BRPI0715930A2 - processo para a hidràlise enzimÁtica de cargas de alimentaÇço lignocelulàsicas prÉ-tratadas - Google Patents

Abstract

Patente de Invenção; "PROCESSO PARA A HIDRàLISE ENZIMÁTICA DE CARGAS DE ALIMENTAÇçO LIGNOCELULàSICA PRÉ-TRATADAS". É fornecida uma mistura de enzima para a hidrólise enzimática de uma carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada em açúcares solúveis. Também é fornecido um processo para a hidrólise de uma carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada com uma mistura de enzima. A hidólise enzimática compreende a adição de uma mistura de enzima celulase a uma carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada. A mistura de enzima celulase compreende uma mistura de celulose primária de CBH1 e CBH2 e EG1 e EG2. As CBH1 e CBH2 estando presentes em mais do que ou igual a 55% e menos do que 85% da mistura celulase primária. Além disso, a CBH2 está presente em uma fração em relação a CBNH1 e CBH2 e a EG2 está presente em uma fração em relação às EG1 e EG2.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção "PROCESSO PA- RA A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE CARGAS DE ALIMENTAÇÃO LIG- NOCELULÓSICAS PRÉ-TRATADAS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma mistura de enzimas. Tam-

bém é fornecido um processo para a hidrólise enzimática de uma carga de alimentação lignocelulósica, em particular para a hidrólise enzimática de uma carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada. ANTECEDENTE DA INVENÇÃO O etanol combustível é correntemente produzido a partir de car-

gas de alimentação tais como amido de milho, cana de açúcar e beterraba açucareira. No entanto, o potencial para a produção de etanol a partir destas fontes é limitado quando a maioria das glebas de terra cultivada que é ade- quada para a produção destas lavouras já está em uso para fornecer uma fonte alimentícia para seres humanos e animais. Além disso, a produção de etanol destas cargas de alimentação possui emissões de gás de estufa sig- nificativas porque os combustíveis fósseis são utilizados no processo de conversão.

A produção de etanol a partir de cargas de alimentação conten- do celulose, tais como resíduos agrícolas, pastos e resíduos de área flores- tal, tem recebido muita atenção nos últimos anos. As razões para isto são porque estas cargas de alimentação são amplamente disponíveis e bardas e seu uso para a produção de etanol fornece uma alternativa aos materiais residuais lignocelulósicos de queima ou aterro de lixo. Além do mais, uma parte da carga de alimentação, lignina, pode ser usada como um combustí- vel para prover de energia o processo, em vez dos combustíveis fósseis. Vários estudos concluíram que, quando o ciclo total de produção e consumo for levado em conta, o uso de etanol produzido a partir da celulose gera ga- ses de estufa nas proximidades de zero. As cargas de alimentação lignocelulósicas que são no máximo

promissores par a produção de etanol incluem (1) resíduos agrícolas tais como forragem agrícola, palha de trigo, palha de cevada, palha de aveia, palha de arroz, palha de canola e palha de soja; (2) pastos tais como capim flexível, miscanthus, capim de corda, e reed canary grass; (3) resíduos do processo de fibras tais como fibra de milho, polpa de beterraba, finos e refu- gos de moinho de polpa e bagaço de cana de açúcar; (4) resíduos de área florestal tais como madeira de álamo, outras madeiras de lei, madeira macia e serragem; e (5) produtos de papel residual pós consumo.

A etapa do processo mais importante de converter uma carga de alimentação lignocelulósica em etanol envolve a conversão da celulose em glicose, para a subsequente conversão em etanol mediante a fermentação. Os dois processos primários para executar isto são a hidrólise ácida, que envolve a hidrólise da carga de alimentação usando uma etapa única de tra- tamento ácido, e a hidrólise enzimática, que envolve um pré-tratamento de ácido seguido pela hidrólise com enzimas celulases.

No processo de hidrólise de ácido, a carga de alimentação é tipi- camente submetida ao vapor e ácido sulfúrico em uma temperatura, concen- tração de ácido e duração do tempo que são suficientes para hidrolisar a celulose em glicose e a hemicelulose em xilose e arabinose. O ácido pode ser concentrado (25 a 80% p/p) ou diluído (3 a 8% p/p).A glicose é depois fermentada em etanol usando levedura, e o etanol é recuperado e purificado por destilação. Opcionalmente, a glicose pode ser fermentada em ácido lác- tico, butanol ou outros produtos.

No processo de hidrólise enzimática, as condições de reação são selecionadas tais que a área superficial da celulose é grandemente au- mentada quando a carga de alimentação fibrosa for convertida em uma tex- tura lamacenta, mas existe pouca conversão da celulose em glicose. A celu- lose pré-tratada é depois hidrolisada em glicose em uma etapa subsequente que utiliza enzimas celulases, e o tratamento de vapor e/ou ácido neste caso é conhecido como pré-tratamento. A glicose pode depois ser fermentada em etanol, ácido láctico, butanol, ou outros produtos. Antes da adição da enzi- ma, o pH da carga de alimentação acídica é ajustado para um valor que é adequado para a reação de hidrólise enzimática. Tipicamente, isto envolve a adição de álcali em um pH entre cerca de 4 a cerca de 6, que é a faixa de pH ideal par muitas celulases, embora o pH pode ser mais elevado se as celulases alcalofílicas forem usadas.

Em um tipo de processo de pré-tratamento, a pressão produzida pelo vapor é derrubada rapidamente com descompressão explosiva, que é conhecida como explosão de vapor. Foody (Patente U.S. n° 4.461.648) des- creve o equipamento e condições usadas no pré-tratamento de explosão de vapor. A explosão de vapor com ácido sulfúrico realizada em um pH de 0,4 a 2,0 produz material pré-tratado que é uniforme e requer menos enzima celu- Iase para hidrolisar a celulose do que outros processos de pré-tratamento. As enzimas de celulose catalisam a hidrólise da celulose (hidró-

Iise de ligações P-1,4-D-glucan) na carga de alimentação em produtos tais como glicose, celobiose, e outros celoligossacarídeos. A celulase é um ter- mo genérico que significa uma mistura de múltiplas enzimas compreendendo celobio-idrolases de exo-atuação (CBHs), endoglucanases (EGs) e β- glicosidases (βΘ) que podem ser produzidas por várias plantas e micro- organismos. As enzimas na celulase de Trichoderma reesei que contêm um domínio de ligação de celulose incluem CBH1 (mais geralmente, Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1 (Cel7B), EG2 (Cel5), EG4 (Cel61A), EG5 (Cel45A), EG6 (Cel74A), Cip1, Cip2, acetil xilan esterase, β-mananase, e suolenina. EG3 (Cel12) é um exemplo de uma enzima celulolítica sem um domínio de liga- ção de celulose.

As enzimas de celulase trabalham sinergisticamente para hidro- lisar a celulose em glicose. CBH1 e CBH2 atuam em extremidades opostas das cadeias de celulose para liberar celobiose (Barr e outros, 1996), enquan- to as endoglucanases atuam nas localizações internas na celulose. O produ- to primário destas enzimas é a celobiose, que é ainda hidrolisada em glicose pela β-glucosidase. É sabido que a maioria das CBHs e EGs se liga à celu- lose na carga de alimentação através de módulos de ligação ao carboidrato (CBMs), tais como domínios de ligação a celulose (CBDs), enquanto a maio- ria das enzimas β-glicosidases, incluído as enzimas β-glucosidases Tricho- derma e Aspergillus, não contém tais módulos de ligação e ficam em solução durante a hidrólise. Enzimas de celulase podem conter uma região de liga- ção que fazem conexão com o domínio catalítico ao módulo de ligação ao carboidrato. A região de ligação é suposta de facilitar a atividade do domínio cataliticamente ativo.

Os cinéticos da hidrólise enzimática de substratos celulósicos insolúveis por celulases não seguem o comportamento simples de Michaelis- Menten (Zhang e outros, 1999). Especificamente, aumentando a dosagem de celulase em uma reação de hidrólise não fornece um aumento linearmen- te dependente na quantidade de glicose produzida em um dado momento. Também existe uma diminuição significativa na taxa de reação quando a hidrólise de celulose continua (Tolan, 2002). Várias explicações foram pro- postas para explicar o declínio da taxa de reação. As hidroforeses principais incluem a inibição do produto, aumento da recalcitrância do substrato atra- vés do curso de uma hidrólise e inativação da enzima.

Os cinéticos da ação de celulase tornam a hidrólise enzimática do material de pré-tratamento uma etapa ineficiente na produção de etanol de celulose. A redução dos custos associada com a hidrólise enzimática, através do aumento da produção ou atividade da celulase, foi identificada como uma oportunidade importante para economizar os custos (Sheehan, 1999). Um relato recente de uma oficina de etanol celulósico patrocinado pela United States Department of Energy estimou um custo de 10 a 25 vezes mais elevado para a produção das enzimas para o etanol de celulose do que para as enzimas requeridas para produzir etanol de amido (Houghton, 2006).

Vários métodos foram tomados para aumentar a atividade das misturas de celulase. Aumentando a quantidade de β-glicosidase produzida pelo micro-organismo que também secreta as celulases misturadas se alivia a inibição do produto pela celobiose (Patente U.S. n° 6.015.703). As técnicas de propósito racional ou mutagênese aleatória também podem ser usadas para modular as propriedades das enzimas individuais, como demonstrado pela produção de uma variante de CBH1 com termoestabilidade aumentada (WO 2005/0277172). Um método alternativo para explorar a diversidade ge- nética é para diretamente examinar os homólogos de enzima de muitas es- pécies celulolíticas. Este método foi tomado com CBH1 (WO 2004/0197890) e CBH2 (WO 2006/0053514). A construção de uma proteína de fusão que combina atividades complementares de enzimas endo- e exocelulolíticas também foi demonstrada (WO 2006/00057672). A estrutura de domínio mo- dular das enzimas celulolíticas tem permitido a construção de enzimas com- preendendo o domínio catalítico. A ausência de um CBD tem efeitos dramá- ticos sobre a ligação de substrato e as atividades destas enzimas (WO 2004/0053373, WO 2006/0008885). As enzimas de hidrolisação de celulose geneticamente planejadas foram criadas as quais compreendem novas combinações do domínio cataliticamente ativo, da região de ligação e do CDB (Patente U.S. n° 5.763.254).

Todos os métodos descritos acima, embora direcionando os di- ferentes aspectos da hidrólise enzimática de celulose, não têm aumentado a atividade de celulase suficientemente para superar o custo elevado de celu- Iase para a hidrólise de celulose. Uma desvantagem destas estratégias tem sido o foco em uma única enzima em um momento, negligenciando as pos- síveis sinergias com outras enzimas celulósicas.

