CN102459325A - 胃抑胜肽受体活化的胰高血糖素化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有增加胃抑胜肽(GIP)活性的胰高血糖素胜肽，其可选择的具有胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及/或胰高血糖素活性。在某些实施例中，本发明提供包含有实际上与天然胰高血糖素相似的羧基端延伸的胰高血糖素胜肽。

Description

胃抑胜肽受体活化的胰高血糖素化合物
技术领域
本发明提供了一种胰高血糖素胜肽类似物，其对于胃抑胜肽受体(GIP)显现促效剂(agonist)活性。同时于本文中提出了使用该类似物的方法。
背景技术
胰高血糖素前原(pre-proglucagon)是一种具有158个氨基酸的前体多肽，其在不同组织中经处理而形成的许多不同的胰高血糖素原(proglucagon)的衍生肽，包括：胰高血糖素(glucagon)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)及调酸素(OXM；oxyntomodulin)，其参与多样生理功能，包括葡萄糖体内平衡、胰岛素分泌、胃排空、及肠道生长、以及食物摄取量调节。胰高血糖素(Glucagon)是对应于胰高血糖素前原由33至61位氨基酸组成的含29个氨基酸的胜肽，而胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是经产生为对应于胰高血糖素前原由72至108位氨基酸组成的含37个氨基酸的胜肽。胰高血糖素样肽-1(7-36)酰胺或胰高血糖素样肽-1(7-37)酸是胰高血糖素样肽-1的生物有效形式，其主要对胰高血糖素样肽-1受体展现相等的活性。
当血糖值降得太低时而不能提供足够能量供身体活动时，会发生低血糖症。在成人或超过10岁大的孩童中，低血糖症除了作为糖尿病治疗的副作用出现外，并不常见，但其会由其他的药物治疗或疾病、激素或酵素缺乏、或肿瘤所引起。当血糖开始下降时，胰高血糖素(一种由胰脏所产生的激素)会对肝脏发出分解肝糖(glycogen)及释放葡萄糖的信号，导致血糖值朝向正常值上升。因此，胰高血糖素在葡萄糖调节中所扮演之一般角色是为抗衡胰岛素的作用及维持血糖值。然而，对于糖尿病患，此胰高血糖素对低血糖症的反应可能受损，而使得葡萄糖值更难回到正常范围。
低血糖症是一种需要立即医疗而威胁生命的事件。施予胰高血糖素是为一种已确定的用于治疗急性低血糖症的药物疗法，且其是可在给药的数分钟内恢复正常葡萄糖值。当将胰高血糖素用于低血糖症的急性医疗时，将结晶形态的胰高血糖素用稀酸缓冲液溶解，且以肌内注射该溶液。虽然此治疗有效，但此方法对于意识不清的人士而言麻烦且危险。因此，需要有一种胰高血糖素类似物，其可维持或超越母分子的生物效能但在相关的生理条件下可充分溶解且稳定，且可预先调配为溶液，并且能够立即注射。
此外，糖尿病患者被鼓励要维持接近正常的血糖值，以延缓或预防微血管并发症。此目标的达成通常需要密集的胰岛素治疗。在努力达成此目标时，医师已遭遇的糖尿病患中的低血糖症频率及严重度大量增加。因此，需要比目前的胰岛素疗法更不易诱导低血糖症的用于治疗糖尿病的改良药物及方法。
胰高血糖素样肽-1具有与胰高血糖素不同的生物活性。其作用包括：刺激胰岛素合成及分泌、抑制胰高血糖素分泌，以及抑制食物摄取量。胰高血糖素样肽-1已证实可降低糖尿病患中的高血糖症(升高的葡萄糖值)。促胰岛素分泌素-4(exendin-4)，是一种来自蜥蜴毒液(lizard venom)的与GLP-1共有约50％氨基酸相似度的胜肽，其是可活化GLP-1受体且同样已证实可降低糖尿病患中的高血糖症。
也证实胰高血糖素样肽-1及促胰岛素分泌素-4可降低食物摄取量及促进减重，其是一种不仅对糖尿病患，且亦对罹患肥胖症的病患有益的效果。肥胖症的病患有较高的糖尿病、高血压、高脂血症、心血管疾病、及肌肉骨骼疾病的患病风险。
因此，有需要用于治疗糖尿病及肥胖症的替代且较佳的经改良的方法。
发明内容
如本文所述，本发明是提供一种胰高血糖素胜肽类似物，其对于胃抑胜肽受体(GIP)显现促效剂(agonist)活性。同时于本文提出使用所述类似物的方法。
天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)不会活化胃抑胜肽受体，且天然胰高血糖原本于胃抑胜肽受体显现0％(例如：小于0.001％、0.0001％)的天然胃抑胜肽活性。天然胰高血糖素对于胰高血糖素样肽-1受体，具有约1％天然胰高血糖素样肽-1活性。如本文所述对该天然胰高血糖素序列(SEQ ID NO：1)的修饰产生胰高血糖素胜肽类似物，其是可显现与天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)活性相等或更佳的有效胰高血糖素活性，与天然胃抑胜肽(SEQ ID NO：675)活性相等或更佳的有效胃抑胜肽活性，及/或与天然胰高血糖素样肽-1、胰高血糖素样肽-1(7-36)酰胺(SEQ ID NO：52)或胰高血糖素样肽-1(7-37)酸(SEQ ID NO：50)的活性<是胰高血糖素样肽-1的生物有效形式，证实基本上对胰高血糖素样肽-1受体相等的活性>相等或更佳的有效胰高血糖素样肽-1活性。如本文所述的数据证实具有胃抑胜肽活性及胰高血糖素样肽-1活性的胰高血糖素类似物对于导致体重降低或预防体重增加，以及治疗高血糖症，包括糖尿病，特别有效。鉴于先前技术的启示，即拮抗胃抑胜肽为降低日常食物摄取量及体重，并增加胰岛素敏感性及能量消耗，该活性并未特别地被预期。(Irwin et al.，Diabetologia 50：1532-1540(2007)；and Althage et al.，J Biol Chem，e-publication onApril 17，2008).。
因此，在某些实施例中，该胰高血糖素类似物为100nM或更少，或约：75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1nM或更少时，显现对胃抑胜肽受体活化活性的EC50值。在某些实施例中，本文所述的类似物为约0.001nM、0.01nM或0.1nM的胃抑胜肽受体显现一EC50值。在某些实施例中，本文所述的类似物为不超过1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、8nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、40nM、50nM、75nM、或100nM的胃抑胜肽受体显现一EC50值。在某些实施例中，该类似物为100nM或更少，75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1nM或更少时，显现对胰高血糖素受体活化的EC50值。在某些实施例中，本文所述的类似物为约0.001nM、0.01nM或0.1nM的胰高血糖素受体显现一EC50值。在某些实施例中，该于胰高血糖素受体的EC50值不超过1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、8nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、40nM、50nM、75nM、或100nM。在某些实施例中，该类似物显现约100nM或更少，或约：75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1nM或更少的对胰高血糖素样肽-1受体活化的EC50值。在某些实施例中，本文所述的类似物为约0.001nM、0.01nM或0.1nM的胰高血糖素样肽-1受体显现一EC50。在某些实施例中，该于胰高血糖素样肽-1的EC50值不超过1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、8nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、40nM、50nM、75nM、或100nM。受体活化是通过体外(in vitro)测定法而测得，其是在HEK293细胞中过度表达该受体以测试cAMP的诱导，例如：测定的HEK293细胞与DNA编号的受体共同转染，且具连接至如实施例14所述的cAMP应答元件(responsive element)的一荧光素酶基因(luciferase gene)。
在某些实施例中，该类似物于胃抑胜肽受体相对于天然胃抑胜肽(胃抑胜肽效能)显现至少约0.005％、0.0075％、0.01％、0.025％、0.05％、0.075％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、100％、125％、150％、175％或200％或更高的活性。在某些实施例中，本文所述的类似物于胃抑胜肽受体相对于天然胃抑胜肽显现不超过约100％、1000％、10,000％、100,000％，或1,000,000％的活性。在某些实施例中，该类似物于胰高血糖素受体相对于天然胰高血糖素(胰高血糖素效能)显现至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％或更高的活性。在某些实施例中，本文所述的类似物于胰高血糖素受体相对于天然胰高血糖素显现不超过约100％、1000％、10,000％、100,000％，或1,000,000％的活性。在某些实施例中，该类似物于胰高血糖素样肽-1受体相对于天然胰高血糖素样肽-1(胰高血糖素样肽-1效能)显现至少约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、100％、125％、150％、175％或200％或更高的活性。在某些实施例中，本文所述的类似物于胰高血糖素样肽-1受体相对于天然胰高血糖素样肽-1显现不超过约100％、1000％、10,000％、100,000％，或1,000,000％的活性。
在特定实施例中，如本文所述的类似物及胰高血糖素胜肽，当缺少亲水性基团时，例如：聚乙二醇(PEG)，显现标示％的活性，然而，当包含亲水性基团时，例如：聚乙二醇(PEG)，显现一降低％的活性(例如：约10倍降低的活性)。因此，在某些实施例中，该类似物在缺少亲水性基团时显现前述％活性程度，并在包含亲水性基团时，显现一约10倍降低的活性。一类似物于一受体相对于该受体之一天然配体的活性，其是以该类似物对天然配体两者的EC50取倒数计算。
因此，本发明一方面提供可于胰高血糖素受体及胃抑胜肽受体显现活性的类似物(胰高血糖素/胃抑胜肽共同促效剂(co-agonist))。此类类似物缺少天然胰高血糖素的选择性(其是胰高血糖素受体相对于胃抑胜肽受体的选择性)。在某些实施例中，该类似物于胃抑胜肽受体的EC50，与其于胰高血糖素受体的EC50不同，是少于约50倍、40倍、30倍或20倍(较高或较低)。在某些实施例中，该类似物的胃抑胜肽效能，与其于胰高血糖素效能不同，是少于约500倍、450倍、400倍、350倍、300倍、250倍、200倍、150倍、100倍、75倍、50倍、25倍、20倍、15倍、10倍或5倍(较高或较低)。在某些实施例中，该类似物于胃抑胜肽受体的EC50除以该类似物于胰高血糖素受体的EC50的比值，约少于100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施例中，于胃抑胜肽受体的EC50除以胰高血糖素受体的EC50的比值，约为1或少于1(例如：约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在某些实施例中，该类似物胃抑胜肽效能相较于该类似物胰高血糖素效能的比值，约少于500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施例中，于胃抑胜肽受体的效能除以于胰高血糖素受体的效能的比值，约为1或少于1(例如：约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在某些实施例中，胰高血糖素样肽-1活性是可显著地降低或破坏，例如：通过第7号位置的氨基酸修饰，如：取代异亮氨酸(Ile)，羧基端至第27号或第28号位置的删除，产生27-或28-氨基酸胜肽，或其组合。
本发明的另一方面提供于胰高血糖素、胃抑胜肽及胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1 receptor)(胰高血糖素/胃抑胜肽/胰高血糖素样肽-1三重促效剂(tri-agonist)显现活性的类似物。此类类似物会损失天然胰高血糖素的选择性(其是胰高血糖素受体相对于胰高血糖素样肽-1及胃抑胜肽受体的选择性)。在某些实施例中，该类似物于胃抑胜肽受体的EC50，分别与其于胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1受体的EC50不同，是约少于5000倍、2500倍、1000倍、750倍、500倍、250倍、100倍、50倍、40倍、30倍或20倍(较高或较低)。在某些实施例中，该类似物的胃抑胜肽效能，与其于胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1效能不同，是少于约1000倍、750倍、500倍、450倍、400倍、350倍、300倍、250倍、200倍、150倍、100倍、75倍、50倍、25倍、20倍、15倍、10倍或5倍(较高或较低)。在某些实施例中，三重促效剂于胃抑胜肽受体的EC50除以三重促效剂于胰高血糖素样肽-1受体的EC50的比值，约少于10,000、7500、5000、2500、1000、750、500、250、100、75、60、50、40、30、20、15、10、5或1。在某些实施例中，于胰高血糖素样肽-1受体的EC50除以于胃抑胜肽受体的EC50的比值，约为5、4、3、2或1，或少于1(例如：少于约0.00001、0.0001、0.001、0.0025、0.005、0.0075、0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在某些实施例中，于胰高血糖素样肽-1受体的EC50大于约0.1(例如：大于约0.25、0.75、1)。在某些实施例中，三重促效剂于胃抑胜肽受体的效能除以三重促效剂于胰高血糖素样肽-1受体的效能的比值，约1000、750、500、250、100、75、60、50、40、30、20、15、10、5或1。在某些实施例中，于胃抑胜肽受体的效能除以于胰高血糖素样肽-1受体的效能的比值，约为5、4、3、2或1，或少于1(例如：少于约0.0001、0.001、0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在相关实施例中，三重促效剂于胃抑胜肽受体的EC50除以三重促效剂于胰高血糖素受体的EC50的比值，约少于100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施例中，于胃抑胜肽受体的EC50除以胰高血糖素受体的EC50的比值，约为1或少于1(例如：约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在某些实施例中，该三重促效剂的胃抑胜肽效能相较于该三重促效剂的胰高血糖素效能的比值，约少于500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施例中，于胃抑胜肽受体的效能除以于胰高血糖素受体的效能的比值，约为1或少于1(例如：约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在某些实施例中，三重促效剂于胰高血糖素样肽-1的EC50除以三重促效剂于胰高血糖素受体的EC50的比值，约少于100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施例中，于胰高血糖素样肽-1的EC50除以胰高血糖素受体的EC50的比值，约为1或少于1(例如：约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在某些实施例中，三重促效剂的胰高血糖素样肽-1效能除以三重促效剂的胰高血糖素效能的比值，约少于100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施例中，于胰高血糖素样肽-1受体的效能除以于胰高血糖素受体的效能的比值，约为1或少于1(例如：约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。
本发明的又另一方面提供于胰高血糖素样肽-1受体及胃抑胜肽受体显现活性，但其中胰高血糖素活性是显著地降低或破坏(胃抑胜肽/胰高血糖素样肽-1共同促效剂)的类似物，例如：第3号位置氨基酸修饰。举例来说：此位置取代为酸性、碱性或疏水性氨基酸(谷氨酸、鸟氨酸、亮氨酸)而降低胰高血糖素的活性。在某些实施例中，该类似物于胃抑胜肽受体的EC50，与其于胰高血糖素样肽-1受体的EC50不同，是约少于1000倍、750倍、500倍、250倍、100倍、50倍、40倍、30倍或20倍(较高或较低)。在某些实施例中，该类似物的胃抑胜肽效能，与其胰高血糖素样肽-1效能不同，是少于约1000倍、750倍、500倍、250倍、100倍、25倍、20倍、15倍、10倍或5倍(较高或较低)。在某些实施例中，此类类似物于胰高血糖素受体具有约10％或更少的天然胰高血糖素活性，例如：约1至10％，或约0.1至10％，或大于约0.1％但小于约10％。在某些实施例中，该类似物于胃抑胜肽受体的EC50除以该类似物于胰高血糖素样肽-1受体的EC50的比值，约少于100、75、60、50、40、30、20、15、10或5，且不少于1。在某些实施例中，该类似物的胃抑胜肽效能相较于该类似物的胰高血糖素样肽-1的比值，约少于100、75、60、50、40、30、20、15、10或5，且不少于1。在某些实施例中，于胰高血糖素样肽-1受体的EC50除以于胃抑胜肽受体的EC50的比值，约为5、4、3、2或1，或少于1(例如：少于约0.00001、0.0001、0.001、0.0025、0.005、0.0075、0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在某些实施例中，共同促效剂的胃抑胜肽效能除以共同促效剂的胰高血糖素样肽-1效能，约1000、750、500、250、100、75、60、50、40、30、20、15、10、5或1。在某些实施例中，于胃抑胜肽受体的效能除以于胰高血糖素样肽-1受体的效能的比值，约为5、4、3、2或1，或少于1(例如：少于约0.0001、0.001、0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。
本发明的另一方面提供于胃抑胜肽受体显现活性，其胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1活性显著地降低或破坏(「胃抑胜肽促效剂胰高血糖素胜肽」)的类似物，例如第3及7号位置的氨基酸取代。在某些实施例中，此类类似物于胰高血糖素受体具有约10％或更少的天然胰高血糖素活性，例如：约1至10％，或约0.1至10％，或大于约0.1％、0.5％或1％，但小于约1％、5％或10％。在某些实施例中，此类类似物于胰高血糖素样肽-1受体具有约10％或更少的天然胰高血糖素样肽-1活性，例如：约1至10％，或约0.1至10％，或大于约0.1％、0.5％或1％，但小于约1％、5％或10％。
在本发明的某些方面，于胃抑胜肽受体显现促效剂活性的类似物包含有SEQ IDNO：1，是具有至少一个氨基酸修饰以及一种延伸，其是由1至21个氨基酸(例如：5至18、7至15、9至12个氨基酸)的羧基端至类似物第29号位置的氨基酸。
在特定实施例中，该类似物包含至少一个氨基酸修饰并高达15个(例如：不超过15个，不超过10个氨基酸修饰)。举例来说，该类似物包含有SEQ ID NO：1，具1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸修饰。在特定实施例中，该类似物包含至少一个氨基酸修饰，高达10个氨基酸修饰以及额外的保留性氨基酸修饰。于又一方面，该至少一个的氨基酸修饰是赋予稳定类似物羧基端部分中一稳定化的α螺旋结构。达成稳定化的α螺旋结构的修饰是如本文所述。请参见，例如，在「α螺旋结构的稳定/分子内架桥」章节中的教学。
包含有一酰基化或烷基化羧基端延伸或一包括1至6个带正电氨基酸羧基端延伸的类似物，意外地于胃抑胜肽受体显现增加的促效剂活性。因此，在特定实施例中，该延伸的氨基酸至少一个，是位于第37至43号位置中任何位置(根据SEQ ID NO：1的编号)包含有：酰基或烷基，其中该酰基或烷基对自然发生的氨基酸来说是非自然的，即该延伸酰基化或烷基化。在某些实施例中，该酰基或烷基是直接连接至氨基酸，例如：通过氨基酸侧链。在其他实施例中，该酰基或烷基是可通过间隔物(例如：单一氨基酸、双肽、三肽、亲水性双功能间隔物、疏水性双功能间隔物)连接至酰基或烷基。适合包含酰基或烷基的氨基酸，也适合如本文所述的酰基及烷基。请参见，例如标题为「酰基化及烷基化」章节中的教学。
在其他实施例中，延伸的1至6个氨基酸(例如：1至2个、1至3个、1至4个、1至5个氨基酸)为带正电氨基酸，例如：化学式IV的氨基酸，如：赖氨酸。如本文所使用的术语：「带正电氨基酸(positive-charged amino acid)」是指包含在生理pH下(例如：pH 6.8至8.0，pH 7.0至7.7)的任何自然生成或非自然生成，在其侧链原子上带正电的氨基酸。在特定方面，该带正电氨基酸是位于第37、38、39、40、41、42及43号位置中任何位置。在特定实施例中，该带正电氨基酸是位于第40号位置。
在其他实施例中，该延伸中是如本文所述经酰基化或烷基化，并包含如本文所述的1至6个带正电氨基酸。
在又一实施例中，该胃抑胜肽受体显现促效剂活性的类似物包含：(i)SEQ ID NO：1，其是具有至少一个氨基酸修饰，(ii)一种延伸，为1至21个氨基酸(例如：5至18、7至15、9至12个氨基酸)，其是羧基端至类似物第29号位置的氨基酸，以及(iii)包含酰基或烷基的氨基酸，该酰基或烷基是指对自然生成的氨基酸来说是非自然的氨基酸，该氨基酸是位于羧基端延伸外(例如：第1至29号位置中任何位置)。在某些实施例中，该类似物包含于第10号位置经酰基化或烷基化的氨基酸。在特定方面，该酰基或烷基是为C4至C30脂肪酰基或C4至C30烷基。在某些实施例中，该酰基或烷基是可通过间隔物(例如：一氨基酸、双肽、三肽、亲水性双功能间隔物、疏水性双功能间隔物)连接至酰基或烷基。在特定方面，该类似物包含稳定α螺旋的氨基酸修饰，(例如：其是介于第16号位置的谷氨酸及第20号位置的赖氨酸间的盐桥，或位于第16、20、21、及24号位置中任意一、二、三或多个位置的α，α双取代氨基酸)。在特定方面，该类似物额外地包含有氨基酸修饰，其是赋予对第四型双胜肽蛋白水解酶切割的抗性。包含另外氨基酸修饰的类似物需于此处考虑。
在特定实施例中，该具胃抑胜肽受体活性的类似物于胃抑胜肽受体显现至少约0.1％(例如：至少0.5％、1％、2％、5％、10％、15％或20％)的天然胃抑胜肽活性。在某些实施例中，该类似物于胃抑胜肽受体显现超过20％(例如：超过50％、75％、100％、200％、300％、500％)的天然胃抑胜肽活性。在某些实施例中，该胃抑胜肽受体于胰高血糖素样肽-1受体及胰高血糖素受体中之一或前述两者显现可观的促效剂活性。在某些方面，对此类受体(其是指胃抑胜肽受体及胰高血糖素样肽-1受体及/或胰高血糖素受体)的选择性为100倍以内。举例来说，该具有胃抑胜肽受体活性的类似物，其对胰高血糖素样肽-1受体的选择性是少于100倍(于50倍内、于25倍内、于15倍内、于10倍内)，该选择性是于胃抑胜肽受体及/或胰高血糖素受体。
如本文所述，提供高效能的胰高血糖素促效剂类似物，其对于胰高血糖素受体也显现增加的活性，在另外实施例中，显现增强的生物物理稳定度及/或水溶液溶解度。此外，依据本发明的另一方面，提供缺少天然胰高血糖素的选择性(其是胰高血糖素受体相对于胰高血糖素样肽-1受体的选择性)的类似物，且因此代表此两类受体的共同促效剂。胰高血糖素类似物内的经选择氨基酸修饰是可控制该类似物的相对活性，其是于胰高血糖素样肽-1受体对胰高血糖素受体的相对活性。因此，本发明的又另一方面提供：胰高血糖素共同促效剂类似物，其是于胰高血糖素受体对胰高血糖素样肽-1受体具较高活性，胰高血糖素共同促效剂类似物是于此两受体均约有相等活性，且胰高血糖素共同促效剂类似物于胰高血糖素样肽-1受体对胰高血糖素受体具较高活性。共同促效剂的后续分类是可设计于胰高血糖素受体显现少量或无活性，而仍保留其活化胰高血糖素样肽-1受体的能力，其是与天然胰高血糖素样肽-1有相同或更强的效能。此类共同促效剂的任一种亦包含有修饰，其是赋予增强的生物物理稳定度及/或水溶液溶解度。
对胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1受体展现共同促效作用的胰高血糖素类似物有利于数个应用。首先，使用胰高血糖素于治疗低血糖症会过度补偿低血糖值，而导致过高的血糖值。若施予胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1受体共同促效剂，则额外的胰高血糖素样肽-1刺激可缓冲胰高血糖素促效剂的效果，而防止由治疗低血糖症所导致的过高的葡萄糖血值。
此外，如本文所述，当单独使用，或与其他抗糖尿病或抗肥胖药剂合并用药时，本发明的胰高血糖素共同促效剂类似物可用于控制高血糖症，或导致体重降低或防止体重增加。另一种导致体重降低的化合物为调酸素，其是一种存在于小肠中的天然产生的消化激素(参见Diabetes 2005；54：2390-2395)。调酸素为包含胰高血糖素的29个氨基酸序列(即SEQ ID NO：1)其后接SEQ ID NO：27的8个氨基酸羧基端延伸(KRNRNNIA)之一37个氨基酸胜肽。虽然本发明考虑将文中所述的胰高血糖素类似物可可选择的结合至此8个氨基酸羧基端延伸(SEQ ID NO：27)，但本发明的某些实施例中亦特别地考虑缺乏SEQ ID NO：27的8个相连羧基氨基酸的类似物及该类似物的使用。
化合物可经由氨基酸修饰而客置化以调节胜肽的胰高血糖素样肽-1活性，且因此可调整本发明的胰高血糖素类似物以治疗特定症状或疾病。更具体地说，本文提供胰高血糖素类似物，其中每一类似物对各别的胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1受体展现特有的活性相对值。举例来说，可对每一胜肽进行修饰，以产生胰高血糖素胜肽，该胰高血糖素胜肽具有对GLP-1受体相对于天然GLP-1为至少约1％(包括至少约1.5％、2％、5％、7％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、100％、125％、150％、175％)至约200％间的任何值或更高活性，以及对胰高血糖素受体相对于天然胰高血糖素为至少约1％(包括至少约1.5％、2％、5％、7％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％)至约500％间的任何值或更高活性。在某些实施例中，本文所述的胰高血糖素胜肽，于胰高血糖素受体显现高达约100％、1000％、10,000％、100,000％或1,000,000％的天然胰高血糖素活性。某些实施例中，本文所述的胰高血糖素胜肽，于胰高血糖素样肽-1受体显现高达约100％、1000％、10,000％、100,000％，或1,000,000％的天然胰高血糖素样肽-1活性。该天然胰高血糖素的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，该胰高血糖素样肽-1(7-36)酰胺的氨基酸序列为SEQ ID NO：52，该胰高血糖素样肽-1(7-37)的氨基酸序列为SEQ ID NO：50。在例示实施例中，一胰高血糖素胜肽是可于胰高血糖素受体显现至少10％的天然胰高血糖素活性，并于胰高血糖素样肽-1受体显现至少50％的天然胰高血糖素样肽-1活性，或于胰高血糖素受体显现至少40％的天然胰高血糖素活性，且于胰高血糖素样肽-1受体显现至少40％的天然胰高血糖素样肽-1活性，或于胰高血糖素受体显现至少60％的天然胰高血糖素活性，并于胰高血糖素样肽-1受体显现至少60％的天然胰高血糖素样肽-1活性。
胰高血糖素胜肽的选择性(其是胰高血糖素受体相对于胰高血糖素样肽-1受体的选择性)，是以胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1活性的相对比率描述(其是于胰高血糖素受体对于天然胰高血糖素的胜肽活性，除以于胰高血糖素样肽-1受体对于天然胰高血糖素样肽-1的胜肽活性)。举例来说，胰高血糖素胜肽有1∶1的胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1活性比率，其是于胰高血糖素受体显现60％的天然胰高血糖素活性，且于胰高血糖素样肽-1受体显现60％的天然胰高血糖素样肽-1活性。胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1活性的例示比率包含约1∶1、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1，或约1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2或1∶1.5。如一实施例，10∶1的胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1活性比率是指10倍的选择性(其是胰高血糖素受体相对于胰高血糖素样肽-1受体的选择性)。同样地，10∶1的胰高血糖素样肽-1/胰高血糖素的活性比率是指10倍的选择性(其是胰高血糖素样肽-1受体相对于胰高血糖素受体的选择性)。
根据一实施例，提供具有增强的效能，及可选择的溶解度及稳定度经改良的胰高血糖素类似物。在一实施例中，增强的胰高血糖素效能，是通过位于天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)中第16号位置的氨基酸修饰而提供。经由非限定实施例的方法，此等增强的效能是通过第16号位置的自然发生的丝氨酸取代为谷氨酸，或另一具有4个原子长度侧链的带负电氨基酸，或替代为谷氨酰胺、高谷氨酸(homoglutamicacid)或同胱氨酸(homocysteic acid)、或带电荷氨基酸，其是具有包含至少一异质原子(例如：N，O，S，P)的侧链以及4个(或3至5)原子长度侧链。在一实施例中，增强效能的胰高血糖素促效剂包含：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7之一胜肽或一SEQ ID NO：5的胰高血糖素促效剂类似物。依据一实施例，是提供一种胰高血糖素类似物蛋白质，其是对胰高血糖素受体相对于野生型胰高血糖素具有增强的效能，其中该胜肽包含：SEQID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的序列，其中该胰高血糖素肽维持其于胰高血糖素受体相对于胰高血糖素样肽-1受体的选择性。
胰高血糖素受体活性，是可通过于第3号位置的氨基酸修饰而减少、维持或增强，例如取代第3号位置自然发生的谷氨酰胺。在一实施例中，第3号位置的氨基酸取代为酸性、碱性、或疏水性氨基酸(谷氨酸、鸟氨酸、亮氨酸)，其是证实可大量地降低或破坏胰高血糖素受体活性。取代该类似物例如：谷氨酸、鸟氨酸或亮氨酸，于胰高血糖素受体具有约10％或更少的天然胰高血糖素活性，例如：约1-10％，或约0.1-10％，或大于约0.1％但小于约10％，而于胰高血糖素样肽-1受体显现约至少20％的胰高血糖素样肽-1活性。举例来说，如本文所述的例示类似物，具有约0.5％、1％或约7％的天然胰高血糖素活性，而于胰高血糖素样肽-1受体显现约至少20％的胰高血糖素样肽-1活性。
在另一实施例中，该胰高血糖素胜肽第3号位置自然发生的谷氨酰胺，是可取代为不会于胰高血糖素受体大量降低活性的谷氨酰胺类似物，且在某些情况下，增强如本文所述胰高血糖素受体的活性。举例来说，该在第3号位置包含有一谷氨酰胺类似物之一胰高血糖素胜肽，是可于胰高血糖素受体显现约5％、10％、20％、50％或约85％，或更高的天然胰高血糖素(例如：SEQ ID NO：1)活性。举例来说，该在第3号位置包含有谷氨酰胺类似物之一胰高血糖素胜肽，是可于胰高血糖素受体显现约5％、10％、20％、50％或约85％，或更高的天然胰高血糖素(例如：SEQ IDNO：1)活性，其是一对应的胰高血糖素胜肽的活性，具有除了在第3号位置经修饰氨基酸外(例如：SEQ ID NO：601或SEQ ID NO：602)，与包含有谷氨酰胺类似物的胜肽相同的氨基酸序列。在某些实施例中，该在第3号位置包含有谷氨酰胺类似物之一胰高血糖素胜肽，是可于胰高血糖素受体显现增强的活性，但增强的活性不超过1000％、10,000％、100,000％、或1,000,000％的天然胰高血糖素活性或一对应的胰高血糖素胜肽的活性，其是具有除了在第3号位置经修饰氨基酸外，与包含有谷氨酰胺类似物的胜肽相同的氨基酸序列。
在某些实施例中，该谷氨酰胺类似物是为自然生成或非自然生成的氨基酸，其是包含有：结构I、II，或III的侧链：
Figure BDA0000121349000000121
结构I
Figure BDA0000121349000000122
结构II
Figure BDA0000121349000000123
结构III
其中R1为C0-3烷基或C0-3异烷基；R2为NHR4或C1-3烷基；R3为C1-3烷基；R4为H或C1-3烷基；X为NH、O、或S；及Y为NHR4、SR3、或OR3。在某些实施例中，X为NH或Y为NHR4。在某些实施例中，R1为C0-2烷基或C1异烷基。在某些实施例中，R2为NHR4或C1烷基。在某些实施例中，R4为H或C1烷基。于结构I的例示实施例中，R1为CH2-S，X为NH，以及R2为CH3(乙酰胺甲基-半胱氨酸，acetamidomethyl-cysteine，C(Acm))；R1为CH2，X为NH，以及R2为CH3(乙酰二胺基丁酸，acetyldiaminobutanoic acid，Dab(Ac))；R1为C0烷基，X为NH，R2为NHR4，以及R4为H(胺甲酰二胺基丙酸，carbamoyldiaminopropanoic acid，Dap(urea))；或R1为CH2-CH2，X为NH，以及R2为CH3(乙酰鸟氨酸，acetylornithine，Orn(Ac))。于结构II的例示实施例中，R1为CH2，Y为NHR4，以及R4为CH3(甲基谷氨酰胺，methylglutamine，Q(Me))；于结构III的例示实施例中，R1为CH2以及R4为H(甲硫氨酸-亚砜，methionine-sulfoxide，M(O))；在特定实施例中，该于第3号位置的氨基酸取代为乙酰二胺基丁酸(Dab(Ac))。举例来说，胰高血糖素促效剂是可包含：SEQID NO：595、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605及SEQ ID NO：606的氨基酸序列。
在另一实施例中，提供胰高血糖素类似物，其是于胰高血糖素受体相对于天然胰高血糖素胜肽具有增强或维持的效能，但对胰高血糖素样肽-1受体亦具有大量增强的活性。胰高血糖素正常于胰高血糖素样肽-1受体，具有约1％的天然胰高血糖素样肽-1活性，而胰高血糖素样肽-1正常于胰高血糖素受体，具有少于约0.01％的天然胰高血糖素活性。于胰高血糖素样肽-1受体增强活性，是通过羧基端氨基酸的羧酸替代为一电中性基团，诸如：酰胺或酯而提供。在一实施例中，此类胰高血糖素类似物包含：SEQ ID NO：20的序列，其中该羧基端氨基酸具有酰胺基以取代存在于天然氨基酸的羧酸基。此类胰高血糖素类似物，是可于胰高血糖素受体及胰高血糖素样肽-1受体均具有很强活性，因此能于前述两受体作为共同促效剂。依据一实施例，提供一胰高血糖素受体及胰高血糖素样肽-1受体的共同促效剂，其中该胜肽包含：SEQ ID NO：20，其中第28号位置的氨基酸取代为天冬酰氨酸或赖氨酸，且第29号位置氨基酸为苏氨酸-酰胺(Thr-amide)。
于胰高血糖素样肽-1受体增强的活性，亦可经由分子内架桥通过三个插入氨基酸(intervening amino acids)分隔的两个氨基酸侧链之间而形成，使胰高血糖素羧基端部分(例如约氨基酸12-29)中α螺旋结构稳定。即：一氨基酸位于第i号位置，且一氨基酸位于第i+4号位置，其中i为任何介于12及25间的整数)，或通过两个插入氨基酸而形成，即：一氨基酸位于第j号位置，且一氨基酸位于第j+3号位置，其中j为任何介于12及27间的整数，或通过六个插入氨基酸而形成，即：一氨基酸位于第k号位置，且一氨基酸位于第k+7号位置，其中k为任何介于12及22间的整数。在例示实施例中，该架桥(bridge)或连接物(linker)约8个原子(或约7至9个原子)，并形成于氨基酸的侧链间，其是第12及16，第16及20，第20及24，第24及28号位置间。此类两氨基酸侧链，是通过非共价键而相互连接，例如：氢键或离子交互作用连接，如：盐桥的形成，或通过共价键而相互连接。
依据一实施例，提供一胰高血糖素促效剂，包含SEQ ID NO：20的胰高血糖素胜肽，其中一内酰胺环，是形成于位于第12、20或28号位置一赖氨酸残基的侧链，以及位于第16或24号位置一谷氨酸残基的侧链间，其中其侧链参与形成内酰胺环的胰高血糖素胜肽的两个氨基酸经三个插入氨基酸彼此隔开。根据一实施例，带有内酰胺的胰高血糖素类似物包含：选自由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18所组成的群之一氨基酸序列。在一实施例中，带有内酰胺胜肽的羧基端氨基酸，具有一酰胺基或一酯基，以取代该末端羧酸。在一实施例中，SEQ ID NO：11、SEQID NO：12、SEQ ID NO：13、及SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18之一胰高血糖素胜肽进一步包含一额外氨基酸，其是共价键结至SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18的羧基端。在一另外实施例中，提供一胰高血糖素胜肽，包含选自由SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68及SEQ ID NO：69所组成的群的序列，其是进一步包含共价键结至SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68及SEQ ID NO：69的羧基端的额外氨基酸。在一实施例中，第28号位置的氨基酸为天冬酰氨酸或赖氨酸，且第29号位置的氨基酸为苏氨酸。
在某些特定实施例中，胰高血糖素促效剂胜肽羧基端部分α螺旋的稳定是通过形成一共价性分子内架桥达成，而非内酰胺架桥。举例来说，适合形成共价键方法(即：形成一共价性分子内架桥的方法)包括：任一或多种烯烃复分解反应(olefinmetathesis)、羊毛硫氨酸为主的环化反应(lanthionine-based cyclization)、双硫架桥，或经修饰含硫架桥的形成、α，ω-二胺烷类是链(α，ω-diaminoalkane tethers)的使用、金属架桥的形成，以及其他用于稳定α螺旋的胜肽环化作用方法。
于胰高血糖素样肽-1受体增强活性，是可通过稳定胰高血糖素胜肽羧基端部分(约氨基酸12至29)的α螺旋而达成，其是通过于该位置导入一或多个α，α-双取代氨基酸(α，α-disubstituted amino acid)以保留期望活性。在某些方面，α螺旋的稳定以此方法达成，而不需目的性导入分子内架桥(例如：盐桥或共价键。)此处列入考虑的胜肽是缺少分子内架桥的胜肽。在特定方面，稳定α螺旋是通过导入一或多个α，α-双取代氨基酸达成，不需导入共价性分子内架桥(例如：内酰胺架桥、双硫架桥)。此处列入考虑的胜肽是缺少共价性分子内架桥的胜肽。在某些实施例中，胰高血糖素胜肽的第16、17、18、19、20、21、24或29号位置中一、二、三、四或多个位置取代为α，α-双取代氨基酸。举例来说，胰高血糖素胜肽的第16号位置取代为胺基异丁酸(AIB)，以在没有盐桥或内酰胺存在时，增强胰高血糖素样肽-1活性。在某些实施例中，第16、20、21或24号位置之一、二、三或更多位置取代为胺基异丁酸。
于胰高血糖素样肽-1受体及胰高血糖素受体，增强对缺少分子内架桥(例如：共价性分子内架桥)的胰高血糖素类似物胜肽的活性，是可通过添加酰基或烷基至该胜肽第10号位置氨基酸的侧链而达成。在某些方面，该酰基或烷基并非自然生成于氨基酸上。在特定方面，该酰基或烷基对任何自然生成的氨基酸而言为非自然者。某些实施例中，该酰基为脂肪酰基，如：C4至C30脂肪酰基。举例来说，在本文中所提供的是一缺少共价性分子内架桥的胰高血糖素类似物胜肽，在第16号位置包含有胺基异丁酸(AIB)，且一C14、C16或C18脂肪酰基是共价连接至第10号位置的赖氨酸侧链。亦提供一缺少分子内架桥(如：共价性分子内架桥)的胰高血糖素类似物胜肽，在第2及16号位置包含有胺基异丁酸(AIB)，且一C14、C16或C18脂肪酰基是共价连接至第10号位置的赖氨酸侧链。此等经酰基化的缺少分子内架桥(如：共价性分子内架桥)的胰高血糖素类似物胜肽，可聚乙二醇化，进一步详述如下。
进一步增强对缺少分子内架桥(例如：分子内架桥)的胰高血糖素类似物胜肽于胰高血糖素样肽-1及胰高血糖素的活性，是可通过纳入一间隔物于酰基或烷基与第10号位置氨基酸的侧链间而达成。依据某些实施例，该间隔物(如：一氨基酸、双肽、三肽、亲水性双功能间隔物、或疏水性双功能间隔物)有3至10个原子长度(如：6至10个原子)。依据特定具体实施例，该间隔物及酰基或烷基的总长度是14至28个原子，例如：17至28、19至26、19至21个原子。对缺少分子内架桥(例如：共价性分子内架桥)的经酰基化或烷基化胰高血糖素类似物胜肽，增强胰高血糖素样肽-1活性及胰高血糖素活性的适合间隔物，进一步详述如下。
举例来说，提供一非自然胰高血糖素胜肽，是与SEQ ID NO：1有不超过10个氨基酸修饰的不同，包含有酰基和烷基，其中该酰基和烷基是连接至一间隔物，且该间隔物是连接至胰高血糖素胜肽第10号位置氨基酸的侧链，其中当该胰高血糖素胜肽缺少一亲水性基团，例如：聚乙二醇(PEG)时，是可于胰高血糖素样肽-1受体显现至少20％(例如：至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、约100％、约150％、约200％、约400％、约500％或更多)的天然胰高血糖素样肽-1活性。在某些实施例中，当该胰高血糖素胜肽缺少一亲水性基团，例如：聚乙二醇(PEG)时，该胰高血糖素胜肽于胰高血糖素受体显现至少0.5％(例如：至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少20％)的天然胰高血糖素活性。在某些实施例中，上述的胰高血糖素胜肽是可于胰高血糖素受体显现任何上述标示活性，并不超过1000％、10,000％、100,000％，或1,000,000％的天然胰高血糖素活性。在某些实施例中，上述的胰高血糖素胜肽是可于胰高血糖素样肽-1受体显现任何上述标示活性，并不超过1000％、10,000％、100,000％，或1,000,000％的天然胰高血糖素样肽-1活性。
于胰高血糖素样肽-1受体增强的活性，是可通过于第20号位置的氨基酸修饰而提供。在一实施例中，第20号位置的谷氨酰胺取代为另一具有带电或具有氢键能力，且长度为至少约5(或约4-6)个原子长度侧链的亲水性氨基酸，例如，赖氨酸、瓜氨酸、精氨酸、或鸟氨酸。
胰高血糖素样肽-1活性是可降低通过包含：(i)一羧酸端α羧酸基，(ii)于第7号位置的苏氨酸取代为缺少羟基的氨基酸，例如：丁氨酸(Abu)、异亮氨酸，(iii)删除羧基端至第27号位置的氨基酸(例如，删除位于第28号位置的氨基酸，删除位于第28及29号位置的氨基酸)，产生一胜肽于长度上具27或28个氨基酸，或(iv)其组合。
任何增加或降低胰高血糖素受体活性，并增加胰高血糖素样肽-1受体活性的上述修饰，可独自使用或以组合方式使用。增加胰高血糖素样肽-1受体活性的修饰以组合方式使用，相较于任一修饰单独使用，可提供更高的胰高血糖素样肽-1活性。举例来说，本发明提供：一种胰高血糖素类似物，其是包含于第16号位置、第20号位置以及于羧基端羧酸基的修饰，可选择的于第16及20号位置间具共价键；一种胰高血糖素类似物，是可包含于第16号位置以及于羧基端羧酸基的修饰；一种胰高血糖素类似物，是可包含于第16及20号位置的修饰，可选择的于第16及20号位置间具共价键；以及一种胰高血糖素类似物，是可包含胰高血糖素胜肽包含于第20号位置以及于羧基端羧酸基的修饰，可选择的附加条件为第12号位置的氨基酸非精氨酸，或可选择的附加条件为第9号位置的氨基酸非谷氨酸。
其他如本文所述，于第1或2号位置处的修饰，是可提高对第四型双胜肽蛋白水解酶(DPP IV)切割的抗性。举例来说，第2号位置的氨基酸取代为D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸，或胺基异丁酸。替代地或添加地，第1号位置的氨基酸是可取代为：D-组氨酸、脱胺基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸、高组氨酸、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸(imidazole aceticacid)或α，α-双甲基咪唑乙酸(DMIA)。
经观察到在第2号位置的修饰(例如，第2号位置的胺基异丁酸)，及在一些情况中，第1号位置的修饰会降低胰高血糖素活性，有时是显著地降低；令人惊奇地，此胰高血糖素活性的降低，是可通过稳定胰高血糖素羧基端部分中α螺旋结构而恢复。可通过在第12及16、16及20、或20及24号位置处的氨基酸间的共价键(例如，在第16号位置的谷氨酸与第20号位置的赖氨酸间的内酰胺架桥)而恢复。例如，通过一介于第i及i+4的氨基酸间的共价键，例如：介于第12及16、16及20、20及24号位置之间。在某些实施例中：该共价键是内酰胺架桥，其是介于在第16号位置的谷氨酸及第20号位置的赖氨酸。在某些实施例中，该共价键是分子内架桥，而非内酰胺架桥。举例来说，适合共价键结的方法包括：任一或多种烯烃复分解反应、羊毛硫氨酸为主的环化反应、双硫架桥或经修饰含硫架桥的形成、α，ω-二胺烷类是链的使用、金属架桥的形成，以及其他胜肽环化作用的方法。
具有胰高血糖素样肽-1活性的胰高血糖素胜肽，其是包含有第1号位置的组氨酸非保留性取代为大的芳香族氨基酸(例如：酪氨酸)，通过如本文所述任一种分子内架桥稳定α螺旋，则可保留胰高血糖素样肽-1活性。例如，通过一共价键，其是介于第i及i+4的氨基酸间。例如：介于第12及16、16及20、或20及24号位置之间。在某些实施例中：该共价键是内酰胺架桥，其是介于在第16号位置的谷氨酸及第20号位置的赖氨酸。在某些实施例中，该共价键是分子内架桥，而非内酰胺架桥。举例来说，适合共价键结的方法包括：任一或多种烯烃复分解反应、羊毛硫氨酸为主的环化反应、双硫架桥或经修饰含硫架桥的形成、α，ω-二胺烷类是链的使用、金属架桥的形成，以及其他胜肽环化作用的方法。
在又一例示实施例中，前述化合物的任一种是可进一步修饰以改善稳定度，其是通过修饰SEQ ID NO：1的第15号位置处氨基酸，以随时间流逝减少胜肽降解，特别是于酸性或碱性缓冲液中。
在另一实施例中，本文所述的胰高血糖素胜肽，其溶解度是可通过连接亲水性基团至胜肽而增强。在一实施例中，该亲水性基团为聚乙二醇(PEG)链，可选择的共价性键结于该胜肽第16、17、20、21、24、29、40，羧基端延伸内，或羧基端氨基酸。在某些实施例中，在此位置的天然氨基酸，取代为一具有适合与亲水性基团交联的侧链，以利亲水性基团连接至该胜肽。在其他实施例中，该经修饰的氨基酸包含一添加至胜肽羧基端的亲水性基团。在一实施例中，该胜肽共同促效剂包含一序列，是选自于：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19所组成的群，其中该胰高血糖素胜肽的第16、17、21及24号位置进一步包含一聚乙二醇链，具有是选自约500至40,000道尔顿(Daltons)的分子量。在一实施例中，聚乙二醇链具有一分子量是选自约500至5,000道尔顿的范围。于另一实施例中，聚乙二醇链具有一分子量约10,000至20,000道尔顿。在又另一实施例中，聚乙二醇链具有一分子量约20,000至40,000道尔顿的范围。
在另一实施例中，任何前述胰高血糖素类似物的溶解度是可通过氨基酸取代，及/或将带电氨基酸导入至胜肽的羧基端部分而添加，较佳地于SEQ ID NO：1羧基端至第27号位置而改进。可选择的可将一、二或三个带电氨基酸导入羧基端部分内，较佳为羧基端至第27号位置。依据一实施例，位于第28号位置及/或第29号处的天然氨基酸取代为带电氨基酸，及/或在另外实施例中，将一至三个带电氨基酸加至胜肽的羧基端。在例示实施例中，一、二或全部的带电氨基酸均带负电。可对胰高血糖素肽进行额外修饰，例如，保留性取代(conservative substitution)，使其仍可维持胰高血糖素活性。在一实施例中，提供SEQ ID NO：20的胜肽的类似物，其中该类似物与SEQ ID NO：20的差异在于第17至26号位置处的1至2个氨基酸取代，且在一实施例中，该类似物与SEQ ID NO：20的胜肽的差异在于第20号位置处的氨基酸取代。
依据某些实施例，如本文所述的胰高血糖素胜肽是通过羧基端截断一或二个氨基酸残基而修饰。此等经修饰的胰高血糖素胜肽，如本文证实，保留于胰高血糖素受体及胰高血糖素样肽-1受体的相似活性及效能。就此点而言，该胰高血糖素胜肽是可包含：天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)胜肽的1至27或1至28氨基酸，可选择的具有如本文所述的任何额外修饰。
依据一实施例，如本文所述的该胰高血糖素胜肽是通过添加第二胜肽至胰高血糖素胜肽的羧基端(例如：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28)而修饰。在一实施例中，一胰高血糖素胜肽其是具有一胜肽序列，选自于由：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68及SEQ ID NO：69所组成的群，该序列是通过一胜肽键共价键结至一第二胜肽，其中，该第二胜肽是选自包含：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28号所组成的群在另外的实施例中，胰高血糖素胜肽包含羧基端延伸，其中于天然胰高血糖素胜肽第29号位置的苏氨酸取代为甘氨酸。一种胰高血糖素相关胜肽，第29号位置的苏氨酸取代为甘氨酸，且包含SEQ ID NO：26的羧基端延伸，其于胰高血糖素样肽-1的效能是为经修饰含有SEQ ID NO：26羧基端延伸的天然胰高血糖素的四倍。胰高血糖素样肽-1效能通过取代原本位于第18号位置的精氨酸为丙氨酸是可进一步增加。
任何如本文所述的胰高血糖素胜肽经修饰而包含一酰基或烷基，例如，C4至C30酰基或烷基。在某些方面，该酰基或烷基对任何自然发生的氨基酸来说是非自然的。酰基化或烷基化是可于循环时增加胰高血糖素胜肽的半生期。酰基化或烷基化是可有利地延迟起效作用及/或延长于胰高血糖素及/或胰高血糖素样肽-1受体的作用期间及/或改善对蛋白酶(如：第四型双胜肽蛋白水解酶)的抗性。如本文所示，胰高血糖素胜肽于胰高血糖素受体及胰高血糖素样肽-1受体的活性维持，如酰基化后未大幅增加。再者，如未大幅增加的话，酰基化类似物的效能与未酰基化版胰高血糖素胜肽相比效能相当。胰高血糖素胜肽可以于有亲水性基团连结的相同、或不同氨基酸位置酰基化或烷基化。在某些实施例中，本发明提供一种胰高血糖素胜肽，其是经修饰而包含共价性键结于该胰高血糖素胜肽第10号位置之一酰基或烷基。该胰高血糖素胜肽是进一步于胰高血糖素胜肽的第10号位置氨基酸及酰基或烷基间包含有间隔物。在某些实施例中，该酰基是可为脂肪酸、胆汁酸(bile acid)，或其盐类，例如：C4至C30脂肪酸、C8至C24脂肪酸、胆酸(cholic acid)、C4至C30烷基、C8至C24烷基，或包含有胆汁酸(bile acid)中类固醇基团的烷基。该间隔物是为具有适合连接至酰基或烷基的反应基团的任何基团。在例示实施例中，该间隔物包含一氨基酸、一双肽、一三肽、一亲水性双功能间隔物、或疏水性双功能间隔物。在某些实施例中，该间隔物是选自包含：色氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸及包含NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH之一间隔物，其中m是为在1至6之间任意整数，且n是为在2至12之间任意整数所组成的群。此等酰基化或烷基化的胰高血糖素胜肽亦进一步包括一亲水性基团，可选择的为聚乙二醇。任何前述胰高血糖素胜肽是可包括两个酰基或两个烷基，或其组合。
因此，如本文所揭示，提供高效能胰高血糖素类似物或胰高血糖素共同促效剂类似物，其亦显现改善溶解度及/或稳定度的作用。一例示的高效能胰高血糖素类似物于胰高血糖素受体显现至少200％的天然胰高血糖素活性，并且可选择的在溶于至少1mg/mL浓度下，pH值介于6到8之间，或介于6到9之间，或介于7到9之间(例如：pH值7)，并且可选择的在24小时后25℃条件下，保留至少95％的原始胜肽(例如：5％或更少的原始胜肽降解或切割)。如另一实施例，例示的胰高血糖素共同促效剂类似物于胰高血糖素受体及胰高血糖素样肽-1受体均显现大于40％或60％的活性(其比例约介于1∶3及3∶1，或1∶2及2∶1之间)，并且可选择的在溶于至少1mg/mL浓度下，pH值介于6到8之间，或介于6到9之间，或介于7到9之间(例如：pH值7)，并且可选择的于24小时后25℃条件下，保留至少95％的原始胜肽。又另一例示的胰高血糖素共同促效剂类似物于胰高血糖素受体显现约10％或更少的天然胰高血糖素活性，并于胰高血糖素样肽-1受体显现至少约20％的天然胰高血糖素样肽-1活性，可选择的在溶于至少1mg/mL浓度下，pH值介于6到8之间，或介于6到9之间，或介于7到9之间(例如：pH值7)，并且可选择的于24小时后25℃条件下，保留至少95％原始胜肽。又另一例示的胰高血糖素共同促效剂类似物于胰高血糖素受体显现约10％或少于10％但大于0.1％、0.5％或1％的天然胰高血糖素活性，并于胰高血糖素样肽-1受体显现至少约50％、60％、70％、80％、90％或100％以上的天然胰高血糖素样肽-1活性，可选择的在溶于至少1mg/mL浓度下，pH值介于6到8之间，或介于6到9之间，或介于7到9之间(例如：pH值7)，并且可选择的于24小时后25℃条件下，保留至少95％原始胜肽。在某些实施例中，该胰高血糖素胜肽于胰高血糖素样肽-1受体显现不超过约1000％、10,000％、100,000％或1,000,000％的天然胰高血糖素样肽-1活性。在某些实施例中，此等胰高血糖素胜肽保留天然胰高血糖素中对应位于自然生成氨基酸的第22、23、24、25、26、27或28号位置。(例如：具有1至7、1至5、或1至3个相对于自然生成胰高血糖素的修饰)。
