CN108064306A - 酶促产生的纤维素 - Google Patents

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Abstract

本文披露了酶促反应，这些酶促反应包含水、葡萄糖‑1‑磷酸、纤维糊精和至少一种包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的纤维糊精磷酸化酶。这些反应产生具有增强特征的低分子量的不溶性纤维素。

Description

酶促产生的纤维素
本申请要求国际申请号PCT/CN2014/094594(2014年12月23日提交)和PCT/CN2014/094593(2014年12月23日提交)的益处，这两个国际申请以其全文通过引用结合在此。
发明领域
本披露属于多糖领域。更具体地，本披露涉及低分子量不溶性纤维素和用于其合成的酶促反应。本披露还关于在各种应用例如粘度改性和膜生产中使用纤维素。
以电子方式提交的序列表的引用
该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为“CL6392WOPCT2_SequenceListing_ST25”，创建于2015年12月9日，且具有39.4千字节大小，并与本说明书同时提交。包括在该ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用结合在此。
背景技术
由使用酶促合成或微生物遗传工程寻找新的结构多糖的愿望驱使，研究人员已经发现了可生物降解的并且可以从可再生来源的原料经济地制得的多糖。一种这样的多糖是纤维素，特征在于具有β-1，4-糖苷键的葡聚糖聚合物。
微晶纤维素(MCC)是白色、无臭、无味、相对自由流动的结晶性粉末，实际上没有有机和无机污染物。它是通过使如从纤维状植物材料(例如木材)作为纸浆获得的α纤维素经受典型地用无机酸进行的水解降解而获得的纯化的、部分解聚的纤维素。MCC是高度结晶的微粒纤维素，主要由通过去除纤维素材料的无定形(纤维状纤维素)区域获得的结晶聚集体组成。MCC用于各种应用，包括食品、药品和化妆品中。尽管存在MCC的各种应用，这种纤维素类型的制备是费力且昂贵的。此外，MCC的活化需要高剪切。
鉴于其在各种应用中的潜在效用，希望开发新形式的纤维素。新颖的酶促方法的开发可能是生产新型纤维素材料的有用手段。
发明内容
在一个实施例中，本披露涉及包含水、葡萄糖-1-磷酸、纤维糊精和合成不溶性纤维素的纤维糊精磷酸化酶的酶促反应。在另一个实施例中，该纤维糊精磷酸化酶包含与SEQID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且合成不溶性纤维素。
在另一个实施例中，纤维素的重均聚合度(DPw)是(i)约10至约30，或(ii)约10至约1000。
在另一个实施例中，纤维糊精包含纤维二糖。
在另一个实施例中，本披露涉及一种用于生产不溶性纤维素的方法。该方法包括：a)使至少水、葡萄糖-1-磷酸、纤维糊精和纤维糊精磷酸化酶如包含与SEQ ID NO：2或SEQID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的纤维糊精磷酸化酶接触，其中产生不溶性纤维素；和b)任选地分离在步骤(a)中产生的该不溶性纤维素。
在另一个实施例中，在该方法的步骤(a)中产生的该纤维素具有(i)约10至约30，或(ii)约10至约1000的重均聚合度(DPw)。在另一个实施例中，在该方法的步骤(a)中产生的该纤维素具有纤维素II晶体结构。
在另一个实施例中，在该方法中使用的纤维糊精包含纤维二糖。
在另一个实施例中，通过提供第二反应在该方法的步骤(a)中提供葡萄糖-1-磷酸，其中该第二反应的产物包含葡萄糖-1-磷酸。在另一个实施例中，该第二反应通过以下方式产生葡萄糖-1-磷酸：(i)使水、无机磷酸盐、淀粉、淀粉磷酸化酶和任选地淀粉脱支酶如支链淀粉酶或异淀粉酶接触；(ii)使水、无机磷酸盐、蔗糖和蔗糖磷酸化酶接触；或(iii)使水、无机磷酸盐、纤维素生物质、内切葡聚糖酶、纤维糊精磷酸化酶和任选地溶解性多糖单加氧酶和/或纤维二糖水解酶接触。在另一个实施例中，在进行步骤(a)的同一容器中提供该第二反应，并且该第二反应在步骤(a)之前和/或与步骤(a)连续进行。
附图和序列的简述
图1A：原子力显微镜法(AFM)用于分析由干燥由查帕西斯瘤胃球菌(R.champanellensis)纤维糊精磷酸化酶合成的不溶性纤维素的胶体分散体制成的薄膜。片状结构的厚度为约5nm。参考实例4。
图1B：AFM用于分析由干燥由红色弧菌(V.ruber)纤维糊精磷酸化酶合成的不溶性纤维素的胶体分散体制成的薄膜。片状结构的厚度为约4.8nm。参考实例4。
图2：粘度对剪切速率，如对于由查帕西斯瘤胃球菌纤维糊精磷酸化酶(蓝色菱形，样品1，2.5wt％在水中)或红色弧菌纤维糊精磷酸化酶(红色方形，样品2，1.7wt％在水中)合成的不溶性纤维素材料的胶体分散体测量的。参考实例4。
图3：与由查帕西斯瘤胃球菌纤维糊精磷酸化酶(2.5wt％在水中)或红色弧菌纤维糊精磷酸化酶(1.7wt％在水中)合成的不溶性纤维素材料的胶体分散体的粘度相比，各种可商购的在水中的水溶性多糖(羧甲基纤维素[CMC]和硬葡聚糖)的粘度。DPw3200和2000的CMC来自斯比凯可公司(CP Kelco)，并且DPw50、360和1200的CMC是来自斯比凯可公司的FINNFIX商标CMC。硬葡聚糖来自嘉吉公司(Cargill)(ACTIGUM)。粘度测量以10 1/s剪切速率报告。
表1.核酸和蛋白质SEQ ID号的总结
具体实施方式
所有引用的专利和非专利文献的披露内容通过引用以其全文结合在此。
除非另有披露，否则本文所使用的术语“一个/一种”(a和an)旨在涵盖引用特征的一个/种或多个/种(即至少一个/种)。
在存在的情况下，所有范围是包含性的和可组合的，除非另有说明。例如，当列举“1至5”的范围时，所列举的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等范围。
术语“纤维糊精磷酸化酶(cellodextrin phosphorylase)”、“纤维糊精磷酸化酶(cellodextrin phosphorylase enzyme)”等在本文中可互换使用。纤维糊精磷酸化酶是酶委员会(EC)条目2.4.1.49并且属于根据CAZy(碳水化合物-活性酶)数据库的糖基水解酶家族94(GH94)。纤维糊精磷酸化酶可以可逆地催化来自α-D-葡萄糖-1-磷酸和纤维糊精(底物)的纤维素和游离磷酸盐(产物)的合成。这种反应也可以写成：葡萄糖-1-磷酸+(1，4-β-D-葡糖基)n-1→(1，4-β-葡糖基)n+磷酸基，其中“(1，4-β-D-葡糖基)n-1”是指纤维糊精，并且“(1，4-β-葡糖基)n”是指纤维素。在本文的某些方面中的纤维糊精磷酸化酶可以合成不溶于水性组合物的低分子量纤维素(例如10-30的DPw)。在本文的某些方面中的纤维糊精磷酸化酶包含与SEQ ID NO：2或6具有至少90％同一性的氨基酸序列。
术语“纤维素”是指具有β-1，4-连接的D-葡萄糖单体单元的直链的葡聚糖多糖。纤维素可以任选地表示为(1，4-β-D-葡糖基)n，其中n可以是与本文披露的低分子量纤维素的DPw值相同的值(例如，10至30)。本文中术语“葡聚糖”是指通过糖苷键(glucosidiclinkage)连接的D-葡萄糖单体的多糖，糖苷键是配糖键(glycosidic linkage)的一种类型。
术语“纤维素II结构”、“纤维素II晶体结构”、“纤维素II”等在本文中可互换使用。例如，纤维素II结构已经由Kolpak和Blackwell(Macromolecules[大分子]9：273-278)和Kroon-Batenburg和Kroon(Glycoconjugate J.[糖结合物杂志]14：677-690)进行描述，这两者都通过引用结合在此。表征纤维素II结构的主要氢键是O-2H---O6、O6-H---O6和O2-H---O2，而纤维素I具有O2-H---O6作为主要氢键。纤维素II的结构包括链折叠并且难以解开。纤维素II包括反平行链，而相比之下，纤维素I链是平行的。
术语“配糖键”(glycosidic linkage和glycosidic bond)等在本文中可互换使用并且是指将碳水化合物分子彼此连接的共价键。术语“糖苷键”(glucosidic linkage和glucosidic bond)等在本文中可互换使用并且是指葡聚糖中的两个葡萄糖分子之间的配糖键。如本文中使用的术语“β-1，4-糖苷键”是指通过葡聚糖中的相邻葡萄糖单体上的碳1和4将葡萄糖分子彼此连接的共价键。
本文中纤维素的配糖键谱图可以使用本领域已知的任何方法确定。例如，可以使用采用核磁共振(NMR)光谱(例如13C NMR或1H NMR)的方法确定键谱图。可以使用的这些和其他方法披露于食品碳水化合物：化学、物理性质和应用(S.W.Cui，Ed.，Chapter 3，S.W.Cui，Structural Analysis of Polysaccharides，Taylor&Francis Group LLC，BocaRaton，FL，2005[S.W.Cui，编辑，第3章，S.W.Cui，多糖的结构分析，泰勒与弗朗西斯基团有限公司，佛罗里达州波卡拉顿，2005])中，其通过引用结合在此。
本文的糖聚合物如纤维素的“分子量”可以表示为数均分子量(Mn)或重均分子量(Mw)，其单位为道尔顿或克/摩尔。可替代地，分子量可以表示为DPw(重均聚合度)或DPn(数均聚合度)。用于计算这些分子量测量的各种方法在本领域中是已知的，例如采用高压液相色谱法(HPLC)、尺寸排阻色谱法(SEC)或凝胶渗透色谱法(GPC)。
如本文中使用的术语“纤维糊精”是指一种或多种葡萄糖聚合物，其具有两个或更多个β-1，4-连接的葡萄糖单体长度。纤维糊精典型地通过纤维素的(酶促)水解产生。“纤维二糖”是包含两个β-1，4-连接的葡萄糖单体的一种类型的纤维糊精(即纤维二糖是一种类型的二糖)。
如本文中使用的“葡萄糖-1-磷酸”(G1P)是指在1-碳上具有磷酸基团的葡萄糖分子。本文的G1P可以是α-D-葡萄糖-1-磷酸。
术语“酶促反应”、“纤维糊精磷酸化酶反应”等在本文中可互换使用，并且除非另有说明，是指由纤维糊精磷酸化酶进行的反应。酶促反应通常是指包含在包含水、葡萄糖-1-磷酸和纤维糊精(例如纤维二糖)和任选的其他组分的溶液中的至少一种活性纤维糊精磷酸化酶的溶液。在纤维糊精磷酸化酶反应中，进行了使水、葡萄糖-1-磷酸、纤维糊精和纤维糊精磷酸化酶接触的步骤。术语“在合适的反应条件下”等是指支持通过纤维糊精磷酸化酶活性将底物转化为低分子量不溶性纤维素的反应条件。本文的纤维糊精磷酸化酶反应不是天然发生的。将理解的是，由于纤维糊精磷酸化酶反应产生不溶性纤维素，所以这种纤维素不存在于溶液中。
如本文中使用的“对照”酶促反应可以是指例如使用不包含与SEQ ID NO：2或6具有至少90％同一性的氨基酸序列的纤维糊酶磷酸化酶的反应。对照反应溶液的所有其他特征(例如，底物浓度、温度、pH、时间)可以与其与之进行比较的反应的那些相同。
如本文中使用的“第二反应”是指除了纤维糊精磷酸化酶反应(“第一反应”)之外的反应，并且该第二反应提供用于第一反应的G1P底物。
