BR112019017224A2 - aperfeiçoamentos em ou relativos a compostos orgânicos - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a uma composição para o cuidado da pele contendo ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio com um peso molecular médio em peso menor que 50 kda, e um grau de acetilação de pelo menos 3,6 que é útil no tratamento dos efeitos visíveis da idade sobre a pele humana.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para APERFEIÇOAMENTOS EM OU RELATIVOS A COMPOSTOS ORGÂNICOS.

[0001] A presente invenção refere-se a princípios ativos e métodos que são úteis para reduzir os sinais visíveis do envelhecimento na pele humana. Mais especificamente, a invenção diz respeito ao uso do ácido hialurônico acetilado ou do seu sal de sódio, para inibir determinadas enzimas degradadoras da matriz que estão envolvidas na deterioração da pele induzida pela radiação ultravioleta ou pela ação do tempo. A invenção também se refere a novas formas do ácido hialurônico acetilado úteis para reduzir os sinais visíveis do envelhecimento, e aos métodos de preparação de tais formas.

[0002] O desejo de parecer atraente está naturalmente enraizado nos consumidores modernos. Mesmo com as mudanças sofridas pelo padrão de beleza ao longo do tempo, existe um entendimento universal de que o estado e a aparência da nossa pele são pontos que colaboram de maneira preponderante para uma aparência externa sedutora.

[0003] Atualmente, uma grande variedade de produtos cosméticos para o cuidado da pele é oferecida aos consumidores. De modo geral, esses produtos estão sob a forma de cremes e loções, contendo água para hidratar a pele, e gorduras e lipídeos que a mantêm lubrificada, com os seus efeitos sendo exercidos sobre a camada mais externa da pele.

[0004] Os efeitos de suavização da pele pelo ácido hialurônico são conhecidos na técnica. No entanto, também se sabe que, com o passar do tempo, a condição física do ácido hialurônico é deteriorada nas preparações cosméticas. O ácido hialurônico acetilado foi proposto no documento EP 0 725 083 como uma alternativa ao ácido hialurônico que, conforme relatado, tem as mesmas funções de suavização da pele do ácido hialurônico, mas não exibe a mesma deterioração física do ácido

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2/37 livre. Entretanto, o documento EP 0 725 083 não propõe ou insinua o uso do ácido hialurônico acetilado no tratamento dos efeitos do envelhecimento sobre a pele, ou suas causas subjacentes.

[0005] Existem várias descrições de ácido hialurônico acetilado e acetil hialuronato de baixo peso molecular (EP 0 725 083; e CN 106176286) e de peso molecular intermediário (Saturnino etal. em Biomed Research International, 2014, 921549: Acetylated hyaluronic acid: enhanced bioavailability and biological studies; e Oka et al. em Polymer, 41: Differential scanning calorimetry studies on the mechanism of skin-softening effect of sodium acetylhyaluronate') com vários graus de substituição da acetila, que podem ser utilizados nos cuidados com a pele. No entanto, como mostraremos abaixo, esses produtos apresentam desvantagens substantivas em relação ao produto da presente invenção.

[0006] O fornecimento de preparações cosméticas eficazes úteis no tratamento das causas do envelhecimento cutâneo e que reduzam os sinais visíveis do envelhecimento continua sendo uma lacuna a ser preenchida.

[0007] O arcabouço estrutural da pele é designado como sua matriz extracelular. Essa estrutura interna contém uma rede de polímeros entremeados, como colágeno e elastina, em cujo interior encontramos as células da pele. A matriz extracelular é responsável pelas propriedades mecânicas da pele, entre elas firmeza, resistência, maleabilidade e elasticidade. Os sinais físicos do envelhecimento cutâneo são um reflexo da condição da matriz da pele. Mais particularmente, quanto mais frágil e menos regular a matriz, maior a tendência da pele de apresentar rugas, asperezas e flacidez.

[0008] A matriz extracelular da pele é um recurso valioso, que na pele jovem e saudável é produzida, mas também consumida. A suavidade, firmeza e juventude da pele humana dependem em larga medida

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3/37 da condição da sua matriz, e esta, por sua vez, depende do balanço entre a síntese da matriz e a degradação e reciclagem da matriz. A matriz extracelular da pele é formada por colágenos (com a prevalência do colágeno do tipo I); elastinas; e outros componentes como glicosaminoglicanos (GAGs). A matriz é sintetizada pelos fibroblastos na derme, e é remodelada por certas enzimas específicas (as metaloproteinases da matriz, ou MMPs). Via de regra, essas enzimas estão envolvidas na cura de feridas, mas são superexpressadas durante o envelhecimento causado pelo tempo e pela radiação ultravioleta, promovendo assim a degradação descontrolada e intensa da matriz, que é notoriamente responsável pelos sinais visíveis do envelhecimento, como o colapso da pele e a formação de rugas. Existem cerca de 20 MMPs, as quais são agrupadas em diferentes categorias conforme a sua especificidade de substrato. Entre elas estão as colagenases, gelatinases, estromelisinas, e MMPs do tipo membrana. A MMP-1 é a colagenase mais conhecida e está envolvida na divagem dos colágenos estruturais, como o colágeno do tipo 1. A MMP-3 é uma estromelisina que está envolvida na divagem de colágenos da membrana basal, como o colágeno IV.

[0009] As proteínas da matriz são moléculas estruturais grandes de meias-vidas longas (da ordem de 70 anos no caso da elastina). Consequentemente, praticamente não há reposição ou renovação desses materiais no tempo de vida normal do homem. Sendo assim, ocorre uma alteração e degradação progressivas da matriz que é acelerada com a idade, corrompendo e enfraquecendo a sustentação da pele e criando sinais visíveis do envelhecimento.

[0010] O envelhecimento cutâneo é o resultado do processo de envelhecimento cronológico intrínseco associado aos fatores ambientais, que consiste predominantemente na exposição à radiação ultravioleta. Os níveis da MMP sobem excessivamente no decorrer do envelhecimento cronológico normal, e os fatores ambientais agem para elevar

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4/37 ainda mais os níveis da MMP. A redução dos níveis das enzimas MMP e o seu retorno aos patamares normais da juventude, que são suficientes para atenuar a degradação da matriz, e preservar uma matriz saudável, podem contribuir para minorar ou suprimir os sinais visíveis do envelhecimento na pele humana.

[0011] Existe a necessidade de fornecer métodos e preparações cosméticas para aplicação cutânea que possam reverter ou reduzir a degradação da matriz da pele, inibindo ou reduzindo os níveis elevados de enzimas degradadoras da matriz, como as MMPs, aos níveis balanceados encontrados na pele jovem ou saudável.

[0012] A invenção refere-se ao uso do ácido hialurônico acetilado ou do seu sal de sódio (acetil hialuronato de sódio) para controlar o balanço entre os materiais degradadores da matriz na matriz extracelular da pele, reduzindo a extensão da degradação de proteínas essenciais da matriz, como o colágeno, e para reduzir os sinais visíveis do envelhecimento (induzidos pelo tempo ou pelo ambiente), sobretudo a prevenção ou redução das rugas e para a produção e manutenção de uma pele com aparência jovial.

[0013] Por conseguinte, a invenção engloba os seguintes aspectos e modalidades:

[0014] Um método para inibir a degradação da matriz extracelular da pele associada aos níveis elevados de enzimas degradadoras da matriz, o dito método compreendendo a etapa de aplicar à pele uma quantidade eficaz de ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio, em particular na forma da composição para cuidado da pele da presente invenção.

[0015] O método descrito acima, que é um método para reduzir os sinais visíveis do envelhecimento cutâneo, mais particularmente um método para prevenção ou redução das rugas.

[0016] O método descrito acima, em que as enzimas degradadoras

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5/37 da matriz são metaloproteinases da matriz e, mais particularmente, as enzimas MMP-1 ou MMP-3.

[0017] O método descrito acima, em que o ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio age para reduzir o grau de degradação do colágeno na matriz extracelular, em particular a degradação pelas metaloproteinases.

[0018] A fração de baixo peso molecular do ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, com um alto grau de acetilação, para uso em um método descrito no presente documento.

[0019] O ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, descrito acima tendo um peso molecular médio em peso de cerca de 50 kDa ou menos, mais particularmente de cerca de 35 kDa ou menos, e ainda mais particularmente de cerca de 30 kDa ou menos.

[0020] O ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, descrito acima, tendo um peso molecular médio em peso de cerca de 50 kDa ou menos, mais particularmente de cerca de 35 kDa ou menos, e ainda mais particularmente de cerca de 30 kDa ou menos, e um índice de polidispersividade que é menor que 2,3, mais particularmente menor que 2,0, mais particularmente menor que 1,8, mais particularmente menor que 1,7, mais particularmente menor que 1,6 ou menos, mais particularmente menor que 1,5, mais particularmente menor que 1,4, e mais particularmente cerca de 1,3 ou menos.

