CN101517073A - 用于酶促水解经预处理之木素纤维素原料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于将经预处理的木素纤维素原料酶促水解成可溶性糖的酶混合物。还提供了用酶混合物水解经预处理之木素纤维素原料的方法。所述酶促水解包括将纤维素酶混合物添加至经预处理的木素纤维素原料中。所述纤维素酶混合物包含CBH1和CBH2以及EG1和EG2的主要纤维素酶混合物。在所述主要纤维素酶混合物中，CBH1和CBH2以高于或等于55％且低于85％存在。此外，CBH2以相对于CBH1和CBH2的一个分数而存在，EG2以相对于EG1和EG2的一个分数而存在。

Description

用于酶促水解经预处理之木素纤维素原料的方法
技术领域
本发明涉及酶混合物。还提供了酶促水解木素纤维素原料的方法，特别是酶促水解经预处理之木素纤维素原料的方法。
背景技术
当前，燃料乙醇由原料如玉米淀粉、甘蔗和糖用甜菜来生产。然而，由于适于生产这些作物的大部分耕地已用来为人类和动物提供食物来源，因此利用这些原料生产乙醇的潜力是有限的。另外，由于转化过程中使用化石燃料，因而从这些原料生产乙醇会排放出大量的温室气体。
近年来，利用含有纤维素的原料(例如农业残余物(agriculturalresidue)、草和林业残余物(forestry residue))生产乙醇已受到广泛关注。究其原因是这些原料来源广泛且价格低廉，并且使用这些原料生产乙醇为焚烧或掩埋木素纤维素废弃物提供了替代方案。此外，所述原料中的一部分——木质素——可用作燃料来为该方法提供能量，而无需使用化石燃料。若干研究已表明，当考虑到整个生产和消费循环时，使用从纤维素生产的乙醇所产生的温室气体近乎为零。
可用于生产乙醇的最有前景的木素纤维素原料(lignocellulosicfeedstock)包括：(1)农业残余物，例如玉米秸秆、麦秸、大麦秸秆、燕麦秸秆、稻秸、油菜秆和大豆秸秆；(2)草类，例如柳枝稷(switch grass)、芒属植物(miscanthus)、米草(cord grass)和草芦(reed canary grass)；(3)纤维加工残余物，例如玉米纤维、甜菜渣(beet pulp)、纸浆厂细小纤维(fines)和废弃物以及甘蔗渣；(4)林业废弃物，例如山杨木、其他硬木、软木和锯屑；以及(5)消费后的废弃纸产品。
将木素纤维素原料转化成乙醇的最重要工艺步骤包括将纤维素转化为葡萄糖，随后通过发酵将葡萄糖转化为乙醇。实现该工艺步骤的两个主要方法是：酸水解，其包括使用一步酸处理来水解原料；酶促水解，其包括用酸进行预处理以及随后的纤维素酶水解。
在酸水解过程中，通常在足以使纤维素水解为葡萄糖以及使半纤维素水解为木糖和阿拉伯糖的温度、酸浓度和时间长度下用蒸汽和硫酸处理原料。所述酸可以是浓的(25-80％重量/重量)或者稀的(3-8％重量/重量)。然后使用酵母将葡萄糖发酵生成乙醇，回收乙醇并通过蒸馏对其进行纯化。任选地，可将葡萄糖发酵为乳酸、丁醇或另一些产物。
在酶促水解过程中，选择反应条件以使纤维性原料被转化为泥状物(muddy texture)因而使纤维素表面积显著增加，而纤维素极少转化为葡萄糖。然后，在随后的步骤中使用纤维素酶将经预处理的纤维素水解为葡萄糖。在该情形中，蒸汽和/或者酸处理被称为“预处理”。然后，可将葡萄糖发酵为乙醇、乳酸、丁醇或另一些产物。在加入酶之前，将所述酸性原料的pH调整至适于进行酶促水解反应的值。通常，这包括添加碱使pH为约4至约6(其为多种纤维素酶的最适pH范围)，而当使用嗜碱纤维素酶时该pH值可以更高。
在一种类型的预处理工艺中，通过爆炸减压(explosive decompression)使蒸汽产生的压力迅速下降，其称为“蒸汽爆炸(steam explosion)”。Foody(美国专利No.4,461,648)描述了用于蒸汽爆炸预处理的装置和条件。使用硫酸在pH 0.4～2.0下进行蒸汽爆炸所产生的预处理材料质地均一，并且与其他预处理方法相比需要较少的纤维素酶来水解纤维素。
纤维素酶催化原料中的纤维素水解(β-1，4-D-葡聚糖键水解)成葡萄糖、纤维二糖以及另一些纤维寡糖。纤维素酶是多酶混合物的通称，其包括外部作用的纤维二糖水解酶(CBH)、葡聚糖内切酶(EG)和β-葡萄糖苷酶(βG)，这些酶可由多种植物和微生物产生。里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶中包含纤维素结合结构域的酶包括：CBH1(更常称为Cel7A)、CBH2(Cel6A)、EG1(Cel7B)、EG2(Cel5)、EG4(Cel61A)、EG5(Cel45A)、EG6(Cel74A)、Cip1、Cip2、乙酰木聚糖酯酶、β-甘露聚糖酶和纤维素膨胀因子(swollenin)。EG3(Cel12)则是不含纤维素结合结构域的纤维素分解酶的例子。
纤维素酶协同作用将纤维素水解为葡萄糖。CBH1和CBH2作用于纤维素链相对的末端以释放纤维二糖(Barr等，1996)，而葡聚糖内切酶则作用于纤维素的内部位点。这些酶的主要产物是纤维二糖，其被β-葡萄糖苷酶进一步水解成葡萄糖。已知大多数CBH和EG通过其碳水化合物结合模块(CBM)(如纤维素结合结构域(CBD))与原料中的纤维素结合，而大多数β-葡萄糖苷酶(包括木霉属(Trichoderma)和曲霉属(Aspergillus)的β-葡萄糖苷酶)不含有这样的结合模块并因此在水解过程中保留在溶液中。纤维素酶可能含有连接催化结构域与碳水化合物结合模块的接头区域。认为该接头区域有利于催化活性结构域发挥活性。
纤维素酶酶促水解不溶性纤维素底物的动力学不遵循简单的米氏规律(Michaelis-Menten behaviour)(Zhang等，1999)。具体而言，在给定时间内，葡萄糖的产量不随着水解反应中纤维素酶剂量的增加而呈线性增加。并且，随着纤维素水解的进行，反应速率显著下降(Tolan，2002)。已提出有关反应速率下降的若干种解释。最主要的假说包括产物抑制、在水解过程中底物的顽拗性(recalcitrance)提高以及酶失活。
在纤维素乙醇的生产中，纤维素酶作用的动力学使得酶促水解经预处理之材料成为低效步骤。通过提高纤维素酶的生产或活性以降低酶促水解相关的成本已被认为是节省成本的主要契机(Sheehan，1999)。最近，来自由美国能源部资助的纤维素乙醇工厂的报告估计，与从淀粉生产乙醇所需的酶相比，生产纤维素乙醇用酶的成本要高出10～25倍(Houghton，2006)。
已有几种方法用来提高纤维素酶混合物的活性。提高由微生物(其还分泌混合纤维素酶)产生的β-葡萄糖苷酶的量可减轻由纤维二糖引起的产物抑制(美国专利No.6,015,703)。还可使用合理设计或随机诱变技术来调节各种酶的活性，如产生了热稳定性增强的CBH1变体所证明的那样(WO2005/0277172)。研究基因多样性的另一种替代方法是直接从多个纤维素分解性物种(cellulolytic species)中寻找酶同源物。使用该方法已得到了CBH1(WO 2004/0197890)和CBH2(WO 2006/0053514)。还已得到将内切和外切纤维素分解酶的互补活性进行组合的融合蛋白(WO2006/00057672)。纤维素分解酶的模块式结构域的结构允许构建包含催化结构域的酶。CBD的缺失显著影响这些酶与底物的结合以及活性(WO2004/0053373，WO 2006/0008885)。已创建出经遗传改造的包含催化活性结构域、接头区域和CBD之新组合的纤维素水解酶(美国专利No.5,763,254)。
所有上述方法尽管针对纤维素酶促水解的不同方面，但是却没有将纤维素酶的活性提高到足以克服纤维素水解用酶成本高之问题的程度。这些策略的一个缺点是一次仅关注于单一种酶，而忽视了可能的与其他纤维素分解酶的协同作用。
因此，提高纤维素酶系统活性的更好方法是致力于使包含多于一种纤维素酶组分的混合物的活性最大化。已有报道称，内切和外切纤维素酶之组合的纤维素水解效率要远高于这些酶单独作用时的活性总和(Wood和McCrae，1979)。先前的研究已通过观察二元或三元混合物的行为来测量里氏木霉的纤维素分解酶之间的协同作用(例如，Nidetsky等，1994)。例如，Wood等人(1989)研究了嗜松青霉(Penicillium pinophilum)的纤维二糖水解酶和葡聚糖内切酶的二元、三元和七元混合物。然而，在青霉菌酶的二元混合物中未观察到协同性。还对来自细菌Thermobifida fusca的3种酶(其中两种来自与包含主要木霉属酶的家族同样的家族)的二元混合物的协同性进行了表征(Jeoh，2006)。然而，尚未有关于性能提高的报道。
已数次尝试针对给定的酶剂量(所述酶剂量是水解给定质量的纤维素所需的酶质量)研发使纤维素水解量最大化的CBH和EG混合。例如，已报道了包含细菌(主要来自T.fusca)的混合来源的纤维素酶之优化混合物(Irwin，1993；Walker等，1993；Kim等，1998)。这些研究中也包括木霉属的CBH1和CBH2，然而细菌不能产生纤维素酶家族7的成员，因此EG1不包括在这些混合物中。Baker等人(1998)曾尝试测定木霉属CBH1、CBH2和EG1的优化混合物，但他们的实验中未包含EG2。在Baker等人的研究中，底物为Sigmacell(一种微晶纤维素制品)。Boisset等人(2001)以细菌纤维素为底物对来自特异腐质霉(Humicola insolens)的CBH1、CBH2和EG5的三元混合物进行优化。然而，这些研究均未成功开发出对预处理木素纤维素生物质之水解性能提高的纤维素酶混合物。
因此，尽管已进行了许多研究，仍需要对预处理木素纤维素原料中的纤维素之水解性能提高的纤维素酶混合物。缺乏这样的酶混合物极大阻碍了将纤维素转化为可溶性糖(包括用于乙醇和另一些产品生产的葡萄糖)的商业化。
发明概述
本发明涉及酶混合物。还提供了酶促水解木素纤维素原料的方法，特别是酶促水解经预处理之木素纤维素原料的方法。
本发明的一个目的是提供酶促水解经预处理之木素纤维素原料的改进方法。
特别地，本发明提供了使用四种主要纤维素酶(CBH1、CBH2、EG1和EG2)的组合来提高将经预处理之木素纤维素原料转化为可溶性糖。