可以表示为“Pi”的“无机磷酸盐”是指溶液中的游离磷酸盐离子，并且与各种磷酸酯中结合的磷酸盐不同。
“产生G1P的酶”可以是指催化产物的合成的酶，其中至少一种产物是G1P。产生G1P的酶的实例包括淀粉磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶和纤维糊精磷酸化酶(当在相反方向上催化上述反应时，即纤维素水解)。
如本文中使用的“淀粉磷酸化酶”是EC条目2.4.1.1并且可以催化淀粉和无机磷酸盐转化为葡萄糖-1-磷酸。这样的反应也可以写成：(1，4-α-D-葡糖基)n+磷酸盐→(1，4-α-D-葡糖基)n-1+α-D-葡萄糖-1-磷酸，其中“(1，4-α-D-葡糖基)n”是指淀粉。
如本文中使用的“淀粉脱支酶”是指可以催化在淀粉中的分支点处的1，6-α-D-糖苷键的水解的酶。本文的淀粉脱支酶的实例包括支链淀粉酶和异淀粉酶。如本文中使用的“支链淀粉酶”是EC条目3.2.1.41。如本文中使用的“异淀粉酶”是EC条目3.2.1.68。
本文中，术语“蔗糖”是指由α-1，2-配糖键连接的α-D-葡萄糖分子和β-D-果糖分子构成的非还原性二糖。通常，蔗糖被称为食用糖。
如本文中使用的“蔗糖磷酸化酶”是EC条目2.4.1.7并且可以催化蔗糖和磷酸盐转化为果糖和G1P。这种反应也可以写成：蔗糖+磷酸盐→果糖+α-D-葡萄糖-1-磷酸。
“纤维素生物质”、“包含纤维素的生物质”等在本文中可互换使用并且是指不能直接用于食品成分或作为发酵底物的包含植物的结构部分(例如，木材、茎)的材料。
“内切葡聚糖酶”和“β-1，4-内切葡聚糖酶”在本文中可互换使用并且是指可以在纤维素链内裂解内部键，从而使纤维素链缩短的酶。这种缩短的链是当在相反方向上催化上述反应(即纤维素水解)时用于纤维糊精磷酸化酶的合适底物。
术语“按体积计的百分比”、“体积百分比”、“vol％”、“v/v％”等在本文中可互换地使用。在溶液中溶质的体积百分比可以使用以下公式确定：[(溶质体积)/(溶液体积)]×100％。
术语“按重量计的百分比”、“重量百分比(wt％)”、“重量-重量百分比(％w/w)”等在本文中可互换地使用。重量百分比是指当包含在组合物、混合物或溶液中时，材料在质量基础上的百分数。
如本文中所使用，术语“增加”可以是指比该增加的量或活性与之进行比较的量或活性多至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、50％、100％、或200％的量或活性。术语“增加的”、“提高的”、“增强的”、“大于”、“改进的”等在本文中可互换地使用。
术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”以及类似物在本文中可互换地使用。这些术语涵盖核苷酸序列等。多核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA的聚合物，其任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。多核苷酸可以由cDNA、基因组DNA、合成DNA或其混合物的一个或多个区段组成。
如本文中所使用，术语“基因”是指从编码区表达RNA(RNA从DNA多核苷酸序列转录)的DNA多核苷酸序列，该RNA可以是信使RNA(编码蛋白质)或非蛋白质编码RNA。基因可以是指单独的编码区，或者可以包括编码区上游和/或下游的调控序列(例如启动子、5’-非翻译区、3’-转录终止子区)。可替代地，编码蛋白质的编码区可以在本文被称为“开放阅读框”(ORF)。“天然”或“内源”的基因是指自然界中发现的具有其自身调节序列的基因；这样的基因位于宿主细胞基因组的天然位置。“嵌合”基因是指不是天然基因的任何基因，该基因包括在自然界中未一起发现的调节序列和编码序列(即，调节区和编码区彼此是异源的)。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“外来”或“异源”的基因是指通过基因转移导入宿主生物体的基因。外来/异源基因可包括插入到非天然生物内的天然基因、导入到天然宿主内的新位置的天然基因、或嵌合基因。在某些实施例中，本文披露的多核苷酸序列是异源的。“转基因”是通过基因递送程序(例如转化)引入基因组中的一种基因。“密码子优化的”开放阅读框的密码子使用频率被设计为模拟宿主细胞优选密码子使用的频率。
本文的包含在细胞或生物体中的“非天然”氨基酸序列或多核苷酸序列不会发生在这种细胞或生物体的天然的(自然的)对应物中。
如本文中所使用，“调节序列”是指位于基因转录起始位点(例如启动子)上游的核苷酸序列、5’非翻译区、内含子和3’非编码区，并且该调节序列可以影响转录、加工或稳定性、和/或从该基因转录的RNA的翻译。本文中，调节序列可以包括启动子、增强子、沉默子、5’非翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点、茎环结构以及涉及调节基因表达的其他元件。本文中一个或多个调节元件(例如，启动子)可以与本文的编码区异源。
如本文中使用的术语“可操作地连接的”是指两个或更多个核酸序列的关联，使得一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它与编码序列可操作地连接。即，编码序列处于启动子的转录控制下。例如，编码序列可以可操作地连接到一个(例如，启动子)或多个(例如，启动子和终止子)调节序列。
当本文中用于表征DNA序列如质粒、载体或构建体时，术语“重组”是指例如通过化学合成和/或通过用基因工程技术操纵分离的核酸区段来将两个原本分离的序列区段进行人工组合。本文中用于制备重组构建体/载体的方法可以遵循标准的重组DNA和分子克隆技术，例如，如由萨姆布鲁克(J.Sambrook)和拉塞尔(D.Raroell)所描述的(分子克隆：实验手 册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，第3版，纽约冷泉港冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)，2001)；希尔豪维(T.J.Silhavy)等人(使用基因融合的实验(Experiments with Gene Fusions)，纽约冷泉港冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)，1984)；以及奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人(简明分子生物学试验方案(Short Protocols in Molecular Biology)，第5版，当前试验方案(Current Protocols)，纽约州约翰威利父子公司(John Wiley and Sons，Inc.，NY)，2002)描述的。
如本文中使用的术语“转化”是指通过任何方法将核酸分子转移到宿主生物体或宿主细胞中。已经转化到生物体/细胞中的核酸分子可以是在生物体/细胞中自主复制的核酸分子，或者整合到生物体/细胞的基因组中的核酸分子，或瞬时存在于细胞中而不进行复制或整合的核酸分子。本文披露了适用于转化的核酸分子的非限制性实例，例如质粒和线性DNA分子。含有转化核酸序列的本文的宿主生物体/细胞可称为例如“转基因”、“重组”、“转化”、工程化、作为“转化体”、和/或是“外源基因表达修饰”。
如本文中所使用，关于多核苷酸或多肽序列的术语“序列同一性”或“同一性”是指在两个序列中的核酸碱基或氨基酸残基当在指定的比较窗口上比对最大对应度时是相同的。因此，“序列同一性百分比”或“百分比同一性”是指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的值，其中与参比序列(其不包含添加或缺失)比较两个序列的最佳比对时，该多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分可以包含添加或缺失(即空位)。通过以下方式计算该百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将该结果乘以100以产生序列同一性百分比。应当理解的是，当计算DNA序列和RNA序列之间的序列同一性时，DNA序列的T残基与RNA序列的U残基比对，并且可以被认为与其“一致”。出于确定第一和第二多核苷酸的百分比互补性的目的，可以通过确定(i)第一多核苷酸和第二多核苷酸的补体序列之间的百分比同一性(或反之亦然)，例如和/或(ii)将产生规范的沃森和克里克碱基对的第一和第二多核苷酸之间的碱基百分比来获得。
可以使用在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站上在线获得的基本局部比对搜索工具(BLAST)，例如，来测量在两个或更多个多核苷酸序列(BLASTN算法)或多肽序列(BLASTP算法)之间的百分比同一性。可替代地，使用Clustal算法(例如，ClustalW、ClustalV或Clustal-欧米加)可以进行序列之间的百分比同一性比对。对于使用Clustal比对方法的多重比对，默认值可以对应于空位罚分(GAP PENALTY)＝10和空位长度罚分(GAPLENGTH PENALTY)＝10。使用Clustal方法进行逐对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数可以是KTUPLE＝1、空位罚分＝3、窗口(WINDOW)＝5、以及存储的对话框(DIAGONALS SAVED)＝5。对于核酸，这些参数可以是KTUPLE＝2、空位罚分＝5、窗口＝4、以及存储的对话框＝4。仍可替代地，序列之间的百分比同一性可以使用BLOSUM矩阵(例如，BLOSUM62)，使用具有参数例如空位开始(GAP OPEN)＝10、空位延伸(GAP EXTEND)＝0.5、最终空位罚分(END GAP PENALTY)＝错误(false)、最终空位开始(END GAP OPEN)＝10、最终空位延伸(END GAP EXTEND)＝0.5的EMBOSS算法(例如，needle)来执行。
作为某些实施例的特征，本文披露了各种多肽氨基酸序列和多核苷酸序列。可以使用与本文披露的序列具有至少约70％-85％、85％-90％、或90％-95％同一性的这些序列的变体。可替代地，变体氨基酸序列或多核苷酸序列可以与本文披露的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。变体氨基酸序列或多核苷酸序列具有与所披露的序列的相同的功能/活性，或具有所披露的序列的功能/活性的至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的功能/活性。典型地，本文披露的不以甲硫氨酸开始的任何多肽氨基酸序列可以在氨基酸序列的N-末端进一步包含至少一个起始甲硫氨酸。本文披露的以甲硫氨酸开始的任何多肽氨基酸序列可以任选地被考虑为不具有该甲硫氨酸残基(即，多肽序列可以是指关于该序列的C-末端残基的位置-2残基而进行参考)。
