KR20150015209A

KR20150015209A - 저분자 아세틸화 히알루론산의 제조방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20150015209A
Application number: KR1020130090970A
Authority: KR
Inventors: 모상현; 김영준; 조석형
Original assignee: 주식회사 피코테라
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2013-07-31
Publication date: 2015-02-10

Abstract

본 발명은 저분자 아세틸화 히알루론산의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 저분자 아세틸화 히알루론산은 고분자인 히알루론산에 저분자화단계 및 아세틸화 단계의 2가지 과정을 모두 수행하여 제조된 것으로서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 저분자 아세틸화 히알루론산은 히알루론산 또는 저분자 히알루론산에 비해 콜라겐합성 효과 및 항염 효과가 우수한 효과가 있다. 또한 본 발명에 따르면 히알루론산에 변성이 일어나지 않으며, 대량생산이 용이하다는 장점이 있다.

Description

저분자 아세틸화 히알루론산의 제조방법 및 이의 용도{A manufacturing method of low molecular weight and acetylation hyaluronic acid and use thereof}

본 발명은 저분자 아세틸화 히알루론산의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

히알루론산(Hyaluronic acid)은 분자량이 500,000 내지 13,000,000Da에 이르는 무색의 고점도 다당류로서, 반복단위인 글루쿠론산과 N-아세틸 글루코오스아민이 (1-3)과 (1-4)로 번갈아 결합되어 있다. 히알루론산은 보습 효과를 가지며, 그 보습력은 히알루론산의 농도가 높을수록 증가하게 된다. 또한, 히알루론산은 물리적 마찰에 대한 윤활효과가 우수하여 화장품 첨가제로 많이 사용된다.

또한 식품과 화장품 용도로 사용되는 일반적인 분자량 범위의 히알루론산은 높은 분자량으로 인해 체내 흡수 및 피부 내로의 흡수가 용이하지 않아 그 효과를 충분히 나타내지 못하는 단점이 있다. 따라서 히알루론산을 저분자화하려는 연구가 계속되고 있다.

하지만, 종래 개발된 히알루론산의 저분화 기술은 재 결정화 공정이 필요하고, 재결정화 시 입자의 뭉침으로 인한 결정화의 어려움이 있을 뿐만 아니라 효율이 낮고 갈색을 띠는 색상의 변화 등 다수의 문제점이 발생하고 있어 보다 효과적인 새로운 방법의 개발이 필요한 실정이다.

일본등록특허 제2587268호

이에 본 발명자들은 주름개선, 미백개선, 탄력개선 등의 효과가 있어 화장품의 용도로 많이 사용되고 있는 고분자의 히알루론산이 높은 분자량으로 인해 체내 흡수 및 피부 내로 흡수가 용이하지 않아 그 효과를 충분히 나타내지 못하지 못함에 착안하여 히알루론산의 가공에 대한 다양한 연구를 진행하던 중, 고분자의 히알루론산을 저분자화하는 단계 및 아세틸화 단계를 모두 거쳤을 때 히알루론산이 효과를 충분히 발휘할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 1 ~ 9KDa의 분자량을 갖는 저분자 아세틸화 히알루론산을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 저분자 아세틸화 히알루로산 제조방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 1 ~ 9KDa의 분자량을 갖는 저분자 아세틸화 히알루론산을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 다른 목적은 1 ~ 9KDa의 분자량을 갖는 저분자 아세틸화 히알루론산을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1 ~ 9KDa의 분자량을 갖는 저분자 아세틸화 히알루론산을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 저분자 아세틸화는 1 ~ 5KDa의 분자량을 가질 수 있다.

