及自由基因為非常地不穩定而容易與細胞內的組成物(包括DNA、蛋白質以及脂質等)相反應，進而導致細胞或組織的氧化性損害。此外，促發炎性因子(proinflammatory factors)[包括環加氧酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)以及前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)]亦會被調控，而使得發炎反應被誘發。在長期的暴露下，甚至可能進一步發展出發炎性皮膚疾病(inflammatory skin diseases)[例如，異位性皮膚炎(atopic dermatitis)、痤瘡(acne)以及乾癬(psoriasis)]以及皮膚癌(skin cancer)[例如，黑色素瘤(melanoma)以及鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma)]。

澤蘭素(eupafolin)是一種存在於藥用植物[諸如鴨舌癀( Phyla nodiflora)以及魁蒿( Artemisia princeps)]中的類黃酮(flavonoid)，它具有下列化學式(I)： (I) 目前已知澤蘭素具有抗發炎、抗氧化以及抗癌的效用。在先前的研究中，申請人藉由活體外試驗( in vitrotest)而發現，澤蘭素的預處理能夠抑制微粒物質在人類角質細胞(human keratinocyte)中所誘導的ROS生成以及COX-2與PGE2的表現。此外，申請人藉由活體內試驗( in vivotest)而發現，澤蘭素的預處理能夠抑制微粒物質在小鼠皮膚的角質細胞中所誘導的COX-2表現(Lee C.W. et al. (2016), Journal of Ethnopharmacology, 189:300-309)。

雖然澤蘭素具有預防微粒物質-誘發的皮膚損害之潛力，但是它仍存在有較低的水溶解度(water solubility)以及較差的皮膚穿透能力(skin penetration ability)之缺點。低的水溶解度是許多天然候選藥物的一個固有特性(intrinsic property)，並且通常與差的吸收以及生物可利用性(bioavailability)有關聯，因而限制了藥物的發展以及臨床應用。因此，現今有許多的研究人員致力於改善候選藥物的水溶解度以及皮膚吸收，例如，使用奈米沉澱法(nanoprecipitation method)來製備藥物遞送系統(drug delivery system)，而使得候選藥物可透過遞送載體(delivery carrier)而被遞送。

經研究，申請人意外地發現：以一範圍落在1：5：5 (w/w/w)至1：10：10 (w/w/w)內的比例之澤蘭素、甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物(aminoalkyl methacrylate copolymer)以及聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)所製得的澤蘭素遞送系統具有較高的水溶解度、皮膚穿透能力以及抗微粒物質-誘發的皮膚損害之效用。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種澤蘭素遞送系統，其包含有澤蘭素以及一遞送載體，該遞送載體含有甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物以及聚乙烯醇，其中，澤蘭素、甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物以及聚乙烯醇是呈一範圍落在1：5：5 (w/w/w)至1：10：10 (w/w/w)內的比例。

在第二個方面，本發明提供一種組成物，其包含有一如上所述的澤蘭素遞送系統。

在第三個方面，本發明提供一如上所述的澤蘭素遞送系統供應用於製備一用來預防微粒物質-誘發的皮膚損害之醫藥品或化妝品的用途。

在第四個方面，本發明提供一種用於預防微粒物質-誘發的皮膚損害的方法，其包括對一需要預防微粒物質-誘發的皮膚損害的個體投予(administering)一如上所述的澤蘭素遞送系統。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。

發明的詳細說明

為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。

為了改善澤蘭素所具有之較低的水溶解度(water solubility)以及較差的皮膚穿透能力(skin penetration ability)的缺點，申請人經戮力研究結果發現，以一範圍落在1：5：5 (w/w/w)至1：10：10 (w/w/w)內的比例之澤蘭素、甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物(aminoalkyl methacrylate copolymer)以及聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)所製得的澤蘭素遞送系統具有較高的水溶解度、皮膚穿透能力以及抗微粒物質-誘發的皮膚損害之效用。

因此，本發明提供一種澤蘭素遞送系統，其包含有澤蘭素以及一遞送載體，該遞送載體含有甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物以及聚乙烯醇，其中，澤蘭素、甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物以及聚乙烯醇是呈一範圍落在1：5：5 (w/w/w)至1：10：10 (w/w/w)內的比例。

依據本發明，該澤蘭素遞送系統可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術而被製得。在此方面，可以參考，例如，Yen F.L. et al.(2009)(同上述)。較佳地，該澤蘭素遞送系統可藉由一包含下列步驟之方法而被製得： 將澤蘭素以及甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物添加至乙醇中，俾以得到一有機相溶液； 將聚乙烯醇添加至水中，俾以得到一水相溶液； 混合該有機相溶液以及該水相溶液，俾以得到一混合物； 對該混合物進行一均質處理，俾以生成一含有該澤蘭素遞送系統的反應產物；以及 自該反應產物中分離出該澤蘭素遞送系統。

