CN103627678A - 一种猪伪狂犬病病毒变异株prv-zj01及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及猪伪狂犬病毒技术领域,特别涉及一种猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01,其保藏号为CGMCCNo.8170。所述的猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01在制备疫苗中的应用。采用PRV-ZJ01株病毒液制成水溶性灭活疫苗,与Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗进行猪体免疫保护试验,结果表明,ZJ01毒株灭活疫苗安全性较好,免疫保护效率明显高于Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗免疫组,Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗对ZJ01超强毒株不能提供完全保护。ZJ01灭活疫苗对PRV变异株和传统毒株均有较好免疫保护作用。PRV-ZJ01株106.0TCID50/mL滴鼻感染85日龄非免疫猪,可致全部发病和死亡。证明该病毒株毒力明显增强,抗原性发生变异,灭活后具有较好免疫原性,可用于该病疫苗和诊断方法研究与开发。
Description
技术领域
本发明涉及猪伪狂犬病毒技术领域,特别涉及一种猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01,还涉及猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01的应用。
背景技术
伪狂犬病毒(PRV)属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科成员,可引起新生仔猪中枢神经系统紊乱,生长猪呼吸道症状,并能导致妊娠母猪流产、死胎与弱仔。美国与部分欧洲国家已宣布消灭和根除该病。我国广泛使用该病基因缺失弱毒疫苗有效控制并逐步净化。但是,自2011年底起,我国很多该病免疫猪场相继出现仔猪呕吐和神经症状、生长猪出现呼吸道症状,死亡率明显增高,妊娠母猪出现流产、死胎、弱仔等,造成严重经济损失,但对流行毒株的致病性和抗原性均不清楚。
发明内容
为了解决以上现有技术中存在的疫情不能得到有效控制的问题,本发明提供了一种猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01。
本发明还提供了所述猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01在制备免疫疫苗的应用。
本发明是通过以下步骤得到的:
一种猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01,其保藏号为CGMCC No.8170。采用106.0TCID50滴鼻感染85日龄健康猪,非免疫猪全部发病和死亡。
所述的猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01在制备疫苗中的应用。
优选所述疫苗为水溶性灭活疫苗。
疫苗的制备过程为:取PRV-ZJ01病毒液灭活,加入卡波姆佐剂混合均匀即得。病毒液中病毒含量为107.0TCID50/mL。
疫苗中病毒抗原含量大于106.0TCID50/mL。
本研究采集我国某发病猪群患病仔猪脑组织病料,无菌处理后接种BHK21细胞,盲传2代,培养2~3天出现明显细胞病变,病毒空斑纯化3次后连续传代15次,均出现相同病变,病毒TCID50为10-7.5/mL,PCR鉴定为PRV,命名为PRV-ZJ01毒株。病毒gE和gB基因序列测定结果显示其与其他已公布的毒株序列同源性分别为97.1%~99.6%和98.1%~99.5%,其gE基因推导的氨基酸序列在第54和448位发生D-I和V-I突变,第496位插入D。采用10头24日龄仔猪进行人工感染发病试验,结果显示,该分离株可引起PRV典型临床症状和病理变化,100%死亡。采用24头85日龄健康育肥猪滴鼻接种102 .0TCID50 ~106.0 TCID50 PRV-ZJ01株病毒液,结果为,攻毒组猪均出现发热,精神沉郁,呕吐,咳嗽,呼吸困难和神经症状等典型症状,106.0 TCID50病毒感染组猪在攻毒后7天内全部死亡,病毒LD50为103.13 TCID50/mL。该毒株与50份Bartha-K61、Bucharest、HB-98疫苗毒株血清及其抗血清交叉中和试验,结果显示,该分离毒株抗原发生明显变异,变异系数R值为0.378~0.448,首次证明PRV-ZJ01毒株为PRV超强毒抗原变异毒株,属于血清2亚型超强毒株。