本发明的一个方面提供了将经预处理的木素纤维素原料酶促水解为可溶性糖的方法，所述酶促水解包括将纤维素酶混合物添加至经预处理的木素纤维素原料中，所述纤维素酶混合物包含纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以及葡聚糖内切酶EG1和EG2的主要纤维素酶混合物，其中纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于55％且低于85％存在于主要纤维素酶混合物中，并且CBH2以相对于纤维二糖水解酶CBH1和CBH2的一个分数而存在(定义为fC2)，EG2以相对于葡聚糖内切酶EG1和EG2的一个分数而存在(定义为fE2)，其中：
当纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于55％且低于65％存在于主要纤维素酶中时，fC2和fE2的值涵盖在图3A的区域1内；
当纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于65％且低于75％存在于主要纤维素酶中时，fC2和fE2的值涵盖在图3B的区域1、2和3内；
当纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于75％且低于85％存在于主要纤维素酶中时，fC2和fE2的值涵盖在图3C的区域1、2和3内。
本发明的另一方面提供了以上定义的纤维素酶混合物。
优选地，纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于65％且低于85％存在于主要纤维素酶中。当所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以65％～75％存在于主要纤维素酶中时，所述fC2和所述fE2的值均优选在图3B的区域2和3内。优选地，fC2和fE2的值均在图3B的区域3内。当纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以75％～85％存在于主要纤维素酶中时，fC2和fE2的值优选在图3C的区域2和3内。优选地，fC2和fE2的值均在图3C的区域3内。
本发明还涉及上述发明的任何上述方面，其中所述主要纤维素酶来源于真菌。编码所述主要纤维素酶的序列可来自子囊菌(Ascomycet)或担子菌(Basidiomycete)。优选地，所述主要纤维素酶来自木霉属(Trichoderma ssp.)、曲霉属(Aspergillus ssp.)、肉座菌属(Hypocrea ssp.)或腐质霉属(Humicola ssp.)。更优选地，编码所述主要纤维素酶的序列来自里氏木霉。
本发明还涉及上述发明的任何上述方面，其中所述主要纤维素酶获得自表达内源性编码序列的生物。或者，所述主要纤维素酶获得自表达异源性编码序列的生物。优选地，所述主要纤维素酶来自里氏木霉。
优选地，所述酶促水解将经预处理的木素纤维素原料中至少约80％的纤维素转化为可溶性糖。可溶性糖可被发酵为乙醇、乳酸、丁醇或其组合。
优选使用含有β-葡萄糖苷酶和里氏木霉分泌组(secretome)的纤维素酶进行酶促水解。
本发明所包括的主要纤维素酶混合物与现有技术中所述的那些相比表现出显著更高的活性。结果显示，本发明中纤维素酶混合物比现有的纤维素酶混合物更强或更有活性，其高出：约10％～约50％(或其间任意量)；或者约10％～约25％(或其间任意量)；或者约10％～约15％(或其间任意量)。
“纤维素-乙醇技术”的经济可行性受到纤维素酶成本的制约。通过提供具有更高活性的酶，本发明的纤维素酶使得该方法更加经济，并且相比于现有技术有显著进步。
该发明概述不必然描述了本发明的所有特征。
附图说明
图1包括经纯化的主要纤维素酶组分的SDS-PAGE和Western印迹分析。图1A显示SDS-PAGE之后经纯化的CBH1、CBH2、EG1和EG2的考马斯蓝染色。对木霉属的纤维素酶进行分析作为平行对照。图1B显示在SDS-PAGE分离并电转移至PVDF膜之后对这些样品进行组分特异性Western印迹分析。
图2是表示ELISA分析结果的柱状图。黑色实心柱表示商品木霉属纤维素酶中CBH1、CBH2、EG1和EG2的百分比组成。其余的柱表明每组ELISA的特异性水平。显示了以下百分比组成：缺乏CBH1之纤维素酶中的CBH1(a)、缺乏CBH2之纤维素酶中的CBH2(b)、缺乏EG1之纤维素酶中的EG1(c)、缺乏EG2之纤维素酶中的EG2(d)。
图3显示含有CBH1、CBH2、EG1和EG2的主要纤维素酶混合物的酶活性图。以EG2相对于EG总量的不同含量分数以及CBH2相对于CBH总量的不同含量分数(分别表示为fE2和fC2)进行测量来绘制各纤维素酶混合物的活性。每个方块中所列的值表示与该实施例中所述基准值相比的所述混合物活性。各种纤维素酶混合物的活性以相对于基准混合物(CBH1、CBH2、EG1和EG2的重量百分比分别为57％、29％、7％、7％)的活性来表示。图3A显示，当CBH1和CBH2的总含量在主要纤维素酶总量中高于或等于55％且低于65％时的混合物活性。图3B显示，当CBH1和CBH2的总含量在主要纤维素酶总量中高于或等于65％且低于75％时的混合物活性。图3C显示，当CBH1和CBH2的总含量在主要纤维素酶总量中高于或等于75％且低于85％时的混合物活性。图3D显示，当CBH1和CBH2的总含量在主要纤维素酶总量中高于或等于85％且低于95％时的混合物活性。
图4是三维图，其显示在由％CBH、fC2和fE2限定的混合物空间(blendspace)中改进的主要纤维素酶混合物所占据的区域。活性为相对于基准混合物的值。每对图像提供了同一区域的两个视图，其区别在于绕％CBH轴旋转180°。图4A显示包含图3A之区域1以及图3B和3C之区域1、2和3的混合物。图4B显示包含图3B和3C之区域2和3的混合物。图4C显示包含图3B和3C之区域3的混合物。
图5是显示基准混合物(其是由以野生型纤维素酶中观察到之相对比例的主要纤维素酶组成的混合物)与代表性改进混合物对经预处理之木素纤维素底物的转化的图。
发明详述
本发明涉及酶混合物。还提供了酶促水解木素纤维素原料的方法，特别是酶促水解经预处理之木素纤维素原料的方法。
以下描述为优选实施方案。
本发明涉及纤维素酶混合物，其包含用于水解经预处理之木素纤维素原料的主要纤维素酶。“主要纤维素酶”被定义为纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以及葡聚糖内切酶EG1和EG2。除了主要纤维素酶CBH1、CBH2、EG1和EG2外，所述纤维素酶混合物可包含额外的纤维素酶以及β-葡萄糖苷酶组分，如下文所进一步详述。
以下定义涉及由隶属国际生物化学与分子生物学联盟的生物化学命名联合委员会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature of theInternational Union of Biochemistry and Molecular Biology)定义(发表于Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego，California，ISBN0-12-227164-5；增补于Eur.J.Biochem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250，1-6；以及Eur.J.Biochem.1999，264；610-650，每篇文献均通过参考并入本文中；也可参见：chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)的纤维二糖水解酶、葡聚糖内切酶和β-葡萄糖苷酶的分类，并涉及由CAZy体系定义的糖类水解酶(glycohydrolase)家族之纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，所述CAZy体系被认可为糖类水解酶的标准命名(Coutinho，P.M.& Henrissat，B.，1999，“Carbohydrate-active enzymes：an integrated database approach.”InRecent Advances in Carbohydrate Bioengineering，H.J.Gilbert，G.Davies，B.Henrissat和B.Svensson编辑，The Royal Society of Chemistry，Cambridge，3-12页，其通过参考并入本文中，也可参见：afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)并为本领域技术人员所熟知。
“CBH1”是一种碳水化合物活性酶，其表达自编码糖类水解酶(GH)家族7之催化结构域(归类为EC 3.2.1.91)的DNA序列。本领域技术人员已知的与任意CBH1酶具有60％～100％氨基酸序列同一性或者更优选地65％～100％氨基酸序列同一性并表现出CBH1活性的任何碳水化合物活性酶(参见纤维二糖水解酶命名的参考文献)被类似地定义为CBH1。例如，所述CBH1可以是本领域技术人员已知的与任意CBH1酶具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％氨基酸序列同一性并表现出CBH1活性的任何碳水化合物活性酶。优选地，所述CBH1在功能上与碳水化合物结合模块(carbohydratebinding module，CBM)(例如家族1的纤维素结合结构域)相关，该模块与结晶纤维素具有高亲和力。
序列同一性可通过比对两个氨基酸序列来容易地进行确定，其使用手工比对或者本领域技术人员已知的任何序列比对算法，例如但不限于：BLAST算法(BLAST和BLAST 2.0；Altschul等，Nuc.Acids.Res.25：3389-3402，1977；以及Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)；由Smith & Waterman Adv.Appl.Math.2：482(1981)所公开的算法；Needleman & Wunsch J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法；Pearson & Lipman，Proc Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性检索法；以上算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics SoftwarePackage，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或者通过手动比对以及肉眼观察来实现(参见例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等，eds.1995增刊))。