依據本發明，該均質處理的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。較佳地，該均質處理是於5,000至25,000 rpm下歷時5至30分鐘而被進行。在本發明的一個較佳具體例中，該均質處理是於22,000 rpm下歷時10分鐘而被進行。

依據本發明的澤蘭素遞送系統經由活體外試驗而被證實可以有效地保護皮膚細胞對抗微粒物質-誘發的氧化性壓力以及發炎。據此，依據本發明的澤蘭素遞送系統被預期具有預防微粒物質-誘發的皮膚損害的效用，因而可供應用於製備一用來預防微粒物質-誘發的皮膚損害之醫藥品的用途。

如本文中所使用的，術語“微粒物質-誘發的皮膚損害”意指生物體的皮膚在經過微粒物質暴露之後所造成的損傷(injury)或損害(damage)。

依據本發明，該皮膚損害是氧化性損害或發炎性損害。

依據本發明，該澤蘭素遞送系統可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地(topically)施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、肥皂(soap)、油膏(salve)、繃帶(bandage)以及類似之物。

依據本發明，該外部製劑是藉由將本發明的組成物與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而被製備。

依據本發明，該基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)[諸如卡波普 ^®941 (carbopol ^®941)、微結晶纖維素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纖維素(carboxymethylcellulose)]、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、螯合劑(chelating agents)、乳化劑(emulsifiers)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)以及推進劑(propellants)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

本發明亦提供一種用於預防微粒物質-誘發的皮膚損害的方法，其包括對一需要預防微粒物質-誘發的皮膚損害的個體投予一如上所述的澤蘭素遞送系統。

如本文中所用的，術語“投予(administering)”與“投藥”以及“施用(application)”可被交換地使用。

依據本發明，澤蘭素遞送系統的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被改善的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被改善的個體之體重、年齡、身體狀況與反應。而有關投藥劑量與投藥次數的選擇是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

特別地，依據本發明的澤蘭素遞送系統亦被預期可供應用於製備一用來預防微粒物質-誘發的皮膚損害之化妝品的用途。

依據本發明，該化妝品可進一步包含有一被廣泛地使用於化妝品製造技術之化妝品上可接受的佐劑(cosmetically acceptable adjuvant)。例如，該化妝品上可接受的佐劑可包含有一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、膠凝劑、活性劑、防腐劑(preservative)、抗氧化劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、介面活性劑、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料以及氣味吸收劑。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該化妝品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的形式，這包括，但不限於：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜(mask)、貼片、貼布(pack)、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯(mousse)、防曬油(sunblock)、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)、眼影(eyeshadow)、卸妝產品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身體清潔產品(body cleansing products)等。

依據本發明，該化妝品亦可與一或多種選自於下列之已知活性的外用劑(external use agents)一起合併使用：美白劑(whitening agents)[諸如維生素A酸(tretinoin)、兒茶素(catechin)、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、抗發炎劑(anti-inflammatory agents)、殺菌劑(bactericides)、紫外線吸收劑(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[諸如蘆薈萃取物(aloe extract)]、皮膚營養劑(skin nutrients)、麻醉劑(anesthetics)、抗痘劑(anti-acne agent)、止癢劑(antipruritic)、止痛劑(analgesic)、抗皮膚炎劑(antidermatitis agents)、抗過角化劑(antihyperkeratolytic agents)、抗乾皮膚劑(anti-dry skin agents)、抗汗劑(antipsoriatic agents)、抗老化劑(antiaging agents)、抗皺劑(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出劑(antiseborrheic agents)、傷口治療劑(wound-healing agents)、皮質類固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

本發明亦提供一種組成物，其包含有一如上所述的澤蘭素遞送系統。

依據本發明，該組成物的投藥途徑與劑型或施用形式以及可供使用之載劑或佐劑是如上面所述者。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例 一般實驗材料： 1. 澤蘭素 (eupafolin) 的來源：

下面實施例中所使用的澤蘭素是參照Tsai M.H. et al.(2014), Toxicology and Applied Pharmacology, 279:240-251當中所述的方法而從鴨舌癀( Phyla nodiflora)(採集自台南)中被萃取、分離、純化以及鑑定。 2. 人類角質細胞細胞株 (human keratinocyte cell line) HaCaT 的來源與培養：

在下面實施例中所使用的人類角質細胞細胞株HaCaT是由高雄醫學大學生物科技學系(Department of Biotechnology, Kaohsiung Medical University)的陳逸夫教授所提供。

HaCaT細胞被培養於含有DMEM/F-12培養基(Thermo Fisher Scientific)[添加有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)以及1%盤尼西林(penicillin)-鏈黴素(streptomycin)]的培養皿(petri dish)中，接著在培養條件被設定為37℃與5% CO ₂的培養箱中進行培養。之後，大約每隔2-3天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約80-90%匯聚(confluence)時，移除培養基並以磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)來洗滌細胞共計2次，接著加入胰蛋白酶-EDTA (trypsin-EDTA)以使細胞自培養皿的底部脫離。之後，加入新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性並以量吸管(pipette)反覆地吸沖培養基以充分打散細胞，然後將所形成的細胞懸浮液分配到新的培養皿中，並在培養條件被設定為37℃與5% CO ₂的培養箱中進行培養。 3. 製備微粒物質 (particulate matter, PM) 的懸浮液：

