CN114133419A - 一种低分子量乙酰化透明质酸盐及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低分子量乙酰化透明质酸盐及其制备方法和应用，属于生物化工技术领域。其中，乙酰基取代度为1.9‑4.0，特性粘度为0.02‑0.11dl/g，其用平均分子量为800‑4500Da的低分子量透明质酸或其盐制备得到，制备方法：在惰性气体保护下，将低分子量的透明质酸或其盐加入到乙酸和乙酸酐的混合溶液中，加入浓硫酸催化剂进行酰化反应；反应结束后将反应液加入到醚类溶剂中析晶过滤，洗涤；收集固体分散于水，碱液调节pH，干燥，即可制得。本发明以低分子量透明质酸盐作为原料，乙酰化程度适中，得到的乙酰化透明质酸盐具有更显著的保湿性、亲脂亲油性和亲肤性，广泛应用于乳液、精华、口红等化妆品领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种低分子量乙酰化透明质酸盐及其制备方法和应用，属于生物化工技术领域。
背景技术
透明质酸(钠)又名玻尿酸、玻璃酸，是一种酸性粘多糖，由D-葡萄糖醛酸以及N-乙酰氨基葡萄糖组成的双糖单位构成的大型多糖类。其大量存在于生物体内的许多组织，例如皮下组织、眼球、关节等。与其他多糖类相比较，透明质酸不含硫，其分子能携带500倍以上的水分，是当今公认的最佳保湿成分，广泛应用于化妆品和保养品中。
乙酰化透明质酸钠是透明质酸钠经过乙酰化反应后得到的一种透明质酸衍生物。由于大量的乙酰基引入，使乙酰化透明质酸钠的亲脂亲油性大大提高，从而比传统透明质酸钠更高效保湿，修复皮肤屏障和增加皮肤弹性效果更佳，目前已成为研究热点。
高分子乙酰化透明质酸是指以分子量为500kDa以上的透明质酸作为原料制备得到的乙酰化透明质酸，中分子乙酰化透明质酸是指以分子量为20-500kDa的透明质酸作为原料制备得到的乙酰化透明质酸，低分子乙酰化透明质酸是采用20kDa以下甚至更低的透明质酸作为原料制备得到的乙酰化透明质酸。低分子乙酰化透明质酸不仅具备低分子透明质酸强大的保湿性及渗透性，由于乙酰基的引入可以使低分子透明质酸具备优良的脂溶性，使低分子透明质酸在口红、彩妆、药品等油溶性配方产品中有广泛的应用。
目前市场在售商品中的乙酰化透明质酸或其盐成分均为大分子量结构，且相关专利和文献报道的均为大分子量的乙酰化透明质酸钠的制备方法，日本资生堂株式会社发表的美国专利US5679657A公开了一种特性粘度为50-200cm3/g，换算为0.5-2dl/g(分子量约80-100万Da)，乙酰基取代度为2.6-3.6的乙酰化透明质酸钠的制备方法，此法在乙酰化反应结束后，先使用大量的水析晶，再加入80％丙酮水溶液和50％乳酸钠水溶液完全溶解上述沉淀，然后加入丙酮再次沉淀进行纯化；最后用乙醇洗涤，该专利采用大量有毒、不环保的丙酮溶剂，造成环境污染。中国专利公开CN109206537A公开了采用平均分子量为50-3000kDa的中高分子量的透明质酸在浓硫酸催化条件下，在乙酸和乙酸酐混合溶剂中进行酰化反应；在水中沉淀，水洗涤收集到的纤维状沉淀后得到乙酰化透明质酸，碱液调节后得到乙酰透明质酸钠。中国专利公开CN110981991A公开了在浓硫酸催化条件下，分子量为10-3000kDa透明质酸盐和乙酸酐进行酰化反应，用水稀释打浆得到乙酰化透明质酸，产率高达90％以上，特性粘数0.1-0.11。中国专利公开CN113121721A公开了平均分子量为5-5000kDa透明质酸盐和乙酸酐在在甲苯溶剂和4-二甲氨基吡啶催化剂条件下反应制备乙酰化透明质酸钠。目前报道的乙酰化透明质酸盐的分子量都是中高分子量(50-3000KDa)，且后处理基本采用水进行沉淀，尚未对分子量低于5000Da的乙酰化透明质酸/盐进行报道。另外由于低分子量透明质酸具有良好的水溶性，如果采用已报道的加入水中沉淀的方法会导致产品溶解，目前在得到低分子量的乙酰化透明质酸或其盐方面遇到极大的困难，因此有必要开发一种新的方法来制备得到低分子量的乙酰化透明质酸及其盐。
发明内容
[技术问题]
现有尚未对分子量低于5000Da的乙酰化透明质酸/盐进行报道，且当前得到低分子量的乙酰化透明质酸或其盐方面遇到极大的困难，例如无法用水进行沉淀等。
[技术方案]
鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种具备显著的保湿性、亲脂亲油性和亲肤性的乙酰基取代度为1.9-4.0，特性粘度为0.02-0.11dl/g，的低分子量乙酰化透明质酸或其盐产品；同时开发一种高收率、乙酰化可控，乙酰基取代度为1.9-4.0的低分子量乙酰化透明质酸或其盐产品的制备方法；将上述所得的低分子量乙酰化透明质酸或其盐应用于护肤品、彩妆化妆品、药品等领域中。
为了实现上述目的，本发明的目的之一是提供了如下的技术方案：
一种低分子量乙酰化透明质酸或其盐，乙酰基取代度为1.9-4.0，特性粘度为0.02-0.11dl/g，其用平均分子量为800-4500Da的低分子量透明质酸或其盐制备得到。
进一步的，所述低分子量乙酰化透明质酸或其盐的平均分子量比低分子量透明质酸或其盐的分子量稍大，约为842-6600Da，优选约为960-1000Da。