본 발명은,

(a) 고분자량인 히알루론산을 알코올 및 아세톤의 혼합용액에 분산시키는 단계;

(b) 상기 히알루론산의 총 중량에 대하여 산을 0.1 내지 25 중량%로 첨가하고 반응시켜 저분자 히알루론산을 제조하는 단계;

(c) 저분자 히알루론산을 디메틸포름아마이드 용매에서 분산시키는 단계;

(d) 아세트산무수물(acetic anhydride)을 첨가하여 반응시키는 단계; 및

(e) 여과 후, 아세트산무수물 및 아세톤으로 세척하는 단계를 포함하는, 저분자 아세틸화 히알루론산의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은,

(a) 고분자량인 히알루론산을 디메틸포름아마이드 용매에서 분산시키는 단계;

(b) 아세트산무수물(acetic anhydride)을 첨가하여 반응시키는 단계;

(c) 반응이 완료된 히알루론산을 알코올 및 아세톤의 혼합용액에 분산시키는 단계;

(d) 상기 히알루론산의 총 중량에 대하여 산을 0.1 내지 25 중량%로 첨가하고 반응시키는 단계; 및

(e) 반응물을 알코올로 세척하여 산을 제거하고 여과시키는 단계를 포함하는, 저분자 아세틸화 히알루론산의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 아세트산무수물(acetic anhydride)을 히알루론산의 반복단위 몰수에 대하여 0.5~2배 몰비로 첨가하고 60℃에서 2시간 반응시킬 수 있다.

본 발명은 1 ~ 9KDa의 분자량을 갖는 저분자 아세틸화 히알루론산을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 마사지 크림 또는 팩의 제형으로 제조될 수 있다.

나아가 본 발명은 1 ~ 9KDa의 분자량을 갖는 저분자 아세틸화 히알루론산을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 저분자 아세틸화 히알루론산은 고분자인 히알루론산에 저분자화단계 및 아세틸화 단계의 2가지 공정을 모두 수행하여 제조된 것으로서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 저분자 아세틸화 히알루론산은 히알루론산 또는 저분자 히알루론산에 비해 콜라겐합성 효과 및 항염 효과가 우수한 효과가 있다. 또한 본 발명에 따르면 히알루론산에 변성이 일어나지 않으며, 대량생산이 용이하다는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 저분자 아세틸화 히알루론산의 세포안정성을 알아보기 위하여 MTT분석을 한 결과이다.
도 2는 본 발명의 저분자 아세틸화 히알루론산에 주름 개선 효과가 있는지를 알아보기 위하여 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드의 양을 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 저분자 아세틸화 히알루론산에 항염 효과가 있는지를 알아보기 위하여 산화질소(NO)의 양을 측정한 결과이다.

본 발명은 저분자 아세틸화 히알루론산의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로서, 히알루론산을 저분자화 단계 및 아세틸화 단계의 2가지 공정을 모두 수행하여 제조할 경우, 보습효과, 콜라겐 합성 효과 및 항염 효과가 우수하다는 사실을 규명하였다는 점에 그 특징이 있다.

히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 고점도성, 보습성, 생체 적합성 등의 특징을 지닌 수용성 다당류의 생체 고분자 물질로서 콜라겐 및 엘라스틴과 함께 피부 3대 요소 중의 하나이다. 체내에 존재하는 HA는 고분자량의 다당류로 관절액의 주성분이고 조직의 세포외 기질에 널리 분포하며 세포의 분화와 증식에 중요한 역할을한다. 세포의 활발한 이동과 증식이 보이는 재생 및 재형성(remodeling) 과정에 조직에 풍부하게 존재하는 것은 HA가 초기 조직 치유반응에 관여하는 것을 시사한다. HA의 치료기전에 대해서는 여러 가지 설명이 있고 몇몇 저자들은 실험실 조건에서 HA가 간엽세포(mesen-chymal cell)의 분화를 촉진함으로써 골 모세포 증식을 증가시키는 것으로 보고하기도 했다. HA는 세포간격유지, 세포의 분열과 분화, 이동, 면역 조절 등에 관여하는 것으로 보고된 바 있다. 인체 피부에서의 HA의 양은 노화와 함께 감소되는 것으로 보고되었는데, 피부 탄력 저하 및 수분 함유랑 감소의 집적적인 원인 중 하나로 여겨지고 있다.