“CBH2”被定义为一种碳水化合物活性酶，其表达自编码糖类水解酶(GH)家族6之催化结构域(归类为EC 3.2.1.91)的DNA序列。本领域技术人员已知的与任意CBH2酶具有60％～100％氨基酸序列同一性或者更优选地65％～100％氨基酸序列同一性并表现出CBH2活性的任何碳水化合物活性酶(参见纤维二糖水解酶命名的参考文献)被类似地定义为CBH2。例如，所述CBH2可以是本领域技术人员已知的与任意CBH2酶具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％氨基酸序列同一性并表现出CBH2活性的任何碳水化合物活性酶。优选地，所述CBH2在功能上与碳水化合物结合模块(CBM)(例如家族1的纤维素结合结构域)相关，该模块与结晶纤维素具有高亲和力。序列同一性可通过上述方法来确定。
“EG1”被定义为一种碳水化合物活性酶，其表达自编码糖类水解酶(GH)家族7之催化结构域(归类为EC 3.2.1.4)的DNA序列。本领域技术人员已知的与任意EG1酶具有60％～100％氨基酸序列同一性或者更优选地65％～100％氨基酸序列同一性并表现出EG1活性的任何碳水化合物活性酶(参见葡聚糖内切酶命名的参考文献)被类似地定义为EG1。例如，所述EG1可以是本领域技术人员已知的与任意EG1酶具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％氨基酸序列同一性并表现出EG1活性的任何碳水化合物活性酶。优选地，所述EG1在功能上与碳水化合物结合模块(CBM)(例如家族1的纤维素结合结构域)相关，该模块与结晶纤维素具有高亲和力。序列同一性可通过上述方法来确定。
“EG2”被定义为一种碳水化合物活性酶，其表达自编码糖类水解酶(GH)家族5之催化结构域(归类为EC 3.2.1.4)的DNA序列。本领域技术人员已知的与任意EG2酶具有60％～100％氨基酸序列同一性或者更优选地65％～100％氨基酸序列同一性并表现出EG2活性的任何碳水化合物活性酶(参见葡聚糖内切酶命名的参考文献)被类似地定义为EG2。例如，所述EG2可以是本领域技术人员已知的与任意EG2酶具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％氨基酸序列同一性并表现出EG2活性的任何碳水化合物活性酶。优选地，所述EG2在功能上与碳水化合物结合模块(CBM)(例如家族1的纤维素结合结构域)相关，该模块与结晶纤维素具有高亲和力。序列同一性可通过上述方法来确定。
“β-葡萄糖苷酶”被定义为GH家族3的任一种酶，其也被归类为EC 3.2.1.21。BGL1定义为表达自里氏木霉bgl1基因的酶。本领域技术人员已知的与BGL1酶具有60％～100％氨基酸序列同一性或者更优选地65％～100％氨基酸序列同一性并表现出β-葡萄糖苷酶活性的任何蛋白质序列(参见葡聚糖内切酶命名的参考文献)被类似地定义为BGL1。例如，所述BGL1可以是本领域技术人员已知的与任意BGL1酶具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％氨基酸序列同一性并表现出BGL1活性的任何碳水化合物活性酶。序列同一性可通过上述方法来确定。
在本发明的纤维素酶混合物中，纤维二糖水解酶CBH1和CBH2(即CBH1和CBH2的总含量)以高于或等于55％且低于85％存在于所述纤维素酶混合物内的主要纤维素酶混合物中(即，CBH1和CBH2的量占纤维素酶混合物中主要纤维素酶混合物的约55％～约85％)。在该CBH1和CBH2混合物范围内，已鉴定了三组这样的主要纤维素酶混合物(其取决于CBH1和CBH2的总含量相对于主要纤维素酶的不同分数(在图3A、3B、3C中表示为％CBH)表现出对木素纤维素原料的水解具有优势。可以将这些混合物组用CBH2相对于CBH1和CBH2纤维二糖水解酶的分数来定义(基于量、重量或重量：体积)，其中该分数称为fC2：fC2＝CBH1/(CBH1+CBH2)。
EG2相对于EG1和EG2葡聚糖内切酶的分数称为fE2：fE2＝EG2/(EG1+EG2)。
所述第一、第二和第三混合物的组分混合物分别图示于图3A、图3B和图3C中。这些混合物所描述的组分混合物空间的三维代表示于图4中。
占主要纤维素酶混合物约55％～约65％的CBH1和CBH2
当纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于55％且低于65％存在于主要纤维素酶中时，纤维二糖水解酶的分数(即CBH2的分数(fC2))以及葡聚糖内切酶的分数(即EG2的分数(fE2))为图3A的区域1所覆盖。图3A的区域1包含以下三个区域：
fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且fE2值大于或等于0.15且小于0.35；
fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且fE2值大于或等于0.15且小于0.25；以及
fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且fE2值大于或等于0.35且小于0.45。
占主要纤维素酶混合物约65％～约75％的CBH1和CBH2
当纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于65％且低于75％存在于主要纤维素酶中时，fC2和fE2的值涵盖在图3B的区域1、2和3内。区域1、2和3包含以下区域：
fC2值大于或等于0.25且小于0.35，并且fE2值大于或等于0.05且小于0.35；
fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且fE2值大于或等于0.05且小于0.55；
fC2值大于或等于0.45且小于0.65，并且fE2值大于或等于0.05且小于0.65；以及
fC2值大于或等于0.65且小于0.75，并且fE2值大于或等于0.15且小于0.55。
图3B的区域2和3包含以下区域：
fC2值大于或等于0.25且小于0.35，并且fE2值大于或等于0.05且小于0.35；
fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且fE2值大于或等于0.05且小于0.55；以及
fC2值大于或等于0.45且小于0.65，并且fE2值大于或等于0.15且小于0.55。
图3B的区域3包含以下两个区域：
fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且fE2值大于或等于0.15且小于0.55；以及
fC2值大于或等于0.55且小于0.65，并且fE2值大于或等于0.35且小于0.45。
优选地，fC2和fE2涵盖图3B的区域2和3的值。更优选地，fC2和fE2涵盖图3B的区域3的值。
占主要纤维素酶混合物约75％～约85％的CBH1和CBH2
当纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于75％且低于85％存在于主要纤维素酶中时，fC2和fE2的值涵盖在图3C的区域1、2和3内。区域1、2和3包含以下区域：
fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且fE2值大于或等于0.05且小于0.25；
fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且fE2值大于或等于0.15且小于0.65；以及
fC2值大于或等于0.55且小于0.65，并且fE2值大于或等于0.15且小于0.35。
区域2和3包含以下三个区域：
fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且fE2值大于或等于0.15且小于0.25；
fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且fE2值大于或等于0.15且小于0.55；
fC2值大于或等于0.55且小于0.65，并且fE2值大于或等于0.15且小于0.25。
区域3界定了fC2值为0.45～0.55且fE2值为0.15～0.25的单一区域。
优选地，fC2和fE2涵盖图3C的区域2和3的值。最优选地，fC2和fE2涵盖图3C的区域3的值。
使用实施例3的方法来确定纤维素酶混合物中每种纤维素酶组分的分数或百分比。
因此，本发明提供了酶混合物以及用于将经预处理之木素纤维素原料酶促水解为可溶性糖的方法，该方法包括应用所述酶混合物水解经预处理的原料。所述纤维素酶混合物包含纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以及葡聚糖内切酶EG1和EG2的主要纤维素酶混合物。所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于55％且低于85％的总含量存在于主要纤维素酶混合物中。CBH2以相对于纤维二糖水解酶CBH1和CBH2的一个分数(定义为fC2)而存在，EG2以相对于葡聚糖内切酶EG1和EG2的一个分数(定义为fE2)而存在，其中：
(i)当所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于55％且低于65％存在于主要纤维素酶中时，所述fC2和所述fE2的值涵盖在图3A的区域1内；
(ii)当所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于65％且低于75％存在于主要纤维素酶中时，所述fC2和所述fE2的值涵盖在图3B的区域1、2和3内；
