RU2788453C2 - Улучшения в органических соединениях или улучшения, относящиеся к органическим соединениям - Google Patents
Улучшения в органических соединениях или улучшения, относящиеся к органическим соединениям Download PDFInfo
- Publication number
- RU2788453C2 RU2788453C2 RU2019128243A RU2019128243A RU2788453C2 RU 2788453 C2 RU2788453 C2 RU 2788453C2 RU 2019128243 A RU2019128243 A RU 2019128243A RU 2019128243 A RU2019128243 A RU 2019128243A RU 2788453 C2 RU2788453 C2 RU 2788453C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- molecular weight
- hyaluronic acid
- low molecular
- acetylated hyaluronic
- sodium salt
- Prior art date
Links
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 title 2
- MAKUBRYLFHZREJ-JWBQXVCJSA-M sodium;(2S,3S,4R,5R,6R)-3-[(2S,3R,5S,6R)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5,6-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C([O-])=O)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O MAKUBRYLFHZREJ-JWBQXVCJSA-M 0.000 claims abstract description 145
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims abstract description 130
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims abstract description 130
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 claims abstract description 83
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims abstract description 60
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 40
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 35
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000001965 increased Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims abstract description 5
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 62
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 62
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 102100018200 MMP1 Human genes 0.000 claims description 31
- 101700019781 MMP1 Proteins 0.000 claims description 31
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims description 31
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 17
- 101700040359 MMP3 Proteins 0.000 claims description 15
- 102100014893 MMP3 Human genes 0.000 claims description 14
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 11
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 11
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 claims description 11
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 11
- 230000001603 reducing Effects 0.000 claims description 11
- 210000002744 Extracellular Matrix Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- 238000005084 2D-nuclear magnetic resonance Methods 0.000 claims description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 7
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 claims description 6
- 102000036690 extracellular matrix enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108091007011 extracellular matrix enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 3
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 claims description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 39
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000003679 aging effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 21
- 229940014041 hyaluronate Drugs 0.000 description 18
- 210000002752 Melanocytes Anatomy 0.000 description 17
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 17
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 14
- 108009000330 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 14
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 14
- 108009000578 Oxidative Stress Proteins 0.000 description 12
- 229940010747 Sodium Hyaluronate Drugs 0.000 description 12
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 12
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002609 media Substances 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 8
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 7
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 7
- 210000004207 Dermis Anatomy 0.000 description 7
- -1 ether sulfates Chemical class 0.000 description 7
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 7
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 6
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 6
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 6
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 6
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 6
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 5
- 229960004441 Tyrosine Drugs 0.000 description 5
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 5
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 5
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 5
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 5
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 4
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 4
- 229940110715 ENZYMES FOR TREATMENT OF WOUNDS AND ULCERS Drugs 0.000 description 4
- 206010062080 Pigmentation disease Diseases 0.000 description 4
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000397 acetylating Effects 0.000 description 4
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 4
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005591 charge neutralization Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 4
- 230000001376 precipitating Effects 0.000 description 4
- 238000002700 transcriptomic Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000003712 anti-aging Effects 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 3
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 3
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036912 Bioavailability Effects 0.000 description 2
- 102000020504 Collagenase family Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase family Proteins 0.000 description 2
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 2
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 2
- 101700054771 GCA Proteins 0.000 description 2
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 101700061402 MTRX Proteins 0.000 description 2
- 101710017884 Segment-8 Proteins 0.000 description 2
- 230000035514 bioavailability Effects 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000002222 downregulating Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000000865 liniment Substances 0.000 description 2
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-N lipoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000011068 load Methods 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 2
- 101700045377 mvp1 Proteins 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000007665 sagging Methods 0.000 description 2
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 108091007018 stromelysin Proteins 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 description 2
- 125000002306 tributylsilyl group Chemical group C(CCC)[Si](CCCC)(CCCC)* 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- 230000037373 wrinkle formation Effects 0.000 description 2
- DPUYCSDGMSDKKV-MKBYFEBXSA-N (2S)-1-[(2S)-2-[[2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-acetamido-4-methylpentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-methylbutanoyl]-N-methylpyrrolidine-2-carboxamide Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NC DPUYCSDGMSDKKV-MKBYFEBXSA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000002469 Basement Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 description 1
- 210000001736 Capillaries Anatomy 0.000 description 1
- 210000003467 Cheek Anatomy 0.000 description 1
- 229940096422 Collagen Type I Drugs 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical class OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-SPPYGRLSSA-N Digitonin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H](O)C[C@]3(C)[C@@H]4[C@H]([C@@H]5[C@H](O)[C@@H]6O[C@]7([C@@H](C)[C@@H]6[C@@]5(C)CC4)OC[C@H](C)CC7)CC[C@H]3C2)O[C@H]1CO)[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O[C@H]3[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO2)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UVYVLBIGDKGWPX-SPPYGRLSSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 1
- 206010014970 Ephelide Diseases 0.000 description 1
- 210000002615 Epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 241000017049 Gea Species 0.000 description 1
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 description 1
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 description 1
- 229940097043 Glucuronic Acid Drugs 0.000 description 1
- 102100003680 HPS4 Human genes 0.000 description 1
- 101700007154 HPS4 Proteins 0.000 description 1
- 230000036499 Half live Effects 0.000 description 1
- 238000009015 Human TaqMan MicroRNA Assay kit Methods 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 208000000069 Hyperpigmentation Diseases 0.000 description 1
- 210000002510 Keratinocytes Anatomy 0.000 description 1
- 208000001126 Keratosis Diseases 0.000 description 1
- 108030001567 Leishmanolysins Proteins 0.000 description 1
- 101710005595 MRPL32 Proteins 0.000 description 1
- 229920002521 Macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 102000000422 Matrix Metalloproteinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 210000002780 Melanosomes Anatomy 0.000 description 1
- 235000010654 Melissa officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 240000004119 Melissa officinalis Species 0.000 description 1
- 102000036688 Metzincins Human genes 0.000 description 1
- 102000013760 Microphthalmia-Associated Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010050345 Microphthalmia-Associated Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 210000004080 Milk Anatomy 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N N'-amino-N-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-Acetylglucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 229950006780 N-Acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 240000008962 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 206010051246 Photodermatosis Diseases 0.000 description 1
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229940068965 Polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101710005285 RPL30 Proteins 0.000 description 1
- 101710005290 RPL32 Proteins 0.000 description 1
- 102100017209 RPL32 Human genes 0.000 description 1
- 101700000491 SAB Proteins 0.000 description 1
- 210000004927 Skin cells Anatomy 0.000 description 1
- 206010040925 Skin striae Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 230000036462 Unbound Effects 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atoms Chemical group 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering Effects 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical class 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 229910052570 clay Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N digitonin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO7)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@@H](CO)O5)O)C[C@@H]4CC[C@H]3[C@@H]2[C@@H]1O)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 230000000534 elicitor Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N glucosamine group Chemical group OC1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000036074 healthy skin Effects 0.000 description 1
- 231100001045 histological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036732 histological change Effects 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003810 hyperpigmentation Effects 0.000 description 1
- 231100001006 hyperpigmentation Toxicity 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000001911 insensitive nuclei enhancement by polarisation transfer Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 235000011929 mousse Nutrition 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 239000007908 nanoemulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000847 nonoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000000238 one-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000000485 pigmenting Effects 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000037380 skin damage Effects 0.000 description 1
- 230000004215 skin function Effects 0.000 description 1
- 230000037335 skin penetration Effects 0.000 description 1
- 231100000245 skin permeability Toxicity 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 238000001374 small-angle light scattering Methods 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 230000037327 stress response Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical Effects 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-QIUUJYRFSA-N β-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-QIUUJYRFSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Группа изобретений относится к уходу за кожей. Композиция для ухода за кожей содержит низкомолекулярную ацетилированную гиалуроновую кислоту или ее натриевую соль, при этом низкомолекулярная ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль имеет средневзвешенную молекулярную массу от 10 до 15 кДа, среднюю степень ацетилирования больше чем 3,8 и показатель полидисперсности меньше чем 1,5. Также раскрыты способ получения низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты, способ получения натриевой соли низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты, порошок низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли для ухода за кожей, способ подавления разрушения внеклеточного матрикса кожи, ассоциированного с повышенными уровнями разрушающих матрикс ферментов. Группа изобретений обеспечивает лечение видимых эффектов старения на человеческой коже. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 6 пр.
Description
Изобретение относится к активным ингредиентам и способам, которые являются полезными для уменьшения видимых признаков старения на человеческой коже. Более конкретно, изобретение относится к применению ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли для подавления некоторых разрушающих матрикс ферментов, которые вовлечены в вызванное временем и ультрафиолетовым (УФ) излучением повреждение кожи. Изобретение также относится к новым формам ацетилированной гиалуроновой кислоты, полезным для уменьшения видимых признаков старения, и к способам их получения.
Желание выглядеть привлекательно естественно поощряется современных потребителей. Несмотря на то, что идеал привлекательности претерпевает изменения с течением времени, повсеместно признается, что состояние и внешний вид нашей кожи представляет собой важное составляющее в привлекательности внешнего вида.
Потребителям в настоящее время предлагается множество косметических продуктов для ухода за кожей. Как правило, эти продукты находятся в форме кремов и лосьонов, содержащих воду для увлажнения кожи и жиры и липиды для ее повторного смазывания, и они оказывают воздействие на самый внешний слой кожи.
Смягчающее кожу воздействие гиалуроновой кислоты известно из уровня техники. Тем не менее, также известно, что физическое состояние гиалуроновой кислоты в косметических препаратах со временем ухудшается. Ацетилированная гиалуроновая кислота была предложена в ЕР 0725083 в качестве альтернативы гиалуроновой кислоте, поскольку сообщалось, что она обладает такими же самыми смягчающими кожу функциями, как и гиалуроновая кислота, но не демонстрирует того же самого ухудшения физического состояния, как свободная кислота. Однако в ЕР 0725083 не предложено или не намекается на применение ацетилированной гиалуроновой кислоты в лечении эффектов старения на коже или вызывающих его причин.