HA은 -D-gucuronic acid와 -D-N-acetylglucosamine이 상호베타 결합으로 이뤄진 직쇄상의 긴 고분자 물질로서, 그 원료, 제조법, 정제방법에 따라 0.1×10⁶~ 10×10⁶Da로 매우 다양하다. 수용액상에서 점성, 탄성 및 보습성을 갖으며 이러한 성질은 분자량과 농도에 밀접한 관계가 있다. HA의 분자량 저분자화 방법은 산 염기촉매에 의한 방법, 고온가열, 초음파를 이용한 방법, 효소를 이용한 방법 등이 있으나 가장 작은 분자량 범위가 5,000이상으로 피부투과율이 15%정도에 지나지 않는다. 또한 가수분해 과정에서 갈변이나 부산물이 생성되는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 히알루론산의 흡수를 높이고 활성을 높이기 위하여 다양한 연구를 진행하던 중 히알루론산을 저분자화 단계 및 아세틸화 단계의 2가지 과정을 모두 수행하여 제조할 경우, 보습효과, 콜라겐 합성 효과 및 항염 효과가 우수하다는 사실을 최초로 규명하였다.

따라서 본 발명은 1 ~ 9KDa의 분자량을 갖는 저분자 아세틸화 히알루론산을 제공한다.

본 발명의 저분자 아세틸화 히알루론산은 1 ~ 9KDa의 분자량을 가질 수 있고, 바람직하게는 1 ~ 5KDa의 분자량을 가질 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 ~ 2KDa의 분자량을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) 고분자량인 히알루론산을 알코올 및 아세톤의 혼합용액에 분산시키는 단계; (b) 상기 히알루론산의 총 중량에 대하여 산을 0.1 내지 25 중량%로 첨가하고 반응시켜 저분자 히알루론산을 제조하는 단계; (c) 저분자 히알루론산을 디메틸포름아마이드 용매에서 분산시키는 단계; (d) 아세트산무수물(acetic anhydride)을 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (e) 여과 후, 아세트산무수물 및 아세톤으로 세척하는 단계를 포함하는, 저분자 아세틸화 히알루론산의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 고분자량인 히알루론산을 디메틸포름아마이드 용매에서 분산시키는 단계; (b) 아세트산무수물(acetic anhydride)을 첨가하여 반응시키는 단계; (c) 반응이 완료된 히알루론산을 알코올 및 아세톤의 혼합용액에 분산시키는 단계;(d) 상기 히알루론산의 총 중량에 대하여 산을 0.1 내지 25 중량%로 첨가하고 반응시키는 단계; 및 (e) 반응물을 알코올로 세척하여 산을 제거하고 여과시키는 단계를 포함하는, 저분자 아세틸화 히알루론산의 제조방법을 제공한다.

상기 히알루론산을 저분자화하는 단계 및 히알루론산을 아세틸화하는 단계는 어떤 것을 먼저 수행해도 상관이 없다.

본 발명자들은 본 발명의 방법으로 제조된 저분자 아세틸화 히알루론산에 주름 개선 효과가 있는지를 확인하기 위하여 인간각질형성세포주에 저분자 아세틸화 히알루론산을 처리하여 배양한 뒤 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드의 양을 측정함으로서 콜라겐 생성 증가효과를 조사한 결과, 대조군인 히알루론산 또는 히알루론산을 저분자화 시킨 시료보다 우수한 콜라겐 합성 촉진 효과를 보임을 알 수 있었다(도 2 참조).

그러므로 본 발명은 저분자 아세틸화 히알루론산을 유효성분으로 포함하는 주름개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상술한 저분자 아세틸화 히알루론산 뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 화장료 조성물을 인간의 피부에 도포하는 것을 특징으로 하는 화장방법을 제공한다.

본 발명의 화장 방법은 본 발명의 화장료 조성물을 인간의 피부에 도포하는 모든 화장 방법을 일컫는다. 즉, 화장료 조성물을 피부에 도포하는 당업계에 공지된 모든 방법이 본 발명의 화장 방법에 속한다.

본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복 도포하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 피부 주름 개선 효과가 우수한 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클린징 제형은 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명자들은 본 발명의 방법으로 제조된 저분자 아세틸화 히알루론산에 항염 효과가 있는지를 확인하기 위하여 Raw264.7 세포주에 저분자 아세틸화 히알루론산을 처리하여 배양한 뒤 산화질소(NO) 생성을 측정한 결과, 대조군인 히알루론산 또는 히알루론산을 저분자화 시킨 시료보다 산화질소(NO) 생성이 감소되어 우수한 항염 효과를 보임을 알 수 있었다(도 3 참조).