本发明所述的平均分子量为800-4500Da的低分子量透明质酸或其盐原料是参考专利CN111040048A使用水蛭型透明质酸酶酶解得到，通过控制酶解时间可以得到不同平均分子量的低分子量透明质酸，另外由于水蛭型透明质酸酶的特殊性，该酶仅酶解大分子透明质酸中的β-1,3糖苷键，生成还原性末端为葡萄糖醛酸的饱和寡糖系列，原料中只有双糖片段，如二糖～二十四糖饱和寡糖的混合物，进一步优选为二糖～十二糖饱和寡糖的混合物，不会得到错误水解的非透明质酸寡糖的小分子水解产物。进一步优选为透明质酸二糖饱和寡糖含量占比为5-40％，透明质酸四糖饱和寡糖含量占比40-70％，透明质酸六糖饱和寡糖含量占比10-30％。通过现有技术(吕梦娴，透明质酸四糖和六糖的制备及生物活性研究[D]，江南大学，2016)可知使用不同类型的酶或者非酶法水解工艺，可以得到结构不同的寡糖系列。比如牛睾丸型透明质酸酶能够水解透明质酸中β-1,4糖苷键，生成以还原性末端为氨基葡萄糖的寡糖系列，最小产物是二糖(GlcUA-GlcNAc)。而通过化学法比如盐酸或氢氧化钠溶液水解透明质酸，水解方式自由，水解发生在糖醛酸残基上的C1糖苷键、C4糖苷键和C5处的C-O等部位，在C1和C4部位的水解导致链的断裂，保留半缩醛环，还原端寡糖的降解、β-消去作用等同时发生，产物复杂无序，比如同包含了不同断裂规则下的透明质酸寡糖和其它非透明质酸寡糖的小分子水解产物时，存在奇数个和偶数个寡糖等现象。
进一步的，所述低分子量透明质酸或其盐的平均分子量为800-4500Da，优选为例如约810Da及以上，约820Da及以上，约830Da及以上，约840Da及以上，约850Da及以上，约860Da及以上，约870Da及以上，约880Da及以上，约890Da及以上，约900Da及以上，约950Da及以上，或低于约4000Da，低于约3500Da，低于约3000Da，低于约2500Da，低于约2000Da，低于约1800Da，低于约1500Da，低于约1200Da，低于约1000Da，或进一步优选约810-4000Da，约820-3500Da，约830-3000Da，约840-2500Da，约850-2000Da，约855-1500Da，约860-1000Da。
进一步的，低分子量乙酰化透明质酸或其盐的乙酰基取代度为1.9-4.0，优选为例如2.5-3.5，因为取代度＞3.5时乙酰化透明质酸的保湿作用降低，而取代度＜2.5时，乙酰化透明质酸的脂溶性降低。
进一步的，所述的低分子量乙酰化透明质酸或其盐的结构通式如下：
其中R:Ac or H，所有R不同时为H；M:Na，K，Mg，Ca，Zn或NH4；n＝1-12。
本发明的第二目的是提供如上述低分子量乙酰化透明质酸盐的制备方法，包括步骤如下：
(1)在惰性气体保护条件下，将低分子量的透明质酸或其盐加入到一定比例乙酸和乙酸酐的混合溶液中，加入浓硫酸催化剂，在一定温度下进行酰化反应；
(2)反应结束后，将反应液加入到醚类溶剂中析晶过滤，洗涤；
(3)收集固体分散于水中，用碱液调节pH，干燥，得到低分子量乙酰化透明质酸或其盐。
进一步的，步骤(1)中所述低分子量的透明质酸或其盐的分子量为800～4500Da。
进一步的，步骤(1)中所述低分子量的透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锌盐或铵盐中任一种或几种。
进一步的，步骤(1)中所述乙酸和乙酸酐的体积比例为1:1-1:4，优选乙酸和乙酸酐的体积比例为2:5。
进一步的，步骤(1)中所述浓硫酸催化剂的添加量为乙酸和乙酸酐的混合溶液体积的1％-10％，优选为5％-8％，更优选为6％-7.5％。
进一步的，步骤(1)中所述酰化温度为10-40℃，优选25℃。
进一步的，步骤(1)中所述酰化反应至反应液透明。
进一步的，步骤(1)中，所述惰性气体包括但不限于氮气、二氧化碳、氩气、氦气等。
进一步的，步骤(2)中，所述醚类溶剂包括但不限于乙醚、甲基叔丁基醚、石油醚、乙二醇二甲醚、二丙醚、异丙醚中的一种或几种，优选甲基叔丁基醚。本发明还尝试了与甲基叔丁基醚极性相似的烷烃类、酯类等其他非极性溶剂，如正己烷、正戊烷、乙酸乙酯，却发现均无法析出乙酰化透明质酸沉淀，可能是溶剂及乙酰化透明质酸的空间结构、空间位阻及其相互作用有关。
进一步的，步骤(2)中所述沉淀用醚类溶剂的体积用量为步骤(1)反应体积的2-20倍，优选4-16倍，最优选8-10倍。
进一步的，步骤(3)中，所述碱液为碱金属氢氧化物、碱金属碳酸化物或碱金属磷酸化物的水溶液；其中碱金属氢氧化物溶液包括但不限于氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液，碱金属碳酸化物的水溶液包括但不限于碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾，碱金属磷酸化物的水溶液包括但不限于磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾；上述碱液调节后pH值为4-6.8，优选为5-6.0。