[0021] O ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, descrito acima tendo grau de acetilação que é maior que 3,6, mais particularmente igual ou maior que 3,7, mais particularmente igual ou maior que 3,8, mais particularmente igual ou maior que 3,9, e ainda mais particularmente igual a 4.

[0022] O ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, descrito acima tendo um grau de acetilação que é maior que 3,6, mais particularmente igual ou maior que 3,7, mais particularmente igual ou maior

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6/37 que 3,8, mais particularmente igual ou maior que 3,9, e ainda mais particularmente igual a 4 determinado com o uso da RMN 2D quantitativa. [0023] Um método para preparar um ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio com um peso molecular médio em peso de 50 kDa ou menos e um grau de acetilação médio maior que 3,6, que compreende as etapas de:

[0024] (i) selecionar um ácido hialurônico de baixo peso molecular com um peso molecular igual ou menor que 50 kDa, mais particularmente igual ou menor que 35 kDa, ou ainda mais particularmente igual ou menor que 30 kDa;

[0025] (ii) expor o ácido acima a condições de acetilação, sendo que as condições de acetilação incluem, de preferência, a etapa de reagir o ácido hialurônico de baixo peso molecular com uma mistura de ácido acético/anidrido acético na presença de um ácido forte; e [0026] (iii) isolar o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular, de preferência por precipitação, usando água de adição.

[0027] Uma preparação cosmética contendo uma quantidade eficaz do ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, descrito acima.

[0028] Uma composição para cuidado da pele contendo ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio, caracterizado por o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio ter um peso molecular médio em peso igual ou menor que 50 kDa e um grau de acetilação médio maior que 3,6.

[0029] A preparação cosmética, e em particularmente a composição para cuidado da pele, descrita acima, contendo pelo menos um excipiente cosmeticamente aceitável.

[0030] Esses e outros aspectos da invenção serão mais bem compreendidos após a descrição detalhada das modalidades particulares da invenção, que é dada abaixo.

[0031 ] Envelhecimento cutâneo é um termo que indica as mudanças

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7/37 sofridas pela pele com a idade, através do envelhecimento cronológico ou da exposição ao sol (fotoenvelhecimento) ou causado por outros agentes ambientais como a fumaça do tabaco, condições climáticas extremas de frio, calor, ou vento, poluentes ou contaminantes químicos, e engloba todas as alterações externas perceptíveis e/ou visíveis ao toque, tais como, entre outros, o desenvolvimento de descontinuidades na pele como rugas, linhas finas, sulcos, irregularidades ou asperezas, aumento do tamanho dos poros, perda de elasticidade, perda de firmeza, perda de suavidade, perda da capacidade de se recuperar de uma deformação, flacidez da pele como bochechas flácidas, o aparecimento de bolsas sob os olhos ou de queixo duplo, entre outros, alterações na coloração da pele como marcas, vermelhidão, ou o aparecimento de áreas hiperpigmentadas, a exemplo das manchas senis ou sardas entre outras, diferenciação anômala, hiperqueratinização, elastose, ceratose, perda da estrutura do colágeno e outras alterações histológicas do estrato córneo, da derme ou da epiderme.

[0032] Como se sabe, o nível elevado de metaloproteinases da matriz (MMPs) é um fator crucial para o envelhecimento cutâneo. As MMPs, como a MMP-1 e a MMP-3, estão envolvidas na degradação da matriz, e em particular na degradação do colágeno do tipo I, que é o tipo de colágeno mais importante encontrado na derme. Durante o processo do envelhecimento cronológico, bem como resultado da exposição ao UV e da exposição aos demais agentes ambientais, a produção de MMPs cresce, levando à degradação dérmica, colapso da pele, formação de rugas e, assim, dos primeiros sinais visíveis do envelhecimento cutâneo.

[0033] De maneira surpreendente, foi constatado que o ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, é capaz de reduzir os níveis das MMPs, em particular da MMP-1 e da MMP-3. Acredita-se, embora a requerente não queira se vincular pela teoria, que o nível mais baixo das

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MMPs resulta da regulação negativa dos genes que codificam essas enzimas.

[0034] O efeito biológico do ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio da presente invenção foi demonstrado em determinados estudos de expressão gênica conduzidos em três tipos principais de células presentes na pele: fibroblastos, queratinócitos e melanócitos. O impacto biológico do ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, também foi determinado por estudos funcionais e de proteínas in vitro. Descobrimos que ele apresenta uma nova atividade antienvelhecimento que está relacionada a limitar a degradação da matriz e proteger a pele contra os sinais da idade. Os estudos são descritos com mais profundidade nos exemplos abaixo.

[0035] Em contrapartida, descobriu-se que o ácido hialurônico acetilado descrito no documento CN 106176286 (obtido da empresa Bloomage Freda Biopharm Co., Ltd.) não induziu qualquer resposta gênica. [0036] A descoberta de que o ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, quando aplicado à pele, pode gerar um efeito biológico que é percebido como uma redução nos sinais visíveis do envelhecimento cutâneo, como a redução de rugas, capacita o indivíduo versado na técnica a fornecer preparações cosméticas para aplicação à pele de um indivíduo humano.

[0037] As preparações cosméticas e, em particular, as composições para o cuidado da pele, da presente invenção contêm uma quantidade cosmeticamente aceitável de ácido hialurônico acetilado ou do seu sal de sódio.

[0038] Uma quantidade cosmeticamente eficaz de ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio é entendida como uma quantidade não tóxica, porém suficiente, de ácido hialurônico acetilado ou do sal de sódio para propiciar o efeito desejado. Com relação ao peso total de uma preparação cosmética, em particular da composição para cuidado da

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9/37 pele, o ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio pode estar presente em quantidades de cerca de 0,005 a cerca de 5,0% em peso, e mais particularmente cerca de 0,05 a cerca de 0,5% em peso.

[0039] As preparações cosméticas e, em particular, as composições para cuidado da pele, da presente invenção podem conter um ou mais excipientes cosmeticamente aceitáveis. Todos os excipientes habitualmente utilizados na elaboração das preparações cosméticas para uso na pele humana podem ser empregados na presente invenção. Excipientes adequados incluem, mas não se limitam aos ingredientes que podem influenciar as propriedades organolépticas, a penetração na pele, e a biodisponibilidade do ácido hialurônico acetilado ou do seu sal de sódio. Mais especificamente, incluem líquidos, como água, óleos ou tensoativos, inclusive derivados do petróleo, animais, plantas ou sintéticos, tais como, entre outros, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim, óleo de rícino, polissorbatos, ésteres de sorbitano, sulfatos de éter, sulfatos, betaínas, glicosídeos, maltosídeos, álcoois graxos, nonoxinóis, poloxâmeros, polioxietilenos, polietilenos glicóis, dextrose, glicerol, digitonina, e similares.

[0040] A preparação cosmética, e em particular a composição para cuidado da pele, pode estar sob a forma de uma composição de lipossomas, lipossomas mistos, oleossomas, niossomas, etossomas, milipartículas, micropartículas, nanopartículas e nanopartículas de lipídeos sólidos, vesículas, micelas, micelas de tensoativos mistos, micelas mistas de fosfolipídeos-tensoativos, milisferas, microsferas e nanosferas, liposferas, milicápsulas, microcápsulas e nanocápsulas, bem como microemulsões e nanoemulsões, que podem ser adicionados para proporcionar uma penetração maior do ácido hialurônico acetilado ou do seu sal de sódio.

[0041] A preparação cosmética, e em particular a composição para

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10/37 cuidado da pele, pode ser produzida em qualquer forma útil, sólida, líquida, ou semissólida, para aplicação tópica ou transdérmica à pele. Portanto, essas preparações de aplicação tópica ou transdérmica incluem, mas não se limitam a cremes, múltiplas emulsões como, entre outras, óleo e/ou silicone em emulsões aquosas, emulsões água em óleo e/ou emulsões do tipo silicone, água/óleo/água ou água/silicone/água, e emulsões do tipo óleo/água/óleo ou silicone/água/silicone, microemulsões, emulsões e/ou soluções, cristais líquidos, composições anidras, dispersões aquosas, óleos, leites, bálsamos, espumas, loções aquosas ou oleosas, géis aquosos ou oleosos, creme, soluções hidroalcoólicas, soluções hidroglicólicas, hidrogéis, linimentos, soros, sabonetes, máscaras faciais, séruns, filmes de polissacarídeos, unguentos, musses, pomadas, pastas, pós, barras, lápis e borrifadores ou aerossóis (borrifadores), inclusive formulações não enxaguáveis ou enxaguáveis. [0042] A descoberta de que o ácido hialurônico acetilado ou o seu sal de sódio gera um efeito biológico foi especialmente surpreendente, tendo em vista que esse efeito não podia ser reproduzido por um ácido hialurônico ou sal não modificado, confirmando que a atividade está atrelada à acetilação da forma de ácido livre ou sal.

