BR112016011609B1 - Variantes de endoglucanases com atividades melhoradas, e, usos das mesmas - Google Patents

Abstract

VARIANTES DE ENDOGLUCANASES COM ATIVIDADES MELHORADAS, E, USOS DAS MESMAS. A presente invenção se refere à expressão e à otimização de enzimas envolvidas na degradação de biomassa de lignocelulose. A presente invenção se refere mais especificamente a variantes de endoglucanase II de Trichoderma reesei, e ao uso das referidas variantes com desempenho melhorado em métodos para degradação de celulose e produção de biocombustível.

Description

[0001] A possibilidade de produzir etanol a partir de celulose tem recebido uma grande atenção devido à disponibilidade de grandes quantidades de matéria-prima e também devido ao valor do etanol como combustível. As matérias-primas naturais à base de celulose, para tal processo, são denotadas "biomassa". Muitos tipos de biomassa, por exemplo, madeira, resíduos agrícolas, culturas herbáceas e resíduos sólidos urbanos, têm sido considerados como potenciais matérias-primas para a produção de biocombustível. Estes materiais consistem principalmente de celulose, hemicelulose e lignina.

[0002] A celulose é um polímero constituído por moléculas de glicose ligadas por ligações beta-1,4 que são muito resistentes à degradação ou despolimerização. Uma vez que a celulose tenha sido convertida em glicose, esta última é facilmente fermentada em biocombustíveis, por exemplo, etanol, utilizando-se uma levedura.

[0003] Os métodos mais antigos estudados para converter celulose em glicose são baseados em hidrólise ácida. Este processo pode ser realizado na presença de ácidos concentrados ou diluídos. No entanto, várias desvantagens, tais como a má recuperação do ácido, quando são utilizados ácidos concentrados, e a baixa produção de glicose no caso da utilização de ácidos diluídos, são prejudiciais para a economia do processo de hidrólise ácida.

[0004] Para superar os inconvenientes do processo de hidrólise ácida, os processos de conversão de celulose têm mais recentemente sido relacionados com a hidrólise enzimática, utilizando enzimas do tipo celulase. Esta hidrólise enzimática da biomassa lignocelulósica (por exemplo, celulose) tem, no entanto, o inconveniente de ser um processo industrial caro. Como resultado, é necessária a utilização de cepas de micro-organismos secretores de celulase cada vez mais eficazes. Neste contexto, muitos micro-organismos compreendem enzimas que hidrolisam celulose, tais como os fungos Trichoderma, Aspergillus, Humicola ou Fusarium e também as bactérias, tais como Thermomonospora, Bacillus, Cellulomonas e Streptomyces. As enzimas secretadas por esses micro-organismos possuem três tipos de atividades que são úteis na conversão de celulose em glicose e são divididas em três grupos: endoglucanases, que atacam aleatoriamente fibras de celulose internamente, exoglucanases que atacam as extremidades das fibras liberando celobiose, e β-glicosidases que hidrolisam celobiose em glicose. Outras classes de enzimas, tais como as hemicelulases ou a classe de enzimas polissacarídeo monooxigenase recentemente descoberta também pode desempenhar um papel na eficiência da hidrólise.

[0005] Existe um grande interesse industrial em diminuir o custo da hidrólise enzimática, e esta redução envolve a utilização de uma quantidade reduzida de enzimas e, portanto, coquetéis de enzimas que são mais eficazes. Consequentemente, vários Pedidos de Patentes descrevem enzimas naturais com capacidades maiores do que as de Trichoderma reesei, ou variantes que foram melhorados por meio de engenharia genética. Pode ser feita menção aos Pedidos de Patente US2010304464, WO 2010/066411 e WO 2013/029176 relativos à exoglucanases, aos Pedidos WO 2007/109441, WO 2012/149192 e WO 2010/076388, relativos à endoglucanases, aos Pedidos WO 2010/029259, WO 2010/135836 ou WO 2010/022518 relativos à β-glicosidases, ou então aos Pedidos WO12135659 e WO12149344 relativos à polissacarídeo monooxigenases.

[0006] As enzimas que hidrolisam biomassa lignocelulósica são classificadas no sistema CAZy (Cantarel, B. L., Coutinho, P.M., Rancurel, C., Bernard, T., Lombard, V., & Henrissat, B. (2009). The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic acids research, 37, D233-8) com base em critérios principalmente estruturais. As endoglucanases podem pertencer às famílias GH 5, 6, 7, 8, 9, 12, 16, 18, 19, 26, 44, 45, 48, 51, 74 e 124.

[0007] Com o intuito de que uma hidrólise da biomassa lignocelulósica seja eficaz e economicamente confortável, a mistura enzimática deve incorporar proporções equilibradas de enzimas que possuem diversas atividades enzimáticas, entre outras coisas, mas não exclusivamente, do tipo exoglucanase, endoglucanase, xilanase e β-glicosidase. A título de exemplo, nas misturas nativas de Trichoderma reesei, a presença de 60% a 70% de exoglucanases, de 15% a 20% de endoglucanases, alguns percentuais de hemicelulases e aproximadamente de 5% a 10% de β-glicosidases, são geralmente observadas. Esta mistura é adequada para hidrolisar a maioria dos substratos pré-tratados (por exemplo, tais como na explosão de vapor de palha de trigo em condições ácidas) com rendimentos aceitáveis. Em suma, o aumento da atividade de endoglucanase não deve ocorrer em detrimento das outras atividades enzimáticas. As especificidades funcionais destas enzimas são, no momento atual, mal compreendidas. O genoma de Trichoderma reesei compreende pelo menos 3 enzimas principais derivadas das famílias 7 (EG1, cel7b), 5 (EG2, cel5a) e 12 (EG3, cel12a). As enzimas EG1 e EG2 são as principais endoglucanases e podem representar até de 10% a 20% em peso do coquetel completo de enzimas produzidas por T. reesei.

[0008] As endoglucanases (EC 3.2.1.4), as primeiras enzimas que atuam sobre a celulose, são conhecidas por possuírem um papel principal na hidrólise, aumentando o número de locais que as exoglucanases podem atacar enquanto diminuem o grau de polimerização das microfibrilas atacadas. Estudos recentes (Szijártó, N., Siika-aho, M., Sontag- Strohm, T., & Viikari, L. (2011). “Liquefaction of hydrothermally pretreated wheat straw at high-solids content by purified Trichoderma enzymes”. Bioresource technology, 102 (2), 1968-1974) enfatizam o seu papel na diminuição da viscosidade da biomassa durante as primeiras horas de hidrólise. Esta diminuição da viscosidade pode possuir um impacto muito significativo nos custos operacionais do processo. a. O problema de viscosidade é acentuado no caso de processos que exigem uma baixa temperatura do recurso, tais como a sacarificação e fermentação simultâneas (SSF, na sigla em inglês) que envolve ambas as enzimas que hidrolisam a biomassa e o micro-organismo que converte os monômeros de açúcar em etanol.

