CN104003963A

CN104003963A - 一种川芎内酯的分离制备方法

Info

Publication number: CN104003963A
Application number: CN201410238826.1A
Authority: CN
Inventors: 刘向前; 邹亲朋; 戴玲; 潘烨
Original assignee: Broad-Ocean Bio-Science & Technique Co Ltd Of Changsha High-Tech Industrial Development Zone
Current assignee: Changsha Broad-Ocean Bio-Science Co.,Ltd.
Priority date: 2014-05-30
Filing date: 2014-05-30
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2034-05-30
Also published as: CN104003963B

Abstract

本发明公开了一种高纯度川芎内酯的分离制备方法，其利用高速逆流色谱技术，包括如下步骤：川芎用溶剂提取得到川芎提取物浸膏；川芎提取物浸膏用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯部分；乙酸乙酯部分采用高速逆流色谱法同时分离得到多个川芎内酯类化合物，经结构鉴定分别为洋川芎内酯N、洋川芎内酯R、洋川芎内酯S和洋川芎内酯I，纯度达98％以上。本发明的川芎内酯的分离制备方法具有操作简单，溶剂用量少，无样品吸附、损失和污染，效率高等优点。

Description

一种川芎内酯的分离制备方法

技术领域

本发明涉及中药提取分离技术领域，尤其涉及一种川芎内酯的分离制备方法。

背景技术

川芎是伞形科蒿本属植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的根茎，始载于《神农本草经》，其性温，味辛。微苦，具有活血行气、祛风止痛功效；主治血瘀气滞所致月经不调，痛经经闭，肝郁气滞而致血行不畅的胸胁疼痛、头痛、风寒湿痹、跌打肿痛等。川芎中主要含有川芎内酯类、生物碱和有机酸类等化学成分，其中动物实验证明川芎药材能够进入大鼠血浆中的主要成分是川芎内酯类化合物和阿魏酸，而阿魏酸广泛存在于植物界，并不是川芎的特征性成分。而川芎内酯类化合物的药理作用研究与川芎传统应用的临床效果一致，所以川芎内酯类化合物是川芎的特征性成分和主要有效成分。故近年来对川芎中川芎内酯的分离及药理作用研究越来越多。

目前，从川芎中分离川芎内酯主要采用组合色谱法(包括反复硅胶柱色谱、半制备高效液相色谱法)、高速逆流色谱法等方法进行分离纯化。国内外很多学者对川芎中内酯类化学成分进行了研究，王普善等从川芎中分得藁本内酯、新川芎内酯、洋川芎内酯、3-丁基苯酞、3-亚丁基苯酞。北京制药工艺研究所的研究人员分离得到4-羟基-3-丁基苯酞，即川芎酚(chuanxiongo1)。温月笙等分离得到3-丁基-3-羟基-4,5-二氢苯酞。王文祥等从川芎中首次分离得到4,7-二羟基-3-丁基苯酞。NatioTakashi等先后从川芎中分离得到洋川芎内酯B，C，D，E，F，G，H，I，J，M，N，O，P，Q，R，S。KobayashiM等从中分得洋川芎内酯K、L。Kaouadji等从川芎中分得藁本内酯二醇。肖永庆等分离得到Z,Z’-6,6’,7,3'α-二聚藁本内酯、Z-6,8’,7,3'-二聚藁本内酯、Z’-3,8-二氢-6,6’,7,3’α-二聚藁本内酯。金灯萍等先从川芎中提取挥发油，然后用反复硅胶柱色谱法进行分离，得到蒿本内酯纯品。文章“应用高速逆流一次性分离川芎中的蛇床内酯A和Z-蒿本内酯”，作者应用高速逆流色谱技术分离川芎中内酯类成分，结果得到了蛇床内酯A和Z-蒿本内酯两个单体。上述分离方法各有优缺点，组合色谱法不仅操作复杂，溶剂用量大，而且在分离过程中有吸附、损失和污染等现象，使整个分离过程效率不高。

高速逆流色谱(High-SpeedCounter-CurrentChromatography,HSCCC)是近几十年来发展起来的液-液色谱分离技术，利用溶质在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同，将不同物质进行有效分离。此项技术不需要固相载体，只需要被分离物在两相中分配，避免了固相载体带来的大量样品吸附、损失与污染等问题，样品回收率高，预处理及后处理都简单易行，已广泛应用于分离。与其它分离方法相比，它不使用固相载体作固定相，能采用不同的溶剂系统和正反相洗脱方式，克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染、峰形拖尾等缺点。HSCCC可采用不同物化特性的溶剂体系和多样性的操作条件，具有较强的适应性，为从复杂的天然产物粗制品中提取不同特性(如不同极性)的有效成分提供了有利条件。