Portanto, um melhor método para aumentar a atividade de um sistema de celulase é focalizar na maximização da atividade de uma mistura contendo mais do que um componente de celulase. Foi relatado que a efici- ência da hidrólise de celulose por uma combinação de endo e exocelulases é muito maior do que seria esperado pela soma das atividades destas enzi- mas que atuam isoladamente (Wood e McCrae1 1979). Estudos anteriores mediram a sinergia entre as enzimas celulolíticas de T. reesei mediante a observação do comportamento das misturas binárias ou ternárias (por e- xemplo, Nidetsky e outros, 1994). Por exemplo, Wood e outros (1989) estu- daram as misturas binárias, terciárias e setenárias de celobio-idrolases e endoglucanases de Penicillium pinophilum. Entretanto, o sinergismo não foi observado nas misturas binárias das enzimas de Penicillium. O sinergismo das combinações binárias destas enzimas da bactéria Thermobifida fusca, duas das quais são das mesmas famílias como aquelas compreendendo as enzimas principais de Trichoderma, também foi caracterizado (Jeoh, 2006). No entanto, o desempenho melhorado não foi relatado. Várias tentativas foram feitas para desenvolver uma mistura de CBHs e EGs para maximizar a quantidade de hidrólise de celulose para uma dada dosagem de enzima (a dosagem de enzima é a massa de enzima re- querida para hidrolisar uma dada massa de celulose). Por exemplo, as mis- turas otimizadas de celulases de origem misturada incluindo bactérias, lar- gamente derivadas de T. fusca, foram relatadas (Irwin, 1993: Walker e ou- tros, 1993; Kim e outros, 1998). Trichoderma CBH1 e CBH2 foram incluídos nestes estudos, mas as bactérias são incapazes de produzir as 7 celulases da família e EG1, portanto não foi parte destas misturas. Baker e outros (1998) tentaram determinar uma mistura ideal de Trichoderma CBH1, CBH2, e EG1, mas não incluíram EG2 em sua experiência. No caso de Baker e ou- tros, o substrato foi Sigmacell, uma preparação de celulose microcristalina. Boisset e outros (2001) executaram uma otimização de uma mistura temária de CBH1, CBH2 e EG5 derivada de Humicola insolens no substrato de celu- Iose bacteriana. No entanto, estes estudos não foram bem sucedidos no de- senvolvimento de misturas de enzima celulase com desempenho melhorado para a hidrólise de celulose dentro da biomassa lignocelulósica pré-tratada.

Assim, a despeito de muito esforço de pesquisa, permanece uma necessidade de uma mistura de enzimas celulases melhorada para a hidrólise de celulose em uma carga de alimentação lignocelulósica pré- tratada. A ausência de uma tal mistura de enzimas representa um grande obstáculo na comercialização de conversão de celulose em açúcares solú- veis incluindo glicose para a produção de etanol e outros produtos. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma mistura de enzimas. Tam-

bém é fornecido um processo para a hidrólise enzimática de uma carga de alimentação lignocelulósica, em particular para a hidrólise enzimática de uma carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada.

É um objetivo da invenção fornecer um processo para uma hi- drólise enzimática melhorada de uma carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada.

Em particular, a presente invenção fornece para a conversão acentuada de uma carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada em açú- cares solúveis utilizando um grupo de combinações das quatro enzimas ce- Iulases primárias, CBH1, CBH1, EG1 e EG2.

De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um proces- so para a hidrólise enzimática de uma carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada em açúcares solúveis, a hidrólise enzimática compreendendo a adição de uma mistura de enzimas celulases na carga de alimentação ligno- celulósica pré-tratada, a mistura de enzimas celulases compreendendo um mistura de celulases primárias de celobio-idrolases CBH1 e CBH2 e endo- glucanases EG1 e EG2, as celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estando presen- tes em mais ou igual a 55% e menos do que 85% da mistura de celulase primária e a CBH2 estando presente em uma fração relativa às celobio- idrolases CBH1 e CBH2 como definida por fC2 e a EG2 estando presente em uma fração relativa às endoglucanases EG1 e EG2 como definida por fE2> em que

quando as celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em mais ou igual a 55% e menos do que 65% das celulases primárias, afC2ea fE2 estão em valores incluídos dentro da zona 1 da figura 3A;

quando as celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em mais ou igual a 65% e menos do que 75% das celulases primárias, a fC2 e a fE2 estão em valores incluídos dentro das zonas 1, 2, e 3 da figura 3B; e

quando as celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em mais ou igual a 75% e menos do que 85% das celulases primárias, a fo e a fE2 estão em valores incluídos dentro das zonas 1, 2 e 3 da figura 3C. De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecida uma

mistura de enzimas celulases como definido acima.

Preferivelmente, as celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estão pre- sentes em mais ou igual a 65% e menos do que 85% das celulases primá- rias. Quando ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em 65% a 75% das celulases primárias, a fc2 e dita fE2 estão cada uma preferivelmen- te em valores incluídos dentro da zonas 2 e 3 da figura 3B. Preferivelmente, a fc2 e a fE2 estão cada uma em valores incluídos dentro da zona 3 da figura 3Β. Quando as celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em 75% a 85% das celulases primárias, as fC2 e fE2 estão preferivelmente em valores incluídos dentro das zonas 2 e 3 da figura 3C. Preferivelmente, as fC2 e fE2 estão cada uma em valores incluídos dentro da zona 3 da figura 3C.

A presente invenção da mesma forma pertence a qualquer um dos aspectos anteriormente mencionados da invenção como definida acima, em que as celulases primárias são de uma fonte fúngica. As seqüências de codificação da celulase primária podem ser de um Ascomycete ou Basidi- omycete. Preferivelmente, as celulases primárias são de Trichoderma ssp, Aspergillus ssp, Hypocrea ssp ou Humieola ssp. Mais preferivelmente, as seqüências de codificação da celulase primária são de Triehoderma reesei.

A presente invenção também pertence a qualquer um dos as- pectos anteriormente mencionados da invenção como definido acima, em que as celulases primárias são obtidas de um organismo mediante a expres- são das seqüências de codificação que são endógenas a dito organismo. Alternativamente, as celulases primárias são obtidas de um organismo me- diante a expressão das seqüências de codificação que são heterólogas a dito organismo. Preferivelmente, as celulases primárias são de Triehoderma reesei.

Preferivelmente, a hidrólise enzimática converte pelo menos cer- ca de 80% da celulose na carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada em açúcares solúveis. Os açúcares solúveis podem ser fermentados para produzir etanol, ácido láctico, butanol, ou uma combinação destes.

A hidrólise enzimática é preferivelmente realizada com enzimas celulases compreendendo β-glucosidase e uma secretoma de Triehoderma reesei.

As misturas de celulase primária incluídas pela invenção apre- sentam atividade significativamente mais elevada do que aquelas descritas na técnica anterior. Os resultados mostram que as misturas de celulase da presente invenção são de cerca de 10% a cerca de 50%, ou qualquer quan- tidade entre estas, cerca de 10% a cerca de 25%, ou qualquer quantidade entre estas, ou de cerca de 10% a cerca de 15%, ou qualquer quantidade entre estas, mais potentes ou mais ativas do que as misturas de celulase correntemente disponíveis.

A possibilidade econômica da tecnologia de celulose em etanol foi limitada pelo custo das enzimas celulases. Mediante o fornecimento de enzimas com atividade melhorada, as enzimas celulases da presente inven- ção aumentam a economia do processo e representam um avanço significa- tivo sobre a técnica anterior.

Este sumário da invenção não necessariamente descreve todos os aspectos da invenção. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 contém a análise SDS-PAGE e Western blot dos com- ponentes de celulase primária purificados. A figura 1A mostra uma mancha Coomassie Blue de CBH1, CBH2, EG1 e EG2 purificadas após a SDS- PAGE. Uma celulase de Trichoderma foi analisada em paralelo para compa- ração. A figura 1B mostra que as Western blots específicas do componente destas amostras foram executadas seguinte a separação de SDS-PAGE e eletrotransferência para uma membrana de PVDF.

A figura 2 é um gráfico de coluna que descreve os resultados das análises ELISA. As colunas pretas sólidas ilustram a composição per- centual de CBH1, CBH2, EG1 e EG2 na celulase de Trichoderma comercial. As colunas remanescentes demonstram o nível de especificidade de cada ELISA. A composição percentual de: CBH1 em celulase desprovida de C- BH1 (a), CBH2 em uma celulase desprovida de CBH2 (b), EG1 em uma ce- lulase desprovida de EG1 (c) e EG2 em uma celulase desprovida de EG2 (d) é apresentada.

A figura 3 mostra diagramas das atividades de enzima de mistu- ras de celulase primária contendo CBH1, CBH2, EG1 e EG2. As atividades de várias misturas de celulase são traçadas em gráfico quando medidas em vários conteúdos fracionais de EG2 em relação à quantidade total de EG e CBH2 em relação ao conteúdo total de CBH (descrito como fE2 e fC2, respec- tivamente). O valor listado dentro de cada quadrado indica a atividade da mistura comparada com um valor de ponto de referência como descrito nos exemplos. As atividades das várias misturas de celulase são expressas em relação às atividades de um Benchmark Blend (CBH1, CBH2, EG1, EG2, em 57%, 29%, 7%, 7%, em peso). A figura 3A mostra as atividades das misturas em que o teor de CBH1 e CBH2 combinado é mais ou igual a 55% e menos do que 65% das celulases primárias totais. A figura 3B mostra as atividades das misturas em que o teor de CBH1 e CBH2 combinado é mais ou igual a 65% e menos do que 75% das celulases primárias totais. A figura 3C mostra as atividades das misturas em que o teor de CBH1 e CBH2 combinado é mais ou igual a 75% e menos do que 85% das celulases primárias totais. A figura 3D mostra as atividades das misturas em que o teor de CBH1 e CBH2 combinado é mais ou igual a 85% e menos do que ou igual a 95% das celu- lases primárias totais.

A figura 4 é um diagrama tridimensional que mostra as regiões ocupadas pelas misturas melhoradas de celulases primárias no espaço de mistura definido por %CBH, fC2 e fE2. As atividades são em relação ao Ben- chmark Blend. Cada par de imagens fornece duas vistas da mesma região e difere em uma rotação de 180° ao redor do eixo %CBH. A figura 4A mostra as misturas compreendendo a zona 1 da figura 3A e as regiões das zonas 1, 2 e 3 das figuras 3B e 3C. A figura 4B mostra as misturas compreendendo as regiões das zonas 2 e 3 das figuras 3B e 3C. A figura 4C mostra as mistu- ras compreendendo as regiões da zona 3 das figuras 3B e 3C.