将下列胜肽中的任一者排除在本发明的化合物外，尽管本发明中可包括展现期望胰高血糖素样肽-1或共同促效剂活性之一或多个进一步修饰，使用此等化合物的医药组合物、套组及治疗方法：具有[精氨酸12]取代及具有羧基端酰胺的SEQ ID NO：1胜肽；具有[精氨酸12，赖氨酸20]取代且具有羧基端酰胺的SEQ ID NO：1胜肽；具有[精氨酸12，赖氨酸24]取代且具有羧基端酰胺的SEQ ID NO：1胜肽；具有[精氨酸12，赖氨酸29]取代且具有羧基端酰胺的SEQ ID NO：1胜肽；具有[谷氨酸9]取代的SEQID NO：1胜肽；失去组氨酸1、具有[谷氨酸9，谷氨酸16，赖氨酸29]取代及羧基端酰胺的SEQ ID NO：1胜肽；具有[谷氨酸9，谷氨酸16，赖氨酸29]取代且具有羧基端酰胺的SEQ ID NO：1胜肽；具有经由内酰胺架桥键结的[赖氨酸13，谷氨酸17]取代且具有羧基端酰胺的SEQ ID NO：1胜肽；具有经由内酰胺架桥键结的[赖氨酸17，谷氨酸21]取代且具有羧基端酰胺的SEQ ID NO：1胜肽；失去组氨酸1、具有经由内酰胺架桥键结取代的[谷氨酸20，赖氨酸24]SEQ ID NO：1胜肽。
依据一实施例，提供一种药学组合物，包括任何如本文所述的新型胰高血糖素胜肽，较佳地为无菌且纯度至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，及一医药可接受稀释剂、载体或辅药。此等组合物是可包括浓度至少为A的如本文所述的一胰高血糖素胜肽，其中A为0.001mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml或更高。在其他实施例中，此等组合物是包括最高浓度为B之一胰高血糖素胜肽，其中B的浓度为30mg/ml、25mg/ml、24mg/ml、23、mg/ml、22mg/ml、21mg/ml、20mg/ml、19mg/ml、18mg/ml、17mg/ml、16mg/ml、15mg/ml、14mg/ml、13mg/ml、12mg/ml、11mg/ml 10mg/ml、9mg/ml、8mg/ml、7mg/ml、6mg/ml、5mg/ml、4mg/ml、3mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、或0.1mg/ml。在某些实施例中，该包含一胰高血糖素胜肽的组合物，是在一A至B的浓度范围，例如，0.001至30.0mg/ml。在一实施例中，该药学组合物包括无菌的水溶液，并可选择的存放于不同容器中。本发明的化合物是可依据某些实施例使用，先配制成一预配制溶液以供注射使用。在某些实施例中，该药学组合物包括经冻干的粉末。该药学组合物是可进一步包装成包括有用于施予患者的一可抛式装置中一套组的一部分。该容器或套组可标示储存于常温或低温下。
根据一实施例，提供一种使用本发明的胰高血糖素胜肽的预调配水性组合物以快速提高葡萄糖值或治疗低血糖症的方法。该方法包括施予有效量水溶液的步骤，该水溶液包含有本发明揭示的一新型经修饰胰高血糖素胜肽的水溶液。在一实施例中，该胰高血糖素胜肽在该胰高血糖素胜肽第21或24号位置处经聚乙二醇化，且该聚乙二醇链具有约500至约5,000道尔顿的分子量。在一实施例中，将经修饰的胰高血糖素溶液预包装在用于将组合物施予罹患低血糖症的病患的装置中。
根据一实施例，提供一种调节胰岛素依赖型病患中的血糖值的改良方法。该方法包括以用于控制糖尿病的治疗有效量施予胰岛素，且以用于预防低血糖症的治疗有效量施予本发明揭示的新型经修饰胰高血糖素胜肽的步骤，其中该施予步骤是在间隔十二小时内进行。在一实施例中，该胰高血糖素胜肽及胰岛素是作为单一组合物共同施予，其中该胰高血糖素胜肽是经具有选自约5,000至约40,000道尔顿范围分子量的一聚乙二醇链而聚乙二醇化。
在另一实施例中，提供一种用于诱发肠道暂时麻痹的方法。该方法包括将一或多种如本文所述的胰高血糖素胜肽施予病患的步骤。
代谢症候群，亦称代谢症候群X、胰岛素抗阻症候群、雷文氏症候群(Reaven′ssyndrome)，是一种影响超过五千万美国人的疾病。代谢症候群，传统上具有下列危险因子中至少三项或多项聚集的特点：(1)不正常肥胖(在腹部或其周围有过度脂肪组织)；(2)血脂肪不正常(血脂肪疾病包括：三酸甘油酯、高密度脂蛋白胆固醇含量低、低密度脂蛋白胆固醇含量高所导致增加动脉壁粥状硬块累积)；(3)血压升高，或正在治疗高血压)；(4)胰岛素抗阻或血糖不耐；(5)易血栓状态(如：血液中有高纤维蛋白原、纤维蛋白溶酶原活化抑制剂-1(plasminogen activatorinhibitor-1))以及(6)易发炎状态(如：血中C-反应蛋白升高)。其他危险因子包括：老化、贺尔蒙失调及基因先决(genetic predisposition)。
代谢症候群与增加冠心病风险及其他与动脉粥状硬块累积相关疾病有关，例如：中风或周边血管疾病，称的为动脉粥状性心血管疾病(简称为ASCVD)。代谢症候群的患者是于疾病早期经历由胰岛素抗阻期进入成熟的第二型糖尿病，是增加罹患ASCVD的风险。无任何理论规范下，胰岛素抗阻、代谢症候群及心血管疾病的关系是可纳入一个或多个同时发生的病理机制，是包含：胰岛素刺激血管舒张的减损、因增加氧化压力导致NO利用性的胰岛素抗阻相关还原、以及脂肪细胞衍生荷尔蒙的异常，例如：脂联素(Lteif and Mather，Can.J.Cardiol.20(suppl.B)：66B-76B(2004))。
依据2001国家胆固醇教育计划的成人治疗准则(ATP III)，个人具有下列任何三准则，则符合代谢症候群准则：(a)不正常肥胖(腰围：男性超过102cm，且女性腰围超过88cm)；(b)血清三酸甘油酯为150mg/dl或更高；(c)高密度脂蛋白胆固醇：男性为40mg/dl或更少，且女性为50mg/dl或更少；(c)血压为130/85或更高；(d)空腹血糖为110mg/dl或超过。依据世界卫生组织(WHO)，个人具有下列至少两准则的高胰岛素浓度(快速升高的血糖或仅餐后升高的血糖)则符合代谢症候群准则：(a)不正常肥胖(腰臀比(waist to hip ratio)大于0.9，身体质量指数(body mass index)至少30kg/m2，或腰围超过37寸)；(b)胆固醇准则显示三酸甘油酯至少为150mg/dl或高密度脂蛋白胆固醇低于35mg/dl；(c)血压为140/90或更高，或正在治疗高血压)。(Mathur，Ruchi，“Metabolic Syndrome，”ed.Shiel，Jr.，William C.，MedicineNet.com，May 11，2009).
为达此目标，若个人符合2001国家胆固醇教育计划的成人治疗准则，或世界卫生组织所提出的准则之一或两者，则该个人视为罹患代谢症候群。
不需任何理论下，如本文所述的胰高血糖素胜肽对治疗代谢症候群有效。因此，本发明提供一种预防或治疗代谢症候群的方法，或降低其一、二、三个以上危险因子，其是施予如本文所述的胰高血糖素胜肽至一有效量以预防或治疗代谢症候群或其危险因子。
非酒精性脂肪肝病变(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)，是指肝脏疾病的广泛系列，其范围是从单纯脂肪肝(steatosis)、非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，NASH)至肝硬化(不可逆的肝脏进一步瘢痕，cirrhosis)。所有非酒精性脂肪肝病变的阶段通常是于肝脏细胞(hepatocytes)堆积脂肪(又称脂肪浸润(fatty infiltration))。单纯脂肪肝是一种特定脂肪(三酸甘油酯)的异常堆积，于肝脏细胞无发炎或瘢痕。于非酒精性脂肪肝炎(NASH)中，脂肪堆积与肝脏发炎(即：肝炎(hepatitis))及瘢痕(即：纤维化(fibrosis))的各种程度有关。该发炎细胞是可破坏肝细胞。(肝细胞坏死，(hepatocellular necrosis))。在术语「脂肪肝炎(steatohepatitis)」及「脂肪坏死(steatonecrosis)」中，steato是指脂肪浸润(fattyinfiltration)，hepatitis是指肝脏发炎，而坏死是指遭破坏的肝脏细胞。非酒精性脂肪肝炎(NASH)最终可导致肝脏瘢痕(即：纤维化(fibrosis))，其后为不可逆的进一步瘢痕(即：肝硬化(cirrhosis))。由非酒精性脂肪肝炎(NASH)所导致的肝硬化(cirrhosis)，是为非酒精性脂肪肝病变(NAFLD)系列中最终且最严重的阶段。(Mendler，Michel，“Fatty Liver：Nonalcoholic Fatty Liver Disease(NAFLD)andNonalcoholic Steatohepatitis(NASH)，”ed.Schoenfield，Leslie J.，MedicineNet.com，August 29，2005).
酒精性肝病变(Alcoholic Liver Disease)或酒精诱导性肝病变(Alcohol-InducedLiver Disease)包含三个与过量酒精摄取有关或导致的生理上相异的肝脏疾病：脂肪肝(steatosis)、慢性或急性肝炎，以及肝硬化(cirrhosis)。酒精性肝炎其范围由异常实验室测试中仅一个疾病征兆的温和性肝炎，至具有并发症的严重肝功能异常，例如：黄疸(因胆红素滞留所导致的黄皮肤)、肝性脑病变(hepaticencephalopathy，是因肝脏失能(liver failure)所导致的神经功能异常)、腹水症(ascites，液体堆积于腹部)、出血性食道静脉曲张(bleeding esophageal varices，于食道静脉曲张)、异常血液凝固及昏迷。组织学上，酒精性肝炎的表征为：肝脏细胞气球样退化(ballooning degeneration)、具嗜中性球的发炎，以及有时有麦洛利氏小体(Mallory bodies)(细胞中间丝蛋白的异常聚集)。肝硬化解剖学上的特征在于：遍布于肝脏的小结(nodules)兼具有纤维化。(Worman，Howard J.，“Alcoholic LiverDisease”，Columbia University Medical Center website).
不需任何特定理论，如本文所述的胰高血糖素胜肽对于治疗酒精性肝病变、非酒精性脂肪肝病变(NAFLD)、或其任何阶段有效，包含例如：单纯性脂肪肝(steatosis)、脂肪肝炎、肝炎、肝性发炎反应(hepatic inflammation)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝硬化或其并发症。因此，本发明提供一种预防或治疗酒精性肝病变、非酒精性脂肪肝病变(NAFLD)或其任何阶段的方法，其是于一受试者包含：施予该受试者有效量的如本文所述的胰高血糖素胜肽以预防或治疗酒精性肝病变、非酒精性脂肪肝病变(NAFLD)或其阶段。这些治疗方法包含：降低下列之一、二、三或以上：肝脂肪含量、肝硬化的发生或进程、肝癌(hepatocellular carcinoma)的发生、发炎指标，例如：异常肝脏酵素浓度(如：天冬氨酸转胺酶(AST)及/或丙氨酸转胺酶(ALT)，或乳酸去氢酶(LDH))、升高的血清铁蛋白、升高的胆红素、及/或纤维化指标，例如：升高的转化生长因子-β(Transforming GrowthFactor-Beta，TGF-beta)。在较佳实施例中，该类胰高血糖素胜肽用于治疗在单纯性脂肪肝(steatosis)进程中并显现发炎或肝炎指标的患者。这些方法是可造成，如，天冬氨酸转胺酶(AST)及/或丙氨酸转胺酶(ALT)浓度的降低。
在又另一实施例中，提供一种治疗高血糖症的方法，或一种减少体重增加或导致体重降低的方法，其包括施予有效量的水溶液，该水溶液包含有本发明的胰高血糖素胜肽。在一实施例中，任一方法包括施予有效量的一含有胰高血糖素促效剂的组合物，是选自由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19所组成的群。在另一实施例中，该方法包括施予有效量的一含有胰高血糖素促效剂的组合物，其中该胰高血糖素促效剂包含有胰高血糖素胜肽，选自由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、及SEQ ID NO：69所组成的群，其中该胰高血糖素胜肽的氨基酸29是通过一胜肽键而键结至一第二胜肽，且该第二胜肽包含SEQ ID NO：26、SEQID NO：27或SEQ ID NO：28的序列。在其他实施例中，提供包括共同施予习知剂量或降低剂量的胰岛素及本发明的胰高血糖素胜肽治疗糖尿病的方法。亦提供利用本发明的胰高血糖素胜肽，不共同施予胰岛素而治疗糖尿病的方法。
在又另一方面，本发明提供用于治疗高血糖症的新型方法及用于减低食欲或促进体重减低的新型方法，其包括：施予活化胰高血糖素受体及胰高血糖素样肽-1受体两者的胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂分子(包括其药学可接受盐类)。促效作用，即活化胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1受体两者，与单独用胰高血糖素样肽-1促效作用治疗高血糖症相比，提供意想不到的改良。因此，增加胰高血糖素促效作用提供意想不到的加成(additive)或协同(synergistic)效果，或其他意想不到的临床益处。根据所述的方法，施予习知剂量的胰岛素、降低剂量的胰岛素、或不施予胰岛素均考虑。与单独用胰高血糖素样肽-1促效作用于促进减重或预防增重相比，胰高血糖素受体的促效作用亦具有意想不到的有利效果。
例示的胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂分子包括：本发明的胰高血糖素胜肽、活化胰高血糖素样肽-1及胰高血糖素受体两者的胰高血糖素样肽-1类似物、胰高血糖素与胰高血糖素样肽-1的融合物、或胰高血糖素类似物与胰高血糖素样肽-1类似物的融合物、或其的化学修饰衍生物。或者，可将活化胰高血糖素受体的化合物与活化胰高血糖素样肽-1受体的化合物(诸如胰高血糖素样肽-1类似物、促胰岛素分泌素-4类似物、或其衍生物)共同施予。本发明亦考虑共同施予胰高血糖素促效剂类似物与胰高血糖素样肽-1促效剂类似物。
这些用于治疗高血糖症及/或用于减低食欲或促进体重减轻的方法包括：施予一具有胰高血糖素类似物，其具有第12号位置处的修饰(例如，精氨酸12)，可选择的并结合在第16及/或20号位置处的修饰。本发明的方法亦包括施予包含在由三个插入氨基酸所分隔的氨基酸12与29的区域内的两个氨基酸(例如，第12与16、13与17(例如，赖氨酸13谷氨酸17或谷氨酸13赖氨酸17)、16与20、17与21(例如，赖氨酸17谷氨酸21或谷氨酸17赖氨酸21)、20与24、或24与28号位置的侧链间分子内架桥的胰高血糖素类似物，可选择的的附加条件为在第9号位置处的氨基酸不为谷氨酸，且可选择的包括羧基端酰胺或酯。
依据一实施例，所述的胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1胰高血糖素样肽-1分子不包括任何习知技术中已知有用于此一方法的胰高血糖素类似物或胰高血糖素样肽-1类似物。在另一实施例中，也排除以美国专利第6,864,069号中所述的用于治疗糖尿病作为胰高血糖素样肽-1及胰高血糖素拮抗剂两者的胜肽作为胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1分子。在另一实施例中，排除使用胰高血糖素拮抗剂治疗糖尿病，例如在Unson et al.，J.Biol.Chem.，264：789-794(1989)，Ahn et al.，J.Med.Chem.，44：3109-3116(2001)，and Sapse et al.，Mol.Med.，8(5)：251-262(2002)所述的拮抗剂。在再一实施例中，亦排除使用调酸素或包含调酸素(SEQ ID NO：27)的8个羧基端氨基酸的胰高血糖素类似物作为胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂分子。
此用于治疗高血糖症的方法预期对治疗各种不同类型的高血糖症有效，包括：糖尿病、第一型、第二型或妊娠性糖尿病(gestational diabetes)，或是胰岛素依赖性、非胰岛素依赖性糖尿病，并降低糖尿病并发症，包括：肾疾病、视网膜病变及血管疾病。所述的用以减少食欲及促进减重的方法亦预期可用于减轻体重，避免体重增加，或是治疗各种原因的肥胖，包括：药物引起的肥胖，并减少因肥胖引起的并发症，包括：血管疾病(冠状动脉疾病、心脏病、外围血管疾病、缺血再灌流(ischemiareperfusion)等)、高血压、第二型糖尿病的发生、高血脂及肌肉骨骼疾病。
如本文所述的所有治疗方法、医药组合物、套组及其他类似实施例将术语胰高血糖素类似物的使用，包括所有药学可接受盐类或其酯列入考虑。
定义
在本发明的说明及请求项中，将使用依照下列定义的术语。
如本文所使用的术语：「药学可接受载体」包括任何标准的药学载体，例如：磷酸盐缓冲液、水、乳化剂诸如油/水、水/油及各种湿润剂。该术语亦包含任何经由美国联邦政府管理机构所准许或美国药典中列出用于动物，包括人类的试剂。
如本文所使用的术语：「药学可接受盐类」是指包括各种保留有原化合物生物活性的化合物盐类，且非为生物上或其他方面所排斥。如本文所述的许多化合物是可通过胺基、羧基或其他相似的官能基而形成酸性或碱性盐类。
药学可接受碱性添加盐类可经由无机或有机碱制成。由无机碱衍生的盐类，包括(仅作为实例)：钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐及镁盐。由有机碱衍生的盐类，包括但不限于一级、二级及三级胺的盐。
药学可接受酸性添加盐类是可经由无机或有机酸制成。由无机酸衍生的盐类，包括：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等。由有机酸衍生的盐类，包括：醋酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、反丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、桂皮酸、杏仁酸、甲基磺酸、乙基磺酸、p-甲苯磺酸、水杨酸等等。
如本文所使用的术语：「治疗」，是包括预防特定疾病或症状，或减轻特定的疾病或症状及/或防止或消除该病症。举例来说，如本文所使用的术语「治疗糖尿病」一般将是指朝正常值的方向改变葡萄糖血中浓度，并可视给定情况而包括提高或降低血糖浓度。
如本文所述胰高血糖素肽的「有效」量或「药理有效」量，是指无毒性且具有但可提供期望效果的足够量胜肽。例如：举例来说，一期望的效果将是预防或治疗低血糖症，如通过血糖值的升高测量。本发明揭示的共同促效剂类似物的另一期望效果包括治疗高血糖症，例如，由较接近正常的血糖值变化所测量，或诱导减重/预防增重，例如，由体重的降低所量测，或预防或降低体重增加，或使体脂肪分布正常化。所谓「有效」量可选择的而不同，取决于年龄及个体之一般情况，施予的模式等等。因此，并非一定可以定义一精确的「有效量」。然而，用在任何个体的适当「有效」量可经由在本领域技术人员藉经验的累积所决定。
术语：「非经肠道」是指不通过供给营养的管道，而是经由一些其他途径诸如：皮下、肌肉内、脊椎内、或静脉内。
如本文所使用的术语「经纯化(purified)」及类似术语是指以实质上不含一般与分子或化合物于原生或自然环境中相关的污染物的形式分离出分子或化合物。
如本文所使用的术语「经纯化」不需要绝对纯度；而是指相对定义。术语「经纯化的多肽」在此是用于描述经自包括(但不限于)核酸分子、脂质及碳水化合物的其他化合物分离的多肽。
术语「经分离」需要将所提及的物质自其原始环境(例如，若其为自然生成时的自然环境)移除。举例来说，存在于活动物体内的自然产生的多核苷酸是未经分离，但自于自然系统中的一些或所有共同存在物质中分离出的相同多核苷酸是为经分离。
如本文所使用的术语：「胜肽」，涵盖3个或更多的氨基酸且典型上少于50个氨基酸的序列，其中该等氨基酸是自然生成或非自然生成的氨基酸。非自然生成的氨基酸是指不会于体外自然生成的氨基酸，然而可纳入如本文所述的胜肽结构。
如本文所使用的术语「多肽」及「蛋白质」是交替用于指示氨基酸的聚合物的术语，而与聚合物长度无关。一般来说，多肽及蛋白质具有大于「胜肽」的聚合物长度。
如本文所使用的「胰高血糖素胜肽」包括任何包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列、或任何SEQ ID NO：1的氨基酸序列的类似物胜肽，包括胜肽的氨基酸取代、加成、删除或翻译后修饰(post translational modification)(例如，甲基化、酰基化、泛素化作用(ubiquitination)、分子内共价键结诸如：内酰胺架桥的形成、聚乙二醇化等等)，其中该类似物刺激胰高血糖素或胰高血糖素样肽-1受体活性，例如，如使用实施例14中所述的测定方法由cAMP产生所测定。
术语「胰高血糖素促效剂」是指包含刺激胰高血糖素受体活性(例如，如使用实施例14中所述的测定方法由cAMP产生所测量)的胰高血糖素胜肽的复合物。
如本文所使用的「胰高血糖素促效剂类似物」是一胰高血糖素胜肽包含有一序列，是选自由：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15所组成的群，或经修饰而包括一或多个处的保留性氨基酸取代，其是于第2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29号位置的保留性氨基酸取代。
如本文所使用的氨基酸的「修饰(modification)」是指氨基酸的取代、添加或删除，并包含任何人体内常见的20种氨基酸、特殊或非自然界产生的氨基酸的取代或添加。于整篇申请案中，所有以数字(例如，第28号位置)所提及的特定氨基酸位置是指在天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)中的该位置，或于其任何类似物中的对应氨基酸位置处者。例如，关于第28号位置是指对应于一胰高血糖素类似物(其SEQ IDNO：1序列的第一个氨基酸被删除)的第27号位置。同样地，关于第28号位置是指对应于一胰高血糖素类似物(其SEQ ID NO：1的胺基端前添加一个氨基酸)的第29号位置。特殊氨基酸的购买来源包括：Sigma-Aldrich(Milwaukee，WI)、ChemPepInc.(Miami，FL)，以及Genzyme Pharmaceuticals(Cambridge，MA)公司。特殊氨基酸可经由供货商所购得、再合成、化学修饰或由其他氨基酸衍生。
如本文所使用的「胰高血糖素共同促效剂」是于胰高血糖素受体显现相对于天然胰高血糖素为至少约10％至约500％或更高的活性，且亦于胰高血糖素样肽-1受体显现相对于天然胰高血糖素样肽-1为至少约10％至约200％或更高的活性的胰高血糖素胜肽。
如本文所使用的「胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂分子」是为一分子，其是于胰高血糖素受体显现相对于天然胰高血糖素为至少约10％的活性，且亦对胰高血糖素样肽-1受体显现相对于天然胰高血糖素样肽-1为至少约10％的活性。
如本文所使用的术语「天然胰高血糖素」是指由SEQ ID NO：1的序列所组成的胜肽，及术语「天然胰高血糖素样肽-1」为通称，指胰高血糖素样肽-1(7-36)酰胺(由SEQ ID NO：52的序列所组成)、胰高血糖素样肽-1(7-37)酸(由SEQ ID NO：50的序列所组成)、或该两化合物的混合。如本文所述，于无进一步指定下，提及「胰高血糖素」或「胰高血糖素样肽-1」分别是意指天然胰高血糖素或天然胰高血糖素样肽-1。
如本文所使用的氨基酸「取代(substitution)」是指以不同的氨基酸残基取代一氨基酸残基。
如本文所使用的术语：「保留性氨基酸取代(conservative amino acidsubstitution)」，于此是定义为下列五种群组内之一的交换：
I.小的、脂肪族、非极性或轻度极性残基：
丙氨酸(亦可简写为Ala)、丝氨酸(亦可简写为Ser)、苏氨酸(亦可简写为Thr)、脯氨酸(亦可简写为Pro)、甘氨酸(Gly)；
II.极性、带负电残基及其酰胺和酯：
天冬氨酸(亦可简写为Asp)、天冬酰胺(亦可简写为Asn)、谷氨酸(亦可简写为Glu)、谷氨酰胺(亦可简写为Gln)、氧化半胱氨酸(cysteic acid)及同胱氨酸(homocysteic acid)；
III.极性、带正电残基：
组氨酸(亦可简写为His)、精氨酸(亦可简写为Arg)、赖氨酸(亦可简写为Lys)；鸟氨酸(Ornithine，亦可简写为Orn)；
IV.大的、脂肪族、非极性残基：
甲硫氨酸(亦可简写为Met)、亮氨酸(亦可简写为Leu)、异亮氨酸(亦可简写为Ile)、缬氨酸(亦可简写为Val)、半胱氨酸(亦可简写为Cys)、正亮氨酸(Norleucine，亦可简写为Nle)、高半胱氨酸(homocysteine)；
V.大的、芳香族残基：
苯丙氨酸(亦可简写为Phe)、酪氨酸(亦可简写为Tyr)、色氨酸(亦可简写为Trp)、乙酰基苯丙氨酸(acetylphenylalanine)。
如本文所使用的一般术语「聚乙二醇链(polyethylene glycol chain)」或「PEG链(PEG chain)」是指由通式H(OCH2CH2)kOH所表示的环氧乙烷与水的呈分支链或直链的缩合聚合物的混合物，其中k至少为9。若不存在任何进一步的特征，则此术语是意指包括平均总分子量选自500至40,000道尔顿(Daltons)的范围的乙二醇的聚合物。「聚乙二醇链」或「PEG链」是与数字字尾结合使用，以指示其近似平均分子量。举例来说，PEG-5,000(5k PEG)是指具有总分子量平均值约5,000道尔顿的聚乙二醇链。
如本文所使用的术语「聚乙二醇化(pegylated)」及类似术语是指通过聚乙二醇链键结至化合物而由天然状态经修饰的化合物。「聚乙二醇化的胰高血糖素胜肽」是指一胰高血糖素胜肽，具有共价键结至该胰高血糖素胜肽的PEG链。
如本文所使用的广义「胜肽」是指包含经修饰胺基及羧基端的胜肽。举例来说，包含酰胺基替代末端羧酸的氨基酸链是意指涵盖于指示标准氨基酸的氨基酸序列内。
如本文所使用的「连接物(linker)」是使两个个别实体彼此结合的键、分子或分子基团。连接物可提供两实体的最适间隔，或可进一步提供使两实体可彼此隔开的不稳定键结。不稳定键结包括光分裂官能基、酸不稳定基团、碱不稳定基团及酵素可分裂基团。
如本文所使用的「二聚体(dimer)」是包含两个子单元通过连接物而彼此共价性键结的复合物。术语二聚体当在没有任何修饰语言下使用时，是涵盖同二聚体(homodimers)及异二聚体(heterodimers)两者。同二聚体包含两个相同的子单元，而异二聚体包含两个不同的子单元，尽管两个子单元实质上彼此相似。
如本文所使用的术语：「带电氨基酸(charged amino acid)」是指一氨基酸，其是包含在生理pH水溶液中带负电(即去质子化)或带正电(即质子化)侧链。举例来说，带负电的氨基酸包括：天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、同胱氨酸(homocysteicacid)、及高谷氨酸，而带正电的氨基酸包括：精氨酸、赖氨酸及组氨酸。带电氨基酸包括20种常见于人类蛋白质中的氨基酸，以及非典型或非自然产生的氨基酸中的带电氨基酸。
如本文所使用的术语：「酸性氨基酸」是指包含第二酸性基团，包括例如：羧酸基或磺酸基。
如本文所使用的术语「烷基」是指直链或分支的碳氢化合物，其是包含碳原子的标示号码。例示的烷基包括甲基、乙基、及直链丙基。
如本文所使用的术语「异烷基(heteroalkyl)」是指直链或分支的碳氢化合物，其是包含碳原子的标示号码，并于结构主链包含至少一个异质原子。适用于此的异质原子包含但不限于：氮、硫及氧。
附图说明
图1为本发明一较佳实施例。图1是呈现胰高血糖素Cys21马来酰亚胺基PEG5K分别在37℃下培养24、48、72、96、144及166小时稳定度的直方图；
图2为分别由胰高血糖素Cys21马来酰亚胺基PEG5K在pH5于37℃下培养24、72或144小时的HPLC分析所产生的数据；
图3为利用胰高血糖素类似物显示受体介导的cAMP诱导数据。更具体地说，图3A比较胰高血糖素受体受胰高血糖素类似物E16，K20●、E15，E16▲、E16，
Figure BDA0000121349000000301
E15，
Figure BDA0000121349000000302
及Gluc-NH2■的诱导；
图4A及4B呈现利用胰高血糖素类似物显示受体介导的cAMP诱导数据。更具体地说，图4A比较胰高血糖素受体受胰高血糖素类似物Gluc-NH2●、E16Gluc-NH2▲、E3，Orn3，
Figure BDA0000121349000000304
及Nle3，E16Gluc-NH2，
Figure BDA0000121349000000305
相对于天然胰高血糖素■的诱导，而图4B比较胰高血糖素样肽-1受体受胰高血糖素类似物Gluc-NH2●、E16Gluc-NH2▲、E3，
Figure BDA0000121349000000306
Orn3，
Figure BDA0000121349000000307
及Nle3，
Figure BDA0000121349000000308
相对于天然胰高血糖素样肽-1■的诱导；
图5A及5B呈现利用胰高血糖素类似物显示受体介导的cAMP诱导数据。更具体地说，图5A比较胰高血糖素受体受胰高血糖素类似物(E16，K20Gluc-NH2●(5nM，储存溶液)、E15，E16Gluc-NH2▲(5nM，储存溶液)、E16，
Figure BDA0000121349000000309
(10nM，储存溶液)、E15，
Figure BDA00001213490000003010
(10nM，储存溶液)及
Figure BDA00001213490000003011
)相对于胰高血糖素-NH2(■)的诱导，而图5B比较胰高血糖素样肽-1受体受胰高血糖素类似物(E16，K20Gluc-NH2●、E15，E16Gluc-NH2▲、及)相对于胰高血糖素样肽-1(■)及胰高血糖素-NH2(□)的诱导；
图6A及6B呈现利用胰高血糖素类似物显示受体介导的cAMP诱导数据。更具体地说，图6A比较胰高血糖素受体受胰高血糖素类似物(Gluc-NH2●、K12E16-NH2内酰胺▲、E16K20-NH2内酰胺K20E24-NH2内酰胺
Figure BDA00001213490000003014
及E24K28-NH2内酰胺
Figure BDA00001213490000003015
)相对于胰高血糖素(■)的诱导，而图6B比较胰高血糖素样肽-1受体受胰高血糖素类似物(Gluc-NH2●、K12E16-NH2内酰胺▲、E16K20-NH2内酰胺
Figure BDA00001213490000003016
K20E24-NH2内酰胺
Figure BDA00001213490000003017
及E24K28-NH2内酰胺)相对于胰高血糖素样肽-1受体(■)的诱导；
图7A及7B呈现利用胰高血糖素类似物显示受体介导的cAMP诱导数据。更具体地说，图7A比较胰高血糖素受体受胰高血糖素类似物(Gluc-NH2●、E16Gluc-NH2，▲、K12，E16Gluc-NH2内酰胺
Figure BDA0000121349000000311
E16，
Figure BDA0000121349000000312
及E16，K20Gluc-NH2内酰胺
Figure BDA0000121349000000313
)相对于胰高血糖素(■)的诱导，而图7B比较胰高血糖素样肽-1受体受胰高血糖素类似物(Gluc-NH2●、E16Gluc-NH2▲、K12，E16Gluc-NH2内酰胺
Figure BDA0000121349000000314
E16，
Figure BDA0000121349000000315
及E16，K20Gluc-NH2内酰胺)相对于胰高血糖素样肽-1(■)的诱导；
图8A～8F呈现由胰高血糖素类似物对胰高血糖素受体(图8A、8C及8E)或胰高血糖素样肽-1受体(图8B、8D及8F)显示受体介导cAMP诱导的数据，其中hE＝高谷氨酸(homoglutamic acid)及hC＝高胱氨酸(homocysteic acid)；
图9A及9B呈现利用胰高血糖素样肽-1(17-26)胰高血糖素类似物显示受体介导cAMP诱导的数据，其中天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的第17至26号位置氨基酸经天然胰高血糖素样肽-1(SEQ ID NO：50)的第17至26号位置氨基酸取代。更具体地说，图9A比较胰高血糖素受体受指定胰高血糖素样肽(17-26)胰高血糖素类似物的诱导，及图9B比较胰高血糖素样肽-1受体受指定胰高血糖素样肽(17-26)胰高血糖素类似物的诱导；
图10A～10E：是提供展现本发明的胰高血糖素胜肽于经皮下注射指示量各别化合物的老鼠中，诱发减重能力的活体内(in vivo)数据的图。图10A-10E中所列的关于胰高血糖素胜肽的序列识别号(Sequence Identifiers)是如下，关于图10A：Chimera2 Aib2 C24 40K PEG(SEQ ID NO：486)、Aib2 C24 Chimera 2 40K内酰胺(SEQ IDNO：504)及Aib2 E16 K20 Gluc-NH2 Lac 40K(SEQ ID NO：528)；图10B：Aib2 C24Chi 2内酰胺40K(SEQ ID NO：504)、DMIA1 C24 Chi 2内酰胺40K(SEQ ID NO：505)、Chimera 2 DMIA1 C24 40K(SEQ ID NO：519)、及Chimera 2 Aib2 C24 40K(SEQ ID NO：486)，其中在序列末端的数字是指示70或350nmol/kg的使用剂量；Fig.10C：AIB2w/内酰胺C24 40K(SEQ ID NO：504)、AIB2 E16 K20w/内酰胺C24 40K(SEQ ID NO：528)、DMIA1 E16 K20w/内酰胺C24 40K(SEQ ID NO：510)、DMIA1E16 K20w/内酰胺CEX 40K(SEQ ID NO：513)及DMIA1 E16 K20 w/o内酰胺CEX40K(SEQ ID NO：529)；图10D：AIB2w内酰胺C24 40K(SEQ ID NO：504)、AIB2E16 K20w内酰胺C24 40K(SEQ ID NO：528)、DMIA1 E16 K20w内酰胺C24 40K(SEQ ID NO：510)及DMIA1 E16 K20w内酰胺/Cex C24 40K(SEQ ID NO：513)，其中在序列末端的数字是指示14或70奈摩尔/公斤/周(nmol/kg/wk)的使用剂量；Fig.10E：AIB2w/o内酰胺C24 40K(SEQ ID NO：486)、Chi 2 AIB2 C24 CEX 40K(SEQ IDNO：533)、AIB2 E16 A18 K20 C24 40K(SEQ ID NO：492)，AIB2w/o内酰胺CEX G29C40 40K(SEQ ID NO：488)、AIB2w/o内酰胺CEX C40 C41-2(SEQ ID NO：532)、AIB2w/o内酰胺CEX C24 C40-2(SEQ ID NO：531)及AIB2w/o内酰胺C24 60K(SEQ ID NO：498)，其中40K或60K的指示是代表连接至胰高血糖素胜肽的聚乙二醇链的分子量；
图11-13是提供经乙酰化的胰高血糖素胜肽于经皮下注射指示量各别化合物的老鼠中，展现能力的活体内(in vivo)数据图表，该能力是指该经乙酰化的胰高血糖素胜肽诱发减重(图11)、减少食物摄取量(图12)、及降低血糖值；
图14A及14B呈现利用胰高血糖素类似物分别显示胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1受体介导的cAMP诱导数据；
图15表示饮食诱导肥胖模式(DIO)老鼠中血糖值(mg/dL)与时间(分钟)关系的图表，该老鼠是以下述物质治疗：2奈摩尔/公斤(nmol/kg)的赋形剂(以三角形代表)、Chimera-2 AIB2、K10-C8 Cys24-40kD PEG(以空心正方形代表)、或Chimera-2AIB2、K10-C16 Cys24-40kD PEG(以倒三角形代表)，接着在该胜肽施予后以葡萄糖注射15分钟；
图16表示饮食诱导肥胖模式(DIO)老鼠中血糖值(mg/dL)与时间(分钟)关系的图表，该老鼠是以下述物质治疗：20奈摩尔/公斤(nmol/kg)的赋形剂(以三角形代表)、Chimera-2 AIB2、K10-C8 Cys24-40kD PEG(以空心正方形代表)、或Chimera-2AIB2、K10-C16 Cys24-40kD PEG(以倒三角形代表)，接着在该胜肽施予后以葡萄糖注射15分钟；
图17表示饮食诱导肥胖模式(DIO)老鼠中血糖值(mg/dL)与时间(分钟)关系的图表，该老鼠是以下述物质治疗：70奈摩尔/公斤(nmol/kg)的赋形剂(以倒三角形代表)、Chimera-2 AIB2、K10-C8 Cys24-40kD PEG(以空心三角形代表)、或Chimera-2 AIB2、K10-C16 Cys24-40kD PEG(以钻石形代表)、或Chimera-2 AIB2，Cys24-40kD PEG(以空心正方形代表)，接着在该胜肽施予后以葡萄糖注射15分钟；
图18表示饮食诱导肥胖模式(DIO)老鼠中血糖值(mg/dL)与时间(分钟)关系的图表，该老鼠是以下述物质治疗：70奈摩尔/公斤(nmol/kg)的赋形剂(以倒三角形代表)、Chimera-2 AIB2、K10-C8 Cys24-40kD PEG(以空心三角形代表)、或Chimera-2 AIB2、K10-C16 Cys24-40kD PEG(以钻石形代表)、或Chimera-2 AIB2，Cys24-40kD PEG(以空心正方形代表)，接着在该胜肽施予后以葡萄糖注射24小时；
图19表示饮食诱导肥胖模式(DIO)老鼠中体重变化((％))与时间(天)关系的图表，该老鼠是以下述物质治疗：剂量15或70奈摩尔/公斤(nmol/kg)剂量的赋形剂(以实线钻石形代表)、Chimera-2 AIB2，Cys24-40kD PEG(15奈摩尔/公斤以虚线空心钻石形代表；70奈摩尔/公斤以实线空心三角形代表)；Chimera-2 AIB2、K10-C8Cys24-40kD PEG(15奈摩尔/公斤以虚线实心三角形代表；70奈摩尔/公斤以实线实心三角形代表)、或Chimera-2 AIB2、K10-C16 Cys24-40kD PEG(15奈摩尔/公斤以虚线倒三角形代表；70奈摩尔/公斤以实线倒三角形代表)；
图20表示老鼠体重总变化图表(％)，是在每周一次(QW)注射10、20、40或80奈摩尔/公斤(nmol/kg)的胜肽A K10-C14、或20nmol/kg Chimera-2 AIB2 K10-C8Cys24-40kD、或一赋形剂对照组；
图21表示血糖值(mg/dL)图表，该血糖值是对应于老鼠的一葡萄糖注射，其是注射有10、20、40或80奈摩尔/公斤(nmol/kg)的胜肽A K10-C14、或20nmol/kg Chimera-2AIB2 K10-C8 Cys24-40kD、或在该葡萄糖注射前24小时的一赋形剂对照组；
图22表示老鼠体重总变化图表(％)，该老鼠注射有标示剂量的赋形剂对照组、利拉鲁肽(liraglutide)、(C16)胰高血糖素酰胺、γE-γE-C16胰高血糖素酰胺、AA-C16胰高血糖素酰胺、或βAβA-C16胰高血糖素酰胺；
图23表示在此研究第七天测量的老鼠脂肪重量(g)图表，该老鼠注射有标示剂量的赋形剂对照组、利拉鲁肽(liraglutide)、(C16)胰高血糖素酰胺、γE-γE-C16胰高血糖素酰胺、AA-C16胰高血糖素酰胺、或βAβA-C16胰高血糖素酰胺；
图24表示老鼠血糖值变化图表(mg/dL；第七天的值-第0天的值)，该老鼠注射有标示剂量的赋形剂对照组、利拉鲁肽(liraglutide)、(C16)胰高血糖素酰胺、γE-γE-C16胰高血糖素酰胺、AA-C16胰高血糖素酰胺、或βAβA-C16胰高血糖素酰胺；
图25表示在有10％TFE或没有10％TFE的10mM磷酸(pH 5.9)中对胜肽X-PEG或胜肽Y-PEG的平均残余椭圆率(mean residue ellipticity)与波长(nm)关系的图表；
图26表示对应胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1、胜肽X、胜肽X-PEG、胜肽Y或结合有胰高血糖素受体(左)或胰高血糖素样肽-1受体的胜肽Y-PEG而产生的％cAMP与波长(nm)胜肽浓度关系的图表；
图27表示以赋形剂对照组、胜肽X-PEG、胜肽Y-PEG治疗一周的饮食诱导肥胖模式(DIO)老鼠中展现活体内(in vivo)效果的图表集合，该效果是A)体重、B)脂肪质量、C)食物摄取量及D)空腹血糖值。更具体地说，图27A表示一％体重(BW)变化与天数(天)关系的图表，图27B表示一在第7天测量的％脂肪重量变化(与初始脂肪重量测量比较)的图表，图27C表示一在第7天测量的此研究时间内总食物摄取量(g)的图表，及图27D表示一在第7天测量的血糖值变化(mg/dL)(与初始血糖值比较)的图表；
图28表示在各种剂量(nmol/kg/week)下，胜肽X-PEG(图28A和图28B)或胜肽Y-PEG(图28C和图28D)治疗的老鼠中展现活体内(in vivo)效果的图表集合，是：体重(图28A和图28C)及D)空腹血糖值(图28B和图28D)的图表集合；
图29表示以赋形剂对照组、胜肽X-PEG或胜肽Y-PEG治疗一个月的饮食诱导肥胖模式(DIO)老鼠中展现活体内(in vivo)效果的图表集合，是A)体重、B)脂肪质量、C)整体食物摄取量、D)能量消耗、E)呼吸商数(respiratory quotient)、F)自主活动性(locomotor activity)、G)空腹血糖值(fasting blood glucose)、H)葡萄糖耐量及I)总血浆胰岛素值的图表集合；
图30表示以赋形剂对照组、胜肽X-PEG或胜肽Y-PEG治疗一个月的饮食诱导肥胖模式(DIO)老鼠中展现活体内(in vivo)第三周对热量测量效果的图表集合，是A)食物摄取量、B)总能量消耗、C)总呼吸商数、D)自主活动性、E)总自主活动性、F)ipGTT曲线下的面积、G)血浆C胜肽值(plasma C-peptide levels)、H)PEPCK/HPRT倍数表现(fold expression)、及I)G6P/HPRT倍数表现的图表集合；
图31表示以赋形剂对照组、胜肽X-PEG、胜肽Y-PEG治疗一个月的饮食诱导肥胖模式(DIO)老鼠中展现活体内(in vivo)对血浆效果的图表集合，是A)胆固醇、B)胆固醇FPLC、C)三酸甘油酯、D)瘦体素(leptin)、E)抵抗素(resistin)、及F)脂联素(adiponectin)的图表集合；
图32表示以赋形剂对照组、胜肽X-PEG、胜肽Y-PEG治疗的老鼠中，通过激素敏感性脂解酶(pHSL)的磷酸化所反映在A)BATUCP-1表现值及B)白色脂肪组织展现活体内(in vivo)效果的图表集合；
图33表示以赋形剂对照组、胜肽X-PEG或胜肽Y-PEG治疗的饮食诱导肥胖模式(DIO)老鼠中展现活体内(in vivo)效果的图表集合，是A)体重及B)脂肪质量的图表集合。图33C表示一实时RT-PCR所定量评估的CD68对TFIIB相对表现的图表，是由赋形剂对照组、胜肽X-PEG或胜肽Y-PEG治疗两周的老鼠分离出的副睪脂肪组织的图表。数据是经显现为对TF1IB mRNA表现正常化的相对CD68 mRNA表现，且表示为平均崆EM；
图34A至34F表示以赋形剂对照组、胜肽X-PEG或胜肽Y-PEG治疗的GLP-1-R基因剔除老鼠中展现活体内(in vivo)效果的图表集合，是对体重(BW；34A及34B)、脂肪质量(34C)、食物摄取量(34D)及血糖值(34E及34F)的图表集合；
图35A至35C表示以赋形剂对照组、胜肽V、或胜肽U治疗的饮食诱导肥胖模式(DIO)老鼠中展现活体内(in vivo)效果的图表是列，是体重(35A)、血糖(35B)及脂肪质量(35C)的图表是列；
图36表示在此研究第十四天测量的老鼠体重总变化图表(％)，该老鼠注射有标示剂量的赋形剂、利拉鲁肽(liraglutide)、胰高血糖素酰胺、MT-261、MT-345、MT-347、或MT-348；
图37表示一在此研究第七天测量的老鼠体重总变化图表(％)，该老鼠注射有标示剂量的赋形剂、MT-278、MT-358、MT-261、MT-297、或MT-364；
图38表示一在此研究第七天测量的老鼠体重总变化图表(％)，该老鼠注射有标示剂量的唯一赋形剂、胜肽83、胜肽900、胜肽901或MT-364。
具体实施方式
本发明提供对胰高血糖素受体、或胰高血糖素样肽-1受体、或两受体具有增加或降低活性的胰高血糖素胜肽。本发明亦提供于胰高血糖素受体相对于胰高血糖素样肽-1受体具有经改变的选择性的胰高血糖素胜肽。
本发明提供对胰高血糖素受体、或胰高血糖素样肽-1受体、或两受体具有增加或降低活性的胰高血糖素胜肽。本发明亦提供于胰高血糖素受体相对于胰高血糖素样肽-1受体具有经改变的选择性的胰高血糖素胜肽。
于胰高血糖素受体增加活性是通过于天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)第16号位置处的氨基酸修饰所提供。于胰高血糖素受体维持或增加活性亦通过于天然胰高血糖素的第3号位置具有谷氨酰胺类似物(例如，(Dab(Ac))的氨基酸修饰所提供。
对胰高血糖素受体的降低活性，例如，经由如本文所述第3号位置处的氨基酸取代为酸性、碱性、或疏水性氨基酸而提供。
对胰高血糖素样肽-1受体增加的活性经由羧基端氨基酸替代为电中性基团，例如酰胺或酯而提供。
于胰高血糖素样肽-1受体增加的活性通过使胰高血糖素的羧基端部分(例如，约残基12-29)中的α螺旋稳定的修饰而提供。在某些实施例中，于胰高血糖素样肽-1受体增强的活性，亦可经由分子内架桥通过三个插入氨基酸(intervening amino acids)分隔的两个氨基酸侧链之间而形成，例如，如本文所述的第12及16、或16及20、或20及24号位置间。在其他实施例中，所述的修饰包括于第16、20、21或24号位置中的一或多处导入一或多个α，α-双取代氨基酸(如：胺基异丁酸(AIB))的插入或取代而修饰。
增加对缺少分子内架桥(例如：分子内架桥)的胜肽于胰高血糖素样肽-1及胰高血糖素的活性，是可通过共价性连接一酰基或烷基至该胜肽第10号位置氨基酸的侧链而达成，其中该酰基或烷基对于第10号位置氨基酸是非自然的。此等缺少分子内架桥(例如，共价性分子内架桥)的胜肽对胰高血糖素样肽-1及胰高血糖素受体的进一步增加的活性可通过在酰基或烷基与第10号位置氨基酸的侧链之间加入一间隔物而达成。适当的间隔物如本文所述，且包括但不限于具3至10个原子长度的间隔物。
如本文所述，于胰高血糖素样肽-1受体增加活性，是通过位于第20号位置的氨基酸修饰而提供。
对胰高血糖素样肽-1受体的增加活性是于包含SEQ ID NO：26的羧基端延伸的胰高血糖素类似物中提供。在所述包含SEQ ID NO：26的类似物中胰高血糖素样肽1活性进一步增加是通过如本文所述修饰位于第18、28或29号位置、或位于第18及29号位置的氨基酸而提供。
已在第1及2号位置处修饰氨基酸降低的胰高血糖素活性的恢复是通过如本文所述于由三个插入氨基酸所分隔的两个氨基酸(例如，第12与16、或16与20、或20与24号位置)侧链间的共价键来提供。
胰高血糖素样肽-1效能进一步适度增加，是通过修饰位于第10号位置的氨基酸为色氨酸而提供。
任何上述使胰高血糖素受体活性提高或降低且使胰高血糖素样肽-1受体活性提高的修饰，可被独自使用或以组合方式使用。任何上述修饰是可结合其他可赋予其他所需特性的修饰，例如增加溶解度及/或稳定度及/或作用期间。或者，任何上述修饰是可结合不会大幅影响溶解度或稳定度或活性的其他修饰。例示修饰包含但不限于：
(A)改善溶解度，举例来说，通过将一、二、三或多个带电氨基酸导入天然胰高血糖素的羧基端部分内而达成，较佳地，是羧基端至第27号位置。此氨基酸是可通过将天然氨基酸取代为带电氨基酸，例如：位于第28或第29号位置处，或者添加一个带电氨基酸，例如第27、28或29号位置后。在例示实施例中，一、二、三或全部的带电氨基酸均带负电。在其他实施例中，一、二、三或全部的带电氨基酸均带正电。所述修饰是可增加溶解度，例如在pH值5.5到8之间，如于pH值7，超过24小时，25℃条件下，提供相较天然胰高血糖素至少2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍或更高的溶解度。
(B)增加溶解度及作用期间或在循环时半生期是通过添加亲水性基团例如聚乙二醇链而达成，如本文所述，是添加在胜肽的第16、17、20、21、24、29号位置，或羧基端氨基酸。
(C)增加稳定度是通过第15号位置的天冬氨酸的修饰而达成，例如：删除或取代为谷氨酸、高谷氨酸、磺基丙氨酸(cysteic acid)或高半胱氨酸(homocysteic acid)。所述修饰是可减少于pH值5.5到8范围间的降解或切割，例如于24小时后，25℃条件下，保留至少原胜肽的75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
(D)增加溶解度是通过第27号位置的甲硫氨酸的修饰而达成，例如：取代为亮氨酸或正亮氨酸。此等修饰是可减少氧化性降解。稳定度是可通过修饰第20或24号位置的谷氨酰胺而增加，例如取代为丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或胺基异丁酸。此等修饰是可减少通过谷氨酰胺的脱酰胺作用而发生的降解。稳定度是可通过修饰第21号位置的天冬氨酸而增加，例如取代为谷氨酸。此等修饰是可减少通过天冬氨酸的脱水作用而发生的降解，该天冬氨酸的脱水作用是形成环化琥珀酰亚胺，其后藉异构化反应产生异天冬氨酸(iso-aspartate)。
(E)提高对第四型双胜肽蛋白水解酶切割的抗性是通过如本文所述修饰于第1或2号位置的氨基酸而达成。
(F)保留性或非保留性取代、添加或删除是不会影响活性，举例来说，在第2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29号位置中一或多个保留性取代；第27、28或29号位置之一或多个氨基酸删除；或第29号位置的氨基酸删除，并可选择的结合将羧基端酰胺或酯取代为羧基端羧酸基；
(G)添加如本文所述的羧基端延伸；
(H)增加于循环时半生期及/或延长作用期间及/或延迟起效作用，举例来说，通过如本文所述胰高血糖素胜肽酰基化或烷基化而达成；
(I)如本文所述的同二聚体化或异二聚体化。
在例示实施例中，胰高血糖素胜肽可相对于天然胰高血糖素序列包含总计1个、高达2个、高达3个、高达4个、高达5个、高达6个、高达7个、高达8个、高达9个、或高达10个氨基酸修饰。
其他修饰包含：第1号位置的组氨酸取代为大的芳香族氨基酸(例如：酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或胺基苯丙氨酸)；
第2号位置的丝氨酸取代为丙氨酸；
第10号位置的酪氨酸取代为缬氨酸或苯丙氨酸；
在第12号位置的赖氨酸取代为精氨酸；
在第15号位置的天冬氨酸取代为谷氨酸；
在第16号位置的丝氨酸取代为苏氨酸或胺基异丁酸(AIB)。
如本文所揭示的一实施例是关于一种胰高血糖素促效剂，其是已修饰相对于His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQ ID NO：1)的野生型胜肽，以增进胜肽对胰高血糖素受体的效能。令人惊奇地，申请人已发现在天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的第16号位置处正常发生的丝氨酸可取代为经选定的酸性氨基酸，以在一有效体外模型测定方法(见实施例14)的刺激cAMP合成能力的方面，增强胰高血糖素效能。更具体地说，该取代增强类似物于胰高血糖素受体的效能至少为大于2倍、4倍、5倍，以及高达10倍。该取代增加类似物于胰高血糖素样肽-1受体的活性，至少为相对于天然胰高血糖素的5倍、10倍或15倍，但选择性仍维持对胰高血糖素受体超过对胰高血糖素样肽-1受体。
依据一实施例，在天然胰高血糖素第16号位置的丝氨酸残基取代为一氨基酸，其是选自包含谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸(homoglutamic acid)、高胱氨酸(homocysteic acid)、苏氨酸及甘氨酸所组成的群。依据一实施例，于天然胰高血糖素第16号位置的丝氨酸残基取代为一氨基酸，其是选自包含谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸(homoglutamic acid)、高半胱氨酸(homocysteic acid)所组成的群，且在一实施例中，丝氨酸残基取代为谷氨酸。在一实施例中，该胰高血糖素胜肽于胰高血糖素受体增强选择性，其是包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10的胜肽，或其胰高血糖素促效剂类似物，其中该羧基端氨基酸保留其天然的羧酸基。根据一实施例，提供一种包含NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH(SEQ ID NO：10)的序列的胰高血糖素促效剂，其中如利用实施例14的体外cAMP测定方法所测量，该胜肽于胰高血糖素受体显现相对于天然胰高血糖素大约五倍的增强效能。