如本文中使用的术语“分离的”是指已经完全或部分纯化的多核苷酸、多肽或纤维素材料。在一些情况下，分离的多核苷酸、多肽或纤维素材料是较大组合物、缓冲体系或试剂混合物的一部分。例如，分离的多核苷酸或多肽分子能以异源方式包含在细胞或生物体内。这种含有异源组分和/或一种或多种遗传缺失的细胞或生物体在自然界中不会发生。另一个实例是分离的纤维糊精磷酸化酶或反应。本文的纤维素组合物和用于生产这些组合物的酶和反应是合成的/人造的，和/或展现出不被认为天然存在的特性。
本文的“水性组合物”具有例如包含至少约10wt％的水的液体组分。水性组合物的实例包括例如混合物、溶液、分散体(例如胶体分散体)、悬浮液和乳液。在某些实施例中，水性组合物可以包含如本文披露的不溶性纤维素，在这种情况下，考虑到纤维素不溶性，水性组合物可以任选地表征为液体包固体(solid-in-liquid)组合物。
如本文中所使用，术语“胶体分散体”是指具有分散相和分散介质的异相系统，即微观上分散的不溶性颗粒悬浮在另一种物质(例如水性组合物例如水或水性溶液)中。本文中胶体分散体的实例是水状胶体。胶体分散体例如水状胶体的全部或一部分颗粒可以包含本披露的纤维素。术语“分散剂(dispersant)”和“分散药剂(dispersion agent)”在本文中可互换地使用，是指促进分散体的形成和/或稳定的材料。
术语“水状胶体(hydrocolloid)”和“水凝胶(hydrogel)”在本文中可互换地使用。水状胶体是指水或水溶液是分散介质的胶体系统。
本文中，术语“水性溶液”是指其中溶剂包含水的溶液。在本文的某些方面，水性溶液可以用作分散剂。在某些实施例中的纤维素可以在水溶液中分散或混合。
如本文中所使用，术语“粘度”是指流体或水性组合物例如水状胶体抵抗趋于导致其流动的力的程度的量度。本文中可以使用的各种粘度单位包括厘泊(cPs)和帕斯卡秒(Pa·s)。一厘泊是一泊的百分之一；一泊等于0.100kg·m-1·s-1或1mPa·s。因此，如本文中所使用，术语“粘度调节剂”、“粘度改性剂”等是指可以改变/改性流体或水性组合物的粘度的任何物质。
如本文中所使用，术语“剪切稀化行为”是指随着剪切速率增加水性组合物的粘度降低。本文中“剪切速率”是指对水性组合物应用渐进剪切变形的速率。例如，可以旋转地应用剪切变形。
如本文中所使用，关于增加水性组合物的粘度的方法，术语“接触”是指导致水性组合物与如目前披露的纤维素在一起的任何作用。可以通过本领域已知的任何方式进行接触，例如像混合、振荡或均质化。
如本文中使用的“DMSO”是指具有式(CH3)2SO的二甲基亚砜。
如本文中使用的“DMAc”是指具有式CH3CON(CH3)2的N，N-二甲基乙酰胺。
术语“丝光化”、“丝光化过程”等在本文中可互换使用，是指纤维素材料在苛性碱条件(典型地包含氢氧化钠)下进行处理的过程。在某些实施例中，如本文披露的纤维素尚未被丝光化。
术语“衍生化”、“衍生化过程”等在本文中可互换使用，是指纤维素材料在导致用不同的部分/官能团(例如，羧甲基)取代纤维素-OH基团的一个或多个氢的条件下进行处理的过程。在某些实施例中，如本文披露的纤维素尚未被衍生化。
如本文中使用的术语“膜”是指薄的、视觉上连续的材料。膜可以作为薄层或涂层包含在材料上，或者可以是单独的(例如，不附接到材料表面)。如本文中使用的“涂层”是指覆盖材料表面的薄层。
如用于表征本文的膜或涂层的术语“均匀厚度”可以指(i)是总膜/涂层面积的至少20％，和(ii)具有例如小于约50nm的厚度的标准偏差的连续区域。
如果对物质的膜/涂层渗透性低于感兴趣的技术中通常指定的阈值，则本文的膜或涂层可表征为对特定物质具有“低渗透性”。为了说明，在SMC(超多涂层的)离型膜场中的苯乙烯渗透性的阈值为200×10-9g cm/cm2/h，例如使用美国化学工程师协会(AmericanInstitute of Chemical Engineer)，第53届国家会议，预印件No.32d(Bixler和Michaels，1964)中描述的方法测量的。如果膜或涂层不允许物质在延长的时间段内(例如一天或多天)通过，则该膜或涂层可表征为对特定物质是“不可渗透的”。
鉴于其在各种应用中的潜在效用，希望开发新形式的纤维素。新颖的酶促方法的开发可能是生产新型纤维素材料的有用手段。
本披露的实施例涉及至少包含水、葡萄糖-1-磷酸、纤维糊精和合成纤维素的纤维糊精磷酸化酶的酶促反应。例如，纤维糊精磷酸化酶可以(i)包含与SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且(ii)合成纤维素。显著地，这样的酶促反应能够在干燥和水性两种条件下产生具有增强特征的低分子量不溶性纤维素，使得这种纤维素具有广泛的适用性。
适合于在如目前披露的酶促反应中使用的具有纤维糊精磷酸化酶活性的酶可以包含例如与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，这样的酶可以包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有100％同一性或至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。包含SEQID NO：2的纤维糊精磷酸化酶的非限制性实例包括包含与SEQ ID NO：4具有100％同一性或至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成的纤维糊精磷酸化酶。包含SEQ ID NO：6的纤维糊精磷酸化酶的非限制性实例包括包含与SEQ ID NO：8具有100％同一性或至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成的纤维糊精磷酸化酶。变体纤维糊精磷酸化酶(例如，与SEQ ID NO：2、4、6或8参考序列具有在90％-99％之间的氨基酸同一性)应当具有相应非变体参考序列的一些(例如，至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)或全部的酶活性(参见上述定义)。
编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多核苷酸序列可以任选地包含分别与SEQ IDNO：1或3具有100％同一性或至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。编码SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的多核苷酸序列可以任选地包含分别与SEQ ID NO：5或7具有100％同一性或至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
鉴于某些氨基酸彼此共享相似的结构和/或电荷特征(即，保守的)，本文的纤维糊精磷酸化酶序列(和/或本文的其他类型的多肽)的一个或多个氨基酸可以被保守的氨基酸残基置换(“保守性氨基酸置换”)，如下：
1.以下的小脂肪族的、非极性或轻微极性的残基可相互置换：Ala(A)、Ser(S)、Thr(T)、Pro(P)、Gly(G)；
2.以下极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺可以相互置换：Asp(D)、Asn(N)、Glu(E)、Gln(Q)；
3.以下极性的、带正电荷的残基可以相互置换：His(H)、Arg(R)、Lys(K)；
4.以下脂族的、非极性残基可以相互置换：Ala(A)、Leu(L)、Ile(I)、Val(V)、Cys(C)，Met(M)；并且
5.以下大的芳香族残基可以相互置换：Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W)。
可以从任何微生物来源例如像细菌或真菌(例如，酵母)获得本文的具有纤维糊精磷酸化酶活性的酶。合适细菌的实例包括弧菌属物种和瘤胃球菌属物种。合适的弧菌属物种的实例包括红色弧菌、霍乱弧菌、适应弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、副溶血性弧菌、解蛋白弧菌和创伤弧菌。合适的瘤胃球菌属物种的实例包括查帕西斯瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、布氏瘤胃球菌、黄化瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌(R.gnavus)、酸奶瘤胃球菌(R.lactaris)、卵形瘤胃球菌(R.obeum)和扭链瘤胃球菌(R.torques)。
本文的具有纤维糊精磷酸化酶活性的酶的实例可以是本文披露的任何氨基酸序列，并且进一步包括在N-末端和/或C-末端的1-300个(或在[例如，10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、或50个]之间的任何整数个)残基。这样的附加残基可以是例如异源序列，例如表位标签(在N-或C-末端)(例如，His标签如六组氨酸)或异源信号肽(在N-末端)。在其中异源氨基酸序列在N-末端并入的那些实施例中，这种异源序列可以与纤维糊精磷酸化酶的原始的起始甲硫氨酸相邻，或者可以例如代替原始的起始甲硫氨酸。在后一个实施例中，可以在所添加的异源序列的N-末端使用新的起始甲硫氨酸。
如目前披露的具有纤维糊精磷酸化酶活性的酶典型地缺少N-末端信号肽。然而，用于生产纤维糊精磷酸化酶的表达系统可以任选地使用编码酶的多核苷酸，该多核苷酸进一步包含编码N-末端信号肽的序列以指导细胞外分泌。在这样的实施例中，将信号肽在分泌过程中从酶上切割。由于据信本文披露的纤维糊精磷酸化酶(例如SEQ ID NO：2和6)与天然表达的信号肽不相关，任何添加的信号肽可被认为是与该酶异源的。可用于本文的信号肽的实例是来自细菌(例如芽孢杆菌属物种例如枯草芽孢杆菌)或真菌物种的信号肽。细菌信号肽的实例是aprE信号肽，例如来自芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌，参见Vogtentanz等人，蛋白质表达与纯化(Protein Expr.Purif.)55：40-52，其通过引用结合在此)的信号肽。
在一些实施例中，纤维糊精磷酸化酶在自然界中不存在；例如，本文的酶不被认为是从微生物(可能从其衍生出本文的纤维糊精磷酸化酶)中天然分泌的(即，成熟形式)。
本文的纤维糊精磷酸化酶可以通过例如适当工程化的微生物菌株的发酵来制备。通过发酵的重组酶生产是本领域众所周知的，使用微生物菌株如大肠杆菌、芽孢杆菌菌株(例如枯草芽孢杆菌)、富养罗尔斯通氏菌、荧光假单胞菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母、如曲霉属(例如泡盛曲霉)和木霉属(例如，里氏木霉)的物种(例如，参见Adrio和Demain，生物分子(Biomolecules)4：117-139，将其通过引用结合在此。