A figura 5 é um diagrama que mostra a conversão do substrato lignocelulósico pré-tratado pela mistura de ponto de referência, que é uma mistura composta de celulases primárias nas proporções relativas observa- das em uma celulase tipo silvestre, e uma mistura melhorada representativa. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a uma mistura de enzimas. Tam- bém é fornecido um processo para a hidrólise enzimática de uma carga de alimentação lignocelulósica, em particular para a hidrólise enzimática de uma carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada.

A seguinte descrição é das modalidades preferidas.

A presente invenção refere-se a um mistura de enzimas célula- ses compreendendo celulases primárias para ser usada para a hidrolização de uma carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada. "Enzimas de celu- Iase primária" ou "celulases primárias" são definidas como as celobio- idrolases, CBH1 e CBH2, e as endoglucanases, EG1 e EG2. Além das celu- lases primárias, CBH1, CBH2, EG1 e EG2, a mistura de enzimas celulases pode compreender celulases adicionais assim como componentes de enzi- ma β-glucosidase como descrito com outros detalhes abaixo.

As seguintes definições se referem à classificação de celobio- idrolases, endoglucanases e β-glucosidases como definido pela Joint Com- mission on Biochemical Nomenclature of the International Union of Bioche- mistry and Molecular Biology (Published in Enzyme Nomenclature 1992, A- cademic Press, San Diego, Califórnia, ISBN 0-12-227164-5; with suppliments in Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250; 1-6, e Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650, cada uma das quais são aqui incorporadas por referên- cia; vide também: chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/) e às famílias de glicoi- drolase de celulases e β-glucosidases como definido pelo sistema CAZy que é aceito como uma nomenclatura padrão para as enzimas glicoidrolases (Coutinho, P.M. & Henrissat, B., 1999, "Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach." In Recent Advances in Carbohydrate Bioen- gineering, H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat and B. Svensson eds., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12, que é aqui incorporado por referência; vide também: afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/) e é familiar a aqueles ver- sados na técnica.

"CBH1" é uma enzima ativa de carboidrato expressa a partir de uma seqüência de DNA que codifica um domínio catalítico de Família 7 de glicoidrolase (GH) classificado sob EC 3.2.1.91. Qualquer enzima ativa de carboidrato com uma identidade de seqüência de aminoácido de 60% a 100% em qualquer enzima CBH1 ou mais preferivelmente de 65% a 100% de identidade de seqüência de aminoácido e que apresenta atividade de CBH1 como conhecido por uma pessoa versada na técnica (vide referências para a nomenclatura de celobio-idrolase), é similarmente definida como uma CBH1. Por exemplo, a CBH1 pode ser qualquer enzima ativa de carboidrato com 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100% de identidade de seqüência de aminoácido em qualquer enzima CBH1 e que apresenta atividade de CBH1 como conhecido por uma pessoa versada na técnica. Preferivelmente, a CBH1 é funcionalmente ligada a um módulo de ligação ao carboidrato (CBM) com uma alta afinidade para celulose cristalina, tal como um domínio de li- gação de celulose da Família 1.

A identidade de seqüência pode ser facilmente determinada pelo alinhamento dos aminoácidos das duas seqüências, usando alinhamento manual, ou qualquer algoritmo de alinhamento de seqüência como conheci- do versado da técnica, por exemplo, mas não limitado a estes, algoritmo BLAST (BLAST and BLAST 2.0; Altschul e outros, Nuc. Acids Res. 25:3389- 3402, 1977; e Altschul e outros, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990), o algoritmo descrito por Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algorit- mo de alinhamento por homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela pesquisa com relação ao método de similaridade de Pe- arson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), por implemen- tações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison1 Wis.), ou pelo alinhamento manual e ins- peção visual (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Au- subel e outros, eds. 1995 supplement)).

A "CBH2" é definida como uma enzima ativa de carboidrato ex- pressa a partir de uma seqüência de DNA que codifica um domínio catalítico da Família 6 de glicoidrolase (GH) classificado sob EC 3.2.1.91. Qualquer enzima ativa de carboidrato com 60% a 100% de identidade de seqüência de aminoácido em qualquer enzima CBH2, ou mais preferivelmente de 65% a 100% de identidade de seqüência de aminoácido e que apresenta ativida- de de CBH2 como conhecido por uma pessoa versada na técnica (vide refe- rências para a nomenclatura de celobio-idrolase), é similarmente definida como uma CBH2. Por exemplo, a CBH2 pode ser qualquer enzima ativa de carboidrato com 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100% de identidade de se- quência de aminoácido em qualquer enzima CBH2 e que apresenta ativida- de de CBH2 como conhecido por uma pessoa versada na técnica. Preferi- velmente, a CBH2 é funcionalmente ligada a um módulo de ligação ao car- boidrato (CBM) com uma afinidade elevada para celulase cristalina, tal como um domínio de ligação de celulose de Família 1. A identidade de seqüência pode ser determinada como acima delineado.

"EG1" é definida como uma enzima ativa de carboidrato expres- sa a partir de uma seqüência de DNA que codifica um domínio catalítico de Família 7 da glicoidrolase (GH) classificado sob EC 3.2.1.4. Qualquer enzi- ma ativa de carboidrato com 60% a 100%, ou mais preferivelmente de 65% a 100% de identidade de seqüência de aminoácido em qualquer enzima EG1 e que apresenta atividade de EG1 como conhecido por uma pessoa versada na técnica (vide referências com relação a nomenclatura de endo- glucanase), é similarmente definida como uma EG1. Por exemplo, a EG1 pode ser qualquer enzima ativa de carboidrato com 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100% de identidade de seqüência de aminoácido em qualquer en- zima EG1 e que apresenta atividade de EG1 como conhecido por uma pes- soa versada na técnica. Preferivelmente, a EG1 é funcionalmente ligada a um módulo de ligação ao carboidrato (CBM) com uma afinidade elevada pa- ra celulase cristalina, tal como um domínio de ligação de celulose da Família 1. A identidade de seqüência pode ser determinada como acima delineado.

A "EG2" é definida como uma enzima ativa de carboidrato ex- pressa a partir de uma seqüência de DNA que codifica um domínio catalítico da Família 5 de glicoidrolase (GH) classificado sob EC 3.2.1.4. Qualquer en- zima ativa de carboidrato com 60% a 100% de identidade de seqüência de aminoácido, ou mais preferivelmente de 65% a 100% de identidade de se- qüência de aminoácido em qualquer enzima EG2 e que apresenta atividade EG2 como conhecido por uma pessoa versada na técnica (vide referências para a nomenclatura de endoglucanase), é similarmente definida como uma EG2. Por exemplo, a EG2 pode ser qualquer enzima ativa de carboidrato com 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100% de identidade de seqüência de aminoácido em qualquer enzima EG2 e que apresenta atividade de EG2 como conhecido por uma pessoa versada na técnica. Preferivelmente1 a EG2 é funcionalmente ligada a um módulo de ligação ao carboidrato (CBM) com um afinidade elevada para celulase cristalina, tal como um domínio de ligação de celulose da Família 1. A identidade de seqüência pode ser deter- minada como acima descrito.

"β-Glucosidase" é definida como qualquer enzima da família 3 de GH que também é classificada sob EC 3.2.1.21. A BGL1 é definida como a enzima expressa do gene bgll de Trichoderma reesei. Qualquer seqüência de proteína com 60% a 100% de identidade de seqüência de aminoácido para a enzima BGL1 ou mais preferivelmente de 65% a 100% de identidade de seqüência de aminoácido e que apresenta atividade de β-glucosidase como conhecido por uma pessoa versada na técnica (vide referências para a nomenclatura de endoglucanase), é similarmente definida como uma BGL1. Por exemplo, a BGL1 pode ser qualquer enzima ativa de carboidrato com 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100% de identidade de seqüência de ami- noácido em qualquer enzima BGL1 e que apresenta atividade de BGL1 co- mo conhecido por uma pessoa versada na técnica. A identidade de seqüên- cia pode ser determinada como acima delineado.

As celobio-idrolases CBH1 e CBH2 dentro da mistura de enzi- mas celulases da presente invenção (isto é, o teor combinado de CBH1 e CBH2) estão presentes em mais ou igual a 55% e menos do que 85% da mistura de celulase primária, dentro da mistura de celulase (isto é, as quan- tidades de CBH1 e CBH2 compreendem de cerca de 55% a cerca de 85% da mistura de celulase primária, da mistura de enzimas celulases). Dentro desta faixa de misturas de CBH1 e CBH2, três conjuntos de misturas de des- tas enzimas de celulase primária, dependentes das diferentes frações do teor de CBH1 e CBH2 combinado em relação às celulases primárias (descri- to como o %CBH nas figuras 3A, 3B e 3C), foram identificados como apre- sentando uma vantagem na realização da hidrólise de uma carga de alimen- tação lignocelulósica. Estes conjuntos de misturas podem ser definidos pela fração de CBH2 em relação às celobio-idrolases CBH1 e CBH2 (em uma base de quantidade, peso, ou p:vol), onde esta fração é referida como fe: fc2 = CBH1/(CBH1 + CBH2). A fração de EG2 em relação às endoglucanases EG1 e EG2 é referida como fE2:

fE2 = EG2/(EG1 + EG2).

A mistura de componente para a primeira, segunda e terceira

misturas é traçada nas figuras 3A, 3B e 3C, respectivamente. As três repre- sentações dimensionais do espaço de mistura do componente descritas por estas misturas são apresentadas na figura 4.