亲水性基团
本发明的胰高血糖素胜肽是可进一步修饰以增加在生理pH值水溶液中的溶解度及稳定度，而可保留相对于天然胰高血糖素的高生物活性。诸如聚乙二醇基的亲水性基团可用于使蛋白质与活化聚合物分子反应的任何适当条件下连接至胰高血糖素胜肽。可使用任何已为本领域的人所熟知的方法，包含：通过酰基化、还原性烷基化、麦可加成(Michael addition)、硫醇烷基化或其他化学选择性结合/连接方法，其是通过在聚乙二醇基团上的反应基(例如：醛基、胺基、酯基、硫醇基、α-卤素乙酰基(α-haloacetyl)、马来酰亚胺基(maleimido)、或胼基(hydrazino group))而连接至目标化合物的反应基(例如：醛基、胺基、酯基、硫醇基、α-卤素乙酰基、马来酰亚胺基、或胼基)。活化基团可用于连接水溶性聚合物至一或多个蛋白质，包括但不限于磺基(sulfone)、马来酰亚胺(maleimide)、硫氢基(sulfhydryl)、硫醇基、三氟甲基磺酸酯、三氟乙基磺酸酯(tresylate)、氮丙啶、环氧乙烷、5-吡啶基及α-卤化酰基(alpha-halogenated acyl group)，例如：α-碘乙酸(alpha-iodo aceticacid)、α-溴乙酸(alpha-bromoacetic acid)、α-氯乙酸(alpha-chloroacetic acid)。若通过还原性烷基化连接，该聚合物应具有单一反应醛基，而可控制聚合反应的程度。请参阅，例如：Kinstler et al.，Adv.Drug.Delivery Rev.54：477-485(2002)；Robertset al.，Adv.Drug Delivery Rev.54：459-476(2002)；and Zalipsky et al.，Adv.DrugDelivery Rev.16：157-182(1995).
在本发明之一特定方面中，在具有硫醇的胰高血糖素胜肽上的氨基酸残基是经如聚乙二醇的亲水性基团修饰。在某些实施例中，该硫醇是在麦可加成反应下以马来酰亚胺-活化聚乙二醇修饰，产生聚乙二醇化胜肽包含如下所示的硫醚(thioether)键结：
在某些实施例中，该硫醇是于亲核剂取代反应下以卤素乙酰基-活化聚乙二醇修饰，产生聚乙二醇化胜肽包含如下所示的硫醚(thioether)键结：
Figure BDA0000121349000000392
合适的亲水性基团包含聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇(polyoxyethylated polyols)(例如：POG)、聚氧乙基化山梨醇(polyoxyethylatedsorbitol)、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化丙三醇(polyoxyethylated glycerol，POG)、聚氧化烯(polyoxyalkylenes)、聚乙二醇丙醛(polyethylene glycol propionaldehyde)、乙二醇/丙二醇的共聚物、单甲氧基聚乙二醇(monomethoxy-polyethylene glycol)、单-(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇(mono-(C1-C10)alkoxy-oraryloxy-polyethylene glycol)、羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose)、聚缩醛(polyacetals)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)，聚乙烯氢吡咯酮(polyvinylpyrrolidone)、聚1，3-二氧环戊烷(poly-1，3-dioxolane)、聚1，3，6-三氧环戊烷(poly-1，3，6-trioxane)、乙二醇/顺丁烯二酸酐的共聚物(ethylene/maleic anhydridecopolymer)、聚(β-氨基酸)(可为同元聚合物或任意共聚物)、聚N-乙烯氢吡咯酮聚乙二醇(poly(n-vinyl pyrrolidone)polyethylene glycol)、丙二醇(propropylene glycol，PPG)同元聚合物及其他聚环氧烷化合物(polyalkylene oxides)、聚环氧丙烷/环氧乙烷的共聚物(polypropylene oxide/ethylene oxide copolymers)、结肠酸(colonicacids)或其他多糖聚合物、聚蔗糖(Ficoll)或聚葡萄糖(dextran)及其混合物。聚葡萄糖为主要通过α1-6键(α1-6 linkages)键结的葡萄糖次单元的多糖聚合物。聚葡萄糖多种有效的分子量范围，例如约1kD至100kD，或从约5、10、15或20kD至20、30、40、50、60、70、80或90kD。直链或分支聚合物在考虑范围内。结合物的合成制备主要可为单分散或多分散，并具有每胜肽约0.5、0.7、1、1.2、1.5或2聚合物基团。
依据一实施例，在SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的胜肽中，导入亲水性基团至第17、21及24号位置，预期可改善高效能胰高血糖素类似物在生理pH值溶液中的溶解度及稳定度。导入此类基团亦可增加作用期间，例如测量于循环时半生期。合适的亲水性基团包含任何已为人所熟知的可溶性聚合物，包含：聚乙二醇、聚乙二醇同元聚合物或共聚物、一聚乙二醇的单甲基取代聚合物(monomethyl-substitutedpolymer of PEG，mPEG)或聚氧乙烯甘油(polyoxyethylene glycerol(POG))。依据一实施例，该亲水性基可包含聚乙二醇(PEG)链。更具体地说，在一实施例中该胰高血糖素胜肽包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的序列，其中聚乙二醇链共价性连接于该胰高血糖素胜肽的第21及24号位置氨基酸的侧链，或其具有羧酸基的羧基端氨基酸。
结合物
本发明揭示内容亦涵盖其他结合物，其中本发明的胰高血糖素相关胜肽可选择的通过共价性键结，并可选择的通过连接物键结至结合物基团。键结可通过共价性化学键、物理力诸如静电、氢、离子、范德华力(van der Waals)、或疏水性或亲水性交互作用而达成。可使用各种非共价偶合系统，包括生物素-抗生物素蛋白质(biotin-avidin)、配体/受体、酵素/基质、核酸/核酸结合蛋白质、脂质/脂质结合蛋白质、细胞黏附分子伴体(cellular adhesion molecule partners)；或其对于彼此具有亲和力的任何结合伴体或片段。
该胰高血糖素相关胜肽可结合于结合物基团，其是通过标的胜肽氨基酸残基与一有机衍生化试剂而直接共价性键结，该有机衍生化试剂能与选定的侧链或是该标的氨基酸的胺基端、羧基端氨基酸进行反应。该胜肽或结合物基团的反应官能基包括如：醛基、胺基、酯基、硫醇基、α-卤素乙酰基(α-haloacetyl)、马来酰亚胺基(maleimido)、胼基(hydrazino)。衍生化试剂包括：如马来酰亚胺苯甲酰硫化琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通过半胱氨酸残基结合)，N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)(通过赖氨酸残基结合)，戊二醛(glutaraldehyde)，琥珀酸酐，或其他已于该领域所熟知药剂。或者，结合物基团可间接地通过一中间载体结合于该胜肽，例如多糖或多肽载体。多糖载体的实施例包括胺葡聚糖(aminodextran)。适合的多肽载体的实施例包括：聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、及其共聚物、以及前述氨基酸或其他氨基酸的混合聚合物，例如丝氨酸，以赋予其载体期望的溶解度性质。
半胱氨酸残基最常与α-卤乙酸酯(及相关胺类)进行反应，例如：氯乙酸或氯乙酰胺，以产生羧甲基或酰胺甲基(carboxyamidomethyl)的衍生物。半胱氨酸残基亦会衍生自与溴三氟丙酮(bromotrifluoroacetone)、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸(alpha-bromo-β-(5-imidozoyl)propionic acid)、氯乙酰磷酸酯(chloroacetylphosphate)、N-烷基马来酰亚胺(N-alkylmaleimides)、二硫化3-硝基-2-吡啶(3-nitro-2-pyridyl disulfide)、二硫化甲基2-吡啶(methyl 2-pyridyl disulfide)、对氯汞苯甲酸盐(p-chloromercuribenzoate)、2-氯汞4-硝基苯酚(2-chloromercuri-4-nitrophenol)、或氯-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二氮唑(chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1，3-diazole)的反应中。
组氨酸残基会衍生自与焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)在pH值为5.5-7.0的反应下，因为此化合物对于组氨酸侧链相对专一。对溴苯酰甲基溴(Para-bromophenacyl bromide)同样具有作用；此反应的较佳条件是在pH 6.0的0.1M的二甲砷酸钠(sodium cacodylate)。
赖氨酸及胺基端残基会与琥珀酸及其他羧酸酐进行反应。与这些成分的衍生反应可反转改变离胺酰基所带电荷。其他适于衍生具有α胺基残基者包括有：亚胺酯(imidoesters)，例如：甲基吡啶亚胺甲酯(methyl picolinimidate)、吡哆醛磷酸(pyridoxal phosphate)、吡哆醛(pyridoxal)、氢氯硼化物(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid)、O-甲基异脲硫酸盐(O-methylisourea)、2，4-戊二酮(2，4-pentanedione)以及与乙醛酸(glyoxylate)的转胺酶催化反应(transaminase-catalyzed reaction)。
精氨酸残基可通过与一或数个传统反应剂发生反应进行修饰，包括：苯甲酰甲醛(phenylglyoxal)、2，3-丁二酮(2，3-butanedione)、1，2-环己二酮(1，2-cyclohexanedione)及茚三酮(ninhydrin)。由于胍(guanidine)官能基的高pKa，精氨酸残基的衍生反应需要在碱性环境下。更甚者，此等成分除可与精氨酸的基团发生反应外，也可与精氨酸的ε胺基反应。
酪氨酸残基的特定修饰可特别重要地在于酪氨酸残基导入光谱标记完成，是经由芳香族重氮(aromatic diazonium)化合物或四硝基甲烷(tetranitromethane)的反应形成。最常见地，是将N-乙酰咪唑(N-acetylimidizole)及四硝基甲烷(tetranitromethane)用以分别形成O-乙酰酪胺酰类(O-acetyl tyrosyl species)及3-氮衍生物。
羧酸侧基团(天冬胺基或糓胺基)是选择性地通过与碳化二亚胺(carbodiimides)(R-N＝C＝N-R′)反应修饰，其中R及R′是为不同烷基，例如1-环己基-3-(2-吗琳基-4-乙基)-碳化二亚胺(1-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimide)或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-双甲基戊基)-碳化二亚胺(1-ethyl-3-(4-azonia-4，4-dimethylpentyl)carbodiimide)。更甚者，天冬胺基或谷胺基通过与铵离子反应而转变为天冬酰胺基或谷氨酰胺基。
其他修饰作用包括脯氨酸及赖氨酸的氢氧化，丝氨酸及苏氨酸的磷酸化，赖氨酸、精氨酸及组氨酸侧链α胺基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure andMolecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，pp.79-86(1983))、天冬酰氨酸或谷氨酰胺的去酰胺化、胺基端胺基的乙酰化，及/或羧基端羧酸基的酰胺化或酯化。
另一共价修饰包括化学性或酵素性偶合糖苷(glycosides)结合于该胜肽。糖类是可结合于(a)精氨酸及组氨酸、(b)游离羧酸基、(c)游离硫氢基(例如半胱氨酸)、(d)丝氨酸、苏氨酸及氢氧化脯氨酸的自由羟基、(e)酪氨酸或色氨酸的芳香残基、或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于在1987年9月11日公开的第WO87/05330号前案，以及Aplin and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981).
例示的结合物是可连接至任何如本文所述的胰高血糖素相关胜肽，包括但不限于：异源性胜肽(heterologous)或多肽(包括，例如：血浆蛋白)、标靶药剂、免疫球蛋白或其部位(例如可变区、CDR或Fc部位)、诊断标记(例如：同位素、荧光或酵素标记)、一聚合物是包括有水溶性聚合物、或其他治疗性或诊断性药剂。在一实施例中，提供一种结合物，其包括一胰高血糖素胜肽及一血浆蛋白，其中该血浆蛋白是选自于包含：白蛋白、运铁蛋白、纤维蛋白原及球蛋白所组成的群。在一实施例中，该结合物的血浆蛋白基团是为白蛋白或运铁蛋白。
在某些实施例中，连接物包括约1至60、1至30个原子或更长的链，2至5、2至10、5至10、10至20个原子长。在某些实施例中，该链的原子全为碳原子。在某些实施例中，组成连接物主链的链原子是选自于包含：碳、氧、氮及硫所组成的群。链原子及连接物是选自依据其期望的溶解度(亲水性)，以提供一更易溶解的结合物。在某些实施例中，连接物提供一种官能基，该官能基易受到酵素或其他催化剂，或在标的组织或器官或细胞中发现水解情形而切割。在某些实施例中，连接物的长度足以减少立体障碍的效能。若连接物是为共价键或肽键，且结合物是为多肽，则整体结合物是可为融合蛋白。此类胜肽连接物是可为任何长度。例示的连接物是为约1至50个氨基酸长度，5至50、3至5、5至10、5至15或10至30个氨基酸长度。另一种方式为所述融合蛋白是可以通过本领域技术人员所熟知的基因重组工程方法所生成。
如前所述，在某些实施例中，该胰高血糖素胜肽是结合有，例如：融合于至免疫球蛋白或其部位(例如：可变区、CDR或Fc部位)。已知的免疫球蛋白(Ig)种类包括：IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc部位是为免疫球蛋白重链的羧基端部位，用以键结至Fc受体以表现活性，例如：再利用(以延长其半生期)、抗体依赖毒杀细胞反应(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，以下简称ADCC)、及补体依赖毒杀细胞反应(complement dependent cytotoxicity，以下简称CDC)。
举例来说，依据某些定义而言，人类免疫球蛋白IgG的重链Fc部位由半胱氨酸226(半胱氨酸226)延伸至重链的羧基端。「枢纽部位(hinge region)」一般是由人类免疫球蛋白IgG1的谷氨酸216(Glu216)延伸至脯氨酸230(Pro230)(其他构造同型(isotypes)IgG的枢纽部位可对齐于IgG1系列，其是通过对齐于包含于半胱氨酸键结的半胱氨酸)。人类免疫球蛋白IgG的Fc部位包括两不变区域(constantdomains)：CH2及CH3。人类免疫球蛋白IgG中Fc部位的CH2区是由第231号位置氨基酸延伸至341号位置氨基酸。人类免疫球蛋白IgG中Fc部位的CH2区是由第342号位置氨基酸延伸至447号位置氨基酸。免疫球蛋白、其片段或区域的氨基酸编号是依据Kabat et al.1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department of Public Health，Bethesda，Md.在一相关实施例中，Fc部位是可包括一或多个天然或经修饰的免疫球蛋白重链不变区域，除CH1外，例如，免疫球蛋白IgG及IgA的CH2与CH3区域，或免疫球蛋白IgE的CH3及CH4区域。
适合的结合物基团包括含有FcRn结合部免疫球蛋白序列的部位。FcRn是一种补救性受体(salvage receptor)，负责免疫球蛋白的再利用且将其送回血液中循环。FcRn部位中键结IgG至FcRn受体的区域已利用X光结晶法显示(Burmeister et al.1994，Nature 372：379)。FcRn及Fc主要接触的区域是接近于CH2和CH3区域的连接位置。FcRn及Fc均于单一IgG的重链内。主要接触的位置包括：CH2区域中第248、250至257、272、285、288、290至291、308至311、及314号位置的氨基酸残基，以及CH3区域中第385至387、428、及433至436号位置的氨基酸残基。
某些结合物基团是可以包括或不包括FcγR结合部。FcγR结合部是用以负责ADCC及CDC进行。Fc区域与FcγR直接接触的位置于第234至239号氨基酸(低枢纽区域)、第265至269号氨基酸(B/Cloop)、第297至299号氨基酸(C′/E loop)、及第327至332号氨基酸(F/G loop)(Sondermann et al，Nature 406：267-273，2000)。IgE的低枢纽区域亦包括于FcRI结合中(Henry，et al，Biochemistry 36，15568-15578，1997)。IgA受体结合的氨基酸残基已发表于Lewis et al.，(J Immunol.175：6694-701，2005)。IgE受体结合的氨基酸残基已发表于Sayers et al.(J Biol Chem.279(34)：35320-5，2004)。
免疫球蛋白的Fc区域亦可形成氨基酸修饰。这些可变的Fc区域至少包括在Fc区域的CH3区域(第342至447号位置)之一氨基酸修饰，及/或至少一氨基酸修饰于Fc区域的CH2区域(第231至341号位置)。某些突变可增加对FcRn的亲和力，包括T256A、T307A、E380A，及N434A(Shields et al.2001，J.Biol.Chem.276：6591)。其他突变在不明显减少FcRn的亲和力情形下，可减少Fc区域对FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB，及/或FcγRIIIA的亲和力。例如，将Fc区域中第297号位置的天冬酰氨酸取代为丙氨酸或其他氨基酸，可除去高度保留的N-糖化部，并伴随着Fc区域半生期的延长而导致免疫力降低，也减少结合于FcγRs(Routledge et al.1995，Transplantation 60：847；Friend etal.1999，Transplantation 68：1632；Shieldsetal.1995，J.Biol.Chem.276：6591)。在IgG1的第233至236号位置的氨基酸修饰可减少结合于FcγRs(Ward and Ghetie 1995，Therapeutic Immunology 2：77及Armour et al.1999，Eur.J.Immunol.29：2613)。某些例示的氨基酸取代揭示于美国专利第7,355,008及7,381,408号，前述每一申请案揭示内容全体皆引用作为本说明书的参考数据。
融合蛋白及末端延伸
本发明亦涵盖胰高血糖素融合胜肽或蛋白质，其中一第二胜肽或多肽已融合至胰高血糖素胜肽的末端(例如，羧基端)。更具体地说，该融合胰高血糖素胜肽是可包含SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的胰高血糖素促效剂，其进一步包含一连接至胰高血糖素胜肽中第29号位置氨基酸的SEQ IDNO：26(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：27(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：28(KRNR)氨基酸序列。在一实施例中，SEQ ID NO：26(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：27(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：28(KRNR)的氨基酸序列，是通过胜肽键连接至胰高血糖素胜肽中第29号氨基酸。申请人发现，该第三类胰高血糖素相关胜肽的融合胜肽包含促胰岛素分泌素-4(例如，SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29)的羧基端延伸，第29号位置的天然苏氨酸残基取代为甘氨酸将大幅增加胰高血糖素样肽-1受体活性。此氨基酸取代是可与其他如本文所述的修饰一起使用，以增进胰高血糖素类似物于胰高血糖素样肽-1受体的亲和力。举例来说，此苏氨酸29甘氨酸(T29G)取代可结合丝氨酸16谷氨酸(S16E)及天冬酰氨酸20赖氨酸(N20K)氨基酸取代，可选择的在第16及20号位置的氨基酸间具有内酰胺架桥，以及可选择的添加如本文所述的聚乙二醇链。在一个实施例中，提供胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂包含SEQ ID NO：64的序列。在某些实施例中，该胰高血糖素融合胜肽的胰高血糖素胜肽部分是选自于包含SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、及SEQ ID NO：5所组成的群，其中具有一聚乙二醇链，该聚乙二醇链存在于第17、21、24号位置、或羧基端氨基酸、或第21及24号位置均存在，该聚乙二醇链的范围选自于约500至40,000道尔顿(Daltons)。更具体地说，在某些实施例中，该胰高血糖素胜肽片段，是选自于包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、及SEQ ID NO：63所组成的群，其中该聚乙二醇链的范围选自于约500至5,000道尔顿(Daltons)。在一个实施例中，该胰高血糖素胜肽为融合胜肽，包含SEQ ID NO：65的序列，其中SEQ ID NO：65的胜肽连接至SEQ ID NO：55的羧基端。
电中性羧基端
依据实施例，SEQ ID NO：10的胰高血糖素胜肽中额外的化学修饰赋予增加胰高血糖素样肽-1受体效能，其是增加至于胰高血糖素受体及胰高血糖素样肽-1受体的相对活性几乎相等的程度。因此，在一个实施例中，提供一种胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1受体共同促效剂，其中本发明的胰高血糖素胜肽的末端氨基酸具有酰胺基以取代天然氨基酸的羧酸基。于个别胰高血糖素受体及胰高血糖素样肽-1受体的胰高血糖素类似物相对活性，是可通过对该胰高血糖素胜肽进一步修饰而调整，生产的类似物证实于胰高血糖素受体具约40％至500％或更高的天然胰高血糖素活性，以及于胰高血糖素样肽-1受体具约20％至200％或更高的天然胰高血糖素样肽-1活性，例如：相对于胰高血糖素样肽-1受体的胰高血糖素正常活性增加50倍、100倍或更高。在某些实施例中，本文所述的胰高血糖素胜肽于胰高血糖素受体显现高达约100％、1000％、10,000％、100,000％，或1,000,000％的天然胰高血糖素活性。在某些实施例中，本文所述的胰高血糖素胜肽于胰高血糖素样肽-1受体显现高达约100％、1000％、10,000％、100,000％，或1,000,000％的天然胰高血糖素样肽-1活性。
α螺旋/分子内架桥的稳定化
在另一个实施例中，提供显现增强的胰高血糖素样肽-1受体促效剂活性的胰高血糖素类似物，其中于两个氨基酸侧链之间形成分子内架桥，以使胜肽的羧基端的三维结构稳定。该两氨基酸侧链可经由非共价键(例如，氢键结)、离子交互作用(诸如形成盐桥)、或通过共价键相互连接。当两个氨基酸侧链是通过一或多个共价键相互连接时，该所述的胜肽可被视为包含共价性分子内架桥。当两个氨基酸侧链是通过非共价键(例如，氢键、离子交互作用)相互连接时，该所述的胜肽可被视为包含非共价性分子内架桥。
在某些实施例中，分子内架桥形成于间隔3个氨基酸的两氨基酸间，例如：第i及i+4号位置的氨基酸，其中i为任何介于12及25间的整数(例如第12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、及25号位置)。更具体地说，于12及16、16及20、20及24、24及28号的氨基酸对(氨基酸对中i＝12、16、20、或24)互相连接，因此稳定胰高血糖素的α螺旋。或者，i可为17。
在某些特定实施例中，其中第i及i+4号位置氨基酸是通过分子内架桥连接，该连接物约8个原子，或约7至9个原子。
在其他实施例中，分子内架桥形成于间隔2个氨基酸的两氨基酸间，例如：第j及j+3号位置的氨基酸，其中j为任何介于12及26间的整数(例如第12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25及26号位置)。在某些特定实施例中，j为17。
在某些特定实施例中，其中第j及j+3号位置氨基酸是通过分子内架桥连接，该连接物约6个原子，或约5至7个原子。
在又一实施例中，分子内架桥形成于间隔6个氨基酸的两氨基酸间，例如：第k及k+7号位置的氨基酸，其中k为任何介于12及22间的整数(例如第12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、及22号位置)。在某些特定实施例中，k是为12、13、或17。在例示实施例中，k是为17。
可共价性键结形成6个原子连接架桥的氨基酸对实施例包括：鸟氨酸与天冬氨酸、谷氨酸与包括化学式I的氨基酸，其中n为2、及高谷氨酸与包括化学式I的氨基酸，其中n为1，其中化学式I是为：
[化学式I]
可共价性键结形成7个原子连接架桥的氨基酸对实施例包括：鸟氨酸-谷氨酸(内酰胺环)；赖氨酸-天冬氨酸(内酰胺)；或高丝氨酸-高谷氨酸(内酯)。可形成8个原子的连接物氨基酸对实施例包括：赖氨酸-谷氨酸(内酰胺)；高赖氨酸-天冬氨酸(内酰胺)；鸟氨酸-高谷氨酸(内酰胺)；4-胺基苯丙氨酸-天冬氨酸(内酰胺)；或酪氨酸-天冬氨酸(内酯)。可形成9个原子连接物的氨基酸对实施例包括：高赖氨酸-谷氨酸(内酰胺)；赖氨酸-高谷氨酸(内酰胺)；4-胺基苯丙氨酸-谷氨酸(内酰胺)；或酪氨酸-谷氨酸(内酯)。此类氨基酸上的任何侧链是可额外地取代为添加的化学基团，只要α螺旋体的三维结构不会被破坏即可。本领域技术人员可预想包括化学修饰衍生物的取代配对或取代氨基酸类似物，将产生类似大小及期望效果的稳定化结构。举例来说，高半胱氨酸-高半胱氨酸双硫架桥的长度为6个原子，且可进一步修饰以提供期望效果。即使没有共价键结，上述的氨基酸对或本领域技术人员可预想的类似配对亦可通过非共价键(例如，通过形成盐桥或氢键的交互作用)而对α螺旋提供增加的稳定度。
进一步例示实施例包括下列氨基酸对，可选择的具有内酰胺架桥：第12号位置谷氨酸与第16号位置赖氨酸；第12号位置天然赖氨酸与第16号位置谷氨酸；第16号位置谷氨酸与第20号位置赖氨酸；第16号位置赖氨酸与第20号位置谷氨酸；第20号位置谷氨酸与第24号位置赖氨酸；第20号位置赖氨酸与第24号位置谷氨酸；第24号位置谷氨酸与第28号位置赖氨酸；第24号位置赖氨酸与第28号位置谷氨酸。
根据一实施例，提供一种显现胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1受体共同促效剂活性的胰高血糖素类似物，其中该类似物包含一氨基酸序列，其选自由SEQ ID NO：11、47、48及49所组成的群。在一实施例中，该侧链是共价性互相键结，且在一实施例中，两氨基酸是互相键结以形成内酰胺环。内酰胺环的大小是可随其氨基酸侧链长度而变，在一实施例中，内酰胺是通过赖氨酸侧链连接至谷氨酸侧链而形成。
内酰胺环的酰胺键顺序可相反(例如：内酰胺环可形成于第12号位置赖氨酸与第16号位置谷氨酸间，或者第12号位置谷氨酸与第16号位置赖氨酸间)。依据一实施例，提供一种SEQ ID NO：45的胰高血糖素类似物，其中至少一个内酰胺环形成于氨基酸对的侧链间，该氨基酸对是选自包含：第12与16，第16与20、第20与24、及第24与28号位置组成的群组。在一实施例中，提供一胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂包含SEQ ID NO：20之一胰高血糖素胜肽类似物，其中该胜肽包含一分子内内酰胺架桥，其是形成于第12及16号、或第16及20号氨基酸位置间。在一实施例中，提供一胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂包含SEQ ID NO：20的序列，其中一分子内内酰胺架桥形成于第12及16号、或第16及20号、或第20及24号氨基酸位置间，且第29号位置为甘氨酸，其中SEQ ID NO：29是连接至SEQ ID NO：20的羧基端氨基酸。在另外的实施例中，第28号位置为天冬氨酸。
可用除内酰胺架桥外的分子内架桥来稳定胰高血糖素类似物胜肽的α螺旋。在一实施例中，该分子内架桥是为一疏水性架桥。在此实施例中，分子内架桥是较佳地位于两氨基酸侧链间，其是胰高血糖素类似物胜肽α螺旋的疏水性面之一部份。举例来说，加入疏水性架桥的氨基酸可以是第10、14、及18号位置的氨基酸。
在一特定方面，烯烃复分解反应(olefin metathesis)是利用全碳水化合物交叉链接系统，而用于交联胰高血糖素胜肽的α螺旋之一或二个弯折。在此例中，胰高血糖素胜肽可包括α-甲基化氨基酸，其具有可变长度的烯烃侧链，且于i及i+4或i+7位置结合R或S立体化学组态。举例来说，烯烃侧链可包括(CH2)n，其中n为1～6之间任一整数。在一实施例中，交联长度为8个原子时，n为3。适于形成此类分子内架桥的方法如先前技术所述，例如可参阅Schafmeister et al.，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)及Walensky et al.，Science 305：1466-1470(2004).或者，该胰高血糖素胜肽可包括氧-烯基丝氨酸(O-allyl Ser)残基，其是邻近于螺旋弯折，通过钌催化环亲近复分解反应(ruthenium-catalyzed ring closing metathesis)而架桥在一起。这里所述的交联方式可参阅例如BlackWell et al.，Angew，Chem.，Int.Ed.37：3281-3284(1998)。
在另一特定方面，利用非自然硫代二丙氨酸氨基酸(thio-dialanine)、羊毛硫氨酸(lanthionine)，其可广泛地应用作为半胱氨酸的拟肽(peptidomimetic)，被用于交联α螺旋的弯折。适于羊毛硫氨酸基础的环化方法是为本领域技术人员所熟知，可参阅例如Matteucci et al.，Tetrahedron Letters 45：1399-1401(2004)；Mayer et al.，J.Peptide Res.51：432-436(1998)；Polinsky et al.，J.Med.Chem.35：4185-4194(1992)；Osapay et al.，J.Med.Chem.40：2241-2251(1997)；Fukase et al.，Bull.Chem.Soc.Jpn.65：2227-2240(1992)；Harpp et al.，J.Org.Chem.36：73-80(1971)；Goodman and Shao，Pure Appl.Chem.68：1303-1308(1996)；and Osapay and Goodman，J.Chem.Soc.Chem.Commun.1599-1600(1993)。
在某些实施例中，α，ω-二胺烷类是链(α，ω-diaminoalkane tethers)(例如1，4-二胺丙烷及1，5-二胺戊烷)在两谷氨酸残基(i及i+7位置)，可用以稳定胰高血糖素胜肽的α螺旋。此种是链(tethers)导致形成一具有9个或更多原子长度的架桥，视二胺烷类是链的长度而定。适于以是链形成交联胜肽的方法可参阅，例如Phelan et al.，J.Am.Chem.Soc.119：455-460(1997)。
在又一实施例中，可利用双硫架桥交联胰高血糖素胜肽的α螺旋之一或二弯折。或者，经修饰的双硫架桥其中一或两硫原子以亚甲基(methylene group)取代，导致异构巨环作用(isosteric macrocyclization)，可用以稳定胰高血糖素胜肽的α螺旋。适于以双硫架桥或硫基环化作用修饰胜肽的方法可参阅如Jackson et al.，J.Am.Chem.Soc.113：9391-9392(1991)及Rudinger and Jost，Experientia 20：570-571(1964)。
在又一实施例中，胰高血糖素相关胜肽的α螺旋可经由下列方式予以稳定：通过在两个组氨酸残基或一个组氨酸与半胱氨酸对的i及i+4位置结合金属原子。该金属原子是可为，如：Ru(III)、Cu(II)、Zn(II)、或Cd(II)。适于以结合金属原子为基础以稳定α螺旋的方法为本领域技术人员所熟知，可参阅例如Andrews and Tabor，Tetrahedron 55：11711-11743(1999)；Ghadiri et al.，J.Am.Chem.Soc.112：1630-1632(1990)；and Ghadiri et al.，J.Am.Chem.Soc.119：9063-9064(1997)。
其他稳定胰高血糖素相关胜肽的α螺旋的方法可以通过胜肽环化，可参阅Davies，J.Peptide.Sci.9：471-501(2003)。α螺旋可经由形成酰胺架桥、硫酯架桥、尿素架桥、胺甲酸酯(carbamate)架桥、硫酰胺(sulfonamide)架桥及其相似物而稳定。举例来说，硫酯架桥可形成于羧基端及半胱氨酸残基的侧链间。或者，硫酯可形成于其侧链具有硫醇(半胱氨酸)及羧酸(例如；天冬氨酸、谷氨酸)的氨基酸。于另一方法中，交联剂例如：二元羧酸(例如：软木酸(octanedioic acid))等，是可导入一连结于氨基酸侧链的两官能基，例如胺基、烃基、硫醇基，或其组合。
依据一实施例，胰高血糖素相关胜肽的α螺旋可经由在i及i+4位置添加疏水性氨基酸使其稳定。例如，i可以为酪氨酸且i+4可以为缬氨酸或亮氨酸；i可以为苯丙氨酸且i+4可以为半胱氨酸或甲硫氨酸：i可以为半胱氨酸且i+4可以为甲硫氨酸；或i可以为苯丙氨酸且i+4可以为异亮氨酸。应了解的是，为达到所述目的，前述的氨基酸对顺序是可反转，指定的氨基酸位于i位置，也可位于i+4位置，此时原来i+4氨基酸是可位于i位置。
根据本发明的又另一实施例，具有增强胰高血糖素样肽-1活性的胰高血糖素胜肽包含：(a)一或多个在氨基酸第12至29号位置内取代为经α，α-双取代氨基酸，及可选择的(b)羧基端酰胺。在某些方面中，应明了所述胰高血糖素胜肽明确地缺少分子内架桥(例如，共价性分子内架桥)，该分子内架桥是使胰高血糖素的羧基端部分(大约第12至29号位置)中的α螺旋结构稳定。在某些实施例中，胰高血糖素的第16、17、18、19、20、21、24或29号位置中一、二、三、四或多个位置取代为α，α-双取代氨基酸，例如：胺基异丁酸，是一种氨基酸，双取代为相同或相异基团，该基团是选自于包含：甲基、乙基、丙基及正-丁基组成的群组、或环辛烷、或环庚烷(例如：1-胺基环辛烷-1-羧酸)。举例来说，在不存在分子内架桥，例如，非共价性分子内架桥(例如：盐桥)或共价性分子内架桥(例如：内酰胺)下，第16号位置取代为胺基异丁酸增强胰高血糖素样肽-1活性。在某些实施例中，第16、20、21及24号位置之一、二、三或更多位置取代为胺基异丁酸。此胰高血糖素胜肽可进一步包含一或多个如本文所述的其他修饰，包括但不限于：酰基化、烷基化、聚乙二醇化、删除1至2个羧基端处的氨基酸、在羧基端添加及/或取代为带电氨基酸、以酰胺取代羧基端羧酸酯、添加一羧基端延伸、及保留性及/或非保留性氨基酸取代(诸如：第27号位置的甲硫氨酸取代为亮氨酸或正亮氨酸(Nle)、在第15号位置的天冬氨酸取代为谷氨酸(或类似氨基酸)、在第1及/或2号位置处是取代为达成第四型双胜肽蛋白水解酶抗性的氨基酸、第2号位置的丝氨酸取代为丙氨酸、第10号位置的酪氨酸取代为缬氨酸或苯丙氨酸、第12号位置的赖氨酸取代为精氨酸、第16号位置的丝氨酸取代为苏氨酸或胺基异丁酸、第20及/或24号位置的谷氨酰胺取代为天冬氨酸、谷氨酸或胺基异丁酸、第16号位置的丝氨酸取代为谷氨酸或苏氨酸、第18号位置精氨酸取代为丙氨酸、第20号位置的谷氨酰胺取代为赖氨酸、第21号位置的天冬氨酸取代为谷氨酸以及第24号位置的谷氨酰胺取代为天冬酰氨酸或半胱氨酸。在某些实施例中，前述的胰高血糖素胜肽包含第29号位置处的谷氨酰胺或甘氨酸或一添加羧基端延伸，例如，第28号位置氨基酸至羧基端的GGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：26)。在一特定方面，胰高血糖素胜肽包含：一或多个替代羧基端羧酸酯的酰胺基、酰基(例如，C16脂肪酸)、及亲水性基团(例如，聚乙二醇(PEG))。
此外，在另一特定方面，胰高血糖素胜肽包含SEQ ID NO：1-25、30-64、及66-555中任何氨基酸序列，其是包含不超过十个相对于SEQ ID NO：1的修饰且包含于第16、20、21、24号位置中一或多个氨基酸取代为胺基异丁酸，其中该胜肽于胜肽两个氨基酸的侧链间缺少一分子内架桥(例如，共价性分子内架桥)。因此，在一更特定方面，胰高血糖素胜肽包含SEQ ID NO：556-561中任何氨基酸序列。
根据某些实施例，缺少分子内架桥的胰高血糖素胜肽包含于氨基酸第12至29号位置内之一或多个取代为α，α-双取代氨基酸的取代，以及共价连接至胰高血糖素胜肽第10号位置处的氨基酸侧链的酰基或烷基。在特定实施例中，该酰基或烷基并非自然生成于氨基酸上。在某些方面，酰基或烷基对于第10号位置处的氨基酸是非自然的。在例示实施例中，缺少分子内架桥的胰高血糖素胜肽包含SEQ ID NO：556-561中任何氨基酸序列及共价连接至胰高血糖素胜肽第10号位置处氨基酸侧链的酰基或烷基。这些缺少分子内架桥的经酰基化或烷基化的胰高血糖素胜肽相较于未经酰基化的相对胜肽，于胰高血糖素样肽-1及胰高血糖素受体呈现增强的活性。于胰高血糖素样肽-1受体及胰高血糖素受体，增强对缺少分子内架桥(例如：共价性分子内架桥)的胰高血糖素类似物胜肽活性，是可通过添加酰基或烷基至该胜肽第10号位置氨基酸的侧链而达成。加入或不加入间隔物的酰基化及烷基化将进一步于本文中说明。
第1号位置处的修饰
根据本发明之一实施例，具有增强胰高血糖素样肽-1活性的胰高血糖素胜肽包含：(a)第1号位置的组氨酸取代为大的、芳香族氨基酸，及(b)稳定胰高血糖素胜肽羧基端部分(约于第12至29号位置)中α螺旋的分子内架桥。在一特定实施例中，第1号位置的氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、胺基苯丙氨酸、硝基苯丙氨酸、氯苯丙氨酸、磺酸基苯丙氨酸(sulfo-Phe)、4-吡啶丙氨酸(4-pyridyl-Ala)、甲基酪氨酸或3-胺基酪氨酸。在一特定方面，该分子内架桥通过三个插入氨基酸分隔的两个氨基酸侧链之间而形成，即：介于第i及i+4号位置的氨基酸侧链间。在某些实施例中，该分子内架桥是内酰胺架桥。在本发明之一更具体实施例中，胰高血糖素胜肽包含有于第1号位置处的大的芳香族氨基酸以及于胜肽的第16及20号位置处的氨基酸间的内酰胺架桥。此一胰高血糖素胜肽可进一步包含一或多个(例如，二、三、四、五或更多)如本文所述的其他修饰。举例来说，胰高血糖素胜肽可包含一酰胺以替代羧基端羧基。因此，在一实施例中，胰高血糖素胜肽包含SEQ ID NO：555的氨基酸序列。
酰基化
根据一实施例，该胰高血糖素胜肽可包含一酰基，如：一对自然生成的氨基酸而言为非自然的酰基。该酰基导致胜肽具有一或多个下列作用：(i)于循环时延长半生期，(ii)延迟起效作用，(iii)延长作用期间，(iv)或增进对蛋白酶如：第四型双胜肽蛋白水解酶的抗性，和(v)增加于胰高血糖素样肽-1受体、胃抑胜肽受体及/或胰高血糖素受体的效能。如文中所示，经酰基化的胰高血糖素胜肽不会相较于对应的未经酰基化的胰高血糖素胜肽于胰高血糖素受体、胃抑胜肽受体、及/或胰高血糖素样肽-1受体显现减低的活性。反之，在一些实施例中，经酰基化的胰高血糖素胜肽实际上于胰高血糖素样肽-1受体、胃抑胜肽受体、及/或胰高血糖素受体显现增加的活性。因此，如未增加的话，酰基化类似物的效能相较于未酰基化版胰高血糖素共同促效剂类似物的效能相当。
根据一实施例，该胰高血糖素胜肽经修饰而包含一酰基，其是通过通过酯、硫酯、或酰胺键结而连接，以达成于循环时延长半生期及/或延迟起效及/或延展作用期间及/或增进对蛋白酶(如：第四型双胜肽蛋白水解酶)抗性的目的。
酰基化可以于胰高血糖素胜肽中任何位置实现，该位置包含第1至29号位置中任一个、位于羧基端延伸内的一位置或羧基端氨基酸，其限制条件为如未增强时，保留胰高血糖素及/或胰高血糖素样肽-1及/或胃抑胜肽活性。非限定的实施例包含：在第5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28、29、30、37、38、39、40、41、42或43号位置(对应于SEQ ID NO：1的氨基酸编号)。在特定实施例中，酰基化是发生在胰高血糖素胜肽的第10或40号位置处，且胰高血糖素胜肽缺少一分子内架桥，例如，共价性分子内架桥(例如，内酰胺架桥)并包含一羧基端延伸。此等缺少分子内架桥并包含一羧基端延伸的经酰基化胜肽相较于对应的未经酰基化胜肽，于胰高血糖素样肽-1、胃抑胜肽及胰高血糖素受体证实有增强的活性。因此，发生酰基化的位置可改变胰高血糖素类似物的总体活性分布。
胰高血糖素胜肽可以在有亲水性基团连结的相同或不同氨基酸位置酰基化。非限定的实施例包含：是发生于第10或40号位置的酰基化及羧基端部分中一或多个位置的聚乙二醇化，例如第24、28、29或40号位置、在羧基端延伸内或在羧基端(例如：通过添加羧基端半胱氨酸)。
该酰基能直接共价性键结于胰高血糖素胜肽的氨基酸，或间接通过间隔物(spacer)键结于胰高血糖素胜肽的氨基酸，其中该间隔物位于胰高血糖素胜肽的氨基酸及酰基间。
在本发明的一特定方面，胰高血糖素胜肽经修饰包含有一酰基，其是通过胰高血糖素胜肽氨基酸侧链的胺基、羟基或硫醇基(thiol)而直接酰基化。在某些实施例中，胰高血糖素胜肽是通过氨基酸的侧链胺基、羟基或硫醇基而直接酰基化。就此点而言，酰基化的胰高血糖素相关胜肽可包含：SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或其包含有如本文所述的一或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。该氨基酸修饰具至少一个氨基酸位于第10、20、24、及29号位置对于任一包含氨基酸侧链胺基、羟基、或硫醇基的氨基酸进行饰。本发明某些特定实施例中，胰高血糖素胜肽的直接烷基化通过位于第10或40号位置氨基酸其侧链的胺基、羟基、或硫醇基而发生。
在某些实施例中，该包含侧链胺基的氨基酸是为如化学式I的氨基酸：
其中n＝1至4
[化学式I]
在某些例示实施例中，该化学式I的氨基酸，其中n为4(赖氨酸)或n为3(鸟氨酸)。
在其他实施例中，该包含侧链羟基的氨基酸是为如化学II的氨基酸：
Figure BDA0000121349000000532
其中n＝1至4
[化学式II]
在某些例示实施例中，该化学式II的氨基酸，其中n为1(丝氨酸)。
又一实施例中，该包含侧链硫醇基的氨基酸是为如化学式III的氨基酸：
Figure BDA0000121349000000533
其中n＝1至4
[化学式III]
在某些例示实施例中，该化学式III的氨基酸，其中n为1(半胱氨酸)。
又另一实施例中，该包含侧链胺基、羟基或硫醇基的氨基酸是为双取代氨基酸，包含如同化学式I、化学式II或化学式III的结构，但排除化学式I、化学式II或化学式III中连接于氨基酸α碳的氢，其是以第二侧链取代。
在本发明一实施例中，该酰基化的胰高血糖素胜肽包含一间隔物，其是位于该胜肽及酰基间。在某些实施例中，该胰高血糖素胜肽是共价性键结至该共价性键结至酰基的间隔物。
在某些实施例中，该间隔物为一包含有侧链胺基、羟基、或硫醇基的氨基酸，或双肽或三肽，该双肽或三肽是包含有一含侧链胺基、羟基、或硫醇基的氨基酸。该有间隔物连接的氨基酸是为任一包含能连接至间隔物基团的氨基酸(例如，经单一或双重α-取代氨基酸)。举例来说，包含一侧链为NH2、-OH、或-COOH(例如：赖氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、或谷氨酸)的氨基酸为适当的。就此点而言，酰基化的胰高血糖素相关胜肽可包含：SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或包含如本文所述的一或多个氨基酸修饰的经修饰氨基酸序列，该氨基酸修饰具至少一个对位于第10、20、24、29及40号位置修饰的任何包含一侧链胺基、羟基、或羧基的氨基酸。
在某些实施例中，该间隔物为包含有侧链胺基、羟基、或硫醇基的氨基酸，或包含有氨基酸的双肽或三肽，而该氨基酸包含侧链胺基、羟基、或硫醇基。
当酰基化通过间隔物氨基酸的胺基而发生，则酰基化能发生于氨基酸的α胺基或侧链胺基。此实施例中，α胺基被酰基化，在该位置的间隔物氨基酸可为任何氨基酸。举例来说，该间隔物氨基酸可为疏水性氨基酸，如：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、六-胺基己酸(6-aminohexanoic acid)、五-胺基戊酸(5-aminovaleric acid)、七-胺基氨酸(7-aminoheptanoicacid)及八-胺基辛酸(8-aminooctanoic acid)。或者，间隔物氨基酸可以为酸性残基，例如：天冬氨酸及谷氨酸。
该实施例中，间隔物氨基酸的侧链胺基被酰基化，在该位置的间隔物氨基酸可为包含侧链胺基的氨基酸，例如：化学式I(如：赖氨酸或鸟氨酸)的氨基酸。在此实施例中，可能α胺基及侧链胺基均被酰基化，如此以致该胰高血糖素胜肽被双酰基化。本发明的实施例包含这些双酰基化分子。
当酰基化通过间隔物的羟基而发生，该氨基酸、或双肽或三肽内氨基酸之一可以为如化学式II的氨基酸。在一特定例示的实施例中，该氨基酸为丝氨酸。
当酰基化通过一间隔物的硫醇基而发生，该氨基酸、或双肽或三肽内氨基酸之一可以为如化学式III的氨基酸。在一特定例示的实施例中，该氨基酸为半胱氨酸。
在某些实施例中，该间隔物包含一亲水性双功能间隔物。在特定实施例中，该亲水性双功能间隔物包含二个或多个反应官能基，例如：胺基、羟基、硫醇基、及羧基或前述的任一组合。在某些实施例中，该亲水性双功能间隔物包含一羟基及一羧基。在其他实施例中，该亲水性双功能间隔物包含一胺基及一羧基。在其他实施例中，该亲水性双功能间隔物包含一硫醇基及一羧基。在一特定实施例中，该间隔物包含胺基多烷氧羧酸(amino poly(alkyloxy)carboxylate)。就此点而言，该间隔物可包括例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m是为在1-6之间的任意整数，且n是为在2-12之间的任意整数，例如8-胺基-3，6-二氧辛酸(8-amino-3，6-dioxaoctanoic acid)，可由Peptides International，Inc.(Louisville，KY)购得。
在某些实施例中，该间隔物为一疏水性双功能间隔物。疏水性双功能间隔物已为人所熟知。请参阅，例如Bioconjugate Techniques，G.T.Hermanson(Academic Press，San Diego，CA，1996)，其揭示内容作为本说明书的参考数据以全文引用的方式并入本发明的说明书中。在特定实施例中，该疏水性双功能间隔物包含二个或多个反应官能基，例如：胺基、羟基、硫醇基、及羧基或前述的任一组合。在特定实施例中，该疏水性双功能间隔物包含一羟基及一羧基。在其他实施例中，该疏水性双功能间隔物包含一胺基及一羧基。在其他实施例中，该疏水性双功能间隔物包含一硫醇基及一羧基。包含一羧基及一羟基或一硫醇基的合适疏水性双功能间隔物，已为人所熟知而包括例如：8-羟基辛酸(8-hydroxyoctanoic acid)及8-硫醇辛酸(8-mercaptooctanoic acid)。
在某些实施例中，该功能间隔物并非包含有介于羧基1至7个碳原子无分支甲烯的双羧酸(dicarboxylic acid)。在某些实施例中，该功能间隔物为包含有介于羧基1至7个碳原子无分支甲烯的双羧酸(dicarboxylic acid)。
在特定实施例中，该间隔物(氨基酸、双肽、三肽、亲水性双功能间隔物、或疏水性双功能间隔物)有3至10个原子长度(如：6至10个原子，(如：6、7、8、9，或10个原子)。在更具体实施例中，该间隔物约有3至10个原子长度(如：6至10个原子)，且其酰基是为C12至C18脂肪酰基，例如：C14、C16脂肪酰基，此等间隔物及其酰基的总长度是14至28个原子，例如：约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27，或28个原子。某些实施例中，该间隔物及其酰基的总长度是17至28个原子(例如：19至26、19至21)。
依据特定前述实施例，该双功能间隔物是可为合成或自然生成的氨基酸(包含但不限于如本文所述者)，包含有3至10个原子长度的氨基酸主链。(例如：六-胺基己酸(6-amino hexanoic acid)、五-胺基戊酸(5-aminovaleric acid)、七-胺基氨酸(7-aminoheptanoic acid)、八-胺基辛酸(8-aminooctanoic acid))。或者，该间隔物是可为具有3至10个(如：6至10个原子)原子长度的胜肽主链的双肽或三肽间隔物。双肽或三肽间隔物的每一氨基酸，是可为与双肽或三肽相同或不同的氨基酸，且是可选自于包含下列所组成的群组：自然生成及/或非自然生成的氨基酸，包含：如任何自然生成氨基酸的D或L异构物(丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰氨酸(Asn)、脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr))，或任何非自然生成氨基酸的D或L异构物选自于包含下列所组成的群组：β-丙氨酸(β-Ala)、N-α甲基丙氨酸(Me-Ala)、丁氨酸(aminobutyric acid，Abu)、γ-丁氨酸(γ-Abu)、aminohexanoic acid(ε-Ahx)、胺基异丁酸(aminoisobutyric acid，Aib)、胺甲基吡咯羧酸(aminomethylpyrrolecarboxylic acid)、胺基哌啶羧酸(aminopiperidinecarboxylic acid)、胺基丝氨酸(aminoserine，Ams)、胺基四氢哌喃-4-羧酸(aminotetrahydropyran-4-carboxylic acid)、精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺(arginine N-methoxy-N-methyl amide)、β-天冬氨酸(β-Asp)、三亚甲亚胺羧酸(azetidine carboxylic acid)、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸(3-(2-benzothiazolyl)alanine)、α-第三丁基甘氨酸(α-tert-butylglycine)、2-胺基-5-脲基正戊酸(2-amino-5-ureido-n-valeric acid，又称瓜氨酸(citrulline，Cit))、β-环己基丙氨酸(β-Cyclohexylalanine，Cha)、乙酰胺甲基-半胱氨酸(acetamidomethyl-cysteine)、乙酰二胺基丁酸(diaminobutanoic acid，Dab)、二胺基丙酸(diaminopropionic acid，Dpr)、二羟苯丙氨酸(dihydroxyphenylalanine，DOPA))、α，α-双甲基咪唑乙酸(dimethylthiazolidine，DMTA))、γ-谷氨酸(γ-谷氨酸)、高丝氨酸(homoserine，Hse)、羟基脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)、异亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺(isoleucine N-methoxy-N-methyl amide)、甲基异亮氨酸(methyl-isoleucine，MeIle)、异哌啶酸(isonipecotic acid，Isn)、甲基亮氨酸(methyl-leucine，MeLeu)、甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸、三甲基赖氨酸、甲醇基脯氨酸、甲硫氨酸-亚砜(methionine-sulfoxide，Met(O))、甲硫氨酸-砜(methionine-sulfone，Met(O2))、亮氨酸(Nle)、甲基亮氨酸(Me-Nle)、正缬氨酸(Nva)、鸟氨酸(Orn)、对胺苯甲酸(para-aminobenzoic acid，PABA)、青霉胺(penicillamine，Pen)、甲基苯丙氨酸(MePhe)、4-氯苯丙氨酸(4-Chlorophenylalanine，Phe(4-Cl))、4-氟苯丙氨酸(4-fluorophenylalanine，Phe(4-F))、4-硝基苯丙氨酸(4-nitrophenylalanine，Phe(4-NO2))、4-氰基苯丙氨酸(4-cyanophenylalanine，Phe(4-CN))、苯甘氨酸(phenylglycine，Phg)、六氢哌啶丙氨酸(piperidinylalanine)、六氢哌啶甘氨酸(piperidinylglycine)、3，4-脱氢脯氨酸(3，4-dehydroproline)、吡咯啶基丙氨酸(pyrrolidinylalanine)、肌氨酸(Sar)、硒半胱氨酸(selenocysteine，Sec)、O-苯基磷丝氨酸(O-Benzyl-phosphoserine)、4-胺基-3羟基
