CN114031667A - 一种蛋白质稳定剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白质稳定剂及其制备方法，包括下述原料：高分子量透明质酸，中分子量透明质酸，低分子量透明质酸，寡聚透明质酸，乙酰化透明质酸，聚丙烯酸钠，乙二胺四乙酸二钠二水合物，苯甲基磺酰氟，氯化镁，聚乙二醇甲醚，氯化钠或氯化钾，ProClin 950，ProClin 300，牛血清白蛋白，胶原蛋白，二丙二醇或丙三醇，磷酸盐或Tris‑HCl缓冲溶液。本发明的有益效果为：本发明使用大小分子透明质酸和明胶等复配技术，加上高分子，防腐剂等协同作用，可大大延长各种蛋白的保质期和稳定性，也包括蛋白在各种表面或溶液中的，如聚苯乙烯板，乳胶珠，磁性颗粒和硝酸纤维素膜等，这些稳定剂还通过消除样品基质和其他测定成分的非特异性结合降低本底。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白质稳定剂及其制备方法。
背景技术
蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分子物质，易受外界条件的影响发生变性。蛋白质稳定性与组成中的氨基酸种类有关系，例如含有巯基的氨基酸，最常见的是半胱氨酸，会降低蛋白质的稳定性，尤其在某些金属离子，Cu2+、Zn2+等存在时，蛋白质对空气中的氧更为敏感，而易发生不可逆变性。蛋白质活性的保存已经成为生物技术领域的重大难题。目前，蛋白质的长期保存一般用真空冷冻干燥方法保存，该保存方法的优点是，活性保存效果理想，保存时间长，但是存在缺点是操作繁琐，需要特殊的仪器，成本高，需要水做复溶剂等，蛋白质以冻干形式和溶液形式使用和存储。如果在制备，储存和处理的关键阶段未使用适当的稳定条件，则干燥和冷冻过程可能导致蛋白质变性。
在临床检测、生命科学研究中，蛋白质检测试剂不仅要有一定的敏感度和特异性，其重复性和稳定性也是非常重要的。良好的稳定性，是其数据可靠性的一个重要标志。但是，一些酶类及蛋白标记物质，其稳定性是非常差的，在一般条件下极易降解或变性，导致检测试剂的整体失效。如在化学发光免疫分析(CLIA)中，酶结合物经稀释后很容易丧失活性，而酶活性的降低或丧失，都直接影响检测结果的准确性。因此，如何保持蛋白质尤其是酶的活性的稳定是蛋白质检测中的关键技术。又如胃泌素17(Gastrin 17，G-17)是小分子多肽，在离体血液中很不稳定，采血之后就开始快速降解，理论上在2-8℃保存时间只有3h，要开发胃泌素17检测试剂盒，如何保证G-17的稳定是一个难点。
近年来，人们发现了一些有助于提高蛋白质溶液稳定性的物质，目前常见的用来增加蛋白质稳定性的方法：1.选择各种添加剂，例如甘油，山梨醇，海藻糖。2.使用市场上可售的稳定剂成品：比如高甲氧基果胶和丙二醇藻酸盐组成用于稳定酸性水成液如汁液中蛋白质悬浮体的蛋白质稳定剂。但他们都有着很明显的局限性：要么保持蛋白质稳定性的能力不够，要么跟后续的实验体系产生冲突；所以应用性十分有限。可以在一定程度上保持蛋白质的活性，但是效果仍然不理想。
一般认为蛋白质的结构和环境条件决定了蛋白质的稳定性。外部因素，如温度、pH值和盐、金属离子或其他污染物的存在可能使蛋白质变性。当蛋白质被吸附到实验容器的一侧时，也会变性。蛋白质必须在稳定其天然结构的环境中储存和使用。
发明内容
本申请的主要目的在于提供一种成本低廉，能长时间保护蛋白活性的蛋白质稳定剂及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种蛋白质稳定剂，包括下述重量份的原料：高分子量透明质酸0.2-2份，中分子量透明质酸0.1-3份，低分子量透明质酸0.1-3份，寡聚透明质酸0.1-5份，乙酰化透明质酸0.05-2份，聚丙烯酸钠0.1-3份，乙二胺四乙酸二钠二水合物0.01-1份，苯甲基磺酰氟0.005-2份，氯化镁0.05-2份，聚乙二醇甲醚0.01-2份，氯化钠或氯化钾0.05-2份，ProClin950 0.01-0.9份，ProClin 300 0.01-0.9份，牛血清白蛋白0.1-6份，胶原蛋白0.05-7份，二丙二醇或丙三醇0.1-1份，磷酸盐或Tris-HCl缓冲溶液。