Существует несколько описаний ацетилированной гиалуроновой кислоты и ацетилгиалуроната с различными степенями замещения ацетила, имеющих низкую молекулярную массу (ЕР 0725083; и CN 106176286) и промежуточную молекулярную массу (Saturnino et al. в Biomed Research International, 2014, 921549: "Acetylated hyaluronic acid: enhanced bioavailability and biological studies"; и Oka et al. в Polymer, 41: "Differential scanning calorimetry studies on the mechanism of skin-softening effect of sodium acetylhyaluronate"), которые могут быть использованы при уходе за кожей. Однако, как будет показано ниже, эти продукты обладают существенными недостатками по сравнению с продуктом по настоящему изобретению.
Обеспечение эффективных косметических препаратов, полезных для лечения причин старения кожи и за счет этого уменьшения видимых признаков старения, остается неудовлетворенной потребностью.
Структурный каркас кожи называется ее внеклеточным матриксом. Этот внутренний каркас включает сеть из сцепленных между собой полимеров, таких как коллаген и эластин, внутри которых содержатся клетки кожи. Он отвечает за механические свойства кожи, включая твердость, прочность, упругость и эластичность. Физические показатели старения кожи отражают состояние матрикса кожи. Более конкретно, чем слабее и менее регулярен матрикс, тем больше морщин, шероховатостей и растяжек будет на коже.
Внеклеточный матрикс кожи представляет собой важный ресурс, который в здоровой и молодой коже как продуцируется, так и потребляется. Гладкость, твердость и молодость человеческой кожи в значительной степени зависят от состояния ее матрикса, который, в свою очередь, зависит от баланса синтеза матрикса и разрушения/рециклинга матрикса. Внеклеточный матрикс кожи состоит из коллагенов (коллаген I типа является наиболее преобладающим); эластинов и других компонентов, таких как гликозаминогликаны (GAG). Матрикс синтезируется фибробластами в дерме и подвергается ремоделированию несколькими специфическими ферментами (металлопротеиназы матрикса или ММР). Эти ферменты обычно вовлечены в заживление ран, однако они демонстрируют увеличенную экспрессию во время старения, вызванного временем или УФ, вследствие чего они способствуют интенсивному и неконтролируемому разрушению матрикса, которое, как известно, ответственно за видимые признаки старения, такие как стягивание кожи и образование морщин. Существует приблизительно 20 ММР, которые сгруппированы в различные категории в зависимости от их субстратной специфичности. Среди них находятся коллагеназы, желатиназы, стромелизины и ММР мембранного типа. ММР-1 представляет собой наиболее известную коллагеназу вовлеченную в расщепление структурных коллагенов, таких как коллаген 1 типа. ММР-3 представляет собой стромелизин, который вовлечен в расщепление коллагенов базальной мембраны, таких как коллаген IV.
Белки матрикса представляют собой большие структурные молекулы, которые обладают длительными периода полувыведения (порядка 70 лет в случае эластина). Следовательно, эти вещества сложно восполнять или обновлять в течение обычной человеческой жизни. Существует само прогрессирующее изменение и разрушение матрикса, которое ускоряется с возрастом, разрушая и ослабляя каркас кожи и создавая видимые признаки старения.
Старение кожи представляет собой результат присущего ей процесса старения со временем, на который накладываются факторы окружающей среды, преимущественно состоящие из воздействия ультрафиолетового излучения. Уровни ММР широко увеличиваются в процессе нормального возрастного старения, и факторы окружающей среды действуют таким образом, что дополнительно увеличивают уровни ММР. Уменьшение уровней ферментов ММР и возвращение их к нормальным для молодого возраста уровням, которое достаточно для того, чтобы предотвратить разрушение матрикса, и сохранить здоровый матрикс, может способствовать уменьшению или устранению видимых признаков старения на человеческой коже.
Остается потребность в обеспечении способами и косметическими препаратами для нанесения на кожу, которые могут обратить или уменьшить разрушение матрикса кожи путем подавления или уменьшения увеличенных уровней ферментов, разрушающих матрикс, таких как ММР, до сбалансированных уровней, обнаруживаемых в молодой или здоровой коже.
Изобретение относится к применению ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли (ацетилгиалуронат натрия) для контроля баланса разрушающих матрикс веществ во внеклеточном матриксе кожи, уменьшения степени разрушения важнейших белков матрикса, таких как коллаген, и для уменьшения видимых признаков старения (вызванных временем и вызванных окружающей средой), в частности, для предупреждения или уменьшения морщин на коже и для достижения и поддержания молодо выглядящей кожи.
Соответственно, изобретение охватывает следующие аспекты и воплощения:
Способ подавления разрушения внеклеточного матрикса кожи, ассоциированного с повышенными уровнями разрушающих матрикс ферментов, где указанный способ включает стадию нанесения на кожу эффективного количества ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли, в частности в форме композиции по уходу за кожей по настоящему изобретению.
Описанный выше способ, который представляет собой способ уменьшения видимых признаков старения кожи, более конкретно способ предупреждения или уменьшения морщин.
Описанный выше способ, где разрушающие матрикс ферменты представляют собой металлопротеиназы матрикса, и более конкретно ферменты ММР-1 или ММР-3.
Описанный выше способ, где ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль действует для уменьшения степени разрушения коллагена во внеклеточном матриксе, в частности его разрушения металлопротеиназами.
Низкомолекулярная фракция ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли с высокой степенью ацетилирования для применения в описанном здесь способе.
Описанные выше ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль имеют средневзвешенную молекулярную массу приблизительно 50 кДа или меньше, более конкретно приблизительно 35 кДа или меньше, и еще более конкретно приблизительно 30 кДа или меньше.
Ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль, описанные выше, имеющие средневзвешенную молекулярную массу приблизительно 50 кДа или меньше, более конкретно приблизительно 35 кДа или меньше, и еще более конкретно приблизительно 30 кДа или меньше, и показатель полидисперсности, составляющий меньше чем 2,3, более конкретно меньше чем 2,0, более конкретно меньше чем 1,8, более конкретно меньше чем 1,7, более конкретно меньше чем 1,6 или менее, более конкретно меньше чем 1,5, более конкретно меньше чем 1,4, и более конкретно приблизительно 1,3 или менее.
Ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль, описанные выше, имеющие степень ацетилирования, больше чем 3,6, более конкретно 3,7 или больше, более конкретно 3,8 или больше, более конкретно 3,9 или больше, и более конкретно 4.
Ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль, описанные выше, имеющие степень ацетилирования больше чем 3,6, более конкретно 3,7 или больше, более конкретно 3,8 или больше, более конкретно 3,9 или больше, и более конкретно 4, определенные с использованием количественного 2D NMR (ядерного магнитного резонанса).
Способ получения низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли, имеющих средневзвешенную молекулярную массу 50 кДа или меньше, и среднюю степень ацетилирования больше чем 3,6, включающий стадии
(1) отбора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты, имеющей молекулярную массу 50 кДа или меньше, более конкретно 35 кДа или меньше, или еще более конкретно 30 кДа или меньше;
(2) подвергания ее условиям ацетилирования, где условия ацетилирования предпочтительно включают стадию взаимодействия низкомолекулярной гиалуроновой кислоты со смесью уксусной кислоты/уксусного ангидрида в присутствии сильной кислоты; и
(3) выделения низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты, предпочтительно путем осаждения с помощью добавления воды.
Косметический препарат, включающий эффективное количество ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли, которые описаны выше.
Композиция для ухода за кожей, включающая низкомолекулярную ацетилированную гиалуроновую кислоту или ее натриевую соль, отличающуюся тем, что низкомолекулярная ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль имеют средневзвешенную молекулярную массу 50 кДа или меньше и среднюю степень ацетилирования больше чем 3,6.
Косметический препарат и, в частности, композиция для ухода за кожей, описанные выше, включающие по меньшей мере один косметически приемлемый эксципиент.
Эти и другие аспекты изобретения будут лучше понятны в свете следующего подробного описания конкретных воплощений изобретения.
«Старение кожи» представляет собой термин, который относится к изменениям, которым подвергается кожа с возрастом, как вследствие старения с возрастом, так и путем воздействия на кожу солнца (фотостарение) или путем других агентов окружающей среды, таких как табачный дым, экстремальные климатические условия холода, тепла или ветра, химические примеси или загрязнения, и включает все внешние видимые и/или изменения, различимые путем прикосновения, таких как развитие неровностей на коже, таких как морщины, тонкие морщины, складки, неровности или шероховатости, увеличение размера пор, утрата эластичности, утрата прочности, утрата гладкости, утрата способности восстанавливаться после деформации, провисание кожи, такое как провисшие щеки, появление мешков под глазами или появление двойного подбородка, среди прочего, изменения цвета кожи, такие как пятна, покраснение или появление областей сверхпигментации, таких как возрастные пятна или веснушки, аномальная дифференцировка, гиперкератинизация, эластоз, кератоз, утрата структуры коллагена и другие гистологические изменения рогового слоя дермы или эпидермиса, но не ограничиваясь ими.
Известно, что увеличенный уровень металлопротеиназ матрикса (ММР) представляет собой ключевой фактор в старении кожи. ММР, такие как ММР-1 и ММР-3, вовлечены в разрушение матрикса, и в частности в разрушение коллагена I типа, который представляет собой наиболее важный тип коллагена, находящийся в дерме. Во время процесса возрастного старения, а также в результате воздействия УФ излучения и воздействия других агентов окружающей среды, продукция ММР увеличивается, что приводит к разрушению дермы, стягиванию кожи, образованию морщин, то есть к первым видимым симптомам старения кожи.
Неожиданно, обнаружили, что ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль, способны уменьшать уровни ММР, в частности ММР-1 и ММР-3. Заявитель полагает, не желая быть связанным теорией, что сниженный уровень ММР является результатом подавления генов, кодирующих эти ферменты.