Figure BDA0000121349000000571
-6甲基庚酸(4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoic acid，Sta)、4-胺基-5环己基-3-羟基戊酸(4-amino-5-cyclohexyl-3-hydroxypentanoic acid，ACHPA)、4-胺基-3羟基-5-苯基戊酸(4-amino-3-hydroxy-5-phenylpentanoic acid，AHPPA)、1，2，3，4，-四氢-异喹啉-3-羧酸(1，2，3，4，-tetrahydro-isoquinoline-3-carboxylic acid，Tic)、四氢哌喃甘氨酸(tetrahydropyranglycine)、噻吩基丙氨酸(thienylalanine，Thi)、O-苯基磷酪氨酸(O-benzyl-phosphotyrosine)、O-磷酪氨酸(O-Phosphotyrosine)、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、O-(bis-双甲基胺基-膦酰基)-酪氨酸(O-(bis-dimethylamino-phosphono)-tyrosine)、酪氨酸硫酸盐第三丁基胺(tyrosinesulfate tetrabutylamine)、甲基缬氨酸(methyl-valine，MeVal)、以及烷基化的3-硫氢丙酸(alkylated 3-mercaptopropionic acid)。
在某些实施例中，该间隔物包含全部为带负电，例如：包含一或两个带负电氨基酸。在某些实施例中，该双肽并非任何一般性结构为A-B的双肽，其中A选自于包含：甘氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸及脯氨酸所组成的群，其中B选自于包含：赖氨酸、组氨酸及色氨酸所组成的群。在某些实施例中，该双肽间隔物是选自于包含：丙氨酸-丙氨酸、β-丙氨酸-β-丙氨酸、亮氨酸-亮氨酸、脯氨酸-脯氨酸、γ胺基丁酸-γ胺基丁酸及γ-谷氨酸-γ-谷氨酸所组成的群。
在某些例示实施例中，胰高血糖素胜肽被修饰包含有通过间隔物的胺基、羟基、或硫醇基酰基化的酰基，其中该间隔物是连接于第10、20、24、29或40号位置的氨基酸侧链或胰高血糖素胜肽的羧基端氨基酸。
在又更具体的实施例中，该酰基是连接至胰高血糖素胜肽的第10或40号位置的氨基酸，且间隔物及酰基的长度是14至28个原子。在某些方面，第10或40号位置的氨基酸是化学式I的氨基酸，例如，赖氨酸，或与化学式I相关的双取代氨基酸。在更具体实施例中，胰高血糖素胜肽缺少分子内架桥，例如，共价性分子内架桥。胰高血糖素胜肽，例如，可为包含一或多个α，α-双取代氨基酸(例如，胺基异丁酸)的胜肽，以使胜肽的α螺旋稳定。因此，该酰基化的胰高血糖素胜肽可包含SEQ IDNO：555-561及610-612中任一所述的氨基酸序列、表20及28或SEQ ID NOs：657-669的含胺基异丁酸胜肽。
适于通过胺类、羟基或硫醇基而酰基化胜肽的方法是为本领域技术人员所熟知，可参阅例如：例如，Miller，Biochem Biophys Res Commun 218：377-382(1996)，实施例19(关于通过胺类酰基化的方法)；Shimohigashi及Stammer，Int J Pept ProteinRes 19：54-62(1982)；及Previero等人，Biochim Biophys Acta 263：7-13(1972)(关于通过羟基酰基化的方法)；及San及Silvius，J Pept Res 66：169-180(2005)(关于通过硫醇酰基化的方法)；Bioconjugate Chem.「蛋白质的化学修饰：历史及应用(ChemicalModifications of Proteins：History and Applications)」，1、2-12页(1990)；Hashimoto等人，Pharmacuetical Res.「胰岛素的棕榈酰基衍生物的合成及其生物活性(Synthesisof Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity)」第6册，No：2，171-176页(1989)。
该酰基化胰高血糖素相关胜肽的酰基可为任何大小，如任何碳链长度，且可为直链或分支。在本发明某些实施例中，该酰基是为C4至C30脂肪酸。举例来说，该酰基是可为C4、C6、C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28或C30脂肪酸。在某些实施例中，该酰基是为C8至C20脂肪酸，例如：C14或C16脂肪酸。
在另一实施例中，该酰基是为胆汁酸。该胆汁酸是可为任何适合的胆汁酸，包括但不限于：胆酸(cholic acid)、鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic acid)、脱氧胆酸(deoxycholic acid)、石胆酸(lithocholic acid)、牛胆酸(taurocholic acid)、甘胆酸(glycocholic acid)、胆固醇酸(cholesterol acid)。
在某些实施例中，该胰高血糖素胜肽通过胰高血糖素胜肽长链烷类酰基化而包含有一酰基。在特定方面，该长链烷类包含胺基、羟基、硫醇基(例如：十八烷基胺(octadecylamine)、十四醇(tetradecanol)、十六烷硫醇(hexadecanethiol))，其是与胰高血糖素胜肽的羧基，或其活化形式反应。该羧基，或其活化形式是为胰高血糖素胜肽氨基酸(如：谷氨酸、天冬氨酸)侧链的一部分或胜肽主链的一部分。
在某些实施例中，该胰高血糖素胜肽通过胰高血糖素胜肽长链烷类酰基化而包含有一酰基。在特定方面，该长链烷类包含胺基、羟基、硫醇基(例如：十八烷基胺(octadecylamine)、十四醇(tetradecanol)、十六烷硫醇(hexadecanethiol))，其是与胰高血糖素胜肽的羧基，或其活化形式反应。在特定实施例中，该包含有离去基的间隔物是可为任何如本文所述的间隔物，例如：氨基酸、双肽、三肽、亲水性双功能间隔物、或疏水性双功能间隔物)，其是进一步包含一适合的离去基。
如本文所使用的术语：「羧基的活化形式(activated form of a carboxyl group)」，是指具有一般性化学式R(C＝O)X的羧基，其中X为离去基，且R为胰高血糖素胜肽或间隔物。举例来说，羧基的活化形式是可包含但不限于：酰基氯化物(acylchlorides)、酸酐及酯类。在某些实施例中，活化的羧基是可为具有N-羟基琥珀硫亚氨(N-hydroxysuccinimide，NHS)离去基的酯类。
关于本发明的这些方面，该胰高血糖素胜肽或间隔物的长链烷类是经酰基化，其中该长链烷类是可为任何大小，并包含任何碳链长度。该长链烷类是可为直链或分支。在特定实施例中，其中该长链烷类是为C4至C30的烷类。举例来说：该长链烷类是为C4、C6、C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28、或C30烷类的任一种。在某些实施例中，该长链烷类包含C8至C20的烷类，如C14、C16或C18烷类。
同时，在某些实施例中，该胰高血糖素胜肽的胺类、羟基或硫醇基是与胆固醇酸(cholesterol acid)酰基化。在特定实施例中，该胰高血糖素胜肽是通过烷基化的脱胺基半胱氨酸间隔物(即烷基化的3-硫氢丙酸(alkylated 3-mercaptopropionicacid))连接至胆固醇酸。烷基化的脱胺基半胱氨酸间隔物可为，例如，包含十二乙二醇基团的半胱氨酸间隔物。
如本文所述的酰基化胰高血糖素胜肽可进一步修饰而包含一亲水性基团。在某些特定实施例中，该亲水性基团可包含聚乙二醇(PEG)链。亲水性基团的结合(incorporation)可通过任何适当方式达到，诸如任何本文述及的方式。就此点而言，该酰基化胰高血糖素相关胜肽包含SEQ ID NO：1，其中包含任何本文述及的修饰：至少一个位于第10、20、24、29及40号位置的包含酰基氨基酸、及至少一个位于第10、20、24、29及40号位置的氨基酸、位于羧基端延伸、羧基端氨基酸(其是以半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸或乙酰苯丙氨酸修饰)，以及氨基酸侧链(其是共价性键结至亲水性基团(例如：聚乙二醇))。在某些实施例中，该酰基是连接至第10或40号位置，其是可可选择的通过一间隔物连接，该间隔物包含：半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸或乙酰苯丙氨酸，且该亲水性基团是结合于第24号位置的半胱氨酸残基。或者，酰基化胰高血糖素胜肽包含有间隔物，其中该间隔物均被酰基化并修饰而包含亲水性基团。适当间隔物的非限定实施例包含一种间隔物，是包括有一或多个氨基酸是选自于包含：半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸及乙酰苯丙氨酸所组成的群。
在本发明的一特定方面，酰基化的胰高血糖素胜肽包含SEQ ID NO：534-544、546-549及657-669中任何的氨基酸序列。
烷基化
根据某些实施例，该胰高血糖素胜肽可经修饰而包含一烷基，如：例如，非自然生成于氨基酸上的烷基(例如，对自然生成的氨基酸为非自然的烷基)。无任何特定理论规范下，据信胰高血糖素胜肽的烷基化将达成相似，即不相同的如：胰高血糖素胜肽的酰基化的效果，例如：在循环时延长半生期、延迟起效作用、延长作用期间、或增进对蛋白酶如：第四型双胜肽蛋白水解酶的抗性、增加于胰高血糖素样肽-1及胰高血糖素受体的效能。
烷基化可以在胰高血糖素相关胜肽中任何位置实现，该位置包含第1至29号位置中任一个、位于羧基端延伸内的一位置或羧基端氨基酸，其限制条件为胰高血糖素活性是经保留。非限定的实施例包含：发生于第5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28、29、30、37、38、39、40、41、42或43号位置(依据SEQ ID NO：1的氨基酸编号)。该烷基能直接共价性键结于胰高血糖素胜肽的氨基酸，或间接通过间隔物键结于胰高血糖素胜肽的氨基酸，其中该间隔物位于胰高血糖素胜肽的氨基酸及烷基间。胰高血糖素胜肽可以于有亲水性基团连结的相同或不同氨基酸位置烷基化。非限定的实施例包含：烷基化，是发生于第40号位置且聚乙二醇化是发生于胰高血糖素胜肽的羧基端部分中一或多个位置，例如第24、28、29或40号位置、于羧基端延伸内或在羧基端(例如：通过添加羧基端半胱氨酸)。
在本发明的特定方面，胰高血糖素胜肽经修饰包含有烷基，其是通过胰高血糖素胜肽氨基酸侧链的胺基、羟基、硫醇基(thiol)而直接烷基化。在某些实施例中，烷基化是位于第24、28、29或40号位置。就此点而言，烷基化的胰高血糖素相关胜肽可包含：SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或其包含如本文所述的一或多个氨基酸修饰的氨基酸序列，该氨基酸修饰具至少一个位于第24、28、29或40号位置的对于任一包含氨基酸侧链胺基、羟基、或硫醇基的修饰。本发明某些特定实施例中，胰高血糖素胜肽的直接烷基化通过位于第40号位置的氨基酸侧链胺基、羟基、或硫醇基而发生。
在某些实施例中，该包含侧链胺基的氨基酸是为如化学式I的氨基酸。在某些例示实施例中，该化学式I的氨基酸，其中n为4(赖氨酸)或n为3(鸟氨酸)。
在其他实施例中，该包含侧链羟基的氨基酸是为如化学式II的氨基酸。在某些例示实施例中，该化学式II的氨基酸，其中n为1(丝氨酸)。
又一实施例中，该包含侧链硫醇基的氨基酸是为如化学式III的氨基酸。在某些例示实施例中，该化学式III的氨基酸，其中n为1(半胱氨酸)。
在又另一实施例中，该包含一侧链胺基、羟基或硫醇基的氨基酸是为双取代的氨基酸，包含如同化学式I、化学式II，或化学式III的结构，但排除化学式I、化学式II或化学式III中连接于氨基酸α碳的氢，其是以第二侧链取代。
在本发明某些实施例中，该烷基化的胰高血糖素胜肽包含间隔物，其是位于胰高血糖素胜肽的氨基酸及烷基间。在某些实施例中，该胰高血糖素胜肽是共价性键结至间隔物，是共价性键结至烷基。在某些例示实施例中，胰高血糖素胜肽被修饰包含有烷基，其是通过间隔物的胺基、羟基，或硫醇烷基化而修饰，该间隔物是连接于胰高血糖素胜肽氨基酸侧链的第10、20、24、29或40号位置。该有间隔物连接的氨基酸是为任一包含能连接至间隔物基团的氨基酸。举例来说，包含有一侧链为NH2、-OH，或-COOH(例如：赖氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、或谷氨酸)的氨基酸为适当的。就此点而言，烷基化的胰高血糖素相关胜肽可包含：SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或包含如本文所述的一或多个氨基酸修饰的经修饰氨基酸序列，其中氨基酸修饰具至少一个位于第10、20、24、29及40号位置对于任一包含氨基酸侧链胺基、羟基、或羧基的修饰。
在某些实施例中，该间隔物为包含有侧链胺基、羟基、或硫醇基的氨基酸，其是、或包含有一氨基酸的双肽或三肽，而该氨基酸是包含侧链胺基、羟基、或硫醇基。
当烷基化通过间隔物氨基酸的胺基而发生时，则烷基化能发生于氨基酸的α胺基或侧链胺基。该实施例中，α胺基被烷基化，在该位置的间隔物氨基酸可为任一氨基酸。举例来说，该间隔物氨基酸可为疏水性氨基酸，例如：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、六-胺基己酸(6-amino hexanoic acid)、五-胺基戊酸(5-aminovaleric acid)、七-胺基氨酸(7-aminoheptanoic acid)及八-胺基辛酸(8-aminooctanoic acid)。或者，若烷基化发生于酸性残基的α胺基，则该间隔物氨基酸可以为酸性残基(例如：天冬氨酸及谷氨酸)。该实施例中，间隔物氨基酸的侧链胺基被烷基化，于该位置的间隔物氨基酸可为包含侧链胺基的氨基酸，例如化学式I(如：赖氨酸或鸟氨酸)的氨基酸。在此实施例中，可能α胺基及侧链胺基均被烷基化，如此以致该胰高血糖素胜肽被双烷基化。本发明的实施例包含这些双烷基化分子。
当烷基化通过间隔物氨基酸的羟基而发生，前述的氨基酸或双肽或三肽的该氨基酸可以为如化学式II的氨基酸。在一特定例示的实施例中，该氨基酸为丝氨酸。
当烷基化通过间隔物氨基酸的硫醇基而发生，该氨基酸、或双肽或三肽的该氨基酸可以为如化学式III的氨基酸。在一特定例示的实施例中，该氨基酸为半胱氨酸。
在某些实施例中，该间隔物为包含亲水性双功能间隔物。在特定实施例中，该亲水性双功能间隔物包含二个或多个反应官能基，例如：胺基、羟基、硫醇基、及羧基或前述的任一组合。在某些实施例中，该亲水性双功能间隔物包含一羟基及一羧基。在其他实施例中，该亲水性双功能间隔物包含一胺基及一羧基。在其他实施例中，该亲水性双功能间隔物包含一硫醇基及一羧基。在一特定实施例中，该间隔物包含胺基多烷氧羧酸(amino poly(alkyloxy)carboxylate)。就此点而言，该间隔物可包括例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m是为在1-6之间的任意整数，且n是为在2-12之间的任意整数，例如8-胺基-3，6-二氧辛酸(8-amino-3，6-dioxaoctanoicacid)，可由Peptides International，Inc.(Louisville，KY)购得。
在某些实施例中，该间隔物包含一疏水性双功能间隔物。在特定实施例中，该疏水性双功能间隔物包含二个或多个反应官能基，例如：胺基、羟基、硫醇基、及羧基或前述的任一组合。在特定实施例中，该疏水性双功能间隔物包含一羟基及一羧基。在其他实施例中，该疏水性双功能间隔物包含一胺基及一羧基。在其他实施例中，该亲水性双功能间隔物包含一硫醇基及一羧基。包含一羧基及一羟基或一硫醇基的合适疏水性双功能间隔物，已为人所熟知而包括例如：8-羟基辛酸(8-hydroxyoctanoic acid)及8-硫醇辛酸(8-mercaptooctanoic acid)。
在特定实施例中，该间隔物(氨基酸、双肽、三肽、亲水性双功能间隔物、或疏水性双功能间隔物)有3至10个原子长度(如：6至10个原子，(如：6、7、8、9，或10个原子)。在更具体实施例中，该间隔物约有3至10个原子长度(如：6至10个原子)，且其烷基是为C12至C18烷基，例如：C14、C16烷基，这些间隔物及其烷基的总长度是14至28个原子，例如：约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个原子。在某些实施例中，该胰高血糖素相关胜肽为第一类、第二类或第三类胰高血糖素相关胜肽，该间隔物及其烷基的总长度是17至28个原子(例如：19至26、19至21)。
依据特定前述实施例，该双功能间隔物是可为合成或自然生成的氨基酸，包含有3至10个原子长度的氨基酸主链。(例如：六-胺基己酸(6-amino hexanoic acid)、五-胺基戊酸(5-aminovaleric acid)、七-胺基氨酸(7-aminoheptanoic acid)、八-胺基辛酸(8-aminooctanoic acid))。或者，该间隔物是可为具有3至10个(如：6至10个原子)原子长度的胜肽主链的双肽或三肽间隔物。该双肽或三肽间隔物，是可由自然生成及/或非自然生成的氨基酸组成，举例来说，任何本文所教示的氨基酸。在某些实施例中，该间隔物包含全部为带负电，例如：包含一或两个带负电氨基酸。在某些实施例中，该双肽间隔物是选自于包含：丙氨酸-丙氨酸、β-丙氨酸-β-丙氨酸、亮氨酸-亮氨酸、脯氨酸-脯氨酸、γ胺基丁酸-γ胺基丁酸及γ-谷氨酸-γ-谷氨酸所组成的群。
适合通过胺类、羟基或硫醇基而烷基化胜肽的方法是为本领域技术人员所熟知，例如：威廉森醚类合成法(Williamson ether synthesis)，是可用于胰高血糖素胜肽及烷基之间形成醚类键结。同时，以烷基卤化物进行胜肽的亲核剂取代反应是可形成酯基、醚基、硫酰基、或胺基键结。
该烷基化胰高血糖素胜肽的烷基为任何大小，如任何碳链长度，且可为直链或分支。在某些实施例中，该烷基是为C4至C30烷基。举例来说，该烷基是可为C4、C6、C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28、或C30烷基。在某些实施例中，该烷基是为C8至C20烷基，例如：C14或C16烷基。
在某些特定实施例中，烷基可以包括胆汁酸的类固醇基团，例如：胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛胆酸、甘胆酸、胆固醇酸。
在本发明某些实施例中，该胰高血糖素胜肽经修饰而包含烷基，该烷基是通过以亲核剂、长链烷类与胰高血糖素胜肽反应而形成，其中胰高血糖素胜肽包含有适合亲核剂取代反应的离去基。在特定方面，该长链烷类的亲核剂基包含胺基、羟基、硫醇基(例如：十八烷基胺(octadecylamine)、十四醇(tetradecanol)、十六烷硫醇(hexadecanethiol))。该胰高血糖素胜肽的离去基是为氨基酸侧链的一部分或胜肽主链的一部分。适合的离去基包含，例如：N-羟基琥珀硫亚氨(NHS)、卤素及磺酸酯(sulfonate esters)。
在特定实施例中，该胰高血糖素胜肽经修饰而包含一烷基，该烷基是通过以亲核剂、长链烷类与间隔物反应而形成，其中该间隔物包含有离去基。在特定方面，该长链烷类是包含胺基、羟基、或硫醇基。在特定实施例中，该包含有离去基的间隔物是可为任何如本文所述的间隔物，例如：氨基酸、双肽、三肽、亲水性双功能间隔物、或疏水性双功能间隔物)，其是进一步包含一适合的离去基。
关于本发明的这些方面，该胰高血糖素胜肽或间隔物的长链烷类是经烷基化，其中该长链烷类可为任何大小，并包含任何碳链长度。该长链烷类是可为直链或分支。在特定实施例中，其中该长链烷类是为C4至C30的烷类。举例来说：该长链烷类为C4、C6、C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28、或C30烷类的任一种。在某些实施例中，该长链烷类包含C8至C20的烷类，如C14、C16或C18烷类。
同时，在某些实施例中，烷基化发生于胰高血糖素胜肽及胆固醇基团间。举例来说，胆固醇的羟基是可取代长链烷类上的离去基，以形成胆固醇-胰高血糖素胜肽产物。
如本文所述的烷基化胰高血糖素胜肽可进一步修饰而包含一亲水性基团。在某些特定实施例中，该亲水性基团可包含聚乙二醇(PEG)链。亲水性基团的结合(incorporation)可通过任何适当方式达到，诸如任何本文述及的方式。就此点而言，该烷基化胰高血糖素相关胜肽包含SEQ ID NO：1，或包含一或多个如本文所述的修饰的经修饰氨基酸序列，其中该修饰是：位于第10、20、24、29或40号位置处的至少一个包含有烷基的氨基酸，及至少一个位于第10、20、24、29或40号位置处的氨基酸、位于羧基端延伸、羧基端氨基酸(其是以半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸，或乙酰基苯丙氨酸修饰)以及氨基酸侧链(其是共价性键结至亲水性基团(例如：聚乙二醇))。在某些实施例中，该烷基是连接至第40号位置，其是可可选择的通过间隔物连接，该间隔物包含：半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸，或乙酰基苯丙氨酸，且该亲水性基团是结合于第24号位置的半胱氨酸残基。或者，烷基化胰高血糖素胜肽包含有间隔物，其中该间隔物均被烷基化并修饰而包含亲水性基团。适当间隔物的非限定的实施例包含一间隔物，其是包括一或多个氨基酸选自于包含：半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸，及乙酰基苯丙氨酸所组成的群。
羧基端截断
在某些实施例中，如本文所述的胰高血糖素胜肽是可以进一步地以截断或删除一或二个羧基端的氨基酸而修饰(如，第29及/或28号位置)，且不影响对于胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1受体的活性及/或效能。就此点而言，胰高血糖素胜肽是可包含：天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)胜肽的1至27或1至28氨基酸，可选择的具有如本文所述的一或多个修饰。
在某些实施例中，该截断的胰高血糖素促效剂胜肽包含SEQ ID NO：550或SEQID NO：551。再另一实施例中，该截断的胰高血糖素促效剂胜肽包含SEQ ID NO：552或SEQ ID NO：553。
带电羧基端残基
该包含SEQ ID NO：20的胰高血糖素胜肽的溶解度是可进一步修饰，举例来说，将一、二或三个带电氨基酸导入SEQ ID NO：20的胜肽羧基端部分，较佳为该羧基端位置至第27号位置。此等带电氨基酸是可导入，通过将天然氨基酸取代为带电氨基酸而达成，例如：位于第28或第29号位置处，或者添加一个带电氨基酸，例如：第27、28或29号位置后。在例示实施例中，一、二、三或全部的带电氨基酸均带负电。或者，溶解度亦可经由将亲水性基团(如：聚乙二醇)共价连接至胜肽而增强。
例示实施例
依据某些实施例，提供一种胰高血糖素类似物，其是包含SEQ ID NO：55的序列，其中该类似物与SEQ ID NO：55有1至3个氨基酸的差异，该氨基酸是选自于第1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28、及29号位置，其中该胰高血糖素胜肽于胰高血糖素样肽-1受体显现至少20％的天然胰高血糖素样肽-1活性。
依据某些实施例，提供一种胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂，包含序列：
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO：33)其中第15号位置的Xaa是选自于包含：天冬氨酸、谷氨酸、氧化半胱氨酸(cysteic acid)、高谷氨酸及高胱氨酸(homocysteic acid)所组成的群，第16号位置的Xaa是选自于包含：丝氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸及高胱氨酸(homocysteic acid)所组成的群，第20号位置的Xaa是：谷氨酰胺或赖氨酸，第24号位置的Xaa是：谷氨酰胺或谷氨酸，第28号位置的Xaa是：天冬酰氨酸、赖氨酸或酸性氨基酸，第29号位置的Xaa是：苏氨酸、甘氨酸或酸性氨基酸，且R是为COOH或CONH2，附加条件是当第16号位置为丝氨酸，则第20号位置为赖氨酸，或者，当第16号位置为丝氨酸，则第24号位置为谷氨酸，且第20号或28位置亦为赖氨酸。在某些实施例中，该胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂包含SEQ ID NO：33的序列，其中第28号位置的氨基酸为天冬氨酸，且第29号位置的氨基酸为谷氨酸。在另一实施例中，第28号位置的氨基酸为天然天冬酰氨酸，且第29号位置的氨基酸为甘氨酸，且SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：65的氨基酸序列，是共价性连接至SEQ ID NO：33的羧基端。
在一实施例中，提供一种包含SEQ ID NO：33序列的共同促效剂，其中是添加一额外的酸性氨基酸至该胜肽的羧基端。在另外的实施例中，胰高血糖素类似物的羧基端氨基酸具有酰胺基以取代天然氨基酸的羧酸基。在一实施例中，该胰高血糖素类似物包含一序列，其是选自于包含SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：44所组成的群。
依据一实施例，提供一种SEQ ID NO：33的胰高血糖素类似物，其中该类似物与SEQ ID NO：33有1至3个氨基酸的差异，该氨基酸是选自于第1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21及27号位置，其中当第16号位置为丝氨酸，则第20号位置为赖氨酸，且内酰胺架桥形成于氨基酸第24号位置及第20或28号位置的氨基酸间。依据一实施例，该类似物与SEQ ID NO：33有1至3个氨基酸的差异，该氨基酸是选自于第1、2、3、21及27号位置。在一实施例中，该SEQ ID NO：33的胰高血糖素类似物有1至2个氨基酸的差异，或在一实施例中，有单一氨基酸的差异，该氨基酸是选自于第1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21及27号位置，附加条件为当第16号位置为丝氨酸，则第20号位置为赖氨酸，且内酰胺架桥形成于序列编号第24号位置及第20或28号位置的氨基酸间。
依据另一实施例，提供一种相对选择的胰高血糖素样肽-1受体促效剂是包括序列：
NH2-His-Ser-Xaa-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO：53)，其中第3号位置的Xaa是选自于包含：谷氨酸、鸟氨酸及正亮氨酸所组成的群，第15号位置的Xaa是选自于包含：天冬氨酸、谷氨酸、氧化半胱氨酸(cysteic acid)、高谷氨酸及高胱氨酸(homocysteic acid)所组成的群，第16号位置的Xaa是选自于包含：丝氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸及高胱氨酸(homocysteic acid)所组成的群，第20号位置的Xaa是：谷氨酰胺或赖氨酸，第24号位置的Xaa是：谷氨酰胺或谷氨酸，第28号位置的Xaa是：天冬酰氨酸、赖氨酸或酸性氨基酸，第29号位置的Xaa是：苏氨酸、甘氨酸或酸性氨基酸，且R是为COOH或CONH2，SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29，附加条件为当第16号位置为丝氨酸，则第20号位置为赖氨酸，或者当第16号位置为丝氨酸，则第24号位置为谷氨酸，且第20号或28位置亦为赖氨酸。在一实施例中，第3号位置的氨基酸为谷氨酸。在一实施例中，该第28及/或29号位置的酸性氨基酸是取代为天冬氨酸或谷氨酸。在一实施例中，该胰高血糖素胜肽包含有一共同促效剂胜肽，其是包含SEQ IDNO：33的序列，进一步包含一添加至胜肽羧基端的额外的酸性氨基酸。在另外的实施例中，胰高血糖素类似物的羧基端氨基酸具有一酰胺基以取代天然氨基酸的羧酸基。
依据一实施例，提供一种胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1受体共同促效剂，其包含有经修饰的胰高血糖素胜肽，是包含下列序列：
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO：34)，其中第15号位置的Xaa是选自于包含：天冬氨酸、谷氨酸、氧化半胱氨酸(cysteic acid)、高谷氨酸及高胱氨酸(homocysteic acid)所组成的群，第16号位置的Xaa是选自于包含：丝氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸及高胱氨酸(homocysteic acid)所组成的群，第20号位置的Xaa是：谷氨酰胺或赖氨酸，第24号位置的Xaa是：谷氨酰胺或谷氨酸，第28号位置的Xaa是：天冬酰氨酸、天冬氨酸或赖氨酸，R是为COOH或CONH2，第29号位置的Xaa是：苏氨酸或甘氨酸，且R是为COOH、CONH2、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29，附加条件为当第16号位置为丝氨酸，则第20号位置为赖氨酸，或者当第16号位置为丝氨酸，则第24号位置为谷氨酸，且第20号或28位置亦为赖氨酸。在一实施例中，其中R为CONH2，第15号位置的Xaa是为天冬氨酸，第16号位置的Xaa是选自于包含：谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸及高胱氨酸(homocysteic acid)所组成的群，第20及24号位置的Xaa每一均为谷氨酰胺，第28号位置的Xaa是：天冬酰氨酸或天冬氨酸且第29号位置的Xaa是为苏氨酸。在一实施例中，第15及16号位置的Xaa每一均为谷氨酸，第20及24号位置的Xaa每一均为谷氨酰胺，第28号位置的Xaa是：天冬酰氨酸或天冬氨酸，第29号位置的Xaa是为苏氨酸，且R是为CONH2。
据报导当保留至少原胜肽某些活性时，天然胰高血糖素胜肽的某些部分是可被修饰。因此，发明人预期一或多个位于SEQ ID NO：11胜肽的第2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29号位置氨基酸取代为不同于天然胰高血糖素胜肽的氨基酸，且仍于胰高血糖素受体保留活性。在一实施例中，天然胜肽第27号位置的甲硫氨酸取代为亮氨酸或正亮氨酸以防止胜肽的氧化性降解。在另一实施例中，于第20号位置的氨基酸取代为赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸或瓜氨酸及/或第21号位置的氨基酸取代为谷氨酸、高谷氨酸、或高胱氨酸(homocysteic acid)。
在一实施例中，提供一种SEQ ID NO：20的胰高血糖素胜肽类似物，其中与SEQID NO：1的氨基酸有1至6个氨基酸的差异，该氨基酸是选自于第1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、27、28或29号的类似物位置，附加条件为当第16号位置的氨基酸为丝氨酸，则第20号位置为赖氨酸，或者当第16号位置为丝氨酸，则第24号位置为谷氨酸，且第20或28号位置亦为赖氨酸。依据另一实施例，提供一种SEQ ID NO：20的胰高血糖素胜肽类似物，其中1至6个氨基酸，选自于类似物第1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20、21、27、28或29号位置，其是不同于SEQID NO：1的氨基酸。在另一实施例中，提供一种SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQID NO：11的胰高血糖素胜肽类似物，其中1至2个氨基酸，选自于类似物第1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20或21号位置，其是不同于SEQ ID NO：1的氨基酸，并在另外的实施例中，该1至2个不同氨基酸代表相对于存在天然胰高血糖素序列(SEQ ID NO：1)氨基酸中的保留性氨基酸取代。在一实施例中，提供一种SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的胰高血糖素胜肽，其中胰高血糖素胜肽进一步包含：一、二或三个氨基酸取代，选自第2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20、21、27或29号位置。在一实施例中，第2、5、7、10、11、13、14、16、17、18、19、20、21、27或29号位置的取代是为保留性氨基酸取代。
依据一实施例，该胰高血糖素/胰高血糖素样肽-受体1共同促效剂包含SEQ IDNO：33的序列变异物，其中1至10个氨基酸，选自于该序列变异物第16、17、18、20、21、23、24、27、28以及29号位置，其是不同于SEQ ID NO：1的氨基酸。依据一实施例，提供一种SEQ ID NO：33的序列变异物，其中是通过一或多个氨基酸取代而产生该序列变异物，该氨基酸取代是选自于包含：第17号位置谷氨酰胺(Gln17)、第18号位置丙氨酸(Ala18)、第21号位置谷氨酸(Glu21)、第23号位置异亮氨酸(Ile23)、第24号位置丙氨酸(Ala 24)、第27号位置缬氨酸(Val27)及第29号位置甘氨酸(Gly29)所组成的群组。依据一实施例，该胰高血糖素/胰高血糖素样肽-受体1共同促效剂包含SEQ ID NO：33的序列变异物，其中1至2个氨基酸，选自于该序列变异物第17至26号位置，其是不同于SEQ ID NO：1的氨基酸。依据一实施例，提供一种SEQ ID NO：33的序列变异物，其中是通过一个氨基酸取代而产生该序列变异物，该氨基酸取代是选自于包含：第17号位置谷氨酰胺(Gln17)、第18号位置丙氨酸(Ala18)、第21号位置谷氨酸(Glu21)、第23号位置异亮氨酸(Ile23)及第24号位置丙氨酸(Ala 24)所组成的群组。依据一实施例，提供一种SEQ ID NO：33的序列变异物，其中是通过于第18号位置的氨基酸取代而产生该序列变异物，该取代的氨基酸选自于包含：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甘氨酸所组成的群组。依据一实施例，提供一种SEQ ID NO：33的序列变异物，其中是通过于第18号位置丙氨酸的氨基酸取代而产生该序列变异物。这些序列变异物包含SEQ ID NO：55。在另一实施例中，提供一种胰高血糖素/胰高血糖素样肽-受体1共同促效剂，包含SEQ ID NO：33的序列变异物，其中1至2个氨基酸，选自于变异第17至22号位置，其是不同于SEQID NO：1的氨基酸，在另外的实施例中，该胰高血糖素/胰高血糖素样肽-受体1共同促效剂包含SEQ ID NO：33的序列变异物，通过于第20及21号位置的一或二个氨基酸取代而产生该序列变异物。依据某些实施例，提供一种胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂，包含序列：
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Xaa-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO：51)，其中第15号位置的Xaa是选自于包含：天冬氨酸、谷氨酸、氧化半胱氨酸(cysteic acid)、高谷氨酸及高胱氨酸(homocysteic acid)所组成的群，第16号位置的Xaa是丝氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸或高胱氨酸(homocysteic acid)，第20号位置的Xaa是谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸或瓜氨酸，第21号位置的Xaa是天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸或高胱氨酸(homocysteicacid)，第24号位置的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸，第28号位置的Xaa是天冬酰氨酸、赖氨酸或酸性氨基酸，第29号位置的Xaa是苏氨酸或酸性氨基酸，且R是为COOH或CONH2。
在某些实施例中，R是为CONH2。依据一实施例，该胰高血糖素/胰高血糖素样肽-受体1共同促效剂包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49的变异序列，其中是通过于第20号位置的氨基酸取代而产生该序列变异物。在一实施例中，该于第20号位置的氨基酸取代是选自于包含：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸及瓜氨酸所组成的群组。
在某些实施例中，提供一种胰高血糖素促效剂，其是包含SEQ ID NO：34的类似物胜肽，其中该类似物通过具有与第2号位置丝氨酸不同的其他氨基酸而不同于SEQID NO：34。在一实施例中，该丝氨酸残基取代为胺基异丁酸、D-丙氨酸，且在一实施例中，该丝氨酸残基取代为胺基异丁酸。此等修饰是抑制第四型双胜肽蛋白水解酶的切割，而仍保留原化合物固有的效能(例如，至少原化合物75、80、85、90、95％或更高的效能)。在一实施例中，类似物的溶解度增加，举例来说，通过将一、二、三或多个带电氨基酸导入天然胰高血糖素的羧基端部分内而达成，较佳地，是羧基端至第27号位置。在例示实施例中，一、二、三或全部的带电氨基酸均带负电。于另一实施例中，该类似物进一步包含一酸性氨基酸，其是于第28或29号位置的天然氨基酸取代为酸性氨基酸或添加一酸性氨基酸至SEQ ID NO：34胜肽的羧基端。
在一实施例中，如本文所述的胰高血糖素类似物是于第1或2号位置进一步修饰，其是可减少被第四型双胜肽蛋白水解酶切割的敏感性。在一实施例中，提供一种SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的胰高血糖素类似物，其中该类似物与母分子不同，是其将第2号位置取代并显现对于被第四型双胜肽蛋白水解酶切割减少的敏感性(即：抗性)。更具体地说，在一实施例中，类似物胜肽第2号位置取代为氨基酸，其是选自于包含D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、胺基-N-丁酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸及胺基异丁酸(AIB)所组成的群。在一实施例中，该类似物胜肽第2号位置取代为氨基酸，其是选自于包含D-丝氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸及胺基异丁酸(AIB)所组成的群。于另一实施例中，该类似物胜肽第2号位置取代为氨基酸，其是选自于包含D-丝氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸及胺基异丁酸(AIB)所组成的群。在一实施例中，该胰高血糖素胜肽包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22的序列。
在一实施例中，提供一种SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的胰高血糖素类似物，其中该类似物与母分子不同，是其将第1号位置取代并显现对于被第四型双胜肽蛋白水解酶切割减少的敏感性(即：抗性)。更具体地说，类似物胜肽第1号位置取代为氨基酸，其是选自于包含：D-组氨酸、α，α-双甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸(imidazole acetic acid)、脱胺基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸、及高组氨酸所组成的群。在另一实施例中，提供一种胰高血糖素促效剂，其是包含SEQ ID NO：34的类似物胜肽，其中该类似物SEQ ID NO：34不同，于第1号位置具有一氨基酸但非组氨酸。在一实施例中，类似物的溶解度增加，举例来说，通过将一、二、三或多个带电氨基酸导入天然胰高血糖素的羧基端部分内而达成，较佳地，是羧基端至第27号位置。在例示实施例中，一、二、三或全部的带电氨基酸均带负电。在另一实施例中，该类似物进一步包含一酸性氨基酸，其是在第28或29号位置的天然氨基酸取代为酸性氨基酸或添加一酸性氨基酸至SEQ ID NO：34胜肽的羧基端。在一实施例中，该酸性氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。
在一实施例中，该胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂包含SEQ ID NO：20的序列，进一步包含一额外的氨基酸的羧基端延伸或一胜肽，该胜肽是选自于包含：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28所组成的群。在该实施例中，单一氨基酸添加至SEQ ID NO：20的羧基端，该氨基酸通常是选自20种一般氨基酸之一，并且在一实施例中，该额外的羧基端的氨基酸具有酰胺基，其是取代天然氨基酸的羧酸。在一实施例中，额外的氨基酸是选自包含谷氨酸、天冬氨酸及甘氨酸所组成的群。
在另一实施例中，提供一种胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂，其中包含至少一内酰胺环，其是形成于谷氨酸残基及赖氨酸残基的侧链，其中谷氨酸残基及赖氨酸残基是间隔三个氨基酸。在一实施例中，含有内酰胺的胰高血糖素胜肽的羧基端氨基酸具有酰胺基以取代天然氨基酸的羧酸。更具体地说，在一实施例中，提供一种胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂，其包含有经修饰的胰高血糖素胜肽，是选自于包含下列序列所组成的群：
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO：66)
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO：67)
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO：68)
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Xaa-R(SEQ ID NO：69)
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-R(SEQ ID NO：16)
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Thr-R(SEQ ID NO：17)
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Thr-R(SEQ ID NO：18)
其中在第28号位置的Xaa＝天冬氨酸或天冬酰氨酸，在第29号位置的Xaa＝苏氨酸或甘氨酸，R选自于包含COOH、CONH2、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28所组成的群，且内酰胺架桥形成于SEQ IDNO：66中第12号位置的赖氨酸及第16号位置的谷氨酸间，于SEQ ID NO：67中第16号位置的谷氨酸及第20号位置的赖氨酸间，于SEQ ID NO：68中第20号位置的赖氨酸及第24号位置的谷氨酸间，于SEQ ID NO：69中第24号位置的谷氨酸及第28号位置的赖氨酸间，于SEQ ID NO：16中第12号位置的赖氨酸及第16号位置的谷氨酸间，以及第20号位置的赖氨酸及第24号位置的谷氨酸间，于SEQ ID NO：17中第12号位置的赖氨酸及第16号位置的谷氨酸间，以及第24号位置的赖氨酸及第28号位置的谷氨酸间，于SEQ ID NO：18中第16号位置的谷氨酸及第20号位置的赖氨酸间，以及第24号位置的谷氨酸及第28号位置的赖氨酸间。在一实施例中，其中R选自于包含COOH、CONH2、谷氨酸、天冬氨酸及甘氨酸所组成的群，第28号位置的氨基酸为天冬酰氨酸，且于第29号位置的氨基酸为苏氨酸。在一实施例中，R为CONH2，第28号位置的氨基酸为天冬酰氨酸，且在第29号位置的氨基酸为苏氨酸。在另一实施例中，R选自于包含SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：65所组成的群，且在第29号位置的氨基酸为甘氨酸。
在另外的实施例中，该胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂是选自于包含：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18所组成的群，其中该胜肽进一步包含一额外的氨基酸的羧基端延伸或一胜肽，该胜肽是选自于包含：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28所组成的群。在一实施例中，该末端延伸包含SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：65的序列，且该胰高血糖素胜肽包含SEQ ID NO：55的序列。在一实施例中，该胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂包含SEQ ID NO：33的序列，其中第16号位置的氨基酸为谷氨酸，第20号位置的氨基酸为赖氨酸，第28号位置的氨基酸为天冬酰氨酸，且SEQ ID No：26或SEQ IDNO：29的序列连接至SEQ ID NO：33的羧基端。
在该实施例中，单一氨基酸添加至SEQ ID NO：20的羧基端，该氨基酸通常是选自20种一般氨基酸之一，并且在一实施例中，该氨基酸具有酰胺基，其是取代天然氨基酸的羧酸。在一实施例中，添加的氨基酸是选自包含：谷氨酸、天冬氨酸及甘氨酸所组成的群。在该实施例中，其中该胰高血糖素类似物进一步包含一羧基端延伸、该延伸的羧基端氨基酸，在一实施例中，其终端是为酰胺基或酯基，而非羧酸。
在另一实施例中，该胰高血糖/胰高血糖素样肽-1共同促效剂包含序列：NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Xaa-CONH2(SEQ ID NO：19)，其中于第30号位置的Xaa代表任何氨基酸。在一实施例中，Xaa是选自20种一般氨基酸之一，且在一实施例中，该氨基酸为谷氨酸、天冬氨酸或甘氨酸。在一实施例中，Xaa是选自20种一般氨基酸之一，且在一实施例中，该氨基酸为谷氨酸、天冬氨酸或甘氨酸。此胜肽的溶解度是可进一步改善，通过共价性键结一聚乙二醇链至SEQ ID NO：19的第17、21、24或30号位置而达成。在另外的实施例中，该胜肽包含一额外的胜肽的羧基端延伸，该胜肽是选自于包含：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28所组成的群。依据一实施例，该胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂包含SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31及SEQ ID NO：32的序列。
额外的点特异修饰(site specific modifications)于SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：64的胰高血糖素序列内可制造产生一系列拥有各种程度胰高血糖素样肽-1促效作用的胰高血糖素促效剂。因此，可制备及特征化于每一受体具有与体外效能几乎相同的胜肽。同样地，可辨识及特征化于两受体中每一受体具有10倍选择性增加效能的胜肽。如同上述指出的取代，即第16号位置的丝氨酸残基取代为谷氨酸，是可增加于胰高血糖素受体及胰高血糖素样肽-1受体两者的天然胰高血糖素效能，但于胰高血糖素受体维持大约10倍的选择性。此外，第3号位置的天然谷氨酰胺取代为谷氨酸(SEQ ID NO：22)产生一种胰高血糖素类似物，其是于胰高血糖素样肽-1受体显现大约10倍的选择性。
胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂的溶解度可进一步于生理pH值的水溶液中增加，而维持相对于天然胰高血糖素的高生物活性，其是通过于胜肽的第16、17、21及24号位置导入亲水性基团，或于胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂的羧基端添加单一修饰氨基酸(例如：一氨基酸经修饰以包含有亲水性基团)而达成。依据于一实施例，该亲水性基团可包含聚乙二醇(PEG)链。更具体地说，在一实施例中，该胰高血糖素胜肽包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18的序列，其中聚乙二醇链共价性键结于胰高血糖素胜肽中第16、17、21、24、29号位置、或羧基端氨基酸，附加条件为当该胜肽包含SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13时，该聚乙二醇链共价性键结于第17、21或24号位置的氨基酸残基，当该胜肽包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15时，该聚乙二醇链共价性键结于第16、17或21号位置的氨基酸残基，且当该胜肽包含SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18时，该聚乙二醇链共价性键结于第17或21号位置的氨基酸残基。
在一实施例中，该胰高血糖素胜肽包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ IDNO：13的序列，其中该聚乙二醇链共价性键结于胰高血糖素胜肽中第17、21、24号位置的氨基酸残基，或羧基端氨基酸，且该胜肽的羧基端氨基酸具有酰胺基以取代天然氨基酸的羧酸基。在一实施例中，该胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂胜肽包含序列，其是选自于包含：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19所组成的群，其中该聚乙二醇链共价性键结于胰高血糖素胜肽的SEQ ID NO：12、SEQID NO：13及SEQ ID NO：19第17、21或24号位置的氨基酸侧链，或于SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15中第16、17或21号位置，或SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ IDNO：18中第17或21号位置。于另一实施例中，该胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：19的序列，其中该聚乙二醇链共价性键结于胰高血糖素胜肽中第17、21或24号位置的氨基酸侧链，或羧基端氨基酸。
依据一实施例，限于前述章节的附加条件限制，该胰高血糖素共同促效剂胜肽经修饰而包含一或多个在第16、17、21、24或29号位置，或羧基端氨基酸的氨基酸取代，其中天然氨基酸取代为一具有适合与亲水性基团交联的侧链，包含例如：聚乙二醇。该天然胜肽是取代为自然生成的氨基酸或合成(非自然)氨基酸。合成或非自然氨基酸是指不会在体外自然生成的氨基酸，然而可纳入如本文所述的胜肽结构。或者，该氨基酸具有一适合与亲水性基团交联的侧链，包含例如：聚乙二醇，其是可添加至如本文所述的任何胰高血糖素类似物的羧基端。依据某些实施例，于胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂的氨基酸修饰，其修饰位置是选自于包含：第16、17、21、24或29号位置，其是将天然氨基酸取代为选自于包含：赖氨酸、半胱氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸及乙酰基苯丙氨酸所组成的群，其中，该取代氨基酸进一步包含一共价性键结至氨基酸的侧链的聚乙二醇链。在一实施例中，该胰高血糖素胜肽是选自包含：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、及SEQ ID NO：19所组成的群，进一步修饰以包含一聚乙二醇链，该聚乙二醇链共价性键结于胰高血糖素胜肽第17或21号位置的氨基酸。在一实施例中，该聚乙二醇化胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1受体共同促效剂进一步包含SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：29的序列。