(iii)当所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于75％且低于85％存在于主要纤维素酶中时，所述fC2和所述fE2的值涵盖在图3C的区域1、2和3内。
本发明的纤维素酶混合物用于酶促水解“经预处理的木素纤维素原料”。经预处理的木素纤维素原料为来源于植物的材料，其在预处理前含有至少20％的纤维素(干重)以及至少12％的木质素(干重)，并且已经过物理和/或者化学方法处理以使纤维素分解酶对纤维的作用更易接近和/或更易接受。
预处理后，所述木素纤维素原料可包含高于约20％的纤维素以及高于约12％的木质素。在一个实施方案中，所述经预处理的木素纤维素原料包含高于约20％的纤维素以及高于约10％的木质素。
可用于本发明的木素纤维素原料包括但不限于：农业残余物，例如玉米秸秆、麦秸、大麦秸秆、稻秸、燕麦秸秆、油菜秆和大豆秸秆；纤维加工残余物，例如玉米纤维、糖用甜菜渣(sugar beet pulp)、纸浆厂细小纤维和废弃物或者甘蔗渣；林业废弃物，例如山杨木、其他硬木、软木和锯屑；或者草类，例如柳枝稷、芒属植物、米草和草芦。
所述木素纤维素原料可首先进行粉碎处理，所述粉碎方法包括但不限于：碾磨、研磨、搅拌、撕碎、压挤/膨胀或另一些类型的机械作用。可以使用适于所述目的的任何类型的设备(例如但不限于锤式粉碎机)来实现机械式尺寸减小。
预处理方法的非限制性实例包括使用以下物质对木素纤维素原料进行化学处理：硫酸或亚硫酸或者其它的酸；氨、石灰、氢氧化铵或其它的碱；乙醇、丁醇或其它的有机溶剂；或者加压水(pressurized water)(参见美国专利No.4,461,648、5,916,780、6,090,595、6,043,392、4,600,590，Weil等(1997)和K.等(2005)；其均通过参考并入本文中)。
可进行预处理以将木素纤维素原料中存在的半纤维素或其一部分水解为单体糖(例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或其组合)。优选地，进行预处理从而使半纤维素几乎完全水解并且纤维素少量转化为葡萄糖。在预处理过程中，通常使用含水浆液中约0.02％(重量/重量)～约2％(重量/重量)(或其间的任何量)的酸浓度来处理木素纤维素原料。优选地，预处理过程中使用的酸为硫酸。
可在预处理之后但在酶促水解之前对经预处理的木素纤维素原料进行以下任意步骤的处理，例如本领域技术人员所熟知的用水稀释、用水清洗、缓冲、过滤、离心或这些方法的组合。
接下来对经预处理的木素纤维素原料进行酶促水解。术语“酶促水解”意指纤维素酶作用于纤维素以使所有或一部分的纤维素转化为可溶性糖的方法。可溶性糖意在包括水溶性的己糖单体和最多六个单体单元的寡聚体，其来源于经预处理之木素纤维素原料的纤维素部分。可溶性糖的实例包括葡萄糖、纤维二糖、纤维糊精或其混合物。优选地，所述可溶性糖主要为纤维二糖和葡萄糖。在一个更优选的实施方案中，所述可溶性糖主要为葡萄糖。
所述酶促水解方法优选地将约80％～约100％(或其间的任何范围)的纤维素转化为可溶性糖。更优选地，所述酶促水解方法将约90％～约100％(或其间的任何范围)的纤维素转化为可溶性糖。在最优选的实施方案中，所述酶促水解方法将约98％～约100％(或其间的任何范围)的纤维素转化为可溶性糖。
使用所述纤维素酶混合物进行酶促水解可以是分批水解(batchhydrolysis)、连续水解(continuous hydrolysis)或其组合。可以对所述水解进行搅拌、非混合或其组合。
优选在约45℃～75℃(或其间的任何温度)以及约3.5～约7.5的pH值(或其间的任何值)下进行酶促水解。在水解开始前，水解反应器中的纤维素初始浓度优选为约4％(重量/重量)～约15％(重量/重量)(或其间的任何浓度)。所有主要纤维素酶的总剂量可为约5～约45mg/克纤维素(或其间的任何量)。水解可进行约12小时～约200小时(或其间的任何值)。优选地，水解进行15小时～100小时。应当认识到，所述反应条件不意在以任何方式限制本发明，并且可根据本领域技术人员的需要进行调整。
所述酶促水解通常在水解反应器中进行。可在将底物加入水解反应器之前、期间或之后将所述主要纤维素酶加至经预处理的木素纤维素原料(即“底物”)中。
优选地，所述主要纤维素酶在一个或多个液体深层培养发酵(submerged liquid culture fermentation)中产生，并且在发酵结束时与细胞分离。可以通过过滤、离心或本领域技术人员熟知的其他方法将细胞与所述纤维素酶分离。在使用前，可以对所述不含细胞的含纤维素酶级分进行浓缩(例如通过超滤来实现)、保存和/或稳定。或者，所述主要纤维素酶不与细胞分离，而是与细胞一起加入酶促水解中。
所述纤维素酶混合物可以是蛋白质于水中的水溶液或者蛋白质于水中的浆液、固体粉剂或颗粒或者凝胶。含有纤维素酶的混合物可包含添加剂如缓冲剂、去污剂、稳定剂、填充剂以及本领域技术人员熟知的其它这样的添加剂。
优选地，所述主要纤维素酶表达自真菌编码序列。在该实施方案中，所述编码序列可来自任何真菌来源。术语“真菌”、“真菌类”、“真菌的”、“子囊菌亚门”、“担子菌亚门”以及相关术语(例如“子囊菌”和“担子菌”)意在囊括定义于The Fungi：An Advanced Treatise(GC Ainsworth，FKSparrow，AS Sussman，eds.；Academic Press 1973)中的生物。
可以在本发明的实践中使用纤维素酶的任何来源。本发明中纤维素酶的编码序列优选来自子囊菌亚门或担子菌亚门。例如，所述编码序列来自选自以下的属：木霉属、曲霉属、肉座菌属、腐质霉属、脉孢菌属(Neurosporaspp.)、Orpinomyces spp.、赤霉属(Gibberella spp.)、裸胞壳属(Emericellaspp.)、毛壳菌属(Chaetomiun spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)、青霉菌属(Penicillium spp.)、稻瘟菌属(Magnaporthe spp.)和平革菌属(Phanerochaete spp.)。优选地，所述主要纤维素酶的编码序列来自里氏木霉。
可以在本领域技术人员已知的作为表达宿主的微生物(如细菌或真菌)中克隆并表达本发明的主要纤维素酶。优选地，所述微生物是真菌。可通过本领域技术人员已知的任何数量的微生物转化方法将所述基因构建体导入宿主微生物体中，所述方法包括但不限于：用CaCl2处理细胞、电穿孔、基因枪轰击(biolistic bombardment)、PEG介导的原生质体融合(例如，White等，WO 2005/093072，其通过参考并入本文中)。
可以从一个生物株系表达所有的主要纤维素酶。或者，也可以从不同生物的不同株系单独地或分组地表达主要纤维素酶。也可考虑从单一生物的不同株系单独地或分组地表达主要纤维素酶，例如从里氏木霉的不同株系。优选地，所有纤维素酶表达自里氏木霉的单一株系。
优选地，所述主要纤维素酶是由表达生物所产生的总纤维素酶系统的一部分。在一个实施方案中，所述主要纤维素酶是纤维素酶系统中仅有的纤维素酶。在另一实施方案中，所述主要纤维素酶是包含β-葡萄糖苷酶之纤维素酶系统的一部分。
所述主要纤维素酶可以是包含里氏木霉分泌组的总纤维素酶系统的一部分。术语“分泌组”是指由特定微生物细胞外分泌至培养基中的所有蛋白质。在一个优选实施方案中，所述主要纤维素酶是包含里氏木霉的BGL1β-葡萄糖苷酶以及里氏木霉的分泌组的总纤维素酶系统的一部分。
可利用微生物来发酵由酶促水解产生的可溶性糖。发酵产物可包含能为发酵工厂带来价值的任何期望产物。优选的发酵产物是乙醇、丁醇和乳酸，它们都具有广阔的市场并且可由多种微生物有效产生。对于乙醇生产来说，可以利用能将糖发酵成乙醇的一种或多于一种微生物来进行发酵。例如，可利用重组的酿酒酵母进行发酵，所述酵母已被改造可以将葡萄糖、甘露糖、半乳糖和木糖发酵生成乙醇或者可以将葡萄糖、甘露糖，半乳糖、木糖和阿拉伯糖发酵生成乙醇。美国专利No.5,789,210中描述了可以将木糖发酵生成乙醇的重组酵母(其通过参考并入本文中)。所述酵母产生在水溶液中含有乙醇的发酵液。对于乳酸生产来说，可以利用能将糖发酵成乳酸的微生物来进行发酵。
在本发明的一个实施方案中，所述纤维素酶混合物通过微生物在酸性pH值下表达主要纤维素酶来生产。优选地，pH值为约2～约5。例如，发酵pH值可以是约2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8或5.0，或者其间的任意pH值。
与现有技术中描述的酶促水解相比，本发明的酶混合物具有非常不同的组成。本发明的主要纤维素酶混合物是与“基准混合物”(CBH1、CBH2、EG1 EG2的组成分别为：57％、29％、7％、7％)显著不同的组合物。最优的混合物图示于图3A、3B和3C中，基准混合物标注于图3D所示的混合物空间中。图4中显示这些区域描述的组分混合物空间的三维表征。本发明的酶混合物与现有技术中所述的那些相比具有更高的活性。所述图的区域1、2和3所示活性比基准混合物高出10％或更多。区域2和3所示活性比基准混合物高出13％或更多。区域3所限定之混合物的活性比基准混合物高出16％或更多。
图3A、3B和3C所示区域的不规则形状是未预见到的，其表明在整个混合物空间内活性急剧渐变。与使用模式底物或者少于四种主要纤维素酶的酶混合物之现有技术可得出的结论相比，本发明的纤维素酶混合物所限定的空间更加复杂。
过去优化混合物的尝试通常在三角形图上描绘三元混合物(参见Baker等，1998)。这些尝试落在空间的角、边或面上，因此与实际的优化相去甚远。
以下的实施例将进一步举例说明本发明。
实施例
实施例1：从里氏木霉纤维素酶纯化主要纤维素酶CBH1、CBH2、EG1和EG2
在本领域技术人员已知的诱导纤维素酶表达的条件下，利用液体深层发酵来培养里氏木霉菌株。木霉菌蛋白质的粗混合物由细胞分泌到发酵液中。利用过滤通过包含Harborlite滤垫的玻璃微纤维滤器来除去发酵液中的真菌细胞。如Bhikhabhai等人(1984)所述使用DEAE-琼脂糖凝胶柱进行阴离子交换层析从而将粗过滤物中的主要纤维素酶(CBH1、CBH2、EG1和EG2)分离出来。该步骤将EG1和EG2分开。然后利用Piyachomkwan等人(1997，1998)报道的对氨基苯基-1-硫代-β-D-纤维二糖苷亲和层析来进一步纯化CBH1和CBH2。使用搅拌式超过滤器(stirredultrafiltration cell)(Amicon)和10kDa NMWL聚醚砜膜将经纯化的纤维素酶组分进行浓缩并将缓冲液更换为50mM柠檬酸钠(pH 5.0)。