本披露的纤维糊精磷酸化酶能够以任何纯化状态(例如，纯的或非纯的)使用。例如，纤维糊精磷酸化酶可以在其使用之前被纯化和/或分离。不纯的纤维糊精磷酸化酶的实例包括呈细胞裂解物形式的那些。可以从用于异源表达酶的细菌(例如，大肠杆菌)制备细胞裂解物或提取物。例如，可以使用弗氏压碎器使细菌经受破裂。在可替代的实施例中，细菌可以用均化器(例如APV、兰尼(Rannie)、戈兰(Gaulin))均化。典型地，纤维糊精磷酸化酶可溶于这些类型的制剂。如果需要，本文的细菌细胞裂解物、提取物或匀浆物能以约0.15％-0.3％(v/v)用于本文的酶促反应中。在其他实施例中，可以在其表达后分离具有纤维糊精磷酸化酶活性的酶。例如，可以使用结合/洗涤或结合/洗涤/洗脱方法(例如，将酶结合到柱或其他固定表面，接着洗涤并任选地将酶洗脱离开柱或其他固定表面)来分离酶。酶分离方法可以包括在某些实施例中结合异源氨基酸序列标记的纤维糊精磷酸化酶，其中这种结合是通过异源氨基酸序列标签(例如His标签)。例如，可以从细胞裂解物或任何其他组合物(例如，任选分泌酶的培养基)中分离纤维糊精磷酸化酶。在某些方面，纤维糊精磷酸化酶制剂可能缺乏葡萄糖-1-磷酸酶活性。在一些方面，纤维糊精磷酸化酶可以被固定(例如，到基质上)或在细胞表面上表达。例如，纤维糊精磷酸化酶可以任选地用聚乙二醇(PEG)改性。
本披露的纤维糊精磷酸化酶可以合成不溶于水性组合物的低分子量纤维素。例如，如本文的酶促反应中使用的纤维糊精磷酸化酶可以产生低分子量的不溶性纤维素。
在某些实施例中由纤维糊精磷酸化酶产生的纤维素可以具有约10-1000的DPw或DPn。例如，本文的纤维素的DPw或DPn可以是约10-500、10-250、10-100、10-75、10-50、10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、15-50、15-45、15-40、15-35、15-30、或15-25。在一些方面，纤维素的DPw或DPn可以是约、至少约或小于约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50。
在一些方面，由纤维糊精磷酸化酶产生的纤维素可以具有约1700-170000、1700-86000、1700-43000、1700-17000、1700-13000、1700-8500、1700-6800、1700-5100、2550-5100、或2550-4250的Mw。在一些方面，Mw可以是约、至少约或小于约1700、1900、2100、2300、2500、2700、2900、3100、3300、3500、3700、3900、4100、4300、4500、4700、4900、或5100。
本文的由纤维糊精磷酸化酶产生的纤维素的配糖键的约100％是例如β-1，4键。在其他方面，纤维素可以具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的β-1，4键的配糖键谱图。因此，本文中酶促产生的纤维素可以具有例如小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的不是β-1，4的配糖键。
本文的由纤维糊精磷酸化酶合成的纤维素的骨架可以是直链的/非支化的。可替代地，纤维素中可以存在分支。因此，在某些实施例中，作为聚合物中配糖键的百分比，纤维素可以不具有分支点或小于约5％、4％、3％、2％或1％的分支点。
在一些方面中，本文的由纤维糊精磷酸化酶产生的纤维素可以具有纤维素II晶体结构。例如，本文的纤维素可以包含按重量计约100％的具有纤维素II晶体结构的纤维素。作为其他实例，纤维素可以包含按重量计至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的具有纤维素II晶体结构的纤维素。在一些方面中，纤维素可以包含按重量计小于约20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的具有纤维素I、III和/或IV晶体结构的纤维素材料。例如，纤维素II晶体结构已经由Kolpak和Blackwell(Macromolecules[大分子]9：273-278)和Kroon-Batenburg和Kroon(Glycoconjugate J.[糖结合物杂志]14：677-690)进行描述，这两者都通过引用结合在此。表征纤维素II结构的主要氢键是O2-H---O6、O6-H---O6和O2-H---O2，而纤维素I具有O2-H---O6作为主要氢键。纤维素II的结构包括链折叠并且难以解开。
纤维素由本披露的纤维糊精磷酸化酶产生，直接作为纤维素II。与目前披露的纤维素相对比，自然界中(例如在植物中)产生的纤维素典型地具有纤维素I结构，并且通常需要丝光化过程和/或其他化学处理(例如，衍生化，接着是非衍生化，形成再生纤维素)以将其转化为纤维素II。在某些实施例中，本文的纤维素在水性和干燥两种条件下均呈纤维素II晶体状态。
如本文中生产的纤维素不溶于水性溶剂如水。然而，它可以溶于包含二甲基亚砜(DMSO)和/或N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)的溶剂中。这种溶剂的实例包括单独的或进一步包含氯化锂(LiCl)(例如DMSO/LiCl和DMAc/LiCl)的DMSO或DMAc。本文的DMSO/LiCl溶剂或DMSO/LiCl溶剂可以包含例如约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10wt％的LiCl，或者可以是LiCl-饱和的。本文的纤维素的浓度可以是在非水溶剂中，例如包含DMSO和/或DMAc的非水溶剂中例如处于约0.1-30wt％、0.1-20wt％、0.1-10wt％或0.1-5wt％，或者可以是约或至少约0.1、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30wt％。在某些方面中本文的包含DMSO和DMAc的溶剂不再另外包含酸。例如，本文的纤维素可以在相对低的温度例如15-30℃、20-30℃或20-25℃(例如室温)下溶解在任何前述的基于DMSO和DMAc的溶剂中。在优选的实施例中，不需要施加热量来溶解纤维素。
本披露的酶促反应包括纤维糊精。适合于本文中酶促反应中使用的纤维糊精的实例包括纤维二糖(DP2)、纤维三糖(DP3)、纤维四糖(DP4)、纤维五糖(DP5)和纤维六糖(DP6)。在某些方面中，纤维二糖用作纤维糊精。本文中适合的纤维糊精的其他实例包括由纤维素的分解(例如，酶分解)产生的7个或更多个β-1，4-连接的葡萄糖单体的葡萄糖聚合物。在一些实施例中，可以使用上述类型的纤维糊精中的一种或多种(例如2、3、4或更多种的混合物)。典型地本文的酶促反应中不使用非磷酸化的葡萄糖单体。
如果需要，可以控制本文的包含纤维糊精磷酸化酶的酶促反应的温度。在某些实施例中，温度在约5℃至约50℃之间。在某些其他实施例中，温度在约20℃至约40℃之间。在还其他实施例中，温度可以是约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。可以使用本领域已知的各种手段来维持酶促反应的温度。例如，可以通过将含有反应物的容器放置在设定在所希望的温度的空气或水浴培养箱中来维持温度。
在某些实施例中，本文的酶促反应的pH可以在约5.0至约9.0之间。可替代地，pH可以为约5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、或9.0。可以通过添加或掺入合适的缓冲液来调节或控制pH，包括但不限于：磷酸盐、Tris、柠檬酸盐或其组合。酶促反应中的缓冲液浓度可以为例如从0mM至约100mM、或约10mM、25mM、50mM或75mM。
在目前披露的纤维糊精磷酸化酶反应中的葡萄糖-1-磷酸(G1P)的初始浓度可以为例如约或至少约1至100mM。其他G1P初始浓度可以是例如约或至少约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mM或约10-50mM。在目前披露的纤维糊精磷酸化酶反应中的纤维糊精(例如，纤维二糖)的初始浓度可以是例如约1至50mM。其他纤维糊精初始浓度可以是例如约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50mM或约5-10mM。底物如G1P或纤维糊精的“初始浓度”是指刚刚加入所有反应组分(至少水、G1P、纤维糊精、纤维糊精磷酸化酶)后在酶促反应中的底物浓度。
在一些实施例中，本文的纤维糊精磷酸化酶的活性可以为每mg的酶蛋白约1至30单位。酶活性可以是每mg的酶蛋白约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、10-20或15-20单位。纤维糊精磷酸化酶活性可以使用本领域已知的任何方法测定。纤维糊精磷酸化酶活性的单位可以是指例如在以下条件下每分钟释放1微摩尔无机磷(从纤维二糖释放)的酶的量：约10mM G1P，约5mM纤维二糖，约25mM Tris-HCl缓冲液，约pH 7.0，保持在约37℃，任选地持续约10分钟。可以使用设计用于检测游离磷酸盐的试剂或试剂盒(例如，PiBlueTM磷酸盐测定试剂盒，加利福尼亚州海沃德博世生物技术有限公司(BioAssay Systems，Hayward，CA))来测量来自纤维二糖的无机磷酸盐释放。
在一些方面，酶促反应中包含的纤维糊精磷酸化酶的量可以为约0.1-2.0或0.5-1.0单位/mL。例如，在反应中可以使用至少约0.2、0.4、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8或2.0单位/mL的酶。
本披露的实施例还涉及一种用于生产纤维素的方法，包括：
a)使至少水、葡萄糖-1-磷酸(G1P)、纤维糊精和纤维糊精磷酸化酶(例如，包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的纤维糊精磷酸化酶)接触，其中产生不溶性纤维素；并且
b)任选地，分离在步骤(a)中产生的该纤维素。
本文的生产纤维素的方法中的接触步骤可任选地表征为提供包含水、葡萄糖-1-磷酸、纤维糊精和本披露的纤维糊精磷酸化酶的酶促反应。本文的纤维素生产方法中的接触步骤可以以任何数量的方式进行。例如，可以首先将所希望的量的G1P和/或纤维糊精(例如纤维二糖)溶解在水中(任选地，也可以在这个制备阶段添加其他组分，例如缓冲液组分)，接着添加一种或多种纤维糊精磷酸化酶。反应可以保持静止，或经由例如搅拌或轨道振荡而搅动。反应可以是，并且典型地是无细胞的。
纤维素生产方法的酶促反应可以包含在任何适合用于应用本文披露的一种或多种反应条件的容器中。例如，可以使用具有适合于包含特定反应的尺寸的不锈钢、塑料或玻璃器皿(vessel)或容器(container)。这样的容器可以任选地配备有搅拌装置。
在某些实施例中纤维素生产方法的酶促反应的完成可以目测确定(例如，不再累积不溶性纤维素)和/或通过测量留在反应中的底物(G1P和/或纤维糊精)的量(例如，随着时间的推移，底物水平不再下降)。典型地，所披露的方法的反应可花费例如约12、18、24、30、36、48、60、72、84、或96小时来完成。反应时间可以取决于例如某些参数，如所使用的底物和/或纤维糊精磷酸化酶的量。
在所披露的方法中生产的不溶性纤维素可以任选地被分离。例如，可以通过离心或过滤分离不溶性纤维素。在这样做时，纤维素与反应溶液分离，该反应溶液可以包含水、一种或多种残留的底物和反应副产物。
本文的纤维素生产方法的接触步骤中生产的不溶性纤维素可以具有本文披露的任何特征。例如，如在本文中别处披露的某些非水性组合物中的水不溶性、DPw(例如，10-30的DPw)和/或Mw、配糖键谱图、骨架结构(例如，线性)、纤维素II结构含量和/或溶解度的任何特征可表征在步骤(a)中生产的纤维素。