在另一实施例中，该胰高血糖素胜肽包含SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56的序列，进一步包含SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：65的羧基端延伸，其是连接至SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56的羧基端氨基酸，并可选择的进一步包含聚乙二醇链，该聚乙二醇链共价性键结于胜肽第17、18、21、24或29号位置的氨基酸或羧基端氨基酸。在另一实施例中，该胰高血糖素胜肽包含SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56的序列，其中该聚乙二醇链共价性键结于胰高血糖素胜肽第21或24号位置的氨基酸侧链，且该胜肽进一步包含SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29的羧基端延伸。
在另一实施例中，该胰高血糖素胜肽包含SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：33或SEQID NO：34的序列，其中，一额外的氨基酸添加至SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34的羧基端，以及一以共价性键结至添加氨基酸的侧链的聚乙二醇链。在另外的实施例中，该聚乙二醇化胰高血糖素类似物进一步包含SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29的羧基端延伸，其是连接至SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34的羧基端氨基酸。在另一实施例中，该胰高血糖素胜肽包含SEQ ID NO：19的序列，其中，聚乙二醇链共价性键结于胰高血糖素胜肽第30号位置的氨基酸侧链，且该胜肽进一步包含SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29的羧基端延伸，其是连接至SEQ ID NO：19的羧基端氨基酸。
该聚乙二醇链是可为直链或支链的形式。依据一实施例，聚乙二醇链的平均分子量选自约500至10,000道尔顿的范围。在一实施例中，聚乙二醇链的平均分子量是选自约1,000至5,000道尔顿的范围。在另一实施例中，聚乙二醇链的平均分子量是选自约10,000至20,000道尔顿的范围。依据一实施例，该聚乙二醇化胰高血糖素胜肽包括二或多个聚乙二醇链，其是共价键结至该胰高血糖素胜肽，其中胰高血糖素链的整体分子量约为1,000至5,000道尔顿。在一实施例中，该聚乙二醇化的胰高血糖素促效剂包含SEQ ID NO：5的胜肽，或一SEQ ID NO：5的胰高血糖素促效剂类似物，其中聚乙二醇链是共价性键结至于第21及24号位置的氨基酸残基，且其中该二条聚乙二醇链的结合分子量约为1,000至5,000道尔顿。
在某些例示实施例中，该胰高血糖素胜肽包含具有高达10个氨基酸修饰的SEQID NO：1的氨基酸序列，且包含是位于第10号位置的酰基化或烷基化氨基酸。在某些实施例中，该第10号位置的酰基化或烷基化氨基酸是为C4至C30脂肪酸。在特定方面，第10号位置的氨基酸包含有酰基或烷基，其中该酰基或烷基对自然生成的氨基酸来说是非自然的。
在特定实施例中，该于第10号位置包含有氨基酸的胰高血糖素胜肽，其是经酰基化或烷基化以包含有一稳定化的α螺旋。因此，在特定方面，该胰高血糖素胜肽包含：一如本文所述的酰基或烷基，以及一分子内架桥(例如，共价性分子内架桥(例如，内酰胺架桥))，分子内架桥是介于第i及i+4号位置的氨基酸侧链间(其中i为12、16、20或24)。该胰高血糖素胜肽是以取代或添加方式包含有：一如本文所述的酰基或烷基，并于胰高血糖素胜肽第16、20、21及/或24号位置中一、二、三或多个取代为α，α-双取代氨基酸，如：胺基异丁酸。在某些实施例中，该非天然胰高血糖素胜肽包含：第16号位置的谷氨酸及第20号位置的赖氨酸，其中可选择的以一内酰胺架桥连接该谷氨酸及赖氨酸，且可选择的，该胰高血糖素胜肽进一步包含一或多个选自于包含下列所组成群组的修饰：谷氨酰胺(在第17号位置)、丙氨酸(在第18号位置)、谷氨酸(在第21号位置)、异亮氨酸(在第23号位置)、及丙氨酸(在第24号位置)。
同时，在任何实施例中，其中该包含有在第10号位置经酰基化或烷基化氨基酸的胰高血糖素胜肽，是可进一步包含有一羧基端酰胺以取代羧基端α羧酸基。
在某些实施例中，该胰高血糖素胜肽包含一如本文所述的酰基或烷基，其是进一步包含于第1号位置、第2号位置或第1号及2号位置处的氨基酸取代，其中该氨基酸取代是可达成第四型双胜肽蛋白水解酶抗性。举例来说，在第1号位置的组氨酸取代为一氨基酸，其是选自于包含：D-组氨酸、α，α-双甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸(imidazole acetic acid)、脱胺基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸及高组氨酸所组成的群。替代地或添加地，在第2号位置的丝氨酸是取代为一氨基酸，其是选自于包含：D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸以及胺基异丁酸所组成的群。
该于第10号位置包含有如本文所述酰基化或烷基化氨基酸的胰高血糖素胜肽，是可包含任何基本上与SEQ ID NO：1相关的氨基酸序列。举例来说，该胰高血糖素胜肽包含具有高达10个氨基酸修饰的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。(例如：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个修饰)。在特定实施例中，该胰高血糖素胜肽的酰基化或烷基化氨基酸序列，与SEQ ID NO：1相较，具有大于25％的同一性(例如，大于30％、35％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或几乎100％与SEQ ID NO：1相同)。在某些特定实施例中，该胰高血糖素胜肽是为一包含SEQ ID NOs：55，并于第10号位置如本文所述酰基化或烷基化氨基酸的胰高血糖素胜肽。该胰高血糖素胜肽是为任何SEQ ID NOs：55，于第2至4、9至18、20、23至25、33、40至44、53、56、61、62、64、66至514以及534号氨基酸位置具有一或二个氨基酸修饰。
此类实施例中的酰基或烷基是为任何如本文所述的酰基或烷基。举例来说：该酰基是为C4至C30(例如：C8至C24)脂肪酰基且烷基是为C4至C30烷基(例如：C8至C24)。
该连接至酰基或烷基的氨基酸是任何如本文所述的氨基酸，例如：化学式I(例如：赖氨酸)、II或III的氨基酸。
在某些实施例中，该酰基或烷基是直接连接至第10号位置的氨基酸侧链。在某些实施例中，该酰基或烷基是通过间隔物连接至第10号位置的氨基酸侧链，例如：具3至10个原子长度的间隔物，例如：氨基酸或双肽。适合连接至酰基或烷基的间隔物如本文所述。
在本发明某些实施例中，提供一种胰高血糖素胜肽的类似物，可于胃抑胜肽受体显现促效剂活性。该类似物在某些实施例中，包含具有至少1个氨基酸修饰的SEQID NO：1的氨基酸序列(可选择的高达15个氨基酸修饰)，及一种由类似物1至21个氨基酸的羧基端至第29号位置的延伸。
在某些方面，该类似物至少包含一个氨基酸修饰并最高可达15个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个氨基酸修饰，亦可最高达10个氨基酸修饰)。在特定实施例中，该类似物包含至少一个氨基酸修饰，高达10个氨基酸修饰以及额外的保留性氨基酸修饰。保留性氨基酸取代如本文所述。
在某些方面，该至少一个的氨基酸修饰赋予稳定类似物的羧基端部分一稳定化的α螺旋结构。达成稳定化的α螺旋结构的修饰是如本文所述。请参见，例如于「α螺旋结构的稳定/分子内架桥」章节中的教学。在某些方面，该类似物包含形成于类似物两氨基酸侧链间的分子内架桥(例如：共价性或非共价性分子内架桥)。在某些方面，分子内架桥连接第i及i+4号位置的氨基酸侧链，其中i为12、13、16、17、20或24。在其他方面，分子内架桥连接第j及j+3号位置的氨基酸侧链，其中j为17，或第k及k+7号位置，其中k为任何介于12及22间的整数。在特定实施例中，分子内架桥是为共价性分子内架桥，例如：内酰胺架桥。在特定方面，该内酰胺架桥是连接第16及20号位置间氨基酸侧链，在具体方面，该第16及20号位置中一个为带正电氨基酸，另一个则为带负电氨基酸。举例来说，该内酰胺架桥是连接第16号位置谷氨酸与第20号位置赖氨酸的侧链。在其他方面，该带正电氨基酸及带负电氨基酸形成盐桥。在此实施例中，分子内架桥是为非共价性分子内架桥。
在具体方面，赋予稳定化的α螺旋结构的氨基酸修饰是将SEQ ID NO：1的氨基酸插入或取代为α，α-双取代氨基酸。适合稳定α螺旋结构的α，α-双取代氨基酸是如本文所述，并包含，例如：胺基异丁酸。在某些方面，SEQ ID NO：1中第16、20、21及24号位置之一、二、三个以上位置取代为α，α-双取代氨基酸，例如：胺基异丁酸。在具体实施例中，该第16号位置的氨基酸为胺基异丁酸。
该于胃抑胜肽受体显现促效剂活性的类似物包含有额外的氨基酸修饰，例如任何如本文所述者。举例来说，该氨基酸修饰是增加或降低于胰高血糖素受体以及胰高血糖素样肽-1受体之一或两者的活性。氨基酸修饰是可增加胜肽稳定度，例如：提高对第四型双胜肽蛋白水解酶降解的抗性，稳定于第15及16号位置的氨基酸。氨基酸修饰是可增加胜肽溶解度及/或改变任何于胃抑胜肽、胰高血糖素、及胰高血糖素样肽-1受体的类似物作用时间。任何此等类型修饰的组合是可存在于类似物，其是可于胃抑胜肽受体显现促效剂活性。
因此，在某些方面，该类似物包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其是具有下列一或多个：第17号位置的谷氨酰胺、第18号位置的丙氨酸、第21号位置的谷氨酸、第23号位置的异亮氨酸、第24号位置的丙氨酸、天冬酰氨酸或半胱氨酸或其保留性取代。在某些方面，该类似物包含一羧基端酰胺，其是取代羧基端α羧酸基。在特定实施例中，该类似物包含于第1号位置、第2号位置或第1号及2号位置处的氨基酸取代，其中该氨基酸取代是可达成第四型双胜肽蛋白水解酶抗性。适合的氨基酸取代如本文所述。举例来说，第1号位置为α，α-双甲基咪唑乙酸(DMIA)及/或第2号位置为D-丝氨酸或胺基异丁酸。
在某些实施例中，该类似物于第27及/或28号位置经修饰，并可选择的于第29号位置。举例来说，第27号位置的甲硫氨酸取代为大的脂肪族氨基酸，可选择的为亮氨酸，第28号位置的天冬酰氨酸取代为小的脂肪族氨基酸，可选择的为丙氨酸，以及第29号位置的苏氨酸取代为小的脂肪族氨基酸，可选择的为甘氨酸。不需任何理论下，据信在第27-29号位置取代为LAG(亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸)氨基酸相较于原来在此处位置的SEQ ID NO：1序列，其胃抑胜肽活性增加。在某些方面，第1号位置的氨基酸包含一咪唑环(例如：组氨酸、组氨酸类似物)的氨基酸以及一如本文所述于第27及/或28号位置的氨基酸修饰，且可选择的于第29号位置经修饰的类似物。
替代或添加地，该类似物包含下列任一种或其组合：(a)第2号位置的丝氨酸取代为丝氨酸；(b)第3号位置的谷氨酰胺取代为谷氨酸或谷氨酰胺类似物；(c)第7号位置的苏氨酸取代为异亮氨酸；(d)第10号位置的酪氨酸取代为色氨酸或包含酰基或烷基的氨基酸，其中该酰基或烷基对自然生成的氨基酸来说是非自然的；(e)第12号位置的赖氨酸取代为异亮氨酸；(f)第15号位置的天冬氨酸取代为谷氨酸；(g)第16号位置的丝氨酸取代为谷氨酸；(h)第20号位置的谷氨酰胺取代为丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或胺基异丁酸；(i)第24号位置的谷氨酰胺取代为丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或胺基异丁酸；(j)第27号位置的甲硫氨酸取代为亮氨酸或正亮氨酸(Nle)；(k)第29号位置的天冬酰氨酸取代为带电荷氨基酸，可选择的为天冬氨酸或谷氨酸；以及(l)第29号位置的苏氨酸取代为甘氨酸或带电荷氨基酸，可选择的为天冬氨酸或谷氨酸。
在特定方面，该类似物并不包含在第1号位置的赋予胃抑胜肽促效剂活性的氨基酸修饰。在某些方面，在第1号位置的氨基酸为非大的、芳香族氨基酸，例如：酪氨酸。在某些实施例中，第1号位置的氨基酸包含咪唑环，例如：组氨酸、组氨酸类似物。在特定实施例中，该类似物并非任何美国申请案61/151,349号所揭示的化合物。在特定实施例中，该类似物包含SEQ ID NOs：657-669任一氨基酸序列。在特定方面，该类似物包含一SEQ ID NOs：657-669的任一经修饰氨基酸序列，其中第12号位置的氨基酸为异亮氨酸及/或第27号位置的氨基酸为亮氨酸及/或第28号位置的氨基酸为丙氨酸。在某些方面，该类似物包含SEQ ID NOs：676、677、679、680号的任一氨基酸序列。
有关于胃抑胜肽受体显现促效剂活性的类似物，该类似物包含1至21个氨基酸的延伸(例如：5至19、7至15、9至12个氨基酸)。若该类似物的延伸为1至21个氨基酸，则该延伸包含任何氨基酸序列。在某些方面，该类似物的延伸为7至15个氨基酸，且在其他方面，该类似物的延伸为9至12个氨基酸。在某些实施例中，该延伸包含：(i)SEQ ID NO：26或674的氨基酸序列，(ii)与SEQ ID NO：26或674氨基酸序列相比具有高序列相似度(例如：至少80％、85％、90％、95％、98％、99％)的氨基酸序列；或(iii)具有一或多个保留性氨基酸修饰的(i)或(ii)氨基酸序列。
在某些实施例中，该延伸中至少一个氨基酸经酰基化或烷基化。该包含酰基或烷基的氨基酸是位于类似物的延伸中任何位置。在特定实施例中，该延伸的酰基化或烷基化氨基酸是位于类似物的第37、38、39、40、41或42号位置(根据SEQ ID NO：1的编号)。在特定实施例中，该酰基化或烷基化氨基酸是位于类似物的第40号位置。
在例示实施例中，该酰基或烷基是指对自然发生的氨基酸来说是非自然的氨基酸的酰基或烷基。举例来说：该酰基或烷基是为C4至C30(例如：C12至C18)脂肪酰基或C4至C30烷基。该酰基或烷基是任何如本文所述者。
在某些实施例中，该酰基或烷基是直接连接至氨基酸，例如：通过氨基酸侧链。在其他实施例中，该酰基或烷基是可通过间隔物(例如：单一氨基酸、双肽、三肽、亲水性双功能间隔物、疏水性双功能间隔物)连接至酰基或烷基。在特定实施例中，该间隔物是为3至10个原子长度。在某些实施例中，该间隔物为单一氨基酸或双肽包含有一或二个六-胺基己酸(6-amino hexanoic acid)丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、β-丙氨酸、γ-谷氨酸(如：γ-谷氨酸γ-谷氨酸)。在特定实施例中，该间隔物是为14至28个原子长度。
同样地，在例示实施例中，该连接至酰基或烷基的氨基酸是任何如本文所述的氨基酸，例如：化学式I、II或III的氨基酸。举例来说，该酰基化或烷基化的氨基酸是可为赖氨酸。适合包含酰基或烷基的氨基酸，也适合如本文所述的酰基及烷基。请参见，例如于「酰基化及烷基化」章节中的教学。
在其他实施例中，延伸的1至6个氨基酸(例如：1至2个、1至3个、1至4个、1至5个氨基酸)为带正电氨基酸，例如：化学式IV的氨基酸，如：赖氨酸。如本文所使用的术语：「带正电氨基酸(positive-charged amino acid)」是指包含于生理pH下的任何自然生成或非自然生成，于其侧链原子上带正电的氨基酸。在特定方面，该带正电氨基酸是位于第37、38、39、40、41、42及43号位置中任一位置。在特定实施例中，该带正电氨基酸是位于第40号位置。
在特定实施例中，该延伸中是如本文所述经酰基化或烷基化，并包含如本文所述的1至6个带正电氨基酸。
在又一实施例中，该胃抑胜肽受体显现促效剂活性的类似物包含：(i)SEQ IDNO：1，其是具有至少一个氨基酸修饰，(ii)一种延伸，是1至21个氨基酸(例如：5至18、7至15、9至12个氨基酸的羧基端至类似物第29号位置的氨基酸，以及(iii)一包含酰基或烷基的氨基酸，该酰基或烷基是指对位于羧基端延伸外的自然生成的氨基酸来说是非自然(例如：第1至29号位置中任何位置)。在某些实施例中，该类似物包含于第10号位置酰基化或烷基化的氨基酸。在特定方面，该酰基或烷基是为C4至C30脂肪酰基或C4至C30烷基。在某些实施例中，该酰基或烷基是可通过间隔物(例如：单一氨基酸、双肽、三肽、亲水性双功能间隔物、疏水性双功能间隔物)连接至酰基或烷基。在特定方面，该类似物包含稳定α螺旋的氨基酸修饰，例如：盐桥，其是介于第16号位置的谷氨酸及第20号位置氨基酸的赖氨酸间，或位于第16、20、21、及24号位置的任何一、二、三或多个位置之一α，α双取代氨基酸。在特定方面，该类似物额外地包含氨基酸修饰，其是赋予对第四型双胜肽蛋白水解酶切割的抗性，例如：于第1号位置的α-双甲基咪唑乙酸(DMIA)，于第2号位置的胺基异丁酸(AIB)。包含进一步氨基酸修饰的类似物需于此处考虑。
在特定实施例中，其中当该类似物缺少一亲水性基团，例如：聚乙二醇(PEG)时，该具胃抑胜肽受体活性的类似物于胃抑胜肽受体显现至少约0.1％(例如：至少0.5％、1％、2％、5％、10％、15％或20％)的天然胃抑胜肽活性。在某些实施例中，该类似物于胃抑胜肽受体显现超过10％(例如：超过20％、50％、75％、100％、200％、300％、500％)的天然胃抑胜肽活性。在某些实施例中，该胃抑胜肽受体于胰高血糖素样肽-1受体及胰高血糖素受体中之一或前述两者显现可观的促效剂活性。在某些方面，对此类受体的效能及/或选择性(其是指胃抑胜肽受体及胰高血糖素样肽-1受体及/或胰高血糖素受体)为1000倍以内、于750倍内、于500倍内、于250倍内、于100倍内(较高或较低)。举例来说，该具有胃抑胜肽受体活性的类似物，其于胃抑胜肽受体的选择性是少于1000倍、500倍、100倍、于50倍内、于25倍内、于15倍内、于10倍内(较高或较低)，该选择性是于胃抑胜肽受体及/或胰高血糖素受体。
于如本文所述的任何方面，本发明排除任何揭示于国际申请公开案第No.WO2010/011439、WO 2008/101017、No.WO 2009/155258的胜肽。
用途
如于实施例中详细描述者，本发明的胰高血糖素促效剂具有增强的生物物理稳定度及水溶液溶解度，同时相对于天然胜肽证实有增强的生物活性。因此，据信本发明的胰高血糖素促效剂适用于前述用于天然胰高血糖素胜肽的任何用途。因此，如本文所述的经修饰胰高血糖素胜肽是可用于：治疗低血糖症或提高血糖值、引起肠道暂时性麻痹供放射性用途、或治疗其他由胰高血糖素的低血值所引起的代谢疾病。亦预期如本文所述的胰高血糖素胜肽可用于：降低或维持体重、或治疗高血糖症、或降低血糖值、或使血糖值正常化。
本发明的胰高血糖素胜肽是可单独使用，或与其他抗糖尿病或抗肥胖药剂合并用药。该领域所熟知或正在研究中的抗糖尿病药物包括：胰岛素、磺酰脲类(sulfonylureas)(例如：甲苯磺丁脲(tolbutamide)(Orinase)、乙酰苯磺酰环己脲(acetohexamide)(Dymelor)、杜拉唑胺(tolazamide)(Tolinase)、氯磺丙脲(chlorpropamide)(Diabinese)、克吡噻(glipizide)(Glucotrol)、甘布若(glyburide)(Diabeta，Micronase，Glynase)、格列美脲(glimepiride)(Amaryl)、或格列齐特(gliclazide)(Diamicron))；氯茴苯酸类(meglitinides)(例如：瑞格列耐(repaglinide)(Prandin)或拿贴葛奈(nateglinide)(Starlix))；双胍类(biguanides)(例如：二甲双胍(metformin)(Glucophage)或苯乙双胍(phenformin))；硫偶氮啶二酮类(thiazolidinediones)(例如：罗西塔松(rosiglitazone)(Avandia)、皮格塔松(pioglitazone)(Actos)、或曲格塔松(troglitazone)(Rezulin)或其他PPARγ抑制剂)；抑制碳水化合物消化的葡萄糖苷酶抑制剂(例如：米格列醇(miglitol)(Glyset)、阿卡波糖(acarbose)(Precose/Glucobay)；依森泰德(exenatide)(Byetta)或普拉立替(pramlintide))；第四型双胜肽蛋白水解酶抑制剂(例如：维达格利普丁(vildagliptin)或西塔葛菌素(sitagliptin))；钠离子依赖型葡萄糖转运蛋白(sodium-dependentglucose transporter 1，SGLT)抑制剂；葡萄糖激酶活化剂(GKA)；胰高血糖素受体拮抗剂(GRA)；或果糖-1，6-双磷酸酶(fructose 1，6-bisphosphatase，FBPase)抑制剂。
该领域所熟知或正在研究中的抗肥胖药剂包括：食欲抑制剂，包括：苯乙胺(phentermine)型兴奋剂、吩特明(phentermine)(可选择的为芬氟拉明(enfluramine)或右芬氟拉明(dexfenfluramine))、二乙基丙酸(diethylpropion)芬二美曲秦(phendimetrazine)
Figure BDA0000121349000000822
苄非他命(benzphetamine)
Figure BDA0000121349000000823
西布他命(sibutramine)
Figure BDA0000121349000000824
莫利那班(rimonabant)其他类大麻(cannabinoid)受体拮抗剂；调酸素；盐酸氟希定(fluoxetinehydrochloride)(Prozac)、奎克司(Qnexa)(托吡酯(topiramate)以及吩特明)、依赛利尔(Excalia)(安非他酮(bupropion)以及抗痉孪剂唑尼沙胺(zonisaminde))或康曲维(Contrave)(安非他酮以及纳曲酮(naltrexone))；或脂酶抑制剂，类似奥丽斯特(Orlistat)
Figure BDA0000121349000000826
或西替利司他(Cetilistat)(亦称ATL-962)，或GT 389-255。
本发明的一方面是指一种用于治疗低血糖症的本发明所揭示的胰高血糖素促效剂的预配置水溶液。如本文所述的促效剂组合物的改良稳定度及溶解度允许用于制备供快速施予及治疗低血糖症用的胰高血糖素的预配置水溶液。在一实施例中，提供一种用于施予罹患低血糖症的病患的包含有经聚乙二醇化的胰高血糖素促效剂的溶液，其中连接至经聚乙二醇化的胰高血糖素促效剂的聚乙二醇链的总分子量是介于约500至约5,000道尔顿之间。在一实施例中，经聚乙二醇化的胰高血糖素促效剂包含一胜肽，是选自由SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、及SEQ ID NO：25所组成的群，及SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、及SEQ ID NO：25的胰高血糖素促效剂类似物，或包含SEQ ID NO：20序列的胰高血糖素的一经聚乙二醇化内酰胺衍生物，其中该胰高血糖素胜肽的氨基酸残基侧链是共价键结至聚乙二醇链。
依据本发明的治疗方法，包括但不限于治疗低血糖症，可包括使用任何标准的使用任何标准给药途径(包括：非经肠道，诸如静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内、鞘内、经皮、经直肠、经口、经鼻或经吸入)而将本文揭示的胰高血糖素促效剂施予病患的步骤。在一实施例中，组合物是经皮下或肌肉内施予。在一实施例中，组合物是非经肠道投与，且胰高血糖素组合物是预包装于注射器中。在另一实施例中，组合物是预包装于吸入器或其他雾化药物传送装置中。
令人惊奇地，申请人已发现可制备得保有原胜肽的生物活性及特异性的经聚乙二醇化的胰高血糖素胜肽。然而，增加聚乙二醇链长度，或将多个聚乙二醇链连接至胜肽，以致连接至聚乙二醇的总分子量大于5,000道尔顿，可开始延迟经修饰胰高血糖素的作用时间。根据一实施例，提供一种SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、及SEQID NO：25的胰高血糖素胜肽，或其胰高血糖素促效剂类似物，或包含SEQ ID NO：20序列的胰高血糖素的聚乙二醇化内酰胺衍生物，其中该胜肽包含一或多个聚乙二醇链，其中该连接至聚乙二醇的总分子量是大于5,000道尔顿，且在一实施例中是大于10,000道尔顿但小于40,000道尔顿。这些经修饰的胰高血糖素胜肽具有经延迟或延长的活性时间，但没有生物活性的损失。因此，可施予此等化合物以延长经施予的胰高血糖素胜肽的作用。
经修饰以共价键结至具有大于10,000道尔顿分子量的聚乙二醇链的胰高血糖素胜肽可与胰岛素结合施予，以缓冲胰岛素的作用并协助维持糖尿病患中的稳定血糖值。本发明的经修饰胰高血糖素胜肽可与胰岛素作为单一组合物共同施予、作为个别溶液同时投与或者胰岛素及经修饰胰高血糖素胜肽可相对于彼此在不同时间施予。在一实施例中，包含胰岛素的组合物及包含经修饰胰高血糖素胜肽的组合物是在相隔不到12小时内施予。经修饰胰高血糖素胜肽相对于经施予胰岛素的精确比率将部分视测定病患的胰高血糖素含量而定，且可通过例行实验而决定。
根据一实施例，提供一种包含胰岛素及一经修饰的胰高血糖素胜肽(选自由SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及其的胰高血糖素促效剂类似物所组成的群)的组合物，其中该经修饰胰高血糖素胜肽进一步包含共价键结至第17、21、24或21及24号位置处的氨基酸侧链的聚乙二醇链。在一实施例中，组合物是包含胰岛素及胰高血糖素类似物的水溶液。在其中胰高血糖素胜肽包含SEQID NO：24或SEQ ID NO：25的序列的实施例中，聚乙二醇链是共价键结于胰高血糖素胜肽的第21或24号位置。在一实施例中，聚乙二醇链的分子量是为约10,000至40,000。
根据一实施例，使用本文所揭示的经修饰胰高血糖素胜肽来诱发肠道的暂时麻痹。此方法可用于放射性用途，且包括施予一有效量医药组合物的步骤，其是包含有经聚乙二醇化的胰高血糖素胜肽、包含此等胜肽的羧基端延伸或二聚体的胰高血糖素胜肽。在一实施例中，胰高血糖素胜肽包含一序列，是选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15所组成的群的。在一实施例中，胰高血糖素胜肽进一步包含一聚聚乙二醇链其是约1,000至40,000道尔顿并共价键结至第21或24号位置处的氨基酸残基。在一实施例中，胰高血糖素胜肽是选自由SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15所组成的群。在一实施例中，聚乙二醇链的分子量是为约500至5,000道尔顿。
在再一实施例中，用于诱发肠道暂时麻痹的组合物包含一第一经修饰的胰高血糖素胜肽及一第二经修饰的胰高血糖素胜肽。该第一经修饰的胜肽包含一序列，是选自由SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25所组成的群，可选择的连接至一约500至约5,000道尔顿的聚乙二醇链，且该第二胜肽包含一序列，是选自由SEQID NO：23、SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25所组成的群，其共价性连接至约10,000至约40,000道尔顿的聚乙二醇链。在此实施例中，每一胜肽的聚乙二醇链是互相独立地共价性键结至个别胜肽的第17、21或24号位置处的氨基酸残基。
调酸素(一种存在于小肠中的自然生成的消化激素)据报告当施予大鼠或人类时会导致体重减轻(参见Diabetes 2005；54：2390-2395)。调酸素是具有37个氨基酸的胜肽，包含胰高血糖素的29个氨基酸序列(即SEQ ID NO：1)其后接SEQ ID NO：27的8个氨基酸羧基端延伸(KRNRNNIA)。因此，申请人相信通过将调酸素的胰高血糖素胜肽部分取代为如本文所揭示的经修饰胰高血糖素胜肽，可维持调酸素的生物活性(即食欲抑制及诱发体重减轻/体重维持)，同时具有改良化合物的溶解度及稳定度并改善药物动力学的作用。此外，申请人亦相信经截断的调酸素分子(其是包含有一本发明的胰高血糖素胜肽，具有调酸素经移除的末端四个氨基酸者)，将亦可有效地抑制食欲及诱发体重减轻/体重维持。
因此，本发明亦涵盖本发明的经修饰胰高血糖素胜肽，其是具有SEQ ID NO：27(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：28的羧基端延伸。可将这些化合物施予个体以诱发体重减轻或预防体重增加。根据一实施例，将SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：20的胰高血糖素促效剂类似物(其进一步包含连接至胰高血糖素胜肽的第29号氨基酸的SEQ IDNO：27(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：28的氨基酸序列)施予个体，以诱导体重减轻或预防体重增加。更具体地说，胰高血糖素胜肽包含一序列，是选自由SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15所组成的群，其进一步包含连接至胰高血糖素胜肽第29号氨基酸的SEQ ID NO：27(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：28的氨基酸序列。
促胰岛素分泌素-4是一种由39个氨基酸组成的胜肽。其是已知为胰高血糖素样肽-1的受体的有力刺激物。此胜肽据报告亦可抑制食欲及诱发体重减轻。申请人发现当将促胰岛素分泌素-4的末端序列添加于胰高血糖素的羧基端时，可改良胰高血糖素的溶解度及稳定度，而无损于胰高血糖素的生物活性。在一实施例中，促胰岛素分泌素-4的末端十个氨基酸(即SEQ ID NO：26(GPSSGAPPPS)的序列)是连接至本发明揭示的胰高血糖素胜肽的羧基端。预期此等融合蛋白对于抑制食欲及诱发体重减轻/体重维持具有药理活性。根据一实施例，将SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：20的胰高血糖素促效剂类似物(其进一步包含连接至胰高血糖素胜肽第29号氨基酸的SEQ ID NO：26(GPSSGAPPPS)或SEQ ID NO：29的氨基酸序列)施予个体，以诱发体重减轻或预防体重增加。更具体地说，胰高血糖素胜肽包含一序列，是选自由SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：56所组成的群，其是进一步包含有连接至胰高血糖素胜肽第29号氨基酸的SEQ ID NO：26(GPSSGAPPPS)或SEQID NO：29的氨基酸序列。在一实施例中，施予的胰高血糖素胜肽类似物包含SEQ IDNO：64的序列。
多聚体
本发明亦涵盖如本文所述的经修饰胰高血糖素胜肽的多聚体。可使用以为人所熟知的标准的连接剂及程序将两个或两个以上的经修饰胰高血糖素胜肽连接在一起。举例来说，可通过使用双官能硫醇交联剂及双官能胺交联剂于两个经修饰胰高血糖素胜肽之间形成二聚体，尤其是对于取代为半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸或乙酰基苯基丙氨酸残基的胰高血糖素胜肽而言(例如，SEQ ID NO：3及SEQID NO：4)。该二聚体是可为同二聚体或异二聚体。在特定实施例中，该连接物是聚乙二醇，例如：5kDa聚乙二醇、20kDa聚乙二醇。在某些实施例中，该连接物是二硫键。举例来说，该二聚体的每一单体是可包含半胱氨酸残基(例如一位于末端或内部半胱氨酸)，以及某一半胱氨酸残基中硫原子均可参与形成二硫键。在本发明的某些方面，该单体是通过末端氨基酸(例如：胺基端或羧基端)、内部氨基酸、位于至少一单体的末端氨基酸、位于至少另一单体的内部氨基酸而连接。在特定方面，该单体不通过胺基端氨基酸连接。在某些方面，多聚体中的单体是以「尾接尾」(“tail-to-tail”)方位相接，其是以每一单体的羧基端氨基酸相接。
在一实施例中，二聚体包含有：一胰高血糖素融合胜肽的同二聚体，其中该胰高血糖素胜肽部分包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：20及连接至胰高血糖素胜肽第29号氨基酸的SEQ ID NO：26(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：27(KRNRNNIA)或SEQ IDNO：28(KRNR)的氨基酸序列。在另一实施例中，二聚体包含一SEQ ID NO：11的胰高血糖素促效剂类似物的同二聚体，其中该胰高血糖素胜肽进一步包含共价性键结至胰高血糖素胜肽的第21或24号位置的聚乙二醇链。
根据一实施例，提供一种二聚体，其是包含有通过连接物键结至一第二胰高血糖素胜肽的一第一胰高血糖素胜肽，其中该第一胰高血糖素胜肽包含有一胜肽，是选自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：11所组成的群，且该第二胰高血糖素胜肽包含SEQ ID NO：20。根据另一实施例，提供一种二聚体，其是包含通过连接物键结至一第二胰高血糖素胜肽的一第一胰高血糖素胜肽，其中该第一胰高血糖素胜肽包含有一序列，选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11所组成的群，且该第二胰高血糖素胜肽包含SEQ ID NO；11，及该等胰高血糖素多肽的药学可接受盐类。根据另一实施例，提供一种二聚体，其是包含通过连接物键结至一第二胰高血糖素胜肽的一第一胰高血糖素胜肽，其中该第一胰高血糖素胜肽是选自由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18所组成的群，且该第二胰高血糖素胜肽是独立地选自由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18所组成的群，及该等胰高血糖素多肽的药学可接受盐类。在一实施例中，该第一胰高血糖素胜肽是选自由SEQ ID NO：20所组成的群，且该第二胰高血糖素胜肽是独立地选自由SEQID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：11所组成的群。在一实施例中，二聚体形成于两个胜肽之间，其中每一胜肽包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
套组
根据一实施例，本发明的经修饰胰高血糖素胜肽可经提供作为一套组的部分。在一实施例中，提供一种用于将胰高血糖素促效剂施予有需要的病患的套组，其中该套组包含选自由下列所组成的群的经修饰胰高血糖素胜肽：1)一胰高血糖素胜肽，是包含SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的序列；2)一胰高血糖素融合胜肽，是包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：55的胰高血糖素促效剂类似物，及连接至胰高血糖素胜肽的第29号氨基酸的SEQ IDNO：26(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：27(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：28(KRNR)的氨基酸序列；及3)一SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：51的经聚乙二醇化的胰高血糖素胜肽，其进一步包含连接至胰高血糖素胜肽的第29号的SEQ ID NO：26(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：27(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：28(KRNR)的氨基酸序列，其中该聚乙二醇链共价键结至第7、21或24位置处，具有约500至约40,000道尔顿的分子量。在一实施例中，该套组包含一胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂，其中该胜肽包含有一序列，选自由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18所组成的群。
在一实施例中，该套组提供一将胰高血糖素组合物施予病患的装置，例如：注射器针头、笔装置、喷射注入器或其他不含针的注入器。另一种方式或除此的外，该套组可包括一或多个容器，例如：小药瓶、管、瓶、单室或多室预填充注射器、卡匣、输注泵(外部或可植入式)、喷射注入器、预填充笔装置及其类似物，其可选择的含有呈一冷冻干燥形式或水溶液的胰高血糖素胜肽。较佳地，该套组亦包括使用说明。根据一实施例，套组的该装置是气溶胶配送装置，其中该组合物是预包装于气溶胶装置内。于另一实施例中，该套组包括注射器及针，且在一实施例中，将无菌胰高血糖素组合物预包装于注射器内。
医药调配物
依据一实施例，提供一种药学组合物，包括本发明的胰高血糖素胜肽或其药学可接受盐类，及一药学可接受载体。该药学组合物是可包含任何药学可接受成分，包含，举例来说，酸化剂、添加剂、吸附剂、推喷剂、空气置换剂、碱化试剂、防结块剂、抗凝聚剂、抗菌防腐剂、抗氧化剂、防腐剂、碱、黏合剂、缓冲剂、螯合剂、涂布剂、着色剂、干燥剂、清洁剂、稀释剂、消毒剂、崩解佐剂、分散剂、助溶剂、染料、润滑剂、乳化剂、乳化稳定剂、填充剂、膜形成剂、风味增强剂、助流剂、胶凝剂、粒化剂、保湿剂、润滑剂、黏膜黏着剂、软膏基、软膏、油性赋形剂、有机碱、片状碱(pastille bases)、色素、可塑剂、磨光剂、防腐剂、多价螯合剂、皮肤渗透剂、增溶剂、溶剂、安定剂、栓剂基体、表面活性剂、界面活性剂、悬浮剂、甜味剂、治疗剂、增稠剂、张力剂、毒性剂、增黏剂、吸水剂、水相互共溶剂、软水剂或湿润剂。
在某些实施例中，该药学组合物包含下列任一种或其组合：阿拉伯胶、醋磺内酯钾(Acesulfame K)、乙酰柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三乙酯、洋菜、白蛋白、酒精、无水酒精、变性酒精、稀释酒精、油桐酸、藻酸、脂肪族聚酯、铝氧、氢氧化铝、十八酸铝、支链淀粉、α-直链淀粉、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、阿斯巴甜、注射用制菌水、皂土、皂黏土乳、羟基氯苯胺、氯化苯齐松(benzethonium chloride)、安息香酸、苄醇、安息酸甲苯、溴硝醇、丁基羟基甲氧苯、二丁基羟基甲苯、羟苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸丁酯钠、褐藻酸钙、抗坏血酸钙、碳酸钙、环己胺磺钙、磷酸氢钙(无水)、磷酸氢钙(2个结晶水)、磷酸钙、丙酸钙、硅酸钙、山梨酸钙、十八酸钙、硫酸钙、半水合硫酸钙、菜籽油、卡波姆、二氧化碳、羟甲基纤维素钙、羟甲基纤维素钙、β-胡萝卜素、鹿角菜胶、篦麻油、氢化篦麻油、阳离子乳化蜡、乙酸纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、粉状纤维素、硅化微晶纤维素、羧甲基纤维素钠盐、十八十六醇、溴化十六基三甲铵、十六碳醇、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、胆固醇、氯己定醋酸盐、氯己定葡糖酸盐、氯己定二盐酸盐、二氟氯乙烷(HCFC)、氯二氟甲烷、氟氯碳化物(CFC)、氯苯氧基乙醇、氯二甲酚、玉米糖浆固体物、无水柠檬酸、单水合柠檬酸、可可脂、着色剂、玉米油、棉花子油、甲酚、m-甲酚、o-甲酚、p-甲酚、交联羧甲基纤维素钠盐、交联聚维酮、环己基氨基磺酸、环糊精、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、无水右旋糖、双咪唑烷基脲、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、二乙醇胺、邻苯二乙酸、二氟乙烷(HFC)、二甲基-β-环糊精、环糊精化合物，例如
Figure BDA0000121349000000881
二甲基乙醚、邻苯二甲酸二甲酯、四乙酸乙二胺二钾、四乙酸乙二胺二钠、磷酸氢二钠、多库酯钙、多库酯钾、多库酯钠、五倍子酸十二酯、十二烷基三甲基溴化铵、四乙酸乙二胺二钠钙、乙二胺四乙酸、葡乙胺(eglumine)、乙醇、乙基纤维素、五倍子酸乙酯、月桂酸乙酯、乙麦芽醇、油酸乙酯、羟苯甲酸乙酯、羟苯甲酸乙酯钾盐、羟苯甲酸乙酯钠盐、乙香草醛、果糖、果糖液、经研磨的果糖、无热原的果糖、粉状果糖、反丁烯二酸、明胶、葡萄糖、葡萄糖液、饱和植物脂肪酸的甘油酯混合物、甘油酯、山萮酸甘油酯、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、自发性乳化单硬脂酸甘油酯、硬脂酸棕榈酸甘油酯、甘氨酸、甘油、四氢呋喃聚乙二醇醚、瓜尔胶、七氟丙烷(HFC)、十六烷基三甲基溴化铵、高果糖糖浆、人类血清白蛋白、碳氢化合物(HC)、稀释氢氯酸、氢化植物油第二型、羟乙基纤维素、2-羟乙基-β-环糊精、羟丙基纤维素、低取代羟丙基纤维素、2-羟丙基-β-环糊精、羟丙基甲纤维素、羟丙甲纤维素酞酸酯、咪唑烷基脲、靛胭脂、离子交换树脂、鐡氧化物、异丙醇、肉荳蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、等张盐溶液、高岭土、乳酸、乳糖醇、乳糖、羊毛脂、羊毛脂醇、无水羊毛脂、卵磷脂、硅酸镁铝、碳酸镁、正常碳酸镁、无水碳酸镁、碳酸氢氧镁、氢氧化镁、月桂醇硫酸酯镁盐、氧化镁、硅酸镁、硬脂酸镁、三硅酸镁、无水三硅酸镁、苹果酸、麦芽、麦芽糖醇、麦芽糖醇溶液、麦芽糖糊精、麦芽酚、麦芽糖、甘露醇、中链脂肪酸甘油三酯、葡甲胺、薄荷醇、甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯、油酸甲酯、羟苯甲酯、羟苯甲酯钾盐、羟苯甲酯钠盐、微晶纤维素及羧甲基纤维素钠盐、矿物油、轻质矿物油、液体石蜡羊毛醇、油、橄榄油、单乙醇胺、高岭石、棓酸辛酯、油酸、软脂酸、石蜡、花生油、凡士林、凡士林羊毛醇、药用釉料、苯酚、液化苯酚、苯氧乙醇、苯氧丙醇、苯乙醇、醋酸苯汞、硼酸苯汞、硝酸苯汞、波拉克林(polacrilin)、波拉克林钾、泊洛沙姆(poloxamer)、葡聚糖、聚乙二醇、聚氧乙烯、聚丙烯酸树脂、聚乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物、聚甲基丙烯酸树脂、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚山梨酯、硬脂酸聚氧乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钾、苯甲酸钾、碳酸氢钾、亚硫酸氢钾、氯化钾、柠檬酸钾、无水柠檬酸钾、磷酸氢钾、焦亚硫酸钾、磷酸二氢钾、丙酸钾、山梨酸钾、聚维酮、丙醇、丙酸、碳酸丙烯酯、丙二醇、藻酸丙二醇酯、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯钾、对羟基苯甲酸丙酯钠、硫酸鱼精蛋白、菜子油、林格氏溶液、糖精、糖精铵、糖精钙、糖精钠、红花子油、皂石、血清蛋白、芝麻油、胶态氧化硅、胶态二氧化硅、藻酸钠、抗坏血酸钠、苯甲酸钠、碳酸氢钠、亚硫酸氢钠、氯化钠、无水柠檬酸钠、柠檬酸钠二水合物、氯化钠、环拉酸钠、四乙酸乙二胺钠、十二基硫酸钠、月桂硫酸钠、焦亚硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、无水丙酸钠、丙酸钠、山梨酸钠、羧甲淀粉钠、硬脂反丁烯二酸钠、亚硫酸钠、山梨酸、山梨坦酯(山梨坦脂肪酯)，山梨醇、山梨醇溶液70％、大豆油、鲸蜡、淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、预胶化淀粉、灭菌玉米淀粉、硬脂酸、纯化硬脂酸，硬脂醇、蔗糖、糖类、可压性蔗糖、蔗糖粉、蔗糖球形颗粒、转化糖、Sugartab、Sunset Yellow FCF、合成石蜡、滑石粉、酒石酸、酒石黄、四氟乙烷(HFC)、可可脂、硫柳汞、二氧化钛、α-生育酚、乙酸生育酚、α酸式琥珀酸生育酚、β生育酚、δ生育酚、γ生育酚、黄蓍胶、甘油三乙酸酯、柠檬酸三丁酯、三乙醇胺、柠檬酸三乙酯、三甲基-β-环糊精、三甲基十四烷基氯化铵、Tris缓冲液、乙二胺四乙基三钠、香草醛、第一型氢化植物油、水、软水、硬水、无二氧化碳水、无热原水、注射用水、无菌吸入水、无菌注射用水、无菌透析水、蜡、阴离子乳化蜡、卡那巴蜡、阳离子乳化蜡、十六醇酯蜡、微晶蜡、非离子性乳化蜡、塞剂蜡、白腊、黄蜡、液体石蜡、羊毛脂、黄原酸胶、木糖醇、玉米蛋白、丙酸锌、锌盐、硬脂酸锌盐，或任何赋形剂，其是于Handbook of Pharmaceutical Excipients，Third Edition，A.H.Kibbe(Pharmaceutical Press，London，UK，2000)，前述揭示内容全体皆引用作为本说明书的参考数据。Remington’s Pharmaceutical Sciences，SixteenthEdition，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1980)，前述揭示内容作为本说明书的参考数据以全文引用的方式并入本发明的说明书中，其是揭露各种使用于配置药学可接受组合物及其已为人所熟知的准备方法。排除于此范围内任何与药学组合物不兼容的传统药剂，其于药学组合物的用途需列入考虑。补充活性成分是亦可纳入组合物中。
如本文所述的该医药调配物是可设计为如下所述的短效剂型、快速释放剂型、长效剂型或持续释放剂型。该医药调配物是可设计为立即释放剂型、控制释放剂型或缓慢释放剂型。该立即组合物进一步包含，例如，胶囊或微脂体，或某些其他胶囊剂型，或施予延长释放剂型以提供延长储存及/或输送的效果。本发明揭示的医药调配物是可依据任何给药方式，举例来说，每天(每天一次、二次、三次、四次、五次、六次)，每两天、每三天、每四天、每五天、每六天每周、每两周、每三周、每月或每两月。
在某些实施例中，前述存在于药学组合物的成分是为任何浓度范围，例如，举例来说，至少为A，其中A为0.0001％w/v、0.001％w/v、0.01％w/v、0.1％w/v、1％w/v、2％w/v、5％w/v、10％w/v、20％w/v、30％w/v、40％w/v、50％w/v、60％w/v、70％w/v、80％w/v、或90％w/v。在某些实施例中，前述存在于药学组合物的成分是为任何浓度，例如，举例来说，为最大值B，其中B为90％w/v、80％w/v、70％w/v、60％w/v、50％w/v、40％w/v、30％w/v、20％w/v、10％w/v、5％w/v、2％w/v、1％w/v、0.1％w/v、0.001％w/v、或0.0001％。在其他实施例中，前述存在于药学组合物的成分是为任何浓度范围，例如，举例来说，约由A至B。在某些实施例中，A为0.0001％且B为90％。
该药学组合物是可配制以达到一生理兼容pH。在某些实施例中，该药学组合物的pH是至少为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、或至少达到10.5且于11的内，是取决于其配方及给药途径。在特定实施例中，该药学组合物是可包含缓冲剂以达到一生理兼容pH。缓冲剂是可包含任何于期望pH中具缓冲能力的化合物，例如，举例来说，磷酸盐缓冲液(例如：PBS)、三乙醇胺(triethanolamine)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、二羟乙甘氨酸(bicine)、3-〔三(羟基甲基)甲基〕胺基-1-磺酸(TAPS)、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(tricine)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪-乙磺酸(HEPES)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-胺基乙磺酸(TES)、3-[N-吗啉基]丙磺酸(MOPS)、六氢哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸))(PIPES)、二甲基胂酸盐(cacodylate)、2-吗啉基乙磺酸(MES)及其他。(为行文方便，以下缓冲液出现时以其英文名称表示)。在特定实施例中，缓冲液强度为至少0.5mM、1mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、120mM、150mM或至少200mM。在特定实施例中，缓冲液强度为不超过300mM(例如：最大为200mM、100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、10mM、5mM、1mM)。
第3号位置的修饰
任何胰高血糖素胜肽包含：胰高血糖素类似物、胰高血糖素促效剂类似物、胰高血糖共同促效剂，以及胰高血糖/胰高血糖素样肽-1共同促效剂分子，如本文所述经修饰而包含于第3号位置的修饰，例如：谷氨酰胺取代为谷氨酸，以产生具高选择性的胜肽，例如10倍选择性，(其是对胰高血糖素样肽-1受体，相较于胰高血糖素受体的选择性)。
任何胰高血糖素胜肽包含：胰高血糖素类似物、胰高血糖素促效剂类似物、胰高血糖共同促效剂，以及胰高血糖/胰高血糖素样肽-1共同促效剂分子，如本文所述被修饰而包含于第3号位置的修饰，例如：谷氨酰胺取代为谷氨酰胺类似物(例如，乙酰二胺基丁酸Dab(Ac))，而对胰高血糖素受体的活性并无实质损失，且在一些情况中，具有增强的胰高血糖素受体活性。
制备方法
如本文所述的化合物是可经标准合成方法制备、DNA重组技术，或任一其他制备胜肽或融合蛋白质的方法。虽然某些特定非天然氨基酸无法以一般DNA重组技术表现，但其制备技术在本领域仍已为人所熟知。本发明的化合物包括非胜肽部分可经由标准有机化学反应合成，或以标准胜肽化学反应也可适用。
【实施方式】
一般合成实验指南：
在经修改的Applied Biosystem Model 430A胜肽合成仪上使用HBTU-活化的「Fast Boc」单一偶合剂自0.2毫摩尔的Boc Thr(OBzl)Pam树脂开始合成得胰高血糖素类似物。Boc-氨基酸及HBTU购买自Midwest Biotech(Fishers，IN)。所使用的侧链保护基为：精氨酸(Tos)、天冬酰氨酸(Xan)、天冬氨酸(OcHex)、半胱氨酸(pMeBzl)、组氨酸(Bom)、赖氨酸(2Cl-Z)、丝氨酸(OBzl)、苏氨酸(OBzl)、酪氨酸(2Br-Z)以及色氨酸(CHO)。氨基酸端的组氨酸上的侧链保护基为Boc。
用哌啶于二甲基甲酰胺(dimethylformamide，以下简称DMF))的20％溶液处理各完成的胜肽基树脂，以自色氨酸移除甲酰基。在对甲酚及二甲基硫的存在下进行液态氟化氢(hydrofluoric acid，以下简称HF)分裂。分裂是使用HF装置(PenninsulaLabs)于冰浴中进行1小时。在蒸发掉HF后，将残留物悬浮于二乙醚中并过滤出固体物质。将各胜肽萃取至30-70毫升的乙酸水溶液中，并利用HPLC[Beckman SystemGold，0.46x5cm Zorbax C8，1ml/min，45C，214nm，A缓冲液＝0.1％三氟醋酸(trifluoroacetic acid，以下简称TFA)，B＝0.1％TFA/90％乙腈，在10分钟内10％至80％B的梯度]分析经稀释的等分试样。
在FPLC上在2.2x 25公分Kromasil C18管柱上进行纯化，同时并监测214纳米处的UV且收集5分钟的溶离份。将均匀的溶离份结合并冻干得＞95％的产物纯度。使用MALDI质谱分析确认准确的分子质量及纯度。
一般聚乙二醇化实验指南(半胱氨酸-马来酰亚胺，Cys-maleimido)
典型上，胰高血糖素半胱氨酸类似物于磷酸盐缓冲溶液(5-10mg/ml)中，并加入0.01M乙二胺四乙酸(Methylenediamine tetraacetic acid)(总体积的10-15％)。加入过量(2倍)的加入过量(2倍)的马来酰亚胺甲氧基聚乙二醇试剂(Nektar)，并将反应于室温下搅拌同时并利用高效液相层析法(high performance liquid chromatography，以下简称HPLC)监测反应。于8-24小时后，将反应混合物酸化，且装填于制备型逆相管柱(preparative reverse phase column)上，以使用0.1％TFA/乙腈梯度进行纯化。将适当的的溶离份结合并冻干得期望经聚乙二醇化类似物。
实施例1
胰高血糖素Cys17(1-29)及类似单半胱氨酸类似物的合成使用FastBoc HBTU-活化的单一偶合剂将存于60毫升反应容器中的0.2毫摩尔Boc Thr(OBzl)Pam树脂(SynChem Inc)及以下序列输入并在经修改的Applied Biosystems 430A胜肽合成仪上执行。
HSQGTFTSDYSKYLDSCRAQDFVQWLMNT(SEQ ID NO：35)