上述一种蛋白质稳定剂，作为一种优选的实施方案，包括下述重量份的原料：高分子量透明质酸0.5份，中分子量透明质酸0.1份，低分子量透明质酸0.2份，寡聚透明质酸0.3份，乙酰化透明质酸0.05份，聚丙烯酸钠0.3份，乙二胺四乙酸二钠二水合物0.03份，苯甲基磺酰氟0.5份，氯化镁0.5份，聚乙二醇甲醚0.1份，氯化钾0.09份，ProClin 950 0.05份，ProClin 300 0.06份，牛血清白蛋白0.2份，胶原蛋白6份，二丙二醇或丙三醇0.3份，磷酸盐或Tris-HCl缓冲溶液。
上述一种蛋白质稳定剂，作为一种优选的实施方案，包括下述重量份的原料：高分子量透明质酸0.4份，中分子量透明质酸0.8份，低分子量透明质酸0.3份，寡聚透明质酸0.1份，乙酰化透明质酸0.6份，聚丙烯酸钠0.5份，乙二胺四乙酸二钠二水合物0.5份，苯甲基磺酰氟1份，氯化镁0.2份，聚乙二醇甲醚0.9份，氯化钾0.9份，ProClin 950 0.9份，ProClin300 0.9份，牛血清白蛋白4份，胶原蛋白7份，二丙二醇1份，磷酸盐或Tris-HCl缓冲溶液。
优选地，所述高分子量透明质酸为分子量＞2000Kda的透明质酸；所述中分子量透明质酸为500Kda≤分子量≤2000Kda的透明质酸；所述低分子量透明质酸为10Kda≤分子量＜500Kda的透明质酸；所述寡聚透明质酸为分子量＜10Kda的透明质酸。
其中缓冲液为调节稳定剂的pH值，起到缓冲作用，高中低及寡聚透明质酸和乙酰化透明质酸保护蛋白骨架和构象不受外界影响，起到稳定蛋白作用，高分子聚丙烯酸钠和聚乙二醇甲醚保护蛋白骨架，牛血清白蛋白和胶原蛋白保护蛋白，起到载体作用，二丙二醇或丙三醇为分散剂，乙二胺四乙酸二钠二水合物和苯甲基磺酰氟为蛋白酶抑制剂，ProClin950和ProClin 300为防腐剂。本发明所述蛋白质稳定剂的各原料相互作用，能有效保持蛋白质的稳定性。
本申请的第二方面，提供一种蛋白质稳定剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将上述各组分加入到磷酸盐或Tris-HCl缓冲溶液中，并混合搅拌至完全溶解；
(2)用氢氧化钠或盐酸调节pH值在7.0-8.0之间，加入缓冲液将混合液调至100份；
(3)过滤步骤(2)所得混合液，罐装得所述蛋白质稳定剂。
上述一种蛋白质稳定剂的制备方法，作为一种优选的实施方案，步骤(1)中，混合搅拌的速度为20-3000rpm。
上述一种蛋白质稳定剂的制备方法，作为一种优选的实施方案，所述过滤为采用0.2-0.8微米的滤膜或惰性材质的过滤填充柱进行过滤。
上述一种蛋白质稳定剂的制备方法，作为一种优选的实施方案，所述罐装为在洁净区进行，根据客户需求灌装一定量，密封室温保存。
本发明的有益效果为：本发明使用大小分子透明质酸和明胶等复配技术，加上高分子，防腐剂等协同作用，可在高温或低温下大大延长各种蛋白的保质期和稳定性，包括各类酶，蛋白，抗体，抗原，样本等，也包括蛋白在各种表面或溶液中的，如聚苯乙烯板，乳胶珠，磁性颗粒和硝酸纤维素膜等，这些稳定剂还通过消除样品基质和其他测定成分的非特异性结合来降低本底。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合案例对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
本申请实施例所描述的高分子量透明质酸为分子量＞2000Kda的透明质酸；所述中分子量透明质酸为500Kda≤分子量≤2000Kda的透明质酸；所述低分子量透明质酸为10Kda≤分子量＜500Kda的透明质酸；所述寡聚透明质酸为分子量＜10Kda的透明质酸。
实施例1
实施例1所述蛋白质稳定剂，包括下述重量份的原料：
高分子量透明质酸0.5份，中分子量透明质酸0.1份，低分子量透明质酸0.2份，寡聚透明质酸0.3份，乙酰化透明质酸0.05份，聚丙烯酸钠0.3份，乙二胺四乙酸二钠二水合物0.03份，苯甲基磺酰氟0.5份，氯化镁0.5份，聚乙二醇甲醚0.1份，氯化钾0.09份，ProClin950 0.05份，ProClin 300 0.06份，牛血清白蛋白0.2份，胶原蛋白6份，二丙二醇0.3份，磷酸盐缓冲溶液。