[0043] As formas particularmente preferenciais do ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio para uso na presente invenção são caracterizados por exibirem um grau de acetilação muito alto. Mais particularmente, as formas preferenciais do ácido hialurônico acetilado são caracterizadas por um grau médio de acetilação maior que 3,6, mais particularmente igual ou maior que 3,7, mais particularmente igual ou maior que 3,8, mais particularmente igual ou maior que 3,9, e ainda mais particularmente igual a 4.

[0044] O ácido hialurônico é um polissacarídeo formado por uma unidade de repetição contendo N-acetil glicosamina e ácido glicurônico. Ele pode existir na sua forma de ácido livre ou sal de sódio. Na forma

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11/37 acetilada, a expressão grau de acetilação indica uma medida do número de grupos hidroxila na unidade de repetição polimérica que são acetilados. Cada unidade de repetição do polímero do sal/ácido hialurônico nativo contém quatro grupos hidroxila que podem ser acetilados e o grau de acetilação é uma medida de quantos desses grupos são substituídos por um grupo acetila.

[0045] A mensuração do grau de acetilação é particularmente desafiadora quando utilizamos técnicas de análise convencionais. Por exemplo, descobrimos que a RMN unidimensional é ineficaz devido à coincidência dos deslocamentos químicos dos prótons a serem medidos.

[0046] No entanto, a requerente demonstrou um método analítico usando RMN bidimensional no qual o grupo N-acetila na fração glicosamina do ácido hialurônico ou do seu sal de sódio é usada como padrão interno para quantificar a funcionalidade acetila introduzida no processo de acetilação.

[0047] Para integrar esses dois tipos de sinais (grupo O-acetila e Nacetila), a requerente concebeu um método RMN-2D. Mais particularmente, o método RMN-2D é um método heteronuclear (análise Heteronuclear de Coerência de Quantum Único), que mede um sinal do próton em uma dimensão, e o sinal dos núcleos de carbono na segunda dimensão.

[0048] Ao empregar a técnica de RMN-2D, a requerente notou que era possível distinguir claramente o sinal N-acetila, dos sinais associados aos grupos O-acetila, permitindo a integração do volume desses grupos, e, portanto, possibilitando a determinação quantitativa do grau de acetilação. O esquema básico de um experimento de HSQC adequado é discutido nos parágrafos abaixo:

[0049] A análise do grau de acetilação é efetuada por um método HSQC ¹H-¹³C melhorado por gradiente que permite a integração do volume para os grupos acetilas citados de maneira quantitativa.

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12/37 [0050] A constante de acoplamento ¹H-¹³C oferece informações sobre a conectividade dos átomos em uma molécula, e na espectroscopia RMN é responsável pelo surgimento de muitos sinais em um espectro. Os volumes de integração dos picos cruzados em um experimento de HSQC são modulados pela constante de acoplamento ¹H-¹³C ¹Jc,h. Porém, picos cruzados oriundos de diferentes constantes de acoplamento normalmente não permitem a integração quantitativa. No entanto, a requerente notou, em um aspecto vantajoso, que no caso do método analítico corrente, ¹Jc,H(N-acetila) foi substancialmente igual a ¹Jc,H(O-acetila), permitindo uma análise quantitativa.

[0051] Assim como nas quantificações RMN-1D tradicionais, um tempo de espera de relaxamento suficiente pode ser fornecido para garantir que os prótons tanto N-acetila como O-acetila tenham tempo para relaxar de uma varredura para outra, a fim de permanecer em condições quantitativas. Adicionalmente, a fim de restringir a relaxação T2 diferenciada entre as espécies N-acetila e O-acetila de interesse durante a sequência, os dois tempos de espera dados por (4 X Jc,h)^-1 no âmbito da transferência INEPT (Insensitive Nuclei Enhanced by Polarization Transfer - Núcleos Insensíveis Melhorados por Transferência de Polarização) do HSQC foram mantidos tão breves quanto possível, por exemplo, por aproximadamente 1,5 milissegundos.

[0052] As medições RMN-2D podem ser conduzidas em qualquer instrumento de campo alto disponível na técnica. Um exemplo de um instrumento adequado é um instrumento RMN de campo alto equipado com uma cabeça de sonda Cryoprobe, mais especificamente um Bruker Avance III 600 MHz, MicroCryoprode TCI 1,7 mm.

[0053] As amostras para análise podem ser preparadas como 1,2 mg de ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, dissolvidas em 50 ml de D2O 99,96% D. A solução da amostra pode ser transferida no tubo de RMN (1,7 mm, Bruker) para medição. Parâmetros de medição

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13/37 típicos incluem: T = 60°C; número de varreduras = 4; varreduras fictícias = 32; tempo de espera da recuperação = 10s; tempo de aquisição = 177 ms; largura espectral (¹H) = 6,0 ppm; largura espectral (¹³C) = 110 ppm; ¹H-deslocamento de pulso = 3,5 ppm; ¹³C-deslocamento de pulso = 60 ppm; domínio de tempo (¹H) = 1272; domínio de tempo (¹³C) = 256. O software para aquisição e processamento de dados, inclusive para a integração de picos cruzados, é o TopSpin 3.0 (Bruker).

[0054] Em particular, essa técnica de RMN-2D permitiu distinguir o ácido hialurônico acetilado ou sal de sódio da presente invenção do produto descrito no documento EP 0 725 083 e comercializado pela Shiseido: o acetil hialuronato da Shiseido tinha um grau médio de acetilação de apenas 3,6 aproximadamente. Isso é importante, já que o produto da Shiseido também mostrou ser inferior ao produto da presente invenção quanto à atividade antienvelhecimento, como mostra o Exemplo 5 adiante.

[0055] O ácido hialurônico acetilado ou sal de sódio usados nos métodos e preparações cosméticas, em particular nas composições para cuidado da pele, da presente invenção é um ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou sal de sódio deste ácido. A expressão baixo peso molecular designa um material polimérico com um peso molecular médio em peso (PM) igual ou menor que 50 kDa, mais particularmente igual ou menor que 35 kDa, mais particularmente igual ou menor que cerca de 30 kDa, mais particularmente igual ou menor que 25 kDa, mais particularmente igual ou menor que 20 kDa, mais particularmente igual ou menor que 15 kDa, e ainda mais particularmente de cerca de 10 kDa a 15 kDa, por exemplo, 13 kDa +/- 1 kDa.

[0056] A massa molecular do ácido hialurônico acetilado ou frações poliméricas do seu sal de sódio deve ser estritamente dispersa. De preferência, o ácido hialurônico acetilado ou o seu sal de sódio tem um

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14/37 índice de polidispersividade (PM/Mn) que é menor que 2,0, mais particularmente menor que 1,8, mais particularmente menor que 1,7, mais particularmente igual ou menor que 1,6, mais particularmente menor que 1,5, e ainda mais particularmente igual ou menor que cerca de 1,4. [0057] Para comparação, os produtos descritos nos documentos EP 0 725 083 (obtido da empresa Shiseido) e CN 106176286 (obtido da empresa Freda) foram analisados por HPLC-SEC (cromatografia por exclusão de tamanho e cromatografia líquida de alta eficiência) usando detecção por espalhamento de luz. Foram obtidos os seguintes resultados:

	Peso molecular médio em peso (PM)	índice de polidispersividade (PM/Mn)
Produto Shiseido	34.958 Da	1,560
Produto Freda	45.676 Da	1,580
Produto da presente invenção	11.721 Da	1,485

0058] A viscosidade intrínseca do ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio é de preferência menor que 0,3 dl/g (30 cm³/g), e mais particularmente 0,245 dl/g (24,5 cm³/g) +/- 0,01 dl/g (1 cm³/g).

[0059] Os parâmetros físicos supracitados podem ser medidos por Cromatografia por Exclusão de Tamanho HPLC. Um instrumento adequado é um Viscotek GPC max VE2001, equipado com Triple Detection Parameters (Viscotek TDA 305): refratômetro, viscosímetro capilar e espalhamento de luz.

[0060] As medições do espalhamento de luz caracterizam a distribuição do tamanho de partícula pela medição da variação angular em intensidade da luz espalhada enquanto um feixe de laser passa através de uma amostra de particulado disperso. Partículas grandes espalham a luz em ângulos relativamente menores do que o feixe de laser e partículas pequenas espalham a luz em ângulos relativamente maiores. Os dados da intensidade do espalhamento angular são então analisados para calcular o tamanho das partículas responsáveis por criar o padrão

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15/37 de espalhamento, usando a Teoria Mie de espalhamento da luz. O tamanho da partícula é informado como o diâmetro da esfera de volume equivalente. A Cromatografia por Exclusão de Tamanho (SEC) é uma técnica analítica que separa as macromoléculas dissolvidas por tamanho com base na sua eluição de colunas abastecidas com um gel poroso. Quando a SEC for associada ao espalhamento da luz, viscosímetro e detectores de concentração (conhecida como detecção tripla), o peso molecular, tamanho molecular e viscosidade intrínseca podem ser medidos.