將適量之得自於美國國家標準技術研究所(National Institute of Standards and Technology, NIST)的標準參考材料(Standard Reference Material, SBM) 1649b添加至PBS中，並且進行超音波處理歷時30分鐘以避免顆粒的聚集，藉此而得到PM懸浮液。PM懸浮液是在製得後的1個小時內被拿來進行下面實施例中的實驗，以避免組成產生變化。 一般實驗方法： 1. 澤蘭素的濃度測定 ：

在下面的實施例中，待測樣品中所含有的澤蘭素的濃度測定是藉由HPLC分析而被進行。所使用的HPLC分析儀器如下：Hitachi高效能液相層析系統(Hitachi high performance liquid chromatography system, Japan)、幫浦(L-2200, Hitachi)、UV-vis偵測器(L-2420, Hitachi)，而有關HPLC的各項操作參數與條件被顯示於下面的表1中。 表1. HPLC的操作參數與條件 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 分離管柱 </td><td> RP-18 GP管柱(Mightysil) </td></tr><tr><td> 管柱長度 </td><td> 250 mm × 4.6 mm </td></tr><tr><td> 樣品注射體積 </td><td> 20 μL </td></tr><tr><td> 偵測波長 </td><td> 290 nm </td></tr><tr><td> 移動相 </td><td> 10 mM KH₂PO₄/乙腈(acetonitrile) 65：35 (v/v) </td></tr><tr><td> 流速 </td><td> 1 mL/分鐘 </td></tr></TBODY></TABLE>

此外，為供比對，使用不同濃度之澤蘭素(1-100 μg/mL)來作為校正標準品並進行相同的分析。 2. 統計學分析 (statistical analysis) ：

在下面的實施例中，各組的實驗被重複至少3次，而實驗數據是以平均值±平均值的標準誤差(standard error of the mean, SEM)來表示。所有的數據是藉由單因子變異數分析(one-way analysis of variance, ANOVA)，繼而以Tukey事後檢定(Tukey’ post hoc test)來作分析，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是 p＜0.05，這表示有統計學顯著性(statistical significance)。 實施例 1. 製備本發明的澤蘭素遞送系統 (eupafolin delivery system)

本發明的澤蘭素遞送系統大體上是參照Yen F.L. et al.(2009), Pharmaceutical Research, 26:893-902當中所述的奈米沉澱法(nanoprecipitation method)並藉由使用甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物(aminoalkyl methacrylate copolymer)(商品名為Eudragit E100，購自於Röhm Pharma)以及聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)(Sigma-Aldrich Co.)作為遞送載體來包覆澤蘭素而被製備。簡言之，將10 mg的澤蘭素以及100 mg的甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物添加至5 mL的95%乙醇中並且利用超音波來促進溶解，藉此而得到一有機相溶液。另外，將100 mg的PVA配於15 mL的純水中，藉此而得到一水相溶液。接著，將該有機相溶液立即添加至該水相溶液中並且於22,000 rpm下進行均質處理歷時10分鐘。之後，對所得到的混合物進行旋轉真空蒸發(rotary vacuum evaporation)以移除乙醇，藉此而得到本發明的澤蘭素遞送系統。

本發明的澤蘭素遞送系統的包覆效率(encapsulation efficiency)大體上是參照Huang P.H. et al.(2016), International Journal of Nanomedicine, 11:1615-1627當中所述的方法來進行測定。而實驗結果發現，其包覆效率大於99%。 實施例 2. 本發明的澤蘭素遞送系統的粒徑之測定

將本發明的澤蘭素遞送系統以純水予以稀釋50倍，繼而使用一N5亞微米粒徑分析儀(N5 submicrometer particle size analyzer)(Beckman Coulter)並依照廠商所提供的操作指引來進行粒徑的測定。此外，為供比較，澤蘭素被拿來作為對照組，並進行相同的實驗。之後，依照上面“一般實驗方法”的第2項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。所得到的實驗結果被顯示於下面的表2中。

從表2可見，本發明的澤蘭素遞送系統在水中的平均粒徑是顯著地小於對照組所具者。這個實驗結果顯示：具有較低水溶解度(water solubility)的澤蘭素在水中的結晶形式(crystalline form)之粒徑會藉由甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物以及PVA的包覆而被顯著地降低。申請人據此而認為：本發明的澤蘭素遞送系統具有較高的水溶解度，於是進一步進行下面的實驗。 表2. 本發明的澤蘭素遞送系統與澤蘭素在水中的平均粒徑 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 平均粒徑(nm) </td></tr><tr><td> 本發明的澤蘭素遞送系統 </td><td> 70.7±5.2* </td></tr><tr><td> 對照組 </td><td> 4,782.9±1,021.1 </td></tr></TBODY></TABLE>*：當與對照組作比較， p＜0.05。 實施例 3. 本發明的澤蘭素遞送系統的水溶解度之測定