实施例2：测量主要纤维素酶的浓度和纯度
使用Bradford等人(1976)的方法来通过化学方法确定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE将每种纯化蛋白样品分开，并利用考马斯蓝染色进行电泳后观察，如图1中A图所示。对于每种纯化组分来说，使用Chemigenius2(Syngene)成像系统通过扫描密度测定法来定量测定每一条带的染色强度。将每种组分的条带强度除以凝胶上中同一泳道中针对所有条带所测量的总染色强度来计算得到相对纯度。缺乏碳水化合物结合模块的EG2以痕量存在，然而不认为其是该酶制备中的污染物。CBH1和CBH2的相对纯度大于95％，而EG1和EG2的相对纯度大于90％。
为了证明每种组分制备物未被主要纤维素酶所污染，使用组分特异性的多克隆兔抗血清对纯化的CBH1、CBH2、EG1和EG2进行Western印迹分析(图1，B图)。利用10％SDS-PAGE来分离蛋白质，然后使用来自BioRad的Mini Trans-
Figure A20078003608200261
Cell以100伏电压将蛋白质转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜1小时。使用Birkett等人的方法进行Western印迹。使用合成肽来产生组分特异性的多克隆抗血清，所述肽的序列基于来自里氏木霉的CBH1、CBH2、EG1和EG2的一级氨基酸序列，这是本领域技术人员已知的。
这些实施例表明，所使用的纯化方法得到基本上纯的CBH1、CBH2、EG1和EG2。这也表明这些抗血清针对每种所述主要纤维素酶组分的特异性。
实施例3：测定木霉菌纤维素酶中CBH1、CBH2、EG1和EG2的相对浓度
利用ELISA来测定里氏木霉纤维素酶中CBH1、CBH2、EG1和EG2的相对浓度。
用pH 7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)将纤维素酶和纯化组分的标准品稀释成1-100μg/mL，并在微量滴定板(Costar EIA-高结合力)中4℃孵育过夜。用含有0.1％吐温20的PBS(PBS/吐温)清洗这些板，然后在含有1％牛血清白蛋白的PBS(PBS/BSA)中室温孵育1小时。用PBS/吐温清洗经封闭的微量滴定孔。用PBS/BSA稀释特异性针对CBH1、CBH2、EG1和EG2的兔多克隆抗血清，将所述抗血清分别加至各微量滴定板并于室温下孵育2小时。清洗微量滴定板，然后与偶联有辣根过氧物酶的山羊抗兔抗体一起在室温下孵育1小时。清洗后，向每个板内加入四甲基联苯胺，并在室温下孵育1小时。
测量每个孔中360nm处的吸光度，并使用实施例2中制备的CBH1、CBH2、EG1和EG2标准将所述吸光度转换为蛋白质浓度。将这些蛋白质浓度除以CBH1、CBH2、EG1和EG2的总浓度计算得到每种组分的相对浓度。
木霉菌纤维素酶中CBH1、CBH2、EG1和EG2的相对组成分别为57％∶29％∶7％∶7％(图2)。这在本文中称为“基准混合物”。该混合物来自商业化的木霉菌纤维素酶产品，如以下所图示。
CBH相对于全部主要纤维素酶的浓度(％CBH)为57％+29％＝86％。这使该组合处于图3D中(CBH占85％～95％)。在其他图中：图3A——％CBH＝55％～65％；图3B——％CBH＝65％～75％；图3C——％CBH＝75％～85％。
CBH2相对于所有CBH的浓度(fC2)为29％/(57％+29％)＝0.337。
EG2相对于所有主要EG的浓度(fE2)为7％/(7％+7％)＝0.5。
还对来自不分泌CBH1(无CBH1)、CBH2(无CBH2)、EG1(无EG1)或EG2(无EG2)的木霉菌菌株的纤维素酶进行分析，以证明每一组ELISA特异性地检测CBH1、CBH2、EG1或EG2(图2)。
实施例4：测量主要纤维素酶混合物对经预处理之木素纤维素原料的纤维素水解活性
将具有实施例3中基准CBH1、CBH2、EG1和EG2比例的主要纤维素酶混合物与具有不同组成的混合物进行比较。在0.25mL混合纤维素水解测定(mixed cellulose hydrolysis assay)中检测这些主要纤维素酶混合物。用含有0.5％苯甲酸钠的柠檬酸盐缓冲液稀释纤维素酶混合物，补充来自黑曲霉(Aspergillis niger)β-葡萄糖苷酶制备物，并与经酸预处理的麦秸一起孵育。参照Foody的美国专利No.4,461,648进行预处理。在50℃孵育24小时，纤维素的目标转化水平大于70％。通过测定实现纤维素目标转化水平所需的酶量并归一化为基准纤维素酶混合物所需的酶量来计算酶活性。
所述归一化值的不确定性在±0.04的数量级上，这表明可认为高出基准值10％的观察值(即归一化值为1.10)显著大于基准。应用跨三维混合物空间(空间的维度分别为fC2、fE2和％CBH)的加权平均值来使活性数据平滑。将给定点(该点的坐标为fC2＝x、fE2＝y、％CBH＝z)的归一化活性数据与其最邻近的6个点(其坐标分别为：x+0.1，y，z；x-0.1，y，z；x，y+0.1，z；x，y-0.1，z；x，y，z+10％；以及x，y，z-10％)进行平均。在用于计算加权平均值(xw)的式xw＝∑wixi/∑wi中，将所研究的点赋予权重w＝1.00，将6个邻近点赋予权重w＝0.15，其中下标i表示计数变量以加和上述所有7个点，xi和wi分别表示第i点的归一化活性和权重。
为了直观地展示这些结果，实施例3中所述的酶活性示于图3A、3B、3C或3D中，并例举于表1中。
表1：主要纤维素酶混合物的归一化葡萄糖产率
混合物   ％CBH1   ％CBH2   ％EG1   ％EG2   ％CBH* 图 fC2 ** fE2 *** 活性
  基准混合物   57％   29％   7％   7％   86％   1D   0.333   0.500   1.00
  1   36％   23％   37％   4％   59％   1A   0.396   0.087   1.08
  2   36％   23％   33％   8％   59％   1A   0.396   0.187   1.11
  3   36％   23％   29％   12％   59％   1A   0.396   0.287   1.10
  4   30％   29％   37％   4％   59％   1A   0.496   0.087   1.09
  5   30％   29％   33％   8％   59％   1A   0.496   0.187   1.11
  6   30％   29％   29％   12％   59％   1A   0.496   0.287   1.09
  7   30％   29％   25％   16％   59％   1A   0.496   0.387   1.11
  8   24％   35％   37％   4％   59％   1A   0.596   0.087   1.06
  9   24％   35％   33％   8％   59％   1A   0.596   0.187   1.06
  10   24％   35％   29％   12％   59％   1A   0.596   0.287   1.04
  11   24％   35％   25％   16％   59％   1A   0.596   0.387   1.06
  12   62％   7％   28％   3％   69％   1B   0.096   0.087   0.90
  13   62％   7％   25％   6％   69％   1B   0.096   0.187   0.91
  14   62％   7％   22％   9％   69％   1B   0.096   0.287   0.91
  15   56％   14％   28％   3％   69％   1B   0.196   0.087   1.05
  16   56％   14％   25％   6％   69％   1B   0.196   0.187   1.08
  17   56％   14％   22％   9％   69％   1B   0.196   0.287   1.08
  18   56％   14％   19％   12％   69％   1B   0.196   0.387   1.02
  19   49％   20％   28％   3％   69％   1B   0.296   0.087   1.15
  20   49％   20％   25％   6％   69％   1B   0.296   0.187   1.14
  21   49％   20％   22％   9％   69％   1B   0.296   0.287   1.13
  22   49％   20％   19％   12％   69％   1B   0.296   0.387   1.08
  23   49％   20％   16％   15％   69％   1B   0.296   0.487   1.08
  24   49％   20％   13％   18％   69％   1B   0.296   0.587   1.06
  25   42％   27％   28％   3％   69％   1B   0.396   0.087   1.14
  26   42％   27％   25％   6％   69％   1B   0.396   0.187   1.14
  27   42％   27％   22％   9％   69％   1B   0.396   0.287   1.13
  28   42％   27％   19％   12％   69％   1B   0.396   0.387   1.13
  29   42％   27％   16％   15％   69％   1B   0.396   0.487   1.14
  30   42％   27％   13％   18％   69％   1B   0.396   0.587   1.06