实施例1所述蛋白质稳定剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将上述各组分加入到磷酸盐缓冲溶液中，在搅拌速度为300rpm的条件下混合搅拌至完全溶解；
(2)用氢氧化钠或盐酸调节pH值在7.0-8.0之间，加入缓冲液将混合液调至100份；
(3)采用0.2微米的滤膜过滤步骤(2)所得混合液，在洁净区罐装得所述蛋白质稳定剂。
实施例2
实施例2所述蛋白质稳定剂，包括下述重量份的原料：高分子量透明质酸0.5份，中分子量透明质酸0.1份，低分子量透明质酸0.2份，寡聚透明质酸0.3份，乙酰化透明质酸0.05份，聚丙烯酸钠0.3份，乙二胺四乙酸二钠二水合物0.03份，苯甲基磺酰氟0.5份，氯化镁0.5份，聚乙二醇甲醚0.1份，氯化钾0.09份，ProClin 950 0.05份，ProClin 300 0.06份，牛血清白蛋白0.2份，胶原蛋白6份，丙三醇0.3份，磷酸盐缓冲溶液。
实施例2所述蛋白质稳定剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将上述各组分加入到磷酸盐缓冲溶液中，在搅拌速度为1000rpm的条件下混合搅拌至完全溶解；
(2)调节pH值在7.0-8.0之间，加入缓冲液将混合液调至100份；
(3)采用0.8微米的滤膜过滤步骤(2)所得混合液，在洁净区罐装得所述蛋白质稳定剂。
实施例3
实施例3所述蛋白质稳定剂，包括下述重量份的原料：高分子量透明质酸0.4份，中分子量透明质酸0.8份，低分子量透明质酸0.3份，寡聚透明质酸0.1份，乙酰化透明质酸0.6份，聚丙烯酸钠0.5份，乙二胺四乙酸二钠二水合物0.5份，苯甲基磺酰氟1份，氯化镁0.2份，聚乙二醇甲醚0.9份，氯化钾0.9份，ProClin 950 0.9份，ProClin 300 0.9份，牛血清白蛋白4份，胶原蛋白7份，二丙二醇1份，Tris-HCl缓冲溶液。
实施例3所述蛋白质稳定剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将上述各组分加入到Tris-HCl缓冲溶液中，在搅拌速度为1000rpm的条件下混合搅拌至完全溶解；
(2)调节pH值在7.0-8.0之间，加入缓冲液将混合液调至100份；
(3)采用惰性材质的过滤填充柱过滤步骤(2)所得混合液，在洁净区罐装得所述蛋白质稳定剂。
实施例4
实施例4所述蛋白质稳定剂，包括下述重量份的原料：高分子量透明质酸2份，中分子量透明质酸3份，低分子量透明质酸0.5份，寡聚透明质酸2份，乙酰化透明质酸1份，聚丙烯酸钠1份，乙二胺四乙酸二钠二水合物0.8份，苯甲基磺酰氟0.05份，氯化镁0.05份，聚乙二醇甲醚0.05份，氯化钾1.5份，ProClin 950 0.3份，ProClin 300 0.4份，牛血清白蛋白2份，胶原蛋白3份，丙三醇1份，Tris-HCl缓冲溶液。
实施例4所述蛋白质稳定剂的制备方法与实施例3所述蛋白质稳定剂的制备方法相同。
对比例1
对比例1所述蛋白质稳定剂，包括下述重量份的原料：高分子量透明质酸0.5份，聚丙烯酸钠0.3份，乙二胺四乙酸二钠二水合物0.03份，苯甲基磺酰氟0.5份，氯化钾0.09份，ProClin 950 0.05份，ProClin 300 0.06份，缓冲液余量。
对比例1所述蛋白质稳定剂的制备方法与实施例1所述蛋白质稳定剂的制备方法相同。
对比例2
对比例2所述蛋白质稳定剂，包括下述重量份的原料：中分子量透明质酸0.1份，寡聚透明质酸0.3份，聚丙烯酸钠0.3份，氯化镁0.5份，聚乙二醇甲醚0.1份，氯化钾0.09份，ProClin 950 0.05份，胶原蛋白6份，丙三醇0.3份，缓冲液余量。
对比例2所述蛋白质稳定剂的制备方法与实施例2所述蛋白质稳定剂的制备方法相同。
对比例3