使用以下的侧链保护基：精氨酸(Tos)、天冬氨酸(OcHex)、天冬酰氨酸(Xan)、半胱氨酸(pMeBzl)、谷氨酸(OcHex)、组氨酸(Boc)、赖氨酸(2Cl-Z)、丝氨酸(Bzl)、苏氨酸(Bzl)、色氨酸(CHO)以及酪氨酸(2Br-Z)。利用20％哌啶/二甲基甲酰胺处理完成的胜肽基树脂，以移除色氨酸的甲酰基保护，然后转移至HF反应容器中并于真空中干燥。加入1.0毫升对甲酚及0.5毫升二甲基硫连同一磁石搅拌棒。将容器连接至HF装置(Pennisula Labs)，于干冰/甲醇浴中冷却，抽真空，及凝结入大约10毫升的液态氟化氢。将反应于冰浴中搅拌1小时，然后于真空中移除HF。将残留物悬浮于乙醚中；将固体过滤，以乙醚洗涤，且将胜肽萃取至50毫升乙酸水溶液中。利用分裂萃取物的小样品进行分析HPLC[0.46x 5cm Zorbax C8，1ml/min，45C，214nm，A缓冲液为0.1％TFA，B缓冲液为0.1％TFA/90％ACN，梯度＝于10分钟内10％B至80％B]。将剩余的萃取物装填于2.2x 25公分Kromasil C 18制备型逆相管柱上，且使用Pharmacia FPLC系统执行乙腈梯度。收集5分钟的溶离份，同时并监测214纳米处的UV(2.0A)。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％乙腈。梯度＝于450分钟内30％B至100％B。
将含有最纯产物的溶离份(48-52)组合冰冻，且冻干得30.1毫克。产物的HPLC分析显示纯度＞90％，且MALDI质谱分析显示3429.7的期望质量。类似地制备得胰高血糖素Cys21、胰高血糖素Cys24、及胰高血糖素Cys29。
实施例2
胰高血糖素-Cex及其他羧基端延伸类似物的合成
将285毫克(0.2毫摩尔)甲氧二苯甲基胺(methoxybenzhydrylamine)树脂(MidwestBiotech)置于60毫升反应容器中，且使用FastBoc HBTU-活化的单一偶合剂于经修改的Applied Biosystems 430A胜肽合成仪上输入并执行以下序列。
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：36)
使用以下的侧链保护基：精氨酸(Tos)、天冬氨酸(OcHex)、天冬酰氨酸(Xan)、半胱氨酸(pMeBzl)、谷氨酸(OcHex)、组氨酸(Boc)、赖氨酸(2Cl-Z)、丝氨酸(Bzl)、苏氨酸(Bzl)、色氨酸(CHO)以及酪氨酸(2Br-Z)。利用20％哌啶/二甲基甲酰胺处理完成的胜肽基树脂，以移除色氨酸的甲酰基保护，然后转移至HF反应容器中并于真空中干燥。加入1.0毫升对甲酚及0.5毫升二甲基硫连同一磁石搅拌棒。将容器连接至HF装置(Pennisula Labs)，于干冰/甲醇浴中冷却，抽真空，及凝结入大约10毫升的液态氟化氢。将反应于冰浴中搅拌1小时，然后于真空中移除HF。将残留物悬浮于乙醚中；将固体过滤，以乙醚洗涤，且将胜肽萃取至50毫升乙酸水溶液中。对分裂萃取物的等分试样进行分析HPLC[0.46x 5cm Zorbax C8，1ml/min，45C，214nm，A缓冲液为0.1％TFA，B缓冲液为0.1％TFA/90％ACN，梯度＝于10分钟内10％B至80％B]。将萃取物装填于2.2x 25公分Kromasil C18制备型逆相管柱上，且使用Pharmacia FPLC系统执行乙腈梯度以进行溶离。收集5分钟的溶离份，同时并监测214纳米处的UV(2.0A)。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％乙腈。梯度＝于450分钟内30％B至100％B。将溶离份58-65组合，冰冻且冻干得198.1毫克。
产物的HPLC分析显示纯度大于95％。MALDI质谱分析显示存在作为羧基端酰胺产物的4316.7的期望理论质量。以经适当装填的PAM树脂开始，类似地制备得作为羧基端羧酸的调酸素及调酸素-KRNR。
实施例3
胰高血糖素Cys17 Mal-聚乙二醇-5K
将15.1毫克的胰高血糖素Cys17(1-29)及27.3毫克的甲氧基聚(乙二醇)马来酰亚胺平均M.W.5000(m聚乙二醇-Mal-5000，Nektar Therapeutics)溶解于3.5毫升的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并加入0.5毫升的0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)。将反应于室温下搅拌，并利用HPLC分析[0.46x 5cm Zorbax C8，1ml/min，45C，214nm(0.5A)，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/90％ACN，梯度＝于10分钟内10％B至80％B]监测反应的进行。
于5小时后，将反应混合物装填于2.2x 25公分Kromasil C18制备型逆相管柱上。于Pharmacia FPLC上执行乙腈梯度，同时并监测214纳米处的UV波长且收集5分钟的溶离份。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％乙腈，梯度＝于450分钟内自30％B至100％B。将对应于产物的溶离份组合，冰冻且冻干得25.9毫克。
于HPLC[0.46x 5cm Zorbax C8，1ml/min，45C，214nm(0.5A)，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/90％ACN，梯度＝于10分钟内自10％B至80％B]上分析此产物，其显示纯度大约为90％。MALDI(基质辅助雷射脱附游离)质谱分析显示8700至9500的宽广质量范围(聚乙二醇衍生物的典型值)。此显示将大约5,000a.m.u添加至起始胰高血糖素胜肽(3429)的质量。
实施例4
胰高血糖素Cys21 Mal-聚乙二醇-5K
将21.6毫克的胰高血糖素Cys21(1-29)及24毫克的m聚乙二醇-MAL-5000(Nektar Therapeutics)溶解于3.5毫升的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并加入0.5毫升的0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)。将反应于室温下搅拌。于2小时后，加入另一12.7毫克的m聚乙二醇-MAL-5000。于8小时后，将反应混合物装填于2.2x 25公分Vydac C18制备型逆相管柱上，且于Pharmacia FPLC上于4毫升/分钟下执行乙腈梯度，同时收集5分钟的溶离份。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％ACN。梯度＝于450分钟内自20％至80％B。
将对应于出现产物的溶离份组合，冰冻且冻干得34毫克。利用分析HPLC[0.46x5cm Zorbax C8，1ml/min，45C，214nm(0.5A)，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/90％ACN，梯度＝于10分钟内自10％B至80％B]分析产物显示不同于起始胰高血糖素胜肽的均匀产物。MALDI(基质辅助雷射脱附游离)质谱分析显示8700至9700的宽广质量范围(聚乙二醇的典型值)。此显示将大约5,000a.m.u加成至起始胰高血糖素胜肽(3470)的质量。
实施例5
胰高血糖素Cys24 Mal-聚乙二醇-5K
在搅拌下将20.1毫克的胰高血糖素C24(1-29)及39.5毫克的m聚乙二醇-Mal-5000(Nektar Therapeutics)溶解于3.5毫升的PBS中，并加入0.5毫升的0.01MEDTA。将反应于室温下搅拌7小时，然后加入另一40毫克的m聚乙二醇-Mal-5000。于大约15小时后，将反应混合物装填于2.2x 25公分Vydac C18制备型逆相管柱上，且使用Pharmacia FPLC执行乙腈梯度。收集5分钟的溶离份，同时并监测214纳米(2.0A)处的UV。A缓冲液＝0.1％TFA，B缓冲液＝0.1％TFA/50％ACN，梯度＝于450分钟内自30％B至100％B。将对应于产物的溶离份组合，冰冻且冻干得45.8毫克。MALDI质谱分析显示最大值位于9175.2(其大约比胰高血糖素C24(3457.8)多5,000a.m.u.)的典型的聚乙二醇宽信号。
实施例6
胰高血糖素Cys24 Mal-聚乙二醇-20K
在室温于搅拌下将25.7毫克的胰高血糖素Cys24(1-29)及40.7毫克的m聚乙二醇-Mal-20K(Nektar Therapeutics)溶解于3.5毫升的PBS中，并加入0.5毫升的0.01MEDTA。于6小时后，如利用HPLC所测得，起始物料对产物的比大约为60∶40。加入另一25.1毫克的m聚乙二醇-Mal-20K且使反应再多搅拌16小时。产物比率并未显著地改善，因此将反应混合物装填于2.2x 25公分Kromasil C18制备型逆相管柱上，且于Pharmacia FPLC上使用于450分钟内自30％B至100％B的梯度进行纯化。A缓冲液＝0.1％TFA，B缓冲液＝0.1％TFA/50％ACN，流率＝4毫升/分钟，且收集5分钟的溶离份同时并监测214纳米(2.0A)处的UV。将含有均匀产物的溶离份组合，冰冻且冻干得25.7毫克。利用分析HPLC测得的纯度为～90％。MALDI质谱分析显示自23,000至27,000的宽峰，其大约比起始胰高血糖素C24(3457.8)多20,000a.m.u.。
实施例7
胰高血糖素Cys29 Mal-聚乙二醇-5K
在室温于搅拌下将20.0毫克的胰高血糖素Cys29(1-29)及24.7毫克的m聚乙二醇-Mal-5000(Nektar Therapeutics)溶解于3.5毫升的PBS中，并加入0.5毫升的0.01MEDTA。于4小时后，加入另一15.6毫克的m聚乙二醇-Mal-5000以驱使反应完全。于8小时后，将反应混合物装填于2.2x 25公分Vydac C18制备型逆相管柱上，且于Pharmacia FPLC系统上执行乙腈梯度。收集5分钟的溶离份，同时并监测214纳米(2.0A)处的UV。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％ACN。将溶离份75-97组合，冰冻且冻干得40.0毫克的不同于在HPLC上的回收起始材料(溶离份58-63)的产物。利用分析HPLC[0.46x 5cm Zorbax C8，1ml/min，45C，214nm(0.5A)，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/90％ACN，梯度＝于10分钟内自10％B至80％B]分析产物显示纯度大于95％。MALDI质谱分析显示存在具8,000至10,000的质量范围(最大值在9025.3)的聚乙二醇成分，其较起始物料(3484.8)大5,540a.m.u.。
实施例8
胰高血糖素Cys24(2-丁内酯)
于24.7毫克的胰高血糖素Cys24(1-29)中加入4毫升的0.05M碳酸氢铵/50％乙腈及5.5微升(ul)的2-溴-4-羟基丁酸-γ-内酯的溶液(100微升于900微升乙腈中)。于在室温下搅拌3小时后，将另一105微升的内酯溶液加至反应混合物，将其再多搅拌15小时。以10％乙酸水溶液将反应混合物稀释至10毫升，并将其装填于2.2x25公分Kromasil C18制备型逆相管柱上。于Pharmacia FPLC上执行乙腈梯度(于450分钟内自20％B至80％B)，同时收集5分钟的溶离份并监测214纳米(2.0A)处的UV。流率＝4毫升/分钟，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％ACN。将溶离份74-77组合，冰冻且冻干得7.5毫克。HPLC分析显示纯度为95％，且MALDI质谱分析显示3540.7的质量或较起始物料多84个质量单位。此结果与添加一单一的丁内酯部分一致。
实施例9
胰高血糖素Cys24(S-羧甲基)
将18.1毫克的胰高血糖素Cys24(1-29)溶解于9.4毫升的0.1M磷酸钠缓冲液(pH＝9.2)中，并加入0.6毫升的溴乙酸溶液(1.3毫克/毫升于乙腈中)。将反应于室温下搅拌并利用分析HPLC追踪反应的进行。于1小时后，加入另一0.1毫升的溴乙酸溶液。将反应再多搅拌60分钟，然后用乙酸水溶液酸化并装填于2.1x 25公分KromasilC18制备型逆相管柱上进行纯化。于Pharmacia FPLC(流率＝4毫升/分钟)上执行乙腈梯度，同时收集5分钟的溶离份并监测214奈米(2.0A)处的UV。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％ACN。将溶离份26-29组合，冰冻且冻干得数毫克的产物。
分析HPLC显示纯度为90％，且MALDI质谱分析确认3515的期望产物的质量。
SEQ ID NO：38
Figure BDA0000121349000000971
实施例10
胰高血糖素Cys24马来酰亚胺基，聚乙二醇-3.4K-二聚体
将16毫克的胰高血糖素Cys24及1.02毫克的Mal-聚乙二醇-Mal-3400，聚(乙二醇)-双-马来酰亚胺平均M.W.3400(Nektar Therpeutics)溶解于3.5毫升的磷酸盐缓冲盐水及0.5毫升的0.01M EDTA中，并将反应于室温下搅拌。于16小时后，加入另一16毫克的胰高血糖素Cys24并持续搅拌。于大约40小时后，将反应混合物装填于Pharmcia PepRPC 16/10管柱上，并于Pharmacia FPLC上执行乙腈梯度，同时收集2分钟的溶离份并监测214奈米(2.0A)处的UV。流率＝2毫升/分钟，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％ACN。将溶离份69-74组合，冰冻且冻干得10.4毫克。分析HPLC显示纯度为90％，且MALDI质谱分析显示在9500-11,000范围内的成分，其与期望的二聚体一致。
Figure BDA0000121349000000981
实施例11
胰高血糖素内酰胺的合成
将285毫克(0.2毫摩尔)的甲氧二苯甲基胺树脂(Midwest Biotech)加至60毫升的反应容器，且使用Boc DEPBT-活化的单一偶合剂在经修改的Applied Biosystems 430A胜肽合成仪上组装以下序列。
HSQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVQWLMNT-NH2(12-16内酰胺；SEQ IDNO：12)
使用以下的侧链保护基：精氨酸(Tos)、天冬氨酸(OcHx)、天冬酰氨酸(Xan)、谷氨酸(OFm)、组氨酸(BOM)、赖氨酸(Fmoc)、丝氨酸(Bzl)、色氨酸(CHO)以及酪氨酸(2Br-Z)。若内酰胺是由16-20、20-24、或24-28所构成，则于第12号位置处使用赖氨酸(C1-Z)。在旋转下用20％哌啶/二甲基甲酰胺将完成的胜肽基树脂处理1小时，以移除色氨酸的甲酰基以及自赖氨酸12及谷氨酸16移除Fmoc及OFm保护。当由阳性水合茚三酮(positive ninhydrin)试验确认移除时，将树脂先用二甲基甲酰胺，接着用二氯甲烷及随后再次用二甲基甲酰胺洗涤。用存于二甲基甲酰胺及二异丙基乙基胺(DIEA)中的520毫克(1毫摩尔)苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基膦六氟磷酸盐(PyBOP)处理树脂。使反应进行8-10小时，且由阴性水合茚三酮反应确认环化。将树脂先用二甲基甲酰胺，接着再用二氯甲烷洗涤，及随后用三氟乙酸处理10分钟。由阳性水合茚三酮反应确认Boc基团的移除。将树脂用二甲基甲酰胺及二氯甲烷洗涤并干燥，随后再转移至氢氟酸(HF)反应容器。加入500微升对甲酚连同一磁石搅拌棒。将容器连接至HF装置(Peninsula Labs)，于干冰/甲醇浴中冷却，抽真空，及将大约10毫升的液态氢氟酸凝结至容器中。将反应于冰浴中搅拌1小时，随后于真空中移除HF。将残留物悬浮于乙醚中；将固体过滤，以乙醚洗涤，且将胜肽用150毫升的20％乙腈/1％乙酸溶解。
在下列条件[4.6X 30mm Xterra C8，1.50mL/min，220nm，A缓冲液为0.1％TFA/10％ACN，B缓冲液为0.1％TFA/100％ACN，梯度为于15分钟内5-95％B]下进行粗制溶解胜肽的分析性HPLC分析。将萃取液用水稀释两倍，且装填于2.2X 25公分Vydac C4制备型逆相管柱上，并于Waters HPLC是统上使用乙腈梯度溶离(A缓冲液为0.1％TFA/10％ACN，B缓冲液为0.1％TFA/10％ACN，及在15.00毫升/分钟的流率下于120分钟内0-100％B的梯度)。经纯化胜肽的HPLC分析显示纯度大于95％，且电喷洒游离(electrospray ionization)质谱分析确认12-16内酰胺的3506Da的质量。类似地制备来自16-20、20-24、及24-28的内酰胺。
实施例12
胰高血糖素溶解度测定方法：
制备存于0.01N HCl中的胰高血糖素(或类似物)的溶液(1毫克/毫升或3毫克/毫升)。用0.01N HCl将100微升的储存溶液稀释至1毫升，并测定UV吸亮度(276奈米)。使用200-250微升的0.1M Na2HPO4(pH9.2)将剩余储存溶液的pH调整至pH7。
使溶液于4℃下静置隔夜然后离心。接着用0.01N HCl将100微升的上清液稀释至1毫升，并测定UV吸亮度(重复两次)。
补偿起始吸亮度读数的体积的增加，且使用以下计算于确定溶解度百分比：
Figure BDA0000121349000000991
结果显示于表1，其中胰高血糖素-Cex代表野生型胰高血糖素(SEQ ID NO：1)加上SEQ ID NO：26的羧基端的添加且胰高血糖素-Cex R12代表SEQ ID NO：39。
表1胰高血糖素类似物的溶解度数据
实施例13
胰高血糖素受体结合测定方法：
利用闪烁邻近(scintillation proximity)测定技术于竞争结合测定方法中测量胜肽对胰高血糖素受体的亲和力。将于闪烁邻近测定缓冲液(0.05M Tris-HCl，pH 7.5，0.15M NaCl，0.1％w/v牛血清白蛋白)中制得的胜肽的连续3倍稀释液于96孔白色/透明底盘(Corning Inc.，Acton，MA)中与0.05nM(3-[125I]-碘酪胺酰基)Tyr10胰高血糖素(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)(每孔1-6微克)、由过度表现人类胰高血糖素受体的细胞制备得的细胞质膜片段、及1毫克/孔的经聚乙烯亚胺处理的小麦胚芽凝集素(agglutinin)A型闪烁邻近测定珠粒(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)混合。当于旋转摇荡器上在800rpm下摇荡5分钟后，将盘置于室温下培养12小时，然后于MicroBeta1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)上进行读取。于具有较测试样品中的最高浓度大4倍浓度的「冷」天然配体的孔中测量非特异结合(NSB)放射性，且于没有竞争物的孔中侦测总结合放射性。特异结合百分比是计算如下：特异结合％＝((结合-NSB)/(总结合-NSB))X100。IC50值是经由使用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)而测得。
实施例14
功能测定方法-cAMP合成
基于萤火虫荧光素酶的报导测定方法中测量胰高血糖素类似物诱导cAMP的能力。经由于经补充0.25％牛生长血清(HyClone，Logan，UT)的DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养16小时，然后再用胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1或新颖胰高血糖素类似物的连续稀释液于37℃，于96孔经涂布聚-D-赖氨酸的「Biocoat」盘(BD Biosciences，San Jose，CA)中的5％CO2下培养5小时，而将经共转染胰高血糖素受体或胰高血糖素样肽-1受体的HEK293细胞及连接至cAMP反应单元的荧光素酶基因除去血清。于培养结束时，将100微升的LucLite发光基质试剂(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)添加至各孔。短暂地摇晃该盘，于暗处培养10分钟，并于MicroBeta-1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)上测量光输出。经由使用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)计算有效的50％浓度。结果显示于图3-9及表2至10中。
表2通过具羧基端延伸的胰高血糖素类似物的cAMP诱导
Figure BDA0000121349000001011
*-实验数目
表3通过经聚乙二醇化胰高血糖素类似物的cAMP诱导
Figure BDA0000121349000001012
Figure BDA0000121349000001021
*-实验数目
表4通过E16胰高血糖素类似物的cAMP诱导
Figure BDA0000121349000001022
表5通过E16胰高血糖素类似物的cAMP诱导
表6通过E16胰高血糖素类似物的cAMP诱导的EC50值
Figure BDA0000121349000001032
表7
通过E16胰高血糖素类似物的cAMP诱导的EC50值
表8通过E16胰高血糖素类似物的cAMP诱导的EC50值
Figure BDA0000121349000001041
当并行测试化合物时，E16 Gluc NH2于胰高血糖素受体的效能相对于G16-COOH及T16 Gluc NH2多四倍。
表9通过E16/内酰胺胰高血糖素类似物的cAMP诱导
表10通过胰高血糖素样肽-117-26胰高血糖素类似物的cAMP诱导
Figure BDA0000121349000001051
实施例15
胰高血糖素Cys-马来酰亚胺基聚乙二醇类似物的稳定度测定方法
将各胰高血糖素类似物溶解于水或PBS中，并进行起始HPLC分析。于调整pH(4、5、6、7)后，将样品于37℃下在指定的期间内培养，并再次利用HPLC分析以测定胜肽的完整性。测定特定相关胜肽的浓度，并相对于起始分析计算保持完整的百分比。关于胰高血糖素Cys21-马来酰亚胺基聚乙二醇5K的结果示于图1及2。
实施例16
大致如上述实施例1-11中所述，建构以下的胰高血糖素胜肽：
在以下所有序列中，「a」是指羧基端酰胺。
HSQGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：70)
HSQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：71)
HSQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：72)
HSQGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：73)
HSQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：74)
HSQGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：75)
HSQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：76)
HSQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：77)
HSQGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：78)
HSQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：79)
HSQGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：80)
HSQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(SEQ ID NO：81)
HSQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：82)
HSQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：83)
HSQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(SEQ ID NO：84)
HSQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(内酰胺12-16；SEQ ID NO：85)
HSQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(内酰胺16-20；SEQ ID NO：86)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：87)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：88)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：89)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：90)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：91)
X1SQGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：92)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：93)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：94)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：95)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：96)
X1SQGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：97)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(SEQ ID NO：98)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：99)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：100)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(SEQ ID NO：101)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：102)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：103)
其中在前述序列中，X1＝(脱胺基)组氨酸
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：104)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：105)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：106)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：107)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：108)
HX2QGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：109)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：110)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：111)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：112)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：113)
HX2QGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：114)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(SEQ ID NO：115)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：116)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：117)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(SEQ ID NO：118)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：119)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：120)
其中在前述序列中，X2＝胺基异丁酸
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：121)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：122)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：123)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：124)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：125)
HX2QGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：126)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：127)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：128)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：129)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：130)
HX2QGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：131)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(SEQ ID NO：132)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：133)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：134)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(SEQ ID NO：135)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：136)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：137)
其中在前述序列中，X2＝(D-丙氨酸)
HSEGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：138)
HSEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：139)
HSEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：140)
HSEGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：141)
HSEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：142)
HSEGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：143)
HSEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：144)
HSEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：145)
HSEGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：146)
HSEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：147)
HSEGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：148)
HSEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(SEQ ID NO：149)
HSEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ ID NO：150)
HSEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ ID NO：151)
HSEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(SEQ ID NO：152)
HSEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(内酰胺12-16；SEQ ID NO：153)
HSEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(内酰胺16-20；SEQ ID NO：154)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：155)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：156)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：157)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：158)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：159)
X1SEGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：160)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：161)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：162)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：163)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：164)
X1SEGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：165)
X1SEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(SEQ ID NO：166)
X1SEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：167)
X1SEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：168)
X1SEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(SEQ ID NO：169)
X1SEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：170)
X1SEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：171)
其中在前述序列中，X1＝(脱胺基)组氨酸
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：172)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：173)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：174)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：175)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：176)
HX2EGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：177)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：178)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：179)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：180)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：181)
HX2EGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：182)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(SEQ ID NO：183)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：184)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：185)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(SEQ ID NO：186)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：187)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：188)
其中在前述序列中，X2＝胺基异丁酸
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：189)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：190)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：191)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：192)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：193)
HX2EGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：194)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：195)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：196)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：197)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：198)
HX2EGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVQW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：199)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(SEQ ID NO：200)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：201)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：202)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(SEQ ID NO：203)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：204)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LVKGa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：205)
其中在前述序列中，X2＝(D-丙氨酸)
HSQGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：206)
HSQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：207)
HSQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：208)
HSQGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：209)
HSQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：210)
HSQGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：211)
HSQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：212)
HSQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：213)
HSQGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：214)
HSQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：215)
HSQGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：216)
HSQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(SEQ ID NO：217)
HSQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：218)
HSQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：219)
HSQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(SEQ ID NO：220)
HSQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：221)
HSQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：222)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：223)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：224)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：225)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：226)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：227)
X1SQGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：228)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：229)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：230)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：231)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：232)
X1SQGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：233)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(SEQ ID NO：234)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：235)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：236)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(SEQ ID NO：237)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：238)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：239)
其中在前述序列中，X1＝(脱胺基)组氨酸；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：240)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：241)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：242)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：243)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：244)
HX2QGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：245)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：246)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：247)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：248)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：249)
HX2QGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：250)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(SEQ ID NO：251)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：252)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：253)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(SEQ ID NO：254)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：255)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：256)
其中在前述序列中，X2＝胺基异丁酸；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：257)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：258)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：259)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：260)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：261)
HX2QGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：262)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：263)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：264)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：265)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：266)
HX2QGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：267)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(SEQ ID NO：268)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：269)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：270)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(SEQ ID NO：271)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：272)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：273)
其中在前述序列中，X2＝(D-丙氨酸)；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
HSEGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：274)
HSEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：275)
HSEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：276)
HSEGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：277)
HSEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：278)
HSEGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：279)
HSEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：280)
HSEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：281)
HSEGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：282)
HSEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：283)
HSEGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：284)
HSEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(SEQ ID NO：285)
HSEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：286)
HSEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：287)
HSEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(SEQ ID NO：288)
HSEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：289)
HSEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：290)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：291)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：292)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：293)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：294)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：295)