[0009] A hidrólise e a fermentação podem ser realizadas de acordo com diferentes regimes. O mais comum é composto por hidrólise separada da fermentação (SHF, na sigla em inglês). Este método faz com que seja possível aperfeiçoar cada etapa através da manutenção das condições ótimas de reação. Esta fermentação é realizada extemporaneamente, a uma temperatura entre aproximadamente 28°C e aproximadamente 30°C, enquanto que a hidrólise ocorre geralmente a uma temperatura de pelo menos 45°C. No entanto, na SHF, os açúcares liberados no final da reação estão presentes em concentrações muito elevadas e conduzem a uma inibição das enzimas, diminuindo a eficiência do processo. Com o intuito de evitar estes inconvenientes, outro tipo de processo pode ser visionado. Na SSF, as duas etapas (hidrólise e fermentação das hexoses) são realizadas simultaneamente, evitando a acumulação de açúcares em concentrações que são inibidoras para as enzimas. Os custos de investimento também são reduzidos em virtude da utilização de um único reator. O grau de hidrólise é superior, seguido pela ausência de inibição, uma vez que os açúcares liberados são imediatamente utilizados para a fermentação em etanol. Neste método, a temperatura do reator encontra-se necessariamente entre as temperaturas ideais para a hidrólise e para a fermentação, tipicamente entre aproximadamente 30°C e aproximadamente 35°C. No entanto, nesta temperatura, a atividade das enzimas celulolíticas é diminuída em cerca de 30%.

[0010] A SSF também permite a expressão de enzimas que quebram a celulose no organismo que fermenta os açúcares, tornando assim possível limitar, ou em um caso extremo eliminar, o recurso de enzimas produzidas durante uma etapa separada.

[0011] Consequentemente, a obtenção de enzimas que mantêm uma atividade de endoglucanase eficaz sob temperaturas ótimas para a hidrólise e para a fermentação (isto é, entre 30°C e 50°C), enquanto, ao mesmo tempo, mantém a proporção de todas as enzimas da mistura seria um ganho significativo para o processo de conversão de biomassa lignocelulósica em biocombustível.

Descrição da invenção

[0012] Os solicitantes desenvolveram um polipeptídeo que possui uma atividade de endoglucanase melhorada, em particular, em comparação com a atividade de endoglucanase da proteína EG2 de tipo selvagem de sequência de SEQ ID NO: 2. A EG2 corresponde a Trichoderma reesei endoglucanase 2.

[0013] Com esta perspectiva, os solicitantes possuem como grande crédito, após numerosas pesquisas, o fato de ter encontrado um polipeptídeo isolado ou purificado que possui uma atividade de endoglucanase melhorada em comparação com a atividade de endoglucanase da proteína EG2 de tipo selvagem (SEQ ID NO: 2).

[0014] De acordo com a invenção, o polipeptídeo é escolhido a partir do grupo que compreende: i) uma sequência de aminoácidos escolhida a partir do grupo que compreende as sequências SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 34; 11) uma sequência de aminoácidos que possui um percentual de identidade de pelo menos 70%, preferivelmente de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%, em relação à sequência SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34.

[0015] De acordo com a invenção, o percentual de identidade de uma dada sequência em relação à SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34 corresponde ao número de resíduos que são idênticos entre essa dada sequência e a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34 dividido pelo número de resíduos na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34. Quando o banco de dados GenomeQuest é utilizado, o referido percentual de identidade em relação à SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34 corresponde ao percentual de identidade de consulta (% do ID da consulta), onde consulta corresponde à sequência SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34.

[0016] Em outra modalidade, o polipeptídeo, tal como descrito acima, é caracterizado pelo fato de que a sua expressão em um organismo fermentativo é, pelo menos, igual à expressão da proteína EG2 de tipo selvagem (SEQ ID NO: 2).

[0017] Os técnicos na arte serão capazes, por exemplo, de determinar o aumento ou em outras palavras, a melhoria da atividade enzimática utilizando o substrato de carboximetilcelulose (CMC), ou um substrato cromogênico (p- nitrofenil glicosídeo). A atividade enzimática será respectivamente revelada pelo ensaio colorimétrico dos açúcares redutores ou então pelo nitrofenol liberado.

[0018] Preferivelmente, o polipeptídeo da invenção possui uma atividade enzimática melhorada em pelo menos 10%, preferivelmente em pelo menos 20%, preferivelmente em pelo menos 30%, em relação à atividade de endoglucanase da proteína EG2 de sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

[0019] Um exemplo de um protocolo, que os técnicos na arte serão capazes de utilizar para determinar se um polipeptídeo, de acordo com a invenção, possui uma atividade enzimática melhorada em relação à da proteína EG2 de tipo selvagem (SEQ ID NO: 2), é o seguinte: - formação de uma cultura de estoque de E. coli que expressa um polipeptídeo de acordo com a invenção durante a noite a 37°C; - inoculação de um meio de cultura LB com 1% de cultura de estoque a 37°C até uma densidade ótica de 0,4 ser obtida; - cultura das referidas células a 20°C durante 18 horas; - centrifugação durante 5 minutos a 7.900 rpm; - ressuspensão dos pellets de células com tampão de fosfato de citrato a 100 mM com pH 5 contendo 1 mg/ml de lisozima (OD600 100); - incubação das células ressuspensas durante 30 minutos em gelo; - lise das células por meio de 3 ciclos de congelamento / descongelamento; - fracionamento do DNA por sonicação; - centrifugação durante 30 minutos a 13.000 rpm; - incubação de 100 μl de sobrenadante de quebra diluído 50 vezes com 100 μl de tampão fosfato citrato a 100 mM com pH 5 contendo 1% de CMC, durante 1 hora a 35°C e 50°C; - remoção de 100 μl de reação; - adição de 100 μl de reagente DNS (Miller, 1959); - incubação durante 5 minutos a 100°C; - incubação durante 3 minutos em gelo; - centrifugação durante 10 minutos a 3.000 rpm; - leitura da densidade ótica a 540 nm em 150 μl de sobrenadante.

[0020] Um objetivo adicional da invenção refere-se a um ácido nucleico purificado ou isolado que codifica pelo menos um polipeptídeo tal como descrito acima. A Tabela 1 abaixo compreende as identificações das sequências peptídicas e nucleicas para os genes EG2, e os genes das endoglucanases putativas 2 de Botryotinia fuckeliana (gene BF) e de Sclerotinia sclerotiorum (gene SS), e também para as sequências peptídicas e nucleicas da invenção.

[0021] Preferivelmente, o referido ácido nucleico purificado ou isolado pode ser escolhido a partir do grupo constituído a partir das seguintes sequências: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 33. TABELA 1

[0022] A invenção adicionalmente se refere a um vetor que compreende um ácido nucleico, tal como descrito acima.

[0023] De acordo com a invenção, o termo "vetor" deverá ser entendido como significando qualquer sequência de DNA na qual é possível inserir fragmentos de ácido nucleico externos, em que os vetores permitem a introdução de DNA externo em uma célula hospedeira. Podem ser citados os vetores não exaustivos de: plasmídeos, cosmídeos, cromossomos artificiais de levedura (YACs), cromossomos artificiais bacterianos (BACs), cromossomos artificiais derivados de bacteriófago P1 (PACs) ou vetores derivados de vírus.

[0024] De acordo com a invenção, o ácido nucleico, tal como descrito acima, pode ser funcionalmente ligado a um promotor, um terminador ou qualquer outra sequência necessária para a sua expressão na célula hospedeira.

[0025] O vetor de acordo com a invenção pode adicionalmente transportar um marcador selecionável. O termo "marcador selecionável" destina-se a significar um gene cuja expressão confere às células que o contêm uma característica que faz com que seja possível selecioná-las. Por exemplo, um gene de resistência a antibióticos.