对比例3所述蛋白质稳定剂，包括下述重量份的原料：低分子量透明质酸0.3份，寡聚透明质酸0.1份，乙酰化透明质酸0.6份，聚丙烯酸钠0.5份，乙二胺四乙酸二钠二水合物0.5份，苯甲基磺酰氟1份，聚乙二醇甲醚0.9份，氯化钾0.9份，ProClin 950 0.9份，二丙二醇1份，缓冲液余量。
对比例3所述蛋白质稳定剂的制备方法与实施例3所述蛋白质稳定剂的制备方法相同。
对比例4
对比例4所述蛋白质稳定剂，包括下述重量份的原料：高分子量透明质酸2份，乙二胺四乙酸二钠二水合物0.8份，苯甲基磺酰氟0.05份，氯化镁0.05份，氯化钾1.5份，ProClin950 0.3份，牛血清白蛋白2份，丙三醇1份，缓冲液余量。
对比例4所述蛋白质稳定剂的制备方法与实施例4所述蛋白质稳定剂的制备方法相同。
1、本发明所述蛋白质稳定剂的效果研究：
以代表性的胃泌素17、富亮氨酸α-2糖蛋白-1(LRG1)、CA724抗体和M2-型丙酮酸激酶(PKM2)为保护对象，类别有蛋白、抗体、激酶等，把上述各实施例和对比例所得蛋白质稳定剂，按一定比例分别加入到上述的保护对象中(蛋白稳定剂比例在5-30％间，根据不同项目调配)，考察在2-8℃，37℃和55℃下的保护情况，分别记录0天，及各天数的信号值变化。
表1本发明所述蛋白质稳定剂对胃泌素17的保护效果研究
从表1可以看出：本发明所述蛋白质稳定剂对胃泌素17具有很好的保护作用。其在2-8℃的保护天数可长达1985天，在55℃的保护天数为16天。而对比例1至对比例4所述蛋白质稳定剂采用单一分子量的透明质酸，且缺少了一些关键组分，其在2-8℃的保护天数最长为310天，在55℃的保护天数最长为5天，远远低于本发明所述蛋白质稳定剂对胃泌素17的保护效果。
表2本发明所述蛋白质稳定剂对富亮氨酸α-2糖蛋白-1(LRG1)的保护效果研究
从表2可以看出：本发明所述蛋白质稳定剂对富亮氨酸α-2糖蛋白-1(LRG1)具有很好的保护作用。其在2-8℃的保护天数可长达1552天，在55℃的保护天数为14天。而对比例1至对比例4所述蛋白质稳定剂采用单一分子量的透明质酸，且缺少了一些关键组分，其在2-8℃的保护天数最长为310天，在55℃的保护天数最长为5天，远远低于本发明所述蛋白质稳定剂对富亮氨酸α-2糖蛋白-1(LRG1)的保护效果。
表3本发明所述蛋白质稳定剂对CA724抗体的保护效果研究
| 组别 | 保护蛋白 | 55℃保护天数 | 37℃保护天数 | 2-8℃保护天数 |
| 实施例1 | CA724抗体 | 21 | 31 | 1247 |
| 实施例2 | CA724抗体 | 19 | 28 | 958 |
| 实施例3 | CA724抗体 | 17 | 27 | 963 |
| 实施例4 | CA724抗体 | 17 | 21 | 638 |
| 对比例1 | CA724抗体 | 5 | 8 | 310 |
| 对比例2 | CA724抗体 | 3 | 7 | 271 |
| 对比例3 | CA724抗体 | 4 | 7 | 265 |
| 对比例4 | CA724抗体 | 4 | 7 | 198 |
从表3可以看出：本发明所述蛋白质稳定剂对CA724抗体具有很好的保护作用。其在2-8℃的保护天数可长达1247天，在55℃的保护天数为21天。而对比例1至对比例4所述蛋白质稳定剂采用单一分子量的透明质酸，且缺少了一些关键组分，其在2-8℃的保护天数最长为310天，在55℃的保护天数最长为5天，远远低于本发明所述蛋白质稳定剂对CA724抗体的保护效果。
表4本发明所述蛋白质稳定剂对M2-型丙酮酸激酶(PKM2)的保护效果研究
| 组别 | 保护蛋白 | 55℃保护天数 | 37℃保护天数 | 2-8℃保护天数 |
| 实施例1 | M2-型丙酮酸激酶(PKM2) | 17 | 25 | 1547 |
| 实施例2 | M2-型丙酮酸激酶(PKM2) | 14 | 19 | 967 |
| 实施例3 | M2-型丙酮酸激酶(PKM2) | 13 | 19 | 1102 |
| 实施例4 | M2-型丙酮酸激酶(PKM2) | 15 | 21 | 1010 |
| 对比例1 | M2-型丙酮酸激酶(PKM2) | 3 | 5 | 124 |
| 对比例2 | M2-型丙酮酸激酶(PKM2) | 3 | 6 | 162 |