Биологическое действие ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли по настоящему изобретению продемонстрировано в нескольких исследованиях по экспрессии генов, проведенных на трех основных типах клеток, присутствующих в коже: фибробластах, кератиноцитах и меланоцитах. Биологическое воздействие ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли также определяли при помощи белковых и функциональных исследований in vitro. Авторы изобретения обнаружили существование новой активности против старения, связанной с ограниченным разрушением матрикса и защитой кожи от симптомов старения. Эти исследования описаны более подробно далее в примерах.
В то же время обнаружили, что ацетилированная гиалуроновая кислота, описанная в CN 106176286 (полученная из Bloomage Freda Biopharm Co., Ltd.), не вызывает какого-либо генного ответа.
Обнаружение того, что ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль, при нанесении на кожу, могут вызывать биологическое действие, проявляемое как уменьшение видимых признаков старения кожи, такое как уменьшение морщин на коже, дает возможность специалисту в данной области техники создать косметические препараты для нанесения на кожу человека.
Косметические препараты, и в частности композиции по уходу за кожей, по настоящему изобретению содержат косметически приемлемое количество ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли.
Понятно, что косметически эффективное количество ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли будет нетоксичным, но достаточным количеством ацетилированной гиалуроновой кислоты или натриевой соли для обеспечения требуемого эффекта. В отношении общей массы косметического препарата, в частности композиции для ухода за кожей, ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль могут быть представлены в количествах от приблизительно 0,005 до приблизительно 5,0% по массе, и, более конкретно, от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,5% по массе.
Косметические препараты, и в частности композиции по уходу за кожей, по настоящему изобретению могут содержать один или более чем один косметически приемлемый эксципиент. Любые эксципиенты, обычно используемые при приготовлении косметических препаратов для нанесения на человеческую кожу, могут быть использованы в настоящем изобретении. Подходящие эксципиенты включают ингредиенты, которые могут влиять на органолептические свойства, проницаемость кожи и биологическую доступность ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли, но не ограничиваются ими. Более конкретно, они включают жидкости, такие как вода, масла или поверхностно-активные вещества, включая вещества из нефти, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как, без ограничения, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло, касторовое масло, полисорбаты, сложные эфиры сорбита, сульфаты простых эфиров, сульфаты, бетаины, гликозиды, мальтозиды, жирные спирты, ноноксинолы, полоксамеры, полиоксиэтилены, полиэтиленгликоли, декстрозу, глицерин, дигитонин и т.п.
Косметический препарат, и в частности композиция для ухода за кожей, может находиться в форме липосомной композиции, смешанных липосом, олеосом, ниосом, этосом, милличастиц, микрочастиц, наночастиц и наночастиц твердое вещество-липиды, везикул, мицелл, смешанных мицелл поверхностно-активных веществ, смешанных мицелл поверхностно-активное вещество-фосфолипид, миллисфер, микросфер и наносфер, липосфер, милликапсул, микрокапсул и нанокапсул, а также микроэмульсий и наноэмульсий, которые могут быть добавлены для достижения большей проникающей способности ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли.
Косметический препарат, и в частности композиция для ухода за кожей, может быть получена в любой из форм: твердой, жидкой или полутвердой, полезной для нанесения на кожу местно или путем трансдермального применения. Таким образом, эти препараты для местного или трансддермального применения включают крема, множественные эмульсии, такие как, без ограничения, эмульсии масло и/или силикон в воде, эмульсии вода-в-масле и/или силиконе, эмульсии типа вода/масло/вода или вода/силикон/вода и эмульсии типа масло/вода/масло или силикон/вода/силикон, микроэмульсии, эмульсии и/или растворы, жидкие кристаллы, безводные композиции, водные дисперсии, масла, молоко, бальзамы, пены, водные или масляные лосьоны, водные или масляные гели, крем, водно-спиртовые растворы, водно-гликолевые растворы, гидрогели, линименты, серум, мыла, маски для лица, сыворотки, полисахаридные пленки, мази, муссы, помады, пасты, порошки, пластинки, карандаши и спреи или аэрозоли (спреи), включая не смываемые и смываемые композиции.
Обнаружение того, что ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль вызывает биологическое действие, было особенно неожиданным с учетом того, что не возможно вызвать это действие при использовании немодифицированной гиалуроновой кислоты или соли, что подтверждает то, что активность связана с ацетилированием формы свободной кислоты или соли.
Особенно предпочтительные формы ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли для использования в настоящем изобретении отличаются тем, что они обладают очень высокой степенью ацетилирования. Более конкретно, предпочтительные формы ацетилированной гиалуроновой кислоты отличаются средней степенью ацетилирования больше чем 3,6, более конкретно 3,7 или выше, более конкретно 3,8 или выше, более конкретно 3,9 или выше, и более конкретно 4.
Гиалуроновая кислота представляет собой полисахарид, состоящий из повторяющегося мономера, содержащего N-ацетилглюкозамин и глюкуроновую кислоту. Она может существовать в форме свободной кислоты или в форме натриевой соли. В ацетилированной форме термин "степень ацетилирования" понимают как показатель количества гидроксильных групп на повторяющейся полимерной единице, которые являются ацетилированными. Каждая повторяющаяся единица полимера нативной гиалуроновой кислоты/соли содержит четыре гидрокисльные группы, которые могут быть ацетилированными, и степень ацетилирования представляет собой показатель того, сколько этих групп замещены ацетильной группой.
Измерение степени ацетилирования особенно затруднено при использовании обычных аналитических способов. Например, авторы изобретения обнаружили, что традиционный одномерный NMR (ядерный магнитный резонанс) является неэффективным из-за совмещения химических сдвигов протонов, которые необходимо измерять.
Тем не менее, заявитель выявил аналитический способ с использованием двухмерного NMR, при котором N-ацетильную группу на глюкозаминовой группировке гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли используют в качестве внутреннего стандарта для количественного определения ацетильной функциональной группы, введенной в процессе ацетилирования.
Для интегрирования этих двух типов сигналов (О-ацетильная группа и N-ацетил) заявитель внес поправки в метод 2D-NMR. Более конкретно, способ 2D-NMR представляет собой гетеронуклеарный способ (анализ при помощи гетероядерной спектроскопии с одноквантовым переносом когеренции (HSQC)), измеряющий протонный сигнал в одном измерении, и сигнал с ядра углерода во втором измерении.
Путем использования метода 2D-NMR заявитель обнаружил, что является возможным ясно отличать N-ацетильный сигнал от сигналов, связанных с О-ацетильными группами, что позволяет сделать объемную интеграцию этих групп, и, таким образом, обеспечивает количественное определение степени ацетилирования. Основная схема подходящего эксперимента HSQC изложена в следующих параграфах.
Анализ степени ацетилирования осуществляют при помощи способа 1Н-13С HSQC, усиленного градиентом, позволяющего объемную интеграцию для приведенных ацетильных групп количественным образом.
Константа связывания 1H-13C обеспечивает информацию, касающуюся связи атомов в молекуле, и при NMR спектроскопии ответственна за появление множества сигналов в спектре. Объемы интегрирования перекрестных пиков в эксперименте HSQC модулируются при помощи константы связывания 1H-13C 1JC,H. Однако перекрестные пики, возникающие в результате различных констант связывания, обычно не допускают количественной интеграции. Однако заявитель успешно обнаружил, что в случае настоящего аналитического способа 1JC,H(N-ацетил) была по существу равна 1JC,H(O-ацетил), что позволяет провести количественный анализ.
В качестве стандартных количественных определений 1D-NMR достаточная релаксационная задержка может гарантировать, чтобы как N-ацетильный, так и О-ацетильный, протоны имели время для релаксации между одним сканом и другим для того, чтобы оставаться в пределах количественных условий. Кроме того, для ограничения дифференцированной Т2 релаксации между N- и О-ацетильными интересующими группами в последовательности, две задержки, заданные (4 X JC,H)-1 в переносе INEPT (нечувствительные ядра, усиленные за счет поляризационного переноса) в HSQC были максимально короткими, например приблизительно 1,5 миллисекунд.
Измерения 2D-NMR могут быть осуществлены на любом приборе высокого поля, существующем в области техники. Пример подходящего прибора представляет собой прибор NMR с полем высокой напряженности, оборудованный системой измерения линейных величин Cryoprobe, более конкретно Bruker Avance III 600 МГц, MicroCryoprode TCI 1,7 мм.
Образцы для анализа могут быть приготовлены в виде 1,2 мг ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли, растворенной в 50 мл D2O с 99,96% D. Раствор с образцом может быть перенесен в пробирку для NMR (1,7 мм, Bruker) для измерения. Типичные параметры измерения включают: Т=60°C; количество сканов = 4; холостые сканы = 32; задержка для восстановления = 10 с; время экспозиции = 177 мс; ширина спектра (1Н)=6,0 млн-1; ширина спектра (13С)=110 млн-1; смещение 1H-импульса = 3,5 млн-1; смещение 13С-импульса = 60 млн-1; временной интервал (1Н)=1272; временной интервал (13С)=256. Программное обеспечение для регистрации и обработки данных, включающее интеграцию перекрестных пиков, представляет собой Top Spin 3.0 (Bruker).
В частности, этот метод 2D-NMR позволяет отличить ацетилированную гиалуроновую кислоту или натриевую соль по настоящему изобретению от продукта, описанного в ЕР 0725083, и представленного на рынке Shiseido: ацетилгиалуронат от Shiseido имеет среднюю степень ацетилирования лишь приблизительно 3,6. Это является важным, поскольку продукт Shiseido также оказывается уступающим продукту по настоящему изобретению в отношении противовозрастной активности, как показано в примере 5 далее.
Ацетилированная гиалуроновая кислота или натриевая соль, используемые в способах и косметических препаратах, в частности композиции по уходу за кожей, по настоящему изобретению представляет собой низкомолекулярную ацетилированную гиалуроновую кислоту или ее натриевую соль. Термин "низкомолекулярный" относится к полимерному материалу, имеющему средневзвешенную молекулярную массу (Mw), составляющую 50 кДа или меньше, более конкретно 35 кДа или меньше, более конкретно приблизительно 30 кДа или меньше, более конкретно 25 кДа или меньше, более конкретно 20 кДа или меньше, более конкретно 15 кДа или меньше, и еще более конкретно приблизительно от 10 кДа до 15 кДа, например 13 кДа ± 1 кДа.