本发明的有益效果:采用PRV-ZJ01株病毒液(106.0TCID50/mL)制成水包油型灭活疫苗,与Bartha-K61活疫苗进行猪体免疫保护试验,结果表明,ZJ01毒株灭活疫苗安全性较好,免疫保护效率明显高于Bartha-K61活疫苗免疫组,Bartha-K61活疫苗对ZJ01超强毒株不能提供完全保护。证明该病毒株具有较好免疫原性,可用于该病疫苗和诊断方法研究与开发。
菌株保藏信息
保藏时间:2013年9月18日,
保藏单位:中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),
保藏编号:CGMCC No.8170,
保藏单位地址:中国科学院微生物研究所,北京市朝阳区北辰西路1号院3号,
分类命名:猪伪狂犬病毒。
附图说明
图1. PRV-ZJ01的分离与PCR鉴定,其中A为病毒感染BHK-21细胞形成的细胞病变;B为病毒感染BHK21细胞形成的空斑;C为分离病毒株PCR检测(1-4泳道为F1,F5,F10与F15代次病毒,第5泳道为细胞对照)。
图2. 24日龄仔猪攻毒后不同时间仔猪死亡统计结果;
图3上两行图片为24日龄仔猪攻毒后死亡猪肉眼病变观察结果,下两行为24日龄仔猪攻毒后死亡猪病理组织学观察结果,其中,a为肝脏;b为脑;c为肺脏;d为脾脏;e为肾脏;f为淋巴结;
图4为24日龄仔猪攻毒后2周不同组织中PRV核酸定量检测结果;
图5为 85日龄猪攻毒后不同时间猪死亡统计结果;
图6上两行为攻毒后死亡猪肉眼病变观察结果;下两行为攻毒后死亡猪病理组织学观察结果,其中a为肝脏;b为脑;c为肺脏;d为脾脏;e为肾脏;f为淋巴结;
图7为85日龄猪攻毒后2周不同组织中PRV核酸定量检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明:
实施例1
1. 病毒分离与PCR鉴定
将采集的发病猪的脑组织剪碎混浆处理(组织与灭菌PBS重量体积比为1:10),12000rpm离心10 min取上清经0.22μm 滤器过滤用于病毒的分离。将1mL过滤的病料上清接种刚长满单层的BHK-21细胞,37℃孵育1h后弃去培养瓶中液体并加入2% DMEM于含5% CO2的37℃细胞培养箱中培养,每天观察细胞是否出现病变。待70%细胞出现病变后,反复冻融3次,接种BHK21细胞。病毒空斑纯化3次,采用PRV PCR方法扩增gE基因,反应体系:1 U AccuPrimeTM pfx DNA Polymerase 与2.5μL 10×AccuPrimeTM pfx Mix (Invitrogen),上下游引物各10 pmol,DNA模板100ng,灭菌双蒸水补足50μL。PCR反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性45s,62℃退火45s,68℃延伸3 min,上述3步骤进行35个循环;68℃后延伸7 min。PCR产物经1%琼脂糖电泳分析。
结果为:病料组织无菌处理后接种长满单层的BHK-21细胞,20h后出现特征性细胞病变,表现为细胞变圆,折光性变强,形成形态各异的合胞体(图1A),并可以形成空斑(图1B)。病毒经3次空斑纯化,连继传代15次,病毒TCID50为107.5/mL,PCR检测F1,F5,F10与F15代细胞毒,均扩增出目的条带188bp(图1C),证明该分离株属于PRV,毒株命名为ZJ01。
株基因序列测定与分析
采用PCR方法扩增gE与gB基因,反应体系同上。PCR产物经1%琼脂糖电泳分析,回收目的片段,克隆至载体pEASYTM-Blunt Zero (TransGen),进行基因测序分析。结果为:新分离毒株的这两个基因与其他已公布的PRV毒株序列同源性分别为97.1%~99.6%和98.1%~99.5%。基因进化树分析图中,新分离株位于一个相对独立的分支中。gE基因推导的氨基酸序列比对发现,新分离株与大多数毒株相比,在54与448位发生了54位(D-I)与448(V-I)突变,在第496位插入D。
日龄仔猪致病性试验