首先，將1 mg之本發明的澤蘭素遞送系統添加至1 mL的純水中，繼而於37℃下以1,000 rpm進行攪拌歷時10分鐘，然後以一孔徑為0.45 μm的過濾器(filter)進行過濾，而所得到的濾液是依據上面“一般實驗方法”的第1項「澤蘭素的濃度測定」當中所述的方法來進行澤蘭素的含量分析，藉此而得到水溶解度。此外，為供比較，澤蘭素被拿來作為對照組，並進行相同的實驗。之後，依照上面“一般實驗方法”的第2項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。所得到的實驗結果被顯示於下面的表3中。

從表3可見，本發明的澤蘭素遞送系統的水溶解度是顯著地高於對照組所具者。這個實驗結果顯示：澤蘭素的水溶解度會藉由甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物以及PVA的包覆而被顯著地提升。 表3. 本發明的澤蘭素遞送系統與澤蘭素的水溶解度 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 水溶解度(μg/mL) </td></tr><tr><td> 本發明的澤蘭素遞送系統 </td><td> 14.757±0.222* </td></tr><tr><td> 對照組 </td><td> 0.421±0.002 </td></tr></TBODY></TABLE>*：當與對照組作比較， p＜0.05。 實施例 4. 本發明的澤蘭素遞送系統的活體外皮膚穿透分析 ( In vitroskin penetration assay) 實驗方法：

本實驗大體上是參照歐洲化妝品、盥用品和香料協會(The European Cosmetic, Toiletry and Perfumery Association, COLIPA)所規範的標準操作程序來進行。簡言之，將來自豬隻側腹部的新鮮皮膚(購自於市場)(實驗面積為0.785 cm ²)固定於Franz擴散槽(Franz diffusion cell)上，而使得該皮膚的真皮層(dermis layer)面對接收室(receptor chamber)並且與被維持在約32℃以及攪拌下的接收液(receptor fluid)(含有0.14 M的NaCl、2 mM K ₂HPO ₄、0.4 mM KH ₂PO ₄以及10%的盤尼西林，pH 7.4)接觸，而該皮膚的角質層(corneum layer)面對供給室(donor chamber)並且暴露於空氣中。接著，將200 μL之本發明的澤蘭素遞送系統施用於該皮膚的角質層表面歷時1或2小時。之後，分別收集角質層以及表皮與真皮層(epidermis and dermis layers)，並且浸泡於2 mL的甲醇中進行萃取歷時1小時。將所得到的萃取產物以一孔徑為0.45 μm的過濾器進行過濾，而所得到的濾液是依據上面“一般實驗方法”的第1項「澤蘭素的濃度測定」當中所述的方法來進行澤蘭素的含量分析。此外，為供比較，澤蘭素被拿來作為對照組，並進行相同的實驗。之後，依照上面“一般實驗方法”的第2項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果：

圖1顯示藉由活體外皮膚穿透分析歷時1與2小時所測得之在豬皮的角質層中的澤蘭素含量。由圖1可見，角質層中的澤蘭素含量會藉由本發明的澤蘭素遞送系統的施用而被顯著地提升，並且隨著時間而明顯地減少。

圖2顯示藉由活體外皮膚穿透分析歷時1與2小時所測得之在豬皮的表皮與真皮層中的澤蘭素含量。由圖2可見，表皮與真皮層中的澤蘭素含量會藉由本發明的澤蘭素遞送系統的施用而被顯著地提升，並且隨著時間而明顯地增加。

這個實驗結果顯示：本發明的澤蘭素遞送系統能夠有效地促進皮膚吸收澤蘭素，並且所吸收的澤蘭素能夠持續地由角質層穿透至表皮與真皮層。 實施例 5. 本發明的澤蘭素遞送系統的預處理在對抗 PM- 誘發的氧化性壓力 (PM-induced oxidative stress) 上的效用評估 實驗方法：

首先，將依據上面“一般實驗材料”的第2項「人類角質細胞細胞株HaCaT的來源與培養」來進行繼代培養的HaCaT細胞分成5組，其中包括1個正常對照組、1個病理對照組、1個澤蘭素D組、1個澤蘭素P組以及1個澤蘭素遞送系統組。將各組細胞分別以一為2×10 ⁵細胞/井的數量培養於含有1,000 μL的DMEM/F-12培養基(添加有10%胎牛血清)的12-井培養盤(12-well plate)中，並在培養箱(37℃、5% CO ₂)中進行培養歷時24小時。