[0061] Em um protocolo de medição típico, o ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio (0,2 g) é solubilizado em tampão TBS (100 ml) mediante agitação por 1 hora a 45°C, antes de armazenar a solução por mais 2 horas em temperatura ambiente sob agitação para hidratar completamente o polímero. A solução é filtrada através de um filtro de seringa de náilon de 0,2 μιτι. Depois disso a solução é injetada em SEC LALS HPLC (100 μΙ). A análise é realizada a 0,35 ml/min com tampão TBS pH 7 a 35°C. O tempo de processamento normal é de 90 minutos e o volume típico de injeção é de 100 μΙ.

[0062] O ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio é um material preferencial para uso nos métodos e preparações cosméticas, em particular nas composições para cuidado da pele, da presente invenção. Acredita-se que o uso de um material de baixo peso molecular é vantajoso porque as suas propriedades de penetração na pele são superiores às das frações de pesos moleculares mais altos.

[0063] O ácido hialurônico ou seu sal de sódio pode ser acetilado de acordo com as metodologias conhecidas na técnica.

[0064] Em um método adequado, o ácido hialurônico é dissolvido em uma mistura de anidrido acético e ácido acético. Depois disso, um ácido forte como o ácido sulfúrico é adicionado à solução, para efetuar

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16/37 a acetilação. Esse método está descrito no documento EP 0 725 083 B1.

[0065] Em uma modalidade da invenção, a razão da mistura (p/p) entre ácido acético e anidrido acético pode variar na faixa de 1:4 a 1:1. A razão da mistura (p/p) entre o ácido forte e o ácido hialurônico pode ser de 1:5 a 1:1.

[0066] A requerente notou de forma surpreendente que um grau de acetilação particularmente alto pode ser obtido se na reação de acetilação for utilizado um ácido hialurônico de baixo peso molecular como material de partida. Sem buscar vínculos teóricos, acredita-se que o ácido hialurônico de baixo peso molecular seja acetilado mais facilmente e mais extensivamente do que um material de partida com alto peso molecular porque os grupos hidroxila são menos impedidos estericamente no material de partida de baixo peso molecular e, portanto, mais facilmente acetilados. Por este motivo, é preferível preparar o ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio da presente invenção usando como substrato de partida um ácido hialurônico ou sal de sódio de baixo peso molecular.

[0067] Por conseguinte, em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de acetilação do ácido hialurônico, no qual o material de partida do ácido hialurônico é uma fração de baixo peso molecular com um peso molecular médio em peso igual ou menor que cerca de 50 kDa, mais particularmente igual ou menor que cerca de 35 kDa, e ainda mais particularmente igual ou menor que cerca de 30 kDa.

[0068] Utilizando um substrato de ácido hialurônico com o baixo peso molecular mencionado, é possível preparar um ácido hialurônico altamente acetilado, ou seu sal de sódio, com um peso molecular médio em peso (PM) igual ou menor que 50 kDa, mais particularmente igual ou menor que 35 kDa, mais particularmente igual ou menor que cerca

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17/37 de 30 kDa, mais particularmente igual ou menor que 25 kDa, mais particularmente igual ou menor que 20 kDa, mais particularmente igual ou menor que 15 kDa, e ainda mais particularmente igual ou menor que cerca de 10 kDa a 15 kDa, por exemplo, 13 kDa +/-1 kDa. Essas formas de baixo peso molecular do ácido hialurônico acetilado e do acetil hialuronato de sódio constituem aspectos adicionais da presente invenção.

[0069] Um método para preparar o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio, o dito método compreendendo as etapas de selecionar um ácido hialurônico de baixo peso molecular com peso molecular médio em peso igual ou menor que cerca de 50 kDa, mais particularmente igual ou menor que cerca de 35 kDa, e ainda mais particularmente igual ou menor que cerca de 30 kDa, e fazêlo reagir em condições de acetilação, por exemplo, as condições aqui descritas, constituem mais um aspecto da invenção.

[0070] Por meio do procedimento sintético descrito acima, obtém-se uma mistura de reação bruta contendo o ácido hialurônico acetilado desejado, da qual o ácido hialurônico acetilado é preferencialmente isolado e purificado.

[0071] Portanto, a invenção fornece em outro dos seus aspectos um método de isolamento do ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular de uma mistura de reação bruta contendo o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular em solução.

[0072] Em uma modalidade particular da invenção, o método de isolamento do ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular compreende a etapa de precipitar o ácido da solução usando água de adição.

[0073] O baixo peso molecular característico do ácido hialurônico acetilado permite que a etapa de precipitação seja realizada usando água de adição, invés de um solvente orgânico volátil de adição. Isso contrasta com os processos da técnica anterior que empregam solventes orgânicos voláteis de adição, como acetona, para precipitar os sais

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18/37 de sódio do ácido hialurônico acetilado a partir de uma mistura de reação bruta.

[0074] Dada a dificuldade de se remover todo o solvente orgânico durante o work-up (marcha de obtenção e desenvolvimento do produto da reação), os sais de sódio do ácido hialurônico formados conforme os processos da técnica anterior podem conter resíduos do solvente volátil, o que pode ser indesejável. Uma vantagem preponderante da presente invenção é poder obter um ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular isento de solventes orgânicos voláteis, como acetona.

[0075] O ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular que está isento de resíduos de solvente orgânico volátil constitui outro aspecto da invenção.

[0076] Ademais, o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular, isento do solvente orgânico volátil, também pode ser convertido no seu sal de sódio, conforme o método descrito abaixo, e o sal de sódio do ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular, isento dos solventes orgânicos voláteis, constitui um aspecto adicional da presente invenção.

[0077] Antes da etapa de precipitação, talvez seja desejável remover da mistura da reação, ao menos parcialmente, o ácido acético e o anidrido acético não consumidos. O ácido acético é um solvente para o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular, e a sua remoção parcial, junto com o anidrido acético, facilita a precipitação do ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ao permitir que a etapa de precipitação seja realizada com volumes relativamente pequenos de água de adição.

[0078] A mistura de ácido acético/anidrido acético pode ser removida por destilação, deixando a mistura de reação bruta na forma de uma pasta viscosa constituída basicamente pelo ácido hialurônico ace

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19/37 tilado de baixo peso molecular desejado. Em seguida, água é adicionada a essa mistura bruta para concluir a precipitação. A mistura destilada de ácido acético/anidrido acético pode ser coletada e reciclada.

[0079] Em uma modalidade preferencial da invenção, a quantidade de água de adição é 1 a 5 equivalentes em peso, mais particularmente 2 a 4 equivalentes em peso por uma parte da mistura da reação bruta contendo o ácido hialurônico acetilado desejado. À medida que adicionamos água à mistura da reação, qualquer anidrido residual acético é hidrolisado. A hidrólise fortemente exotérmica é realizada, preferencialmente, para que a temperatura da massa da reação não ultrapasse 40°C.

[0080] O ácido acético/anidrido acético pode ser removido por destilação. Antes da etapa de destilação, pode ser desejável neutralizar qualquer ácido forte na mistura da reação para evitar o contato do ácido hialurônico acetilado com o ácido forte em condições de refluxo, o que pode levar ao desenvolvimento de uma descoloração indesejável. O ajuste do pH da mistura da reação bruta antes da precipitação, portanto, é uma etapa de processo preferencial em um processo de isolamento e purificação de acordo com a invenção.

[0081] Por conseguinte, em outro aspecto, a invenção fornece um método para isolar o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular de uma mistura de reação contendo o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular em solução, o dito método compreendendo a etapa de precipitar o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular da solução em pH 5 a 8 usando água de adição.

[0082] Em uma modalidade particular, a invenção fornece um método para isolar o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular de uma mistura de reação contendo o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular em solução, o dito método compreendendo a etapa de ajustar o pH da mistura de reação para um pH na faixa de 5 a

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20/37 e precipitar o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular dessa solução usando água de adição.

[0083] Para os propósitos da presente invenção, o pH pode ser ajustado com um agente de tamponamento adequado, por exemplo fosfatos, acetatos e citratos conhecidos para essa finalidade, e mais particularmente, o tamponamento é efetuado pela adição de uma quantidade eficaz de acetato de sódio.

[0084] O ácido hialurônico acetilado precipitado pode ser separado e isolado dos demais componentes da mistura de reação mediante filtração em filtro adequado, como qualquer filtro têxtil de malha fina conhecido para essa finalidade.