选择PRV阴性的24日龄仔猪10头,随机分成两组,每组5头,第1组每头猪滴鼻接种106.0 TCID50 PRV-ZJ01株病毒液(F5),对照组滴鼻接种等量细胞营养液作为对照。隔离饲养,自由采食。每天观察实验猪发病症状(如精神萎靡,食欲不振,发热,神经症状,呼吸道症状与死亡等),对死亡猪系统解剖后采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结与脑组织冷冻保存,并将上述组织于4%多聚甲醛固定,制备组织切片,进行组织病理学检查,同时用荧光定量PCR方法检测各组中PRV核酸含量。见图2-4。
结果为:(1)仔猪攻毒后2天即出现发热(>41℃),精神沉郁、呕吐、咳嗽、呼吸困难和神经症状等临床表现,所有攻毒组仔猪在5天内全部死亡,而对照组全部健活,见图2。(2)肉眼病变为:脾脏与肝脏表面出现白色坏色点,脑组织水肿,肺脏纹理增强,肾脏表面有出血点,淋巴结肿大出血。(3)组织病变为:肝细胞变性坏死,脾细胞坏死,肺脏间质性肺炎、上皮细胞坏死,肾脏出血,淋巴结坏死、出血,非化脓性脑炎(“卫星现象”,“噬神经元现象”且在高倍镜下可见病毒包涵体)。见图3,。(4)PRV DNA 载量均在肺脏中最多,其次是脑组织,见图4。
日龄育肥猪致病性试验
选择PRV阴性的24头85日龄健康猪,随机分成6组,每组4头,其中第1-5组为攻毒组,每头猪分别滴鼻接种102 .0TCID50 ~106.0 TCID50 PRV-ZJ01株病毒液,第6组为对照组,滴鼻接种等量细胞营养液。自由采食,隔离饲养,观察2周,记录发病症状与死亡情况,按Reed-Muench法计算LD50。同时,取死亡猪和试验结束时猪,进行剖检,观察肉眼病变,并取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结与脑组织冷冻保存,并将上述组织于4%多聚甲醛固定,制备组织切片,进行组织病理学检查。同时,用荧光定量PCR方法检测各组中PRV核酸含量。见图5-7.
结果为:攻毒组实验猪均出现发热(>41℃),精神沉郁,咳嗽,呼吸困难,神经症状与死亡等临床表现,106.0 TCID50病毒组在攻毒后7天内全部死亡,对照组全部健活。见图5。病毒对85日龄猪LD50为103.13 TCID50/mL。肉眼病变与24日龄攻毒仔猪相似,主要为:脾脏边缘出血,肝脏表面出现局灶性坏死,肾脏、淋巴结、肺脏与脑组织。组织病变为:肝细胞变性坏死,脾脏出血,肺脏间质性肺炎,肾脏出血,淋巴结坏死,非化脓性脑炎(“袖套现象”)。见图6.PRV DNA 载量均在肺脏中最多,其次是脑组织。见图7。
病毒血清交叉中和试验
选择PRV阴性的30日龄健康猪50头,随机分成5组,每组10头,第1组肌肉注射102 .0TCID50 PRV-ZJ01株病毒液,第2-5组按说明书分别接种4种PRV疫苗,即Bartha-K61清伪灵(LT 1205476,辉瑞)、Bartha-K61 (LT 20120602,武汉中博)、Bucharest扑伪佳(LTA289184,辉瑞)、HB-98株(LT 121041,武汉科前)。免疫后4-5周采集血液,分离血清,抗血清56℃水浴30min灭活处理,用于病毒血清交叉中和试验。血清倍比稀释后分别与100 TCID50 原免疫病毒和ZJ01毒株混合,37℃孵育1h,每个血清稀释度设置4个重复。接种96孔板BHK-21细胞单层,100μL/孔,置5% CO2细胞培养箱37℃培养4d,于显微镜下观察细胞病变CPE,记录病变孔数目。按照Reed-Muench法计算中和抗体效价。运用SPSS 16.0 软件进行统计分析。并采用以下公式计算R值。结果见表1,
ZJ01毒株与Bartha-K61、Bucharest和HB-98株的R值分别为:0.378-0.448,证明PRV-ZJ01毒株为新的血清亚型,定义为血清2亚型。Bartha-K61、Bucharest和HB-98株疫苗免疫仔猪抗体不能有效中和ZJ01毒株感染。
表1 PRV不同毒株免疫猪血清交叉中和抗体效价
6. 灭活疫苗制备与免疫保护试验
采用PRV-ZJ01株病毒液(107.0TCID50/mL),用0.02%甲醛灭活后加入20%卡波姆佐剂混合均匀,疫苗中灭活病毒的含量是106.0TCID50/mL,制成水溶性灭活疫苗。选择PRV阴性的28-30日龄健康仔猪15头,随机分成3组,每组5头,第1组肌肉注射PRV-ZJ01株灭活疫苗,1mL/头,第2组按说明书接种Bartha-K61清伪灵(LT 1205476,辉瑞)。免疫后4周,采集血液分离血清,检测gE、gB-ELISA抗体,并用ZJ01毒株测定中和抗体效价。采血后所有猪采用滴鼻方法攻击PRV-ZJ01株病毒液(106.0TCID50/mL),隔离饲养观察2周。每天观察实验猪发病症状(如精神萎靡,食欲不振,发热,神经症状,呼吸道症状与死亡等,并取发病死亡猪脑组织检测PRV核酸,计算免疫保护效率。