在一些方面，在纤维素生产方法的接触步骤中生产的不溶性纤维素可以具有纤维素II晶体结构(即，纤维素直接作为纤维素II进行酶促合成)。与目前披露的纤维素相对比，自然界中(例如在植物中)产生的纤维素典型地具有纤维素I结构，并且通常需要丝光化过程和/或其他化学处理(例如，衍生化，接着是非衍生化，形成再生纤维素)以将其转化为纤维素II。在某些实施例中，本文的纤维素在水性和干燥两种条件下均呈纤维素II晶体状态。
本文披露的表征酶促反应实施例的任何特征可用于进行纤维素生产方法的接触步骤。例如，如在本文中别处披露的纤维糊精磷酸化酶氨基酸序列和来源、底物水平、温度、pH和缓冲液水平和/或酶活性/量的任何特征可以表征在接触步骤中进行的反应。
在一些方面，纤维素生产方法的接触步骤可以包含纤维二糖作为纤维糊精。适合于本文中酶促反应中使用的纤维糊精的其他实例包括纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖和纤维六糖。本文中适合的纤维糊精的还其他实例包括由纤维素的分解(例如，酶分解)产生的7个或更多个β-1，4-连接的葡萄糖单体的葡萄糖聚合物。在一些实施例中，可以使用上述类型的纤维糊精中的一种或多种(例如2、3、4或更多种的混合物)。
例如，在纤维素生产方法的接触步骤中提供的葡萄糖-1-磷酸(G1P)可以直接通过添加分离的G1P(例如，从商业来源得到的G1P)来提供。可替代地，可以通过提供至少第二反应在接触步骤中提供G1P，其中第二反应的产物包含G1P(即第二反应产生G1P作为产物)。“第二反应”是指除了在接触步骤中进行的纤维糊精磷酸化酶反应(可以任选地表示为“第一反应”)以外的反应，并且该第二反应提供用于纤维糊精磷酸化酶反应的G1P底物。第二反应可任选地表征为使用“产生G1P的酶”如淀粉磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶或纤维糊精磷酸化酶(当催化纤维素水解时)。
在一些方面，可以在进行纤维糊精磷酸化酶酶促反应的同一容器中提供用于提供G1P的第二反应。可替代地，第二反应可以在进行纤维糊精磷酸化酶酶促反应的容器的外部(与其分开)进行。可以在纤维素生产方法的纤维糊精磷酸化酶酶促反应之前和/或与其连续地进行第二反应。
在一些实施例中，第二反应可以包括使水、无机磷酸盐、淀粉、淀粉磷酸化酶和任选地淀粉脱支酶如支链淀粉酶和/或异淀粉酶接触。这种类型的第二反应可任选地表征为淀粉磷酸化酶反应。适合于本文中使用的淀粉磷酸化酶(EC 2.4.1.1)包括在美国专利申请公开号2002/0133849和Tiwari和Kumar(生物技术与分子生物学评论(Biotechnol.Mol.Biol.Rev.)7：69-83)中披露的那些，例如，将该专利通过引用结合在此。在一些方面，淀粉磷酸化酶可以是植物、微生物(例如，细菌)或真菌(例如，酵母)淀粉磷酸化酶。适合于本文中使用的支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)包括在美国专利号8354101、7906306、7449320和7399623中披露的那些，例如，将该专利通过引用结合在此。在一些方面，支链淀粉酶可以是植物、微生物(例如，细菌)或真菌(例如，酵母)支链淀粉酶。适合于本文中使用的异淀粉酶(EC 3.2.1.68)包括在美国专利号5352602、5811277、7615365和8735105中披露的那些，例如，将该专利通过引用结合在此。在一些方面，异淀粉酶可以是植物、微生物(例如，细菌)或真菌(例如，酵母)异淀粉酶。
在一些实施例中，第二反应可包括使水、无机磷酸盐、蔗糖和蔗糖磷酸化酶接触。这种类型的第二反应可任选地表征为蔗糖磷酸化酶反应。适合于本文中使用的蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)包括在美国专利号5716837、7229801和7968309中披露的那些，例如，将该专利通过引用结合在此。在一些方面，蔗糖磷酸化酶可以是植物、微生物(例如，细菌)或真菌(例如，酵母)蔗糖磷酸化酶。
在一些实施例中，第二反应可以包括使水、无机磷酸盐、纤维素生物质(包含纤维素的生物质如木质纤维素生物质)、内切葡聚糖酶、纤维糊精磷酸化酶和任选的溶解性多糖单加氧酶和/或纤维二糖水解酶接触。适合于本文中使用的内切葡聚糖酶(例如，纤维素酶、β-1，4-葡聚糖酶)包括例如在美国专利号4435307、5776757和7604974中披露的那些，例如，将该专利通过引用结合在此。在一些方面，内切葡聚糖酶(例如纤维素酶)可以是植物、微生物(例如，细菌)或真菌(例如，酵母)内切葡聚糖酶。适合于本文中使用的纤维糊精磷酸化酶可以是目前披露的或如在美国专利号8889379或美国专利申请公开号2014/0087435、2014/0057323和2013/0059340中披露的任何纤维糊精磷酸化酶，例如，将这些专利通过引用结合在此。这种类型的第二反应(即内切葡聚糖酶+纤维糊精磷酸化酶)典型地可以与本文的纤维素生产方法的纤维糊精磷酸化酶酶促反应分开进行。适合于本文中使用的溶解性多糖单加氧酶包括Isaksen等人(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)289：2632-2642)和Eibinger等人(生物化学杂志，2014年10月31日，pii：.jbc.M114.602227[印刷前的电子版(Epub aheadof print)])中披露的那些，例如，将其通过引用结合在此。
本披露的实施例进一步涉及一种包含含有与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的氨基酸序列的酶的组合物，其中该酶具有纤维糊酶磷酸化酶活性。显著地，这种酶能够在干燥和水性两种条件下产生具有增强特征的低分子量不溶性纤维素，使得这种纤维素具有广泛的适用性。包含具有与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的氨基酸序列的纤维糊精磷酸化酶的组合物的非限制性实例是酶促反应，例如还至少包含水、葡萄糖-1-磷酸和一种或多种纤维糊精的酶促反应。
本文中具有纤维糊精磷酸化酶活性的酶可以包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的氨基酸序列。在其他实施例中，这样的酶可以包含与SEQ ID NO：2具有100％同一性或至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。包含SEQ ID NO：2的纤维糊精磷酸化酶的非限制性实例包括包含与SEQ ID NO：4具有100％同一性或至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成的纤维糊精磷酸化酶。变体纤维糊精磷酸化酶(例如，与SEQ IDNO：2或4参考序列具有在90％-99％之间的氨基酸同一性)应当具有相应非变体参考序列的一些(例如，至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)或全部的酶活性(参见上述定义)。
本披露的具有纤维糊精磷酸化酶活性的酶可以任选地在包含水、葡萄糖-1-磷酸和纤维糊精的反应中合成纤维素。在这种反应中产生的纤维素可以是不溶的(水不溶性的)并且具有约10至约30的重均聚合度(DPw)。
在本文的某些方面涉及包含编码包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的氨基酸序列的纤维糊精磷酸化酶的核苷酸序列的多核苷酸序列。例如，如本文披露的任何这样的氨基酸序列可以由核苷酸序列编码。核苷酸序列可任选地与启动子序列(例如，异源启动子)处于可操作连接。一些实施例包括例如包含编码包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的氨基酸序列的纤维糊精磷酸化酶的至少一个开放阅读框的多核苷酸(例如，载体或构建体)。这样的编码区可任选地可操作地连接到适合于例如在细胞(例如细菌细胞；真核细胞如酵母、昆虫或哺乳动物细胞)中或在体外蛋白质表达系统中表达的启动子序列(例如，异源启动子)。载体或构建体的实例包括环状(例如质粒)和非环状(例如线性DNA，例如扩增的DNA序列)多核苷酸分子。
本文的某些实施例涉及生产包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的氨基酸序列的纤维糊精磷酸化酶的方法。该方法可以包括以下步骤：提供具有编码包含与SEQ IDNO：2具有至少90％同一性的氨基酸序列(例如，如本文披露的任何这样的氨基酸序列)的纤维素酶磷酸化酶的核苷酸序列的多核苷酸序列，并且从该多核苷酸序列表达纤维糊精磷酸化酶，由此生成纤维糊精磷酸化酶。这种方法中的表达步骤可以任选地在细胞(例如，细菌细胞如大肠杆菌；真核细胞如酵母(例如酿酒酵母)、昆虫或哺乳动物细胞)中进行。可替代地，可以在体外蛋白质表达系统(例如，无细胞蛋白质表达系统，例如使用兔网织红细胞裂解物或小麦胚芽提取物的那些)中进行表达。此外，可以任选地分离在表达步骤中产生的纤维糊精磷酸化酶。例如，这样的分离可以以产生具有本文披露的任何特征(例如，纯度、pH、缓冲液、和/或盐水平)的组合物的方式进行。
本披露的实施例进一步涉及一种包含纤维素的组合物，其中该纤维素：
(i)具有约10至约1000的重均聚合度(DPw)，
(ii)具有纤维素II晶体结构，并且
(iii)不溶于水性组合物。
显著地，这种低分子量的不溶性纤维素因为其在干燥和水性二者条件下具有增强的特征而具有广泛的效用，如本文中进一步披露的。
目前披露的组合物的纤维素是低分子量纤维素和水不溶性的。在某些实施例中，纤维素可以具有约10-1000的DPw或DPn。例如，本文的纤维素的DPw或DPn可以是约10-500、10-250、10-100、10-75、10-50、10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、15-50、15-45、15-40、15-35、15-30、或15-25。在一些方面，纤维素的DPw或DPn可以是约或至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50。
在本文的一些方面，纤维素可以具有约1700-170000、1700-86000、1700-43000、1700-17000、1700-13000、1700-8500、1700-6800、1700-5100、2550-5100、或2550-4250的Mw。在一些实例中，Mw可以是约或至少约1700、1900、2100、2300、2500、2700、2900、3100、3300、3500、3700、3900、4100、4300、4500、4700、4900、或5100。
目前披露的纤维素的配糖键的约100％是例如β-1，4键。在其他方面，纤维素可以具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的β-1，4键的配糖键谱图。因此，本文的纤维素可以具有例如小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的不是β-1，4的配糖键。