Молекулярная масса полимерных фракций ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевая соли должны быть до некоторой степени узко диспергированы. Предпочтительно, ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль имеет показатель полидисперсности (Mw/Mn), который составляет меньше чем 2,0, более конкретно меньше чем 1,8, более конкретно меньше чем 1,7, более конкретно меньше чем 1,6 или меньше, более конкретно меньше чем 1,5, и более конкретно приблизительно 1,4 или меньше.
Для сравнения продукты, описанные в ЕР 0725083 (полученные от Shiseido) и CN 106176286 (полученные от Freda) анализировали при помощи SEC-HPLC (гель-фильтрационная хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография) с использованием детекции путем светорассеяния. Получили следующие результаты:
Собственная вязкость ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли предпочтительно меньше чем 0,3 дл/г (30 см3/г), и более конкретно 0,245 дл/г (24,5 см3/г) ± 0,01 дл/г (1 см3/г).
Вышеприведенные физические параметры могут быть измерены при помощи HPLC гель-фильтрационной хроматографии. Подходящий прибор представляет собой Viscotek GPC max VE2001, оборудованный тремя детекторами (Viscotek TDA 305): рефрактометром, капиллярным вискозиметром и детектором светорассеяния.
Измерения светорассеяния характеризуют распределение размеров частиц путем измерения углового изменения интенсивности света, рассеиваемого по мере того, как лазерный пучок проходит через образец с диспергированными частицами. Крупные частицы отражают свет с относительно меньшими углами по сравнению с лазерным пучком и небольшие частицы отражают свет с относительно большими углами. Данные по интенсивности углового светорассеяния затем анализировали для расчета размера частиц, ответственных за формирование картины рассеяния, с использованием теории Ми светорассеяния. Размер частиц приводят в виде диаметра сферы с эквивалентным объемом. Гель-фильтрационная хроматография (SEC) представляет собой аналитический способ, который разделяет растворенные макромолекулы по размеру на основе их элюирования с колонок, заполненных пористым гелем. Когда SEC сочетают с детектором светорассеяния, вискозиметром и детектором концентрации (известно как тройная детекция), тогда можно измерить молекулярную массу, молекулярный размер и собственную вязкость.
В типичном протоколе измерения ацетилированную гиалуроновую кислоту или ее натриевую соль (0,2 г) растворяют в буфере TBS (100 мл) путем перемешивания в течение 1 ч при 45°C, а затем хранения раствора в течение еще 2 ч при комнатной температуре при перемешивании для полной гидратации полимера. Раствор фильтруют через 0,2 мкм нейлоновый шприцевой фильтр. Раствор затем инжектируют в HPLC SEC LALS (100 мкл). Анализ осуществляют со скоростью 0,35 мл/мин с буфером TBS с рН 7 при 35°C. Типичное время анализа составляет 90 минут и типичный инжектируемый объем составляет 100 мкл.
Низкомолекулярная ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль представляет собой предпочтительное вещество для использования в способах и косметических препаратах, в частности композиций по уходу за кожей по настоящему изобретению. Полагают, что применение низкомолекулярного вещества является удобным из-за его превосходного свойства проникать через кожу по сравнению с высокомолекулярными фракциями.
Гиалуроновая кислота или ее натриевая соль могут быть ацетилированы в соответствии со способами, известными в области техники.
В подходящем способе гиалуроновую кислоту растворяют в смеси уксусного ангидрида и уксусной кислоты. После этого, сильную кислоту, такую как серная кислота, добавляют в раствор для осуществления ацетилирования. Такой способ описан в ЕР 0725083 В1.
В воплощении изобретения отношение смешивания (мас./мас.) уксусной кислоты к уксусному ангидриду может варьировать в пределах диапазона от 1:4 до 1:1. Отношение смешивания (мас./мас.) сильной кислоты к гиалуроновой кислоте может составлять от 1:5 до 1:1.
Заявитель неожиданно обнаружил, что особенно высокой степени ацетилирования можно достичь в том случае, если реакцию ацетилирования осуществлять с использованием низкомолекулярной гиалуроновой кислоты в качестве исходного вещества. Не желая быть связанными теорией, предполагают, что низкомолекулярная гиалуроновая кислота легче и в более значительной степени ацетилируется чем высокомолекулярное исходное вещество, поскольку гидроксильные группы менее стерически затруднены в низкомолекулярном исходном веществе и, таким образом, легче ацетилируются. По этой причине предпочтительно, чтобы ацетилированную гиалуроновую кислоту или ее натриевую соль по настоящему изобретению получали с использованием низкомолекулярной гиалуроновой кислоты или натриевой соли в качестве исходного субстрата.
Соответственно, в еще одном аспекте по настоящему изобретению предложен способ ацетилирования гиалуроновой кислоты, где исходное вещество гиалуроновая кислота представляет собой низкомолекулярную фракцию, имеющую средневзвешенную молекулярную массу приблизительно 50 кДа или меньше, более конкретно приблизительно 35 кДа или меньше, и еще более конкретно приблизительно 30 кДа или меньше.
Путем использования субстрата гиалуроновой кислоты, имеющей вышеупомянутую низкую молекулярную массу, можно получать гиалуроновую кислоту с высокой степенью ацетилирования или ее натриевую соль, имеющую средневзвешенную молекулярную массу (Mw) 50 кДа или меньше, более конкретно 35 кДа или меньше, более конкретно приблизительно 30 кДа или меньше, более конкретно 25 кДа или меньше, более конкретно 20 кДа или меньше, более конкретно 15 кДа или меньше, и еще более конкретно приблизительно от 10 кДа до 15 кДа, например 13 кДа ± 1 кДа. Эти низкомолекулярные формы ацетилированной гиалуроновой кислоты и ацетилгиалуроната натрия образуют дополнительные аспекты настоящего изобретения.
Способ получения низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли, где указанный способ включает стадии отбора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты, имеющей средневзвешенную молекулярную массу приблизительно 50 кДа или меньше, более конкретно приблизительно 35 кДа или меньше, и еще более конкретно приблизительно 30 кДа или меньше, и ее взаимодействие в ацетилирующих условиях, например описанных в настоящем описании условиях, образует еще один аспект настоящего изобретения.
При помощи описанного выше способа синтеза получают неочищенную реакционную смесь, содержащую требуемую ацетилированную гиалуроновую кислоту, из которой ацетилированную гиалуроновую кислоту предпочтительно выделяют и очищают.
Соответственно, в еще одном из аспектов изобретения предложен способ выделения низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты из неочищенной реакционной смеси, содержащей низкомолекулярную ацетилированную гиалуроновую кислоту в растворе.
В конкретном воплощении изобретения способ выделения низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты включает стадию ее осаждения из раствора с помощью добавления воды.
Характерная низкая молекулярная масса ацетилированной гиалуроновой кислоты дает возможность для осуществления стадии осаждения с помощью добавления воды, а не дополнительного летучего органического растворителя. Последнее противопоставляется способам предшествующего уровня техники, в которых для осаждения из неочищенной реакционной смеси натриевых солей ацетилированной гиалуроновой кислоты используют дополнительные летучие органические растворители, такие как ацетон.
Учитывая сложность удаления всех органических растворителей во время обработки, натриевые соли гиалуроновой кислоты, образующиеся в соответствии со способами предшествующего уровня техники, могут содержать остатки летучего растворителя, которые могут быть нежелательны. Значительное преимущество настоящего изобретения заключается в том, что может быть получена низкомолекулярная ацетилированная гиалуроновая кислота без летучих органических растворителей, таких как ацетон.
Низкомолекулярная ацетилированная гиалуроновая кислота, не содержащая остатков летучего органического растворителя, образует еще один аспект настоящего изобретения.
Кроме того, низкомолекулярная ацетилированная гиалуроновая кислота, не содержащая летучий органический растворитель, может быть далее превращена в свою натриевая соль в соответствии со способом, описанным ниже, и натриевая соль низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты, не содержащая летучие органические растворители, образует еще один аспект настоящего изобретения.
До стадии осаждения может быть желательно удалить, по меньшей мере частично, не прореагировавшую уксусную кислоту и уксусный ангидрид из реакционной смеси. Уксусная кислота является растворителем для низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты, и ее частичное удаление вместе с уксусным ангидридом облегчает осаждение низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты за счет того, что обеспечивает возможность для проведения стадии осаждения с относительно небольшими объемами добавленной воды.
Смесь уксусная кислота/уксусный ангидрид может быть удалена путем дистилляции, оставляющей неочищенную реакционную смесь в форме вязкой пасты, состоящей в основном из требуемой низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты. Затем к этой неочищенной смеси добавляют воду для осуществления осаждения. Дистиллированная смесь уксусная кислота/уксусный ангидрид может быть собрана и повторно использована.
В предпочтительном воплощении изобретения количество добавленной воды составляет от 1 до 5 массовых эквивалентов, более конкретно от 2 до 4 массовых эквивалентов на одну часть неочищенной реакционной смеси, содержащей требуемую ацетилированную гиалуроновую кислоту. По мере добавления воды к реакционной смеси остаточный уксусный ангидрид гидролизуется. Сильно экзотермический гидролиз предпочтительно осуществляют таким образом, что температура реакционной массы не превышает 40°C.
Удаление уксусной кислоты/уксусного ангидрида может быть осуществлено путем дистилляции. Перед стадией дистилляции может быть желательным нейтрализовать любую сильную кислоту в реакционной смеси для того, чтобы избежать контакта ацетилированной гиалуроновой кислоты с сильной кислотой в условиях дефлегмации, что может привести к возникновению нежелательного обесцвечивания. Таким образом, корректирование рН неочищенной реакционной смеси до осуществления осаждения является предпочтительной стадией в способе выделения и очистки в соответствии с настоящим изобретением.