X1SEGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：296)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：297)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：298)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：299)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：300)
X1SEGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：301)
X1SEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(SEQ ID NO：302)
X1SEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：303)
X1SEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：304)
X1SEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(SEQ ID NO：305)
X1SEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：306)
X1SEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：307)
其中在前述序列中，X1＝(脱胺基)组氨酸；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：308)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：309)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：310)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：311)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：312)
HX2EGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：313)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：314)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：315)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：316)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：317)
HX2EGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：318)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(SEQ ID NO：319)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：320)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：321)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(SEQ ID NO：322)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：323)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：324)
其中在前述序列中，X2＝胺基异丁酸；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：325)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：326)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：327)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：328)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：329)
HX2EGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：330)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：331)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：332)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：333)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：334)
HX2EGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：335)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(SEQ ID NO：336)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：337)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：338)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(SEQ ID NO：339)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：340)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LVKGa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：341)
其中在前述序列中，X2＝(D-丙氨酸)；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
HSQGT FTSDY SKYLD C*RRAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：342)
HSQGT FTSDY SKYLD C*RAAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：343)
HSQGT FTSDY SKYLD C*QAAK EFIAW LMNTa(SEQ ID NO：344)
HSQGT FTSDY SKYLD C*QAAK EFIAW LVKGa(SEQ ID NO：345)
X1SQGT FTSDY SKYLD C*RRAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：346)
X1SQGT FTSDY SKYLD C*RAAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：347)
X1SQGT FTSDY SKYLD C*QAAK EFIAW LMNTa(SEQ ID NO：348)
X1SQGT FTSDY SKYLD C*QAAK EFIAW LVKGa(SEQ ID NO：349)
其中，X1＝(脱胺基)组氨酸；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
HX2QGT FTSDY SKYLD C*RRAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：350)
HX2QGT FTSDY SKYLD C*RAAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：351)
HX2QGT FTSDY SKYLD C*QAAK EFIAW LMNTa(SEQ ID NO：352)
HX2QGT FTSDY SKYLD C*QAAK EFIAW LVKGa(SEQ ID NO：353)
其中，X2＝胺基异丁酸；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
HX2QGT FTSDY SKYLD C*RRAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：354)
HX2QGT FTSDY SKYLD C*RAAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：355)
HX2QGT FTSDY SKYLD C*QAAK EFIAW LMNTa(SEQ ID NO：356)
HX2QGT FTSDY SKYLD C*QAAK EFIAW LVKGa(SEQ ID NO：357)
其中，X2＝(D-丙氨酸)；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
HSEGT FTSDY SKYLD C*RRAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：358)
HSEGT FTSDY SKYLD C*RAAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：359)
HSEGT FTSDY SKYLD C*QAAK EFIAW LMNTa(SEQ ID NO：360)
HSEGT FTSDY SKYLD C*QAAK EFIAW LVKGa(SEQ ID NO：361)
X1SEGT FTSDY SKYLD C*RRAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：362)
X1SEGT FTSDY SKYLD C*RAAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：363)
X1SEGT FTSDY SKYLD C*QAAK EFIAW LMNTa(SEQ ID NO：364)
X1SEGT FTSDY SKYLD C*QAAK EFIAW LVKGa(SEQ ID NO：365)
其中，X1＝(脱胺基)组氨酸；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
HX2EGT FTSDY SKYLD C*RRAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：366)
HX2EGT FTSDY SKYLD C*RAAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：367)
HX2EGT FTSDY SKYLD C*QAAK EFIAW LMNTa(SEQ ID NO：368)
HX2EGT FTSDY SKYLD C*QAAK EFIAW LVKGa(SEQ ID NO：369)
其中，X2＝(D-丙氨酸)；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
HX2EGT FTSDY SKYLD C*RRAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：370)
HX2EGT FTSDY SKYLD C*RAAK DFVQW LMNTa(SEQ ID NO：371)
HX2EGT FTSDY SKYLD C*QAAK EFIAW LMNTa(SEQ ID NO：372)
HX2EGT FTSDY SKYLD C*QAAK EFIAW LVKGa(SEQ ID NO：373)
其中，X2＝(D-丙氨酸)；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
HSQGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：374)
HSQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：375)
HSQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：376)
HSQGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：377)
HSQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：378)
HSQGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：379)
HSQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：380)
HSQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：381)
HSQGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：382)
HSQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：383)
HSQGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：384)
HSQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(SEQ ID NO：385)
HSQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：386)
HSQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：387)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：388)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：389)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：390)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：391)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：392)
X1SQGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：393)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：394)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：395)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：396)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：397)
X1SQGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：398)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(SEQ ID NO：399)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：400)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：401)
其中在前述序列中，X1＝(脱胺基)组氨酸
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：402)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：403)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：404)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：405)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：406)
HX2QGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：407)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：408)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：409)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：410)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：411)
HX2QGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：412)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(SEQ ID NO：413)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：414)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：415)
其中在前述序列中，X2＝胺基异丁酸
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：416)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：417)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：418)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：419)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：420)
HX2QGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：421)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：422)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：423)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：424)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：425)
HX2QGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：426)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(SEQ ID NO：427)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：428)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：429)
其中在前述序列中，X2＝(D-丙氨酸)
HSEGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：430)
HSEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：431)
HSEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：432)
HSEGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：433)
HSEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：434)
HSEGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：435)
HSEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：436)
HSEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：437)
HSEGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：438)
HSEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：439)
HSEGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：440)
HSEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(SEQ ID NO：441)
HSEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ ID NO：442)
HSEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ ID NO：443)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：444)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：445)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：446)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：447)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：448)
X1SEGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：449)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：450)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：451)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：452)
X1SEGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：453)
X1SEGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：454)
X1SEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(SEQ ID NO：455)
X1SEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：456)
X1SEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：457)
其中在前述序列中，X1＝(脱胺基)组氨酸
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：458)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：459)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：460)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：461)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：462)
HX2EGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：463)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：464)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：465)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：466)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：467)
HX2EGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：468)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(SEQ ID NO：469)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：470)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：471)
其中在前述序列中，X2＝胺基异丁酸
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：472)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：473)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：474)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：475)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：476)
HX2EGT FTSDY SKYLD KRRAE DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：477)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(SEQ ID NO：478)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：479)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAQ DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：480)
HX2EGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：481)
HX2EGT FTSDY SKYLD KRAAE DFVQW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：482)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(SEQ ID NO：483)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(内酰胺12-16；SEQ IDNO：484)
HX2EGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMDTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：485)
其中在前述序列中，X2＝(D-丙氨酸)
大致如以上在实施例1-11中所述，构造以下具有约5或以上的胰高血糖素样肽-1/胰高血糖素活性比的胰高血糖素胜肽。一般而言，在这些胜肽中，第2号位置的胺基异丁酸提供第四型双胜肽蛋白水解酶抗性，但亦显著地降低胰高血糖素活性。
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(SEQ ID NO：486)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNC*a(SEQ ID NO：487)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNGG PSSGA PPPSC*a(SEQ IDNO：488)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNGG PSSGA PPPSC*a(内酰胺16-20；SEQ ID NO：489)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNGG PSSGA PPPSa(SEQ IDNO：490)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNGG PSSGA PPPSa(内酰胺16-20；SEQ ID NO：491)
其中在前述序列中，X2＝胺基异丁酸；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：492)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNC*a(SEQ ID NO：493)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNGG PSSGA PPPSC*a(SEQ IDNO：494)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVQW LMNGG PSSGA PPPSC*a(内酰胺16-20；SEQ ID NO：495)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNGG PSSGA PPPSa(SEQ IDNO：496)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERAAK DFVC*W LMNGG PS SGA PPPSa(内酰胺16-20；SEQ ID NO：497)
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HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNGG PSSGA PPPSC*a(SEQ IDNO：500)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNGG PSSGA PPPSC*a(内酰胺16-20；SEQ ID NO：501)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNGG PSSGA PPPSa(SEQ IDNO：502)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNGG PSSGA PPPSa(内酰胺16-20；SEQ ID NO：503)
其中在前述序列中，X2＝胺基异丁酸；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
亦大致如上述实施例1-11中所述，构造以下作为胰高血糖素样肽-1/胰高血糖素共同促效剂的胰高血糖素胜肽。于第16与20氨基酸的间形成内酰胺架桥使因第2号位置处的取代所导致的胰高血糖素活性的降低恢复。
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：504)
其中在前述序列中，X2＝胺基异丁酸；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：505)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNC*a(内酰胺16-20；SEQ IDNO：506)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNGG PSSGA PPPSC*a(内酰胺16-20；SEQ ID NO：507)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNGG PSSGA PPPSC*a(内酰胺16-20；SEQ ID NO：508)
X1SQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNGG PSSGA PPPSa(内酰胺16-20；SEQ ID NO：509)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：510)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：511)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVQW LMNC*a(内酰胺16-20；SEQ IDNO：512)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNGG PSSGA PPPSa(内酰胺16-20；SEQ ID NO：513)
其中在前述序列中，X1＝α，α-双甲基咪唑乙酸(alpha，alpha-dimethyl imidiazoleacetic acid，DMIA)；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
HSQGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(可选择的地具内酰胺16-20；SEQ ID NO：514)
其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：517)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(内酰胺16-20；SEQ IDNO：528)
HX2QGT FTSDY SKYLD ERRAK EFIC*W LMNGG PSSGA PPPSC*a(SEQ ID NO：531)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LMNGG PSSGA PPPSC*C*a(SEQ IDNO：532)
HX2QGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIC*W LMNGG PSSGA PPPSa(SEQ IDNO：533)
其中在前述序列中，X2＝胺基异丁酸；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
HSQGT FTSDYSKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(SEQ ID NO：518)
X1SQGT FTSDYSKYLD EQAAK EFIC*W LMNTa(SEQ ID NO：519)
X1SQGT FTSDYSKYLD EQAAK EFIAW LMNC*a(SEQ ID NO：520)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNGG PSSGA PPPSa(SEQ IDNO：529)
X1SQGT FTSDY SKYLD ERRAK DFVC*W LMNTa(SEQ ID NO：530)
其中在前述序列中，X1＝α，α-双甲基咪唑乙酸(alpha，alpha-dimethyl imidiazoleacetic acid，DMIA)；且其中C*为半胱氨酸(Cys)，或连接至亲水性聚合物的半胱氨酸，或者C*为连接至约20kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸，或者C*为连接至约40kD平均分子量的聚乙二醇的半胱氨酸。
HSQGT FTSDYSKYLD SRRAQ DFVQW LMNTGPSSGAPPPSa(SEQ ID NO：521)
HSQGT FTSDYSKYLD SRRAQ DFVQW LMNGGPSSGAPPPSa(SEQ ID NO：522)
HSQGT FTSDYSKYLD SRRAQ DFVQW LMKGGPSSGAPPPSa(SEQ ID NO：523)
HSQGT FTSDYSKYLD SRRAQ DFVQW LVKGGPSSGAPPPSa(SEQ ID NO：524)
HSQGT FTSDYSKYLD SRRAQ DFVQW LMDGGPSSGAPPPSa(SEQ ID NO：525)
HSQGT FTSDYSKYLD ERRAK DFVQW LMDGGPSSGAPPPSa(SEQ ID NO：526)
HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGGa(SEQ ID NO：527)
X1X2QGT FTSDY SKYLD ERX5AK DFVX3W LMNX4(SEQ ID NO：61)
其中
X1＝组氨酸、D-组氨酸、脱胺基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸、高组氨酸、α，α-双甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、或咪唑乙酸(imidazole acetic acid)，
X2＝丝氨酸、D-丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸或胺基异丁酸(AIB)、N-甲基丙氨酸以及D-丙氨酸。
X3＝丙氨酸、谷氨酰胺或Cys-PEG。
X4＝Thr-CONH2或Cys-PEG或GGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：515)或GGPSSGAPPPSC-PEG(SEQ ID NO：516)其限制条件为当X3为Cys-PEG，X4不为Cys-PEG或GGPSSGAPPPSC-PEG(SEQ ID NO：516)，及当X2＝丝氨酸，X1不为组氨酸。X5＝丙氨酸或精氨酸。
X1X2QGT FTSDY SKYLD EQ X5AK EFI X3W LMNX4(SEQ ID NO：62)
其中
X1＝组氨酸、D-组氨酸、脱胺基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸、高组氨酸、α，α-双甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、或咪唑乙酸(imidazole acetic acid)，
X2＝丝氨酸、D-丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸或胺基异丁酸(AIB)、N-甲基丙氨酸以及D-丙氨酸。
X3＝丙氨酸、谷氨酰胺或Cys-PEG。
X4＝Thr-CONH2或Cys-PEG或GGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：515)或GGPSSGAPPPSC-PEG(SEQ ID NO：516)
其限制条件为当X3为Cys-PEG，X4不为Cys-PEG或GGPSSGAPPPSC-PEG(SEQID NO：516)，及当X2＝丝氨酸，X1不为组氨酸。X5＝丙氨酸或精氨酸。
HSEGT FTSDY SKYLD EQAAK EFIAW LXNTa(SEQ ID NO：554)，其中第27号位置处的X为正亮氨酸，其中第29号位置处的氨基酸经酰胺化。
任何前述的序列皆可包括额外的修饰，例如，1、2、3、4或5个不会破坏活性的修饰，包括但不限于，可用于增强效能的W10或R20取代。任何前述的序列亦可经制成为没有赋予第四型双胜肽蛋白水解酶抗性的修饰，即其中天然组氨酸是位于第1号位置且天然丝氨酸是位于第2号位置。此外，任何前述的化合物可可选择的键联至一结合物，诸如异源多肽、免疫球蛋白或其的一部分(例如，Fc区域)、标靶试剂、诊断标记、或诊断或治疗剂。
实施例17
大致如上述实施例1-11中，构造以下经修饰成包含连接至胰高血糖素胜肽的羧基端的SEQ ID NO：26的羧基端延伸的胰高血糖素胜肽，并使用实施例14中所述的体外测定方法测定对胰高血糖素样肽-1及胰高血糖素受体的活性。
表11显现各种胰高血糖素类似物对胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1受体的活性。数据显示对于包含SEQ ID NO：26的羧基端延伸的胰高血糖素类似物，第16、20、28及29号位置处的氨基酸取代会影响对胰高血糖素样肽-1受体的类似物活性。
表11胰高血糖素-Cex结构活性关系
Figure BDA0000121349000001341
Figure BDA0000121349000001351
实施例18
表12显现各种胰高血糖素类似物对胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1受体的体外活性数据。
表12有及无聚乙二醇的促效剂及共同促效剂的比较
Figure BDA0000121349000001352
Figure BDA0000121349000001353
Figure BDA0000121349000001361
Figure BDA0000121349000001371
实施例19
如下制备经酰基化及/或聚乙二醇化的胜肽。使用CS Bio 4886胜肽合成仪或Applied Biosystems 430A胜肽合成仪于固态载体树脂上合成胜肽。使用如Schnolzer等人，Int.J.Peptide Protein Res.40：180-193(1992)所述的原位中和化学。对于经酰基化胜肽，以Nε-FMOC赖氨酸残基取代待酰基化的目标氨基酸残基(例如，第10号位置)。以于DMF中的20％哌啶将完成的胺基端受BOC保护的胜肽处理30分钟而移除FMOC/甲酰基。经由于DMF/DIEA中偶合十倍摩尔过量的受FMOC保护的间隔物氨基酸(例如FMOC-(N-BOC)-色氨酸-OH)或酰基链(例如C17-COOH)及PyBOP或DEPBT偶合试剂，而达成对自由ε-胺基赖氨酸残基的偶合。在移除间隔物氨基酸的FMOC基的后，接着再重复用酰基链偶合。最后用100％TFA处理导致移除任何的侧链保护基及N-端BOC基。将胜肽树脂用5％DIEA/DMF中和，干燥，然后使用HF/对甲酚(95∶5)在0℃下自载体分裂历时1小时。于乙醚萃取后，使用5％HOAc溶液于将粗制胜肽溶剂合。然后利用ESI-MS确认溶液样品包含正确分子量的胜肽。利用RP-HPLC使用10％CH3CN/0.1％TFA至0.1％TFA于100％CH3CN中的线性梯度纯化正确的胜肽。使用Vydac C1822毫米x 250毫米蛋白质管柱来进行纯化。经酰基化的胜肽类似物一般是藉由20∶80的缓冲比完成溶离。将溶离份汇集在一起并利用分析性RP-HPLC检查纯度。将纯溶离份冻干得白色固体胜肽。产量典型上视合成法而在10毫克至100毫克范围内。
若胜肽包含内酰胺架桥及待酰基化的目标残基，则酰基化是如前所述在将该氨基酸添加至胜肽主链的后进行。
对于胜肽聚乙二醇化，使用将胜肽及聚乙二醇两者溶解成澄清溶液所需的最少量的溶剂(对于使用2-3毫克胜肽的反应一般低于2毫升)使40kDa甲氧基聚(乙二醇)马来酰亚胺基-丙酰胺(Chirotech Technology Ltd.)与摩尔当量的胜肽于7M尿素、50mMTris-HCl缓冲剂中反应。开始在室温下剧烈搅拌4-6小时，且利用分析性RP-HPLC分析反应。经聚乙二醇化的产物由于减少的滞留时间而明显不同于起始材料。于VydacC4管柱上利用与起始胜肽纯化所用者类似的条件进行纯化。溶离是在50∶50的缓冲比附近发生。发现纯的经聚乙二醇化胜肽的溶离份并冻干。产率高于50％，依据反应而异。
经由将HEK293细胞共转染胰高血糖素受体(GLUR)或胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)及连接至cAMP反应单元的荧光素酶基因，而测定胜肽的生物活性。经转染的细胞经由于经补充0.25％牛生长血清的DMEM中培养16小时，然后分别利用选定类似物及作为标准的胰高血糖素或胰高血糖素样肽-1的连续稀释液培育5小时，而除去血清。于Genesys 6光谱亮度计(Thermo Electron Corporation)上自280奈米处的UV吸亮度测量值获得胜肽吸亮度读数。使用比尔定律(Beer’s Law)来基于各类似物中的色氨酸及酪氨酸的数目计算溶液浓度。于培养结束时，将100微升的LucLite发光基质试剂添加至各孔，将盘密封并振摇，且置于Wallac Trilux发光计数器中进行cAMP侦测。使用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)计算有效的50％浓度(EC50)。
制备基于经酰基化胰高血糖素的共同促效剂胜肽。此等胜肽的体外结果的集合显示于表13。虽然未经酰基化胜肽如同天然胰高血糖素不可以1毫克/毫升浓度溶于磷酸盐缓冲盐水溶液中，但观察到酰基化可在中性pH下增强胜肽的溶解度。
表13
Figure BDA0000121349000001381
Figure BDA0000121349000001391
所有四种经酰基化胜肽皆对胰高血糖素样肽-1受体呈现提高的效能。包含色氨酸间隔物对胰高血糖素受体提供较佳的效能。C18的酰基链长度稍佳。
虽然酰基化可使胜肽的半衰期延长至数小时或以上，但具有在数十kDa范围内的重复的聚乙二醇化的效果甚至更大。制备包含两种类型修饰的胜肽。预期此等胜肽呈现延长的循环半衰期，以及对第四型双胜肽蛋白水解酶及其他蛋白酶的抗性。此等胜肽的体外结果的集合显示于表14。
表14
Figure BDA0000121349000001392
三种胜肽中的两种维持其对胰高血糖素样肽-1及胰高血糖素受体两者的高效能，其具有低于1nM的EC50。K10-W-C18经酰基化及聚乙二醇化的胜肽于两受体呈现约十倍的效能损失。此是列的胜肽显示第10号位置酰基化与胰高血糖素胜肽的羧基端部分(例如，第24、28或29号位置)、羧基端延伸内、或羧基端处的聚乙二醇化兼容(例如，通过添加羧基端半胱氨酸)。
实施例20
基本上如实施例19所述制得各种经酰基化的胰高血糖素共同促效剂胜肽并测试活体内活性。明确言的，胜肽A(经修饰成包含第2号位置的胺基异丁酸、第16号位置的谷氨酸、第17号位置的谷氨酰胺、第18号位置的丙氨酸、第20号位置的赖氨酸、第21号位置的谷氨酸、第23号位置的异亮氨酸、第24号位置的半胱氨酸(该半胱氨酸是键结至40K聚乙二醇)、及羧基端酰胺的SEQ ID NO：1)经进一步修饰成包含第10号位置的赖氨酸。赖氨酸10是经C8脂肪酸链、C14脂肪酸链、C16脂肪酸链、或C18脂肪酸链酰基化。
如实施例14所述测定各经酰基化胜肽对胰高血糖素样肽-1受体的活性且与作为对照组的胰高血糖素样肽-1(7-37)酸(SEQ ID NO：50)的活性作比较。表15所显示的各经酰基化胜肽对胰高血糖素样肽-1受体的EC50与胰高血糖素样肽-1胜肽的EC50相似。
表15
  胰高血糖素样肽-1受体活化效能EC50(nM)
  胰高血糖素样肽-1   0.0222±0.0002
  胜肽A K10-C8   0.0174±0.0004
  胜肽A K10-C14   0.0168±0.0004
  胜肽A K10-C16   0.0127±0.0003
  胜肽A K10-C18   0.0118±0.0002
然后经由饮食诱导肥胖模式(DIO)老鼠皮下注射各种经酰基化及未经酰基化胜肽，或仅赋形剂，QW(70奈摩尔/公斤/周)历时两周，而于活体内测试胜肽。测试每组6只具有44克初始平均体重的老鼠。定期测定体重、体组成、食物摄取量、及血糖值。
如图11所示，经酰基化胜肽可导致与未经酰基化胜肽相似程度的重量减轻。如图11所示，在用经酰基化胜肽治疗的前三天内达成介于约7及12％间的重量减轻。如图12所示，经酰基化胜肽导致食物摄取量减少。此外，如图13所示，经酰基化胜肽的任意血糖值于治疗1天后降低。
实施例21
基本上如实施例19所述制得以下的经酰基化胰高血糖素共同促效剂胜肽。
(A)“嵌合物-2 Aib2 Lys10-C18 Cys24(40K)”：包含下列修饰的天然胰高血糖素氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：第16号位置的谷氨酸、第17号位置的谷氨酰胺、第18号位置的丙氨酸、第20号位置的赖氨酸、第21号位置的谷氨酸、第23号位置的异亮氨酸、第24号位置的丙氨酸及羧基端酰胺(「嵌合物2」)，其进一步经修饰为具有第2号位置的胺基异丁酸、经C18脂肪酸酰基化的赖氨酸10及第24号位置的处经40K聚乙二醇基团聚乙二醇化的半胱氨酸；
(B)“嵌合物-2 Aib2 Lys10-C16 Cys24(40K)”：嵌合物2进一步经修饰为具有第2号位置的胺基异丁酸、经C16脂肪酸酰基化的赖氨酸10及经40K聚乙二醇基团聚乙二醇化的半胱氨酸24；
(C)“胰高血糖素Lys10-C18 E16 K20 Cys24(40K)”：包含以下修饰的天然胰高血糖素氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：第16号位置的谷氨酸、第20号位置的赖氨酸、及羧基端酰胺(「E16K20-胰高血糖素-NH2」)进一步经修饰成具有经C18脂肪酸酰基化的赖氨酸10及经40K聚乙二醇基团聚乙二醇化的半胱氨酸24；
(D)“胰高血糖素Lys10-TrpC16 E16 K20 Cys24(40K)”：E16K20-胰高血糖素-NH2进一步经修饰为具有连接至经C16脂肪酸酰基化的色氨酸间隔物的赖氨酸10；
(E)“胰高血糖素Lys10-TrpC18 E16 K20 Cys24(40K)”：E16K20-胰高血糖素-NH2进一步经修饰为具有连接至经C18脂肪酸酰基化的色氨酸间隔物的赖氨酸10。
大致如实施例14所述测试经酰基化的胰高血糖素共同促效剂胜肽于胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1受体的活性。对各胰高血糖素受体及胰高血糖素样肽-1受体的EC50与对照组(GLP-1(7-37)OH(胰高血糖素样肽-1的氨基酸7-37)、胰高血糖素(1-29)OH(SEQ ID NO：1)、及嵌合物2Cys24(40K)(具有位于Cys24的40K聚乙二醇的嵌合物2))的比较如表16所示。
表16
Figure BDA0000121349000001411
Figure BDA0000121349000001421
实施例22
基本上如实施例19所述制得以下的经酰基化胰高血糖素共同促效剂胜肽：
(A)胜肽A：包含以下修饰的天然胰高血糖素氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：包含以下修饰的天然胰高血糖素氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：第16号位置的谷氨酸、第20号位置的赖氨酸、及羧基端酰胺(「E16K20-胰高血糖素-NH2」)；
(B)胜肽B：进一步包含经C16脂肪酸酰基化的赖氨酸10的E16K20-胰高血糖素-NH2；
(C)胜肽C：进一步包含经C18脂肪酸酰基化的赖氨酸10的E16K20-胰高血糖素-NH2；
(D)胜肽D：进一步包含连接至经C16脂肪酸酰基化的谷氨酸(间隔物残基)的赖氨酸10的E16K20-胰高血糖素-NH2；
(E)胜肽E：进一步包含连接至经C18脂肪酸酰基化的色氨酸(间隔物残基)的赖氨酸10的E16K20-胰高血糖素-NH2。
大致根据实施例14测定胜肽的活性且于各胰高血糖素受体及胰高血糖素样肽-1受体的EC50显示于表17。
表17
Figure BDA0000121349000001422
实施例23
制得包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列与以下修饰的胰高血糖素共同促效剂胜肽：第16号位置的谷氨酸、第17号位置的谷氨酰胺、第18号位置的丙氨酸、第20号位置的赖氨酸、第21号位置的谷氨酸、第23号位置的异亮氨酸、第24号位置的丙氨酸、第27号位置的缬氨酸、第28号位置的赖氨酸及羧基端酰胺(「嵌合物1」)。经由将嵌合物1的第29号位置的氨基酸删除(「Chi 1(1-28)」)，或经由将嵌合物1的第28及29号位置处的氨基酸删除(「Chi 1(1-27)」)，而制得羧基端截断形式的嵌合物1。