그러므로 본 발명의 저분자아세틸화 히알루론산은 우수한 항염 활성을 나타내므로 염증과 관련된 증상들을 예방, 개선 및 치료하는데 사용할 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 염증의 증상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 염증 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 저분자아세틸화 히알루론산을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 염증의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 저분자아세틸화 히알루론산의 약학적으로 유효한 양은 0.01 ~ 100mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.1 ~ 10 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 ‘약학적으로 허용되는’이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 염증 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 염증 예방 또는 치료용 조성물은 염증의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

세포배양

인간 피부세포주(각질형성세포주 HaCaT)는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% fetal bovine serum(FBS), antibiotic-antimycotic (GIBCO, Cat No. 15240-062)과 함께 75 Cm² 플라스크에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였으며, 이 세포가 플라스크 내에서 80% 이상이 되도록 배양한 후, 계대 배양하였다.

< 실시예 2>

저분자 아세틸화 히알루론산 제조

고분자의 히알루론산을 저분자화 시키고, 이후 아세틸화 시켜 저분자 아세틸화 히알루론산을 제조하였다. 즉, 하기 표 1에 기재된 7개의 시료를 제조하였는데 시료1은 고분자히알루론산을 아세틸화 시켰고, 시료 2는 고분자 히알루론산(평균분자량: 1,500,000 Da)을 에탄올에 분산시키고 염산의 양을 총중량에 대하여 2 중량%로 첨가하여 60℃에서 2시간 반응시켜 고분자 히알루론산을 분해하여 필터하고 세척한 후 건조하여 저분자 히알루론산을 제조하였다. 시료 3과 4는 상기의 방법과 동일하나 염산의 양을 총중량에 대하여 각각 5 중량%, 8중량%로 첨가하여 저분자히알루론산을 각각 제조하였다. 또한, 저분자 히알루론산을 DMF에 분산시킨 후 히알루론산 단위 몰당 아세트산무수몰을 0.5 당량 내지 동당량으로 60℃에서 2시간 반응시켜 필터하고 세척하여 아세틸화된 저분자 히알루론산인 시료 5 내지 7을 제조하였다.

최종 제조된 저분자 아세틸화 히알루론산은 하기 표 1에 기재된 바와 같은 분자량을 갖는 것을 확인하였다. 제조된 저분자 히알루론산의 평균분자량은 GPC로 분석하였다.

참고로, 하기 표에서 AcHA는 아세틸화 히알루론산을 나타낸 것이고, LMHA는 저분저화 히알루론산을 나타낸 것이며, AcLMHA 아세틸화 저분자 히알루론산을 나타낸 것이다.

본 발명의 실험에 사용한 시료

시료명	Mw	Mn	Mz
시료1(AcHA)	1,500,000
시료2(LMHA-11-1)	4,811	2,342	9,035
시료3(LMHA-14)	996	987	1005
시료4(LMHA-16)	4,595	644	4,954
시료5(AcLMHA-11-1)	4,854	2,385	9,078
시료6(AcLMHA-14)	1,039	1,030	1,048
시료7(AcLMHA-16)	4,638	687	4,997

< 실시예 3>

세포안정성 측정

다양한 기능성화장품 원료 물질의 탐색에서 첫 단계는 피부를 구성하는 세포종들(keratinocyte, melanocyte 그리고 fibroblast)에서 세포독성을 나타내지 않는 농도범위를 선택하는 것이다. 따라서 본 발명자들은 인간각질형성세포주에 대하여 상기 표 1의 시료 7종에서 세포독성이 있는지 여부를 알아보기 위하여 세포안정성을 측정하였다.