进一步的，步骤(3)中，所述碱液的浓度为0.1-10mol/L，优选1-2mol/L。
进一步的，步骤(3)中，所述干燥优选为喷雾干燥。
本发明的第三目的是提供如下技术方案：一种含有乙酰基取代度为1.9-4.0，特性粘度为0.02-0.11dl/g的低分子量乙酰化透明质酸或其盐的组合物，其用平均分子量为800-4500Da的低分子量透明质酸或其盐制备得到。
进一步的，所述组合物包括护肤品、化妆品或药物。
进一步的，所述组合物可以被制造成业界通常制造的任何剂型，如溶液、悬浮液、乳浊液、膏、凝胶、面霜、乳液、粉饼、肥皂、表面活性剂-含油清洁剂、油、粉末粉底液、乳浊液粉底液、蜡粉底液及喷雾等，优选的，包括但不限于按摩霜、精华液、眼霜、洗面奶、洗面奶、卸妆水、面膜、喷雾或粉饼等形式。
本发明的第四个目的是提供上述制备方法在护肤、彩妆、医药领域的应用。
本发明相对现有技术，具有以下优势：
1、本发明提供的通过使用平均分子量约为800-4500Da的低分子量透明质酸或其盐制备得到，乙酰基取代度为1.9-4.0，特性粘度为0.02-0.11dl/g的低分子量乙酰化透明质酸或其盐产品，具备更显著的保湿性、亲脂亲油性和亲肤性，能够达到深层次补水及长效锁水的效果，且随着分子量的降低，皮肤水分含量越高。弥补市场上只有中、高分子量的乙酰化透明质酸或其盐的遗憾，为客户提供多样性的选择。另外，在本研究中意外地发现低分子乙酰化透明质酸钠分子量不是越低越好，当低于800Da如为600Da时，皮肤水分含量反而降低。
2、本发明在制备低分子量乙酰化透明质酸或其盐过程中，通过控制乙酸和乙酸酐的混合溶剂的比例及浓硫酸用量，筛选得到乙酰化适中的低分子量乙酰化透明质酸。
3、本发明在制备低分子量乙酰化透明质酸或其盐过程中，克服低分子量乙酰化透明质酸无法通过水、乙醇等沉淀的方法制备得到的技术难题；本发明利用甲基叔丁基醚等醚类溶剂，同时控制该醚类溶剂的添加量，析晶得到、高收率和乙酰化可控的低分子量乙酰化透明质酸。
4、本发明提供的制备方法制备工艺简单，生产周期短，显著降低生产成本。同时不使用丙酮等有毒的有机溶剂，减少处理过程废水的排放量，更加环保。
5、本发明提供的制备方法，得到的低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率可高达90％及以上，产品乙酰基取代度1.9-4.0，特性粘数0.02-0.11dl/g。
6、本发明原料采用水蛭型透明质酸酶工艺得到，相对采用牛睾丸型透明质酸酶或者化学法结合牛睾丸型透明质酸酶组合工艺，所得的低分子乙酰化透明质酸钠对皮肤水分含量影响较大，其中采用水蛭型透明质酸酶所得的800Da低分子乙酰化透明质酸钠取得了最佳的效果，分析可能原因是皮肤水分含量与低分子乙酰化透明质酸钠的寡糖类型、空间结构及纯度密切相关。
附图说明
图1是皮肤水分测试结果图，其中，AcHA(800Da)：低分子量乙酰化透明质酸钠800Da，AcHA(1000Da)：低分子量乙酰化透明质酸钠1000Da，AcHA(2000Da)：低分子量乙酰化透明质酸钠2000Da，AcHA(4500Da)：低分子量乙酰化透明质酸钠4500Da，AcHA(50kDa)：中分子量乙酰化透明质酸钠，HA(800Da)：低分子量透明质酸钠(800Da)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
为便于本领域技术人员理解本发明内容，下面将结合具体实施例进一步描述本发明的技术方案，但以下内容不应以任何方式限制本发明权利要求书请求保护的范围。
本发明实施例中，参照文献(郭晓强，等人，乙酰化银耳多糖的制备及其取代度测定[J].食品工业科技，2013，34(12)：255-257)中的检测方法测定乙酰基取代度，计算可用下述公式表示：
乙酰基取代度(DS)＝[401.3×w]/[4300-(43-1)×w]
其中，w：乙酰基在低分子量乙酰化透明质酸或其盐中的含量。
低分子量乙酰化透明质酸钠的收率可用得到的低分子量乙酰化透明质酸钠与原料低分子量透明质酸的质量比进行简单换算。
特性粘度的测量方法参考2020年中国药典第四部通则0633乌氏毛细管粘度计测定法。
本发明实际提供的一种低分子量乙酰化透明质酸或其盐及其制备方法的反应式如下(乙酸/乙酸酐)：
其中R:Ac or H，所有R不同时为H；M:Na，K，Mg，Ca，Zn或NH4；n＝1-12。
实施例1-4控制制备过程中的酰化反应条件一致，考察不同低分子量的透明质酸对低分子量乙酰化透明质酸钠产率和乙酰基取代度的影响；
实施例5-6仅调节酰化反应条件(调节乙酸酐的加入量及浓硫酸的加入量)，其它参数均同实施例1，考察酰化反应条件对低分子量乙酰化透明质酸钠产率和乙酰基取代度的影响。
实施例7-9仅调节后处理条件(调节甲基叔丁基醚的加入量及pH数值)，其它参数均同实施例1，考察后处理条件对低分子量乙酰化透明质酸钠产率和乙酰基取代度的影响。
实施例10-12仅调节酰化反应醚类溶剂的类型，其它参数均同实施例1，考察醚类溶剂的类型对低分子量乙酰化透明质酸钠产率和乙酰基取代度的影响。