CBH1 e CBH2 compreendendo de cerca de 55% a cerca de 65% da mistura de celulase primária

Quando as celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em mais ou igual a 55% e menos do que 65% das celulases primárias, a fração de celobio-idrolases que é CBH2 (fe) e a fração de endoglucanases que é EG2 (fE2) são cobertas pela zona 1 da figura 3A. A zona 1 da figura 3A inclui as seguintes três regiões:

valores da fc2 maiores ou iguais a 0,35 e menores do que 0,45 e valores dafE2 maiores ou iguais a 0,15 e menores do que 0,35;

valores da fc2 maiores ou iguais a 0,45 e menores do que 0,55 e valores dafE2 maiores ou iguais a 0,15 e menores do que 0,25; e valores dafc2 maiores ou iguais a 0,45 e menores do que 0,55 e

valores da fE2 maiores ou iguais a 0,35 e menores do que 0,45. CBH1 e CBH2 compreendendo de cerca de 65% a cerca de 75% da mistura de celulase primária

Quando as celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em maiores ou iguais a 65% e menores do que 75% das celulases primárias, a fc2 e a fE2 estão em valores incluídos dentro das zonas 1, 2, e 3 da figura 3B. As zonas 1, 2 e 3 incluem as seguintes regiões:

valores dafc2 maiores ou iguais a 0,25 e menores do que 0,35 e valores da fE2 maiores ou iguais a 0,05 e menores do que 0,35; valores dafc2 maiores ou iguais a 0,35 e menores do que 0,45 e

valores dafE2 maiores ou iguais a 0,05 e menores do que 0,55;

valores da fc2 maiores ou iguais a 0,45 e menores do que 0,65 e valores dafE2 maiores ou iguais a 0,05 e menores do que 0,65; e

valores dafC2 maiores ou iguais a 0,65 e menores do que 0,75 e valores da fE2 maiores ou iguais a 0,15 e menores do que 0,55.

As zonas 2 e 3 da figura 3B incluem as seguintes regiões: valores da fC2 maiores ou iguais a 0,25 e menores do que 0,35 e

os valores dafE2 são maiores ou iguais a 0,05 e menores do que 0,35;

valores dafC2 maiores ou iguais a 0,35 e menores do que 0,45 e os valores dafE2 são maiores ou iguais a 0,05 e menores do que 0,55; e

valores dafo maiores ou iguais a 0,45 e menores do que 0,65 e valores da fE2 maiores ou iguais a 0,15 e menores do que 0,55.

A zona 3 da figura 3B inclui as seguintes duas regiões: valores dafC2 maiores ou iguais a 0,45 e menores do que 0,55 e valores dafE2 maiores ou iguais a 0,15 e menores do que 0,55; e

valores dafC2 maiores ou iguais a 0,55 e menores do que 0,65 e valores da fE2 maiores ou iguais a 0,35 e menores do que 0,45.

Preferivelmente, a fc2 e a fE2 incluem valores dentro das zonas 2 e 3 da figura 3B. Mais preferivelmente, a fC2 e a fE2 incluem valores dentro da zona 3 da figura 3B.

CBH1 e CBH2 compreendendo de cerca de 75% a cerca de 85% da mistura de celulase primária

Quando as celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em menos ou equal a 75% e menos do que 85% das celulases primárias, a fc2 e a fE2 estão em valores incluídos dentro das zonas 1, 2 e 3 da figura 3C. As zonas 1, 2 e 3 incluem as seguintes regiões: valores dafc2 maiores ou iguais a 0,35 e menores do que 0,45 e

valores dafE2 maiores ou iguais a 0,05 e menores do que 0,25;

valores dafc2 maiores ou iguais a 0,45 e menores do que 0,55 e valores dafE2 maiores ou iguais a 0,15 e menores do que 0,65; e

valores dafc2 maiores ou iguais a 0,55 e menores do que 0,65 e valores dafE2 maiores ou iguais a 0,15 e menores do que 0,35.

As zonas 2 e 3 incluem as seguintes três regiões:

valores dafc2 maiores ou iguais a 0,35 e menores do que 0,45 e valores dafE2 maiores ou iguais a 0,15 e menores do que 0,25;

valores dafC2 maiores ou iguais a 0,45 e menores do que 0,55 e valores dafE2 maiores ou iguais a 0,15 e menores do que 0,55; e

valores da fC2 maiores ou iguais a 0,55 e menores do que 0,65 e valores da fE2 maiores ou iguais a 0,15 e menores do que 0,25.

A zona 3 define uma região única incluindo os valores da fc2 en- tre 0,45 e 0,55 e valores dafE2 entre 0,15 e 0,25.

Preferivelmente, afC2ea fE2 incluem valores dentro das zonas 2 e 3 da figura 3C. Mais preferivelmente, a fC2 e a fE2 incluem valores dentro da zona 3 da figura 3C.

A fração ou porcentagem de cada componente de celulase den- tro da mistura de celulase é determinada mediante o uso dos métodos do Exemplo 3.

Portanto, a presente invenção fornece um mistura de enzimas e um processo para a hidrólise enzimática de uma carga de alimentação Iigno- celulósica pré-tratada em açúcares solúveis compreendendo a hidrolisação da carga de alimentação pré-tratada com a mistura de enzimas. A mistura de enzimas celulases compreende uma mistura de celulase primária de celobio- idrolases CBH1 e CBH2 e endoglucanases EG1 e EG2. As celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em um teor combinado maior ou igual a 55% e menor do que 85% da mistura de celulase primária. As CBH2 estão pre- sentes em um fração, definida por fc2, em relação às celobio-idrolases CBH1 e CBH2, e as EG2 estão presentes em uma fração, definida por fE2, em rela- ção às endoglucanases EG1 e EG2, em que (i) quando ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em mais ou igual a 55% e menos do que 65% das celulases primárias, dita fC2 e dita fE2 estão em valores incluídos dentro da zonas 1 da figura 3A;

(ii) quando ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em mais ou igual a 65% e menos do que 75% das celulases primárias, dita fe e

dita fE2 estão em valores incluídos dentro das zonas 1, 2, e 3 da figura

3B; e

(iii) quando ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em mais ou igual a 75% e menos do que 85% das celulases primárias, dita fc2 e dita ÍE2 estão em valores incluídos dentro das zonas 1, 2, e 3 da figura 3C.

A mistura de enzimas celulases da invenção é usada para a hi- drólise enzimática de uma "carga de alimentação lignocelulósica pré- tratada". Uma carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada é um materi- al de origem vegetal que, antes do pré-tratamento, contém pelo menos 20% de celulose (peso seco) e pelo menos 12% Iignina (peso seco), e que foi submetido aos processos físicos e/ou químicos tornar a fibra mais acessível e/ou receptiva às ações de enzimas celulolíticas.

Após o pré-tratamento, a carga de alimentação lignocelulósica pode conter mais do que cerca de 20% de celulose e mais do que cerca de 12% de lignina. Em uma modalidade, a carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada contém mais do que cerca de 20% de celulose e mais do que cerca de 10% de lignina.

As cargas de alimentação lignocelulósicas que podem ser utili- zadas na invenção incluem, mas não são limitados a eles, resíduos agrícolas tais como forragem de milho, palha de trigo, palha de cevada, palha de ar- roz, palha de aveia, palha de canola e palha de soja; resíduos do processo fibroso tais como fibra de milho, polpa de beterraba açucareira, finos e refu- gos de moinho de polpa ou bagaço de cana de açúcar; resíduos de área flo- restal tais como madeira de álamo, outras madeiras de lei, madeira macia e serragem; ou pastos tais como capim flexível, miscanthus, capim de corda, e reed canary grass.

A carga de alimentação lignocelulósica pode ser primeiro sub-

metida a redução de tamanho por métodos incluindo, mas não limitado a estes, moagem, trituração, agitação, corte em pedaços, compres- são/expansão, ou outros tipos de ação mecânica. A redução de tamanho por ação mecânica pode ser executada por qualquer tipo de equipamento adap- tado para o propósito, por exemplo, mas não limitado a este, um moinho de martelo.

Exemplos não Iimitativos de processos de pré-tratamento inclu- em o tratamento químico de uma carga de alimentação lignocelulósica com ácido sulfúrico ou sulfuroso, ou outros ácidos; amônia, cal, hidróxido de a- mônio, ou outras bases; etanol, butanol, ou outros solventes orgânicos; ou água pressurizada (Ver as Patentes U.S. n°J_ 4.461.648, 5.916.780, 6.090.595, 6.043.392, 4.600.590, Weil e outros (1997) e Õhgren, K., e outros (2005); que são aqui incorporadas por referência).

O pré-tratamento pode ser realizado para hidrolisar a hemicelu- lose, ou uma parte desta, que está presente na carga de alimentação ligno- celulósica nos açúcares monoméricos, por exemplo, xilose, arabinose, ma- nose, galactose, ou uma combinação das mesmas. Preferivelmente, o pré- tratamento é realizado de modo que a hidrólise quase completa da hemicelu- Iose e uma pequena quantidade de conversão de celulose em glicose ocor- re. Durante o pré-tratamento, tipicamente uma concentração de ácido na pasta fluida aquosa de cerca de 0,02% (p/p) a cerca de 2% (p/p), ou qual- quer quantidade entre estas, é usada para o tratamento da carga de alimen- tação lignocelulósica. Preferivelmente, o ácido usado durante o pré- tratamento é ácido sulfúrico.

A carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada pode ser pro- cessada após o pré-tratamento, mas antes da hidrólise enzimática por qual- quer uma das diversas etapas, tais como diluição com água, lavagem com água, tamponamento, filtração ou centrifugação, ou um combinação destes processes, como é familiar para aqueles versados na técnica.

A carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada é logo depois submetida à hidrólise enzimática. Pelo termo "hidrólise enzimática", quer dizer um processo pelo qual as enzimas celulases atuam na celulose para converter totalmente ou uma parte desta em açúcares solúveis. Os açúcares solúveis significam incluir monômeros e oligômeos de hexose solúveis em água de até seis unidades monoméricas que são derivadas da porção de celulose da carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada. Exemplos de açúcares solúveis são glicose, celobiose, celodextrinas ou misturas destes. Preferivelmente, os açúcares solúveis são predominantemente celobiose e glicose. Em uma modalidade mais preferida, os açúcares solúveis são pre- dominantemente glicose.

O processo de hidrólise enzimática preferivelmente converte cerca de 80% a cerca de 100% da celulose em açúcares solúveis, ou qual- quer faixa entre esta. Mais preferivelmente, o processo de hidrólise enzimá- tica converte cerca de 90% a cerca de 100% da celulose em açúcares solú- veis, ou qualquer faixa entre esta. Na modalidade mais preferida, o processo de hidrólise enzimática converte cerca de 98% a cerca de 100% da celulose em açúcares solúveis, ou qualquer faixa entre esta.

A hidrólise enzimática usando a mistura de celulase pode ser hidrólise por batelada, hidrólise contínua, ou uma combinação das mesmas. A hidrólise pode ser agitada, não misturada, ou uma combinação das mes- mas.