이를 위해 시험물질을 녹이거나 희석시킬 때는 FBS가 함유되지 않은 DMEM배지를 사용하였다. 구체적인 시험 방법으로는 세포를 24 웰에 1×10⁴ cell/well로 분주 한 후 세포배양 조건에서 세포가 50 ~ 60%에 도달할 때까지 배양하였고, 배지를 버리고 10% PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 다음 10% FBS가 포함하지 않는 새로운 배지를 넣고 일정농도의 시험물질을 처리하여 48시간 추가 배양하였다. MTT 용액(6.6mg/ml, 3-(4,5-dimethyl thiazol-2yl)-2,5 diphenyl-2H-tetrazolium bromide액)을 각 웰에 50ul씩 넣고 3시간 추가 배양하였으며, 배양액을 제거한 다음 dimethylsulfoxide(DMSO, Amresco, 0231-500ML)를 200ul씩 넣고 10분간 흔들어 준 다음 100 씩 96웰에 취하여 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 리더로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

세포안정성(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도)x100

인간각질형성세포주인 HaCaT에서의 히알루론산(AcHA), 히알루론산을 저분자화 시킨 LMHA-11-1, LMHA-14 및 LMHA-16 시료, 히알루론산을 저분자화와 아세틸화를 동시에 한 본 발명의 AcLMHA-11-1, AcLMHA-14 및 AcLMHA-16 시료의 세포 안전성을 MTT 분석한 결과, 상기 7개 시료의 0.5 %, 1.0 % 농도에서 대조군과 비교하여 독성을 보이지 않음을 알 수 있었다(도 1 참조).

< 실시예 4>

주름 개선 효과 측정

본 발명의 저분자 아세틸화 히알루론산(AcLMHA-11-1 시료, AcLMHA-14 시료 및 AcLMHA-16 시료)이 주름 개선 효과가 있는지를 알아보기 위해, 인간각질형성세포주를 이용하여 측정하였다. 인간각질형성세포주를 48 웰에 2×10⁴cells/well로 분주 한 후 세포배양 조건에서 세포가 80%이상 도달 될 때 까지 배양하였으며, 히알루론산(AcHA), 히알루론산을 저분자화 시킨 LMHA-11-1, LMHA-14 및 LMHA-16 시료, 히알루론산을 저분자화와 아세틸화를 동시에 한 본 발명의 AcLMHA-11-1 시료, AcLMHA-14 시료 및 AcLMHA-16 시료가 1.0 % 농도로 함유된 배지로 교체 한 다음 24시간 세포배양 조건에서 추가 배양하였다. 이 후 배양배지를 1ml씩 취하여 4℃, 2,000rpm으로 원심분리 하여 상등액만 취하여 실험에 사용하였으며, 콜라겐 단백질 측정 키트 (Takara Shuzo Co., Ltd, Japan)를 사용하여 채취한 배양액에 존재하는 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드의 양을 측정함으로서 콜라겐 생성 증가효과를 조사하였다.

시험 순서로는 Antibody-POD conjugate solution 100 μl를 각 웰에 넣은 다음 히알루론산(AcHA), 히알루론산을 저분자화 시킨 LMHA-11-1, LMHA-14 및 LMHA-16 시료, 히알루론산을 저분자화와 아세틸화를 동시에 한 본 발명의 AcLMHA-11-1 시료, AcLMHA-14 시료, AcLMHA-16 시료 및 표준액 20 μl를 넣고 37℃에서 3시간 배양하였다. 웰에서 배양액을 제거한 다음, Ice-cold PBS(phosphated buffer saline) 400 μl로 4회 워싱(washing)하였다. 발색시약인 기질(substrate)을 100 μl 로딩(loading)하고, 실온에서 15분간 반응시킨 후, 반응의 스탑솔루션인 1N H₂SO₄ 100 μl 로딩(loading) 후, 450nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 측정하였다.

그 결과, 히알루론산을 저분자화와 아세틸화를 동시에 한 본 발명의 AcLMHA-11-1 시료, AcLMHA-14 시료 및 AcLMHA-16 시료에서는 대조군인 히알루론산 또는 히알루론산을 저분자화 시킨 LMHA-11-1, LMHA-14 및 LMHA-16 시료보다 우수한 콜라겐 합성 촉진 효과를 보임을 알 수 있었다(도 2 참조).

< 실시예 5>

항염 활성 측정

본 발명자들은 본 발명의 저분자 아세틸화 히알루론산(AcLMHA-11-1 시료, AcLMHA-14 시료 및 AcLMHA-16 시료)에 항염 활성 효과가 있는지를 알아보기 위해, Raw264.7 세포를 DMEM배지에 1×10⁵ 세포를 현탁시켜 24 웰 플레이트에 접종하였다. 80 % 이상 세포가 찼을 때(confluence), 펩타이드 물질을 농도별로 처리한 후, 1시간 후 인위적인 염증 유발인자인 1 ㎍/ml LPS (Lipopolysccharide)를 처리하여 24시간 동안 더 배양하였다.