实施例13-14仅调节酰化反应的温度，其它参数均同实施例1，考察酰化反应的温度对低分子量乙酰化透明质酸钠产率和乙酰基取代度的影响。
平均分子量为600Da、800Da～4500Da(具体如800Da、1000Da、2000Da、4500Da)的低分子量透明质酸(以下简称水蛭型透明质酸酶酶解产物)、平均分子量为800Da的低分子量透明质酸(牛睾丸型透明质酸酶酶解产物)、平均分子量为800Da的低分子量透明质酸(化学酸法结合牛睾丸型透明质酸酶酶法产物)均通过本公司制备得到。其中水蛭型透明质酸酶或牛睾丸型透明质酸酶酶解的具体制备方法参考专利CN111040048A，利用不同类型透明质酸酶酶解大分子透明质酸钠(500kDa)得到，通过控制酶解时间可以得到不同平均分子量的低分子量透明质酸。化学酸法结合牛睾丸型透明质酸酶酶法的具体制备方法参考专利CN101507733。其中水蛭型透明质酸酶通过重组基因的P.pastoris发酵得到(Jin P,etal.High-yield novel leech hyaluronidase to expedite the preparation ofspecific hyaluronan oligomers[J].Scientific Reports,2014,4:8)。牛睾丸透明质酸酶采购自北京华迈科生物技术公司。
实施例1
取15g平均分子量为800Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢加入到700mL甲基叔丁基醚中搅拌析出絮状沉淀，收集乙酰化透明质酸固体粗品，甲基叔丁基醚洗涤两次，将纯化后的乙酰化透明质酸固体分散于100mL纯化水中，用1moL/L NaOH溶液调节pH至5.8，过滤除杂，喷雾干燥，即得14.25g低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率95％，特性粘度为0.02。
实施例2
取15g平均分子量为1000Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢加入到700mL甲基叔丁基醚中搅拌析出絮状沉淀，收集乙酰化透明质酸固体粗品，甲基叔丁基醚洗涤两次，将纯化后的乙酰化透明质酸固体分散于100mL纯化水中，用1moL/LNaOH溶液调节pH至5.8，过滤除杂，喷雾干燥，即得13.95g低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率93％，特性粘度为0.03。
实施例3
取15g平均分子量为2000Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢加入到700mL甲基叔丁基醚中搅拌析出絮状沉淀，收集乙酰化透明质酸固体粗品，甲基叔丁基醚洗涤两次，将纯化后的乙酰化透明质酸固体分散于100mL纯化水中，用1moL/LNaOH溶液调节pH至5.8，过滤除杂，喷雾干燥，即得13.5g低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率90％，特性粘度为0.06。
实施例4
取15g平均分子量为4500Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢加入到700mL甲基叔丁基醚中搅拌析出絮状沉淀，收集乙酰化透明质酸固体粗品，甲基叔丁基醚洗涤两次，将纯化后的乙酰化透明质酸固体分散于100mL纯化水中，用1moL/LNaOH溶液调节pH至5.8，过滤除杂，喷雾干燥，即得12g低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率80％，特性粘度为0.11。
实施例5
取15g平均分子量为800Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和20mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加2mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢加入到700mL甲基叔丁基醚中搅拌析出絮状沉淀，收集乙酰化透明质酸固体粗品，甲基叔丁基醚洗涤两次，将纯化后的乙酰化透明质酸固体分散于100mL纯化水中，用1moL/L NaOH溶液调节pH至5.8，过滤除杂，喷雾干燥，即得11.25g低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率75％，特性粘度为0.02。
实施例6
取15g平均分子量为800Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和80mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加8mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢加入到700mL甲基叔丁基醚中搅拌析出絮状沉淀，收集乙酰化透明质酸固体粗品，甲基叔丁基醚洗涤两次，将纯化后的乙酰化透明质酸固体分散于100mL纯化水中，用1moL/LNaOH溶液调节pH至5.8，过滤除杂，喷雾干燥，即得12g低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率80％，特性粘度为0.02。