Соответственно, в еще одном аспекте изобретения предложен способ выделения низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты из реакционной смеси, содержащей низкомолекулярную ацетилированную гиалуроновую кислоту в растворе, где указанный способ включает стадию осаждения низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты из раствора при рН от 5 до 8 с помощью добавления воды.
В конкретном воплощении изобретения предложен способ выделения низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты из реакционной смеси, содержащей низкомолекулярную ацетилированную гиалуроновую кислоту в растворе, где указанный способ включает стадию корректирования рН реакционной смеси до значения рН в диапазоне от 5 до 8 и осаждения низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты из этого раствора с помощью добавления воды.
Для цели настоящего изобретения корректирование рН может быть осуществлено с использованием подходящего буферного агента, например фосфатов, ацетатов и цитратов, известных для такой цели, и более конкретно, забуферивание осуществляют путем добавления эффективного количества ацетата натрия.
Осажденная ацетилированная гиалуроновая кислота может быть отделена и выделена из других компонентов реакционной смеси путем фильтрования через подходящий фильтр, такой как любой текстильный фильтр с малой величиной ячейки, известный для такой цели.
Осажденная низкомолекулярная ацетилированная гиалуроновая кислота может быть подвергнута дополнительным процедурам обработки после осаждения. Например, она может быть промыта водой для удаления каких-либо следов водорастворимых примесей до осуществления сушки осажденного вещества для того, чтобы получить низкомолекулярную ацетилированную гиалуроновую кислоту в форме светлого белого легкотекучего порошка без или практически без желтоватого оттенка.
Низкомолекулярная ацетилированная гиалуроновая кислота может быть использована в этой форме в способах и косметических препаратах, в частности в композициях по уходу за кожей по настоящему изобретению.
На этой стадии также может быть желательным подвергнуть ацетилированную гиалуроновую кислоту дополнительным процедурам обработки, таким как стадия отбеливания или полировки для удаления любого нежелательного желтого окраса с использованием, например, активированного угля. Очищенная ацетилированная гиалуроновая кислота после этого может быть высушена, возможно, в вакууме, с получением ацетилированной гиалуроновой кислоты в форме, подходящей для применения в способах и косметических препаратах по настоящему изобретению без дополнительной модификации.
Альтернативно, может быть желательным превратить низкомолекулярную ацетилированную гиалуроновую кислоту в ее натриевую соль.
Ацетилированная гиалуроновая кислота по настоящему изобретению может быть превращена в ее соответствующую натриевую соль при помощи стадии нейтрализации.
Нейтрализация может быть осуществлена путем добавления водного источника ионов натрия, такого как гидроксид натрия, ацетат натрия или любое другое подходящее содержащее ионы натрия основание, в водный раствор или суспензию низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты.
Стадия нейтрализации может быть осуществлена при температуре от 0 до 30°C, и время реакции может варьировать в диапазоне от 0,5 до 12 часов.
Во время нейтрализации желательно, чтобы основание, например гидроксид натрия, добавляли в раствор или суспензию низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты медленно для того, чтобы ощутимые концентрации основания не образовывались, и значение рН не превышало приблизительно 9, более конкретно приблизительно 8, более конкретно приблизительно 7,5, более конкретно приблизительно 7, и еще более конкретно приблизительно 6,5. Вследствие этого, не образуются никакие нежелательные побочные продукты, и удается избежать возникновение нежелательного обесцвечивания.
В течение реакции нейтрализации для удобства может быть осуществлено отслеживание рН реакционной смеси, и нейтрализованный раствор соответствующего низкомолекулярного ацетилгиалуроната натрия получают тогда, когда рН достигает 6,5±0,5.
Раствор низкомолекулярного ацетилгиалуроната натрия, который образует еще один аспект настоящего изобретения, может быть использован в этой форме в способах и косметических препаратах, в частности композициях по уходу за кожей по настоящему изобретению без дополнительной модификации. Тем не менее, если желательно использовать раствор ацетилгиалуроната натрия в виде неочищенного вещества в указанных композициях и способах, тогда желательно включать в раствор подходящий антимикробный агент, и такие агенты хорошо известны в области техники.
Альтернативно, низкомолекулярный ацетилгиалуронат натрия может быть дополнительно обработан для того, чтобы перевести его в твердую форму, более конкретно в форму порошка.
Способы предшествующего уровня техники для выделения ацетилгиалуроната натрия в его твердой форме включают стадию его осаждения из водного ацетонового раствора с использованием чистого ацетона. Тем не менее, выделение и очистка, осуществляемые таким путем, могут оставлять остатки летучего органического растворителя в конечном продукте, и этих растворителей по возможности, как правило, следует избегать (или при возможности удалять) для того, чтобы соответствовать спецификациям продукта и другим показателям качестве, которые, как правило, могут потребоваться от сырья, прдназначенного для применения в косметической промышленности.
Кроме того, вследствие высокой растворимости низкомолекулярного ацетилгиалуроната натрия в воде, в летучих органических растворителях, а также в их смесях, он не может быть получен в твердой форме путем осаждения.
Таким образом, еще один аспект по настоящему изобретению основан на задаче, заключающейся в том, чтобы предложить способ получения не содержащего летучий органический растворитель низкомолекулярного ацетилгиалуроната натрия в твердой форме, и предпочтительно в форме порошка, который является светло-белым, легкотекучим и легким в обработке.
Заявителю удалось выполнить эти задачи, и им предложен способ превращения водного раствора низкомолекулярного ацетилгиалуроната натрия в форму порошка, где указанный способ включает стадию дегидратирования раствора низкомолекулярного ацетилгиалуроната натрия. Стадия дегидратации может быть осуществлена при помощи известных методов, таких как лиофилизация. Тем не менее, более предпочтительно стадию дегидратации осуществляют путем распылительной сушки.
Соответственно, в еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ дегидратирования жидкой водной среды, и, в частности, раствора, включающего ацетилгиалуронат натрия, в частности, ацетилгиалуронат натрия, полученный в соответствии с описанным здесь способом.
В одном из воплощений изобретения предложен описанный выше способ, где указанный способ включает стадии распыления жидкой водной среды каплями в осушительной камере, в которой поддерживаются условия, вызывающие выпаривание жидкой водной среды с образованием частиц ацетилгиалуроната натрия.
В более конкретном воплощении температура на входе камеры для распылительной сушки составляет приблизительно 150°C, и температура на выходе камеры для распылительной сушки составляет приблизительно 70°C или меньше.
В более конкретном воплощении воздух нагнетают в осушительную камеру, так, чтобы температура на выходе из осушительной камеры уменьшалась до приблизительно 40-50°C.
Высушенный путем распыления ацетилгиалуронат натрия, который образует еще один аспект настоящего изобретения, демонстрирует требуемые свойства, такие как высокая насыпная плотность, форма и текучесть, которые делают продукт легким для обработки, транспортировки и применения. Возможность избежать продукта с низкой плотностью и пыльного продукта представляет собой особенное преимущество ацетилгиалуроната натрия, высушенного путем распыления.
Высушенный путем распыления ацетилгиалуронат натрия образуется с достаточной белизной и прозрачностью, которые в высшей степени подходят для использования в продуктах, предназначенных для косметических применений, в частности для композиций по уходу за кожей.
Высушенный путем распыления продукт, получающийся в соответствии со способом, описанным выше, образует еще один аспект изобретения.
Как низкомолекулярая ацетилированная гиалуроновая кислота, так и низкомолекулярный ацетилгиалуронат натрия, легко включаются в косметические препараты, и, в частности, в композиции по уходу за кожей. Благодаря своей очень низкой молекулярной массе и своей порошковой физической форме, они не являются вязкими или комковатыми, и могут быть легко растворены или суспендированы в водных средах, и смешаны в косметических основаниях.
Кроме того, поскольку сильно окрашенные ингредиенты могут быть неприемлемы в качестве сырьевых материалов для производителей косметических препаратов, весьма благоприятно, чтобы как низкомолекулярная ацетилированная гиалуроновая кислота, так и низкомолекулярный ацетилгиалуронат натрия, могли быть получены в виде белых порошков без или по существу без желтоватого оттенка, и которые не изменяют или не нарушают цветовой тон какого-либо косметического препарата, в который они могут быть включены, независимо от количества материала, используемого в косметическом препарате.
После завершения обработки ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли может быть осуществлена стадия отбеливания или полировки, путем которых устраняется незначительное обесцвечивание с использованием подходящего отбеливающего агента, такого как глина или форма активированного угля. Тем не менее, такие стадии не особенно эффективны для обесцвечивания таких продуктов, которые уже сильно обесцвечены в результате синтеза.
Особенностью настоящего изобретения является то, что описанные здесь способы получения и выделения обеспечивают низкомолекулярную ацетилированную гиалуроновую кислоту и низкомолекулярный ацетилгиалуронат натрия в виде продуктов, которые находятся в форме белых порошков с достаточной яркостью и прозрачностью, которые в случае осуществления стадии отбеливания или полировки способны эффективно обесцвечивать продукты.
Более конкретно, описанные в настоящей заявке способы способы получения и выделения обеспечивают получение низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты и низкомолекулярного ацетилгиалуроната натрия в виде продуктов, которые находятся в форме белых порошков, каждый из которых имеет величину L* 90 или больше; и величину b*, которая меньше чем 8, где величины b* и b* представляют собой координаты системы хроматичности CIELAB.
Осветленность и оттенок порошка могут быть охарактеризованы при помощи координат хроматичности CIELAB L* а* b* в соответствии с колориметрическими способами, известными в области техники. Величина L* представляет собой величину, которая обозначает насыщенность белого в веществе и указывается значением от 0 до 100. Значение величины L* 100 указывает на самое яркое состояние (полностью белое), а значение величины L* 0 указывает на самое темное состояние (полностью черный). Величина b* обозначает желто-белый оттенок вещества. Чем больше величина b*, тем выше степень желтизны. Чем меньше величина b*, тем выше степень синевы.