[0085] O ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular precipitado pode ser submetido a procedimentos de work-up adicionais depois da precipitação. Por exemplo, ele pode ser lavado com água para remover eventuais traços de impurezas solúveis em água, antes de secar o material precipitado para produzir o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular na forma de um pó branco e brilhante de fluxo livre com nenhum ou quase nenhum matiz amarelado.

[0086] O ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular pode ser usado nessa forma nos métodos e preparações cosméticas, em particular nas composições para cuidado da pele, da presente invenção.

[0087] Neste estágio, também pode ser desejável submeter o ácido hialurônico acetilado a procedimentos de work-up adicionais, como uma etapa de branqueamento ou polimento para remover qualquer coloração amarela indesejada usando, por exemplo, carbono ativado. Depois disso, o ácido hialurônico purificado acetilado pode ser secado, opcionalmente a vácuo, para proporcionar o ácido hialurônico acetilado na forma adequada para uso nos métodos e preparações cosméticas da presente invenção sem modificação adicional.

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21/37 [0088] Em alternativa, pode ser desejável converter o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular no seu sal de sódio.

[0089] O ácido hialurônico acetilado da presente invenção pode ser convertido no seu sal de sódio correspondente através de uma etapa de neutralização.

[0090] A neutralização pode ser efetuada adicionando uma fonte aquosa de íons sódio, como hidróxido de sódio, acetato de sódio ou qualquer outra base adequada que contenha um íon sódio, a uma suspensão ou solução aquosa do ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular.

[0091] A etapa de neutralização pode ser realizada na temperatura de 0 a 30°C, e o tempo de reação pode variar na faixa de 0,5 a 12 horas. [0092] Durante a neutralização, é desejável que a base, por exemplo, hidróxido de sódio, seja adicionada lentamente à solução ou suspensão do ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular para não acumular concentrações consideráveis da base, e para que o pH não ultrapasse cerca de 9, mais particularmente cerca de 8, mais particularmente cerca de 7,5, mais particularmente cerca de 7, e ainda mais particularmente cerca de 6,5. Desta maneira, subprodutos indesejáveis não são gerados e o desenvolvimento da descoloração indesejável é evitado.

[0093] O curso da reação de neutralização pode ser seguido convenientemente acompanhando o pH da mistura de reação, e uma solução neutralizada do acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular correspondente é obtido quando o pH atinge 6,5 +/- 0,5.

[0094] A solução de acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular, que constitui outro aspecto da invenção, pode ser usada nessa forma nos métodos e preparações cosméticas, em particular nas composições para cuidado da pele, da presente invenção sem modificação

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22/37 adicional. No entanto, se a intenção for utilizar a solução de acetil hialuronato de sódio como matéria prima nas ditas composições e métodos, é desejável incorporar à solução um agente antimicrobiano adequado, que são agentes bastante conhecidos na técnica.

[0095] Em alternativa, o acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular pode ser processado adicionalmente para ser produzido em forma sólida, mais particularmente em forma de pó.

[0096] Os métodos da técnica anterior para isolamento do acetil hialuronato de sódio em forma sólida compreendem a etapa de precipitar o dito composto de uma solução de acetona aquosa usando acetona pura. No entanto, quando isolado e purificado dessa maneira, existe a possibilidade de resíduos do solvente orgânico volátil permanecerem no produto acabado e, de maneira geral, esses solventes devem ser evitados ao máximo (ou removidos quando apropriado) para satisfazer as especificações do produto e outras características de qualidade que tipicamente possam ser exigidas das matérias primas destinadas ao uso na indústria cosmética.

[0097] Além disso, dada a elevada solubilidade do acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular em água, solventes orgânicos voláteis, e em misturas desses compostos, ele não pode ser fornecido na forma sólida por precipitação.

[0098] Outro aspecto da presente invenção, portanto, se baseia no objetivo de fornecer um método para a produção do acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular livre de solventes orgânicos voláteis em forma sólida, e de preferência em forma de pó, que é branco brilhante, de fluxo livre e fácil manipulação.

[0099] A requerente atingiu esses objetivos e fornece um método para converter uma solução aquosa do acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular para a forma em pó, o dito método compreendendo a etapa de desidratar a solução de acetil hialuronato de sódio de

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23/37 baixo peso molecular. A etapa de desidratação pode ser efetuada usando técnicas conhecidas, como liofilização. No entanto, mais preferencialmente, a etapa de desidratação é efetuada usando secagem por pulverização.

[0100] De acordo, a invenção fornece, em outro aspecto, um método para desidratar um meio aquoso líquido, e em particular uma solução, contendo acetil hialuronato de sódio, em particular, acetil hialuronato de sódio formado de acordo com um processo aqui descrito.

[0101] Em uma modalidade, a invenção fornece o método descrito acima, sendo que o dito método compreende as etapas de atomizar o meio aquoso líquido em forma de gotas dentro de uma câmara de secagem mantida em condições que ensejam a evaporação do meio aquoso líquido para formar partículas do acetil hialuronato de sódio.

[0102] Em uma modalidade mais particular, a temperatura de entrada da câmara de secagem por pulverização é de cerca de 150°C, e a temperatura de saída da câmara de secagem por pulverização é igual ou menor que 70°C aproximadamente.

[0103] Em uma modalidade ainda mais particular, o ar é bombeado para dentro da câmara de secagem para reduzir a temperatura de saída da câmara de secagem a cerca de 40 a 50°C.

[0104] O acetil hialuronato de sódio seco por pulverização, que constitui outro aspecto da presente invenção, exibe propriedades desejáveis, como elevada densidade a granel, forma e fluidez, que facilitam a manipulação, transporte e uso do produto. Evitar um produto em pó de baixa densidade é uma vantagem particular do acetil hialuronato de sódio seco por pulverização.

[0105] O acetil hialuronato de sódio seco por pulverização é formado com brancura e clareza suficientes, o que é eminentemente adequado para uso em produtos destinados às aplicações cosméticas, e em particular para as composições para cuidado da pele.

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24/37 [0106] O produto seco por pulverização formado de acordo com um processo descrito acima constituiu outro aspecto da invenção.

[0107] Tanto o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular como o acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular são facilmente incorporados às preparações cosméticas, e em particular às composições para cuidado da pele. Graças ao peso molecular muito baixo e à forma física em pó, eles não são viscosos ou grumosos e podem ser facilmente dissolvidos ou suspendidos em meios aquosos e misturados às bases cosméticas.

[0108] Ademais, como ingredientes altamente coloridos podem ser inaceitáveis como matérias primas para os fabricantes de preparações cosméticas, é altamente vantajoso que o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular e o acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular possam ser preparados como pós brancos com nenhum, ou substancialmente nenhum, matiz amarelado, e que não alterem ou prejudiquem o tom de cor de qualquer preparação cosmética em que sejam incorporados, independentemente da quantidade do material empregado na preparação cosmética.

[0109] Ao término do work-up do ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio, podemos conduzir uma etapa de branqueamento ou polimento através da qual qualquer leve descoloração é removida por um agente de branqueamento adequado, por exemplo, uma argila ou uma forma de carbono ativado. No entanto, essas etapas não são particularmente eficientes para descolorir esses produtos se estes já estiverem altamente descoloridos como consequência do processo sintético.

[0110] Uma característica da presente invenção é que os métodos de preparação e isolamento aqui descritos fornecem o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular e o acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular como produtos que estão sob a forma de pós

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25/37 brancos com brilho e clareza suficientes que, caso uma etapa de branqueamento ou polimento seja necessária, ela é capaz de descolorir efetivamente os produtos.

[0111] Mais particularmente, os métodos de preparação e isolamento aqui descritos fornecem o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular e o acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular como produtos que estão sob a forma de pós brancos, cada um deles com um valor L* igual ou maior que 90; e um valor b*, que é menor que 8, sendo que os valores L* e b* representam as coordenadas de cromaticidade do sistema CIELAB.

[0112] A luminância e a matiz de um pó podem ser caracterizadas pelas coordenadas de cromaticidade CIELAB L* a* b* de acordo com os métodos colorimétricos conhecidos na técnica. O valor L* é um valor que especifica a luminância de uma substância e é indicado por um valor entre 0 e 100. Um valor L* igual a 100 indica o estado mais claro (completamente branco), e um valor L* igual a 0 indica o estado mais escuro (completamente preto). O valor b* especifica a matiz azul-amarelada de uma substância. Quanto maior o valor b*, mais intenso o tom de amarelo. Quanto menor o valor b*, mais intenso o tom de azul.