本文披露的纤维素的骨架可以是线性/非支化的。可替代地，纤维素中可以存在分支。因此，在某些实施例中，作为聚合物中配糖键的百分比，纤维素可以不具有分支点或小于约5％、4％、3％、2％或1％的分支点。
如本文披露的纤维素可以具有纤维素II晶体结构。例如，本文的纤维素可以包含按重量计约100％的具有纤维素II晶体结构的纤维素。作为其他实例，纤维素可以包含按重量计至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的具有纤维素II晶体结构的纤维素。在一些方面中，纤维素可以包含按重量计小于约20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的具有纤维素I、III和/或IV晶体结构的纤维素材料。例如，纤维素II晶体结构已经由Kolpak和Blackwell(Macromolecules[大分子]9：273-278)和Kroon-Batenburg和Kroon(Glycoconjugate J.[糖结合物杂志]14：677-690)进行描述，这两者都通过引用结合在此。表征纤维素II结构的主要氢键是O2-H---O6、O6-H---O6和O2-H---O2，而纤维素I具有O2-H---O6作为主要氢键。纤维素II的结构包括链折叠并且难以解开。
本文的纤维素可以被表征为例如被分离。不认为包含如目前披露的纤维素的组合物在自然界中发生。
如本文披露的纤维素可以任选地表征为具有纳米级的薄片或薄片状形状。由纤维素形成的薄片或薄片状形状具有纳米级尺寸；当使用如本发明实例中披露的适当的微观技术时，这种形状可以表现为平坦的薄片材料。在其他方面，本文的纤维素不是衍生的，也没有被衍生。因此，如本文披露的纤维素不包括添加的官能团如醚基(例如羧甲基)或酯基(例如乙酸酯基)。
如本文目前披露的组合物的纤维素可以是包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成的纤维糊精磷酸化酶的产物。在其他实施例中，纤维素可以是包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有100％同一性或至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成的纤维糊精磷酸化酶的产物。包含SEQ ID NO：2的纤维糊精磷酸化酶的非限制性实例包括包含与SEQID NO：4具有100％同一性或至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成的纤维糊精磷酸化酶。包含SEQ ID NO：6的纤维糊精磷酸化酶的非限制性实例包括包含与SEQ ID NO：8具有100％同一性或至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成的纤维糊精磷酸化酶。变体纤维糊精磷酸化酶(例如，与SEQ ID NO：2、4、6或8参考序列具有在90％-99％之间的氨基酸同一性)应当具有相应非变体参考序列的一些(例如，至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)或全部的酶活性(参见上述定义)。使用纤维糊精磷酸化酶的纤维素的生产可以通过例如本文披露的酶促反应来完成。
如由本披露的纤维糊精磷酸化酶产生的纤维素可以具有纤维素II晶体结构；这种纤维素尚未经受丝光化或衍生化过程。本文的纤维素当它通过纤维糊精磷酸化酶的酶促合成之后立即或不久存在(例如，小于约0.5、1、5、10、15、30、60、90或120分钟)时可以包含呈纤维素II晶体状态的纤维素。与目前披露的纤维素相对比，自然界中(例如在植物中)产生的纤维素典型地具有纤维素I结构，并且通常需要丝光化过程和/或其他化学处理(例如，衍生化，接着是非衍生化，形成再生纤维素)以将其转化为纤维素II。在某些实施例中，本文的纤维素包含在水性和干燥两种条件下均呈纤维素II晶体状态的纤维素。
目前披露的组合物的纤维素不溶于水性溶剂如水。相比之下，它可以溶于某些非水性溶剂，例如包含二甲基亚砜(DMSO)和/或N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)的那些。这种溶剂的实例包括单独的或进一步包含氯化锂(LiCl)(例如DMSO/LiCl和DMAc/LiCl)的DMSO或DMAc。本文的DMSO/LiCl溶剂或DMSO/LiCl溶剂可以包含例如约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10wt％的LiCl，或者可以是LiCl-饱和的。本文的纤维素的浓度可以是在非水溶剂中，例如包含DMSO和/或DMAc的非水溶剂中例如处于约0.1-30wt％、0.1-20wt％、0.1-10wt％或0.1-5wt％，或者可以是约或至少约0.1、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30wt％。在某些方面中本文的包含DMSO和DMAc的溶剂不再另外包含酸。例如，本文的纤维素可以在相对低的温度例如15-30℃、20-30℃或20-25℃(例如室温)下溶解在任何前述的基于DMSO和DMAc的溶剂中。在优选的实施例中，不需要施加热量来溶解纤维素。
包含本文的纤维素的组合物可以是非水性的(例如干组合物)。这样的实施例的实例包括膜/涂层、粉末、颗粒、微胶囊、薄片或任何其他形式的颗粒物质。其他实例包括更大的组合物，例如球粒、棒、核、珠粒、片剂、条棍或其他附聚物。本文的非水性组合物或干组合物典型地在其中包含有少于3wt％、2wt％、1wt％、0.5wt％、或0.1wt％的水。例如，非水性组合物或干组合物中的本文的纤维素的量可以是约或至少约1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、16wt％、17wt％、18wt％、19wt％、20wt％、21wt％、22wt％、23wt％、24wt％、25wt％、26wt％、27wt％、28wt％、29wt％、30wt％、31wt％、32wt％、33wt％、34wt％、35wt％、36wt％、37wt％、38wt％、39wt％、40wt％、41wt％、42wt％、43wt％、44wt％、45wt％、46wt％、47wt％、48wt％、49wt％、50wt％、51wt％、52wt％、53wt％、55wt％、56wt％、57wt％、58wt％、59wt％、60wt％、61wt％、62wt％、63wt％、64wt％、65wt％、66wt％、67wt％、68wt％、69wt％、70wt％、71wt％、72wt％、73wt％、74wt％、75wt％、76wt％、77wt％、78wt％、79wt％、80wt％、81wt％、82wt％、83wt％、84wt％、85wt％、86wt％、87wt％、88wt％、89wt％、90wt％、91wt％、92wt％、93wt％、94wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％、99wt％、99.5wt％、或99.9wt％。
在本披露的某些实施例中，包含纤维素的组合物可以是任选地具有至少约100cPs的粘度的水性组合物。例如，本文的水性组合物可以具有的粘度是至少约100cPs、250cPs、500cPs、750cPs、1000cPs、2000cPs、3000cPs、4000cPs、5000cPs、6000cPs、7000cPs、8000cPs、9000cPs、10000cPs、11000cPs、12000cPs、13000cPs、14000cPs、15000cPs、16000cPs、17000cPs、18000cPs、19000cPs、20000cPs、25000cPs、30000cPs、35000cPs、40000cPs、45000cPs、或50000cPs(或在100cPs与50000cPs之间的任何整数)。本文的水性组合物的实例包括胶体分散体。
例如，粘度可以用本文的水性组合物在约3℃至约110℃之间(或在3℃与110℃之间的任何整数)的任何温度下测量。可替代地，粘度可以在例如在约4℃至30℃、或约20℃至25℃之间的温度下测量。粘度可以在大气压(约760托)或任何其他更高或更低的压力下测量。
本文披露的水性组合物的粘度可以使用粘度计或流变仪或使用本领域已知的任何其他方法来测量。本领域技术人员应当理解，粘度计或流变仪可以用于测量本文的表现出剪切稀化行为(即具有随着流动条件变化的粘度)的水性组合物的粘度。这样的实施例的粘度可以例如以约0.1rpm至1000rpm(每分钟转数)的旋转剪切速率测量。在一些实施例中，可以在约10rpm、60rpm、150rpm、250rpm或600rpm的旋转剪切速率下测量粘度。
本文披露的水性组合物的pH可以例如在约2.0至约12.0之间。可替代地，pH可以为例如约2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0；或在5.0至约12.0之间；或在约4.0与8.0之间；或在约5.0与8.0之间。
本文的水性组合物可以包含具有至少约10wt％或20wt％水的溶剂。在其他实施例中，例如，溶剂包含至少约30wt％、40wt％、50wt％、60wt％、70wt％、80wt％、90wt％、或100wt％的水(或在10wt％与100wt％之间的任何整数)。
例如，本披露的纤维素能以约或至少约0.01wt％、0.05wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1.0wt％、1.2wt％、1.4wt％、1.6wt％、1.8wt％、2.0wt％、2.5wt％、3.0wt％、3.5wt％、4.0wt％、4.5wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、16wt％、17wt％、18wt％、19wt％、20wt％、21wt％、22wt％、23wt％、24wt％、25wt％、26wt％、27wt％、28wt％、29wt％、30wt％、31wt％、32wt％、33wt％、34wt％、35wt％、36wt％、37wt％、38wt％、39wt％、40wt％、41wt％、42wt％、43wt％、44wt％、45wt％、46wt％、47wt％、48wt％、49wt％、50wt％、51wt％、52wt％、53wt％、55wt％、56wt％、57wt％、58wt％、59wt％、60wt％、61wt％、62wt％、63wt％、64wt％、65wt％、66wt％、67wt％、68wt％、69wt％、70wt％、71wt％、72wt％、73wt％、74wt％、75wt％、76wt％、77wt％、78wt％、79wt％、80wt％、81wt％、82wt％、83wt％、84wt％、85wt％、86wt％、87wt％、88wt％、89wt％、或90wt％的wt％作为不溶性材料存在于水性组合物中。下面的实例4表明，在某些方面，纤维素在相对低浓度的纤维素下为水性组合物提供高粘度。因此，本披露的某些实施例涉及具有少于约30wt％、29wt％、28wt％、27wt％、26wt％、25wt％、24wt％、23wt％、22wt％、21wt％、20wt％、19wt％、18wt％、17wt％、16wt％、15wt％、14wt％、13wt％、12wt％、11wt％、10wt％、9wt％、8wt％、7wt％、6wt％、5wt％、4wt％、3wt％、2wt％、1wt％、或0.5wt％的本文的纤维素的水性组合物。