  31   42％   27％   10％   21％   69％   1B   0.396   0.687   1.05
  32   35％   34％   28％   3％   69％   1B   0.496   0.087   1.11
  33   35％   34％   25％   6％   69％   1B   0.496   0.187   1.16
  34   35％   34％   22％   9％   69％   1B   0.496   0.287   1.17
  35   35％   34％   19％   12％   69％   1B   0.496   0.387   1.17
  36   35％   34％   16％   15％   69％   1B   0.496   0.487   1.18
  37   35％   34％   13％   18％   69％   1B   0.496   0.587   1.12
  38   35％   34％   10％   21％   69％   1B   0.496   0.687   1.07
  39   28％   41％   28％   3％   69％   1B   0.596   0.087   1.11
  40   28％   41％   25％   6％   69％   1B   0.596   0.187   1.14
  41   28％   41％   22％   9％   69％   1B   0.596   0.287   1.14
  42   28％   41％   19％   12％   69％   1B   0.596   0.387   1.16
  43   28％   41％   16％   15％   69％   1B   0.596   0.487   1.15
  44   28％   41％   13％   18％   69％   1B   0.596   0.587   1.11
  45   28％   41％   10％   21％   69％   1B   0.596   0.687   1.07
  46   21％   48％   28％   3％   69％   1B   0.696   0.087   1.07
  47   21％   48％   25％   6％   69％   1B   0.696   0.187   1.11
  48   21％   48％   22％   9％   69％   1B   0.696   0.287   1.10
  49   21％   48％   19％   12％   69％   1B   0.696   0.387   1.10
  50   21％   48％   16％   15％   69％   1B   0.696   0.487   1.10
  51   14％   55％   28％   3％   69％   1B   0.796   0.087   1.00
  52   14％   55％   25％   6％   69％   1B   0.796   0.187   1.02
  53   14％   55％   22％   9％   69％   1B   0.796   0.287   1.00
  54   14％   55％   19％   12％   69％   1B   0.796   0.387   1.00
  55   71％   8％   19％   2％   79％   1C   0.096   0.087   0.90
  56   71％   8％   17％   4％   79％   1C   0.096   0.187   0.89
  57   64％   15％   19％   2％   79％   1C   0.196   0.087   1.00
  58   64％   15％   17％   4％   79％   1C   0.196   0.187   1.05
  59   64％   15％   15％   6％   79％   1C   0.196   0.287   1.04
  60   56％   23％   19％   2％   79％   1C   0.296   0.087   1.06
  61   56％   23％   17％   4％   79％   1C   0.296   0.187   1.08
  62   56％   23％   15％   6％   79％   1C   0.296   0.287   0.97
  63   56％   23％   13％   8％   79％   1C   0.296   0.387   0.92
  64   56％   23％   11％   10％   79％   1C   0.296   0.487   0.90
  65   56％   23％   9％   12％   79％   1C   0.296   0.587   0.88
  66   48％   31％   19％   2％   79％   1C   0.396   0.087   1.10
  67   48％   31％   17％   4％   79％   1C   0.396   0.187   1.13
  68   48％   31％   15％   6％   79％   1C   0.396   0.287   1.08
  69   48％   31％   13％   8％   79％   1C   0.396   0.387   1.03
  70   48％   31％   11％   10％   79％   1C   0.396   0.487   1.01
  71   48％   31％   9％   12％   79％   1C   0.396   0.587   0.92
  72   40％   39％   19％   2％   79％   1C   0.496   0.087   1.09
  73   40％   39％   17％   4％   79％   1C   0.496   0.187   1.16
  74   40％   39％   15％   6％   79％   1C   0.496   0.287   1.15
  75   40％   39％   13％   8％   79％   1C   0.496   0.387   1.13
  76   40％   39％   11％   10％   79％   1C   0.496   0.487   1.14
  77   40％   39％   9％   12％   79％   1C   0.496   0.587   1.10
  78   32％   47％   19％   2％   79％   1C   0.596   0.087   1.08
  79   32％   47％   17％   4％   79％   1C   0.596   0.187   1.15
  80   32％   47％   15％   6％   79％   1C   0.596   0.287   1.10
  81   32％   47％   13％   8％   79％   1C   0.596   0.387   1.04
  82   32％   47％   11％   10％   79％   1C   0.596   0.487   1.03
  83   32％   47％   9％   12％   79％   1C   0.596   0.587   1.01
  84   24％   55％   19％   2％   79％   1C   0.696   0.087   1.00
  85   24％   55％   17％   4％   79％   1C   0.696   0.187   1.06
  86   24％   55％   15％   6％   79％   1C   0.696   0.287   1.06
  87   16％   63％   19％   2％   79％   1C   0.796   0.087   0.95
  88   16％   63％   17％   4％   79％   1C   0.796   0.187   0.94
  89   16％   63％   15％   6％   79％   1C   0.796   0.287   0.98
  90   63％   26％   10％   1％   89％   1D   0.296   0.087   0.92
  91   63％   26％   9％   2％   89％   1D   0.296   0.187   0.96
  92   63％   26％   8％   3％   89％   1D   0.296   0.287   0.92
  93   54％   35％   10％   1％   89％   1D   0.396   0.087   0.96
  94   54％   35％   9％   2％   89％   1D   0.396   0.187   1.06
  95   54％   35％   8％   3％   89％   1D   0.396   0.287   1.00
  96   45％   44％   10％   1％   89％   1D   0.496   0.087   1.02
  97   45％   44％   9％   2％   89％   1D   0.496   0.187   1.07
  98   45％   44％   8％   3％   89％   1D   0.496   0.287   1.05
  99   45％   44％   7％   4％   89％   1D   0.496   0.387   0.97
  100   36％   53％   10％   1％   89％   1D   0.596   0.087   1.07
  101   36％   53％   9％   2％   89％   1D   0.596   0.187   1.08
  102   36％   53％   8％   3％   89％   1D   0.596   0.287   0.98