刘雯等应用高速逆流色谱法一次性分离川芎中的蛇床内酯A和Z-蒿本内酯，称取川芎生药材100g，粉碎成细粉，加入600mL乙醇，加热回流提取，提取3次，每次2h，过滤，减压蒸干，得39g棕黄色浸膏备用。根据分配系数测定的结果，两相溶剂系统采用正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(1:1:1:1)，临用前分开上下相，超声30min。以溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相，以9mL/min的流速将上相泵入管路，待固定相充满整个管路后，停泵，启动主机，把转速调至892RPM，然后以1.2mL/min的流速泵入流动相。当上下相平衡时，记录固定相流出的体积，计算得到固定相保留值0.53。供试品100mg溶解于50mL流动相，浓度为10mg/mL，进样量为10mL，以1.2mL/min的流速泵入流动相。紫外检测波长为280nm，根据紫外检测谱图，收集各峰的组分，将各峰对应的收集液分别浓缩，干燥。用HPLC及TLC检测。

中国发明专利第200810208206.8号公开了一种高纯度Z-蒿本内酯和蛇床内酯A的制备方法，其采用高速逆流色谱技术，制备川芎或当归粗提物作为进样物；配制构成固定相和流动相同时泵入柱内，再转主机；由进样阀进样；根据检测器图谱接收目标成分，经分离后可得到Z蒿本内酯和蛇床内酯A。

目前川芎中川芎内酯类成分的分离方法主要有组合色谱法，包括反复硅胶柱层析、ODS柱层析、Sephadex-LH20柱色谱、制备薄层色谱、半制备高效液相色谱等方法，这些方法不仅操作复杂，溶剂用量大，而且在分离过程中有吸附、损失和污染等现象，使整个分离过程效率不高。分离方法还有高速逆流色谱方法，其中刘雯等应用高速逆流色谱法分离到川芎中的Z-藁本内酯和蛇床内酯A。利用高速逆流色谱法同时分离洋川芎内酯N、洋川芎内酯R、洋川芎内酯S和洋川芎内酯I多种川芎内酯的方法未见报道。

发明内容

针对以上问题，本发明的目的在于提供一种操作简单，溶剂用量少，无样品吸附、损失和污染，效率高的川芎内酯的分离方法。高速逆流色谱(High-SpeedCounter-CurrentChromatography,HSCCC)利用溶质在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同，将不同物质进行有效分离。此项技术不需要固相载体，只需要被分离物在两相中分配，避免了固相载体带来的大量样品吸附、损失与污染等问题，样品回收率高，预处理及后处理都简单易行，与其它分离方法相比，它不使用固相载体作固定相，能采用不同的溶剂系统和正反相洗脱方式，克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染、峰形拖尾等缺点。

本发明采用如下技术方案：

本发明的川芎内酯的分离制备方法的具体步骤如下：

(1)川芎提取物的制备：

称取川芎，然后加入5-12倍体积的溶剂，提取，静置，过滤，药渣用上述方法再提取2次，合并提取液，然后在水浴中减压蒸馏回收溶剂，制得川芎提取物浸膏，川芎提取物浸膏用水分散，再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；

(2)高速逆流色谱法分离制备川芎内酯：

两相溶剂系统由A、B、C、D四个组分组成，A组分为烷烃，B组分为脂肪酯或醚，C组份为脂肪醇或脂肪酮，D组分为水，所述的烷烃为正己烷或环己烷，所述的脂肪酯为乙酸乙酯或乙酸甲酯，所述的醚为乙醚或石油醚，所述的脂肪醇为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇；所述脂肪酮为丙酮，所述体系A、B、C、D四个组分的体积比依次为3-5：3-6：4-6：5-6，将该溶剂系统混匀静置后，分开上下相，超声20-40min，溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相，以2-40ml/min的流速将上相泵入管路，待固定相充满整个管路后，停泵，启动主机，然后以0.6-3ml/min的流速泵入流动相，当上下相平衡时，记录固定相流出的体积，计算得到固定相的保留值，取步骤(1)制备的乙酸乙酯萃取物，溶解于固定相中，进样，根据检测器检测谱图，收集各峰的组分，将各峰对应的收集液分别浓缩，干燥。

步骤(1)中所述的提取方法为加热回流提取、闪式提取或者超声提取。

步骤(1)中所述的提取溶剂为甲醇、乙醇、水或者其混合物。

步骤(2)中所述的A组分为正己烷，B组分为乙酸乙酯，C组分为乙醇，D组分为水。

步骤(2)中所述的A组分为环己烷，B组分为石油醚，C组分为乙醇，D组分为水。

步骤(2)中，两相溶剂系统采用正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水体积比为4.5：5.5：4：6。