除了所披露的纤维素之外，本文的水性组合物可以包含其他组分。例如，水性组合物可以包含一种或多种盐，例如钠盐(例如NaCl、Na2SO4)。盐的其他非限制性实例包括具有(i)铝、铵、钡、钙、铬(II或III)、铜(I或II)、铁(II或III)、氢、铅(II)、锂、镁、锰(II或III)、汞(I或II)、钾、银、钠、锶、锡(II或IV)或锌阳离子，和(ii)乙酸盐、硼酸盐、溴酸盐、溴化物、碳酸盐、氯酸盐、氯化物、亚氯酸盐、铬酸盐、氨腈(cyanamide)、氰化物、重铬酸盐、磷酸二氢盐、铁氰化物、亚铁氰化物、氟化物、碳酸氢盐、磷酸氢盐、硫酸氢盐、硫化氢、亚硫酸氢盐、氢化物、氢氧化物、次氯酸盐、碘酸盐、碘化物、硝酸盐、氮化物、亚硝酸盐、草酸盐、氧化物、高氯酸盐、高锰酸盐、过氧化物、磷酸盐、磷化物、亚磷酸盐、硅酸盐、锡酸盐、亚锡酸盐、硫酸盐、硫化物、亚硫酸盐、酒石酸盐或硫氰酸盐阴离子的那些。因此，例如，具有上述(i)中的阳离子和上述(ii)中的阴离子的任何盐可以在水性组合物中。例如，盐能以约(或至少约)0.01至约10.00(或在0.01至10.00之间的任何百分比增量)的wt％存在于本文的水性组合物中。
包含本文的纤维素的水性组合物可以是例如胶体分散体。本文的胶体分散体中的纤维素颗粒的平均尺寸/直径典型地为在约1nm至200000nm(200微米)的范围内。在一些实例中，平均粒径可以为约1-100nm、1-1000nm、1-10000nm、1-100000nm、1-200000nm、10-100nm、10-1000nm、10-10000nm、10-100000nm、10-200000nm、100-1000nm、100-10000nm、100-100000nm、100-200000nm、1000-10000nm、1000-100000、1000-200000nm、10000-100000nm、或10000-200000nm。
在某些实施例中，水性组合物具有剪切稀化行为。剪切稀化行为被观测为随着剪切速率增加而降低水性组合物的粘度。水性组合物的剪切稀化行为的改性可归因于本文的纤维素与水性组合物的混合。因此，本披露的一种或多种纤维素材料可以添加到水性组合物中以改变其流变特征(即，水性液体、溶液或混合物的流动特性被改变)。而且，可以将本文的一种或多种纤维素材料添加到水性组合物中以改性其粘度。
通过在增加的旋转剪切速率(例如，从约0.1rpm至约1000rpm)下测量粘度可以观测到本文的水性组合物的流变特性。例如，本文披露的水性组合物的剪切稀化行为可以被观测为随着旋转剪切速率从约10rpm增加至60rpm、从10rpm增加至150rpm、从10rpm增加至250rpm、从60rpm增加至150rpm、从60rpm增加至250rpm、或从150rpm增加至250rpm，粘度(cPs)降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％(或在5％与95％之间的任何整数)。
本文披露的组合物和方法的非限制性实例包括：
1.一种酶促反应，该酶促反应包含水、葡萄糖-1-磷酸、纤维糊精和合成不溶性纤维素的纤维糊精磷酸化酶(例如，包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列并且合成不溶性纤维素的纤维糊精磷酸化酶)。
2.如实施例1所述的酶促反应，其中该纤维素具有(i)约10至约30，或(ii)约10至约1000的重均聚合度(DPw)。
3.如实施例1或2所述的酶促反应，其中该纤维糊精包含纤维二糖。
4.一种用于生产不溶性纤维素的方法，该方法包括：
a)使至少水、葡萄糖-1-磷酸、纤维糊精和纤维糊精磷酸化酶如包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的纤维糊精磷酸化酶接触，
其中产生不溶性纤维素；并且
b)任选地，分离在步骤(a)中产生的该不溶性纤维素。
5.如实施例4所述的方法，其中在步骤(a)中产生的该纤维素具有(i)约10至约30，或(ii)约10至约1000的重均聚合度(DPw)。
6.如实施例4或5所述的方法，其中在步骤(a)中产生的该纤维素具有纤维素II晶体结构。
7.如实施例4、5或6所述的方法，其中该纤维糊精包含纤维二糖。
8.如实施例4、5、6或7所述的方法，其中通过提供第二反应在步骤(a)中提供该葡萄糖-1-磷酸，其中该第二反应的产物包含葡萄糖-1-磷酸。
9.如实施例8所述的方法，其中该第二反应通过以下方式产生葡萄糖-1-磷酸：
(i)使水、无机磷酸盐、淀粉、淀粉磷酸化酶和任选地淀粉脱支酶如支链淀粉酶或异淀粉酶接触；
(ii)使水、无机磷酸盐、蔗糖和蔗糖磷酸化酶接触；或
(iii)使水、无机磷酸盐、纤维素生物质、内切葡聚糖酶、纤维糊精磷酸化酶和任选地溶解性多糖单加氧酶和/或纤维二糖水解酶接触。
10.如实施例8或9所述的方法，其中在进行步骤(a)的同一容器中提供该第二反应，并且其中该第二反应在步骤(a)之前和/或与步骤(a)连续进行。
实例
本披露在以下实例中进一步示例。应该理解，这些实例尽管说明了本文的某些优选方面，但仅是以例证的方式给出的。从上述论述和这些实例中，本领域的技术人员可确定所披露的实施例的必要特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可进行各种变化和修改以使所披露的实施例适应多种用途和条件。
实例1
红色弧菌纤维糊精磷酸化酶的表达与分析
本实例描述了推定的红色弧菌纤维糊精磷酸化酶在大肠杆菌中的表达。此外，本实例证明，通过分析酶的比活性，该酶实际上是纤维糊精磷酸化酶。
在红色弧菌DSMl4379中鉴定出推定的纤维糊精磷酸化酶VruCdp1(本文中也称为“CRC03362-VruCdp1”)。编码VruCdp1的核酸序列基于基因组序列预测，并表示为SEQ IDNO：1。由SEQ ID NO：1编码的VruCdp1的氨基酸序列呈现为SEQ ID NO：2。
推定的VruCdp1纤维糊精磷酸化酶接下来在大肠杆菌中如下异源表达。编码VruCdp1的多核苷酸序列针对在大肠杆菌中的表达进行了密码子优化。将该序列(SEQ IDNO：3)通过捷瑞公司(Generay)(上海，中国)在NdeI和XhoI位点处插入到pET30a(Novagen)表达载体中，得到质粒pZZH634。SEQ ID NO：3包含密码子优化的开放阅读框以及在C-末端处编码两个额外氨基酸(Leu-Glu)和6x His标签的序列。由SEQ ID NO：3编码的氨基酸序列呈现为SEQ ID NO：4。将pZZH634质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Novagen)中，将其涂板在补充有50ppm卡那霉素的LB琼脂平板上。将如通过PCR和测序确认的正确转化的菌落接种到补充有50ppm卡那霉素的5ml LB培养基中并在37℃在振荡下培养约16小时。然后将约1mL的培养物接种到补充有50ppm卡那霉素的25mL LB培养基中，并在37℃在振荡下培养直到OD600达到约0.4-1.0。然后将IPTG以100mM的最终浓度加入到培养物中以诱导VruCdp1表达。然后将培养物在16℃下培养12-16小时。
在诱导VruCdp1表达的这段时间后，将大肠杆菌细胞沉淀，重悬于裂解缓冲液(50mM Tris pH 7.0，500mM NaCl，10％甘油，0.1％吐温-20)中，并通过超声处理在冰上裂解10分钟(35％功率，20分钟，2秒开/2秒关)(SCIENT2-II D，宁波新芝生物科技有限公司(Ningbo Scientz Biotechnology Co.，Ltd))。通过以13000rpm离心30分钟来清除裂解物(贝克曼库尔特商贸公司(BECKMAN COULTER)，AvantiTMJE)。将澄清的裂解物施用到用50mMTris pH 7.0、500mM NaCl和10％甘油预平衡的His TrapTMHP(5mL)(GE医疗集团(GEHealthcare))上。用在平衡缓冲液中从0-250mM咪唑的线性梯度从柱上洗脱出靶蛋白(VruCdp1)。将含有靶蛋白的级分合并、浓缩并使用10K Amicon Ultra装置交换为平衡缓冲液，并在-20℃下储存在40％甘油中直至使用。
使用10mM G-1-P(Sigma G7000，α-D-葡萄糖-1-磷酸二钠盐水合物)和5mM纤维二糖(Sigma C7252，D-(+)-纤维二糖)作为底物测量VruCdp1(上述分离的)的活性。测定在25mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.0中在37℃下进行10分钟。使用PiBlueTM试剂(博世生物技术有限公司，美国)定量来自酶促反应的磷释放。纤维糊精磷酸化酶活性的一个单位被定义为在测定条件下每分钟释放1μmol无机磷的酶的量。分离的VruCdp1的比活性测定为18.4单位/mg。基于该观测，VruCdp1被确定为属于糖基水解酶家族94(GH94，CAZy编号)的纤维糊精磷酸化酶(EC 2.4.1.49)。
因此，包含SEQ ID NO：2(VruCdp1)的酶被表达、分离并显示具有纤维糊精磷酸化酶活性。
实例2
查帕西斯瘤胃球菌纤维糊精磷酸化酶的表达与分析
本实例描述了推定的查帕西斯瘤胃球菌纤维糊精磷酸化酶在大肠杆菌中的表达。此外，本实例证明，通过分析酶的比活性，该酶实际上是纤维糊精磷酸化酶。
在查帕西斯瘤胃球菌18P13中鉴定出推定的纤维糊精磷酸化酶RchCdp1(本文中也称为“CRC03359-RchCdp1”)。编码RchCdp1的核酸序列(基因库登录号NC_021039.1的位置2373141至2375537)呈现为SEQ ID NO：5。由SEQ ID NO：5编码的RchCdp1的氨基酸序列呈现为SEQ ID NO：6。
推定的RchCdpl纤维糊精磷酸化酶接下来在大肠杆菌中如下异源表达。编码RchCdp1的多核苷酸序列针对在大肠杆菌中的表达进行了密码子优化。将该序列(SEQ IDNO：7)通过捷瑞公司(上海，中国)在NdeI和XhoI位点处插入到pET30a(Novagen)表达载体中，得到质粒pZZH631。SEQ ID NO：7包含密码子优化的开放阅读框以及在C-末端处编码两个额外氨基酸(Leu-Glu)和6x His标签的序列。由SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列呈现为SEQ ID NO：8。将pZZH631质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Novagen)中，将其涂板在补充有50ppm卡那霉素的LB琼脂平板上。将如通过PCR和测序确认的正确转化的菌落接种到补充有50ppm卡那霉素的5ml LB培养基中并在37℃在振荡下培养约16小时。然后将约1mL的培养物接种到补充有50ppm卡那霉素的25mL LB培养基中，并在37℃在振荡下培养直到OD600达到约0.4-1.0。然后将IPTG以100mM的最终浓度加入到培养物中以诱导RchCdp1表达。然后将培养物在16℃下培养12-16小时。