A hidrólise enzimática é preferivelmente realizada em uma tem- peratura de cerca de 45°C a cerca de 75°C, ou qualquer quantidade entre estas, e um pH de cerca de 3,5 a cerca de 7,5, ou qualquer quantidade entre estas. A concentração inicial de celulose no reator de hidrólise, antes de co- meçar a hidrólise, é preferivelmente de cerca de 4% (p/p) a cerca de 15% (p/p), ou qualquer quantidade entre estas. A dosagem combinada de todas as enzimas de celulase primária pode ser de cerca de 5 a cerca de 45 mg de proteína por grama de celulose, ou qualquer quantidade entre estas. A hidró- lise pode ser realizada durante um período de tempo de cerca de 12 horas a cerca de 200 horas, ou qualquer quantidade entre estas. Preferivelmente, a hidrólise é realizada durante um período de 15 horas a 100 horas. Deve ser observado que as condições de reação não significam limitar a invenção de qualquer maneira e podem ser ajustadas como desejável por aqueles versa- da na técnica.

A hidrólise enzimática é tipicamente realizada em um reator de hidrólise. As enzimas de celulase primária são adicionadas na carga de ali- mentação lignocelulósica pré-tratada (também referida como o "substrato") antes, durante ou após a adição do substrato ao reator de hidrólise.

Preferivelmente, as celulases primárias são produzidas em uma ou mais fermentações de cultura submersas em líquido e separadas das células no final da fermentação. As células podem ser separadas das celula- ses por filtração, centrifugação, ou outros processos familiares para aqueles versados na técnica. A fração contendo celulase livre de célula pode depois ser concentrada (por exemplo, através da ultrafiltração), conservada e/ou estabilizada antes do uso. Alternativamente, as celulases primárias não são separadas das células, mas são adicionadas à hidrólise enzimática com as células.

A mistura de celulase pode ser uma solução aquosa de proteína em água, uma pasta fluida de proteína em água, um pó sólido ou grânulo, ou um gel. A mistura compreendendo enzimas celulases pode incluir aditivos tais como tampões, detergentes, estabilizantes, cargas, ou outros tais aditi- vos familiares para aqueles versados na técnica.

Preferivelmente, as celulases primárias são expressas a partir das seqüências de codificação dos fungos. Nesta modalidade, as seqüên- cias de codificação devem ser de qualquer fonte fúngica. Os termos "fungo", "fungos", "fúngico", "Ascomycotina", "Basidiomycotina" e termos relaciona- dos (por exemplo, "ascomicetos" e "basidiomicetos") e significam incluir a- queles organismos definidos como tais em The Fungi: An Advanced Treatise (GC Ainsworth, FK Sparrow, COMO Sussman, eds.; Academic Press 1973).

Qualquer fonte de enzimas celulases pode ser usada na prática da invenção. As seqüências de codificação das celulases da invenção são preferivelmente de Ascomycotina ou Basidomycotina. Por exemplo, as se- qüências de codificação são dos gêneros selecionados de Trichoderma ssp., Aspergillus ssp., Hypocrea ssp., Humicola ssp., Neurospora ssp., Orpinomy- ces ssp., Gibberella ssp., Emericella ssp., Chaetomiun ssp., Fusarium ssp., Penicillium ssp., Magnaporthe ssp., e Phanerochaete ssp. Preferivelmente, as seqüências de codificação para as celulases primárias são de Trichoder- ma reesei.

As celulases primárias da invenção podem ser clonadas e ex- pressas em um micro-organismo conhecido daqueles versada na técnica como um hospedeiro de expressão, tal como uma bactéria ou um fungo. Preferivelmente, o micro-organismo é um fungo. A construção genética pode ser introduzida no micróbio hospedeiro por qualquer número de métodos conhecidos por uma pessoa versada na técnica de transformação microbia- na, incluindo, mas não-limitada a estes, tratamento de células com CaCI2, electroporação, bombardeio biolístico, fusão mediada por PEG de protoplas- tos (por exemplo, White e outros, WO 2005/093072, que é aqui incorporado por referência).

Todas as celulases primárias podem ser expressas a partir de uma cepa de um organismo. Alternativamente, as celulases primárias podem ser expressas individualmente ou em subgrupos de diferentes cepas de dife- rentes organismos. Também é contemplado que as celulases primárias po- dem ser expressas individualmente ou em subgrupos de diferentes cepas de um único organismo, tais como de diferentes cepas de Trichoderma reesei. Preferivelmente, todas as celulases são expressas a partir de uma única ce- pa de Trichoderma reesei.

As celulases primárias são preferivelmente partes de um sistema de celulase total produzido pelo(s) organismo(s) de expressão. Em uma mo- dalidade, as celulases primárias são as únicas enzimas celulases do sistema de celulase. Em uma outra modalidade, as celulases primárias são partes de um sistema de celulase que inclui β-glucosidase.

As celulases primárias podem ser partes de um sistema de celu- lase total que inclui a secretoma de Trichoderma reesei. Pelo termo "secre- toma", significa todas as proteínas secretadas extracelularmente no meio de crescimento por um micro-organismo específico. Em uma modalidade prefe- rida, as celulases primárias são partes de um sistema de celulase total que inclui a β-glucosidase BGL1 de Trichoderma reesei e a secretoma de Tri- choderma reesei.

Os açúcares solúveis produzidos pela hidrólise enzimática po- dem ser fermentados por micróbios. Os produtos da fermentação podem incluir quaisquer produtos desejados que gerem o valor à usina de fermenta- ção. Os produtos de fermentação preferidos são etanol, butanol e ácido lác- tico, todos dos quais possuem grandes mercados e são produzidos eficien- temente por muitos micróbios. Para a produção de etanol, a fermentação pode ser realizada por um ou mais do que um micróbio que é capaz de fer- mentar os açúcares em etanol. Por exemplo, a fermentação pode ser reali- zada pela levedura de Saccharomyces recombinante que foi planejada para fermentar glicose, manose, galactose e xilose em etanol, ou glicose, mano- se, galactose, xilose e arabinose em etanol. As leveduras recombinantes que podem fermentar xilose em etanol são descritas na Patente U.S. n° 5.789.210 (que é aqui incorporada por referência). A levedura produz um caldo de fermentação que compreende etanol em uma solução aquosa. Para a produção de ácido láctico, a fermentação pode ser realizada por um mi- cróbio que fermenta os açúcares em ácido láctico.

Em uma modalidade da invenção, a mistura de enzimas celula- ses é produzida mediante a expressão das celulases primárias de um micro- organismo em valores de pH acídicos. Preferivelmente, os valores de pH estão entre cerca de 2 e cerca de 5. Por exemplo, o pH da fermentação po- de ser cerca de 2,0, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4,0, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8 ou 5,0, ou qualquer pH entre estes.

As misturas de enzima da invenção são de composição muito diferente do que aquelas descritas na técnica anterior para a hidrólise de celulose. As misturas de celulase primária da invenção são composições significativamente diferentes de um "Benchmark Blend", uma composição de CBH1, CBH2, EG1 e EG2 de 57%, 29%, 7%, 7%, respectivamente. As me- lhores misturas são traçadas nas figuras 3A, 3B e 3C e o Benchmark Blend é indicada onde ocorre no espaço de mistura traçado na figura 3D. As repre- sentações tridimensionais do espaço de mistura do componente descritas por estas zonas são mostradas na figura 4. As misturas de enzima da pre- sente invenção possuem atividade superior do que aquelas descritas na téc- nica anterior. As zonas 1, 2 e 3 das figuras apresentam aumentos de ativi- dade de 10% ou mais quando comparadas com a Benchmark Blend. As zo- nas 2 e 3 apresentam aumentos de atividade de 13% ou mais quando com- paradas à Benchmark Blend. As misturas definidas pela zona 3 apresentam aumentos de 16% mais em relação à Benchmark Blend.

A forma irregular das zonas traçadas das figuras 3A, 3B e 3C não foi prevista e indica regiões de atividade exagerada dentro do espaço de mistura inteiro. A mistura de celulase da invenção define um espaço que é mais complicado do que pode ser considerado pelo trabalho anterior usando substratos padrão ou misturas de enzima de menos do que quatro celulases primárias.

Os últimos esforços otimizaram as misturas tipicamente empre- gadas em misturas ternárias traçadas em gráfico em um diagrama triangular (conforme Baker e outros, 1998). Tais esforços caíram sobre os ângulos, bordas, ou superfícies do espaço, e assim estão distantes do ideal efetivo. A presente invenção será ainda ilustrada nos exemplos que se-

guem.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Purificação das celulases primárias CBH1, CBH2, EG1 e EG2 da celulase de Trichoderma reesei Uma cepa de Trichoderma reesei foi desenvolvida em fermenta-

ção líquida submersa sob condições que induzem a produção de celulase como conhecido por aqueles versados na técnica. A mistura bruta de proteí- nas de Trichoderma foi secretada pelas células no caldo de fermentação. As células fúngicas foram removidas do caldo de fermentação pelà filtração a- través de um filtra de microfibra de vidro contendo um leito de filtro Harborli- te. As celulases primárias (CBH1, CBH2, EG1, EG2) foram separadas do filtrado bruto pela cromatografia de troca de ânion usando uma coluna de DEAE-Sepharose como descrito por Bhikhabhai e outros (1984). Esta etapa isolada EG1 e EG2. As CBH1 e CBH2 foram depois mais adiante purificadas por cromatografia por afinidade de p-aminofenil-1-tio-p-D-celobiosida como relatado em Piyachomkwan e outros (1997, 1998). Os componentes de celu- lase purificados foram concentrados e o tamponante trocado em citrato de sódio 50 mM, pH 5,0 usando uma células de ultrafiltração agitada (Amicon) e uma membrana de polietersulfona 10 kDa NMWL. Exemplo 2: Medição da concentração e pureza das celulases primárias

As concentrações de proteína foram determinadas quimicamen- te usando o método de Bradford e outros (1976). As amostras de cada prote- ína purificada foram separadas por SDS-PAGE e visualizadas pós- eletroforeticamente pela mancha de Commassie Blue como mostrado na figura 1, painel A. Para cada componente purificado, a intensidade da man- cha de cada faixa foi quantificada pela densiometria de varredura usando um sistema de formação de imagem Chemigenius2 (Syngene). A pureza relativa foi calculada pela divisão da intensidade de faixa para cada componente pe- la intensidade total da mancha medida para todas as faixas na mesma pas- sagem sobre o gel. A EG2 que carece de um módulo de ligação ao carboi- drato estava presente em quantidades de traço, mas não foi considerada um contaminante nesta preparação de enzima. A pureza relativa de CBH1 e CBH2 foi de >95% enquanto que para as EG1 e EG2 foi de >90 %.