接著，將各組的細胞培養物分別更換以新鮮的培養基，繼而將適量之配於DMSO中的澤蘭素添加至澤蘭素D組的細胞培養物中，將配於PBS中的澤蘭素添加澤蘭素P組的細胞培養物中，以及將本發明的澤蘭素遞送系統添加澤蘭素遞送系統組的細胞培養物中，而使得各組分別具有一最終濃度為10 μM的澤蘭素。另外，正常對照組以及病理對照組的細胞培養物則不作任何處理。各組細胞培養物在培養箱(37℃，5% CO ₂)中進行培養歷時1小時後，將適量之PM懸浮液添加至病理對照組、澤蘭素D組、澤蘭素P組以及澤蘭素遞送系統組的細胞培養物中，而使得各組具有一最終濃度為50 μg/cm ²的PM。另外，正常對照組的細胞培養物被添加以等體積的PBS。接著，將各組細胞培養物置於培養箱(37℃，5% CO ₂)中進行培養歷時1小時。

之後，將各組的細胞培養物分別更換以新鮮的培養基，繼而將適量之2’,7’-二氯螢光黃二乙酸酯(2’,7’-Dichlorofluorescin diacetate, DCFDA)(Sigma-Aldrich Co.)添加至各組的細胞培養物中，而使得各組具有一最終濃度為10 μM的DCFDA，並且於37℃下進行避光反應歷時30分鐘。接著，收取各組的細胞培養物並以PBS予以清洗，繼而加入300 mL的胰蛋白酶-EDTA並予以混合均勻，然後使用一Fluoroskan Ascent FL螢光培養盤讀取儀(Fluoroskan Ascent FL fluorescent plate reader)並於504 nm的激發波長(excitation wavelength)以及524 nm的放射波長(emission wavelength)下來測量各組的螢光強度(fluorescence intensity)。

ROS的相對產量(relative production)是藉由將所測得的螢光強度代入下列公式(I)而被計算出： A ＝ (B/C) × 100 (I)其中：A＝ROS的相對產量(%) B＝各組的螢光強度 C＝正常對照組的螢光強度

之後，依照上面“一般實驗方法”的第2項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果：

圖3顯示各組細胞培養物所測得的ROS的相對產量。從圖3可見，與正常對照組的細胞相較之下，病理對照組的細胞會大量地表現ROS，這表示PM成功地誘發HaCaT細胞產生氧化性壓力。而與病理對照組的細胞相較之下，澤蘭素P組的細胞的ROS的相對產量沒有明顯的變化。至於澤蘭素遞送系統組以及澤蘭素D組的ROS的相對產量皆呈現顯著下降的情形。特別地，澤蘭素遞送系統組的ROS的相對產量是近似於澤蘭素D組所具者。這個實驗結果顯示：本發明的澤蘭素遞送系統的預處理能夠有效地保護皮膚細胞對抗PM-誘發的氧化性壓力。 實施例 6. 本發明的澤蘭素遞送系統的預處理在對抗 PM- 誘發的發炎 (PM-induced inflammation) 上的效用評估

在本實施例中，申請人以環加氧酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)以及前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)的表現量來作為發炎的指標，俾以評估本發明的澤蘭素遞送系統的預處理在對抗PM-誘發的發炎上的效用。 實驗方法： A、 COX-2 的表現量分析：

首先，將依據上面“一般實驗材料”的第2項「人類角質細胞細胞株HaCaT的來源與培養」來進行繼代培養的HaCaT細胞分成11組，其中包括1個正常對照組、1個病理對照組、3個澤蘭素D組(亦即澤蘭素D組1至3)、3個澤蘭素P組(亦即澤蘭素P組1至3)以及3個澤蘭素遞送系統組(亦即澤蘭素遞送系統組1至3)。將各組細胞分別以一為2×10 ⁵細胞/井的數量培養於含有1,000 μL的DMEM/F-12培養基(添加有10%胎牛血清)的12-井培養盤中，並在培養箱(37℃、5% CO ₂)中進行培養歷時24小時。

接著，將各組的細胞培養物分別更換以新鮮的培養基，繼而將適量之配於DMSO中的澤蘭素分別添加至澤蘭素D組1至3的細胞培養物中，而使得澤蘭素D組1至3分別具有一最終濃度為0.1、1以及10 μM的澤蘭素，將適量之配於PBS中的澤蘭素分別添加至澤蘭素P組1至3的細胞培養物中，而使得澤蘭素P組1至3分別具有一最終濃度為0.1、1以及10 μM的澤蘭素，以及將本發明的澤蘭素遞送系統分別添加至澤蘭素遞送系統組1至3的細胞培養物中，而使得澤蘭素遞送系統組1至3分別具有一最終濃度為0.1、1以及10 μM的澤蘭素。另外，正常對照組以及病理對照組的細胞培養物則不作任何處理。各組細胞培養物在培養箱(37℃，5% CO ₂)中進行培養歷時1小時後，將適量之PM懸浮液添加至病理對照組、澤蘭素D組1至3、澤蘭素P組1至3以及澤蘭素遞送系統組1至3的細胞培養物中，而使得各組具有一最終濃度為50 μg/cm ²的PM。另外，正常對照組的細胞培養物被添加以等體積的PBS。接著，將各組細胞培養物置於培養箱(37℃，5% CO ₂)中進行培養歷時24小時後。