实施例7
取15g平均分子量为800Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢加入到1500mL甲基叔丁基醚中搅拌析出絮状沉淀，收集乙酰化透明质酸固体粗品，甲基叔丁基醚洗涤两次，将纯化后的乙酰化透明质酸固体分散于100mL纯化水中，用1moL/LNaOH溶液调节pH至4.2，过滤除杂，喷雾干燥，即得9g低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率60％，特性粘度为0.02。
实施例8
取15g平均分子量为800Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢加入到1500mL甲基叔丁基醚中搅拌析出絮状沉淀，收集乙酰化透明质酸固体粗品，甲基叔丁基醚洗涤两次，将纯化后的乙酰化透明质酸固体分散于100mL纯化水中，用1moL/LNaOH溶液调节pH至6.5，过滤除杂，喷雾干燥，即得12.3g低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率82％，特性粘度为0.02。
实施例9
取15g平均分子量为800Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢加入到350mL甲基叔丁基醚中搅拌析出絮状沉淀，收集乙酰化透明质酸固体粗品，甲基叔丁基醚洗涤两次，将纯化后的乙酰化透明质酸固体分散于100mL纯化水中，用1moL/LNaOH溶液调节pH至6.5，过滤除杂，喷雾干燥，即得12.75g低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率85％，特性粘度为0.02。
实施例10
取15g平均分子量为800Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢加入到700mL乙二醇二甲醚中搅拌析出絮状沉淀，收集乙酰化透明质酸固体粗品，乙二醇二甲醚洗涤两次，将纯化后的乙酰化透明质酸固体分散于100mL纯化水中，用1moL/L NaOH溶液调节pH至5.8，过滤除杂，喷雾干燥，即得13.98g低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率93％，特性粘度为0.02。
实施例11
取15g平均分子量为800Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢加入到700mL异丙醚中搅拌析出絮状沉淀，收集乙酰化透明质酸固体粗品，异丙醚洗涤两次，将纯化后的乙酰化透明质酸固体分散于100mL纯化水中，用1moL/L NaOH溶液调节pH至5.8，过滤除杂，喷雾干燥，即得14.1g低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率94％，特性粘度为0.02。
实施例12
取15g平均分子量为800Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢加入到700mL二丙醚中搅拌析出絮状沉淀，收集乙酰化透明质酸固体粗品，二丙醚洗涤两次，将纯化后的乙酰化透明质酸固体分散于100mL纯化水中，用1moL/L NaOH溶液调节pH至5.8，过滤除杂，喷雾干燥，即得13.95g低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率93％，特性粘度为0.02。
实施例13
取15g平均分子量为800Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在10℃以下，滴加结束后，将反应温度设为10℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢加入到700mL二丙醚中搅拌析出絮状沉淀，收集乙酰化透明质酸固体粗品，二丙醚洗涤两次，将纯化后的乙酰化透明质酸固体分散于100mL纯化水中，用1moL/L NaOH溶液调节pH至5.8，过滤除杂，喷雾干燥，即得11.88g低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率79％，特性粘度为0.02。
实施例14
取15g平均分子量为800Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在40℃以下，滴加结束后，将反应温度设为40℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢加入到700mL二丙醚中搅拌析出絮状沉淀，收集乙酰化透明质酸固体粗品，二丙醚洗涤两次，将纯化后的乙酰化透明质酸固体分散于100mL纯化水中，用1moL/L NaOH溶液调节pH至5.8，过滤除杂，喷雾干燥，即得12.05g低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率85％，特性粘度为0.02。