[0026] Um objetivo adicional da invenção refere-se a uma célula hospedeira isolada que compreende pelo menos um dos polipeptídeos, tais como descritos acima, ou pelo menos um dos ácidos nucleicos, tais como descritos acima, ou pelo menos um dos vetores, tais como descritos acima.

[0027] Os técnicos na arte serão capazes de introduzir um dos polipeptídeos, um dos ácidos nucleicos ou um dos vetores, tais como descritos acima, na célula hospedeira por meio de métodos convencionais bem conhecidos. Por exemplo, pode ser feita menção ao tratamento com cloreto de cálcio, eletroporação, ou a utilização de uma pistola de partículas.

[0028] De acordo com uma modalidade, os técnicos na arte serão capazes de introduzir na célula hospedeira, e por meio de métodos convencionais, várias cópias de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que possui uma atividade de endoglucanase melhorada de acordo com a invenção.

[0029] De acordo com uma modalidade, a célula hospedeira isolada, tal como descrita acima, é escolhida a partir do grupo que compreende Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola, Myceliophthora, Chrysosporium, Penicillium, Fusarium, Thermomonospora, Bacillus, Pseudomonas, Escherichia, Clostridium, Cellulomonas, Streptomyces, Yarrowia, Pichia e Saccharomyces.

[0030] De acordo com uma modalidade preferencial, a célula hospedeira isolada, tal como descrita acima, é escolhida a partir do grupo que compreende Trichoderma reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Myceliophthora thermopila, Chrysosporium lucknowense, Neurospora crassa, Humicola grisae, Penicillium pinophilum, Penicillium oxalicum, Escherichia coli, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium benjerinckii, Clostridium butylicum, Pichia pastoris, Yarrowia lipolityca e Saccharomyces cerevisiae.

[0031] De acordo com uma modalidade preferencial, a célula hospedeira isolada, tal como descrita acima, é escolhida a partir de Trichoderma reesei e Saccharomyces cerevisiae.

[0032] Um objetivo adicional da invenção é a utilização de qualquer um dos polipeptídeos descritos acima para a hidrólise da celulose.

[0033] Um objetivo adicional da invenção é a utilização de qualquer um dos polipeptídeos descritos acima para a produção de biocombustível.

[0034] De acordo com a invenção, o termo "biocombustível" pode ser definido como sendo qualquer produto que resulta da conversão de biomassa e que pode ser utilizado para fins energéticos. Além disso, e sem pretender ficar limitado, podem ser citados, a título de exemplo, os biogases, produtos que podem ser incorporados (opcionalmente após a conversão subsequente) em um combustível ou podem ser um combustível no seu próprio direito, tais como álcoois (etanol, butanol e/ou isopropanol, dependendo do tipo de organismo fermentativo utilizado), solventes (acetona), ácidos (ácido butírico), lipídeos e derivados dos mesmos (ácidos graxos de cadeia curta ou cadeia longa, ésteres de ácidos graxos), e também hidrogênio.

[0035] Preferivelmente, o biocombustível de acordo com a invenção é um álcool, por exemplo, etanol, butanol e/ou isopropanol. Mais preferivelmente, o biocombustível de acordo com a invenção é o etanol.

[0036] Em outra modalidade, o biocombustível é biogás.

[0037] Em outra modalidade, o produto é uma molécula de interesse para a indústria química, por exemplo, outro álcool, tal como 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,4- butanodiol, 2,3-butanodiol, ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ácido propiônico, ácido acrílico, ácido butírico, ácido succínico, ácido málico, ácido fumárico, ácido cítrico ou ácido itacônico, ou hidroxiácidos tais como ácido glicólico, ácido láctico ou ácido hidroxipropiônico.

[0038] Uma modalidade de produção de um coquetel enzimático que é útil para a hidrólise do material lignocelulósico é descrita abaixo. As cepas de fungos filamentosos, preferivelmente Trichoderma, mais preferivelmente T. reesei, capazes de expressar pelo menos um polipeptídeo de acordo com a invenção, são cultivadas em fermentadores na presença de um substrato à base de carbono, tal como lactose ou glicose, escolhido para o crescimento do micro-organismo. Em uma modalidade, este substrato à base de carbono, dependendo da sua natureza, é introduzido no fermentador antes da esterilização, ou é esterilizado separadamente e introduzido no fermentador após esterilização deste último de modo a obter uma concentração inicial de 20 g/l a 35 g/l.

[0039] Uma solução aquosa contendo o substrato escolhido para a produção das enzimas é então adicionada. Uma composição enzimática que atua sobre a biomassa lignocelulósica produzida pelos fungos é finalmente recuperada por filtração do meio de cultura. Nesta composição estão, em particular, a β-glicosidase, a exoglucanase e a endoglucanase, de acordo com a invenção. Em uma modalidade, a solução aquosa contendo o substrato escolhido para a produção das enzimas é preparada a uma concentração de 200 g/l a 250 g/l e adicionalmente contém um substrato indutor, tal como lactose. Esta solução aquosa é injetada após a exaustão do substrato inicial à base de carbono de modo a fornecer uma quantidade otimizada, entre 35 mg/l e 45 mg/g, de células ("batelada alimentada"). Durante esta fase de "batelada alimentada", a concentração residual de açúcar no meio de cultura é inferior a 1 g/l e as enzimas que atuam sobre a biomassa lignocelulósica são secretadas pelo fungo. O último pode ser recuperado por filtragem do meio de cultura.

[0040] Um objetivo da invenção é uma composição enzimática capaz de atuar sobre a biomassa lignocelulósica, sendo a referida composição enzimática preferivelmente produzida por fungos filamentosos e que compreende pelo menos um polipeptídeo que possui atividade de endoglucanase melhorada em relação à atividade de endoglucanase da proteína EG2 de tipo selvagem. O termo "fungos filamentosos" pretende significar, em particular, Trichoderma, mais preferivelmente T. reesei.

[0041] Finalmente, um objetivo da invenção é um processo para a produção de biocombustível a partir de biomassa, que compreende as seguintes etapas sucessivas: - suspensão, em uma fase aquosa, da biomassa a ser hidrolisada; - hidrólise, na presença de uma composição enzimática da biomassa lignocelulósica, tal como descrito acima, de modo a produzir um hidrolisado contendo glicose; - fermentação da glicose do hidrolisado de modo a produzir um mosto fermentativo; - separação do biocombustível a partir do mosto fermentativo.

[0042] Em uma modalidade, a biomassa a ser hidrolisada é suspensa em uma fase aquosa em uma proporção de 6% a 40% de sólidos, preferivelmente de 20% a 30%. O pH é ajustado entre 4 e 5,5; preferivelmente entre 4,8 e 5,2, e a temperatura é ajustada entre 40°C e 60°C, preferivelmente entre 45°C e 50°C. A reação de hidrólise é iniciada pela adição da composição enzimática que atua sobre a biomassa lignocelulósica; a quantidade utilizada é normalmente de 10 mg a 30 mg de proteína excretada por grama de substrato pré- tratado ou menos. A reação dura, em geral, de 15 a 48 horas. A reação é monitorada por ensaio de liberação de açúcares, em particular, de glicose. A solução de açúcares é separada a partir da fração sólida não hidrolisada, constituída essencialmente de lignina, por filtragem ou centrifugação e, subsequentemente, tratada em uma unidade de fermentação.