步骤(2)中，两相溶剂系统临用前分开上下相，超声30min，以溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相，以30ml/min的流速将上相泵入管路，待固定相充满整个管路后，停泵，启动主机，把转速调到892.5r/min，然后以1.2ml/min的流速泵入流动相，进样量为20ml，紫外检测波长为280nm，根据紫外检测谱图，收集各峰的组分，将各峰对应的收集液分别浓缩，干燥。

本发明的积极效果如下：

本发明的川芎内酯的分离制备方法具有操作简单，溶剂用量少，无样品吸附、损失和污染，效率高等优点，本发明的川芎内酯的分离制备方法可一次性分离得到4个川芎内酯类化合物，经检测纯度达98％以上。

附图说明

图1是本发明制备的川芎内酯化合物的紫外检测图谱。

1-川芎内酯N、2-洋川芎内酯R、3-洋川芎内酯S、4-洋川芎内酯I。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

实施例1

(1)川芎提取物的制备：

称取川芎，然后加入5倍体积的乙醇，加热回流提取1h，静置，过滤，药渣用上述方法再提取2次，合并提取液，然后在水浴中减压蒸馏回收溶剂，制得川芎提取物浸膏，川芎提取物浸膏用7倍体积的水分散，再用乙酸乙酯萃取5次，得到乙酸乙酯萃取物；

(2)高速逆流色谱法分离制备川芎内酯：

两相溶剂系统采用正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水体积比为4：5：4：5，临用前分开上下相，超声20min，以溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相，以20ml/min的流速将上相泵入管路，待固定相充满整个管路后，停泵，启动主机，把转速调到860r/min，然后以1ml/min的流速泵入流动相，当上下相平衡时，记录固定相流出的体积，计算得到固定相的保留值，取步骤(1)制备的乙酸乙酯萃取物，溶解于固定相中，进样量为20ml，以1ml/min流速泵入流动相，紫外检测波长为280nm，根据紫外检测谱图，收集各峰的组分，将各峰对应的收集液分别浓缩，干燥。

实施例2

(1)川芎提取物的制备：

称取川芎，然后加入12倍体积的乙醇，加热回流提取3h，静置，过滤，药渣用上述方法再提取2次，合并提取液，然后在水浴中减压蒸馏回收溶剂，制得川芎提取物浸膏，川芎提取物浸膏用13倍体积的水分散，再用乙酸乙酯萃取5次，得到乙酸乙酯萃取物；

(2)高速逆流色谱法分离制备川芎内酯：

两相溶剂系统采用环己烷：乙酸乙酯：乙醇：水体积比为5：6：5：6，临用前分开上下相，超声40min，以溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相，以40ml/min的流速将上相泵入管路，待固定相充满整个管路后，停泵，启动主机，把转速调到950r/min，然后以1.5ml/min的流速泵入流动相，当上下相平衡时，记录固定相流出的体积，计算得到固定相的保留值，取步骤(1)制备的乙酸乙酯萃取物，溶解于固定相中，进样量为20ml，以1.5ml/min流速泵入流动相，紫外检测波长为280nm，根据紫外检测谱图，收集各峰的组分，将各峰对应的收集液分别浓缩，干燥。

实施例3

(1)川芎提取物的制备

取川芎药材1000g，加入按药材8倍体积的95％乙醇，加热回流提取2小时，静置，滤过；药渣用同样方法再提取2次，合并提取液，85℃水浴减压回收溶剂，得川芎提取物浸膏；川芎提取物浸膏用10倍体积水分散后，用乙酸乙酯萃取5次，即得乙酸乙酯萃取物作为供试品。

(2)高速逆流色谱法(HSCCC)分离制备川芎内酯

根据分配系数测定的结果，两相溶剂系统采用环己烷：石油醚：乙醇：水(4.5：5.5：4：6)，临用前分开上下相，超声30min。以溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相，以30ml/min的流速将上相泵入管路，待固定相充满整个管路后，停泵，启动主机，把转速调到892.5r/min，然后以1.2ml/min的流速泵入流动相。当上下相平衡时，记录固定相流出的体积，计算得到固定相的保留值0.68。取供试品0.5921g溶解于20ml固定相中，进样量为20ml，以1.2ml/min流速泵入流动相。紫外检测波长为280nm，根据紫外检测谱图，收集各峰的组分，将各峰对应的收集液分别浓缩，干燥。

(3)川芎内酯结构鉴定

紫外检测图谱如图1所示，分别为洋川芎内酯N、洋川芎内酯R、洋川芎内酯S和洋川芎内酯I，结构式如下：

洋川芎内酯I

淡黄色油状物，易溶于氯仿、甲醇。EI-MSm/z:224,180,165,151,95,77,55。IR(KBr)cm^-1：3394,2966,2937,2877,1749,1684,1635,1456,1419,1248,1030,958,800,669。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)：0.89～1.00(5H,m)，1.45～1.55(2H,m)，1.85～1.94(1H,m)，2.07～2.14(1H,m)，2.33～2.38(2H,m)，2.47～2.60(2H,m)，3.20(1H,s)，3.91～3.97(1H,m)，4.48(2H,d,J＝6.08Hz)，5.29(1H,t)。红外数据3394cm^-1且峰较宽，提示结构中可能含有缔合的羟基；1749cm^-1,1248cm^-1提示结构中可能含有五元环内酯。EI-MS给出分子离子峰m/z224[M]⁺，再根据碎片离子180,165,151,95,77,55推知其为典型的洋川芎内酯I的质谱裂解。查阅文献，数据与文献基本一致，鉴定为洋川芎内酯I(SenkyunolideI)，分子式C₁₂H₁₆O₄。

洋川芎内酯N

淡黄色油状物，易溶于氯仿、甲醇。EI-MSm/z:226[M]⁺，208,182,139,126。IR(KBr)cm^-1:3424,1744,1674,1040.¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ(ppm):0.90(1H,t),1.29～1.32(2H,m),2.02～2.05(2H,m),2.17～2.18(1H,m),3.74(1H,s),4.25(1H,s),4.86(1H,s).EI-MS给出分子离子峰m/z226[M]⁺，再根据碎片离子208,182,139,126推知其为洋川芎内酯N的质谱裂解。查阅文献，数据与文献基本一致，鉴定为洋川芎内酯N(SenkyunolideN)。HR-MSm/z:226.1200(M⁺)。

洋川芎内酯R

淡黄色油状物，易溶于氯仿、甲醇。EI-MSm/z:240[M]⁺,222,211,193,165,148,139,71,57；IR(KBr)cm^-1:3392,1758,1704,1680,1640,1302,1090,1028,966,800。¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ(ppm):0.93(1H,t),1.52～1.59(1H,m),1.90～2.03(1H,m),2.32～2.41(1H,m),3.96(1H,ddd),4.16(1H,d),4.27(1H,d),5.35(1H,d).EI-MS给出分子离子峰m/z240[M]⁺，再根据碎片离子222,211,193,165,148,139,71,57推知其为洋川芎内酯R的质谱裂解。查阅文献，数据与文献基本一致，进一步通过HMQC、HMBC、NOESY及X射线衍射鉴定为洋川芎内酯R(SenkyunolideR)。HR-MSm/z:240.1003[M]⁺。

洋川芎内酯S

淡黄色油状物，易溶于氯仿、甲醇。EI-MSm/z:240[M]⁺,222,211,193,165,148,139,71,57；IR(KBr)cm^-1:3392,1758,1704,1680,1640,1302,1090,1028,966,800。¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ(ppm):0.93(1H,t),1.52～1.61(1H,m),1.91～2.03(1H,m),2.33～2.41(1H,m),3.96(1H,ddd),4.16(1H,d),4.28(1H,d),5.34(1H,d).EI-MS给出分子离子峰m/z240[M]⁺，再根据碎片离子222,211,193,165,148,139,71,57推知其为洋川芎内酯R的质谱裂解。查阅文献，数据与文献基本一致，进一步通过HMQC、HMBC、NOESY及X射线衍射，鉴定为洋川芎内酯R(SenkyunolideR)。HR-MSm/z:240.1003[M]⁺

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种川芎内酯的分离制备方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：

(1)川芎提取物的制备：

(2)高速逆流色谱法分离制备川芎内酯：

2.如权利要求1所述的川芎内酯的分离制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的提取方法为加热回流提取、闪式提取或者超声提取。

3.如权利要求1所述的川芎内酯的分离制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的提取溶剂为甲醇、乙醇、水或者其混合物。

4.如权利要求1所述的川芎内酯的分离制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的A组分为正己烷，B组分为乙酸乙酯，C组分为乙醇，D组分为水。

5.如权利要求1所述的川芎内酯的分离制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的A组分为环己烷，B组分为石油醚，C组分为乙醇，D组分为水。

6.如权利要求4所述的川芎内酯的分离制备方法，其特征在于：步骤(2)中，两相溶剂系统采用正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水体积比为4.5：5.5：4：6。

7.如权利要求5所述的川芎内酯的分离制备方法，其特征在于：步骤(2)中，两相溶剂系统采用正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水体积比为4.5：5.5：4：6。

8.如权利要求1所述的川芎内酯的分离制备方法，其特征在于：步骤(2)中，两相溶剂系统临用前分开上下相，超声30min，以溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相，以30ml/min的流速将上相泵入管路，待固定相充满整个管路后，停泵，启动主机，把转速调到892.5r/min，然后以1.2ml/min的流速泵入流动相，进样量为20ml，紫外检测波长为280nm，根据紫外检测谱图，收集各峰的组分，将各峰对应的收集液分别浓缩，干燥。