结果见表2,所有猪接种后精神和食欲正常。免疫后4周,ZJ01毒株灭活疫苗免疫组血清中和抗体效价平均值1:36.5,明显高于Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗免疫组。免疫后采用ZJ01毒株攻击,ZJ01毒株灭活疫苗免疫组免疫保护效率达100%,Bartha-K61活疫苗免疫组均有4-5头发病,表现体温升高(>40.5℃),精神沉郁,腹泻和呼吸困难,对照组攻毒后全部发病并死亡,脑组织PCR检测PRV阳性,表明ZJ01毒株灭活疫苗免疫保护效率明显高于Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗免疫组。Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗对ZJ01超强毒株不能提供完全保护。
表2 PRV-ZJ01毒株灭活疫苗免疫保护试验结果
*分母为该组猪总数,分子为检测阳性数;# 中和抗体效价的倒数;**分母为该组猪总数,分子为发病数或死亡数。
灭活疫苗对PRV不同强毒株的交叉免疫保护作用
取4头怀孕80~90天母猪(PRV gB和gE抗体阴性),分成2组,每组2头,第1组接种上述得到的PRV-ZJ01灭活疫苗,肌肉注射,2mL/头,间隔3周后相同方法加强免疫一次。第2组不免疫对照,隔离饲养,观察母猪健康和产仔情况。
取各组母猪后代21日龄健康仔猪10头,采血分离血清,采用IDEXX PRV gB-ELISA和gE-ELISA抗体检测试剂盒检测gB和gE抗体,并将各组仔猪10头再随机分为2组,共计4个组,即ZJ01灭活疫苗免疫组1-1和1-2、非免疫对照组3-1和3-2,每组5头,隔离饲养,第1-1和3-1组采用PRV-ZJ01细胞毒(106.0 TCID50/mL)攻击,滴鼻1mL/头。第1-2和3-2组采用PRV传统株LA细胞毒(106.0 TCID50/mL)攻击,滴鼻1mL/头。攻毒后观察临床表现,死亡猪和明显发病猪采集脑组织冷冻保存,用PCR方法检测PRV核酸,判定疫苗免疫保护效率。
结果为:母猪接种ZJ01灭活疫苗后,没有任何异常反应,产仔正常,健仔数与非免疫母猪组相似,分别为21/22和22/24(健仔数/总仔数)。ZJ01灭活疫苗免疫母猪后代21日龄时PRV gB和gE抗体均为阳性。PRV-ZJ01攻击后3-10天,对照组出现呕吐和神经症状等明显临床症状,并全部死亡,ZJ01灭活疫苗组无明显临床症状。PRV传统毒株LA攻击后4-14天,对照组均出现明显临床症状,死亡2头,ZJ01灭活疫苗免疫组仔猪均无明显异常。所有发病猪和病死猪脑组织用PCR方法检测PRV均为阳性(见表3),证明ZJ01灭活疫苗对PRV变异株和传统毒株均有较好免疫保护作用。
表3 ZJ01灭活疫苗对PRV传统毒株攻毒交叉保护试验结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受实施例的限制,其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01,其保藏号为CGMCC No.8170。
2.一种权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01在制备疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于所述疫苗为水溶性灭活疫苗。
4.根据权利要求2或3所述的应用,其特征在于疫苗的制备过程为:取含有PRV-ZJ01病毒的病毒液,灭活,加入佐剂混合均匀即得。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于病毒液中病毒含量为107.0TCID50/mL。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的应用,其特征在于疫苗中病毒抗原含量大于 106.0TCID50/mL。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的应用,其特征在于所述病毒液与佐剂的重量比为4:1。
8.根据权利要求4-6中任一项所述的应用,其特征在于所述佐剂为卡波姆。
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