[0043] Em uma modalidade, será possível separar a biomassa a partir do mosto fermentativo, por exemplo, através de destilação.

[0044] Outro objetivo da invenção é um processo para a produção de biocombustível a partir de biomassa, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas sucessivas: - suspensão, em uma fase aquosa, da biomassa a ser hidrolisada; - adição simultânea de uma composição enzimática, tal como definida acima e de um organismo fermentativo, preferivelmente a uma temperatura entre 30°C e 35°C, de modo a produzir um mosto fermentativo; - separação do biocombustível a partir do mosto fermentativo.

[0045] Preferivelmente, a composição enzimática e o organismo fermentativo são adicionados ao mesmo tempo e, em seguida, incubados a uma temperatura entre 30°C e 35°C de modo a produzir um mosto fermentativo.

[0046] De acordo com esta modalidade, a celulose presente na biomassa é convertida em glicose, e ao mesmo tempo, no mesmo reator, o organismo fermentativo (por exemplo, uma levedura) converte a glicose e o produto final de acordo com uma SSF, processo conhecido pelos técnicos na arte. Dependendo da capacidade metabólica e hidrolítica do organismo fermentativo, pode ser necessária a adição de uma quantidade maior ou menor de mistura celulolítica com o intuito de que a operação proceda corretamente.

[0047] Em outra modalidade, o organismo fermentativo adicionalmente produz o polipeptídeo que constitui o objetivo da invenção através de secreção ou na superfície da sua célula, opcionalmente em conjunto com outras enzimas que atuam sobre a biomassa lignocelulósica, assim limitando ou eliminando a necessidade de enzimas produzidas pelo fungo filamentoso. Preferivelmente, o organismo fermentativo é uma célula hospedeira tal como descrita acima.

[0048] Assim, de um modo preferencial, um objetivo da invenção é um processo para a produção de biocombustível a partir de biomassa, que compreende as seguintes etapas sucessivas: - suspensão, em uma fase aquosa, da biomassa a ser hidrolisada; - adição de uma ou mais células hospedeiras, tal como descritas acima, com um organismo fermentativo e/ou uma composição enzimática, tal como descrito acima, de modo a produzir um mosto fermentativo; - separação do biocombustível a partir do mosto fermentativo.

[0049] Preferivelmente, as células hospedeiras com a composição enzimática e/ou o organismo fermentativo são adicionados e, em seguida, incubados a uma temperatura de entre 30°C e 35°C de modo a produzir um mosto fermentativo.

[0050] A utilização do polipeptídeo que possui uma atividade de endoglucanase melhorada, de acordo com a presente invenção, tem assim a vantagem de se obter um rendimento melhorado da produção de glicose. Assim, a presente invenção torna possível a utilização de uma quantidade menor de enzima do que anteriormente, o que fornece uma vantagem econômica.

[0051] Outros aspectos, vantagens, temas e características da invenção serão apresentados na leitura da descrição não restritiva que se segue e que descreve modalidades preferencias da invenção, dadas por meio de exemplos e figuras.

[0052] A Figura 1 é um gráfico que representa a hidrólise de 1% de p-nitrofenil-β-celotriosideo (pNPC3) pela endoglucanase EG2 de referência (SEQ ID NO: 2) e mutantes 222E1 e 225C7 (SEQ ID NO: 24 e 26, respectivamente) secretado para o meio de cultura pelas cepas Scα-EG2, Scα-222E1 e Scα- 225C7, respectivamente.

[0053] A Figura 2 é um gráfico que apresenta a hidrólise de 1% de CMC pela endoglucanase EG2 de referência (SEQ ID NO: 2) e mutantes 222E1 e 225C7 (SEQ ID NO: 24 e 26, respectivamente) secretado para o meio de cultura pelas cepas Scα-EG2, Scα-222E1 e Scα-225C7, respectivamente.

[0054] A Figura 3 é um gráfico que apresenta os resultados de SHF para o coquetel derivado da cepa 146C4/7, um coquetel de referência produzida pela cepa CL847 ΔEG1 (ΔEG1) suplementada com β-glicosidase e outro coquetel de referência produzido pela cepa CL847 ΔEG1 retransformada com o gene de referência EG2 (ΔEG1cEG2) suplementado com β- glicosidase.

[0055] A Figura 4 é um gráfico que apresenta os resultados de SHF para o coquetel derivado da cepa 222E1 (SEQ ID NO: 24) e um coquetel derivado da cepa 225C7/7 (SEQ ID NO: 26), um coquetel de referência produzido pela cepa CL847 ΔEG1 (ΔEG1) suplementada com β-glicosidase e outro coquetel de referência produzido pela cepa CL847 ΔEG1 retransformada com o gene de referência EG2 (ΔEG1cEG2) suplementado com β-glicosidase.

[0056] A Figura 5 é um gráfico que apresenta os resultados de SSF para o coquetel derivado a partir da cepa 146C4/7 (SEQ ID NO: 16) e para um coquetel derivado a partir da cepa 191H11/9 (SEQ ID NO: 22), um coquetel de referência produzido pela cepa CL847 ΔEG1 (ΔEG1) suplementada com β- glicosidase e outro coquetel de referência produzido pela cepa CL847 ΔEG1 retransformada com o gene de referência EG2 (ΔEG1cEG2) suplementada com β-glicosidase.

[0057] A Figura 6 é um gráfico que apresenta á média dos resultados de SSF para os três coquetéis derivados a partir das cepas 222E1/1, 222E1/2 e 222E1/7 (SEQ ID NO: 24) e os resultados para o coquetel derivado a partir da cepa 225C7/7 (SEQ ID NO: 26), um coquetel de referência produzido pela cepa CL847 ΔEG1 (ΔEG1) suplementada com β-glicosidase e outro coquetel de referência produzido pela cepa CL847 ΔEG1 retransformada com o gene de referência EG2 (ΔEG1cEG2) suplementada com β-glicosidase.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Evolução de L-shuffling

[0058] A sequência do gene de Trichoderma reesei endoglucanase EG2 foi submetida a um ciclo de L-shuffling, de acordo com o processo descrito no Documento EP1104457B1, com os genes de endoglucanase 2 de Botryotinia fuckeliana (gene BF) e de endoglucanase 2 putativa de Sclerotinia sclerotiorum (gene SS) cada um possuindo aproximadamente 64% de identidade com o gene de referência EG2 da SEQ ID NO: 1.

1 - Rastreio de alto rendimento

[0059] Um teste de rastreio de alto rendimento foi desenvolvido com o intuito de selecionar os melhores clones resultantes a partir da L-shuffling, isto é, aqueles que exibem melhoria de pelo menos 20% na atividade de endoglucanase em relação à enzima de T. reesei.

[0060] O teste de rastreio de alto rendimento foi realizado de acordo com as seguintes etapas: - isolamento em ágar dos clones de E. coli que expressam as variantes da enzima recombinante de acordo com a invenção e pré-cultivo das referidas colônias em meio LB durante a noite a 37°C; - inoculação de um meio LB a 6% com a pré-cultura, seguida de incubação durante 5 horas a 37°C, depois 17 horas a 20°C; - centrifugação durante 10 minutos a 3.000 rpm; - lise das células por adição de 80 μl de uma solução - e lisozima a 1 mg/ml em um tampão de fosfato de citrato 0,1 M, com pH 5; - incubação durante 4 horas à temperatura ambiente; - adição de 80 μl de tampão de fosfato de citrato 0,1 M, pH 5, contendo 1% de carboximetilcelulose; - incubação durante 3 horas a 35°C; - centrifugação durante 10 minutos a 3.000 rpm; - remoção de 100 μl de sobrenadante; - adição de 100 μl de reagente DNS; - incubação durante 10 minutos a 100°C e depois 5 minutos em gelo; - leitura da DO a 540 nm em 120 μl.

[0061] Sob estas condições de rastreio, uma melhoria da atividade de endoglucanase (aumento na DO a 540 nm) em relação à enzima referência EG2 (SEQ ID NO: 2) foi encontrada nos clones 37D12, 45A7, 46H1, 50F10, 108G5, 140F7, 146C4, 149E4, 173C6, 191H11, 222E1, 225C7, 227C4, 229D1, 231C9 e 330F9.

2 - Determinação da melhoria na atividade de endoglucanase 2.1 - No substrato de carboximetilcelulose (CMC)

[0062] Com o intuito de estimar a kcat dos clones 37D12, 45A7, 46H1, 50F10, 108G5, 140F7, 146C4, 149E4, 173C6, 191H11, 222E1, 225C7, 227C4, 229D1, 231C9 e 330F9 em comparação com as enzimas de referência, o seguinte procedimento é realizado: - preparação de uma cultura de reserva de E. coli que expressa uma enzima recombinante de acordo com a invenção durante a noite a 37°C; - inoculação de um meio de cultura LB com 1% de cultura de estoque a 37°C até uma densidade óptica a 600 nm de 0,4 ser obtida; - cultura das referidas células a 20°C durante 18 horas; - centrifugação durante cinco minutos a 7.900 rpm; - ressuspensão dos sedimentos de células com tampão de citrato fosfato 0,1 M com pH 5 contendo 1 mg/ml de lisozima (DO600 final de 100); - incubação das células ressuspensas durante 30 minutos em gelo; - lise das células por meio de 3 ciclos de congelamento / descongelamento; - fracionamento do DNA com ultrassons durante 3 segundos na potência 5; - centrifugação durante 30 minutos a 13.000 rpm; - incubação de 100 μl de sobrenadante de quebra com 100 μl de tampão de fosfato de citrato 0,1 M com pH 5 contendo 1% de CMC, durante 1 hora a 35°C e 50°C; - remoção de 100 μl de reação; - adição de 100 μl de reagente DNS; - incubação durante 5 minutos a 100°C; - incubação durante 3 minutos em gelo; - centrifugação durante 10 minutos a 3.000 rpm; - leitura da densidade ótica a 540 nm em 150 μl.

[0063] De acordo com a invenção, os valores da kcat são calculadas da seguinte forma: - expressão das DOs a 540 nm como uma função da quantidade de proteína de interesse (em nM); - subtração do valor do controle negativo; - divisão pelo coeficiente da faixa padrão de glicose (várias quantidades de glicose são reveladas com o DNS); - divisão pelo tempo de reação.

[0064] A Tabela 2 apresenta os valores kcat e também o fator de melhoria obtidos em relação à proteína de referência EG1 (SEQ ID NO: 2) para os clones 37D12, 45A7, 46H1, 50F10, 108G5, 140F7, 146C4, 149E4, 173C6, 191H11, 222E1, 225C7, 227C4, 229D1, 231C9 e 330F9 sob as condições experimentais do teste de atividade sobre CMC. TABELA 2: Atividade de endoglucanase em CMC

[0065] Os resultados mostram uma melhoria significativa da atividade enzimática em relação à enzima de referência da SEQ ID NO: 2 para esses clones.

2.2 - No substrato de celulose inchada com ácido fosfórico (PASC)

[0066] A melhoria da atividade dos clones 37D12, 45A7, 46H1, 50F10, 108G5, 140F7, 146C4, 149E4, 173C6, 191H11, 222E1, 225C7, 227C4, 229D1, 231C9 e 330F9 foi então confirmada em um segundo substrato: celulose inchada com ácido fosfórico (PASC).

[0067] A Tabela 3 apresenta os valores kcat e também o fator de melhoria obtidos para os clones 37D12, 45A7, 46H1, 50F10, 108G5, 140F7, 146C4, 149E4, 173C6, 191H11, 222E1, 225C7, 227C4, 229D1, 231C9 e 330F9 a 50°C em relação à proteína de referência EG2 (SEQ ID NO: 2) sob as condições experimentais do teste de atividade sobre PASC. TABELA 3: Atividade de endoglucanase em PASC

[0068] Os resultados mostram uma melhoria significativa na atividade enzimática em relação à enzima de referência EG2 (SEQ ID NO: 2) para esses clones.

2.3 - No substrato Sigmacell

[0069] A melhoria nos clones 37D12, 45A7, 46H1, 50F10, 108G5, 140F7, 146C4, 149E4, 173C6, 191H11, 222E1, 225C7, 227C4, 229D1, 231C9 e 330F9 foi adicionalmente avaliada em um terceiro substrato: Sigmacell. O protocolo do teste é o mesmo anteriormente descrito com o substrato CMC. A incubação com o substrato foi realizada durante 24 horas a 50°C.

[0070] A Tabela 4 apresenta os valores de kcat e também o fator de melhoria obtidos para os clones 37D12, 45A7, 46H1, 50F10, 108G5, 140F7, 146C4, 149E4, 173C6, 191H11, 222E1, 225C7, 227C4, 229D1, 231C9 e 330F9 a 50°C em relação à proteína de referência EG2 (SEQ ID NO: 2), sob as condições experimentais do teste de atividade em Sigmacell. TABELA 4: Atividade de endoglucanase em Sigmacell

[0071] Os resultados mostram uma melhoria da atividade para os clones 37D12, 45A7, 46H1, 50F10, 108G5, 140F7, 146C4, 149E4, 173C6, 191H11, 222E1, 225C7, 227C4, 229D1, 231C9 e 330F9 pode ser vista em relação à enzima de referência EG2 (SEQ ID NO: 2) com o substrato Sigmacell.

Exemplo 2:

[0072] As variantes 146C4, 191H11, 222E1 e 225C7, e também o gene de referência EG2 de T. reesei (SEQ ID NO: 2) foram clonados entre o promotor e o terminador cbh1 no plasmídeo pUT1040 contendo um gene de resistência à fleomicina como marcador, por meio de uma dupla digestão BamH1/XhoI. 5 μg de cada vetor foram utilizados para a transformação da cepa de T. reesei CL847 ΔEG1. Os protoplastos foram transformados de acordo com um método convencional conhecido pelos técnicos na arte, através de choque de PEG e cálcio, com 5 μg de cada construto. Os transformantes foram selecionados em meio seletivo de PDA/sacarose contendo 30 μg/l de fleomicina. Após três subculturas sucessivas, tornando-se possível obter clones puros, entre onze e quinze clones foram obtidos para cada uma das variantes. Todos os clones foram cultivados em meio F45 (800 μl de H3PO4 a 85%, 4,2 g de (NH4)2SO4, 0,3 g de MgSO4.7H2O, 0,75 g de CornSteep, 1 ml de Oligo Ferment, 6g de ftalato de potássio, pH de 5,8 a 6) com 5 g/l de glicose e 10 g/l de sorbose como substrato de carbono e indutor. Após 7 dias de cultura a 30°C, o sobrenadante é removido e o equivalente a 10 mg/l de proteínas, medido pelo método de Lowry, é utilizado para um teste de atividade em carboximetilcelulose.

[0073] Para as medições da atividade, 150 μl de uma solução de CMC a 2% em tampão de citrato a 50 mM, pH 4,8, são misturados com 150 μl de tampão de citrato contendo 10 mg/l de proteínas. A reação é incubada a 50°C e 35°C durante 10 minutos e em seguida inativada em um banho de água fervente. Depois da centrifugação durante 5 minutos, 20 μl são removidos com o intuito de ensaiar açúcares redutores utilizando ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS). A redução do DNS e a formação de ácido 3-amino-5-nitrossalicílico são monitoradas através da leitura da absorção a 540 nm e os açúcares redutores são quantificados utilizando uma gama de glicose.

[0074] A Tabela 5 resume as atividades (expressas em equivalente de glicose μmol / mg de proteína / min) obtidas para os melhores clones para cada variante. O valor para a cepa ΔEG1 transformada com o gene nativo EG2 (ΔEG1cEG2) é uma média dos quatro melhores clones. TABELA 5: Atividade de endoglucanase em CMC

[0075] Para cada variante, pelo menos um clone possui uma atividade de CMCase maior do que a da cepa ΔEG1cEG2 a 35°C ou a 50°C, os melhores clones que apresentaram duas vezes mais atividade do que a cepa ΔEG1cEG2.

Exemplo 3: Expressão recombinante da endoglucanase EG2 de referência e das variantes 222E1 e 225C7 em Saccharomyces cerevisiae 1 - Produção de EG2 de referência e proteínas e variante 222E1 da mesma no meio extracelular

[0076] O gene de referência de endoglucanase EG2 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 1) e os genes das variantes 222E1 e 225C7 (SEQ ID NO: 23 e 25 respectivamente) foram clonados, sem o seu peptídeo sinal, no vetor pESC-LeuαΔmyc (CNRS-CERMAV). Esta construção permite a expressão de proteínas no meio de cultura da cepa de Saccharomyces cerevisiae EBY100, que é auxotrófica para leucina e triptofano (Boder E.T. e Wittrup K.D., Biotechnol Prog, 1998, 14: 55-62). Este plasmídeo faz com que seja possível colocar a expressão dos genes sob o controle do promotor GAL1 induzível por galactose e possui o gene marcador selecionável de auxotrofia (Leu2) que permite a seleção dos transformantes.

[0077] A transformação de Saccharomyces cerevisiae EBY100 foi realizada de acordo com os métodos convencionais conhecidos pelos técnicos na arte (transformação de leveduras por choque térmico e acetato de lítio). Os transformantes foram selecionados em meio 0,67%YNB-2%Glc-0,01%Trp.

[0078] Um transformante para cada gene (Scα-EG2 e Scα-222E1) foi utilizado para inocular 15 ml de um médio mínimo 0,67%YNB-2%Glc-SD-0,01%Trp. SD é uma mistura de aminoácidos (40 mg/l de sulfato de adenina, 20 mg/l de L- arginina; 100 mg/l de ácido aspártico; 100 mg/l de ácido L- glutâmico; 20 mg/l de L-histidina; 30 mg/l de L-lisina, 20 mg/l de L-metionina; 50 mg/l de L-fenilalanina; 375 mg/l de L-serina; 200 mg/l de L-treonina; 30 mg/l de L-tirosina; 150 mg/l de L-valina e 20 mg/l de uracil). Após 24 horas de pré- cultura a 30°C com agitação a 220 rpm, as três cepas de Scα- EG1, de Scα-222E1 e de Scα-225C7 foram utilizadas para inocular (DO600 de 0,5) a 150 ml de meio 0,67%YNB-2%Gal-SD- 0,01%Trp. As culturas foram incubadas a 25°C com agitação a 220 rpm. Após 8 horas de incubação, 6 ml de citrato de sódio com pH 5,6 foram adicionados a cada cultura, com o intuito de estabilizar o pH em 5.

[0079] Após quatro dias de incubação, 20 ml de cultura foram removidos. O sobrenadante da cultura foi obtido depois de centrifugação a 3.000 g, a 4°C, durante 5 minutos.

2 - Determinação da atividade de endoglucanase em p- nitrofenil-β-celotriosídeo

[0080] A atividade de endoglucanase dos sobrenadantes de cultura foi medida por meio de hidrólise do substrato de pNPC3 em um volume de 450 μl nas seguintes condições: - 50 mM de tampão de citrato com pH 5; - 2 mM de pNPC3; - 56,3 μl de sobrenadante de cultura a partir das cepas Scα-EG2. Scα-221E1 e Scα-225C7; - incubação a 35°C durante 6 horas.

[0081] A reação foi interrompida pela adição de 100 μl de 1M de carbonato de sódio para 100 μl de reação de hidrólise. A concentração de para-nitrofenol (PNP) liberado por hidrólise de pNPC3 foi determinada medindo-se a absorvância a 415 nm por comparação com uma escala padrão de para-nitrofenol (linear de 0,36 μM a 360 μM).

[0082] Os resultados da Figura 1 mostram que a cepa Scα-222E1 possui uma atividade de endoglucanase melhorada por um fator de 1,6 em relação à cepa Scα-EG2 que expressa a enzima de referência EG2 (SEQ ID NO: 2). A cepa Scα-225C7 foi encontrada, por sua vez, sendo menos eficaz para a hidrólise deste substrato.

3- Determinação da atividade de endoglucanase em carboximetilcelulose

[0083] A atividade de endoglucanase dos sobrenadantes de cultura foi medida por meio de hidrólise de carboximetilcelulose (CMC) em um volume de 700 μl nas seguintes condições: - 50 mM de tampão de citrato com pH 5; - 1% de CMC; - 210 μl de sobrenadante de cultura de cepas Scα-EG2, Scα-222E1 e Scα-225C7 dialisadas contra 50 nM de tampão de citrato, pH 5, em uma membrana de 10 kDa, e concentradas duas vezes; - incubação a 35°C durante 24 horas.

[0084] A reação foi interrompida pela adição de 150 μl de reagente de DNS para 100 μl da reação de hidrólise. Depois aquecimento durante 5 minutos a 100°C e arrefecimento em gelo, a quantidade de açúcares redutores liberados foi determinada medindo-se a absorvância a 550 nm por comparação com uma escala padrão produzida com glicose.

[0085] Os resultados da Figura 2 indicam que a quantidade de açúcares redutores libertados pela ação de variantes das cepas Scα-222E1 e Scα-225C7 é maior do que com a da cepa Scα-EG2. Assim, após 1 hora de hidrólise de CMC, o fator de melhoria a 35°C sobre este substrato é de 3,5 para Scα-222E1 e de 2,6 para Scα-225C7 em relação à Scα-EG2. Além deste tempo de incubação, a CMC continua a ser hidrolisada pelas duas variantes, enquanto que a velocidade da reação torna-se virtualmente igual à zero na presença da proteína de referência EG2 (SEQ ID NO: 2).

Exemplo 4: Produção de enzimas por T. reesei em frascos alimentados

[0086] As cepas de referência e aquelas que possuem a melhor atividade sobre CMC (CL847, ΔEG1, ΔEG1cEG2, 146C4/7, 191H11/9, 222E1/1, 222E1/2, 222E1/7 e 225C7/7) foram cultivadas em fracos Erlenmeyer de250 ml, 55 ml de meio F45 (10 g/l de tampão de biftalato de potássio, pH 6, 4,2 g/l de (NH4)2SO4, 300 mg/l de MgSO4.7H2O, 150 mg/l de CaCl2.2H2O, 1,5 g/l de cornsteep, ácido ortofosfórico a 0,07%, 5 mg/l de FeSO4, 1,4 mg/l de MnSO4, 1,4 mg/l de ZnSO4, 3,7 mg/l de CoCl2 e 12,5 g/l de glicose) são inoculadas e agitadas a 150 rpm e 30°C. A produção é realizada em duas fases: uma fase de batelada em glicose e uma fase de batelada alimentada em lactose. Amostras regulares tornam possível determinar o momento em que a concentração de glicose vai abaixo de 3 g/l. Nesta fase, a alimentação da batelada alimentada utilizando uma bomba de seringa (6-vias) é iniciada. As culturas são alimentadas com uma solução de 50 g/l de lactose e 0,3% de NH3 a uma taxa de fluxo de 40 mg de açúcar / grama de biomassa por hora. Amostras diárias são tomadas com o intuito de determinar o pH, o peso seco e a concentração de proteínas no sobrenadante. Após 5 dias de cultura em batelada alimentada, a cultura é filtrada através de um filtro de 0,45 μm e o sobrenadante é congelado.

[0087] A concentração final de proteínas foi de cerca de 3 g/l a 4 g/l. Se a concentração for inferior a 3 g/l, os sobrenadantes foram concentrados em uma coluna (Vivaspin MWCO5, Sartorius).

Exemplo 5: Eficácia das enzimas resultantes da L-shuffling na hidrólise da biomassa lignocelulósica de acordo com um processo de SHF

[0088] O substrato de referência utilizado é uma palha de trigo que foi submetida a um pré-tratamento de explosão de vapor (19 bar - 3 minutos) após impregnação ácida com 0,01% de H2SO4 durante 10 horas, e sendo lavada, neutralizada em pH 5, prensada e seca. As características das mesmas são apresentas na Tabela 9. Tabela 6: Composição da palha utilizada para os ensaios de hidrólise

[0089] As hidrólises foram realizadas a 10% de sólidos em peso, isto é, um equivalente de 5,4% de celulose em peso.

[0090] O teor de proteínas foi fixado em 10 mg/g de sólidos, isto é, aproximadamente 19 mg/g de celulose. A concentração dos coquetéis enzimáticos foi medida pelo método de Lowry utilizando BSA como referência. Cada coquetel foi suplementado com atividade de β-glicosidase em uma quantidade de 120 ± 2 UI/g de celulose, através da adição de SP188 β-glicosidase (Novozymes).

[0091] Os testes são realizados em tubos Eppendorf com uma capacidade de trabalho de 2 ml (capacidade de reação de 1 g) contendo: - 0,11 ± 0,001 g de substrato de palha lavada, - 0,9 ± 0,02 ml de meio de reação de hidrólise composto por 50 mM de tampão de acetato, pH 4,8, e cloranfenicol (0,05 g/l), - entre 0,1 e 0,2 ± 0,02 g de coquetel enzimático em função do seu teor de proteína.

[0092] As hidrólises enzimáticas são realizadas a 45°C ± 2°C com agitação do tipo vortex a 900 rotações por minuto em um Eppendorf Thermomixer Comfort.

[0093] Todos os testes são realizados em duplicado com tempos de amostragem fixos em t 24, 48 e 96 horas, com algumas amostras colhidas em t 72 horas.

[0094] Em cada instante de tempo de amostragem, os hidrolisados são fervidos durante 5 minutos, em tubos Eppendorf sacrificados. Esses tubos são, em seguida, arrefecidos e centrifugados. O ensaio de glicose é realizado por HPLC. Em paralelo, os resíduos sólidos de cada tubo Eppendorf são lavados e centrifugados 3 vezes antes de serem secos a 105°C durante 24 horas de forma a avaliar os Sólidos Insolúveis em Água (WIS, na sigla em inglês). O rendimento de hidrólise é calculado tendo em conta o valor de WIS.

[0095] Os coquetéis resultantes do Exemplo 4 foram avaliados. Dois ensaios de controle são realizados com os coquetéis de referência também suplementados com β- glicosidase para comparação: um coquetel produzido pela cepa ΔEG1 CL847 (ΔEG1) e um coquetel produzido pela cepa CL847 ΔEG1 retransformado com o gene de referência EG2 (ΔEG1cEG2).

[0096] A Figura 3 apresenta os resultados de SHF para o coquetel resultante da cepa 146C4/7 (SEQ ID NO: 16).

[0097] Os resultados apresentados na Figura 3 mostram que a taxa inicial de hidrólise do coquetel produzido pela variante 146C4 é maior do que aquelas dos coquetéis de referência ΔEG1 e ΔEG1cEG2. O rendimento da hidrólise final é também maior do que a dos coquetéis de referência ΔEG1 e ΔEG1cEG2.

[0098] A Figura 4 apresenta os resultados de SHF para o coquetel resultante da cepa 222E1/1 (SEQ ID NO: 24) e o coquetel resultante da cepa 225C7/7 (SEQ ID NO: 26).

[0099] Os resultados apresentados na Figura 4 mostram que as taxas iniciais de hidrólise dos coquetéis produzidos pela variante 222E1 e pela variante 225C7 são maiores do que aquelas dos coquetéis de referência ΔEG1 e ΔEG1cEG2. Os rendimentos de hidrólise finais são também maiores do que os dos coquetéis de referência ΔEG1 e ΔEG1cEG2.

Exemplo 6: Eficácia das enzimas na hidrólise de biomassa lignocelulósica de acordo com um processo de SSF

[0100] O substrato utilizado é o mesmo que o descrito na Tabela 6 (Exemplo 4).

[0101] As SSF são realizadas em triplicado em reatores laboratoriais. Os referidos reatores constituídos pelos seguintes elementos: - um frasco de vidro com um 30 ml de capacidade de trabalho; - uma rolha de segurança de poliéter éter cetona (PEEK); - uma válvula de via única DV-118 vendida pela empresa Vaplock ligada através da rolha. A válvula é configurada para abrir a saída quando a pressão relativa no frasco é maior do que 70 mbar; - um tubo oco de polipropileno, provido através de um segundo, que passa através da rolha, e equipado na extremidade inferior do referido tubo com um septo; - uma vedação plana disposta entre o gargalo da garrafa e rolha.