| 对比例3 | M2-型丙酮酸激酶(PKM2) | 3 | 7 | 184 |
| 对比例4 | M2-型丙酮酸激酶(PKM2) | 5 | 6 | 153 |
从表4可以看出：本发明所述蛋白质稳定剂对M2-型丙酮酸激酶(PKM2)具有很好的保护作用。其在2-8℃的保护天数可长达1547天，在55℃的保护天数为17天。而对比例1至对比例4所述蛋白质稳定剂采用单一分子量的透明质酸，且缺少了一些关键组分，其在2-8℃的保护天数最长为184天，在55℃的保护天数最长为3天，远远低于本发明所述蛋白质稳定剂对CA724抗体的保护效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种蛋白质稳定剂，其特征在于，包括下述重量份的原料：高分子量透明质酸0.2-2份，中分子量透明质酸0.1-3份，低分子量透明质酸0.1-3份，寡聚透明质酸0.1-5份，乙酰化透明质酸0.05-2份，聚丙烯酸钠0.1-3份，乙二胺四乙酸二钠二水合物0.01-1份，苯甲基磺酰氟0.005-2份，氯化镁0.05-2份，聚乙二醇甲醚0.01-2份，氯化钠或氯化钾0.05-2份，ProClin 950 0.01-0.9份，ProClin 300 0.01-0.9份，牛血清白蛋白0.1-6份，胶原蛋白0.05-7份，二丙二醇或丙三醇0.1-1份，磷酸盐或Tris-HCl缓冲溶液。
2.根据权利要求1所述一种蛋白质稳定剂，其特征在于，包括下述重量份的原料：高分子量透明质酸0.5份，中分子量透明质酸0.1份，低分子量透明质酸0.2份，寡聚透明质酸0.3份，乙酰化透明质酸0.05份，聚丙烯酸钠0.3份，乙二胺四乙酸二钠二水合物0.03份，苯甲基磺酰氟0.5份，氯化镁0.5份，聚乙二醇甲醚0.1份，氯化钾0.09份，ProClin 950 0.05份，ProClin 300 0.06份，牛血清白蛋白0.2份，胶原蛋白6份，二丙二醇或丙三醇0.3份，磷酸盐或Tris-HCl缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述一种蛋白质稳定剂，其特征在于，包括下述重量份的原料：高分子量透明质酸0.4份，中分子量透明质酸0.8份，低分子量透明质酸0.3份，寡聚透明质酸0.1份，乙酰化透明质酸0.6份，聚丙烯酸钠0.5份，乙二胺四乙酸二钠二水合物0.5份，苯甲基磺酰氟1份，氯化镁0.2份，聚乙二醇甲醚0.9份，氯化钾0.9份，ProClin 950 0.9份，ProClin300 0.9份，牛血清白蛋白4份，胶原蛋白7份，二丙二醇1份，磷酸盐或Tris-HCl缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述一种蛋白质稳定剂，其特征在于，所述高分子量透明质酸为分子量＞2000Kda的透明质酸；所述中分子量透明质酸为500Kda≤分子量≤2000Kda的透明质酸；所述低分子量透明质酸为10Kda≤分子量＜500Kda的透明质酸；所述寡聚透明质酸为分子量＜10Kda的透明质酸。
5.权利要求1-4之一所述一种蛋白质稳定剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将上述各组分加入到磷酸盐或Tris-HCl缓冲溶液中，并混合搅拌至完全溶解；
(2)用氢氧化钠或盐酸调节pH值在7.0-8.0之间，加入缓冲液将混合液调至100份；
(3)过滤步骤(2)所得混合液，罐装得所述蛋白质稳定剂。
6.根据权利要求5所述一种蛋白质稳定剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，混合时搅拌的速度为20-3000rpm。
7.根据权利要求5所述一种蛋白质稳定剂的制备方法，其特征在于，所述过滤为采用0.2-0.8微米的滤膜或惰性材质的过滤填充柱进行过滤。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220211 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |