CN105874066A - 活性提高的内切葡聚糖酶变体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及参与木质纤维素生物质分解的酶的表达和优化。更具体地，本发明涉及里氏木霉内切葡聚酶II的变体，和性能提高的所述变体在分解纤维素和生产生物燃料的方法中的用途。

Description

活性提高的内切葡聚糖酶变体及其用途
技术领域
由于大量原料的可利用性以及乙醇作为燃料的价值，由纤维素生产乙醇的可能性已经得到密切关注。用于此类工艺的基于纤维素的天然原料称为“生物质”。已经考虑将许多类型的生物质，例如木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物，作为生产生物燃料的潜在原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。
背景技术
纤维素是由β-1，4键连接的葡萄糖分子组成的聚合物，其对降解或解聚合非常有抗性。一旦纤维素被转化为葡萄糖，后者容易用酵母发酵成生物燃料，如乙醇。
研究的用于将纤维素转化为葡萄糖的最古老的方法基于酸水解。该方法可以在浓酸或稀酸存在下进行。然而，一些缺点(例如当使用浓酸时酸回收很差，以及使用稀酸情况下葡萄糖产量低)对酸水解工艺的经济性是不利的。
为了克服酸式水解工艺的缺点，最近的纤维素转化工艺已经更多地与酶促水解(使用纤维素酶类型的酶)相关。然而，这种酶促水解木质纤维素生物质(例如纤维素)的缺点是其工业工艺较为昂贵。因此，有必要使用日益有效的分泌纤维素酶的微生物菌株。在这方面，很多微生物包含水解纤维素的酶，例如真菌木霉(Trichoderma)、曲霉(Aspergillus)、腐质霉(Humicola)或镰刀菌(Fusarium)以及细菌高温单孢菌属(Thermomonospora)、芽孢杆菌(Bacillus)、纤维单胞菌(Cellulomonas)和链霉菌(Streptomyces)。这些微生物分泌的酶具有用于将纤维素转化为葡萄糖的三种类型的活性，且分为三组：随机攻击纤维素纤维内部的内切葡聚酶，攻击纤维末端并释放纤维二糖的外切葡聚酶，和将这种纤维二糖水解为葡萄糖的β-葡萄糖苷酶。其他类型的酶，例如半纤维素酶或最近发现的多糖单加氧酶类也可以在水解效率中起作用。
降低酶促水解的成本具有强大的产业利益，这种降低涉及使用减少量的酶以及更有效的酶的混合物(cocktail)。因此，一些专利申请描述能力高于里氏木霉(Trichodermareesei)的天然酶或通过基因工程改进的变体。可以提及与外切葡聚酶有关的专利申请US2010304464、WO 2010/066411和WO 2013/029176，与内切葡聚酶有关的申请WO 2007/109441、WO 2012/149192和WO 2010/076388，与β-葡萄糖苷酶有关的申请WO 2010/029259、WO 2010/135836或WO 2010/022518，或与多糖单加氧酶有关的其他申请WO12135659和WO12149344。
主要基于结构标准，水解木质纤维素生物质的酶在CAZy系统(Cantarel，B.L.，Coutinho，P.M.，Rancurel，C.，Bernard，T.，Lombard，V.，&Henrissat，B.(2009).TheCarbohydrate-Active EnZymes database(CAZy)：an expert resource forGlycogenomics.Nucleic acids research，37，D233-8)中分类。内切葡聚酶属于GH 5、6、7、8、9、12、16、18、19、26、44，、45、48、51、74和124家族。
为了使木质纤维素生物质的水解有效且经济适用，酶混合物必须包含比例平衡的各种酶活性(尤其是，但不排除其他，外切葡聚酶、内切葡聚酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶)。例如，一般注意到在里氏木霉的天然混合物中存在60-70％的外切葡聚酶、15-20％的内切葡聚酶、少量百分比的半纤维素酶和约5-10％的β-葡萄糖苷酶。该混合物适于水解大多数预处理的底物(例如在酸性条件下汽爆的小麦秸秆)且产量可接受。简言之，内切葡聚酶活性的增加必须不会损害其他酶的活性。这些酶的功能特异性目前仍知之甚少。里氏木霉基因组包含至少3种主要的酶，其来自家族7(EG1，cel7b)、5(EG2，cel5a)和12(EG3，cel12a)。EG1和EG2酶是主要的内切葡聚酶，按重量计可以占里氏木霉产生的全部酶混合物的10-20％。
内切葡聚酶(EC3.2.1.4)是作用于纤维素的第一个酶，已知其在水解中具有重要作用：增加外切葡聚酶可以攻击的位点数，同时降低被攻击的微纤维的聚合度。最近的研究(Szijártó，N.，Siika-aho，M.，Sontag-Strohm，T.，&Viikari，L.(2011).Liquefaction ofhydrothermally pretreated wheat straw at high-solids content by purifiedTrichoderma enzymes.Bioresource technology，102(2)，1968-74)强调它们在水解第一个小时期间降低生物质粘性的作用。这种粘性的降低对工艺的操作成本具有非常显著的影响。
粘性问题在需要低温资源的工艺的情况下加剧，例如同时糖化和发酵(SSF)，其涉及水解生物质的酶和将糖单体转化为乙醇的微生物两者。
水解和发酵可以根据各种方案进行。最常见的由独立的水解和发酵(SHF)组成。这种方法可以通过维持最佳反应条件来优化各步骤。发酵在约28℃至约30℃的温度即时进行，而水解一般在至少45℃的温度进行。然而，在SHF中，在反应结束时释放的糖的浓度非常高，导致对酶的抑制，降低该方法的效率。为了避免这些缺点，可以预期另一种方法。在SSF中，两个步骤(己糖的水解和发酵)同时进行，防止糖积累至抑制酶的浓度。投资成本也因为使用单个反应器而降低。由于没有抑制，之后的水解程度更高，因为释放的糖被立即用于发酵成乙醇。在该方法中，反应器温度必定构成水解和发酵的最佳温度之间的平衡，通常在约30℃至约35℃之间。然而，纤维素酶的活性在该温度降低约30％。
SSF还允许在发酵糖的生物中分解纤维素的酶的表达，从而可以将资源限制，或在极端情况下消除至单独步骤中产生的酶。
因此，获得在水解和发酵的最佳温度(例如，在30℃-50℃之间)下保持有效的内切葡聚酶活性同时保持混合物中所有酶的比例的酶对于将木质纤维素生物质转化为生物燃料的工艺而言将具有显著收益。
发明内容
发明人已经开发了尤其与序列SEQ ID NO：2的野生型EG2蛋白的内切葡聚酶活性相比，内切葡聚酶活性提高的多肽。EG2对应于里氏木霉内切葡聚酶2。
从这个角度，申请人很大的功劳在于经过大量研究之后，发现了与野生型EG2蛋白(SEQ ID NO：2)的内切葡聚酶活性相比，内切葡聚酶活性提高的分离或纯化多肽。
根据本发明，所述多肽选自：
i)选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：34的氨基酸序列；
ii)与序列SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性百分比的氨基酸序列。
根据本发明，给定序列相对于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQID NO：34的同一性百分比对应于给定序列和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34之间相同的残基数除以SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQID NO：34的残基数。当使用Genome Quest数据库时，所述相对于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34的同一性百分比对应于Query同一性百分比(％idQuery)，其中Query对应于序列SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQ IDNO：34。
在另一个实施方案中，上述多肽的特征在于，其在发酵生物中的表达至少等于野生型EG2蛋白(SEQ ID NO：2)的表达。
例如，本领域技术人员将能够使用底物羧甲基纤维素(CMC)或使用显色底物(对硝基苯基苷)来确定酶活性的增加或换言之提高。酶活性将通过还原糖或释放的硝基苯酚的比色分析分别揭示。
优选地，相对于氨基酸序列SEQ ID NO：2的EG2蛋白的内切葡聚酶活性，本发明的多肽的酶活性提高至少10％，优选至少20％，优选至少30％。
本领域技术人员可以用来确定根据本发明的多肽的酶活性相对于野生型EG2蛋白(SEQ ID NO：2)是否提高的方案的实例如下：
-于37℃过夜形成表达根据本发明的多肽的大肠杆菌(E.coli)的原种培养物；
-于37℃用1％原种培养物接种LB培养基直至获得最佳密度0.4；
-于20℃培养所述细胞18h；
-在7900rpm离心5分钟；
-用含有1mg/ml溶菌酶的pH5的100mM柠檬酸盐缓冲液重悬细胞沉淀(最终OD600为100)；
-在冰上孵育重悬细胞30分钟；
-通过3个循环的冷冻/融化裂解细胞；
-通过超声法使DNA片段化；
-在13000rpm离心30分钟；
-于35℃和50℃孵育100μl分解上清液1h，所述分解上清液用100μl含有1％CMC的pH5的100mM柠檬酸盐缓冲液稀释50倍；
-移除100μl反应；
-加入100μl DNS试剂(Miller，1959)；
-于100℃孵育5分钟；
-在冰上孵育3分钟；
-在3000rpm离心10分钟；
-在540nm读取150μl上清液的光密度。
本发明的主题还是编码至少一个上述多肽的纯化或分离的核酸。下表1包含以下基因的核酸和肽序列的鉴定：EG2基因、推测的灰葡萄孢霉(Botryotinia fuckeliana)内切葡聚酶2基因(BF基因)和推测的核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)内切葡聚酶2基因(SS基因)，以及本发明的核酸和多肽序列。
优选地，所述纯化或分离的核酸可以选自以下序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：33。
表1
本发明还涉及包含上述核酸的载体。
根据本发明，术语“载体”意欲是指在其中有可能插入外源核酸片段的任何DNA序列，载体能够将外源DNA引入宿主细胞。作为载体，非穷举地可以提及：质粒、黏性质粒、酵母人造染色体(YAC)、细菌人造染色体(BAC)、P1噬菌体衍生的人造染色体(PAC)或病毒衍生的载体。
根据本发明，上述核酸可以与启动子、终止子或其在宿主细胞中表达所需的任何其他序列功能性连接。
根据本发明的载体还可以携带选择标记。术语“选择标记”意欲是指其表达使包含它的细胞具有能够选择它们的特征。例如，它是耐抗生素的基因。
本发明的主题还是包含至少一种上述多肽、或至少一种上述核酸或至少一种上述载体的分离的宿主细胞。
本领域技术人员将能够通过熟知的常规方法将上述的多肽之一、核酸之一或载体之一引入宿主细胞。例如，可以提及用氯化钙处理、电穿孔或使用基因枪。
根据一个实施方案，本领域技术人员将能够通过常规方法将编码内切葡聚酶活性提高的根据本发明的多肽的几个拷贝的核酸引入宿主细胞。
根据一个实施方案，上述分离的宿主细胞选自木霉、曲霉、链孢霉(Neurospora)、腐质霉、毁丝霉(Mycelioｐｈthora)、金孢霉(Chrysosporium)、青霉(Penicillium)、镰刀菌、高温单孢菌、芽孢杆菌、假单胞菌(Pseudomonas)、埃希氏菌(Escherichia)、梭菌(Clostridium)、纤维单胞菌、链霉菌、耶氏酵母(Yarrowia)、毕赤醇母(Pichia)和酵母(Saccharomyces)。
根据一个实施方案，上述分离的宿主细胞选自里氏木霉、绿色木霉(Trichodermaviridae)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、文氏曲霉(Aspergillus wenｔｉｉ)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、海枣曲霉(Aspergillus ｐｈoenicis)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermopila)、Chrysosporium lucknowense、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、灰腐质霉(Humicola grisae)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、糖解梭菌(Clostridium saccharolyticum)、拜氏梭菌(Clostridiumbenjerinckii)、丁酸梭菌(Clostridium butylicum)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolityca)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
根据一个优选的实施方案，上述分离的宿主细胞选自里氏木霉和酿酒酵母。
本发明的主题还是上述任何一种多肽用于水解纤维素的用途。
本发明的主题还是上述任何一种多肽用于生产生物燃料的用途。
根据本发明，术语“生物燃料”可以定义为来自生物质的转化且可用于能源目的的任何产物。并且，不希望被限制且通过举例的方式可以提到的，可以纳入燃料的产物-生物气(任选地在随后的转化之后)或其本身可以作为燃料，例如醇(根据使用的发酵生物的类型，乙醇、丁醇和/或异丙醇)、溶剂(丙酮)、酸(丁酸)、脂质及其衍生物(短链或长链脂肪酸、脂肪酸酯)和氢气。
优选的，根据本发明的生物燃料是醇，例如乙醇、丁醇和/或异丙醇。更优选的，根据本发明的生物燃料是乙醇。
在另外一个实施方案中，生物燃料是生物气。
在另外一个实施方案中，产物是在化学工业中感兴趣的分子，例如另一种醇(如1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、2，3-丁二醇)、有机酸(如乙酸、丙酸、丙烯酸、丁酸、琥珀酸、苹果酸、延富马酸、柠檬酸、或衣康酸)，或羟基酸(如乙醇酸、羟基丙酸或乳酸)。
以下描述用于水解木质纤维素的酶混合物的生产的实施方案。将能够表达根据本发明多肽的丝状真菌菌株，优选木霉，更优选里氏木霉，在选择用于微生物生长的碳基底物(如乳糖或葡萄糖)的存在下在发酵罐中培养。在一个实施方案中，将该碳基底物根据其性质在灭菌前引入发酵罐或单独灭菌后再引入灭菌后的发酵罐以获得20-35g/l的初始浓度。
然后加入选择用于生产酶的含有底物的水性溶液。最后通过过滤培养基回收真菌产生的作用于木质纤维素生物质的酶组合物。在该组合物中，尤其有β-葡萄糖苷酶、外切葡聚糖酶和根据本发明的内切葡聚糖酶。在一个实施方案中，该选择用于生产酶的含有底物的水性溶液以200-250g/l的浓度制备，其还包含诱导底物例如乳糖。在初始的碳基底物耗尽后加入该水性溶液以提供35-45mg/g的最佳细胞量(“补料分批”)。在该“补料分批”阶段，培养基中糖的残留浓度少于1g/l，且作用于木质纤维素生物质的酶由真菌分泌。后者可以通过过滤培养基回收。
本发明的主题是能够作用于木质纤维素生物质的酶组合物，所述酶组合物优选由丝状真菌产生，且包含至少一种相对于野生型EG2蛋白的内切葡聚酶活性，其内切葡聚酶活性提高的多肽。术语“丝状真菌”意欲尤其是指木霉，更优选里氏木霉。
最后，本发明的主题是从生物质生产生物燃料的方法，包含以下连续步骤：
-将待水解的生物质悬浮于水相；
-如上所述在酶组合物存在下水解木质纤维素生物质以产生含有葡萄糖的水解物；
-发酵水解物中的葡萄糖以产生发酵液；
-从发酵液中分离生物燃料。
在一个实施方案中，将待水解的生物质以6％-40％的固体，优选20％-30％的比例悬浮于水相。调节pH至4-5.5，优选4.8-5.2，并且调节温度至40-60℃，优选45-50℃。通过加入作用于木质纤维素生物质的酶组合物启动水解反应，通常用量是每克预处理的底物10-30mg分泌的蛋白或更少。反应一般持续15-48小时。通过分析释放的糖，尤其是葡萄糖监测反应。通过过滤或离心从非水解固体级分中分离主要由木质素组成的糖溶液，随后在发酵单元中处理。
在一个实施方案中，可通过蒸馏从发酵液中分离生物燃料。
本发明的另一个主题是从生物质生产生物燃料的方法，其特征在于它包含以下连续步骤：
-将待水解的生物质悬浮于水相；
-优选在30℃-35℃的温度同时添加上述酶组合物和发酵生物以产生发酵液；
-从发酵液中分离生物燃料。
优选地，同时添加酶组合物和发酵生物，然后在30℃-35℃的温度孵育以产生发酵液。
根据这个实施方案，根据本领域技术人员已知的SSF(同时糖化和发酵)方法，将生物质中存在的纤维素转化为葡萄糖，同时在同一反应器中，发酵微生物(例如酵母)将葡萄糖转化为最终产物。取决于发酵生物的代谢和水解能力，正确进行该操作可能需要添加或多或少量的外源分解纤维素的混合物。
在另一个实施方案中，发酵生物通过分泌或在其细胞表面产生作为本发明主题的多肽，任选地与作用于木质纤维素生物质的其他酶一起，从而限制或消除对由丝状真菌产生的酶的需求。优选地，发酵生物是上述宿主细胞。
因此，优选地，本发明的主题是从生物质生产生物燃料的方法，包含以下连续步骤：
-将待水解的生物质悬浮于水相；
-添加一种或多种上述宿主细胞以及上述发酵生物和/或酶组合物以产生发酵液；
-从发酵液中分离生物燃料。
优选地，添加宿主细胞以及酶组合物和/或发酵生物，然后在30℃-35℃的温度孵育以产生发酵液。
因此，使用根据本发明的内切葡聚酶活性提高的多肽具有获得更好葡萄糖生产产量的优势。因此，本发明能够使用比之前更少的酶，这具有来自经济观点的优势。
本发明的其他方面、主题、优势和特征将通过阅读以实施例和图的方式给出的以下描述本发明优选实施方案的非限制性描述展示。
附图说明
图1是表示分别由菌株Scα-EG2、Scα-222E1和Scα-225C7分泌到培养基的EG2参考内切葡聚酶(SEQ ID NO：2)以及突变体222E1和225C7(分别为SEQ ID NO：24和26)水解p-硝基苯基-β-纤维三糖苷(pNPC3)的图。
图2是表示分别由菌株Scα-EG2、Scα-222E1和Scα-225C7分泌到培养基的EG2参考内切葡聚酶(SEQ ID NO：2)以及突变体222E1和225C7(分别为SEQ ID NO：24和26)水解1％CMC的图。
图3是表示以下混合物的SHF结果的图：衍生自菌株146C4/7的混合物、由补充有β-葡萄糖苷酶的菌株CL847 ΔEG1(ΔEG1)产生的参考混合物、以及由补充有β-葡萄糖苷酶的菌株并用EG2参考基因再转化的CL847 ΔEG1(ΔEG1cEG2)产生的另一种参考混合物。
图4是表示以下混合物的SHF结果的图：衍生自菌株222E1(SEQ ID NO：24)的混合物、衍生自菌株225C7/7(SEQ ID NO：26)的混合物、由补充有β-葡萄糖苷酶的菌株CL847 ΔEG1(ΔEG1)产生的参考混合物、以及由补充有β-葡萄糖苷酶的菌株并用EG2参考基因再转化的CL847 ΔEG1(ΔEG1cEG2)产生的另一种参考混合物。
图5是表示以下混合物的SSF结果的图：衍生自菌株146C4/7(SEQ ID NO：16)的混合物、衍生自菌株191H11/9(SEQ ID NO：22)的混合物、由补充有β-葡萄糖苷酶的菌株CL847ΔEG1(ΔEG1)产生的参考混合物、以及由补充有β-葡萄糖苷酶的菌株并用EG2参考基因再转化的CL847 ΔEG1(ΔEG1cEG2)产生的另一种参考混合物。
图6是表示以下混合物的平均SSF结果的图：衍生自菌株222E1/1、222E1/2和222E1/7(SEQ ID NO：24)的3种混合物、衍生自菌株225C7/7(SEQ ID NO：26)的混合物、由补充有β-葡萄糖苷酶的菌株CL847 ΔEG1(ΔEG1)产生的参考混合物、以及由补充有β-葡萄糖苷酶的菌株并用EG2参考基因再转化的CL847 ΔEG1(ΔEG1cEG2)产生的另一种参考混合物。
具体实施方式
实施例1：通过L-洗牌的进化
将里氏木霉内切葡聚酶2(EG2)的基因序列用各自与EG2参考基因(SEQ ID NO：1)具有64％同一性的推测的灰葡萄孢霉内切葡聚酶2基因(BF基因)和推测的核盘菌内切葡聚酶2基因(SS基因)根据EP1104457B11中所述的专利方法进行一轮L-洗牌。
1-高通量筛选
开发高通量筛选试验以选择由L-洗牌产生的最佳克隆，例如，相对于里氏木霉的酶其内切葡聚酶活性显示至少20％提高的那些。
高通量筛选试验根据以下步骤进行：
-在琼脂上分离表达根据本发明的重组酶的变体的大肠杆菌克隆，并将所述克隆于37℃在LB培养基中预培养过夜；
-用所述预培养接种6％的LB培养基，然后于37℃孵育5小时，然后于20℃孵育17小时；
-在3000rpm下离心10分钟；
-添加80μl pH5含有1mg/ml溶菌酶的0.1M柠檬酸盐缓冲液溶液裂解细胞；
-在室温下孵育4小时；
-添加80μl pH5含有1％羧甲基纤维素的0.1M柠檬酸盐缓冲液；
-于35℃孵育3小时；
-在3000rpm下离心10分钟；
-移除100μl上清液；
-添加100μl DNS试剂；
-于100℃孵育10分钟，然后在冰上孵育5分钟；
-在540nm读取120μl的OD。
在这些筛选条件下，在克隆37D12、45A7、46H1、50F10、108G5、140F7、146C4、149E4、173C6、191H11、222E1、225C7、227C4、229D1、231C9和330F9中发现内切葡聚酶活性相对于EG2参考酶(SEQ ID NO：2)的提高(在540nm的OD增加)。
2-测定内切葡聚酶活性的提高
2-1/在羧甲基纤维素(CMC)底物上
为了评估克隆37D12、45A7、46H1、50F10、108G5、140F7、146C4、149E4、173C6、191H11、222E1、225C7、227C4、229D1、231C9和330F9与参考酶相比的Kcat，进行以下过程：
-于37℃过夜制备表达根据本发明的重组酶的大肠杆菌的原种培养液；
-于37℃用1％原种培养物接种LB培养基直至获得600nm的光学密度为0.4；
-于20℃培养所述细胞18h；
-在7900rpm离心5分钟；
-用pH5含有1mg/ml溶菌酶的0.1M柠檬酸盐缓冲液重悬细胞沉淀(最终OD600为100)；
-在冰上孵育重悬细胞30分钟；
-通过3个循环的冷冻/融化裂解细胞；
-通过在能量5超声3秒使DNA片段化；
-在13000rpm离心30分钟；
-于35℃和50℃用100μl含有1％CMC的pH5的0.1M柠檬酸盐缓冲液孵育100μl分解上清液1h；
-移除100μl反应；
-添加100μl DNS试剂；
-于100℃孵育5分钟；
-在冰上孵育3分钟；
-在3000rpm离心10分钟；
-在540nm读取150μl的光密度。
根据本发明，按照以下方式计算Kcat值：
-将540nm的OD表达为目标蛋白量(以nM表示)的函数；
-减去阴性对照的值；
-除以葡萄糖标准范围的系数(用DNS揭示各种葡萄糖含量)；
-除以反应时间。
表2表示在CMC上的活性试验的实验条件下，克隆37D12、45A7、46H1、50F10、108G5、140F7、146C4、149E4、173C6、191H11、222E1、225C7、227C4、229D1、231C9和330F9相对于EG2参考蛋白(SEQ ID NO：2)的Kcat值以及提高倍数。
表2：在CMC上的内切葡聚酶活性
结果表明这些克隆的酶活性相对于EG2参考蛋白(SEQ ID NO：2)显著提高。
2-2/在磷酸溶胀纤维素(PASC)底物上
然后在第二种底物：磷酸溶胀纤维素(PASC)上确认克隆37D12、45A7、46H1、50F10、108G5、140F7、146C4、149E4、173C6、191H11、222E1、225C7、227C4、229D1、231C9和330F9活性的提高。
表3表示在PASC上的活性试验的实验条件下，克隆37D12、45A7、46H1、50F10、108G5、140F7、146C4、149E4、173C6、191H11、222E1、225C7、227C4、229D1、231C9和330F9相对于EG2参考蛋白(SEQ ID NO：2)在50℃的Kcat值以及提高倍数。
表3：在PASC上的内切葡聚酶活性
结果表明这些克隆的酶活性相对于EG2参考蛋白(SEQ ID NO：2)显著提高。
2-3/在Sigmacell底物上
还在第三种底物：Sigmacell上评估克隆37D12、45A7、46H1、50F10、108G5、140F7、146C4、149E4、173C6、191H11、222E1、225C7、227C4、229D1、231C9和330F9的提高。试验方案与之前所述的用CMC底物的方案相同。于50℃用底物孵育24小时。
表4表示在Sigmacell上的活性试验的实验条件下，克隆37D12、45A7、46H1、50F10、108G5、140F7、146C4、149E4、173C6、191H11、222E1、225C7、227C4、229D1、231C9和330F9相对于EG2参考蛋白(SEQ ID NO：2)在50℃的Kcat值以及提高倍数。
表4：在Sigmacell上的内切葡聚酶活性
结果表明，在Sigmacell底物上可见克隆37D12、45A7、46H1、50F10、108G5、140F7、146C4、149E4、173C6、191H11、222E1、225C7、227C4、229D1、231C9和330F9的活性相对于EG2参考酶(SEQ ID NO：2)提高。
实施例2
通过BamH1/XhoI双消化，将变体146C4、191H11、222E1和225C7，以及里氏木霉的EG2参考基因(SEQ ID NO：2)克隆入含有耐腐草霉素基因作为标记的pUT1040质粒的cbh1启动子和终止子之间。用5μg的各载体转化里氏木霉菌株CL847ΔEG1。用5μg的各构建体通过钙和PEG冲击按照本领域技术人员已知的常规方法转化原生质体。在含有30μg/l腐草霉素的PDA/蔗糖选择培养基上选择转化体。在可能获得纯克隆的三次连续的继代培养后，各变体获得11-15个克隆。在含有5g/l葡萄糖和10g/l山梨糖作为碳底物和诱导剂的F45培养基(800μl 85％H3PO4、4.2g(NH4)2SO4、0.3g MgSO4.7H2O、0.75g玉米浆、1ml Oligo Ferment、6g邻苯二甲酸钾、pH 5.8-6)中培养所有克隆。于30℃培养7天后，移除上清液，将Lowry方法测量的10mg/l蛋白当量用于羧甲基纤维素上的活性试验。
对于活性测量，将150μl在pH4.8、50mM柠檬酸缓冲液中的2％CMC溶液与150μl含有10mg/l蛋白的柠檬酸缓冲液混合。于50℃和35℃孵育反应10分钟，然后在沸水浴中失活。离心5分钟后，移除20μl以用3，5-二硝基水杨酸(DNS)分析还原糖。通过在540nm读取吸光度来监测DNS的还原和3-氨基-5-硝基水杨酸的形成，用葡萄糖范围定量还原糖。
表5总结了各变体的最佳克隆获得的活性(以μmol葡萄糖当量/mg蛋白/min表示)。用天然EG2基因转化的菌株ΔEG1(ΔEG1cEG2)的值是最佳的4个克隆的平均值。
表5：在CMC上的内切葡聚酶活性
对于各变体，至少一个克隆在35℃或50℃具有高于菌株ΔEG1cEG2的CMCase活性，最佳克隆的活性是菌株ΔEG1cEG2的两倍。
实施例3：EG2参考内切葡聚酶以及222E1和225C7变体在酿酒酵母中的重组表达
1-在胞外培养基中EG2参考内切葡聚酶参考蛋白及其222E1变体的产生
将里氏木霉的EG2参考内切葡聚酶基因(SEQ ID NO：1)以及222E1和225C7变体的基因(分别是SEQ ID NO：23和25)在不存在其信号肽的情况下克隆入pESC-LeuαΔmyc载体(CNRS-CERMAV)。该构建体允许在酿酒酵母菌株EBY100的培养基中表达蛋白质，所述菌株是亮氨酸和色氨酸营养缺陷型(Boder ET和Wittrup KD，Biotechnol Prog，1998，14：55-62)。该质粒能够将基因表达置于半乳糖诱导的GAL1启动子的控制下，且具有允许转化体选择的营养缺陷型可选择标记基因(Leu2)。
根据本领域技术人员已知的常规方法(通过热休克和乙酸锂转化酵母)进行酿酒酵母EBY100的转化。在0.67％YNB-2％Glc-0.01％Trp培养基上选择转化体。
用每个基因的一个转化体(Scα-EG2、Scα-222E1和Scα-225C7)接种15ml 0.67％YNB-2％Glc-SD-0.01％Trp的基本培养基。SD是氨基酸的混合物(40mg/l硫酸腺嘌呤、20mg/l L-精氨酸、100mg/l天冬氨酸、100mg/l L-谷氨酸、20mg/l L-组氨酸、30mg/l L-赖氨酸、20mg/l L-甲硫氨酸、50mg/l L-苯丙氨酸、375mg/l L-丝氨酸、200mg/l L-苏氨酸、30mg/lL-酪氨酸、150mg/l L-缬氨酸和20mg/l尿嘧啶)。于30℃以220rpm振摇预培养24小时后，用三个菌株Scα-EG2、Scα-222E1和Scα-225C7接种(OD600＝0.5)150ml0.67％YNB-2％Gal-SD-0.01％Trp培养基。于25℃以220rpm振摇孵育该培养物。孵育8小时后，向各培养物中添加6ml pH5.6的柠檬酸钠以将pH稳定在5。
孵育4天后，移除20ml培养物。于4℃在3000g离心5分钟获得培养物上清液。
2-在对硝基苯基-β-纤维三糖苷上测定内切葡聚酶活性
通过在以下条件下，在450μl体积中水解pNPC3底物测量培养物上清液的内切葡聚酶活性：
-pH5的50mM柠檬酸缓冲液；
-2mM pNPC3；
-来自Scα-EG2、Scα-222E1和Scα-225C7菌株的56.3μl培养物上清液；
-于35℃孵育6小时。
向100μl水解反应中添加100μl 1M碳酸钠停止反应。通过测量415nm的吸光度并与对硝基苯酚的标准范围(0.36-360μM是线性)进行比较来测定由pNPC3水解释放的对硝基苯酚(pNP)的浓度。
图1的结果表明，Scα-222E1菌株的内切葡聚酶活性相对于表达EG2参考酶(SEQ IDNO：2)的Scα-EG2菌株提高了1.6倍。发现菌株Scα-225C7方面对于水解这种底物的效率较低。
3-在羧甲基纤维素上测定内切葡聚酶活性
通过在以下条件下，在700μl体积中水解羧甲基纤维素(CMC)测量培养物上清液的内切葡聚酶活性：
-pH5的50mM柠檬酸缓冲液；
-1％CMC；
-Scα-EG2、Scα-222E1和Scα-225C7菌株的210μl培养物上清液，所述上清液在10kDa膜上用pH5的50mM柠檬酸缓冲液透析并浓缩两倍；
-于35℃孵育24小时。
向100μl水解反应中添加150μl DNS试剂停止反应。于100℃加热5分钟并在并上冷却后，通过测量550nm的吸光度并与用葡萄糖制备的标准范围进行比较来测定释放的还原糖的量。
图2的结果表明，由菌株Scα-222E1和Scα-225C7变体的作用释放的还原糖的量高于菌株Scα-EG2。因此，在水解CMC1小时后，在35℃的该底物上，Scα-222E1和Scα-225C7相对于Scα-EG2的提高倍数分别是3.5和2.6。超出该孵育时间，两种变体继续水解CMC，但反应速率在EG2参考蛋白(SEQ ID NO：2)存在下几乎变为零。
实施例4：在补料瓶中通过里氏木霉生产酶
在250ml Erlenmeyer瓶中培养参考菌株和在CMC上具有最佳活性的那些(CL847、ΔEG1、ΔEG1cEG2、146C4/7、191H11/9、222E1/1、222E1/2、222E1/7、225C7/7)。接种55mlF45培养基(10g/l邻苯二甲酸二钾缓冲液、pH 6，4.2g/l(NH4)2SO4、300mg/l MgSO4.7H2O、150mg/l CaCl2.2H2O、1.5g/l玉米浆、0.07％正磷酸、5mg/l FeSO4、1.4mg/l MnSO4、1.4mg/lZnSO4、3.7mg/l CoCl2和12.5g/l葡萄糖)，于30℃以150rpm振摇。生产在两个阶段进行：在葡萄糖上的分批阶段和在乳糖上的补料-分批阶段。规律取样可以测定葡萄糖浓度低于3g/l的时刻。在这个阶段，开始使用注射泵(6路)的补料-分批进料。以40mg糖/g生物质/小时的流速用50g/l乳糖和0.3％NH3为培养进料。每天取样以测定pH、干重和上清液中的蛋白浓度。补料-分批培养5天后，用0.45μm过滤器过滤培养物并将上清液冷冻。
最终的蛋白浓度为约3-4g/l。如果浓度低于3g/l，在柱(Vivaspin MWCO5，Sartorius)上浓缩上清液。
实施例5：L-洗牌产生的酶根据SHF方法水解木质纤维素生物质的效率
所使用的参考底物是小麦秸秆，所述小麦秸秆用0.01％H2SO4酸浸渍10小时，洗涤，在pH5中和，压制并干燥后，进行汽爆预处理(19巴-3分钟)。其特征如表9所示。
组成 ％w/w
WIS 97.52
灰含量 5
纤维素 51.7
修正的木聚糖 3.57
半纤维素 4.14
Klason木质素(高估) 36.49
乙酰 0.6
表6：用于水解试验的秸秆组成
水解在10％固体w/w进行，即相当于5.4％纤维素w/w。
将蛋白含量固定在10mg/g固体，即约19mg/g纤维素。用BSA作为参考用Lowry方法测量酶混合物的浓度。通过添加SP188β-葡萄糖苷酶(Novozymes)向各混合物以120±2IU/g纤维素的量补充β-葡萄糖苷酶活性。
在具有2ml工作量(1g反应量)的含有以下的Eppendorf管中进行试验：
-0.11±0.001g洗涤的秸秆底物；
-0.9±0.02ml由pH4.8的50mM醋酸盐缓冲液和氯霉素(0.05g/l)组成的水解反应基质；
-取决于其蛋白含量，0.1-0.2±0.02g的酶混合物。
在Eppendorf Thermomixer Comfort中，于45±2℃以900转/分钟的涡流搅拌进行酶促水解。
所有试验重复进行，取样时间固定在t24、48和96小时，一些在t72小时取样。
在各取样时间，在灭菌的Eppendorf管里将水解物煮沸5分钟。然后冷却并离心这些管。用HPLC进行葡萄糖分析。平行地，将各Eppendorf管中的固体残留物洗涤，离心3次，并于105℃干燥24小时，从而评估WIS(水溶性固体)。将WIS考虑在内计算水解产量。
评估由实施例4产生的混合物。用同样添加有β-葡萄糖苷酶的参考混合物进行对照试验用于比较：由菌株CL847ΔEG1(ΔEG1)产生的混合物，和由用EG2参考基因再转化的菌株CL847 ΔEG1(ΔEG1cEG2)产生的混合物。
图3表示由菌株146C4/7(SEQ ID NO：16)产生的混合物的SHF结果。
图3所示的结果表明，146C4变体产生的混合物的初始水解速率高于ΔEG1和ΔEG1cEG2参考混合物。其最终水解产量也高于ΔEG1和ΔEG1cEG2参考混合物。
图4表示由菌株222E1/1(SEQ ID NO：24)产生的混合物和由菌株225C7/7(SEQ IDNO：26)产生的混合物的SHF结果。
图4的结果表明，222E1变体和225C7变体产生的混合物的初始水解速率高于ΔEG1和ΔEG1cEG2参考混合物。其最终水解产量也高于ΔEG1和ΔEG1cEG2参考混合物。
实施例6：酶根据SSF方法水解木质纤维素生物质的效率
使用的底物与表6所述的底物(实施例4)相同。
在实验室反应器中进行三次SSF。所述反应器由以下元件组成：
-具有30ml工作量的玻璃瓶；
-聚醚醚酮(PEEK)安全塞；
-通过塞相连的Vaplock公司出售的DV-118单向阀。当瓶中的相对压力高于70m巴时，该阀设置为在出口打开；
-中空的聚丙烯管，在一秒中固定，其通过所述塞，且用隔板将其配备于所述管的下端；
-置于瓶颈和塞之间的平面密封。
操作生物反应器的原理如下：在乙醇发酵期间产生的CO2积聚在位于反应基质上方的顶部空间，通过积累造成生物反应器内压力增加(PG)。当PG高于打开单向阀的压力(Ps)时，所述阀打开以允许一定量的气体排出，所述量例如通过称重测定。当PG＜Ps，阀再次关闭直至PG大于Ps。因此，运行中的生物反应器总是在压力下，从而确保发酵的稳定厌氧培养基。通过CO2的产生评估产生的乙醇量，所述CO2的产生基于以下用于将葡萄糖发酵成乙醇的化学计量方程通过重量损失来估计：
C6H12O6(葡萄糖)→2CO2+2CH3CH2OH(乙醇)+能量
用于SSF的培养基是包含以下的水性培养基：
-pH5的50mM醋酸盐缓冲液；
-0.1g/l的氯霉素；