Para demonstrar que cada preparação de componente foi des- provida de celulases primárias contaminantes, as CBH1, CBH2, EG1, EG2 purificadas foram analisadas por Western blotting usando antissoro policlo- nal específico do componente de coelho (figura 1, painel B). As proteínas foram separadas por 10% SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) em 100 V durante 1 h usando um Mini Trans-Blot® Cell da BioRad. Western blotting foi executado usando o método de Birkett e outros O antissoro policlonal específico do componente foi gera- do usando peptídeos sintéticos, as seqüências dos quais se basearam na seqüência de aminoácido primária de CBH1, CBH2, EG1 ou EG2 de Tricho- derma reesei, como conhecido daqueles versados na técnica.

Estes exemplos demonstraram que os métodos de purificação usados produziram CBH1, CBH2, EG1 e EG2 substancialmente puras. Isto também demonstrou a especificidade deste antissoro para cada um destes componentes de celulase primária.

Exemplo 3: Determinação das concentrações relativas de CBH1, CBH2, EG1 e EG2 em Celulase de Trichoderma

As concentrações relativas de CBH1, CBH2, EG1 e EG2 em ce- Iulase de Trichoderma reesei foram determinadas por ELISA.

Padrões de componente de celulase e purificado foram diluídos de 1 a 100 μg/ml em salina tamponada de fosfato, pH 7,2 (PBS) e incubados durante a noite a 4°C em placas de microtítulo (Costar EIA - ligação eleva- da). Estas placas foram lavadas com PBS contendo 0,1% Tween 20 (PBS/Tween) e depois incubadas em PBS contendo 1% albumina de soro bovino (PBS/BSA) durante 1 h em temperatura ambiente. As cavidades de microtítulo bloqueados foram lavados com PBS/Tween. O antissoro policlo- nal de coelho para CBH1, CBH2, EG1 e EG2 foi diluído em PBS/BSA, adi- cionado para separar as placas de microtítulo e incubado durante 2 h em temperatura ambiente. As placas foram lavadas e incubadas com um anti- corpo anticoelho de cabra acoplado com peroxidase de rábano picante du- rante 1 h em temperatura ambiente. Após lavagem, tetrametilbenzidina foi adicionado em cada placa e incubado durante 1 h em temperatura ambiente.

A absorvência em 360 nm foi medida em cada cavidade e con- vertida em concentração de proteína usando os padrões de CBH1, CBH2, EG1 e EG2 desenvolvidos no Exemplo 2. A concentração relativa de cada componente foi calculada pela divisão destas concentrações de proteína pela concentração total de CBH1, CBH2, EG1 e EG2.

A composição relativa de CBH1, CBH2, EG1 e EG2 na celulase de Trichoderma foi 57 %:29 %:7 %:7%, respectivamente (figura 2). Isto será aqui referido como nosso Benchmark Blend. Esta Blend é de um produto comercial de celulase de Trichoderma e é traçado como se segue.

A concentração de CBHs em relação ao conjunto inteiro de celu- Iases primárias (% de CBH) é 57 %+29% = 86 %. Isto se aplica ao conjunto na figura 3D, que é de 85% a 95% de CBHs. As outras figuras são figura 3A, com %CBH = 55% a 65%, figura 3B, com% CBH = 65% a 75% e figura 3C com %CBH = 75% a 85 %.

A concentração de CBH2 em relação a todas as CBH (fe) é 29 %/(57 %+29 %) = 0,337.

A concentração de EG2 em relação a todas as POR EXEMPLO, primárias (fE2) é 7 %/(7 %+7 %) = 0,5. A celulase das cepas de Trichoderma que não secretam CBH1

(CBH1 nula), CBH2 (CBH2 nula), EG1 (EG1 nula) ou EG2 (EG2 nula) tam- bém foi analisada para demonstrar que cada ELISA detectou CBH1, CBH2, EG1 ou EG2 especificamente (figura 2).

Exemplo 4: Medição da atividade de hidrólise de celulose de misturas de celulase primária em uma carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada.

Uma mistura de celulases primárias com nossas relações Ben- chmark CBH1, CBH2, EG1 e EG2 do exemplo 3 foi comparada com as mis- turas com diferentes composições. Estas misturas de celulases primárias foram testadas em um ensaio de 0,25 ml de hidrólise de celulose misturada. As misturas de celulase foram diluídas em tampão de citrato contendo 0,5% benzoato de sódio, complementadas com uma preparação de β-glucosidase de Aspergillis niger e incubadas com palha de trigo pré-tratado com ácido. O pré-tratamento foi realizado como por Foody, Patente U.S. n° 4.461.648. A incubação foi em 50°C durante 24 h e o nível de conversão de celulose alvo foi maior do que 70 %. A atividade de enzima foi calculada mediante a de- terminação da quantidade de enzima requerida para alcançar o nível de conversão de celulose alvo e normalização daquela requerida para a mistura de celulase Benchmark.

A incerteza dos valores normalizados é na ordem de ± 0,04, in- dicando que um valor 10% acima que o observado para o ponto de referên- cia (isto é, um valor normalizado de 1,10) pode ser dito de ser significativa- mente maior do que o ponto de referência. Uma média pesada através do espaço de mistura tridimensional (espaço com as dimensões fc2, fE2, e %C- BH) foi aplicada para facilitar os dados de atividade. Os dados de atividade normalizados para um dado ponto (as coordenadas deste ponto são fC2 = x, ÍE2 = y, %CBH = z) foram divididos proporcionalmente com seus seis pontos mais estritamente próximos com as seguintes coordenadas: χ + 0,1, y, ζ; χ - 0,1, y, z; x, y + 0,1, z; x, y- 0,1, z; x, y, z+ 10 %; e x, y, z- 10 %. O ponto em questão foi dado uma pesagem w = 1,00 e os seis pontes próximos fo- ram a cada um dado uma pesagem de w = 0,15 na seguinte fórmula para a média ponderada (xw): xw = IwíXí/Iwí onde o subscrito i significa uma conta- gem variável para somar o total de 7 pontos descritos acima e x, e w, indica a atividade normalizada e pesagem do ponto ith respectivamente.

Para representar estes resultados graficamente, a atividade de enzima é mostrada nas figuras 3A, 3B, 3C, ou 3D como descrita no exemplo 3 e ilustrada na Tabela 1.