[0102] O princípio para o funcionamento dos biorreatores é a seguinte: O CO2 produzido durante a fermentação alcoólica acumula-se no espaço superior situado acima do meio de reação, causando, através de acumulação, um aumento na pressão no biorreator (PG). Quando PG torna-se maior do que a pressão para abrir a válvula via única (PS), a referida válvula é aberta para permitir que uma quantidade de gás escape, sendo a referida quantidade, por exemplo, determinada por pesagem. Quando PG < PS, a válvula se fecha novamente até que PG seja maior do que PS. Deste modo, o biorreator durante a operação está sempre sob pressão, de modo a assegurar um meio anaeróbico estável durante a fermentação. A quantidade de etanol produzida é avaliada pela produção de CO2 estimada pela perda de peso com base na seguinte equação estequiométrica para a fermentação de glicose em etanol: C6H12O6 (glicose) ^ 2 CO2 + 2 CH3CH2OH (etanol) + energia

[0103] O meio de cultura utilizado para a SSF é um meio aquoso que compreende: - 50 mM de tampão de acetato com pH 5; - cloranfenicol a 0,1 g/l; - meio nutritivo contendo 3 g/l de KH2PO4, 2 g/l de (NH4)2SO4, 0,4 g/l de MgSO4.7H2O e 1 g/l de extrato de levedura.

[0104] As SSF foram realizadas a 10 ± 0,01% em peso de sólidos, isto é, um equivalente de 5,4% de celulose em peso de uma massa total de reação de 15 ± 0,003 g. O teor de proteínas foi fixado em 10 ± 0,01 mg de celulases por grama de sólidos, isto é, aproximadamente 19 mg/g de celulose. A concentração dos coquetéis enzimáticos foi medida pelo método de Lowry utilizando Albumina de Soro Bovino (BSA, na sigla me inglês) como referência. Cada coquetel foi suplementado com atividade de β-glicosidase em uma quantidade de 120 ± 2 UI/g de celulose, adicionando SP188 β- glicosidase (Novozymes).

[0105] A levedura de fermentação de açúcar (Saccharomyces cerevisiae, Cepa Ethanol Red, Fermentis, França) é adicionada ao meio de modo a obter um teor de 2 ± 0,1 g/kg.

[0106] As enzimas e as leveduras são adicionadas aos biorreatores após uma hora de condicionamento da palha de trigo que tenha sido pré-tratada a 35°C com o tampão, cloranfenicol e meio de cultura.

[0107] A reação de SSF é realizada a uma temperatura de aproximadamente 35°C, colocando-se o biorreator laboratorial em uma incubadora padrão HT Multitron com uma velocidade de rotação orbital de 150 revoluções por minuto.

[0108] Ao longo do tempo, a perda de peso foi monitorada através da pesagem dos biorreatores. No final da reação, o mosto fermentativo é aquecido a 100°C durante 5 minutos, arrefecido e centrifugado para separar os sólidos não hidrolisados a partir do licor de fermentação. Este último é, em seguida, analisado por cromatografia gasosa, com o intuito de determinar a concentração de etanol.

[0109] Foram avaliados os coquetéis resultantes do Exemplo 4. Dois ensaios de controle são realizados com os coquetéis de referência também suplementados com β- glicosidase para comparação: um coquetel produzido pela cepa CL847 ΔEG1 (ΔEG1) e um coquetel produzido pela cepa CL847 ΔEG1 retransformados com o gene de referência EG2 (ΔEG1cEG2).

[0110] A Figura 5 apresenta os resultados de SSF para o coquetel resultante da cepa 146C4/7 e para o coquetel resultante da cepa 191H11/9 (SEQ ID NO. 22):

[0111] Os resultados apresentados na figura 5 mostram que as progressões (produções de etanol para a mesma dose de enzimas) de SSF ao longo de 100 horas para o coquetel que expressa a endoglucanase 146C4 e o coquetel que expressa a endoglucanase 191H11 são maiores do que as dos coquetéis de referência ΔEG1 e ΔEG1cEG2.

[0112] A Figura 6 apresenta os resultados de SSF para os 3 coquetéis resultantes das cepas 222E1/1, 222E1/2 e 222E1/7 (média dos resultados obtidos com as duas variantes) e para o coquetel resultante da cepa 225C7/7.

[0113] Os resultados apresentados na Figura 6 mostram que as progressões de SSF ao longo de 100 horas para o coquetel que expressa a endoglucanase 222E1 e para o coquetel que expressa a endoglucanase 225C7 são equivalentes e maiores do que aquelas dos coquetéis de referência ΔEG1 e ΔEG1cEG2.

Claims (13)

1. Polipeptídeo isolado ou purificado caracterizado pelo fato de ter uma atividade melhorada de endoglucanase em comparação com a atividade de endoglucanase da proteína de referência EG2 conforme definida na SEQ ID NO: 2, sendo o referido polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo de uma sequência de aminoácidos escolhida a partir de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 34.

2. Polipeptídeo isolado ou purificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ter uma atividade melhorada de endoglucanase a 35 oC em comparação com a atividade de endoglucanase da proteína de referência EG2.

3. Ácido nucleico purificado ou isolado caracterizado pelo fato de ser escolhido dentre as seguintes sequências: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 33 e em que ele codifica pelo menos um polipeptídeo como definido na reivindicação 1.

4. Vetor caracterizado pelo fato de compreender um ácido nucleico como definido na reivindicação 3.

5. Célula hospedeira isolada caracterizada pelo fato de compreender o ácido nucleico como definido na reivindicação 3 ou o vetor como definido na reivindicação 4, em que a referida célula é escolhida dentre Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola, Penicillium, Fusarium, Thermomonospora, Myceliophthora, Chrysosporium, Bacillus, Pseudomonas, Escherichia, Clostridium, Cellulomonas, Streptomyces, Yarrowia, Pichia e Saccharomyces.

6. Célula hospedeira isolada de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de ser escolhida dentre Trichoderma reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Neurospora crassa, Humicola grisae, Myceliophthora thermopila, Chrysosporium lucknowense, Penicillium pinophilum, Penicillium oxalicum, Escherichia coli, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium benjerinckii, Clostridium butylicum, Pichia pastoris, Yarrowia lipolityca e Saccharomyces cerevisiae.

7. Uso do polipeptídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a hidrólise de celulose.

8. Uso do polipeptídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a produção de biocombustíveis.

9. Composição enzimática capaz de atuar sobre a biomassa lignocelulósica, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um polipeptídeo como definido na reivindicação 1.

10. Processo para a produção de biocombustíveis a partir de biomassa, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas sucessivas: - suspender, em uma fase aquosa, a biomassa a ser hidrolisada; - hidrolisar, na presença de uma composição enzimática como definida na reivindicação 9, a biomassa lignocelulósica de modo a produzir um hidrolisado contendo glicose; -fermentar a glicose do hidrolisado de modo a produzir um bolor de fermentação; - separar o biocombustível do bolor de fermentação.

11. Processo para a produção de biocombustíveis a partir de biomassa, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas sucessivas: - suspender, em uma fase aquosa, a biomassa a ser hidrolisada; - adicionar simultaneamente uma composição enzimática como definida na reivindicação 9 e um organismo fermentativo, de modo a produzir um bolor de fermentação; - separar o biocombustível do bolor de fermentação.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o organismo fermentativo é escolhido a partir de uma célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 5 a 6.

13. Processo para a produção de biocombustíveis a partir de biomassa, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas sucessivas: - suspender, em uma fase aquosa, a biomassa a ser hidrolisada; - adicionar uma ou mais células hospedeiras como definidas em qualquer uma das reivindicações 5 a 6, com um organismo fermentativo e/ou uma composição enzimática como definida na reivindicação 9, de modo a produzir um bolor de fermentação; - separar o biocombustível a partir do bolor de fermentação.

Images