-含有3g/l KH2PO4、2g/l(NH4)2SO4、0.4g/l MgSO4.7H2O和1g/l酵母提取物的营养培养基。
SSF在10±0.01％w/w固体进行，即相当于15±0.003g的总反应质量使用5.4％纤维素w/w。将蛋白含量固定在10±0.01mg纤维素酶/g固体，即约19mg/g纤维素。用BSA(牛血清白蛋白)作为参考用Lowry方法测量酶混合物的浓度。通过添加SP188β-葡萄糖苷酶(Novozymes)向各混合物以120±2IU/g纤维素的量补充β-葡萄糖苷酶活性。
向培养基中添加糖发酵酵母(酿酒酵母，Ethanol Red菌株，Fermentis，France)以获得2±0.1g/kg的含量。
将已经于35℃用缓冲液、氯霉素和培养基预处理过的小麦秸秆调节(condition)1小时后，向生物反应器中添加酶和酵母。
在约35℃的温度，通过将实验室生物反应器置于轨道旋转速度为150转/分钟的Infors HT Multitron标准孵育器中进行SSF反应。
通过称重生物反应器监测重量随时间的损失。在反应结束时，将发酵液于100℃加热5分钟，冷却并离心以分离未水解固体和发酵液体。然后用气相色谱分析后者以测定其乙醇浓度。
评估由实施例4产生的混合物。用同样添加有β-葡萄糖苷酶的参考混合物进行对照试验用于比较：由菌株CL847 ΔEG1(ΔEG1)产生的混合物，和由用EG2参考基因再转化的菌株CL847 ΔEG1(ΔEG1cEG2)产生的混合物。
图5表示由菌株146C4/7产生的混合物和由菌株191H11/9(SEQ ID NO：22)产生的混合物的SSF结果。
图5所示的结果表明，在100小时的过程中，表达146C4内切葡聚酶的混合物和表达191H11内切葡聚酶的混合物的SSF进展(相同剂量的酶的乙醇产量)高于ΔEG1和ΔEG1cEG2参考混合物。
图6表示由菌株222E1/1、222E1/2和222E1/7产生的3种混合物(用两个变体获得的平均结果)和由菌株225C7/7产生的混合物的SSF结果。
图6的结果表明，在100小时的过程中，表达222E1内切葡聚酶的混合物和表达225C7内切葡聚酶的混合物的SSF进展等于且高于ΔEG1和ΔEG1cEG2参考混合物。

Claims (14)

1.一种分离或纯化的多肽，其特征在于，与EG2参考蛋白的内切葡聚酶活性相比,它的内切葡聚酶活性提高，所述多肽选自：
i)选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
ii)与序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:34具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性百分比的氨基酸序列。
2.一种纯化或分离的核酸，其特征在于，它编码至少一种如权利要求1所述的多肽。
3.如权利要求2所述的纯化或分离的核酸，选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:31和SEQ ID NO:33。
4.一种载体，其特征在于它包含如权利要求2或3所述的核酸。
5.一种分离的宿主细胞，其特征在于它包含如权利要求2或3所述的核酸或如权利要求4所述的载体。
6.如权利要求5所述的分离的宿主细胞，其特征在于，它选自木霉、曲霉、链孢霉、腐质霉、毁丝霉、金孢霉、青霉、镰刀菌、高温单孢菌、芽孢杆菌、假单胞菌、埃希氏菌、梭菌、纤维单胞菌、链霉菌、耶氏酵母、毕赤醇母和酵母。
7.如权利要求5或6所述的分离的宿主细胞，其特征在于，它选自里氏木霉、绿色木霉、康氏木霉、黑曲霉、构巢曲霉、文氏曲霉、米曲霉、海枣曲霉、嗜热毁丝霉、Chrysosporiumlucknowense、粗糙脉孢菌、灰腐质霉、嗜松青霉、草酸青霉、大肠杆菌、丙酮丁醇梭菌、糖解梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、毕赤酵母、解脂耶氏酵母和酿酒酵母。
8.如权利要求1所述的多肽用于水解纤维素的用途。
9.如权利要求1所述的多肽用于生产生物燃料的用途。
10.一种能够作用于木质纤维素生物质的酶组合物，所述酶组合物包含至少一种如权利要求1所述的多肽。
11.一种用于从生物质生产生物燃料的方法，其特征在于包含以下连续步骤：
–将待水解的生物质悬浮于水相；
–在如权利要求10所述的酶组合物存在下水解木质纤维素生物质以产生含有葡萄糖的水解物；
–发酵水解物中的葡萄糖以产生发酵液；
–从发酵液中分离生物燃料。
12.一种用于从生物质生产生物燃料的方法，其特征在于包含以下连续步骤：
–将待水解的生物质悬浮于水相；
–同时加入如权利要求10所述的酶组合物和发酵生物以产生发酵液；
–从发酵液中分离生物燃料。
13.如权利要求12所述的方法，其中发酵生物选自如权利要求6或7所述的宿主细胞。
14.一种用于从生物质生产生物燃料的方法，其特征在于包含以下连续步骤：
–将待水解的生物质悬浮于水相；
–加入一种或多种如权利要求5-7任一项所述的宿主细胞以及发酵生物和/或如权利要求10所述的酶组合物以产生发酵液；
–从发酵液中分离生物燃料。
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