[0113] O valor L* e o valor b* podem ser medidos com qualquer espectrofotômetro comercialmente disponível adequado, como o Minolta CM3500d. O espectrofotômetro deve ser ligado pelo menos uma hora antes da medição. Um recipiente de vidro deve ser abastecido pela metade com o produto sólido a ser medido, tendo-se o cuidado de verificar que o fundo do recipiente esteja completamente coberto com o produto. Depois disso, o recipiente abastecido deve ser colocado no suporte de amostra fornecido. A tecla da amostra no instrumento deve ser pressionada e os valores L* e b* lidos no painel do visor. Antes de tomar as leituras, o instrumento deve ser calibrado para reflexão zero e 100%

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26/37 posicionando os objetos brancos e pretos fornecidos para essa finalidade na janela do sensor óptico dos instrumentos.

[0114] Segue abaixo uma série de exemplos ilustrativos da invenção.

Exemplo 1: Método para Fabricação do Acetil Hialuronato de Sódio

Ácido hialurônico PM 28702 Da

C14H20N NaOn [401.30]

20-30 kDa

AcgO [102.03]

AcOH [60.02]

H₂SO₄ [98.08]

NaOAc [82.03]

Acetil hialuronato

C22H29NO15 [547.46]

Acetil hialuronato de sódio θ22^28^Οΐ5Ν3 [569.45] [0115] Um reator de 5 I foi lavado com nitrogênio e carregado com ácido hialurônico (Renovhyal™ fabricado pela Soliance, peso molecular 10-50 kDa; 300 g, 0,7 mol). Anidrido acético de classificação comercial (2160 g, 21,2 mol) e ácido acético (525 g, 8.7 mol) foram adicionados e a temperatura da suspensão foi definida para 25°C. Ácido sulfúrico 96% (194 g, 1,9 mol) foi adicionado ao longo do período de 10 minutos. A temperatura foi mantida a 25°C pelo controle interno. A agitação continuou por 15 horas. O controle interno foi desligado e acetato de sódio (154 g, 1,9 mol) foi adicionado mediante agitação. A temperatura subiu para 35°C e a agitação continuou por 30 minutos. O reator foi evacuado para 40 mbar e a temperatura da camisa foi definida para 50°C. Ao longo do período de 5 horas, uma mistura de anidrido acético e ácido acético foi removida por destilação (1343 g). O conteúdo restante, levemente pastoso, mas ainda possível de ser agitado, do reator foi resfriado até a temperatura ambiente e água (5500 ml) foi adicionada (de início com muita cautela), mantendo a temperatura da mistura sempre abaixo de 50°C. Aos poucos foi formada uma suspensão branca fina. Os sólidos foram isolados por filtração e lavados com água (10 I). Os sólidos foram então ressuspendidos em água (700 ml) e a mistura neutralizada

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27/37 (pH 6,5) com a adição de NaOH 1M (600 ml) para produzir uma solução de acetil hialuronato de sódio (1520 g, c = 0,11 g/g). A solução foi seca por pulverização para produzir o acetil hialuronato de sódio (175 g, 0,3 mol, 44% de rendimento) como um pó fino de fluxo livre. A análise pelo experimento de HSQC-RMN indicou um grau de acetilação de 3,9.

Exemplo 2: Método para Isolar o Acetil Hialuronato de Sódio Através da Técnica de Secagem por Pulverização [0116] A secagem por pulverização de uma solução aquosa de acetil hialuronato de sódio a 11% foi realizada usando um secador pulverizador GEA VERSATILE-SD™ 6.3, equipado com um atomizador rotativo, aplicando os seguintes parâmetros:

- Temperatura de alimentação: 15°C

- Temperatura de entrada: 150°C

- Temperatura de saída: 70°C

- Taxa de alimentação: 20 kg/h

- Velocidade da ventoinha: 400 kg ar/h

- Velocidade das rodas: 12000 rpm [0117] Um pó branco de fluxo livre de acetil hialuronato de sódio foi obtido.

Exemplo 3: Citotoxicidade [0118] As avaliações citotóxicas preliminares do acetil hialuronato de sódio em fibroblastos e melanócitos foram efetuadas por um teste de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio). Em resumo, as células foram semeadas em placas de cultura com 96 cavidades e tratadas com acetil hialuronato de sódio em diferentes concentrações de 10, 5, 1, 0,5, 0,1,0,05, 0,01, e 0,005 mg/ml, respectivamente, por 24 horas e 48 horas. A citotoxicidade foi avaliada pela solução de MTT (5 mg/ml diluída a 1/6 em tampão fosfato-salino (PBS)). As placas foram incubadas por 4 horas a 37°C ao abrigo da luz. O produto púrpura

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28/37 insolúvel Formazan foi dissolvido em 50 μΙ de DMSO e a densidade óptica foi lida a 560 nm com uma leitora de microplacas (TECAN).

	Fibroblastos	Melanócitos
Acetil hialuronato de sódio	24h	48h	24h	48h
10 mg/ml	67	45	77	83
5 mg/ml	74	66	82	90
1 mg/ml	89	84	84	91
0,5 mg/ml	87	93	88	94
0,1 mg/ml	100	107	93	93
0,05 mg/ml	109	110	91	91
0,01 mg/ml	105	112	96	96
0,005 mg/ml	99	120	88	102
Quadro 1: Avaliação de citotoxicidade efetuada pe	o teste de MTT em

fibroblastos e melanócitos [0119] Quanto ao impacto do acetil hialuronato de sódio sobre os fibroblastos em termos de citotoxicidade, a citotoxicidade foi induzida apenas nas concentrações de 10 e 5 mg/ml. Abaixo dessas doses, nenhum efeito foi observado.

[0120] Quanto ao impacto sobre os melanócitos, apenas a concentração 10 mg/ml do acetil hialuronato de sódio mostrou um efeito citotóxico. Abaixo dessa dose, não houve efeito sobre os melanócitos (quadro 1).

[0121] A concentração ótima que pode ser utilizada sem induzir efeitos tóxicos em cada tipo de célula foi determinada como 0,1 mg/ml para fibroblastos e de 0,5 mg/ml para melanócitos. Essas concentrações foram empregadas no decorrer das investigações biológicas.

Exemplo 4: Avaliação Transcriptômica [0122] A fim de identificar a potencial atividade biológica do acetil hialuronato de sódio, uma análise transcriptômica in vitro foi efetuada em dois tipos de células presentes na pele, incluindo melanócitos e fibroblastos. Foi estudada em 128 genes distribuídos em duas placas transcriptômicas. Uma primeira placa era específica para a função da

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29/37 derme com muitos genes envolvidos na matriz extracelular, remodelamento da matriz, defesas à oxidação, respostas ao estresse, cura de ferimentos e outras funções biológicas. Uma segunda placa foi específica para funções de pigmentação da pele com os genes mais importantes envolvidos na síntese da melanina, formação e maturação de melanossomas e outras funções atreladas aos melanócitos.

[0123] A análise transcriptômica foi realizada por Rt-qPCR (Reação em Cadeia de Polimerização com Quantificação em Tempo Real) usando ensaios TaqMan em três repetições para cada tipo de célula. Em resumo, depois de 24 horas de estimulação das células com 0,1 mg/ml para fibroblastos e 0,5 mg/ml para melanócitos, o RNA total foi extraído pelo método Trizol. O RNA total foi quantificado com o espectrômetro e as concentrações ajustadas para 400 ng/μΙ. A qualidade do RNA foi verificada por migração em gel de agarose. O RNA total foi retrotranscrito em cDNA usando um kit Verso de cDNA seguindo as recomendações do fornecedor. A transcrição reversa foi validada por PCR clássica direcionada ao gene de manutenção: o gene RPL32. O cDNA foi então utilizado para realizar a RT-qPCR na qual 10 ng do cDNA foi depositado por cavidade usando um ensaio de TaqMan.

[0124] Os resultados obtidos estão representados no quadro 2 abaixo. Uma indução acima de 1,3 vezes (positiva ou negativa) em comparação com a condição não tratada é considerada um indício de uma modificação biológica.

	Nome do gene	Dobra de Indução
Derme (NHDF)	MMP-1	-1,51 (*) vezes
MMP-3	-1,35 (*) vezes
Pigmentação (NHM)	HPS4	+1,82 (*) vezes
MITF	+1,28 (*) vezes
ENDR6	+1,33 (*) vezes

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Quadro 2: Genes que são modulados significativamente pelo acetil hialuronato de sódio em fibroblastos (derme) e melanócitos (pigmentação). p<0,05 *

Exemplo 5: Impacto do Acetil Hialuronato de Sódio em Fibroblastos (Derme) [0125] Quanto aos resultados relativos à derme, MMP-1 e MMP-3 são duas metaloproteinases da matriz envolvidas na degradação da matriz, como o colágeno do tipo I, que é o colágeno mais importante presente na derme.

[0126] Durante o envelhecimento, a produção de MMPs aumenta, causando a degradação da matriz intradérmica, que promove o colapso da pele e a formação de rugas. Esses são os primeiros sinais visíveis do envelhecimento cutâneo.