之後，收取各組的細胞培養物，並且分別加入150 μL的SDS樣品緩衝液(SDS sample buffer)並予以混合均勻。將所形成的細胞混合物置於微量離心管中進行震盪歷時3分鐘，繼而將之靜置於冰上歷時3分鐘。接著，於4℃下以1,000 rpm進行離心歷時1分鐘後，收集上澄液並以此作為蛋白質樣品。

蛋白質樣品是採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析，以及COX-2的西方墨點分析(Western Blotting)，並且選用GAPDH作為內部對照組(internal control)。而所使用的儀器與試劑分別如下所述： (1) SDS-PAGE分析是使用一垂直電泳槽(Buffer Tank and Lid #1658040, Bio-rad)來進行。 (2) 蛋白質轉印(protein transfer)是使用轉漬電泳槽(TE 42 Standard Transfer Tank, Hoefer)以及硝基纖維素膜(nitrocellulose membrane)來進行。 (3) 在西方墨點分析中，針對各個蛋白質所使用的一次抗體(primary antibody)以及二次抗體(secondary antibody)分別被顯示於下面表4中。 表4. 用於進行西方墨點分析的一次抗體與二次抗體 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 蛋白質 </td><td> 一次抗體 </td><td> 二次抗體 </td></tr><tr><td> COX-2 </td><td> 兔子抗COX-2多株抗體(rabbit anti COX-2 polyclonal antibody)(Abcam, Cat. No. ab15191) </td><td> 山羊抗兔子IgG-辣根過氧化氫酶(HRP)抗體[goat anti rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) antibody](Jackson Immunoresearch Laboratories Inc, Cat. No. 111-035-003) </td></tr><tr><td> GAPDH </td><td> 兔子抗GAPDH多株抗體(rabbit anti GAPDH polyclonal antibody)(BioLegend, Cat. No. 631402) </td></tr></TBODY></TABLE>(4) 化學發光染色(chemiluminescence staining)是使用增強化學發光偵測系統(enhanced chemiluminescence system)(GE Healthcare Bio-Sciences AB)來進行，並使用Hyperfilm底片(GE Healthcare Bio-Sciences AB)以及密度計(densitometer)(Molecular Imager® Gel Doc ^TMXR+ System #1708195, Bio-rad)來偵測訊號。

之後，使用Image Lab ^TM軟體來進行分析，藉此蛋白質帶(protein band)能夠被半-定量地計算出所對應的蛋白質表現量，蛋白質表現量接而以其所對應的GAPDH表現量來予以標準化(normalized)，然後將正常對照組之經標準化的COX-2表現量當作100%，藉此而計算出其他各組相對於正常對照組的COX-2表現量百分比(%正常對照組)。之後，依照上面“一般實驗方法”的第2項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 B、 PGE2 的表現量分析：

首先，將依據上面“一般實驗材料”的第2項「人類角質細胞細胞株HaCaT的來源與培養」來進行繼代培養的HaCaT細胞分成11組，其中包括1個正常對照組、1個病理對照組、3個澤蘭素D組(亦即澤蘭素D組1至3)、3個澤蘭素P組(亦即澤蘭素P組1至3)以及3個澤蘭素遞送系統組(亦即澤蘭素遞送系統組1至3)。將各組細胞分別以一為2×10 ⁵細胞/井的數量培養於含有1 mL的DMEM/F-12培養基(添加有10%胎牛血清)的12-井培養盤中，並在培養箱(37℃、5% CO ₂)中進行培養歷時24小時。

接著，將各組的細胞培養物分別更換以新鮮的培養基，繼而將適量之配於DMSO中的澤蘭素分別添加至澤蘭素D組1至3的細胞培養物中，而使得澤蘭素D組1至3分別具有一最終濃度為0.1、1以及10 μM的澤蘭素，將適量之配於PBS中的澤蘭素分別添加至澤蘭素P組1至3的細胞培養物中，而使得澤蘭素P組1至3分別具有一最終濃度為0.1、1以及10 μM的澤蘭素，以及將本發明的澤蘭素遞送系統分別添加至澤蘭素遞送系統組1至3的細胞培養物中，而使得澤蘭素遞送系統組1至3分別具有一最終濃度為0.1、1以及10 μM的澤蘭素。另外，正常對照組以及病理對照組的細胞培養物則不作任何處理。各組細胞培養物在培養箱(37℃，5% CO ₂)中進行培養歷時1小時後，將適量之PM懸浮液添加至病理對照組、澤蘭素D組1至3、澤蘭素P組1至3以及澤蘭素遞送系統組1至3的細胞培養物中，而使得各組具有一最終濃度為50 μg/cm ²的PM。另外，正常對照組的細胞培養物被添加以等體積的DMSO。接著，將各組細胞培養物置於培養箱(37℃，5% CO ₂)中進行培養歷時24小時後。