Как величина L*, так и величина b*, могут быть измерены с использованием любого подходящего имеющегося в продаже спектрофотометра, такого как Minolta CM3500d. Этот спектрофотометр должен быть включен в течение по меньшей мере одного часа до проведения измерений. Предназначенный для этого стеклянный контейнер должен быть заполнен наполовину твердым продуктом, измеряемым с осторожностью для обеспечения того, что дно контейнера полностью покрыто продуктом. После этого заполненный контейнер должен быть помещен в специально предназначенный для этого держатель для образца. Следует нажать кнопку «образец» ("sample") на приборе и величины L* и b* считываются с панели дисплея. Перед осуществлением каких-либо измерений прибор должен быть откалиброван на ноль и 100% отражение путем помещения специально предназначенных для этого черных и белых объектов в окно оптического сенсора прибора.
Далее следует ряд примеров, предназначенных для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения.
Пример 1: Способ получения ацетилгиалуроната натрия
Реактор объемом 5 л продували азотом и загружали гиалуроновой кислотой (Renovhyal™ производства Soliance, молекулярная масса 10-50 кДа; 300 г, 0,7 моль). Добавляли технический уксусный ангидрид (2160 г, 21,2 моль), и уксусную кислоту (525 г, 8,7 моль), и температуру суспензии устанавливали на уровне 25°C. Добавляли 96% серную кислоту (194 г, 1,9 моль) в течение периода 10 минут. Температуру поддерживали на уровне 25°C путем внутреннего контроля. Перемешивание поддерживали в течение 15 часов. Внутренний контроль отключали и ацетат натрия (154 г, 1,9 моль) добавляли при перемешивании. Температуру увеличивали до 35°C и перемешивание продолжали в течение 30 минут. Реактор опустошали до 40 мбар (4 кПа) и температуру рубашки устанавливали равной 50°C. В течение периода, равного 5 часам, смесь уксусного ангидрида и уксусной кислоты удаляли путем перегонки (1343 г). Оставшееся слегка пастообразное, но все еще перемешиваемое содержимое реактора охлаждали до комнатной температуры и добавляли воду (5500 мл) (сначала очень осторожно), постоянно поддерживая температуру смеси ниже 50°C. Постепенно образовывалась мелкодисперсная белая суспензия. Твердые вещества выделяли путем фильтрования и промывали водой (10 л). Твердые вещества затем ресуспендировали в воде (700 мл) и смесь нейтрализовали (рН 6,5) путем добавления 1 М NaOH (600 мл) с получением раствора ацетилгиалуроната натрия (1520 г, с=0,11 г/г). Этот раствор подвергали распылительной сушке с получением ацетилгиалуроната натрия (175 г, 0,3 моль, выход 44%) в виде тонкодисперсного свободно текучего порошка. Анализ при помощи HSQC-NMR (гетероядерный ядерный магнитный резонанс с одноквантовым переносом когеренции) указывал на степень ацетилирования, равную 3,9.
Пример 2: Способ выделения ацетилгиалуроната натрия методом распылительной сушки
Распылительную сушку 11% водного раствора ацетилгиалуроната натрия осуществляли с использованием аппарата для распылительной сушки GEA VERSATILE-SD™ 6.3, оборудованного центробежным тонкодисперсным распылителем, с использованием следующих параметров:
- Температура загружаемого материала: 15°C
- Температура на входе: 150°C
- Температура на выходе: 70°C
- Скорость загрузки: 20 кг/ч
- Производительность вентилятора: 400 кг воздуха/ч
Скорость вращения перемешивающих устройств: 12000 об/мин
Получали белый свободно текучий порошок ацетилгиалуроната натрия.
Пример 3: Цитотоксичность
Предварительные оценки цитотоксичности ацетилгиалуроната натрия в отношении фибробластов и меланоцитов осуществляли при помощи теста с использованием МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид). Вкратце, клетки высевали на 96-луночные культуральные планшеты и обрабатывали ацетилгиалуронатом натрия в различных концентрациях 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 и 0,005 мг/мл, соответственно, в течение 24 ч и 48 ч. Цитотоксичность оценивали при помощи раствора МТТ (5 мг/мл, разведенного в отношении 1/6 в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (PBS)). Планшеты инкубировали в течение 4 ч при 37°C, в условиях защиты от света. Нерастворимый пурпурный формазановый продукт разводили в 50 мкл DMSO (диметилсульфоксид), и оптическую плотность считывали при 560 нм при использовании микропланшетного ридера (TECAN).
Таблица 1: Оценка цитотоксичности, осуществляемая при помощи теста МТТ, на фибробластах и меланоцитах
В отношении воздействия ацетилгиалуроната натрия на фибробласты с точки зрения цитотоксичности, он вызывал цитотоксичность только в концентрациях 10 и 5 мг/мл. Ниже этих доз не обнаруживали никакого действия.
В отношении его воздействия на меланоциты только концентрация 10 мг/мл ацетилгиалуроната натрия демонстрировала цитотоксическое действие. Ниже этой дозы действие на меланоциты отсутствовало (таблица 1).
Оптимальную концентрацию, которая может быть использована без того, чтобы вызвать токсические действия на каждом из типов клеток, определили равной 0,1 мг/мл для фибробластов и 0,5 мг/мл для меланоцитов. Эти концентрации использовали во время биологических экспериментов.
Пример 4: Транскриптомная оценка
Для идентификации потенциальной биологической активности ацетилгиалуроната натрия осуществляли транскриптомный анализ in vitro на двух типах клеток, представленных в коже, включающих меланоциты и фибробласты. Ее исследовали на 128 генах, распределенных на двух планшетах для проведения транскриптомного анализа. Первый планет был специфическим в отношении в отношении функции дермы с множеством генов, вовлеченных во внеклеточный матрикс, ремоделирование матрикса, окислительную защиту, стрессовые ответы, заживление ран и другие биологические функции. Второй планшет был специфическим в отношении функций пигментации кожи с наиболее важными генами, вовлеченными в синтез меланина, образование и созревание меланосом и другие функции, связанные с меланоцитами.
Транскриптомный анализ осуществляли при помощи Rt-qPCR (количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени) с использованием анализов TaqMan в трех повторностях для каждого типа клеток. Вкратце, после 24 ч клеточной стимуляции при использовании 0,1 мг/мл для фибробластов и 0,5 мг/мл для меланоцитов общую РНК экстрагировали методом выделения РНК с тризолом (Trizol). Общую РНК количественно определяли при помощи спектрометра, и концентрации доводили до уровня 400 нг/мкл. Количество РНК подтверждали при помощи миграции в агарозном геле. Общую РНК подвергали обратной транскрипции до кДНК с использованием набора cDNA Verso kit в соответствии с рекомендациями производителя. Обратную транскрипцию подтверждали при помощи классической ПЦР, направленной против гена домашнего хозяйства ген RPL32. кДНК затем использовали для осуществления RT-qPCR, при которой 10 нг кДНК помещали в лунку с использованием методики TaqMan assay.
Полученные результаты представлены в таблице 2 ниже. Индукцию на уровне в более чем 1,3 раза (как положительная, так и отрицательная) по сравнению с состоянием без обработки рассматривают как показатель биологической модификации.
Таблица 2: Гены, которые существенно модулируются ацетилгиалуронатом натрия на фибробластах (дерма) и меланоцитах (пигментация). p<0,05 *
Пример 5: Влияние ацетилгиалуроната натрия на фибробласты (дерма)
В отношении результатов, относящихся к дерме, ММР-1 и ММР-3 представляют собой две металлопротеиназы матрикса, вовлеченные в разрушение матрикса, такого как коллаген I типа, который представляет собой наиболее важный коллаген, представленный в дерме.
В процессе старения продукция ММР увеличивается, что приводит к разрушению внутрикожного матрикса, которое способствует стягиванию кожи и образованию морщин. Они представляют собой первые видимые показатели старения кожи.
Это явление может быть ускорено внешними факторами, такими как УФ излучение. Несомненно, УФ вызывает окислительный стресс в коже, который отвечает за существенное увеличение высвобождения ММР, которое, в свою очередь, способствует преждевременному старению кожи вследствие сильного разрушения матрикса.
Результаты транскриптомного анализа свидетельствуют о том, что ацетилгиалуронат натрия может ограничивать этот эффект путем понижающей регуляции ММР-1 и ММР-3 (таблица 2).
Была разработана специфическая модель старения in-vitro на фибробластах, способная к сверхэкспрессии ММР-1 и ММР-3 за счет окислительного стресса (H2O2 100 мкМ-200 мкМ в течение 2 ч). Вкратце, фибробласты подвергали предварительной обработке ацетилгиалуронатом натрия (0,1 мг/мл) в базальной среде в течение 2 ч до индуцирования окислительного стресса. После окислительного стресса фибробласты инкубировали в течение 48 ч в базальной среде при 37°C, предоставляя возможность для аккумулирования ММР в культуральной среде. Количество ММР-1 и ММР-3, высвобождающееся из супернатантов, затем оценивали при помощи мультиплексного способа с использованием технологии Luminex (принцип ELISA (иммуноферментный анализ) на частицах).
Высвобождение ММР-1:
Таблица 3: Влияние ацетилгиалуроната натрия на высвобождение ММР-1, вызванное окислительным стрессом in vitro на фибробластах (выраженное в относительных единицах). * - p<0,05; н.з. незначимо. Процентные величины, представленные в скобках, отражают уровень ингибирования, вызванного ацетилгиалуронатом натрия или гиалуронатом натрия относительно отсутствия активного вещества.
Было продемонстрировано, что ацетилгиалуронат натрия значительно уменьшал секрецию ММР-1, опосредованную окислительным стрессом на белковом уровне. В противоположность этому, обнаружили, что гиалуронат натрия не был способен воспроизводить это действие, что подтверждает то, что обнаруженные эффекты являлись следствием ацетилирующей модификации (таблица 3).
Сравнительное исследование высвобождения ММР-1:
Для сравнения эффекты (а) продукта по настоящему изобретению, (б) гиалуроната моноацетата и (в) ацетилированного гиалуроната в соответствии с ЕР 0725083 (от Shiseido; средняя степень ацетилирования приблизительно 3,6; ММ (молекулярная масса) приблизительно 100 кДа) на ММР-1 исследовали в соответствии со следующей процедурой.