[0127] Esse fenômeno pode ser acelerado por fatores externos, como a exposição ao UV. De fato, o UV induz o estresse oxidativo na pele, que é responsável por um aumento substancial da liberação das MMPs, as quais, por seu turno, promovem o envelhecimento prematuro da pele pela intensa degradação da matriz.

[0128] Os resultados transcriptômicos sugerem que o acetil hialuronato de sódio podería limitar esse efeito pela regulação negativa da MMP-1 e MMP-3 (quadro 2).

[0129] Foi desenvolvido um modelo de envelhecimento in vitro específico capaz de superexpressar a MMP-1 e a MMP-3 pelo estresse oxidativo (H2O2 100μΜ - 200μΜ por 2 horas) nos fibroblastos. Em resumo, fibroblastos foram pré-condicionados com acetil hialuronato de sódio (0,1 mg/ml) em meio basal por 2 horas antes da indução do estresse oxidativo. Em seguida ao estresse oxidativo, os fibroblastos foram incubados por 48 horas em meio basal a 37°C, permitindo que as MMPs se acumulassem no meio de cultura. A quantidade de MMP-1 e MMP-3 liberada pelos sobrenadantes foi então estimada pelo método

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31/37 multiplex usando a tecnologia Luminex (princípio do ELISA em esferas).

Liberação da MMP-1:

MMP-1	Isento de ativo	Acetil hialuronato de sódio (0,1 mg/ml)	Hialuronato de sódio (0,1 mg/ml)
H2O2IOO μΜ	1,48	0,80 (*; 46%)	1 (ns; 32%)
Η202200 μΜ	1,95	1,17(*;-40%)	1,61 (ns;-17%)

Quadro 3: Impacto do acetil hialuronato de sódio sobre a liberação da MMP-1 induzida por estresse oxidativo in vitro sobre os fibroblastos (expresso em Unidades Arbitrárias). * = p<0,05; ns = não significativo. Os valores percentuais mostrados em parênteses refletem o grau de inibição induzido pelo acetil hialuronato de sódio ou hialuronato de sódio em relação à ausência de ativo.

[0130] Foi demonstrado que o acetil hialuronato de sódio reduziu significativamente a secreção de MMP-1 mediada pelo estresse oxidativo no nível da proteína. Inversamente, constatou-se que o hialuronato de sódio não conseguiu reproduzir esse efeito, confirmando que os efeitos observados decorreram da modificação na acetilação (quadro 3). Estudo comparativo sobre a liberação da MMP-1:

[0131] Para comparação, os efeitos do (a) produto da presente invenção, (b) hialuronato monoacetato e (c) hialuronato acetilado de acordo com o documento EP 0 725 083 (da Shiseido; grau médio de acetilação de cerca de 3,6; PM cerca de 100 kDa) sobre a MMP-1 foram investigados observando o seguinte procedimento:

[0132] Fibroblastos da biópsia abdominal de uma mulher caucasiana (26 anos de idade) foram semeados em placas de 12 cavidades à densidade de 200.000 células/cavidade em 1 ml de meio completo (ZenBio, ref. DF-1). Passadas 24 horas do plaqueamento, o meio completo foi substituído por meio basal sem soro (Zen-Bio, ref. DF-2). Após 24 horas de cultura em meio basal, as células foram pré-incubadas com os produtos de teste a 0,1 mg/ml por 2 horas a 37°C e em seguida expostas ao estresse oxidativo (H2O2 200 μΜ) por 2 horas a 37°C. O meio de

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32/37 cultura foi substituído por meio basal e as células incubadas por mais 48 horas a 37°C. O sobrenadante foi coletado e armazenado a -80°C até análise.

[0133] A MMP-1 foi quantificada usando o kit de ELISA para MMP1 Humana RayBio®, um ensaio imunoadsorvente ligado à enzima in vitro para a medição quantitativa das formas ativas e pró-ativas da MMP1 humana no soro, plasma, e sobrenadantes da cultura de células. Esse ensaio usa um anticorpo específico para a MMP-1 humana revestido em uma placa de 96 cavidades. Os padrões e as amostras são pipetados e depositados nas cavidades, e a MMP-1 presente em uma amostra se liga às cavidades pelo anticorpo imobilizado. As cavidades são lavadas e o anticorpo anti-MMP-1 humana biotinilado é adicionado. Depois de lavar o anticorpo biotinilado não ligado, a estreptavidina conjugada com HRP é pipetada e depositada nas cavidades. As cavidades são novamente lavadas e uma solução do substrato TMB (3,3',5'5'-tetrametilbenzidina) é adicionada às cavidades, havendo o desenvolvimento de uma coloração proporcional à quantidade da MMP-1 ligada. A Solução de Interrupção muda a cor de azul para amarelo, e a intensidade da cor é medida a 450 nm.

[0134] A MMP-1 foi medida após diluição 1/100 das amostras, em três repetições. A curva padrão foi realizada com duas repetições. A partir das concentrações padronizadas da MMP-1 de 18.000, 6.000, 2.000, 666,7, 222,2, 74,07 e 24,69 pg/ml, uma regressão logística de quatro parâmetros foi calculada.

[0135] Os resultados são mostrados na Figura 1.

[0136] Em condição basal, notou-se que apenas o hialuronato de sódio acetilado da presente invenção (a) induziu uma inibição significativa da produção da MMP-1 (-23%). O hialuronato monoacetato (b) não reproduziu o efeito, mostrando inclusive um efeito oposto, com um aumento na produção da MMP-1 (+44%). O ácido hialurônico acetilado da

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Sisheido (c) não teve efeito significativo sobre a liberação da MMP-1 nessa condição experimental (+3%).

[0137] Sob estresse oxidativo mediado por uma H2O2 (sem 0 tratamento com hialuronato acetilado) a fim de reproduzir 0 efeito do envelhecimento, foi observada uma produção excessiva significativa da MMP-1 (+103%), que validou 0 experimento.

[0138] Uma pré-incubação com 0 hialuronato de sódio acetilado da presente invenção (a) induziu uma redução significativa na produção da MMP-1 mediada pelo estresse, enquanto os outros dois produtos mostraram efeito inverso, com +63% e +12% para 0 hialuronato monoacetato (b) e 0 ácido hialurônico acetilado da Sisheido (c), respectivamente. [0139] Como conclusão, apenas 0 hialuronato de sódio acetilado da presente invenção (a) apresenta uma atividade eficiente para inibir a liberação da MMP-1 em basal e na presença de estresse oxidativo (similar ao envelhecimento).

Liberação da MMP-3:

MMP-3	Isento de ativo	Acetil hialuronato de sódio (0,1 mg/ml)	Hialuronato de sódio (0,1 mg/ml)
H2O2IOO μΜ	1,25	0,91 (*; -27%)	1,03 (ns; 18%)
H202200 μΜ	1,83	1,15 (*; -37%)	1,39 (ns; -24%)

Quadro 4: Impacto do acetil hialuronato de sódio sobre a liberação da MMP-3 induzida por estresse oxidativo in vitro em fibroblastos (expresso em Unidades Arbitrárias). * = p<0,05; ns = não significativo. Os valores percentuais mostrados em parênteses refletem 0 grau de inibição induzida pelo acetil hialuronato de sódio em relação à ausência de ativo (sem acetil hialuronato de sódio).

[0140] Foi demonstrado que 0 acetil hialuronato de sódio reduziu significativamente a secreção da MMP-3 mediada por estresse oxidativo no nível da proteína. Inversamente, constatou-se que 0 hialuronato de sódio não conseguiu reproduzir esse efeito, confirmando que os efeitos observados decorreram da modificação na acetilação (quadro 4).

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Medições da Fluorescência [0141] As MMPs são liberadas sob duas formas que englobam a pró-forma inativa (pró-MMP) e a forma ativa com o pró-peptídeo clivado (MMP). Apenas as MMPs ativas são capazes de induzir a degradação do colágeno. O colágeno do tipo I DQ, que é um colágeno do tipo I fluorescente acoplado a um quencher, foi usado. Quando degradado, ele promove a liberação e a emissão de fluorescência pelo quencher. Por fim, a fluorescência emitida, que é proporcional à degradação do colágeno, foi medida. Esse experimento foi conduzido exatamente nas mesmas condições experimentais usadas para quantificar a secreção de MMP-1 e MMP-3. Em resumo, o sobrenadante foi incubado com o colágeno-DQ por 4 horas à temperatura ambiente e a fluorescência medida pela Leitora de Microplacas (TECAN) com comprimento de onda de excitação de 495 nm e comprimento de onda de emissão de 515 nm.

	Isento de ativo	Acetil hialuronato de sódio (0,1 mg/ml)	Hialuronato de sódio (0,1 mg/ml)
H2O2IOO μΜ	157%	130% (ns; -17%)	160% (ns;+1%)
H2O22OO μΜ	157%	91% (*; -42%)	149% (ns; -5%)

Quadro 5: Impacto do acetil hialuronato de sódio sobre a degradação do colágeno do tipo I após estresse oxidativo in vitro em fibroblastos (expresso em Unidades Arbitrárias). * = p<0,05; ns = não significativo. Os valores percentuais mostrados em parênteses refletem o grau de inibição induzido pelo acetil hialuronato de sódio ou hialuronato de sódio em relação à ausência de ativo.