Raw264.7 세포주로부터 생성된 산화질소(NO)의 양은 세포 배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-형태로서 그 후, 배지인 상층액을 회수하여 96 웰 플레이트에 100 ㎕ 씩 넣고 그리스시약(Griess reagent, Sigma)을 동량 첨가하여 상온에서 10 분간 가볍게 흔들어 주어 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

NO 활성 저해능(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도)x100

그 결과, 히알루론산을 저분자화와 아세틸화를 동시에 한 본 발명의 AcLMHA-11-1 시료, AcLMHA-14 시료 및 AcLMHA-16 시료에서는 대조군인 히알루론산 또는 히알루론산을 저분자화 시킨 LMHA-11-1, LMHA-14 및 LMHA-16 시료보다 산화질소(NO)의 생성이 감소되어 우수한 항염 효과를 보임을 알 수 있었다(도 3 참조).

또한, 본 발명자들은 산화질소(NO)의 감소가 실제로 본 발명의 시료의 처리로 인한 것인지 알아보기 위하여 MTT 분석을 하여 세포생존율(cell Viability)도 측정한 결과, 7종의 시료 모두에서 90 % 이상의 생존율을 보였다.

따라서 상기의 결과를 통해 본 발명의 저분자 아세틸화 히알루론산은 고분자인 보통의 히알루론산에 비해 높은 주름 개선 효과 및 항염 효과가 있다는 것을 알 수 있었고, 아세틸화와 저분자화를 함께 처리하여 수득한 히알루론산이 저분자화만 시킨 히알루론산에 비해 주름개선 및 항염 효과가 더 우수하다는 것을 알 수 있었으며, 특히 시료 6(1,039Da)에서 가장 우수한 효과를 갖는다는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

1 ~ 9KDa의 분자량을 갖는 저분자 아세틸화 히알루론산.

제1항에 있어서,
상기 저분자 아세틸화는 1 ~ 5KDa의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 저분자 아세틸화 히알루론산.

(a) 고분자량인 히알루론산을 알코올 및 아세톤의 혼합용액에 분산시키는 단계;
(b) 상기 히알루론산의 총 중량에 대하여 산을 0.1 내지 25 중량%로 첨가하고 반응시켜 저분자 히알루론산을 제조하는 단계;
(c) 저분자 히알루론산을 디메틸포름아마이드 용매에서 분산시키는 단계;
(d) 아세트산무수물(acetic anhydride)을 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(e) 여과 후, 아세트산무수물 및 아세톤으로 세척하는 단계를 포함하는, 저분자 아세틸화 히알루론산의 제조방법.

(a) 고분자량인 히알루론산을 디메틸포름아마이드 용매에서 분산시키는 단계;
(b) 아세트산무수물(acetic anhydride)을 첨가하여 반응시키는 단계;
(c) 반응이 완료된 히알루론산을 알코올 및 아세톤의 혼합용액에 분산시키는 단계;
(d) 상기 히알루론산의 총 중량에 대하여 산을 0.1 내지 25 중량%로 첨가하고 반응시키는 단계; 및
(e) 반응물을 알코올로 세척하여 산을 제거하고 여과시키는 단계를 포함하는, 저분자 아세틸화 히알루론산의 제조방법.

제3항 또는 제4항에 있어서,
아세트산무수물(acetic anhydride)을 히알루론산의 반복단위 몰수에 대하여 0.5~2배 몰비로 첨가하고 60℃에서 2시간 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.

제3항 또는 제4항의 방법으로 제조된 1 ~ 9KDa의 분자량을 갖는 저분자 아세틸화 히알루론산을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물.

제6항에 있어서,
상기 저분자 아세틸화 히알루론산은 콜라겐 합성 증진 효과 및 보습 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물.

제6항에 있어서,
상기 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 마사지 크림 또는 팩의 제형으로 제조됨을 특징으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물.

제3항 또는 제4항의 방법으로 제조된 1 ~ 9KDa의 분자량을 갖는 저분자 아세틸화 히알루론산을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.