Фибробласты после абдоминальной биопсии европеоидной женщины (возраст 26 лет) засеивали в 12-луночные планшеты в концентрации 200000 клеток/лунку в 1 мл полной среды (ZenBio, название DF-1). Через 24 ч после высевания полную среду заменяли на базальную среду без сыворотки крови (Zen-Bio, название DF-2). После 24 ч выращивания в базальной среде клетки предварительно инкубировали с тестируемыми продуктами в концентрации 0,1 мг/мл в течение 2 ч при 37°C и затем подвергали воздействию окислительного стресса (Н2О2 200 мкМ) в течение 2 ч при 37°C.Культуральную среду заменяли на базальную среду и клетки инкубировали в течение еще 48 ч при 37°C. Супернатант собирали и хранили при -80°C до проведения анализа.
Количественное определение ММР-1 осуществляли с использованием набора RayBio® Human MMP-1 ELISA kit иммуноферментный анализ на иммуносорбенте in vitro для количественного измерения про и активной форм человеческого ММР-1 в сыворотке крови, плазме крови и супернатантах клеточной культуры. В этом анализе используется антитело, специфическое в отношении человеческой ММР-1, покрывающее 96-луночный планшет. Стандарты и образцы пипетируют в лунки и ММР-1, представленная в образце, связывается с лунками за счет иммобилизированного антитела. Лунки промывают и добавляют биотинилированное антитело против человеческой ММР-1. После отмывания несвязанного биотинилированного антитела конъюгированный с HRP (пероксидаза хрена) стрептавидин пипетируют в лунки. Лунки вновь промывают, в лунки добавляют раствор субстрата ТМВ (3,3',5'5'-тетраметилбензидин), и окрашивание развивается пропорционально количеству связавшейся ММР-1. Останавливающий раствор изменяет окрашивание с голубого на желтое, и интенсивность окрашивания измеряют при 450 нм.
ММР-1 измеряли после разведения образцов 1/100 в трех повторностях. Стандартную кривую строили в двух повторностях. В соответствии со стандартными концентрациями ММР-1 18000, 6000, 2000, 666,7, 222,2, 74,07 и 24,69 пг/мл рассчитывали четырехпараметрическую логистическую регрессию.
Результаты представлены на фиг. 1.
В базовых условиях обнаружили, что только ацетилированный гиалуронат натрия по настоящему изобретению (а) вызывал значительное ингибирование продукции ММР-1 (-23%). Моноацетат гиалуронат (б) не воспроизводил этот эффект и даже демонстрировал противоположное действие, заключающееся в увеличении продукции ММР-1 (+44%). Ацетилированная гиалуроновая кислота от Sisheido (в) не оказывала существенного действия на высвобождение ММР-1 в этих экспериментальных условиях (+3%).
В условиях окислительного стресса, опосредованного Н2О2 (без обработки ацетилированным гиалуронатом) для воспроизводства эффекта старения, бы обнаружена значительная сверхпродукция ММР-1 (+103%), которая валидировала эксперимент.
Предварительная инкубация с ацетилированным гиалуронатом натрия по настоящему изобретению (а) вызывала значительное уменьшение опосредованной стрессом продукции ММР-1, тогда как другие продукты демонстрировали обратный эффект с +63% и +12% для моноацетата гиалуроната (б) и ацетилированной гиалуроновая кислоты от Sisheido (в), соответственно.
В заключение, только ацетилированный гиалуронат натрия по настоящему изобретению (а) демонстрирует эффективную активность в отношении ингибирования высвобождения ММР-1 в базовых условиях и в присутствии окислительного стресса (напоминающего старение).
Высвобождение ММР-3:
Таблица 4: Влияние ацетилгиалуроната натрия на высвобождение ММР-3, вызванное окислительным стрессом in vitro на фибробластах (выраженное в относительных единицах). * - p<0,05; н.з. незначимо. Процентные величины, представленные в скобках, отражают величину ингибирования, вызванного ацетилгиалуронатом натрия относительно отсутствия активного вещества (отсутствие ацетилгиалуроната натрия).
Было продемонстрировано, что ацетилгиалуронат натрия значительно уменьшал секрецию ММР-3, опосредованную окислительным стрессом на белковом уровне. В противоположность этому, обнаружили, что гиалуронат натрия не был способен воспроизводить это действие, что подтверждает то, что обнаруженный эффект, был следствием ацетилирующей модификации (таблица 4).
Измерения флуоресценции
ММР высвобождаются в двух формах, включающих инактивированную проформу (про-ММР) и активную форму с отщепленным пропептидом (ММР). Только активные ММР способны вызывать разрушение коллагена. Использовали коллаген DQ-типа I, который представляет собой коллаген I типа, флуоресцентно связанный с гасителем. При своем разрушении он способствует высвобождению гасителя и испусканию флуоресценции. Наконец, измеряли испускаемую флуоресценцию, которая пропорциональна разрушению коллагена. Этот эксперимент осуществляли непосредственно в тех же самых экспериментальных условиях, которые использовали для количественного определения секреции ММР-1 и ММР-3. Вкратце, супернатант инкубировали с DQ-коллагеном в течение 4 ч при комнатной температуре, и флуоресценцию измеряли при помощи микропланшетного ридера (TECAN) с длиной волны возбуждения 495 нм и длиной волны испускания 515 нм.
Таблица 5: Влияние ацетилгиалуроната натрия на разрушение коллагена I типа после окислительного стресса in vitro на фибробластах (выраженное в относительных единицах). * - p<0,05; н.з. - незначимо. Процентные величины, представленные в скобках, отражают уровень ингибирования, вызванного ацетилгиалуронатом натрия или гиалуронатом натрия относительно отсутствия активного вещества.
Было обнаружено, что ацетилгиалуронат натрия уменьшал разрушение DQ-коллагена, такое как обнаруженное по уменьшению уровня флуоресценции (таблица 5). Эти результаты продемонстрировали, что ацетилгиалуронат натрия ограничивает высвобождение активных форм ММР-1 и ММР-3, ответственных за разрушение DQ-коллагена. В целом, эти результаты in vitro обеспечили то, что ацетилгиалуронат натрия обладает антивозрастной активностью путем воздействия на ремоделирование матрикса, которое вовлечено в видимые признаки старения кожи. Несомненно, он ограничивает старение путем понижающей регуляции ММР-1 и ММР-3, которая контролирует разрушение матрикса, такого как коллаген I типа. В дополнение, гиалуронат натрия не способен обеспечить те же самые результаты, что подтверждает то, что его биологическая активность связана с ацетилирующей модификацией (таблица 5).
Пример 6: Влияние ацетилгиалуроната натрия на меланоциты (меланоциты)
Функция пигментации
В отношении функции пигментации обнаружили, что ацетилгиалуронат натрия вызывает значительное увеличение экспрессии генов HPS4, MITF и ENDR6 на транскриптомном уровне. Эти результаты свидетельствуют о том, что он может обладать пропигментирующим свойством. Действие ацетилгиалуроната натрия на синтез меланина in vitro анализировали на меланоцитах в базовых условиях и стимулированных условиях, опосредованных добавлением L-тирозинового субстрата. Вкратце, в отношении базовых условий меланоциты инкубировали в 24-луночном планшете в течение 24 ч выращивания культуры. Среду затем заменяли на культуральную среду с ацетилгиалуронатом натрия или без него или немодифицированный гиалуронат натрия в концентрациях 0,1, 0,25, 0,5 и 1 мг/мл, соответственно, или контроль (L-тирозин 1 мМ). Клетки инкубировали в течение 10 суток с двумя возобновлениями обработки после 3 и 7 суток инкубации.
Таблица 6: Влияние ацетилгиалуроната натрия на синтез меланина in vitro на меланоциты в базовом состоянии (выраженное в % относительно контрольных условий). ** - p<0,01**; *** - p<0,001; н.з. - незначимо. Процентные величины в скобках отражают эффекты, вызванные тестируемыми соединениями (L-тирозин, ацетилгиалуронат натрия и гиалуронат натрия относительно действия при отсутствии тестируемого соединения (контроль)).
Результаты показали, что ацетилгиалуронат натрия вызывает уменьшение синтеза меланина в базовых условиях с действием, зависящим от дозы (+2% при 0,1 мг/мл и -9% при 1 мг/мл). Немодифицированный гиалуронат натрия был менее эффективным, что демонстрирует то, что ацетилирование улучшает биологическую активность гиалуроната натрия.
Стимулирование
В отношении стимулированного состояния меланоциты инкубировали в 24-луночных планшетах в течение 24 часов выращивания культуры. Среду затем заменяли на культуральную среду, содержащую L-тирозин (1 мМ), дополненный ацетилгиалуронатом натрия или не модифицированным гиалуронатом натрия в концентрациях 0,1, 0,25, 0,5 и 1 мг/мл, соответственно, или контроль (липоевая кислота 5 мкг/мл). Клетки инкубировали в течение 10 суток с двумя возобновлениями обработки после 3 и 7 суток инкубирования.
Таблица 7: Влияние ацетилгиалуроната натрия на синтез меланина in vitro на меланоциты в стимулированном состоянии (выраженное в % относительно 1 мМ L-тирозина в качестве контрольных условий). * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001; н.з. - незначимо. Процентные величины в скобках отражают действия, вызванные тестируемыми соединениями (липоевая кислота, ацетилгиалуронат натрия и гиалуронат натрия относительно действия при отсутствии тестируемого соединения (контроль)).
Результаты демонстрировали то, что ацетилгиалуронат натрия вызывает увеличение синтеза меланина с обратным действием в зависимости от доз (+11% при 0,1 мг/мл и -7% при 1 мг/мл). Немодифицированный гиалуронат натрия был менее эффективным, что демонстрирует то, что ацетилирование улучшает биологическую активность гиалуроната натрия.
Claims (23)
1. Композиция для ухода за кожей, содержащая низкомолекулярную ацетилированную гиалуроновую кислоту или ее натриевую соль, отличающаяся тем, что низкомолекулярная ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль имеет средневзвешенную молекулярную массу от 10 до 15 кДа, среднюю степень ацетилирования больше чем 3,8 и показатель полидисперсности меньше чем 1,5.