Tabela 1: Produção de glicose normalizada pelas misturas de celulase pri- mária

Mistura % CBH1 % CBH2 % EG1 % EG2 % CBH* Figura r ** 'C2 t *** 'E2 Ativi- dade Ben- chmark Blend 57% 29% 7% 7% 86% 1D 0,333 0,500 1,00 1 36% 23% 37% 4% 59% 1A 0,396 0,087 1,08 2 36% 23% 33% 8% 59% 1A 0,396 0,187 1,11 3 36% 23% 29% 12% 59% 1A 0,396 0,287 1,10 4 30% 29% 37% 4% 59% 1A 0,496 0,087 1,09 30% 29% 33% 8% 59% 1A 0,496 0,187 1,11 6 30% 29% 29% 12% 59% 1A 0,496 0,287 1,09 7 30% 29% 25% 16% 59% 1A 0,496 0,387 1,11 8 24% 35% 37% 4% 59% 1A 0,596 0,087 1,06 9 24% 35% 33% 8% 59% 1A 0,596 0,187 1,06 24% 35% 29% 12% 59% 1A 0,596 0,287 1,04 11 24% 35% 25% 16% 59% 1A 0,596 0,387 1,06 12 62% 7% 28% 3% 69% 1B 0,096 0,087 0,90 13 62% 7% 25% 6% 69% 1B 0,096 0,187 0,91 14 62% 7% 22% 9% 69% 1B 0,096 0,287 0,91 56% 14% 28% 3% 69% 1B 0,196 0,087 1,05 16 56% 14% 25% 6% 69% 1B 0,196 0,187 1,08 17 56% 14% 22% 9% 69% 1B 0,196 0,287 1,08 18 56% 14% 19% 12% 69% 1B 0,196 0,387 1,02 19 49% 20% 28% 3% 69% 1B 0,296 0,087 1,15 49% 20% 25% 6% 69% 1B 0,296 0,187 1,14 21 49% 20% 22% 9% 69% 1B 0,296 0,287 1,13 22 49% 20% 19% 12% 69% 1B 0,296 0,387 1,08 23 49% 20% 16% 15% 69% 1B 0,296 0,487 1,08 24 49% 20% 13% 18% 69% 1B 0,296 0,587 1,06 42% 27% 28% 3% 69% 1B 0,396 0,087 1,14 26 42% 27% 25% 6% 69% 1B 0,396 0,187 1,14 Mistura % CBH1 % CBH2 % EG1 % EG2 % CBH* Figura f ** Tc2 r *** •E2 Ativi- dade 27 42% 27% 22% 9% 69% 1B 0,396 0,287 1,13 28 42% 27% 19% 12% 69% 1B 0,396 0,387 1,13 29 42% 27% 16% 15% 69% 1B 0,396 0,487 1,14 42% 27% 13% 18% 69% 1B 0,396 0,587 1,06 31 42% 27% 10% 21% 69% 1B 0,396 0,687 1,05 32 35% 34% 28% 3% 69% 1B 0,496 0,087 1,11 33 35% 34% 25% 6% 69% 1B 0,496 0,187 1,16 34 35% 34% 22% 9% 69% 1B 0,496 0,287 1,17 35% 34% 19% 12% 69% 1B 0,496 0,387 1,17 36 35% 34% 16% 15% 69% 1B 0,496 0,487 1,18 37 35% 34% 13% 18% 69% 1B 0,496 0,587 1,12 38 35% 34% 10% 21% 69% 1B 0,496 0,687 1,07 39 28% 41% 28% 3% 69% 1B 0,596 0,087 1,11 40 28% 41% 25% 6% 69% 1B 0,596 0,187 1,14 41 28% 41% 22% 9% 69% 1B 0,596 0,287 1,14 42 28% 41% 19% 12% 69% 1B 0,596 0,387 1,16 43 28% 41% 16% 15% 69% 1B 0,596 0,487 1,15 44 28% 41% 13% 18% 69% 1B 0,596 0,587 1,11 45 28% 41% 10% 21% 69% 1B 0,596 0,687 1,07 46 21% 48% 28% 3% 69% 1B 0,696 0,087 1,07 47 21% 48% 25% 6% 69% 1B 0,696 0,187 1,11 48 21% 48% 22% 9% 69% 1B 0,696 0,287 1,10 49 21% 48% 19% 12% 69% 1B 0,696 0,387 1,10 50 21% 48% 16% 15% 69% 1B 0,696 0,487 1,10 51 14% 55% 28% 3% 69% 1B 0,796 0,087 1,00 52 14% 55% 25% 6% 69% 1B 0,796 0,187 1,02 53 14% 55% 22% 9% 69% 1B 0,796 0,287 1,00 54 14% 55% 19% 12% 69% 1B 0,796 0,387 1,00 55 71% 8% 19% 2% 79% 1C 0,096 0,087 0,90 56 71% 8% 17% 4% 79% 1C 0,096 0,187 0,89 57 64% 15% 19% 2% 79% 1C 0,196 0,087 1,00 58 64% 15% 17% 4% 79% 1C 0,196 0,187 1,05 59 64% 15% 15% 6% 79% 1C 0,196 0,287 1,04 60 56% 23% 19% 2% 79% 1C 0,296 0,087 1,06 Mistura % CBH1 % CBH2 % EG1 % EG2 % CBH* Figura r ** >C2 r *** «E2 Ativi- dade 61 56% 23% 17% 4% 79% 1C 0,296 0,187 1,08 62 56% 23% 15% 6% 79% 1C 0,296 0,287 0,97 63 56% 23% 13% 8% 79% 1C 0,296 0,387 0,92 64 56% 23% 11% 10% 79% 1C 0,296 0,487 0,90 65 56% 23% 9% 12% 79% 1C 0,296 0,587 0,88 66 48% 31% 19% 2% 79% 1C 0,396 0,087 1,10 67 48% 31% 17% 4% 79% 1C 0,396 0,187 1,13 68 48% 31% 15% 6% 79% 1C 0,396 0,287 1,08 69 48% 31% 13% 8% 79% 1C 0,396 0,387 1,03 70 48% 31% 11% 10% 79% 1C 0,396 0,487 1,01 71 48% 31% 9% 12% 79% 1C 0,396 0,587 0,92 72 40% 39% 19% 2% 79% 1C 0,496 0,087 1,09 73 40% 39% 17% 4% 79% 1C 0,496 0,187 1,16 74 40% 39% 15% 6% 79% 1C 0,496 0,287 1,15 75 40% 39% 13% 8% 79% 1C 0,496 0,387 1,13 76 40% 39% 11% 10% 79% 1C 0,496 0,487 1,14 77 40% 39% 9% 12% 79% 1C 0,496 0,587 1,10 78 32% 47% 19% 2% 79% 1C 0,596 0,087 1,08 79 32% 47% 17% 4% 79% 1C 0,596 0,187 1,15 80 32% 47% 15% 6% 79% 1C 0,596 0,287 1,10 81 32% 47% 13% 8% 79% 1C 0,596 0,387 1,04 82 32% 47% 11% 10% 79% 1C 0,596 0,487 1,03 83 32% 47% 9% 12% 79% 1C 0,596 0,587 1,01 84 24% 55% 19% 2% 79% 1C 0,696 0,087 1,00 85 24% 55% 17% 4% 79% 1C 0,696 0,187 1,06 86 24% 55% 15% 6% 79% 1C 0,696 0,287 1,06 87 16% 63% 19% 2% 79% 1C 0,796 0,087 0,95 88 16% 63% 17% 4% 79% 1C 0,796 0,187 0,94 89 16% 63% 15% 6% 79% 1C 0,796 0,287 0,98 90 63% 26% 10% 1% 89% 1D 0,296 0,087 0,92 91 63% 26% 9% 2% 89% 1D 0,296 0,187 0,96 92 63% 26% 8% 3% 89% 1D 0,296 0,287 0,92 93 54% 35% 10% 1% 89% 1D 0,396 0,087 0,96 94 54% 35% 9% 2% 89% 1D 0,396 0,187 1,06 Mistura % CBH1 % CBH2 % EG1 % EG2 % CBH* Figura r ** 'C2 r *** 'E2 Ativi- dade 95 54% 35% 8% 3% 89% 1D 0,396 0,287 1,00 96 45% 44% 10% 1% 89% 1D 0,496 0,087 1,02 97 45% 44% 9% 2% 89% 1D 0,496 0,187 1,07 98 45% 44% 8% 3% 89% 1D 0,496 0,287 1,05 99 45% 44% 7% 4% 89% 1D 0,496 0,387 0,97 100 36% 53% 10% 1% 89% 1D 0,596 0,087 1,07 101 36% 53% 9% 2% 89% 1D 0,596 0,187 1,08 102 36% 53% 8% 3% 89% 1D 0,596 0,287 0,98 103 36% 53% 7% 4% 89% 1D 0,596 0,387 0,93 104 27% 62% 10% 1% 89% 1D 0,696 0,087 0,86 105 27% 62% 9% 2% 89% 1D 0,696 0,187 0,90 106 27% 62% 8% 3% 89% 1D 0,696 0,287 0,91

* %CBH = %CBH1 + %CBH2

** fC2 = CBH2/(CBH1+CBH2) ***fE2 = EG2/(EG1+EG2)

Estes esquemas são mostrados representando misturas de celu- Iase tendo teores de CBH fracionais (%CBH) dentro das seguintes faixas: 55-65% (figura 3A), 65-75% (figura 3B), 75-85% (figura 3C), e 85-95% (figu- ra 3D).

As áreas sombreadas nas figuras 3A, 3B e 3C representam as atividades de hidrólise relativas para misturas com atividade significativa- mente mais elevada do que a mistura Benchmark. A atividade é 1,10-1,12 na zona 1, que é a atividade de 10% a 12% mais elevada do que a Benchmark Blend. A atividade é 1,13-1,15 na zona 2. Esta é a atividade de 13% a 15% mais elevada do que a Benchmark Blend. A atividade mais elevada de 1,16- 1,18 é na zona 3, que é 16% a 18% mais elevada do que a Benchmark Blend. A figura 3A, que abrange de 55% a 65% de CBHs, não possui qual- quer mistura com atividade acima de 1,12 e, portanto, apenas inclui valores dentro da zona 1. A figura 3D, que abrange de 85% a 95% de CBHs, não possui qualquer mistura com atividade acima de 1,10.

Existem vários aspectos de interesse para os resultados mostra- dos nas figuras 3A, 3B, 3C e 3D. Primeiro, existem misturas de celulases primárias identificadas com atividade significativamente mais elevada do que a Benchmark Blend, que propriamente dito representa as proporções de ce- Iulases primárias observadas nas em enzimas celulases típicas comercial- mente disponíveis. Isto mostra que é possível produzir misturas de celulase que são >15% mais potentes do que as misturas correntemente dispiníveis. Estas misturas diferem significativamente na composição a partir da Bench- mark Blend.

Um segundo ponto é a forma irregular das zonas traçadas. Estas formas irregulares não foram previstas e indicam regiões de atividade exage- rada dentro do espaço total de mistura. Os dados experimentais definem um espaço que é mais complicado do que pode ser considerado pelo trabalho anterior usando substratos modelos ou misturas de enzima de menos do que quatro celulases primárias.

Um terceiro ponto é que as melhores misturas são composições significativamente diferentes das misturas da técnica anterior (vide Exemplo 5). Sem ser limitado pela teoria, percebeu-se ser necessário utilizar uma carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada para a medição da ativida- de de celulase. Muitos estudos da técnica anterior usaram substratos mode- los de celulose pura.

Representações tridimensionais do espaço de mistura de com-

ponente compreendidas destas zonas são mostradas na figura 4. Exemplo 5: Mapeamento das composições de celulases de Trichoderma

As composições relativas de dez celulases de Trichoderma para a hidrólise de celulose da literatura científica e de patente foram determina- das mediante a divisão da concentração de proteína relatada de CBH1, C- BH2, EG1 e EG2 pela qual a soma destes quatro componentes em cada respectiva celulase. Estas celulases foram depois divididas em grupos base- ados em seu percentual de CBH como foi feito para as misturas de celulase primária no Exemplo 4. Estas celulases foram depois traçadas em gráfico como uma função de suas fC2 e fE2 e subseqüentemente comparadas com as zonas associadas com uma melhora na atividade de hidrólise de celulose em relação à mistura de componente do ponto de referência. As celulases de Trichoderma na literatura com CBH < 55% ou CBH > 95% não foram in- cluídas nesta análise.

Todas as composições publicadas de celulases primárias se si- tuam bem fora das zonas que produzem a atividade de celulase mais eleva- da.

Tabela 2: Mapeamento das composições conhecidas na figura 3

Mistura CBH1 (%) CBH2 (%) EG1 (%) EG2 (%) CBH (%) Figura fc2 ÍE2 Bakere outros (1998) 60 20 20 0 80 3C 0,25 0 Cytolase (na Patente U.S. n° 5.525.507) 50 14 12 9 75 3C 0,22 0,43 Henrissat e outros (1985) 0 95 5 0 95 3D 1 0 Henrissat e outros (1985) 0 95 0 5 95 3D 1 1 Jeoh e outros (2006) 0 70 0 30 1 3B 1 1 Celloviridin (em Mar- kov e outros, 2005) 50 30 10 10 80 3C 0,38 0,5 Nidetsky e outros (1994) 88,6 0 11,4 0 88,6 3D 0 0 Valjamae e outros (2003) 90,9 0 0 9,1 90,9 3D 0 1 Woodward e outros (1988) 50 25 0 25 75 3B 0,33 1 Woodward e outros (1988) 88 0 0 12 88 3D 0 1

Uma celulase de Trichoderma que necessita de EG2 também foi

traçada em gráfico na figura 3D. Esta composição continha 61,3% de CBH1, 31,2% de CBH2, 7,5% de EG1, e os valores da fC2efE2 foram 0,337 e 0, res-

pectivamente. Esta composição também se situa fora das zonas que produ- zem a atividade de celulase mais elevada (vide figuras 3B e 3C). Exemplo 6: Medição da atividade de hidrólise das misturas de celulase pri- mária sobre a carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada durante um período prolongado.

Uma mistura de celulases primárias com nossas relações de

CBH1, CBH2, EG1 e EG2 Benchmark do Exemplo 3 foi comparada com uma mistura melhorada com uma melhora de atividade de 15% no Exemplo 4 em uma hidrólise prolongada. A mistura melhorada foi composta de 32% Cel7A, 47% Cel6A, 17% Cel7B e 4% Cel5A. Ambas as misturas foram do- sadas em 18 mg de enzima por g de celulose e ainda suplementadas com uma preparação de β-glucosidase de Aspergillus nigerem 100 lU/g de celu- lose.