[0142] Foi observado que o acetil hialuronato de sódio reduzia a degradação do colágeno-DQ de acordo com a observação da redução no nível de fluorescência (quadro 5). Esses resultados demonstraram que o acetil hialuronato de sódio limita a liberação das formas ativas da MMP-1 e MMP-3 responsáveis pela degradação do colágeno-DQ. Sobretudo, esses resultados in vitro provaram que o acetil hialuronato de sódio possui uma atividade antienvelhecimento que se dá pelo impacto

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35/37 no remodelamento da matriz, que está envolvida nos sinais visíveis do envelhecimento cutâneo. Na verdade, a substância limita o envelhecimento através de uma expressão negativa da MMP-1 e MMP-3 que controlam a degradação da matriz, como o colágeno do tipo I. Além disso, o hialuronato de sódio não conseguiu promover os mesmos resultados, confirmando que a bioatividade está associada à modificação acetilada (quadro 5).

Exemplo 6: Impacto do Acetil Hialuronato de Sódio Nos Melanócitos (Melanócitos)

Função de pigmentação [0143] Quanto à função de pigmentação, foi constatado que o acetil hialuronato de sódio induziu um aumento significativo das expressões dos genes HPS4, MITF e ENDR6 no nível transcriptômico. Esses resultados sugerem que ele possa ter uma propriedade pró-pigmentadora. O efeito do acetil hialuronato de sódio sobre a síntese da melanina in vitro foi analisado em melanócitos em condição basal e em condições estimuladas mediadas pela adição do substrato L-Tirosina. Em resumo, com relação à condição basal, melanócitos foram incubados em placa de 24 cavidades para 24 horas de cultura. O meio foi então substituído por meio de cultura com ou sem acetil hialuronato de sódio ou hialuronato de sódio não modificado nas concentrações de 0,1,0,25, 0,5, e 1 mg/ml, respectivamente, ou referência (L-tirosina 1 mM). As células foram incubadas por 10 dias com duas renovações de tratamento no 3^Q e 7^Q dia posteriores à incubação.

		Basal
	controle	100%
L-tirosina 1 mM	302% (“‘ ; +202%)
Acetil hialuronato de sódio	0,1 mg/ml	101% (ns, +2%)
0,25 mg/ml	99% (ns ; -1%)
0,5 mg/ml	90% (**; -10%)
1 mg/ml	86% (“ ; -14%)

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Hialuronato de sódio	0,1 mg/ml	103% (ns ; +3%)
0,25 mg/ml	90% (“‘; -10%)
0,5 mg/ml	95% (“‘; -10%)
1 mg/ml	94% (“ ; -6%)

Quadro 6: Impacto do acetil hialuronato de sódio sobre a síntese da melanina in vitro em melanócitos em condição basal (expresso em % das condições de controle). ** = p<0,01 **; *** = p<0,001; ns = não significativo. Os valores percentuais em parênteses refletem os efeitos exercidos pelos compostos testados (L-tirosina, acetil hialuronato de sódio e hialuronato de sódio em relação ao desempenho na ausência do composto de teste (controle)).

[0144] Os resultados mostraram que o acetil hialuronato de sódio induz uma redução na síntese da melanina na condição basal com um efeito dependente da dose (+2% a 0,1 mg/ml e -9% a 1 mg/ml). O hialuronato de sódio não modificado foi menos eficiente, demonstrando que a acetilação melhora a atividade biológica do hialuronato de sódio. Estimulação [0145] No que concerne à condição estimulada, melanócitos foram incubados em placas de 24 cavidades para 24 horas de cultura. O meio foi então substituído por meio de cultura contendo L-tirosina (1 mM) suplementado com acetil hialuronato de sódio ou hialuronato de sódio não modificado nas concentrações de 0,1,0,25, 0,5, e 1 mg/ml, respectivamente, ou referência (Ácido Lipoico 5 pg/ml). As células foram incubadas por 10 dias com duas renovações do tratamento no 3^Q e 7^Q dia posteriores incubação.

		Estimulados com L-tirosina 1 mM
	Controle (L-tirosina 1 mM)	100 %
Ácido Lipoico (5pG/ml)	27% (*** ; -73%)
Acetil hialuronato de sódio	0,1 mg/ml	105% (** ; +5%)
0,25 mg/ml	103% (ns ; +3%)
0,5 mg/ml	98% (ns ; -2%)
1 mg/ml	89% (*** ;-11%)

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Hialuronato de sódio	0,1 mg/ml	105% (*; +5%)
0,25 mg/ml	98% (ns ; -2%)
0,5 mg/ml	100% (ns)
1 mg/ml	102% (ns ; +2%)

Quadro 7: Impacto do acetil hialuronato de sódio sobre a síntese in vitro da melanina em melanócitos na condição estimulada (expressa em % da condição de controle L-tirosina 1 mM). * = p<0,05 ; ** = p<0,01; *** = p<0,001; ns = não significativo. Os valores percentuais em parênteses refletem os efeitos exercidos pelos compostos testados (Ácido Lipoico, acetil hialuronato de sódio e hialuronato de sódio em relação ao desempenho na ausência do composto de teste (controle)).

[0146] Os resultados mostraram que o acetil hialuronato de sódio induz um aumento na síntese da melanina com um efeito inverso conforme as doses (+11% a 0,1 mg/ml e -7% em 1 mg/ml). O hialuronato de sódio não modificado foi menos eficiente, demonstrando que a acetilação melhora a atividade biológica do hialuronato de sódio.

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição para cuidado da pele contendo ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio, caracterizado por o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio ter um peso molecular médio em peso igual ou menor que 50 kDa e um grau de acetilação médio maior que 3,6.
2. 2. Composição para cuidado da pele, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio ter um grau de acetilação médio igual ou maior que 3,7, mais particularmente igual ou maior que 3,8, mais particularmente igual ou maior que 3,9, e ainda mais particularmente igual a 4,0.
3. 3. Composição para cuidado da pele, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio ter um peso molecular médio em peso igual ou menor que 35 kDa, mais particularmente igual ou menor que cerca de 30 kDa.
4. 4. Composição para cuidado da pele, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio ter um índice de polidispersividade que é menor que 2,0, mais particularmente menor que 1,8, mais particularmente menor que 1,7, mais particularmente menor que 1,6 ou menor, mais particularmente menor que 1,5, e ainda mais particularmente menor que cerca de 1,4.
5. 5. Composição para cuidado da pele, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o grau de acetilação ser determinado por RMN-2D quantitativa.
6. 6. Método de preparação de um ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio que tem um peso molecular médio em peso igual ou menor que 50 kDa e um grau de acetilação

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   2/3 médio maior que 3,6, caracterizado por compreender as etapas de:

   (i) selecionar um ácido hialurônico de baixo peso molecular que tem um peso molecular igual ou menor que 50 kDa, mais particularmente igual ou menor que 35 kDa, ou ainda mais particularmente igual ou menor que 30 kDa;

   (ii) expor o ácido acima a condições de acetilação, em que as condições de acetilação incluindo, de preferência, a etapa de reagir o ácido hialurônico de baixo peso molecular com uma mistura de ácido acético/anidrido acético na presença de um ácido forte; e (iii) isolar o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular, de preferência por precipitação usando água de adição.
7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender ainda a etapa de:

   (iv) reagir o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular com uma base que fornece uma fonte de íons sódio para obter uma solução de acetil hialuronato de sódio.
8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a conversão do ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular no acetil hialuronato de sódio ser realizada em um pH não maior que 9, mais particularmente não maior que 8, mais particularmente não maior que 7, e ainda mais particularmente não maior que 6,5.
9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado por compreender ainda a etapa de:

   (v) desidratar a solução por liofilização ou secagem por pulverização.
10. 10. Ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio com um peso molecular médio em peso igual ou menor que 50 kDa e grau de acetilação médio maior que 3,6, caracterizado por estar na forma de um pó branco com um valor L* igual ou maior que cerca de 90, e um valor b* menor que cerca de 8.

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11. 11. Método para inibir a degradação da matriz extracelular da pele associada aos elevados níveis de enzimas degradadoras da matriz, caracterizado por compreender a etapa de aplicar à pele uma quantidade eficaz da composição para cuidado da pele como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio como definido na reivindicação 10.
12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por reduzir os sinais visíveis do envelhecimento na pele.
13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado por as enzimas degradadoras da matriz serem metaloproteinases, em particular MMP-1 ou MMP-3.
14. 14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado por o ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio inibir a degradação do colágeno na matriz extracelular.