对比例1
取15g平均分子量为800Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢滴加至700mL的纯化水中搅拌。
现象：无沉淀产生，产品未能析出，得不到终产品。
对比例2
取15g平均分子量为800Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液滴加至700mL乙醇溶液中。
现象：无沉淀产生，产品未能析出，得不到终产品。
对比例3
取15g平均分子量为800Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液滴加至700mL正己烷溶液中。
现象：无沉淀产生，产品未能析出，得不到终产品。采用与甲基叔丁基醚极性相似的正己烷溶剂，也无法析出乙酰化透明质酸沉淀。
对比例4
取15g平均分子量为600Da的透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢加入到700mL甲基叔丁基醚中搅拌析出絮状沉淀，收集乙酰化透明质酸固体粗品，甲基叔丁基醚洗涤两次，将纯化后的乙酰化透明质酸固体分散于100mL纯化水中，用1moL/L NaOH溶液调节pH至5.8，过滤除杂，喷雾干燥，即得13.90g低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率93％，特性粘度约为0.02。
对比例5
取15g平均分子量为800Da的透明质酸(牛睾丸型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢加入到700mL甲基叔丁基醚中搅拌析出絮状沉淀，收集乙酰化透明质酸固体粗品，甲基叔丁基醚洗涤两次，将纯化后的乙酰化透明质酸固体分散于100mL纯化水中，用1moL/L NaOH溶液调节pH至5.8，过滤除杂，喷雾干燥，即得13.90g低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率93％，特性粘度为0.02。
对比例6
取15g平均分子量为800Da的透明质酸(化学酸法+牛睾丸型透明质酸酶酶解产物)加入到20mL乙酸和50mL乙酸酐混合溶液中，氮气保护下，缓慢滴加5mL 98％浓硫酸，维持温度在25℃以下，滴加结束后，将反应温度设为25℃，当反应液透明时，停止反应。将反应液缓慢加入到700mL甲基叔丁基醚中搅拌析出絮状沉淀，收集乙酰化透明质酸固体粗品，甲基叔丁基醚洗涤两次，将纯化后的乙酰化透明质酸固体分散于100mL纯化水中，用1moL/L NaOH溶液调节pH至5.8，过滤除杂，喷雾干燥，即得13.80g低分子量乙酰化透明质酸钠产品，产率92％，特性粘度为0.02。
将上述实施例所得的低分子量乙酰化透明质酸钠最终产品进行比对，结果如下：
表1：实施例1-14和对比例1-6产品数据统计
| 实施例 | 收率，％ | 乙酰基取代度 | pH | 特性粘度 | 产品外观 |
| 1 | 95 | 3.5 | 5.8 | 0.02 | 白色粉末，无特殊气味 |
| 2 | 93 | 3.0 | 5.8 | 0.03 | 白色粉末，无特殊气味 |
| 3 | 90 | 2.5 | 5.8 | 0.06 | 白色粉末，无特殊气味 |
| 4 | 80 | 1.9 | 5.8 | 0.11 | 白色粉末，无特殊气味 |
| 5 | 75 | 2.0 | 5.8 | 0.02 | 白色粉末，无特殊气味 |
| 6 | 80 | 4.0 | 5.8 | 0.02 | 白色粉末，无特殊气味 |
| 7 | 60 | 3.2 | 4.2 | 0.02 | 白色粉末，有醋酸气味 |
| 8 | 82 | 3.0 | 6.5 | 0.02 | 淡黄色粉末，无特殊气味 |
| 9 | 85 | 3.3 | 6.5 | 0.02 | 淡黄色粉末，无特殊气味 |
| 10 | 93 | 3.2 | 5.8 | 0.02 | 白色粉末，无特殊气味 |
| 11 | 94 | 3.3 | 5.8 | 0.02 | 白色粉末，无特殊气味 |
| 12 | 93 | 3.1 | 5.8 | 0.02 | 白色粉末，无特殊气味 |
| 13 | 79 | 2.2 | 5.8 | 0.02 | 白色粉末，无特殊气味 |
| 14 | 85 | 2.6 | 5.8 | 0.02 | 白色粉末，无特殊气味 |
| 对比例1 | - | - | - | - | 未得到产品 |
| 对比例2 | - | - | - | - | 未得到产品 |
| 对比例3 | - | - | - | - | 未得到产品 |
| 对比例4 | 93 | 3.1 | 5.8 | 0.02 | 白色粉末，无特殊气味 |