  103   36％   53％   7％   4％   89％   1D   0.596   0.387   0.93
  104   27％   62％   10％   1％   89％   1D   0.696   0.087   0.86
  105   27％   62％   9％   2％   89％   1D   0.696   0.187   0.90
  106   27％   62％   8％   3％   89％   1D   0.696   0.287   0.91
＊％CBH＝％CBH1+％CBH2
＊＊fC2＝CBH2/(CBH1+CBH2)
＊＊＊fE2＝EG2/(EG1+EG2)
这些图表中所示的纤维素酶混合物具有以下范围的CBH百分含量(％CBH)：55-65％(图3A)，65-75％(图3B)，75-85％(图3C)以及85-95％(图3D)。
图3A、3B和3C中的阴影部分表示活性显著高于基准混合物之混合物的相对水解活性。区域1中的活性为1.10-1.12，其活性比基准混合物高出10％～12％。区域2中的活性为1.13-1.15，其活性比基准混合物高出13％～15％。区域3中的活性最高，为1.16-1.18，其活性比基准混合物高出16％～18％。图3A(其中CBH含量为55％～65％)中没有活性高于1.12的任何混合物，因此仅包含区域1内的值。图3D(CBH含量为85％～95％)中没有活性高于1.10的任何混合物。
图3A、3B、3C和3D所示的结果中有几个令人感兴趣的方面。
首先，鉴定出活性显著高于基准混合物(其主要纤维素酶比例可在通常市售的纤维素酶中发现)的主要纤维素酶混合物。这表明有可能生产出活性比现有混合物高出15％的纤维素酶混合物。这些混合的组成与基准混合物显著不同。
第二点是所图示区域的不规则形状。这些不规则的形状是未预见到的，其表明在整个混合物空间内活性急剧变化。与使用模式底物或者少于四种主要纤维素酶的酶混合物之现有技术可得出的结论相比，该实验数据所限定的空间更加复杂。
第三点是最优混合物的组成与现有技术中的混合物显著不同(参见实施例5)。不限于任何理论，我们认为有必要使用经预处理的木素纤维素原料来测量纤维素酶的活性。而现有技术中的许多研究使用纯纤维素模式底物。
图4显示由这些区域构成的组分混合物空间的三维表征。
实施例5：图示分析木霉菌纤维素酶的组成
来自科学和专利文献的用于水解纤维素的十种木霉菌纤维素酶的相对组成如下确定：将所报道的CBH1、CBH2、EG1和EG2的蛋白浓度除以每种纤维素酶中这四个组分浓度之和。然后基于CBH的百分比将这些纤维素酶进行分组，如实施例4中对主要纤维素酶混合物所进行的分组一样。然后，将这些纤维素酶绘制成其fC2和fE2的函数，随后相对于基准组分混合物与纤维素水解活性改善的相关区域进行比较。该分析中不包括文献中CBH＜55％或CBH＞95％的木霉菌纤维素酶。
发表的所有主要纤维素酶的组成均在所述产生最高纤维素酶活性的区域之外。
表2：将已知组成标示到图3上
 混合物   CBH1(％)   CBH2(％)   EG1(％)   EG2(％)   CBH(％)   图   fC2   fE2
 Baker等(1998)   60   20   20   0   80   3C   0.25   0
 Cytolase(在美国专利No.5,525,507中)   50   14   12   9   75   3C   0.22   0.43
 Henrissat等(1985)   0   95   5   0   95   3D   1   0
 Henrissat等(1985)   0   95   0   5   95   3D   1   1
 Jeoh等(2006)   0   70   0   30   1   3B   1   1
 Celloviridin(在Markov等，2005中)   50   30   10   10   80   3C   0.38   0.5
 Nidetsky等(1994)   88.6   0   11.4   0   88.6   3D   0   0
 Valjamae等(2003)   90.9   0   0   9.1   90.9   3D   0   1
 Woodward等(1988)   50   25   0   25   75   3B   0.33   1
 Woodward等(1988)   88   0   0   12   88   3D   0   1
一种缺乏EG2的木霉菌纤维素酶也标示于图3D中。该组合物包含61.3％的CBH1，31.2％的CBH2，7.5％的EG1，并且fC2和fE2值分别为0.337和0。该组成也在所述产生最高纤维素酶活性的区域之外(参见图3B和3C)。
实施例6：测量主要纤维素酶混合物对经预处理之木素纤维素原料在长时间中的水解活性
在长时间的水解中，将具有实施例3中基准CBH1、CBH2、EG1和EG2比例的主要纤维素酶混合物与实施例4中活性提高15％的改进型混合物进行比较。所述改进型混合物由32％的Cel7A、47％的Cel6A、17％的Cel7B和4％的Cel5A组成。两种混合物的用量均为每克纤维素18mg酶，此外补充来自黑曲霉的β-葡萄糖苷酶制备物(每克纤维素100IU)。
在50℃、200rpm连续振荡的条件下，将所述混合物与50mM柠檬酸盐(pH 5.0)(其含有0.5％苯甲酸钠和0.01％Triton X-100)中25g/L纤维素一起孵育56小时。在图5所示的时间点取出0.5mL等分试样，测定可溶部分中葡萄糖的浓度并将其换算为转化分数。然后，将该转化数据与一条直角双曲线拟合，以及使用最小化拟合残差平方和(sum ofsquared residuals)的额外线性项。所述等式具有以下形式：转化率＝(最大×时间)/(半数最大+时间)+c×时间。这两组数据均与唯一的最大值和半数最大值以及共用的变量c值完全拟合。使用模型比较法(Motulsky和Christopolous，2003)计算最大转化率值的标准误差。使用t-检验来比较基准混合物与所优化混合物(如上所述)的最大转化率值。
所述优化混合物的最大转化率值为0.69，这比基准混合物的最大转化率值0.59有所提高。这代表了16％的显著提高(p＜0.05)。在除了本文涉及的四种纤维素酶之外的另一些纤维素酶组分存在下，这些混合物的转化率将更高。
所有引用均通过参考并入本文中。
本发明已通过一个或多个实施方案来进行描述。然而，对于本领域技术人员来说，在不背离权利要求书所限定的本发明范围的前提下可进行多处改动和修改是显而易见的。
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所有引用均通过参考并入本文中。

Claims (23)

1.用于将经预处理的木素纤维素原料酶促水解成可溶性糖的方法，该方法包括将纤维素酶混合物添加至经预处理的木素纤维素原料中，所述纤维素酶混合物包含纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以及葡聚糖内切酶EG1和EG2的主要纤维素酶混合物，所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于所述主要纤维素酶混合物的55％且低于85％的量存在，所述CBH2以定义为fC2的相对于纤维二糖水解酶CBH1和CBH2的一个分数存在，所述EG2以定义为fE2的相对于葡聚糖内切酶EG1和EG2的一个分数存在，其中：
当所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于55％且低于65％存在于主要纤维素酶中时，
所述fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.35；
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.25；或者
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且所述fE2值大于或等于0.35且小于0.45；
当所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于65％且低于75％存在于主要纤维素酶中时，
所述fC2值大于或等于0.25且小于0.35，并且所述fE2值大于或等于0.05且小于0.35；
所述fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且所述fE2值大于或等于0.05且小于0.55；
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.65，并且所述fE2值大于或等于0.05且小于0.65；或者
所述fC2值大于或等于0.65且小于0.75，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.55；
当所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于75％且低于85％存在于主要纤维素酶中时，
所述fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且所述fE2值大于或等于0.05且小于0.25；
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.65；或者
所述fC2值大于或等于0.55且小于0.65，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.35。
2.权利要求1的方法，其中所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以65％～85％存在于所述主要纤维素酶中，其中：
当所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以65％～75％存在于主要纤维素酶中时，
所述fC2值大于或等于0.25且小于0.35，并且所述fE2值大于或等于0.05且小于0.35；
所述fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且所述fE2值大于或等于0.05且小于0.55；或者