As misturas foram incubadas com 25 g/L de celulose em 50 mM de citrato, pH 5,0, contendo 0,5% de benzoato de sódio e 0,01% de Triton X- 100 em 50°C durante 56 horas com agitação contínua em 200 rpm. Alíquo- tas de 0,5 ml foram tomadas nos pontos de tempo indicados na figura 5 e a concentração de glicose na parte solúvel foi avaliada e convertida em uma conversão fracionária. Os dados de conversão foram depois adaptados com uma hipérbole retangular com um termo linear adicional usando a minimiza- ção da soma de resíduos quadrados adaptados. A equação foi da seguinte forma: conversão = (max*tempo)/(meia max + tempo) + c*tempo. Ambos os conjuntos de dados foram adaptados globalmente com valores max e meio max únicos e um valor repartido da variável c. Erros padrão dos valores de conversão max foram calculados usando um método de comparação modelo (Motulsky and Christopolous, 2003). Um t-teste foi usado para comparar os valores de conversão max com relação às misturas do ponto de referência e otimizadas (supra).

O valor de conversão max para a mistura otimizada foi 0,69, um aumento a mais da conversão max de 0,59 da mistura do ponto de referên- cia. Isto representa um aumento significativo (P < 0,05) de 16 %. A conver- são destas misturas será mais elevada na presença de componentes adicio- nais da celulase à parte dos quatro aqui considerados.

Todas as citações são por meio desta incorporadas por referên- cia.

A presente invenção foi descrita com referência a uma ou mais modalidades. No entanto, ficará evidente para as pessoas versadas na téc- nica que diversas variações e modificações podem ser feitas sem divergir do escopo da invenção como definida nas reivindicações.

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Todas as citações são aqui incorporadas por referência.

Claims (23)

1. Processo para a hidrólise enzimática de uma carga de alimen- tação lignocelulósica pré-tratada em açúcares solúveis, o processo compre- endendo a adição de uma mistura de enzima celulase à carga de alimenta- ção lignocelulósica pré-tratada, dita mistura de enzima celulase compreen- dendo uma mistura de celulase primária de celobio-idrolases CBH1 e CBH2 e endoglucanases EG1 e EG2, ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estan- do presentes em mais do que ou igual a 55% e menos do que 85% da mistu- ra de celulase primária, dita CBH2 estando presente em uma fração em re- lação às celobio-idrolases CBH1 e CBH2 como definido por fc2 e dita EG2 estando presente em uma fração em relação às endoglucanases EG1 e EG2 como definido por fE2, em que quando ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estiverem presentes em mais do que ou igual a 55% e menos do que 65% das celulases primárias, ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,35 e menores que 0,45 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e me- nores que 0,35; ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,45 e menores que 0,55 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que -0,25; ou ditos valores de fe são maiores ou iguais a 0,45 e menores que -0,55 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,35 e menores que 0,45, quando ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estiverem presentes em mais do que ou igual a 65% e menos do que 75% das celulases primárias, ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,25 e menores que 0,35 e ditos valo- res de fE2 são maiores ou iguais a 0,05 e menores que 0,35; ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,35 e menores que 0,45 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,05 e menores que 0,55; ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,45 e menores que 0,65 e ditos valores de fE2 são maio- res ou iguais a 0,05 e menores que 0,65; ou ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,65 e menores que 0,75 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,55, quando ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estiverem presentes em mais do que ou igual a 75% e menos do que -85% das celulases primárias, ditos valores de fC2 são maiores ou iguais a -0,35 e menores que 0,45 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,05 e menores que 0,25; ditos valores de fC2 são maiores ou iguais a 0,45 e me- nores que 0,55 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,65; ou ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,55 e menores que 0,65 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,35.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que ditas celo- bio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em 65% a 85% das celulases primárias e em que quando ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estiverem presentes em 65% a 75% das celulases primárias, ditos valores de fe são maiores ou iguais a 0,25 e menores que 0,35 e ditos valores de fE2 são maio- res ou iguais a 0,05 e menores que 0,35; ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,35 e menores que 0,45 e ditos valores de fE2 são maiores ou i- guais a 0,05 e menores que 0,55; ou ditos valores de fc2 são maiores ou i- guais a 0,45 e menores que 0,65 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,55; e quando ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estiverem presentes em 75% a 85% das celulases primárias, ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,35 e menores que 0,45 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,25; ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,45 e menores que 0,55 e ditos valores de fE2 são maio- res ou iguais a 0,15 e menores que 0,55; ou ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,55 e menores que 0,65 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,25.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que ditas celo- bio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em 75% a 85% das celulases primárias e ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,35 e menores que 0,45 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,25; ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,45 e menores que 0,55 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,55; ou ditos valores de fC2 são maiores ou iguais a 0,55 e menores que 0,65 e ditos valo- res de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,25.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que ditos valo- res de fC2 são maiores ou iguais a 0,45 e menores que 0,55 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,25.

5. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que ditas celo- bio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em 65% a 75% das celulases primárias ditos valores de fC2 são maiores ou iguais a 0,25 e menores que - 0,35 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,05 e menores que 0,35; ditos valores de fC2 são maiores ou iguais a 0,35 e menores que 0,45 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,05 e menores que 0,55; ou ditos valores de fC2 são maiores ou iguais a 0,45 e menores que 0,65 e ditos valo- res de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,55.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que ditos valo- res de fc2 são maiores ou iguais a 0,45 e menores que 0,55 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,55; ou ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,55 e menores que 0,65 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,35 e menores que 0,45.

7. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que as celula- ses primárias são de uma fonte fungosa.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que as celula- ses primárias são de um Ascomycete ou Basidiomycete.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que as celula- ses primárias são de Trichoderma ssp, Aspergillus ssp, Hypoerea ssp ou Humieola ssp.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que as celu- lases primárias são de Triehoderma reesei.

11. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que as celu- Iases primárias são obtidas de um organismo mediante a expressão das se- qüências de codificação que são endógenas a dito organismo.

12. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que as celu- lases primárias são obtidas de um organismo mediante a expressão das se- qüência de codificação que são heterólogas a dito organismo.

13. Processo de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que as celulases primárias são obtidas de Triehoderma reesei.

14. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a hidróli- se enzimática converte pelo menos cerca de 80% da celulose na carga de alimentação lignocelulósica pré-tratada em açúcares solúveis.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, ainda compre- endendo a etapa de fermentação dos açúcares solúveis para produzir eta- nol, ácido láctico, butanol ou uma combinação dos mesmos.

16. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a hidróli- se enzimática é realizada com enzimas celulases compreendendo β- glicosidase e uma secretoma de Trichoderma reesei.

17. Mistura de enzima celulase compreendendo uma mistura de celulase primária de celobio-idrolases CBH1 e CBH2 e endoglucanases EG1 e EG2, ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estando presentes em mais do que ou igual a 55% e menos do que 85% da mistura de celulase primária, dita CBH2 estando presente em uma fração em relação às celobio-idrolases CBH1 e CBH2 como definido por fC2 e dita EG2 estando presente em uma fração em relação às endoglucanases EG1 e EG2 como definido por fE2, em que quando ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estiverem presentes em mais do que ou igual a 55% e menos do que 65% das celulases primárias, ditos valores de fC2 são maiores ou iguais a 0,35 e menores que 0,45 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,35; ditos valo- res de fC2 são maiores ou iguais a 0,45 e menores que 0,55 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,25; ou ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,45 e menores que 0,55 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,35 e menores que 0,45, quando ditas celobio- idrolases CBH1 e CBH2 estiverem presentes em mais do que ou igual a -65% e menos do que 75% das celulases primárias, ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,25 e menores que 0,35 e ditos valores de fE2 são maio- res ou iguais a 0,05 e menores que 0,35; ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,35 e menores que 0,45 e ditos valores de fE2 são maiores ou i- guais a 0,05 e menores que 0,55; ditos valores de fC2 são maiores ou iguais a 0,45 e menores que 0,65 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a -0,05 e menores que 0,65; ou ditos valores de fC2 são maiores ou iguais a -0,65 e menores que 0,75 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,55, quando ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estive- rem presentes em mais do que ou igual a 75% e menos do que 85% das celulases primárias, ditos valores de fC2 são maiores ou iguais a 0,35 e me- nores que 0,45 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,05 e menores que 0,25; ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,45 e menores que 0,55 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,65; ou ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,55 e menores que 0,65 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,35.

18. Mistura de enzima celulase de acordo com a reivindicação 17, em que ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em 65% a 85% das celulases primárias e em que quando ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estiverem presentes em 65% a 75% das celulases primárias, ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,25 e menores que 0,35 e ditos valo- res de Íe2 são maiores ou iguais a 0,05 e menores que 0,35; ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,35 e menores que 0,45 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,05 e menores que 0,55; ou ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,45 e menores que 0,65 e ditos valores de fE2 são maio- res ou iguais a 0,15 e menores que 0,55; e quando ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estiverem presentes em 75% a 85% das celulases primárias, ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,35 e menores que 0,45 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,25; ditos valo- res de fc2 são maiores ou iguais a 0,45 e menores que 0,55 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,55; ou ditos valores de fC2 são maiores ou iguais a 0,55 e menores que 0,65 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,25.

19. Mistura de enzima celulase de acordo com a reivindicação 18, em que ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em 75% a 85% das celulases primárias e ditos valores de fC2 são maiores ou iguais a 0,35 e menores que 0,45 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,25; ditos valores de fC2 são maiores ou iguais a 0,45 e me- nores que 0,55 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,55; ou ditos valores de fC2 são maiores ou iguais a 0,55 e menores que 0,65 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,25.

20. Mistura de enzima celulase de acordo com a reivindicação 19, em que ditos valores de fC2 são maiores ou iguais a --0,45 e menores que -0,55 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,25.

21. Mistura de enzima celulase de acordo com a reivindicação -18, em que ditas celobio-idrolases CBH1 e CBH2 estão presentes em 65% a -75% das celulases primárias ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a -0,25 e menores que 0,35 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,05 e menores que 0,35; ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,35 e me- nores que 0,45 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,05 e menores que 0,55; ou ditos valores de fo são maiores ou iguais a 0,45 e menores que 0,65 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que -0,55.

22. Mistura de enzima celulase de acordo com a reivindicação -21, em que ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,45 e menores que -0,55 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,15 e menores que 0,55; ou ditos valores de fc2 são maiores ou iguais a 0,55 e menores que 0,65 e ditos valores de fE2 são maiores ou iguais a 0,35 e menores que 0,45.

23. Mistura de enzima celulase de acordo com a reivindicação -17, em que a mistura de enzima celulase é produzida mediante a expressão das celulases primárias a partir de um micro-organismo em valores de pH entre cerca de 2 e cerca de 5.