之後，收取各組的細胞培養物，於4℃下以2000 rpm進行離心歷時2分鐘後，收集上澄液，繼而使用前列腺素E2 EIA套組-單株(Prostaglandin E2 EIA Kit-Monoclonal)(Cayman Chemical Company)並依照廠商所提供的操作指引來測定PGE2的含量。之後，依照上面“一般實驗方法”的第2項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果： A、 COX-2 的表現量分析：

圖4顯示各組細胞培養物所測得的COX-2的表現量。從圖4可見，與正常對照組的細胞(將正常對照組的細胞的COX-2的表現量當作100%)相較之下，病理對照組的細胞會大量地表現COX-2，這表示PM成功地誘發HaCaT細胞產生發炎反應。而與病理對照組的細胞相較之下，澤蘭素P組1至3的細胞的COX-2表現量沒有明顯的變化。至於澤蘭素遞送系統組1至3以及澤蘭素D組1至3的COX-2表現量皆呈現顯著下降的情形。特別地，澤蘭素遞送系統組1至3的COX-2表現量是近似於澤蘭素D組1至3所具者。 B、 PGE2 的表現量分析：

圖5顯示各組細胞培養物所測得的PGE2的表現量。從圖5可見，與正常對照組的細胞相較之下，病理對照組的細胞會大量地表現PGE2，這表示PM成功地誘發HaCaT細胞產生發炎反應。而與病理對照組的細胞相較之下，澤蘭素P組1至3的細胞的PGE2表現量沒有明顯的變化。至於澤蘭素遞送系統組1至3以及澤蘭素D組1至3的PGE2表現量皆呈現顯著下降的情形。特別地，澤蘭素遞送系統組1至3的COX-2表現量是明顯地低於澤蘭素D組1至3所具者，甚至近似於正常對照組所具者。

綜合以上的實驗結果可知：本發明的澤蘭素遞送系統的預處理能夠有效地保護皮膚細胞對抗PM-誘發的發炎。 實施例 7. 本發明的澤蘭素遞送系統的配方比例對於溶解度以及抗發炎效用上的影響 實驗方法： A、 製備具有不同配方比例的澤蘭素遞送系統：

為了探討本發明的澤蘭素遞送系統的配方比例對於溶解度以及抗發炎效用上的影響，申請人參照上面實施例1當中所述的製備方法並依據下面表5所示的配方來製備3種澤蘭素遞送系統，亦即澤蘭素遞送系統1至3。接著，將所得到的澤蘭素遞送系統1至3拿來進行下面第B與C項的實驗。 表5. 澤蘭素遞送系統1至3的配方 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 澤蘭素遞送系統 </td><td> 配方中所含有的各個組分的重量(mg) </td></tr><tr><td> 澤蘭素 </td><td> 甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物 </td><td> PVA </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 10 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 10 </td><td> 50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr></TBODY></TABLE>B、 水溶解度之測定：

本實驗大體上是參照上面實施例3當中所述的方法來進行，不同之處在於：純水被替換為pH 5.5的PBS，以模擬皮膚的微酸條件(slightly acidic condition)。 C、 COX-2 與 PGE2 的表現量分析：

首先，將依據上面“一般實驗材料”的第2項「人類角質細胞細胞株HaCaT的來源與培養」來進行繼代培養的HaCaT細胞分成5組，其中包括1個正常對照組、1個病理對照組、以及3個澤蘭素遞送系統組(亦即澤蘭素遞送系統組1至3)。將各組細胞分別以一為2×10 ⁵細胞/井的數量培養於含有1000 μL的DMEM/F-12培養基(添加有10%胎牛血清)的12-井培養盤中，並在培養箱(37℃、5% CO ₂)中進行培養歷時24小時。

接著，將各組的細胞培養物分別更換以新鮮的培養基，繼而將適量之澤蘭素遞送系統1至3分別添加至澤蘭素遞送系統組1至3的細胞培養物中，而使得各組分別具有一最終濃度為10 μM的澤蘭素。另外，正常對照組以及病理對照組的細胞培養物則不作任何處理。各組細胞培養物在培養箱(37℃，5% CO ₂)中進行培養歷時1小時後，將適量之PM懸浮液添加至病理對照組以及澤蘭素遞送系統組1至3的細胞培養物中，而使得各組具有一最終濃度為50 μg/cm ²的PM。另外，正常對照組的細胞培養物被添加以等體積的PBS。至於病理對照組的細胞培養物則不作任何處理。接著，將各組細胞培養物置於培養箱(37℃，5% CO ₂)中進行培養歷時24小時後。之後，依據上面實施例6的第A項與第B項當中所述的方法來分別進行COX-2與PGE2的表現量分析。 結果： A、 水溶解度之測定：