2. Композиция для ухода за кожей по п. 1, отличающаяся тем, что низкомолекулярная ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль имеет среднюю степень ацетилирования 3,9 или больше, и еще более конкретно 4,0.
3. Композиция для ухода за кожей по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что низкомолекулярная ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль имеет средневзвешенную молекулярную массу 13 кДа плюс/минус 1 кДа.
4. Композиция для ухода за кожей по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что низкомолекулярная ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль имеет показатель полидисперсности 1,4 или меньше.
5. Композиция для ухода за кожей по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что степень ацетилирования определена количественным 2D NMR (ядерным магнитным резонансом).
6. Способ получения низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты, имеющей средневзвешенную молекулярную массу от 10 до 15 кДа, среднюю степень ацетилирования больше чем 3,8 и показатель полидисперсности меньше чем 1,5, включающий стадии:
(1) отбора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты, имеющей молекулярную массу 30 кДа или меньше;
(2) подвергания ее условиям ацетилирования; и
(3) выделения низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты путем осаждения с помощью добавления воды.
7. Способ получения натриевой соли низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты, имеющей средневзвешенную молекулярную массу от 10 до 15 кДа, среднюю степень ацетилирования больше чем 3,8 и показатель полидисперсности меньше чем 1,5, включающий стадии:
(1) отбора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты, имеющей молекулярную массу 30 кДа или меньше;
(2) подвергания ее условиям ацетилирования;
(3) выделения низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты путем осаждения с помощью добавления воды; и
(4) взаимодействия низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты с основанием, которое обеспечивает источник ионов натрия, с получением раствора ацетилгиалуроната натрия.
8. Способ по п. 7, где превращение низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты в ацетилгиалуронат натрия осуществляют при pH, который не превышает 9, более конкретно, который не превышает 8, более конкретно, который не превышает 7, и, еще более конкретно, который не превышает 6,5.
9. Способ по п. 7 или 8, дополнительно включающий стадию
(5) дегидратации раствора путем лиофилизации или распылительной сушки.
10. Способ по любому из пп. 7-9, где условия ацетилирования включают стадию взаимодействия низкомолекулярной гиалуроновой кислоты со смесью уксусная кислота/уксусный ангидрид в присутствии сильной кислоты.
11. Порошок низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли для ухода за кожей, где низкомолекулярная ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль имеет средневзвешенную молекулярную массу от 10 до 15 кДа, среднюю степень ацетилирования больше чем 3,8 и показатель полидисперсности меньше чем 1,5, где порошок является белым и имеет значение L* 90 или больше и значение b* меньше чем 8, где величина L* обозначает насыщенность белого в веществе и величина b* обозначает желто-белый оттенок вещества.
12. Способ подавления разрушения внеклеточного матрикса кожи, ассоциированного с повышенными уровнями разрушающих матрикс ферментов, где указанный способ включает стадию нанесения на кожу эффективного количества композиции по уходу за кожей по любому из пп. 1-5 либо низкомолекулярной ацетилированной гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли по п. 11.
13. Способ по п. 12, который представляет собой способ уменьшения видимых признаков старения на коже.
14. Способ по п. 12 или 13, где разрушающие матрикс ферменты представляют собой металлопротеиназы, в частности MMP-1 или MMP-3.
15. Способ по любому из пп. 12-14, где ацетилированная гиалуроновая кислота или ее натриевая соль подавляют разрушение коллагена во внеклеточном матриксе.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB1703850.6A GB201703850D0 (en) | 2017-03-10 | 2017-03-10 | Improvements in or relating to organic compounds |
GB1703850.6 | 2017-03-10 | ||
PCT/EP2018/055823 WO2018162672A1 (en) | 2017-03-10 | 2018-03-08 | Improvements in or relating to organic compounds |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2019128243A RU2019128243A (ru) | 2021-04-12 |
RU2019128243A3 RU2019128243A3 (ru) | 2021-05-11 |
RU2788453C2 true RU2788453C2 (ru) | 2023-01-19 |
Family
ID=
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996005233A1 (fr) * | 1994-08-11 | 1996-02-22 | Shiseido Co., Ltd. | Acide hyaluronique acetyle a faible poids moleculaire, emollient, et procedes d'obtention et de purification de cet acide |
RU2388504C2 (ru) * | 2004-10-11 | 2010-05-10 | Соновиа Лимитед | Устройство для лечения дерматологических состояний |
RU2539395C2 (ru) * | 2009-07-30 | 2015-01-20 | Карбилан Терапьютикс, Инк. | Полимерные композиции модифицированной гиалуроновой кислоты и способы их применения |
RU2543651C1 (ru) * | 2014-01-21 | 2015-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ДЖИ-Групп" | Комплексное косметическое средство |
RU2536981C9 (ru) * | 2009-06-22 | 2015-05-10 | ВАЙЕТ ЭлЭлСи | Иммуногенные композиции антигенов staphylococcus aureus |
CN104004208B (zh) * | 2014-04-16 | 2016-02-03 | 常州药物研究所有限公司 | 交联透明质酸钠生物膜及其制备方法 |
EP2644188B1 (en) * | 2012-02-10 | 2018-09-26 | Shiseido Company, Ltd. | Oil-in-water-type emulsion skin cosmetic |
CN106176286B (zh) * | 2016-08-30 | 2019-05-28 | 华熙生物科技股份有限公司 | 透明质酸皮肤护理膜及制备方法和应用 |
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996005233A1 (fr) * | 1994-08-11 | 1996-02-22 | Shiseido Co., Ltd. | Acide hyaluronique acetyle a faible poids moleculaire, emollient, et procedes d'obtention et de purification de cet acide |
RU2388504C2 (ru) * | 2004-10-11 | 2010-05-10 | Соновиа Лимитед | Устройство для лечения дерматологических состояний |
RU2536981C9 (ru) * | 2009-06-22 | 2015-05-10 | ВАЙЕТ ЭлЭлСи | Иммуногенные композиции антигенов staphylococcus aureus |
RU2539395C2 (ru) * | 2009-07-30 | 2015-01-20 | Карбилан Терапьютикс, Инк. | Полимерные композиции модифицированной гиалуроновой кислоты и способы их применения |
EP2644188B1 (en) * | 2012-02-10 | 2018-09-26 | Shiseido Company, Ltd. | Oil-in-water-type emulsion skin cosmetic |
RU2543651C1 (ru) * | 2014-01-21 | 2015-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ДЖИ-Групп" | Комплексное косметическое средство |
CN104004208B (zh) * | 2014-04-16 | 2016-02-03 | 常州药物研究所有限公司 | 交联透明质酸钠生物膜及其制备方法 |
CN106176286B (zh) * | 2016-08-30 | 2019-05-28 | 华熙生物科技股份有限公司 | 透明质酸皮肤护理膜及制备方法和应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11766393B2 (en) | Skin care composition comprising acetylated hyaluronic acid with degree of acetylation quantified by 2D-MR | |
Dou et al. | The effect of ultrasound irradiation on the physicochemical properties and α-glucosidase inhibitory effect of blackberry fruit polysaccharide | |
Ngo et al. | Production of chitin oligosaccharides with different molecular weights and their antioxidant effect in RAW 264.7 cells | |
Wu et al. | Enhancing the broad-spectrum adsorption of lignin through methoxyl activation, grafting modification, and reverse self-assembly | |
JP5225590B2 (ja) | 保護及び再生用組成物 | |
KR100825450B1 (ko) | 연교추출물을 함유하는 피부 주름개선용 화장료 조성물 | |
WO2000062789A1 (fr) | Extrait peptidique du lupin et composition pharmaceutique ou cosmetique ou nutraceutique comprenant un tel extrait | |
Xie et al. | Quantification of 3, 6-anhydro-galactose in red seaweed polysaccharides and their potential skin-whitening activity | |
AU2009234355A2 (en) | Xanthohumol compositions and methods for treating skin diseases or disorders | |
Zhu et al. | Comparison of disaggregative effect of A-type EGCG dimer and EGCG monomer on the preformed bovine insulin amyloid fibrils | |
WO2017217695A1 (ko) | 알파-망고스틴, 베타-망고스틴, 감마-망고스틴 또는 가르탄닌 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 또는 피부 보습용 조성물 | |
RU2788453C2 (ru) | Улучшения в органических соединениях или улучшения, относящиеся к органическим соединениям | |
KR20120025244A (ko) | 애기동백 추출물을 함유하는 주름 개선용 화장료 조성물 | |
CN106061941B (zh) | 硝酮化合物及其在个人护理中的使用 | |
JP6521210B2 (ja) | セロビオースリピッドを含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤 | |
FR3055550B1 (fr) | Nouvel actif immunomodulateur et composition le comprenant | |
Akbal et al. | Optimization of ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from Ulva rigida and evaluation of their antioxidant activity | |
BR112019017224B1 (pt) | Ácido hialurônico, composição de ácido hialurônico para cuidado da pele, métodos de preparação do ácido hialurônico e do seu sal e método para inibir a degradação da matriz extracelular da pele | |
US20090286959A1 (en) | High Molecular Weight Fibroin Having Improved Antioxidant Activity, Tyrosinase Inhibitory Ability and/or Cytotoxicity to Cancer Cells by Irradiation, and Methods of Making and Using the Same | |
CN106458871A (zh) | 硝酮化合物和其在个人护理中的用途 | |
Senevirathne et al. | 14 Brown Algae-Derived Compounds as Potential Cosmeceuticals | |
Li | Formation of Hydrogels from Antioxidative Synthetic Hydroxycinnamate Ester Conjugates Based on Corn Bran Arabinoxylan | |
KR101733618B1 (ko) | 신규 커큐민―트리펩타이드 복합체 및 이를 함유한 항산화 또는 피부개선용 항노화 피부외용제 조성물 | |
KR101176524B1 (ko) | 플라보노이드계 화합물을 유효 성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물 | |
JP6744537B2 (ja) | 毛髪の成長を促進させる組成物 |