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.65，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.55；以及
当所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以75％～85％存在于主要纤维素酶中时，
所述fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.25；
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.55；或者
所述fC2值大于或等于0.55且小于0.65，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.25。
3.权利要求2的方法，其中所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以75％～85％存在于主要纤维素酶中，并且：
所述fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.25；
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.55；或者
所述fC2值大于或等于0.55且小于0.65，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.25。
4.权利要求3的方法，其中所述fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.25。
5.权利要求2的方法，其中所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以65％～75％存在于主要纤维素酶中：
所述fC2值大于或等于0.25且小于0.35，并且所述fE2值大于或等于0.05且小于0.35；
所述fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且所述fE2值大于或等于0.05且小于0.55；或者
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.65，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.55。
6.权利要求5的方法，其中：
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.55；或者
所述fC2值大于或等于0.55且小于0.65，并且所述fE2值大于或等于0.35且小于0.45。
7.权利要求1的方法，其中所述主要纤维素酶来源于真菌。
8.权利要求7的方法，其中所述主要纤维素酶来自子囊菌(Ascomycete)或担子菌(Basidiomycete)。
9.权利要求8的方法，其中所述主要纤维素酶来自木霉属(Trichoderma ssp)、曲霉属(Aspergillus ssp)、肉座菌属(Hypocrea ssp)和腐质霉属(Humicola ssp)。
10.权利要求9的方法，其中所述主要纤维素酶来自里氏木霉。
11.权利要求1的方法，其中所述主要纤维素酶获得自表达内源性编码序列的生物。
12.权利要求1的方法，其中所述主要纤维素酶获得自表达异源性编码序列的生物。
13.权利要求11或12的方法，其中所述主要纤维素酶获得自里氏木霉。
14.权利要求1的方法，其中所述酶促水解将经预处理之木素纤维素原料中至少约80％的纤维素转化为可溶性糖。
15.权利要求14的方法，其还包括将可溶性糖发酵生成乙醇、乳酸、丁醇或其组合的步骤。
16.权利要求1的方法，其中所述酶促水解利用包含β-葡萄糖苷酶和里氏木霉分泌组的纤维素酶来进行。
17.包含纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以及葡聚糖内切酶EG1和EG2之主要纤维素酶混合物的纤维素酶混合物，所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于55％且低于85％存在于该主要纤维素酶混合物中，所述CBH2以定义为fC2的相对于纤维二糖水解酶CBH1和CBH2的一个分数存在，所述EG2以定义为fE2的相对于葡聚糖内切酶EG1和EG2的一个分数存在，其中：
当所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于55％且低于65％存在于主要纤维素酶中时，
所述fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.35；
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.25；或者
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且所述fE2值大于或等于0.35且小于0.45；
当所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于65％且低于75％存在于主要纤维素酶中时，
所述fC2值大于或等于0.25且小于0.35，并且所述fE2值大于或等于0.05且小于0.35；
所述fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且所述fE2值大于或等于0.05且小于0.55；
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.65，并且所述fE2值大于或等于0.05且小于0.65；或者
所述fC2值大于或等于0.65且小于0.75，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.55；
当所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于75％且低于85％存在于主要纤维素酶中时，
所述fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且所述fE2值大于或等于0.05且小于0.25；
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.65；或者
所述fC2值大于或等于0.55且小于0.65，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.35。
18.权利要求17的纤维素酶混合物，其中所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以65％～85％存在于主要纤维素酶中，其中：
当所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以65％～75％存在于主要纤维素酶中时，
所述fC2值大于或等于0.25且小于0.35，并且所述fE2值大于或等于0.05且小于0.35；
所述fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且所述fE2值大于或等于0.05且小于0.55；或者
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.65，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.55；以及
当所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以75％～85％存在于主要纤维素酶中时，
所述fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.25；
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.55；或者
所述fC2值大于或等于0.55且小于0.65，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.25。
19.权利要求18的纤维素酶混合物，其中所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以75％～85％存在于主要纤维素酶中并且：
所述fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.25；
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.55；或者
所述fC2值大于或等于0.55且小于0.65，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.25。
20.权利要求19的纤维素酶混合物，其中所述fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.25。
21.权利要求18的纤维素酶混合物，其中所述纤维二糖水解酶CBH1和CBH2以65％～75％存在于主要纤维素酶中，并且：
所述fC2值大于或等于0.25且小于0.35，并且所述fE2值大于或等于0.05且小于0.35；
所述fC2值大于或等于0.35且小于0.45，并且所述fE2值大于或等于0.05且小于0.55；或者
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.65，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.55。
22.权利要求21的纤维素酶混合物，其中：
所述fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.55；或者
所述fC2值大于或等于0.55且小于0.65，并且所述fE2值大于或等于0.35且小于0.45。
23.权利要求17的纤维素酶混合物，其中所述纤维素酶混合物在pH值为约2至约5时通过微生物表达所述主要纤维素酶而产生。
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