| 对比例5 | 93 | 3.3 | 5.8 | 0.02 | 白色粉末，无特殊气味 |
| 对比例6 | 92 | 2.9 | 5.8 | 0.02 | 白色粉末，无特殊气味 |
结论：1)实施例1-4表明采用平均分子量800-4500Da范围内的低分子透明质酸(水蛭型透明质酸酶酶解产物)在乙酸和乙酸酐溶液中，浓硫酸催化条件下可以得到不同乙酰基取代度的低分子乙酰化透明质酸钠，且低分子透明质酸原料的分子量越小，所得产品的收率越高，可能原因为由于分子量的增加导致乙酰基取代的难度增加，因此，在相同条件下，分子量越低，乙酰基取代度越高，导致后处理过程中低分子乙酰化透明质酸钠在甲基叔丁基醚中的溶解度越低，最终收率随着分子量增加而降低。
2)实施例5-6表明通过调节乙酸酐/乙酸的加入量或浓硫酸的加入量，对得到的低分子乙酰化透明质酸钠的收率和乙酰基取代度影响较大。实施例5-6结合实施例1，表明乙酸与乙酸酐的体积比为2:5，浓硫酸的体积量为反应液的体积7％时，反应收率最高，乙酰基取代度较佳。
3)特性粘度与透明质酸的分子量有关系，使用的低分子透明质酸的分子量不变，低分子乙酰化透明质酸钠的特性粘度不会有很大变化。
4)实施7-9表明通过调节不同的后处理条件，对得到的低分子乙酰化透明质酸钠的收率、乙酰基取代度以及颜色、气味等性状影响较大。实施例7所得产品有醋酸气味，是由于调节的pH过低导致溶液中的醋酸未能充分中和，因此在喷雾处理后产品具有醋酸味。实施例8-9在pH6.5条件下可能产生了更多杂质，导致产品呈现淡黄色。
5)对比例1-3表明采用已报到的水或者乙醇剂型溶剂，或者正己烷等非极性溶剂作为沉淀剂的后处理方法并未得到终产品，说明现有技术方法不能得到平均分子量约为800～4500Da低分子乙酰化透明质酸钠。
6)实施例10-12结合实施例1，表明通过改变醚类溶剂，对得到的低分子乙酰化透明质酸钠的收率和乙酰基取代度影响不大，表明醚类溶剂是优良的沉淀用溶剂，其中，用甲基叔丁基醚沉淀效果最好，产品收率最高。
7)实施例13-14结合实施例1，表明通过改变酰化反应温度，对得到的低分子乙酰化透明质酸钠的收率和乙酰基取代度有一定影响，温度较低，转化速率较慢，温度较高，转化速率较高。
8)通过大量实验研究表明，控制乙酸与乙酸酐的体积比例在2:5，浓硫酸的体积量为反应液的体积7％，甲基叔丁基醚用量为反应液体积的9倍，后处理pH为5.8时，获得的乙酰化透明质酸钠产品性状较为优异，产物收率最高。
将实施例1-4制备得到的低分子量乙酰化透明质酸钠按照下表2所示的乳液基础配方，配置成含有0.1％质量低分子乙酰化透明质酸钠的乳液1-乳液4。
将市场采购的中分子量乙酰化透明质酸钠(山东银河生物科技有限公司，50kDa)与下表2所示的乳液基础配方，配置成含有0.1％质量中分子量乙酰化透明质酸钠的乳液5。
将本公司采用CN111040048A工艺得到的800Da低分子量透明质酸钠、对比例4制备方法得到的约600Da低分子量乙酰化透明质酸钠，对比例5-6制备方法得到的约800Da低分子量乙酰化透明质酸钠分别与下表2所示的乳液基础配方，配制成含有0.1％质量低分子量透明质酸钠的乳液6-乳液9。
空白组：涂抹乳液10，其不含有任何透明质酸成分，其余均同表2中的乳液基础配方。
将上述10种乳液同等对比其保湿功效及满意度、肤感及滋润度评价。
表2：乳液基础配方
经过皮肤保湿效果实验，测试结果如下：
将上述10种乳液分别给50位25-30岁女士涂抹使用(总共50名受试者，分成10组，5名/组)，涂抹后5min进行皮肤水分含量测试并计算平均值，对比发现(见表3和图1)：
表3不同乳液对皮肤水分含量的影响
结果说明乳液1-4，相对乳液5-6，在皮肤水分保湿性能方面有明显提高，且原料低分子透明质酸钠分子量在800-4500Da范围内，随着分子量的降低，皮肤水分含量越高。另外，在本研究中意外地发现低分子乙酰化透明质酸钠分子量不是越低越好，当低于800Da时，如通过乳液1与乳液7对比可知，当分子量为600Da时，乳液7对应的皮肤水分含量却没有乳液1高，突破了本领域技术人员的认知，分析可能原因是寡糖组合物中的四糖(分子量约800Da)含量越高，越有利于增加皮肤水分含量。通过对比乳液1和乳液8-9可知，原料低分子透明质酸采用水蛭型透明质酸酶工艺得到，相对采用牛睾丸型透明质酸酶或者化学法结合牛睾丸型透明质酸酶组合工艺，乳液1取得了更突出效果，分析可能原因是皮肤水分含量与低分子乙酰化透明质酸钠的寡糖类型、空间结构及纯度密切相关，比如通过牛睾丸型透明质酸酶工艺得到的低分子透明质酸原料是还原性末端为氨基葡萄糖的寡糖系列，因此经过乙酰化后的低分子乙酰化透明质酸钠的结构也是还原性末端为氨基葡萄糖的寡糖系列，空间结构的差异导致皮肤水分含量更低。通过化学法结合牛睾丸型透明质酸酶组合工艺，然后乙酰化得到的低分子乙酰化透明质酸钠因为产物复杂无序，比如同包含了不同断裂规则下的透明质酸寡糖和其它非透明质酸寡糖的低分子水解产物时，存在奇数个和偶数个寡糖等现象，含有错误裂解的各种杂质，导致纯度较低，起关键作用的成分(可能为四糖)含量较少，导致皮肤水分含量更低。