下面表6顯示澤蘭素遞送系統1至3所測得的水溶解度。從表6可見，澤蘭素遞送系統1與2的水溶解度是顯著地高於澤蘭素遞送系統3所具者。這個實驗結果顯示：澤蘭素、甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物以及PVA的相對比例為1：5：5 (w/w/w)至1：10：10 (w/w/w)時所製得的澤蘭素遞送系統具有較佳的水溶解度。 表6. 澤蘭素遞送系統1至3的水溶解度 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 澤蘭素遞送系統 </td><td> 水溶解度(μg/mL) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 468.32 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 503.69 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 48.9 </td></tr></TBODY></TABLE>B、 COX-2 與 PGE2 的表現量分析：

圖6顯示各組細胞培養物所測得的COX-2的表現量。從圖6可見，與正常對照組的細胞(將正常對照組的細胞的COX-2的表現量當作100%)相較之下，病理對照組的細胞會大量地表現COX-2，這表示PM成功地誘發HaCaT細胞產生發炎反應。而與病理對照組的細胞相較之下，澤蘭素遞送系統組3的細胞的COX-2表現量沒有明顯的變化。至於澤蘭素遞送系統組1與2的COX-2表現量皆有呈現顯著下降的情形。特別地，澤蘭素遞送系統組2的COX-2表現量是近似於正常對照組所具者。

圖7顯示各組細胞培養物所測得的PGE2的表現量。從圖7可見，與正常對照組的細胞相較之下，病理對照組的細胞會大量地表現PGE2，這表示PM成功地誘發HaCaT細胞產生發炎反應。而與病理對照組的細胞相較之下，澤蘭素遞送系統組3的細胞PGE2表現量沒有明顯的變化。至於澤蘭素遞送系統組1與2的PGE2表現量皆有呈現顯著下降的情形。特別地，澤蘭素遞送系統組2的PGE2表現量是近似於正常對照組所具者。

這個實驗結果顯示：澤蘭素、甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物以及PVA的相對比例為1：5：5 (w/w/w)至1：10：10 (w/w/w)時所製得的澤蘭素遞送系統能夠展現優異的抗發炎效用。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中： 圖1顯示藉由活體外皮膚穿透分析歷時1與2小時所測得之在豬皮的角質層中的澤蘭素含量，其中“*”表示：當與對照組作比較， p＜0.05； 圖2顯示藉由活體外皮膚穿透分析歷時1與2小時所測得之在豬皮的表皮與真皮層中的澤蘭素含量，其中“*”表示：當與對照組作比較， p＜0.05； 圖3顯示各組細胞培養物所測得的ROS的相對產量，其中“*”表示：當與正常對照組作比較， p＜0.05；以及“#”表示：當與病理對照組作比較， p＜0.05； 圖4顯示各組細胞培養物所測得的COX-2的表現量，其中“*”表示：當與正常對照組作比較， p＜0.05；以及“#”表示：當與病理對照組作比較， p＜0.05； 圖5顯示各組細胞培養物所測得的PGE2的表現量，其中“*”表示：當與正常對照組作比較， p＜0.05；以及“#”表示：當與病理對照組作比較， p＜0.05； 圖6顯示各組細胞培養物所測得的COX-2的表現量，其中“*”表示：當與正常對照組作比較， p＜0.05；以及“#”表示：當與病理對照組作比較， p＜0.05；以及 圖7顯示各組細胞培養物所測得的PGE2的表現量，其中“*”表示：當與正常對照組作比較， p＜0.05；以及“#”表示：當與病理對照組作比較， p＜0.05；。

Claims (10)

1. 一種澤蘭素遞送系統，其包含有澤蘭素以及一遞送載體，該遞送載體含有甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物以及聚乙烯醇，其中，澤蘭素、甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物以及聚乙烯醇是呈一為1：5：5(w/w/w)的比例。
2. 如請求項1的澤蘭素遞送系統，它是藉由一包含下列步驟之方法而被製得：將澤蘭素以及甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物添加至乙醇中，俾以得到一有機相溶液；將聚乙烯醇添加至水中，俾以得到一水相溶液；混合該有機相溶液以及該水相溶液，俾以得到一混合物；對該混合物進行一均質處理，俾以生成一含有該澤蘭素遞送系統的反應產物；以及自該反應產物中分離出該澤蘭素遞送系統。
3. 一種組成物，其包含有一如請求項1或2的澤蘭素遞送系統。
4. 如請求項3的組成物，它是呈一供局部施用的形式。
5. 如請求項3的組成物，其進一步包含有一藥學上可接受的載劑。
6. 如請求項3的組成物，其進一步包含有一化妝品上可接受的佐劑。
7. 一種如請求項1或2的澤蘭素遞送系統供應用於製備一用來預防微粒物質-誘發的皮膚損害之醫藥品的用途。
8. 如請求項7的用途，其中該皮膚損害是氧化性損害。
9. 如請求項7的用途，其中該皮膚損害是發炎性損害。
10. 如請求項7的用途，其中該醫藥品是呈一供局部施用的形式。