在诱导RchCdp1表达的这段时间后，将大肠杆菌细胞沉淀，重悬于裂解缓冲液(50mM Tris pH 7.0，500mM NaCl，10％甘油，0.1％吐温-20)中，并通过超声处理在冰上裂解10分钟(35％功率，20分钟，2秒开/2秒关)(SCIENT2-II D，宁波新芝生物科技有限公司(Ningbo Scientz Biotechnology Co.，Ltd))。通过以13000rpm离心30分钟来清除裂解物(贝克曼库尔特商贸公司(BECKMAN COULTER)，AvantiTMJE)。将澄清的裂解物施用到用50mMTris pH 7.0、500mM NaCl和10％甘油预平衡的His TrapTM HP(5mL)(GE医疗集团(GEHealthcare))上。用在平衡缓冲液中从0-250mM咪唑的线性梯度从柱上洗脱出靶蛋白(RchCdp1)。将含有靶蛋白的级分合并、浓缩并使用10K Amicon Ultra装置交换为平衡缓冲液，并在-20℃下储存在40％甘油中直至使用。
使用10mM G-1-P(Sigma G7000，α-D-葡萄糖-1-磷酸二钠盐水合物)和5mM纤维二糖(Sigma C7252，D-(+)-纤维二糖)作为底物测量RchCdp1(上述分离的)的活性。测定在25mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.0中在37℃下进行10分钟。使用PiBlueTM试剂(博世生物技术有限公司，美国)定量来自酶促反应的磷释放。纤维糊精磷酸化酶活性的一个单位被定义为在测定条件下每分钟释放1μmol无机磷的酶的量。分离的RchCdp1的比活性测定为15.4单位/mg。基于该观测，RchCdp1被确定为属于糖基水解酶家族94(GH94，CAZy编号)的纤维糊精磷酸化酶(EC 2.4.1.49)。
因此，包含SEQ ID NO：6(RchCdp1)的酶被表达、分离并显示具有纤维糊精磷酸化酶活性。
实例3
使用红色弧菌和查帕西斯瘤胃球菌纤维糊精磷酸化酶来生产低分子量不溶性纤 维素
该实例描述了当应用于含有G-1-P和纤维糊精的反应中时，使用实例1和2中所述的纤维糊精磷酸酶来生产纤维素。
在红色弧菌纤维糊精磷酸化酶(VruCdp1，参见实例1)的存在下，包含G-1-P和纤维二糖的反应产生不溶性多糖。为了产生足够的不溶性多糖进行分析，通过将1g G-1-P、0.25g纤维二糖和400μg(约7.4单位)分离的VruCdp1加入到含有80mL25mM Tris缓冲液pH7.0中进行按比例放大反应。将反应在37℃孵育过夜。通过以3000rpm离心20分钟收集不溶性多糖产物。该材料被确定为低分子量纤维素(参见下面的实例4)。
在查帕西斯瘤胃球菌纤维糊精磷酸化酶(RchCdp1，参见实例2)的存在下，包含G-1-P和纤维二糖的反应产生不溶性多糖。为了产生足够的不溶性多糖进行分析，通过将1gG-1-P、0.25g纤维二糖和400μg(约6.2单位)分离的RchCdp1加入到含有80mL 25mM Tris缓冲液pH 7.0中进行按比例放大反应。将反应在37℃孵育过夜。通过以3000rpm离心20分钟收集不溶性多糖产物。该材料被确定为低分子量纤维素(参见下面的实例4)。
因此，当在包含G-1-P和纤维糊精(例如纤维二糖)底物的反应中提供时，包含SEQID NO：2(VruCdp1)或SEQ ID NO：6(RchCdp1)的酶产生低分子量的不溶性纤维素。值得注意的是，这些酶具有这种特定的纤维素合成活性，鉴于类似表达和分析的十六种其他纤维糊精磷酸化酶没有这种能力(数据未示出)。
实例4
由红色弧菌和查帕西斯瘤胃球菌纤维糊精磷酸化酶产生的不溶性多糖的分析
该实例描述了在实例3中所述的反应中获得的不溶性多糖产物的各种分析。这些分析表明产品包含低分子量的不溶性纤维素。
对由红色弧菌和查帕西斯瘤胃球菌纤维糊精磷酸化酶产生的不溶性物质(实例3)进行1H-NMR分析。简言之，13.8mg的每种样品通过在60℃下在0.8ml DMSO-d6，3wt％LiCl中搅拌1小时溶解。使用配备有5-mm CPC Q1冷冻探针的AVANCE III HDNMR装置在溶解的样品上进行NMR。该分析表明，不溶性物质是葡萄糖与β-1，4键的聚合物，该β-1，4键是纤维素的特征键。因此，由红色弧菌和查帕西斯瘤胃球菌纤维糊精磷酸化酶产生的不溶性物质包含不溶性纤维素。
使用三检测器SEC(尺寸排阻色谱法)进一步分析每种不溶性纤维素材料以确定其分子量(Mw)。简言之，每种样品以0.1-0.3wt％溶解在DMSO，2wt％LiCl中，并穿过SEC。发现每种样品的Mw为约3-4kDa(DPw约18-24)(表2)。
表2
由RchCdp1和VruCdp1酶产生的纤维素的分子量
aMn，数均分子量。
bMp，峰分子量。
cMw，质均分子量。
dMz，z-均分子量。
eDPw，质均聚合度。
fIV，特性粘度。
因此，与由棉花、木浆和微生物来源获得的纤维素相比，由RchCdp1和VruCdp1酶中的每一种产生的纤维素样品具有低得多的分子量。
低分子量纤维素样品在室温下在DMSO/LiCl(如上述提供用于SEC分析的制剂)和DMAc/LiCl(5wt％LiCl在DMAc中)中是易于溶解的和可过滤的。这是值得注意的，因为例如从木浆获得的纤维素典型地不能溶解在DMSO/LiCl中，并且需要升高的温度(例如约100℃)和时间(例如1天或更多天)来溶解在DMAc/LiCl中。由于对每个样品观察到明显的粘度计峰(数据未示出)，看起来酶促产生的低分子量纤维素分子表现为刚性棒。
制造后原样的(如实例3中生产的并储存在水中，但从未干燥的)和干燥的纤维素材料(如由RchCdp1和VruCdp1酶两者合成的)二者在广角X射线散射(WAXS)分析下表现出指示纤维素II晶体的反射，这是纤维素的最稳定的晶体形式。值得注意的是，尽管制造后原样的样品在酶促生产后在大量的水中提供(分别地对于RchCdp1和VruCdp1酶的纤维素产物，98.5wt％和97.5wt％的水)，但是仍然观测到清楚的反射，叠加到来自水的广泛的无定形衍射。纤维素II结构的这种观测是有趣的，因为据信典型地在纤维素经历某些化学处理步骤(例如丝光化；衍生化，接着是回收未衍生的纤维素)后获得纤维素II(Kroon-Batenburg和Kroon，糖结合物杂志14：677-690)。相比之下，本发明实例表明，如在含有RchCdp1和VruCdp1酶的反应中直接产生的纤维素具有纤维素II晶体结构，而不施加任何合成后化学处理。
原子力显微镜法(AFM)用于分析通过干燥由RchCdp1或VruCdp1酶合成的不溶性纤维素的胶体分散体制成的薄膜。简言之，使用具有3密耳厚度的刮刀涂布机从约2wt％的不溶性纤维素在水中的分散体流延膜。将涂覆的湿膜在室温下通过缓慢的水蒸发干燥。干燥涂层的AFM分析(图1A和1B)显示出具有约5nm的高度均匀厚度和几百纳米的宽度的片材的独特形态。据信这样的二维石墨烯状纤维素涂层以前从未被证实。典型地相反，纤维素材料如纳米结晶纤维素和来自微生物来源的纤维素材料形成棒状胶体，而不是二维薄片状结构。预期薄片状二维结构具有许多优点。例如，具有这种结构特性的纤维素材料可能具有增强的氧和/或水阻挡特性。此外，本文提供的纤维素材料的高度结晶性质应当允许传统的热塑性聚合物的增加的机械特性。
上述制备的不溶性纤维素的胶体分散体可以容易地被涂覆以产生高度透明的连续膜。这种膜具有在1与2微米之间的范围内的非常薄的厚度，具有约300nm的粗糙度(数据未示出)。因此，预期本文提供的低分子量的不溶性纤维素材料在能够实现许多应用的水基涂料体系中是有用的。此类应用的实例包括包装塑料上的氧气和水蒸气阻挡涂层、以及水果和蔬菜上的可食用涂层，以增加产品保质期。此外，所披露的涂层可用于种子包衣应用并且能够实现药物组合物中的活性成分释放。
分析含有1.7-2.5wt％的由RchCdp1或VruCdp1酶合成的不溶性纤维素的在水中的胶体分散体的粘度。简言之，使用布鲁克菲尔德(Brookfield)流变仪获得粘度对剪切速率数据，其中从曲线以10(1/s)的剪切速率测量粘度。发现两种胶体分散体都表现出高于水的粘度10000倍的高粘度(图2)。此外，分散体表现出剪切稀化行为(其中粘度随剪切速率的变化而降低)，这在许多增稠应用中是期望的。鉴于每种不溶性纤维素样品具有低DPw(小于25DPw，表2)，获得如此高的粘度水平是值得注意的。事实上，可商购的羧甲基衍生的纤维素(水溶性的)需要显著更高的DPw(约1000或更高)以将在水中的粘度增加至与使用本文提供的不溶性纤维素样品时观察到的粘度相同的程度(图3)。
因此，由红色弧菌和查帕西斯瘤胃球菌纤维糊精磷酸化酶产生的不溶性多糖物质包含低分子量的不溶性纤维素。该纤维素具有约18-24的DPw并表现出纤维素II晶体结构。该纤维素II晶体结构不是诸如丝光化或衍生化/非衍生化过程的化学处理的结果，而是在其由酶促直接产生时表征不溶性纤维素材料。本文提供的不溶性纤维素的独特特性赋予该材料广泛的效用，例如在粘度和流变学改性应用以及膜/阻挡层应用中使用。

Claims (12)

1.一种酶促反应，该酶促反应包含水、葡萄糖-1-磷酸、纤维糊精和包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的纤维糊精磷酸化酶，
其中该纤维糊精磷酸化酶合成不溶性纤维素。
2.如权利要求1所述的酶促反应，其中所述纤维素具有10至1000的重均聚合度(DPw)。
3.如权利要求1所述的酶促反应，其中所述纤维素具有10至30的重均聚合度(DPw)。
4.如权利要求1所述的酶促反应，其中该纤维糊精包含纤维二糖。
5.一种用于生产不溶性纤维素的方法，所述方法包括：
a)使至少水、葡萄糖-1-磷酸、纤维糊精和包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的纤维糊精磷酸化酶接触，
其中产生不溶性纤维素；并且
b)任选地，分离在步骤(a)中产生的该不溶性纤维素。
6.如权利要求5所述的方法，其中在步骤(a)中产生的该纤维素具有约10至约1000的重均聚合度(DPw)。
7.如权利要求5所述的方法，其中在步骤(a)中产生的该纤维素具有约10至约30的重均聚合度(DPw)。
8.如权利要求5所述的方法，其中在步骤(a)中产生的该纤维素具有纤维素II晶体结构。
9.如权利要求5所述的方法，其中该纤维糊精包含纤维二糖。
10.如权利要求5所述的方法，其中通过提供第二反应在步骤(a)中提供所述葡萄糖-1-磷酸，其中该第二反应的产物包含葡萄糖-1-磷酸。
11.如权利要求10所述的方法，其中该第二反应通过以下方式产生葡萄糖-1-磷酸：
(i)使水、无机磷酸盐、淀粉、淀粉磷酸化酶和任选地淀粉脱支酶如支链淀粉酶或异淀粉酶接触；
(ii)使水、无机磷酸盐、蔗糖和蔗糖磷酸化酶接触；或
(iii)使水、无机磷酸盐、纤维素生物质、内切葡聚糖酶、纤维糊精磷酸化酶和任选地溶解性多糖单加氧酶和/或纤维二糖水解酶接触。
12.如权利要求10所述的方法，其中在进行步骤(a)的同一容器中提供该第二反应，并且其中该第二反应在步骤(a)之前和/或与步骤(a)连续进行。
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