此外再对皮肤保湿效果最佳的乳液1(含有0.1％质量低分子乙酰化透明质酸钠(约800Da)的乳液1)进一步进行水分测试，考察锁水能力，选用5名受试人员，其结果通过湿度测量值(Moisture Measurement Value,MMV)来表示，具体如表4所示。表明乳液1能够实现长效锁水效果，在8h还能保持45数值以上的湿度。
表4乳液1长时间的锁水能力测试结果
将实施例1制备的低分子量乙酰化透明质酸钠(800Da，原料用水蛭型透明质酸酶酶解得到)、市购中分子乙酰化透明质酸钠(50KDa)低分子量透明质酸钠(800Da)、对比例4制备的低分子量乙酰化透明质酸钠(600Da)、对比例5制备的低分子量乙酰化透明质酸钠(800Da，原料用牛睾丸型透明质酸酶酶解得到)、对比例6制备的低分子量乙酰化透明质酸钠(800Da，原料用化学酸法结合牛睾丸型透明质酸酶酶解得到)按照表5中的配方，分别配制成含有0.1％质量低分子乙酰化透明质酸钠或者低分子透明质酸钠的口红，分别给10位25-30岁女士试用，从满意度、肤感和滋润度三个维度进行评分。
表5口红基础配方
试用满意度调查：1-5分，分别代表，1分：非常差，2分：较满意，3分：舒服，4分：好，5分：很满意。
肤感调查：1-5分，分别代表，1分：铺展性很差，吸收很差；2分：铺展性较差，吸收较差；3分：铺展性一般，吸收一般；4分：铺展性较好，吸收较好；5分：铺展性非常好，易吸收。
滋润度调查：1-5分，分别代表，1分：干涩，无滋润；2分：略微滋润；3分：有滋润感；4分：滋润度好；5分：滋润度很好。
调查结果如下表6所示。
表6：口红满意度、肤感及滋润度调查统计表
结果表明低分子量乙酰化透明质酸钠可以应用于油溶性的口红产品中，并未出现不良的溶解性，并且相对中分量乙酰化透明质酸钠、低分子量透明质酸钠及原料采用牛睾丸型酶法或者化学法结合牛睾丸型酶法得到的低分子量乙酰化透明质酸钠，含有800Da低分子量乙酰化透明质酸钠(原料采用水蛭型酶法得到)的口红滋润度性能良好，在使用肤感及满意度方面均表现较好，基本符合女士需求。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种低分子量乙酰化透明质酸或其盐，其特征在于，乙酰基取代度为1.9-4.0，特性粘度为0.02-0.11dl/g，其用平均分子量为800-4500Da的低分子量透明质酸或其盐制备得到。
2.根据权利要求1所述的一种低分子量乙酰化透明质酸或其盐，其特征在于，所述的低分子量乙酰化透明质酸的结构通式如下：
其中，R:Ac or H，所有R不同时为H；M:Na，K，Mg，Ca，Zn或NH4；n＝1-12。
3.权利要求1或2所述的低分子量乙酰化透明质酸盐的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
(1)在惰性气体保护条件下，将低分子量的透明质酸或其盐加入到一定比例乙酸和乙酸酐的混合溶液中，加入浓硫酸催化剂，在一定温度下进行酰化反应；
(2)反应结束后，将反应液加入到醚类溶剂中析晶过滤，洗涤；
(3)收集固体分散于水中，用碱液调节pH，干燥，得到低分子量乙酰化透明质酸或其盐。
4.根据权利要求3的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述低分子量的透明质酸或其盐的分子量为800～4500Da；优选的，步骤(1)中所述低分子量的透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锌盐或铵盐中任一种或几种。
5.根据权利要求3或4的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述乙酸和乙酸酐的体积比例为1:1-1:4，优选乙酸和乙酸酐的体积比例为2:5。
6.根据权利要求3～5任一项的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述浓硫酸催化剂的添加量为乙酸和乙酸酐的混合溶液体积的1％-10％，优选为5％-8％，更优选为6％-7.5％。
7.根据权利要求3～6任一项的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述酰化温度为10-40℃，优选25℃。
8.根据权利要求3～7任一项的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述醚类溶剂包括乙醚、甲基叔丁基醚、石油醚、乙二醇二甲醚、二丙醚、异丙醚中的一种或几种，优选甲基叔丁基醚；所述沉淀用醚类溶剂的体积用量为步骤(1)反应体积的2-20倍，优选4-16倍，最优选8-10倍；步骤(3)中，调解后pH值为4-6.8，优选为5-6.0。
9.一种包含权利要求1或2所述的低分子量乙酰化透明质酸或其盐的组合物，其特征在于，所述组合物包括护肤品、化妆品或药物。
10.权利要求1或2所述的低分子量乙酰化透明质酸或其盐或权利要求3～8任一项所述的制备方法在护肤、彩妆、医药领域的应用。
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