包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列与以下修饰的胰高血糖素胜肽：第16号位置的谷氨酸，亦经由将第29号位置处的氨基酸删除(「E16 GlucNH2(1-28)」)，或经由将第28及29号位置处的氨基酸删除(「E16 GlucNH2(1-27)」)，而将羧基端酰胺(「E16Gluc-NH2」)羧基端截断。
大致根据实施例14测定经截断胜肽以及未经截断胜肽于胰高血糖素受体及胰高血糖素样肽-1受体的活性的功能活性。删除E16 GlucNH2胜肽或嵌合物1胜肽的第28及29号位置处的氨基酸不会显著地影响胜肽于胰高血糖素受体的活性。删除E16GlucNH2的第28及29号位置处的氨基酸不会明显改变胜肽于胰高血糖素样肽-1受体的效能。删除嵌合物1的第28及29号位置处的氨基酸不会影响其对胰高血糖素样肽-1受体的活性。
删除嵌合物1胜肽或E16 GlucNH2胜肽的第29号位置处的氨基酸不会显著地影响于胰高血糖素受体或胰高血糖素样肽-1受体的活性。
实施例24
于-15分钟时间点时饮食诱导肥胖模式(DIO)老鼠经腹膜内注射0.2、2、20、或70奈摩尔/公斤的下列中的一种：
(A)仅赋形剂，
(B)包含下列修饰的天然胰高血糖素氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：第16号位置的谷氨酸、第17号位置的谷氨酰胺、第18号位置的丙氨酸、第20号位置的赖氨酸、第21号位置的谷氨酸、第23号位置的异亮氨酸、第24号位置的丙氨酸及羧基端酰胺(「嵌合物2」)，其进一步经修饰为具有第2号位置的胺基异丁酸、第24号位置的半胱氨酸，该半胱氨酸是经40K聚乙二醇聚乙二醇化(「嵌合物-2-AIB2 Cys24-40kD」)，
(C)进一步经修饰为包含第2号位置的胺基异丁酸、第10号位置的赖氨酸(该赖氨酸是经C8脂肪酸酰基化)、及第24号位置的半胱氨酸(该半胱氨酸是经40K聚乙二醇聚乙二醇化)(「嵌合物-2 AIB2 K10-C8 Cys24-40kD」)，或
(D)进一步经修饰为包含第2号位置的胺基异丁酸、第10号位置的赖氨酸(该赖氨酸是经C16脂肪酸酰基化)、及第24号位置的半胱氨酸(该半胱氨酸是经40K聚乙二醇聚乙二醇化)(「嵌合物-2 AIB2 K10-C16 Cys24-40kD」)。
于0分钟时间点时以1.5克/公斤的剂量注射包含25％(v/v)葡萄糖的盐水溶液。血糖值于第-15、0、15、30、60及120分钟时间点测量。
图15-17分别显示于指示时间点时注射2、20、及70奈摩尔/公斤的老鼠的血糖值(mg/dL)。对于所有测试剂量，嵌合物-2 AIB2 K10-C8 Cys24-40kD于老鼠中展现最大的降低血糖能力。如图17所示，此胜肽具有与嵌合物-2-AIB2 Cys24-40kD相似的活性。
实施例25
于-24小时时间点时对DIO小鼠经腹膜内注射70奈摩尔/公斤的下列中的一种：
(A)仅赋形剂，
(B)如上述实施例24中的嵌合物-2-AIB2 Cys24-40kD，
(C)如上述实施例24中的嵌合物-2 AIB2 K10-C8 Cys24-40kD，或
(D)如上述实施例24中的嵌合物-2 AIB2 K10-C16 Cys24-40kD。
于0分钟时间点时以1.5克/公斤体重的剂量注射包含25％(v/v)葡萄糖的盐水溶液。于0、15、30、60、及120分钟时间点时测量血糖值。
图18展现于指示时间点时的老鼠的血糖值(mg/dL)。所有三种胜肽皆对降低老鼠的血糖展现显著的活性。
实施例26
对DIO老鼠经腹膜内注射仅赋形剂或15或70奈摩尔/公斤的下列中的一者：
(A)如上述实施例24中的嵌合物-2-AIB2 Cys24-40kD，
(B)如上述实施例24中的嵌合物-2 AIB2 K10-C8 Cys24-40kD，或
(C)如上述实施例24中的嵌合物-2 AIB2 K10-C16 Cys24-40kD。
于注射前及于注射后1、3、5、及7天测量体重。
图19展现各组老鼠的体重变化％。于两者测试剂量下，嵌合物-2 AIB2 K10-C8Cys24-40kD及嵌合物-2 AIB2 Cys24-40kD展现相当的降低体重能力。在较高测试剂量下，嵌合物-2 AIB2 K10-C16 Cys24-40kD展现显著的降低体重能力。
实施例27
基本上如上述合成得包含第1号位置处的酪氨酸及E16与K20间的内酰胺架桥(及替代羧基端羧酸酯的酰胺)的SEQ ID NO：555的胜肽，且根据实施例14于体外测试对胰高血糖素样肽-1及胰高血糖素受体的活性。胜肽对各受体的EC50显示于表18。
表18
  受体   EC50(nM)   Std.Dev   相对活性
  胰高血糖素   0.044   0.151   343.18％
  胰高血糖素样肽-1   0.062   0.062   100.00％
相对活性是相对于指示受体的天然激素的活性。
基于这些数据，经判定SEQ ID NO：555的胜肽为例示的胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1共同促效剂胜肽。
实施例28
基本上如上述合成得SEQ ID NO：1的胜肽(胰高血糖素(1-29))、具有取代羧基端羧酸酯的酰胺的SEQ ID NO：1的胜肽(胰高血糖素(1-29a))、及具有在第2号位置及第16号位置各者处的胺基异丁酸及取代羧基端羧酸酯的酰胺的SEQ ID NO：1的胜肽(胰高血糖素(1-29a)Aib2 Aib16)。接着利用实施例14所述的方法于体外测试此等胜肽于胰高血糖素样肽-1受体及胰高血糖素受体的活性。各胜肽的EC50显示于表19。
表19
Figure BDA0000121349000001461
SD＝标准偏差
实施例29
基本上如上述合成得以下胜肽：
(1)如上述实施例28中的胰高血糖素(1-29)，
(2)胰高血糖素(1-29a)Aib2 Aib16(如实施例28中所述)，具有第24号位置处的半胱氨酸及共价键结至包含C16脂肪酸的色氨酸的第10号位置处的赖氨酸(「胰高血糖素(1-29a)Aib2 Lys10-Trp-C16 Aib16 Cys24」)，
(3)胰高血糖素(1-29a)Aib2 Lys10-Trp-C16 Aib16 Cys24，其中该半胱氨酸包含40kD聚乙二醇基团(「胰高血糖素(1-29a)Aib2 Lys10-Trp-C16 Aib16 Cys24-40kD」)，
(4)胰高血糖素(1-29a)Aib2 Lys10-Trp-C16 Aib16 Cys24，包含于第20号位置的胺基异丁酸(「胰高血糖素(1-29a)Aib2 Lys10-Trp-C16 Aib16 Aib20 Cys24」)，以及
(5)胰高血糖素(1-29a)Aib2 Lys10-Trp-C16 Aib16 Aib20 Cys24，其中该半胱氨酸包含40kD聚乙二醇基团(「胰高血糖素(1-29a)Aib2 Lys10-Trp-C16 Aib16 Aib20Cys24-40kD」)。
接着利用实施例14的方法于体外测试此等胜肽于胰高血糖素样肽-1受体及胰高血糖素受体的活性。各胜肽的EC50显示于表20。
表20
Figure BDA0000121349000001462
Figure BDA0000121349000001471
实施例30
于饮食诱导肥胖模式(DIO)老鼠中测试经酰基化及经聚乙二醇化胰高血糖素胜肽的活体内作用。具体地说，将6组饮食诱导肥胖模式(DIO)老鼠(每组8只老鼠)(各组具有58克的平均初始体重)以腹膜内注射10、20、40、或80奈摩尔/公斤的经酰基化及经聚乙二醇化胰高血糖素胜肽或一赋形剂对照组，每周一次历时2周。用于研究的经酰基化及经聚乙二醇化胰高血糖素胜肽为嵌合物-2 AIB2 K10-C8Cys24-40kD(如实施例26中所述)及胜肽A K10-C14(如实施例20中所述)。
于注射后0、1、3、5、7、8、10、12、及14天测量老鼠的体重变化及食物摄取量。在整个14天期间内监测老鼠的血糖值。藉由在施予经酰基化或经聚乙二醇化胜肽后1小时或24小时注射存于盐水溶液中的25％葡萄糖而进行葡萄糖耐受性试验，且于葡萄糖注射后的-60、0、15、30、60、或120分钟测量血糖值。
如图20所示，经注射40或80奈摩尔/公斤的经酰基化及经聚乙二醇化胜肽AK10-C14的老鼠的总体重相较于经注射赋形剂对照组的老鼠降低。
如图21所示，经注射20、40或80奈摩尔/公斤的胜肽A K10-C14或20奈摩尔/公斤的嵌合物-2 AIB2 K10-C8 Cys24-40kD的老鼠反应葡萄糖注射的血糖值相较于赋形剂对照组降低。
实施例31
经由固相合成制得包含或缺少一共价性分子内架桥的经酰基化的胰高血糖素类似物胜肽，且测试于胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1受体的体外活性。对各受体的EC50(nM)及胜肽于相关受体相对于天然胜肽的活性％显示于表21。
表21
Figure BDA0000121349000001481
基本上如本文所述制得数种缺少共价性分子内架桥且包含第2号位置处的胺基异丁酸(AIB)、第16号位置处的胺基异丁酸(AIB)、及通过间隔物连接至第10号位置处的赖氨酸残基的脂肪酰基的胰高血糖素类似物。经酰基化胰高血糖素类似物的差异在于间隔物的类型、是否存在聚乙二醇化、及/或酰基的大小。基本上如实施例14所述测试经酰基化的胰高血糖素类似物对胰高血糖素受体及胰高血糖素样肽-1受体的体外活性。各胜肽的结构及于胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1受体的体外活性的概述显示于表22及23。
表22
Figure BDA0000121349000001491
Figure BDA0000121349000001501
*指示胜肽包含在第24号位置处的半胱氨酸残基(替代谷氨酰胺)其中该半胱氨酸共价性连接至一40kDa PEG基团。
表23
Figure BDA0000121349000001502
Figure BDA0000121349000001511
**胜肽包含在第24号位置处的半胱氨酸残基(替代谷氨酰胺)其中该半胱氨酸共价性连接至一PEG分子。
如表22及23所示，包含通过间隔物连接的脂肪酰基的胜肽相较于包含直接连接至胜肽主链的脂肪酰基的胜肽显著地提高其效能。
实施例32
将各具有48.7克平均体重的DIO老鼠(每组8只老鼠)每天皮下注射单一赋形剂、30奈摩尔/公斤或100奈摩尔/公斤的经酰基化胰高血糖素类似物胜肽、或长效型胰高血糖素样肽-1类似物利拉鲁肽胜肽(Liraglutide)(Novo Nordisk，Denmark)历时七天。经酰基化胰高血糖素类似物是如下：
「(C16)胰高血糖素酰胺」包含野生型胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列，其中第10号位置处的酪氨酸经修饰成经酰基化的赖氨酸残基，其中该经酰基化赖氨酸包含C16脂肪酰基，且羧基端羧酸酯经酰胺基取代；「γE-γE-C16胰高血糖素酰胺」包含C16胰高血糖素酰胺的相同结构，仅除了C16脂肪酰基是通过γGlu-γGlu双肽间隔物连接至第10号位置处的赖氨酸(见以下经酰基化的赖氨酸的结构)；
Figure BDA0000121349000001521
「AA-C16胰高血糖素酰胺」包含C16胰高血糖素酰胺的相同结构，仅除了C16脂肪酰基是通过丙氨酸-丙氨酸双肽间隔物连接至第10号位置处的赖氨酸；以及
「βAβA-C16胰高血糖素酰胺」包含C16胰高血糖素酰胺的相同结构，仅除了C16脂肪酰基是通过β-丙氨酸-β-丙氨酸双肽间隔物连接至第10号位置处的赖氨酸。
每天监测老鼠的体重且体重总变化(％)显示于图22。如图22所示，在各剂量下的大部分的经酰基化胰高血糖素胜肽皆导致体重减轻。虽然利拉鲁肽胜肽展现大约12％的体重减低，但胰高血糖素类似物胜肽γE-γE-C16胰高血糖素酰胺于老鼠中在配合剂量下显现最大的导致体重减轻能力。即使是较低剂量的γE-γE-C16胰高血糖素酰胺亦可导致体重的实质减低。
在研究的第7天测量老鼠的脂肪质量。如图23所示，经施予100奈摩尔/公斤γE-γE-C16胰高血糖素酰胺的老鼠显现最低的脂肪质量。
亦于测定过程期间监测老鼠的血糖值。如图24所示，较高剂量下的胰高血糖素类似物胜肽γE-γE-C16胰高血糖素酰胺以及利拉鲁肽胜肽可有效地于老鼠中减低血糖值。
实施例33
如下评估具有胰高血糖素样肽-1活性的胰高血糖素类似物胜肽的酰基化。将包含嵌合物2的结构与第2号位置处的胺基异丁酸及第24号位置处的半胱氨酸的未经酰基化胰高血糖素类似物胜肽(包含40kDa聚乙二醇分子)修饰成包含第10号位置处的经酰基化的赖氨酸残基。未经酰基化胰高血糖素类似物胜肽包含SEQ IDNO：580的氨基酸序列。第10号位置的赖氨酸是经C8、C14、C16、或C18脂肪酰基酰基化，且经酰基化胜肽分别包含SEQ ID NO：534-537的结构。基本上如本文所述测试未经酰基化胜肽及其经酰基化形式于胰高血糖素样肽-1受体的体外活性。各胜肽对胰高血糖素样肽-1受体的EC50显示于表24。
表24
Figure BDA0000121349000001531
实施例34
如文中所述经由固相胜肽合成制得胰高血糖素类似物胜肽，且于胜肽的第10号或30号位置处酰基化。胜肽及其结构如下：
「胜肽dS2E16K20K30-C14Gluc酰胺」包含HXQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVQWLMNTK-酰胺(SEQ ID NO：581)的氨基酸序列，其中第2号位置的X为d-丝氨酸，其中第30号位置的赖氨酸是经C14脂肪酰基酰基化，且羧基端羧酸酯取代为一酰胺；
「胜肽dS2K10(C14)E16K20-Gluc酰胺」包含HXQGTFTSDKSKYLDERRAKDFVQWLMNT-酰胺(SEQ ID NO：582)的氨基酸序列；其中第2号位置的X为d-丝氨酸，其中第10号位置的赖氨酸是经C14脂肪酰基酰基化，且羧基端羧酸酯取代为一酰胺；
「胜肽dS2E16K20K30-C16Gluc酰胺」包含HXQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVQWLMNTK-酰胺(SEQ ID NO：583)的氨基酸序列，其中第2号位置的X为d-丝氨酸，其中第30号位置的赖氨酸是经C16脂肪酰基酰基化，且羧基端羧酸酯取代为一酰胺；
「胜肽dS2K10(C16)E16K20-Gluc酰胺」包含HXQGTFTSDKSKYLDERRAKDFVQWLMNT-酰胺(SEQ ID NO：584)的氨基酸序列，其中第2号位置的X为d-丝氨酸，其中第10号位置的赖氨酸是经C16脂肪酰基酰基化，且羧基端羧酸酯取代为一酰胺；
「胜肽嵌合物2-AIB2-K10-酰基化」包含HXQGTFTSDKSKYLDEQAAKEFICWLMNT-酰胺(SEQ ID NO：585)的氨基酸序列；其中第2号位置的X为胺基异丁酸，第10号位置的K是经C18脂肪酰基酰基化，第24号位置的半胱氨酸包含40kDa聚乙二醇分子，且羧基端羧酸酯取代为一酰胺；以及
「胜肽嵌合物2-AIB2-K30-酰基化」包含HXQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNTK-酰胺(SEQ ID NO：586)的氨基酸序列；其中第2号位置的X为胺基异丁酸，第10号位置的K是经C18脂肪酰基酰基化，第24号位置的半胱氨酸包含40kDa聚乙二醇分子，且羧基端羧酸酯取代为一酰胺。
基本上如实施例14所述测试各胜肽于胰高血糖素样肽-1受体及胰高血糖素受体的体外活性。结果显示于表25。
表25
Figure BDA0000121349000001541
Figure BDA0000121349000001551
实施例35
使用固相胜肽合成于组装序列XSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVCWLMNT-NH2，其中X＝DMIA(SEQ IDNO：587)。
于选择性去保护第16号位置的谷氨酸及第20号位置的赖氨酸后，通过树脂上的内酰胺架桥使胜肽环化。然后藉由制备型RP-HPLC纯化于分裂后的粗制胜肽且以MS定性([M+H]的计算值：3479.9；实测值3480.9)。经由在室温下将胜肽前驱物及碘乙酰基-官能化40k Da聚乙二醇(NOF)(1∶1)于7M尿素/50mM Tris缓冲液(pH 8.5)中混合45分钟进行聚乙二醇化，而于胜肽的聚乙二醇与半胱氨酸间形成共价硫醚键，如下所示
Figure BDA0000121349000001552
通过制备型HPLC纯化的聚乙二醇的胜肽，且收集期望的溶离份并冻干而得灰白色粉末。产物经MALDI-TOF-MS(44000-46000，宽峰)确认。
基本上如实施例14所述测试对胰高血糖素样肽-1受体及胰高血糖素受体的体外活性。于胰高血糖素样肽-1受体及胰高血糖素受体的EC50分别为0.327nM及0.042nM。
实施例36
使用固相胜肽合成于制备胜肽前驱物HXEGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNT-NH2，其中X＝胺基异丁酸(AIB)(SEQID NO：589)。然后藉由制备型RP-HPLC纯化粗制胜肽且以MS定性([M+H]的计算值：3412.8；实测值3413.9)。经由在室温下将胜肽前驱物及碘乙酰基-官能化40k Da聚乙二醇(NOF)(1∶1)于7M尿素/50mM Tris缓冲液(pH 8.5)中混合45分钟进行聚乙二醇化，而于胜肽的聚乙二醇与半胱氨酸间形成共价硫醚键，如下所示
通过制备型HPLC纯化的聚乙二醇的胜肽，且收集期望的溶离份并冻干而得灰白色粉末。产物经MALDI-TOF-MS(44000-46000，宽峰)确认。
基本上如实施例14所述测试对胰高血糖素样肽-1受体及胰高血糖素受体的体外活性。于胰高血糖素样肽-1受体及胰高血糖素受体的EC50分别为0.027nM及33nM。
实施例37
基本上如本文所述经由固相胜肽合成制得以下包含胜肽JHS-X-GTFTSDYSKYLDTRRAAEFVAWL(Nle)DE(SEQ ID NO：591)或胜肽KHS-X-GTFTSDYSKYLD(Aib)RRAADFVAWLMDE(SEQ ID NO：592)的主链，与第3号位置的额外修饰的胰高血糖素类似物胜肽。
基本上如实施例14所述测试胜肽于胰高血糖素受体的体外活性。各胜肽的EC50(nM)显示于表26。
表26
Figure BDA0000121349000001562
Figure BDA0000121349000001571
Q＝谷氨酰胺；C(Acm)＝乙酰胺甲基-半胱氨酸；Dab(Ac)＝乙酰二胺基丁酸；Dap(脲)＝胺甲酰二胺基丙酸；Q(Me)＝甲基谷氨酰胺；M(O)＝甲硫氨酸-亚砜；Orn(Ac)＝乙酰鸟氨酸。
如表26所示，多种氨基酸可位于第3号位置，而不会有对胰高血糖素受体的活性的实质损失，且在一些情况中，修饰实际上提高活性，例如，在胜肽K主链上的Dab(Ac)及Q(Me)。
实施例38
基本上如本文所述制得包含在各种胰高血糖素类似物主链上的第3号位置的Dab(Ac)的胰高血糖素类似物胜肽，并测试对胰高血糖素受体的体外活性。各胜肽的结构及活性显示于表27。
表27
Figure BDA0000121349000001572
Figure BDA0000121349000001581
实施例39
基本上如本文所述制得包含SEQ ID NO：1与第2号及第16号位置处的胺基异丁酸(AIB)、第10号位置的赖氨酸的第一胰高血糖素类似物胜肽(AIB2，AIB16，K10(C16)Gluc酰胺)，其中第10号位置处的赖氨酸是共价连接至C16脂肪酰基，且以酰胺取代羧基端羧酸酯。
第二胰高血糖素类似物胜肽(AIB2，AIB16，K10(C16)，K30 Gluc酰胺)具有与第一胰高血糖素类似物胜肽相同的结构，仅除了将赖氨酸添加至羧基端。
基本上如实施例14所述测试胜肽的体外活性，且额外于包含20％人类血浆的溶液中进行测试。胜肽对各受体的EC50(nM)显示于表28。
表28
Figure BDA0000121349000001582
实施例40
瘦体素的发现证明存在调节能量平衡及身体肥胖症的内分泌是统。亦于肥胖研究中吸取关注及投资来作为找出管理已成为全球流行病的环境及药理途径的手段。尚未出现对于肥胖症的充分有效且安全的药物治疗法，而外科手术成为维持减重的唯一经证实的选择。此处据报告于两内分泌激素受体的受体促效作用的组合效能可于单一胜肽的长期作用期间达成有效的引发饱足及脂肪分解作用。于啮齿动物肥胖模型中对两种于GLP1-R具有与天然胰高血糖素样肽-1相当的活性，但互相不同处在于其的胰高血糖素受体促效作用程度的特定胰高血糖素类似物。每周施予一次此等选自一是列具不同胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1活性的高效能类似物的经聚乙二醇化胜肽在一个月内使饮食诱导肥胖老鼠(平均体重约50克)的肥胖及葡萄糖耐受性程度回归正常。体重减轻是由减少食物摄取量及增加能量消耗所导致的体脂损耗的结果，其随胰高血糖素受体促效作用程度的增加而增加。此等共同促效剂化合物亦使包括脂肪肝的葡萄糖及脂质代谢正常化。效果亦与剂量相关且于饮食诱导肥胖的大鼠中成功地再现。此等临床前研究指示当利用适当的胰高血糖素受体活化程度增强完全的胰高血糖素样肽-1促效作用时，可实质且安全地加速体脂减少。文中所示的发现建立临床测试的基础且提出对于代谢症候群的引人瞩目的新颖治疗选择。
实施例41
以下的材料及方法是关于实施例42至51中所述的实验。
Boc胜肽合成及切割
于经修改的Applied Biosystems 430A胜肽合成仪上使用0.2毫摩尔的4-甲基二苯甲胺(MBHA)树脂(Midwest Biotech，Fishers，Indiana)进行胜肽合成。固相胜肽合成法利用对Boc化学原位中和作用(Schnolzer，M.等人，国际胜肽研究及治疗期刊(International Journal of Peptide Research and Therapeutics)，13：31-44(2007))。将完成的胜肽基树脂用HF/对甲酚(10∶0.5v/v)于0℃下处理1小时。将HF于真空中移除，且使经去保护的胜肽沈淀并于二乙醚中洗涤。将胜肽溶解于20％乙腈/1％乙酸中并冻干。藉由Boc化学制得大部分的胜肽。对Boc-氨基酸(Midwest Biotech)使用以下的侧链保护基：精氨酸(Tos)、天冬氨酸(OcHex)、天冬酰氨酸(Xan)、谷氨酸(OcHex)、组氨酸(BOM)、赖氨酸(2-Cl-Z)、丝氨酸(Bzl)、苏氨酸(Bzl)、色氨酸(CHO)、酪氨酸(Br-Z)。利用电喷洒游离或MALDI-TOF质谱术确认胜肽分子量，且如文中他处所述进行纯化。
内酰胺合成
于树脂上合成具有i至i+4内酰胺形成的环化胜肽。Glu(OFm)-OHγ酯(PeptidesInternational，Louisville，Kentucky)及Lys(Fmoc)-OH(Peptides International)在参与内酰胺形成的位置处取代Glu(OcHex)及Lys(2-Cl-Z)。将完全受保护的胜肽基树脂用存于DMF中的20％哌啶处理45分钟，以移除Fmoc及OFm保护基。于树脂上，在用存于DMF/DIEA中的5当量苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基膦六氟磷酸盐(benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate，PyBOP)(Fluka)处理5小时后，达成内酰胺形成。由水合茚三酮分析确认内酰胺形成，且质量相对于开放形式的胜肽减少18。
胜肽纯化
于自树脂切割后，利用分析性逆相HPLC分析粗制胜肽萃取物。于Zorbax C8管柱(0.46X 5cm)上于具有乙腈梯度的0.1％TFA中进行分析性分离。于分析性分析后，利用半制备型层析术于Vydac C4或C18管柱(2.2X 25cm)上于具有乙腈梯度的0.1％TFA中纯化粗制萃取物。使用相同条件纯化经聚乙二醇化的胜肽。利用分析性逆相HPLC利用关于分析分离所列的条件分析制备溶离份的纯度(＞95％)。利用电喷洒游离质谱术(ESI-MS)或基质辅助雷射脱附/游离飞行时间(MALDI-TOF)质谱术确认胜肽质量及纯度。经聚乙二醇化的胜肽经MALDI-TOF显现跨越43400的宽质量范围。将经纯化胜肽冻干并储存于4℃下。
胜肽的聚乙二醇化
将经纯化胜肽与甲氧基聚(乙二醇)马来酰亚胺基-丙酰胺-40K(ChirotechTechnology Ltd，Cambridge)以1∶1摩尔比混合于7M尿素/50mM Tris(pH 8.0)中。利用分析性逆相HPLC监测反应进行，且游离胜肽于30分钟内耗尽。使反应于0.1％TFA中停止，如他处所述进行纯化及定性。
胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1受体介导的cAMP合成
测试各胜肽类似物通过胰高血糖素(Gcg)及胰高血糖素样肽-1受体刺激cAMP产生的能力。将HEK293细胞共转染GcgR或GLP-1R cDNA及连接至cAMP反应单元(CRE)的荧光素酶报导基因。经由于经补充0.25％牛生长血清(HyClone，Logan，UT)的DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中进行培养，将细胞除去血清历时16小时。将胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1类似物的连续稀释液添加至含有经共转染HEK293细胞的96孔经涂布聚-D-赖氨酸的盘(BD Biosciences，San Jose，CA)中，且将盘于37℃、5％CO2下培养5小时。于培养后，将当量体积(100微升)的LucLite发光基质试剂(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)添加至各孔，且将盘于800rpm下振摇3分钟。将盘于暗处培养10分钟，并于MicroBeta1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)上定量光输出。利用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)计算有效的50％浓度(EC50)。
圆二色性(Circular dichroism)测量
将胜肽溶解于具有渐增TFE浓度的10mM磷酸盐缓冲液pH 5.9中，且定量胜肽浓度。将各样品稀释至10μM以进行CD测量。于具有恒定氮气流及设定于25℃的1毫米路径长度单元的JASCO J-715圆二色性光谱偏光计上收集CD数据。对自270-190奈米以100奈米/分钟的扫描速度及1奈米波长步进的5次扫描累积光谱数据。于JASCO光谱管理(Spectra Manager)软件中，减去溶剂讯号且将数据平滑化(Savitzky及Golay，Anal.Chem.36：1627(1964))。将所获得的毫度值转变为具有deg.cm2.dmol-1单位的平均残余椭圆率。将计算得的平均残余椭圆率值输入至DICHRO WEB(Whitmore及Wallace，生物聚合物(Biopolymers)89：392-400(2008)；Whitmore及Wallace，核酸研究(Nucleic Acids Research)32：W668-W673(2004))中，而得百分螺旋度(helicity)值。
动物
C57BI/6老鼠是获自杰克森实验室(Jackson Laboratories)，且经喂食来自Research Diets的致糖尿病饮食(58％kcal来自脂肪的高蔗糖饮食)。老鼠是独居或群居于22℃下的12:12小时昼夜循环中，且可自由进食及饮水。所有研究皆是根据辛辛那提大学(University of Cincinnati)的实验动物管理及使用委员会(Institutional AnimalCare and Use Committee)的纲领经认可及进行。
体组成测量
使用NMR技术(EchoMRI，Houston，TX)测量全部体组成(脂肪及瘦肉质量)。
能量平衡生理测量
利用组合间接量热是统(TSE Systems，Bad Homburg，Germany)评估能量摄取及消耗、以及饲养笼活动。每隔45分钟测量氧气消耗及CO2产生总共历时120小时(包括12小时的适应)，以测定呼吸商数及能量消耗。在间接量热评估的同时经由将量尺整合至密封笼环境中，而连续测定食物及水的摄取及进餐模式历时120小时。将进餐定义为持续时间最少60秒的食物摄取量事件，且在食物摄取量事件的间中断300秒。使用多维红外光束是统，使光束扫描笼的底部及顶部而测定居笼活动力，且将活动力表示为光束中断。不动活动(坐立不安)是定义为在笼底部的单一光束的连续中断，步行移动是定义为在笼底部的任两不同光束的中断，及跳动是定义为在笼底部及顶部两者的光束同时中断。
血液参数
于禁食6小时后使用经涂布EDTA的Microvette管(Sarstedt，Nuremberg，Germany)自尾部静脉收集血液，且立即冷冻于冰块中。于在3,000g及4℃下离心15分钟后，将血浆储存于-80℃下。利用获自Linco(Sensitive Rat Insulin RIA；Linco Research，St.Charles，MO)的放射免疫测定方法定量血浆胰岛素。利用酵素测定套组(ThermoElectron，Waltham，MA)测量血浆TG及胆固醇浓度。个别地分析样品，仅除了使来自5只动物/组的汇集样品(0.25毫升)在两个串联连接的Superose 6管柱上进行速效液相层析(FPLC)凝胶过滤以分离脂蛋白。所有测定是根据制造商的指示进行。
葡萄糖耐受性试验
为测定葡萄糖耐受性，使老鼠禁食6小时且经腹膜内注射(i.p.)2克葡萄糖/公斤体重(50％D-葡萄糖(Sigma)存于0.9％盐水中)，以进行葡萄糖耐受性试验(GTT)。于注射前(0分钟)及于注射后15、30、60、90及120分钟利用手持式血糖计(TheraSenseFreestyle)测量尾部血糖值(mg/dl)。
Western blot分析
将脂肪组织置于1.5毫升微量离心管中，且使用组织研磨器(Retsch，IncNewtown，PA Cat.#85210)在30hz下于冰冷的RIPA缓冲液(1X PBS、1％NonidetP40、0.5％脱氧胆酸钠、具有50mM NaF的0.1％SDS、0.5M苯甲基磺酰氟、0.1mM钒酸钠、20μg/ml Aprotinin、10μg/ml Leupeptin)中溶解3分钟。使样品于12,000rpm下旋转15分钟(4℃)，此时将内部澄清液移至新的管，并于冰上超音波震荡15秒。使样品于14,000rpm下旋转10分钟(4℃)，且将内部澄清液收集至新的管。使样品再次于19,000rpm下旋转10分钟(4℃)，且将内部澄清液收集至新的管。然后取出等份样品进行蛋白质测定。接着使样品于4x SDS/DTT缓冲液中沸腾2分钟。使来自细胞溶解产物的50微克蛋白质于9％(w/v)丙烯酰胺分离凝胶上进行SDS/PAGE，且转移至Hybond ECL硝基纤维素薄膜。将薄膜封阻且用相关的主要抗体(来自Cell Signaling的HSL(4107)；来自Cell Signaling的Phospho-HSL(ser 660)(4126))探测于洗涤后，使用HRP-结合抗-(兔IgG)或抗-(鼠IgG)(HRP-结合抗-兔及抗-鼠二抗购自Bio-Rad(170-6515&170-6516))进行主要抗体侦测，且使用增强化学发光(AmershamBiosciences)侦测并暴露至CL-Xposure膜(Pierce)。
免疫组织化学
如说明将白色副睪脂肪组织的石蜡包埋切片(5微米)用苏木精/曙红染色(Ogden，C.L.等人，JAMA 295：1549-1555(2006))。对于各个别的老鼠组织区块，使用Image Pro Plus 5.1软件(Media Cybernetics，Bethesda，MD，USA)定量来自三个不同高功率场的各者的100个细胞的脂肪细胞大小作为面积测量值。
油红染色
为观察于肝组织中的脂质累积，将于牺牲时取得的肝脏的4-8毫米横切片用OilRed O染料染色。使用[复合透镜]显微镜取得在20X及40X倍率下的影像。
定量RT-PCR程序
采用断颈法处死处于饱食状态(在晨间喂食后1-4小时)的动物，且将各种组织取样、冷冻钳制、并储存于-80℃下，供随后利用实时定量PCR(icycler，BioRad)测量PEPCK、G6P、及HPRT(管家基因)的mRNA的表达用。
使用RNeasy Lipid Tissue Kit(Qiagen，Ca#74804)使用标准方案自冷冻组织样品提取总RNA。利用光谱亮度测定法使用Nanodrop测定RNA浓度及纯度。使用总RNA的2微克获得供RT-PCR用的cDNA模板。利用10X DNase I反应缓冲液、DNase I，AmpGrade，1U/μl，depc-H20、25mM EDTA、10mM dNTP Mix、寡(dT)20(50μM)、5XFirst-Strand缓冲液、0.1M DTT、RNaseOUT、及SuperScript III(Invitrogen)进行逆转录反应。
使用含有最终浓度0.5μM的上游及下游引物的荧光染料SYBR绿(BioRad，Ca#1708882)经由PCR进行cDNA扩增反应。经由解离曲线确认产物纯度。在所有测定中包括无模板对照组，其未产生一致的扩增。使用标准曲线获得PEPCK或G6P的相对浓度，且根据用作管家基因的HPRT的浓度校正结果。将结果表示为赋形剂的百分比，将赋形剂组的平均值设定为100％，然后计算3组研究动物的各个别值。
引物序列
自NIH网站取得PEPCK、G6P、及HPRT的引物序列，且利用IDT DNA产生引物。
逆转录及定量实时RT-PCR
如说明利用实时RT-PCR定量CD68 mRNA的表达(Nomiyama，T.等人，临床研究期刊(Journal of Clinical Investigation)117：2877-2888(2007))。简而言的，动物在处死后，将100毫克副睪脂肪组织于TRIZOL中均质化，且将总mRNA逆转录成cDNA。使用iCycler(Bio-Rad)及SYBR Green I系统(Bio-Rad)进行PCR反应。将各样品重复分析三次且对TFIIB mRNA表现的值正常化。所使用的老鼠引物序列如下：
CD68，5′-CAAGGTCCAGGGAGGTTGTG-3′(上游)(SEQ ID NO：638)，5′-CCAAAGGTAAGCTGTCCATAAGGA-3′(下游)(SEQ ID NO：639)；
及TFIIB，5′-CTCTCCCAAGAGTCACATGTCC(SEQ ID NO：640)，
5`-CAATAACTCGGTCCCCTACAAC-3′(反置)(SEQ ID NO：641)。
统计分析
除非另作指示，否则所有统计分析是使用GraphPad Prism单因子ANOVAs及栏统计学(column statistics)进行。所述的P值是用于单因子变异数分析。将所有结果呈现为平均值±SE。(受体活化数据为±S.D.)。
实施例42
如本文所述制得两种包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列与氨基酸修饰的胰高血糖素胜肽(胜肽X及Y)。两种胜肽包含第2号位置的胺基异丁酸、第16号位置的谷氨酸、第17号位置的谷氨酰胺、第18号位置的丙氨酸、第20号位置的赖氨酸、第21号位置的谷氨酸、第23号位置的异亮氨酸、及第24号位置的半胱氨酸。通过与马来酰亚胺官能化直链聚乙二醇反应在第24号位置的半胱氨酸达成点特异的40-kd聚乙二醇化，而产生胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇。胜肽Y及Y-聚乙二醇与胜肽X及X-聚乙二醇的不同处分别在于在胜肽Y或胜肽Y-聚乙二醇的中间导入单一侧链内酰胺架桥，以使次要结构稳定及增强胰高血糖素促效作用。第16号位置的谷氨酸及第20号位置的赖氨酸的两侧链在胜肽组装过程中共价性偶合为侧链酰胺。此胜肽的巨环化呈现21-原子内酰胺。测试胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇的溶解度，发现其可以超过25毫克/毫升的浓度溶解于生理缓冲液中，且胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇经证实可完全抵抗利用血浆的体外培养历时1星期的期间。
实施例43
通过圆二色性分析当胜肽溶解于各种浓度的三氟乙醇(TFE)水溶液中时的第二构形(图25)。胰高血糖素是经测试的最少螺旋度的胜肽，且其于0、10及20％的TFE溶液中分别具有10、15及33％的经计算螺旋度(表29)。在相同的实验条件下，胰高血糖素样肽-1具有14、29及55％的增强螺旋度，显示此两胜肽的主要以及次要结构不同。当胜肽X及Y经聚乙二醇化时，尽管聚乙二醇化部份占分子的多于90质量％，但其的螺旋度并无显著变化(表29)。相对地，胜肽Y在磷酸盐缓冲液中在不存在TFE下的明显螺旋度(apparent helicity)大约为胜肽X的两倍，自17％至36％。因此，此两嵌合物胜肽的聚乙二醇化形式(胜肽X-聚乙二醇及胜肽Y-聚乙二醇)的次要结构明显不同(图25)，且生物性质的差异可能是此等次要结构差异的函数。
表29
Figure BDA0000121349000001651
实施例44
评估两种胜肽(胜肽X及Y)及其40-kd聚乙二醇化衍生物(胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇)在基于细胞的CRE-荧光素酶报导测定方法中刺激cAMP合成的能力(图26)。如表30所示，天然胰高血糖素在0.055±0.014nM的有效浓度(EC50)及胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)在甚高的浓度(3.29±0.39nM的EC50)下半最大地活化胰高血糖素受体。相对地，胰高血糖素样肽-1以0.028±0.009nM的EC50活化其受体且由于以超过1μM的EC50发生的对胰高血糖素受体(GcgR)的交互作用而经证实高度特异。天然配体对其受体所呈现的特异性的动态范围超过一百万。胜肽X-聚乙二醇对GLP-1R的效能为天然胰高血糖素样肽-1的两倍，且对GcgR甚至更以相对的方式增强。然而，GcgR活性仅为天然胰高血糖素的大约10％。导入内酰胺恢复完全的胰高血糖素促效作用，而无对GLP-1R的变化。结果，胜肽Y-聚乙二醇是相对于天然配体于两各别受体的完全有效、接近平衡的共同促效剂。各胜肽的聚乙二醇化使对GcgR的效能降低多至十倍及对GLP-1R降低五倍。对GcgR的活性的稍微增加的损失可能是羧基端序列对胰高血糖素受体交互作用的较大相对重要性的函数。经聚乙二醇化的胜肽(胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇)对GLP-1R较天然胰高血糖素样肽-1稍微无效，但仍具有低于nM的EC50。胜肽X-聚乙二醇较此胜肽的内酰胺形式(即：胜肽Y-聚乙二醇)对GLP-1R的选择性多七倍。因此，此两DPP-4抗性胜肽适用于承受活体内时间作用实验且对GLP-1R促效作用的配合良好，但胰高血糖素促效作用不同。
Figure BDA0000121349000001671
实施例45
于饮食诱导肥胖(D10)C57B6老鼠中使用40-kd聚乙二醇化胜肽(胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇)作为单次每周皮下(s.c)注射。单次注射325奈摩尔/公斤的胜肽Y-聚乙二醇使体重于一周内减少25.8％，自50.9±1.4克至37.8±0.8克(p＜0.0001，n＝8只/组)。相当地施予胜肽X-聚乙二醇有效，但效能显著较低，由于体重减少为9％(49.1±1.51克至44.68±1.38g)。经注射盐水的对照老鼠并未改变其体重(的前：50.61±1.32克，的后：50.87±1.46克；图27A)。体重改变是脂肪质量减少的结果(内酰胺胜肽为41.9％，开放形式为22.2％，对照组为2.3％，p＜0.001；图27B)，且伴随平均每日食物摄取量的显著减少(胜肽Y-聚乙二醇：0.40±0.29克/天，胜肽X-聚乙二醇：1.83±0.81克/天，盐水：2.70±0.78克/天，p＜0.0001，图27C)。当与对照组比较时，两种胜肽的血糖显著地减低，且胜肽Y-聚乙二醇稍微更大(胜肽Y-聚乙二醇：-90.1mg/dL，胜肽X-聚乙二醇：-79.6mg/dL，对照组：-23.9g/dL，p＝0.0433；图27D)。两种胜肽(胜肽X-聚乙二醇及胜肽Y-聚乙二醇)的间的相对差异不具统计意义。
实施例46
在一个别的实验中，单次s.c.注射六种不同剂量(0、7、14、35、70、140及350奈摩尔/公斤)的胜肽Y-聚乙二醇及胜肽X-聚乙二醇于体重及血糖中显现线性反应、剂量相关性减少(图28A、28B、28C及28D)。此显示观察到的作用具药理相关性，其除了体重快速、过度减轻的间接作用外，并无明显毒性。胜肽Y-聚乙二醇的作用大小更为明显，且显示胰高血糖素促效作用的额外元素可改善胜肽的效能。
实施例47
在一个别的实验中，每周s.c.注射70奈摩尔/公斤的胜肽Y-聚乙二醇或胜肽X-聚乙二醇分别使DIO老鼠的体重减少28.1％及20.1％(p＜0.0001，n＝7-8/组；图29A)。体重变化伴随脂肪质量的减少(胜肽Y-聚乙二醇为-62.9％，胜肽X-聚乙二醇为-52.2％，及对照组为5.1％，p＜0.0001；图29B)。此等较低剂量对食物摄取量的长期作用(p＝0.95；图29C)较利用较高剂量的短期作用(图27C)不明显。胜肽Y-聚乙二醇的能量消耗(14.60±0.69kcal/[kg*h])及胜肽X-聚乙二醇的(17.19±1.49kcal/[kg*h])较赋形剂的(12.71±0.45kcal/[kg*h])，p＝0.0187)增加，而呼吸商数倾向于减低(图29D及29E；胜肽Y-聚乙二醇为0.719±0.01，胜肽X-聚乙二醇为0.725±0.01，及赋形剂为0.755±0.01，p＝0.1028)，显示增加的热生成(thermogenesis)及改变的营养分配可说明总体的负能量平衡。由于在治疗组与对照组间的活动力并无不同(p＝0.4281；图29F)，因而增加的能量消耗与自发物理活动所引发的热生成(NEAT)的改变并无关联。自动在线监测急性喂食及慢性监测食物摄取量皆未显示热量摄取的任何差异(自动p＝0.667，慢性p＝0.9484；图30A)。
在自初次注射后第3天起的治疗期间内的血糖值显著地减低(平均减低：胜肽Y-聚乙二醇-32％，胜肽X-聚乙二醇-24.5％，对照组：-2.7％，p＜0.0001；图29G)。回应第3天的腹膜内(i.p.)葡萄糖施予，血糖峰(图29H)及分布(AUC)(图30F)于两接受治疗组(胜肽Y-聚乙二醇14183±1072，胜肽X-聚乙二醇13794±824.1)中较经赋形剂治疗的对照组(34125±3142，p＜0.0001)显著地减低。于用胜肽Y-聚乙二醇或胜肽X-聚乙二醇治疗一个月后，于治疗组中的血浆胰岛素(1194pg/ml，1034pg/ml，p＝0.0244)较对照组的(2675pg/ml)低，显示改良的胰岛素敏感性(图29I)。于用胜肽Y-聚乙二醇或胜肽X-聚乙二醇治疗一个月后的血浆C-胜肽浓度(738.8pg/ml，624.7pg/ml)倾向于较赋形剂(1077pg/ml)(p＝0.108)减低(图30G)。
为判定主要现象是否跨越物种，将两种化合物施予饮食诱导肥胖的大鼠(平均重量777.4+/-2.1克，剂量70奈摩尔/公斤/周，每周注射一次，治疗三周)。胜肽Y-聚乙二醇及胜肽X-聚乙二醇各使DIO大鼠的体重(胜肽X-聚乙二醇：-11.15+/-0.88％；胜肽Y-聚乙二醇：-20.58+/-2.26％，赋形剂：1.09+/-0.56％)(p＜0.0001)及脂肪质量(胜肽X-聚乙二醇：-19.17+/-2.03％；胜肽Y-聚乙二醇：-33.76+/-4.76％，赋形剂：0.65+/-1.20％；p＜0.0001)减低，证实此抗肥胖治疗方法的与物种无关的适用性。
实施例48
在27天内用胜肽X-聚乙二醇及胜肽Y-聚乙二醇的慢性s.c.治疗使DIO老鼠的总胆固醇(分别为106.9±6.3mg/dL及200.8±29.58mg/dL)相对于赋形剂(254.025.33mg/dL，p＝0.0441；图31A)减低。在一个别的实验中，使DIO老鼠于第0及7天时接受70奈摩尔/公斤s.c.的胜肽X-聚乙二醇、胜肽Y-聚乙二醇或赋形剂，且于第9天时进行评估。胜肽Y-聚乙二醇使血浆三酸甘油酯、LDL胆固醇及总胆固醇减低(总胆固醇63.02.49mg/dL相较于赋形剂的177.7±11.8mg/dL)(p＜0.0001)，同时可能导致从LDL转变为HDL胆固醇(图31B)。胜肽X-聚乙二醇使LDL及HDL胆固醇两者减低，但对三酸甘油酯没有显著作用(图31C)。瘦体素有显著的减少(胜肽Y-聚乙二醇为3343±723.3pg/ml；胜肽X-聚乙二醇为7308±2927，及赋形剂为18,642±6124；p＝0.0426；图31D、31E、31F)。慢性治疗27天亦使肝脏脂防含量回归正常，而对照DIO老鼠则维持明显的脂肪肝(未显示数据)。
实施例49
用胜肽X-聚乙二醇或胜肽Y-聚乙二醇治疗一个月导致DIO老鼠的白色脂肪组织(WAT)中的激素敏感性脂解酶(HSL)的增加的磷酸化(胜肽X-聚乙二醇：1.135±0.315；胜肽Y-聚乙二醇：1.625±0.149；赋形剂：0.597±0.204；p＝0.0369；图32B)，显示胰高血糖素特异的对WAT脂肪分解的直接作用。伴随经以胜肽Y-聚乙二醇及胜肽X-聚乙二醇以35奈摩尔/公斤/周的剂量治疗2星期的老鼠的脂肪质量的减少，当与对照组老鼠比较时，副睪脂肪组织的脂肪细胞的大小有显著的减小(未显示数据)。然而，尽管具有减少的脂肪质量及较小的脂肪细胞，但此利用胜肽Y-聚乙二醇及胜肽X-聚乙二醇短期治疗2星期未伴随如由对CD68的实时RT-PCR所定量的脂肪组织巨噬细胞含量的显著减少(图33C)。于棕色脂肪组织(BAT)中的解偶联蛋白质I(UCP1)含量经由胜肽X-聚乙二醇治疗提高，但未由胜肽Y-聚乙二醇治疗提高(胜肽X-聚乙二醇2.167±0.429，胜肽Y-聚乙二醇1.287±0.1558，及赋形剂1.0±0.118；p＝0.0264；图32A)，此与对BAT休息生热的胰高血糖素样肽-1特异作用一致。反映肝脏糖质新生(gluconeogenesis)的肝脏基因表现未受胜肽X-聚乙二醇或胜肽Y-聚乙二醇影响(图30H及30I)。组织学显示胰岛在胜肽X-聚乙二醇治疗后倾向于较小(未显示数据)。
实施例50
为仔细研究胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇的GLP-1R及GcgR促效剂成分的贡献；将其各施予维持高脂肪饮食的胰高血糖素样肽-1受体基因剔除(GLP-1R-/-)老鼠历时一个月。胜肽X-聚乙二醇与盐水相比导致体重(p＞0.05；图34A及34B)及脂肪质量(p＞0.05；图34C)的减少。胜肽Y-聚乙二醇于GLP-1R-/-老鼠中导致体重(p＝0.0025)及脂肪质量(p＝0.0025)的显著减小(图34A-34C)。胜肽X-聚乙二醇对GLP-1R-/-老鼠的食物摄取量没有影响，而胜肽Y-聚乙二醇则显著地抑制食物摄取量(p＝0.017)(图34D)。胜肽Y-聚乙二醇(但非胜肽X-聚乙二醇)具有在葡萄糖耐受性试验中在不存在功能性GLP-1R下提高血糖的倾向(p＝0.03)(图34E及34F)，显示需要共同促效剂的胰高血糖素样肽-1成分来防止由胰高血糖素所诱导的高血糖症。
实施例51
为独立评估可归因于胰高血糖素促效作用的胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇的作用，研究两种具有相当的GLP-1R效能但显著不同的GcgR活性的额外胜肽促效剂。两种胜肽(胜肽U及V)是与胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇相关。胜肽U及V包含SEQID NO：1的氨基酸序列与以下的修饰：第16号位置的谷氨酸、第17号位置的谷氨酰胺、第18号位置的丙氨酸、第20号位置的赖氨酸、第21号位置的谷氨酸、第23号位置的异亮氨酸、及第24号位置的半胱氨酸，但包含第24号位置的半胱氨酸的20-kd聚乙二醇化且不包含第2号位置的胺基异丁酸。胜肽V另外包含谷氨酰胺3取代为谷氨酸，其使胰高血糖素促效作用选择性地降低超过十倍。胜肽U及胜肽V皆不包含内酰胺架桥。每天用胜肽V以50奈摩尔/公斤s.c.治疗DIO老鼠历时1星期相对于胜肽U显现对降低体重的降低效果(分别为-9.09±0.80相对于-13.71±0.92克，p＜0.0001；图35A)。
实施例52
基本上如本文所述制得包含通过γ-谷氨酸间隔物或γ-谷氨酸-γ-谷氨酸双肽间隔物连接至赖氨酸残基的C16脂肪酰基的胰高血糖素胜肽，其中该赖氨酸残基是位于第10号位置或羧基端(于第29号位置)处。如本文所述测试胜肽于胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1受体的体外活性。结果显示于表31。
Figure BDA0000121349000001721
实施例53
基本上如本文所述制得表32所示的胜肽：
表32
Figure BDA0000121349000001741
除了SEQ ID NO：624、631、及632的胜肽外，表32的所有胜肽于胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1受体两者显现强效的体外活性。
基本上如本文所述制得除了表33中概述的变化外，包含天然胰高血糖素的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的A组的胜肽。
表33：
Figure BDA0000121349000001742
Figure BDA0000121349000001751
Figure BDA0000121349000001761
*表示第17、28、21及23号位置处的氨基酸为野生型或嵌合物2。(第17号位置的谷氨酰胺、第18号位置的丙氨酸、第21号位置的谷氨酸及第23号位置的异亮氨酸。)
基本上如本文所述制得除了第27号位置的甲硫氨酸取代为正亮氨酸外，具有与A组胜肽相同结构的胜肽。这些经修饰胜肽为B组的胜肽。
基本上如本文所述制得除了第24号位置的谷氨酰胺取代为共价性连接至40kDa聚乙二醇的半胱氨酸外，具有与A及B组胜肽相同结构的胜肽。此等经聚乙二醇化的胜肽形成C组的胜肽。
基本上如本文所述制得除了第10号位置的酪氨酸经共价连接至C8、C12、C14、C16、或C18脂肪酰基的赖氨酸取代外，具有与A、B、或C组胜肽相同结构的胜肽。经C8脂肪酰基酰基化的胜肽形成D组的胜肽。经C12脂肪酰基酰基化的胜肽形成E组的胜肽。经C14脂肪酰基酰基化的胜肽形成F组的胜肽。经C16脂肪酰基酰基化的胜肽形成G组的胜肽。经C18脂肪酰基酰基化的胜肽形成H组的胜肽。
基本上如本文所述制得除了脂肪酰基通过一间隔物连接至第10号位置的赖氨酸外，具有与D至H组胜肽相同结构的胜肽。包含γ-谷氨酸-γ-谷氨酸间隔物的胜肽形成I组的胜肽。包含γ-谷氨酸间隔物的胜肽形成J组的胜肽。包含丙氨酸-丙氨酸间隔物的胜肽形成K组的胜肽。包含β-丙氨酸-β-丙氨酸间隔物的胜肽形成L组的胜肽。
实施例54
基本上如本文所述制得包含具有15个氨基酸修饰(一1至21个氨基酸的羧基端延伸)的SEQ ID NO：1的胰高血糖素胜肽，其中：(a)该延伸经酰基化或烷基化，及/或(b)该延伸包括1至6个带正电氨基酸。基本上如实施例14所述测试胜肽于胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1及胃抑胜肽受体的体外活性。该胜肽的结构及其体外活性总结于表34。
Figure BDA0000121349000001791
如于表34所示，证实于胃抑胜肽受体的促效剂活性大于0.1％的所有未聚乙二醇化的胜肽(胜肽mt-345、mt-362以及mt-364)证实于胃抑胜肽受体有异常强效的活性。胜肽mt-350、mt-351以及mt-352证实活性小于0.1％可能是由于此类胜肽经聚乙二醇化的事实。
实施例55
mt-345(具有SEQ ID NO：657的结构)的活体内效果与其他经酰基化胜肽(利拉鲁肽，mt-261(SEQ ID NO：670)、及mt-347(SEQ ID NO：659))及一未经酰基化胜肽(mt-348；SEQ ID NO：660)。胜肽mt-345、mt-261以及mt-347包含具有氨基酸修饰的胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列，并进一步包含GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：26)至第29号位置处氨基酸接着一第40号位置处的经酰基化赖氨酸的一延伸。胜肽mt-345包含第2号位置的胺基异丁酸、第16号位置的谷氨酸、第17号位置的谷氨酰胺、第18号位置的丙氨酸、第20号位置的赖氨酸、第21号位置的谷氨酸、第23号位置的异亮氨酸、第24号位置的半胱氨酸、第29号位置的甘氨酸、SEQ ID NO：26羧基端至第29号位置处甘氨酸以及一第40号位置处的经酰基化的赖氨酸。mt-345的酰基一为C14脂肪酰基。胜肽mt-261具有与mt-345相似的结构，除了mt-261包含第1号位置的酪氨酸、第3号位置的谷氨酸、第12号位置的异亮氨酸、第16号位置的赖氨酸、第17号位置的谷氨酰胺、第18号位置的丙氨酸、第20号位置的胺基异丁酸、第23号位置的缬氨酸、第24号位置的天冬酰氨酸、第27号位置的亮氨酸、第28号位置的丙氨酸以及第40号位置处的一C16脂肪酰基。该mt-347及mt-348与mt-345的结构相同，除了mt-347及mt-348包含第16号位置的胺基异丁酸。该mt-347与mt-348的结构相同，除了mt-347包含第40号位置处的一C14脂肪酰基，而mt-348缺少一酰基。
基本上如实施例14所述测试各胜肽于于胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1及胃抑胜肽受体的体外活性。该相对活性结果显示于表35。
表35
Figure BDA0000121349000001811
％相对活性是相对于指示受体的天然激素。
该胜肽以10或30奈摩尔/公斤剂量皮下注射而每日施予至8 C57B1/6老鼠11组中历时两周。老鼠的初始平均体重为51克。该老鼠是6个月大且经喂食致糖尿病饮食4个月。老鼠中一组接受一赋形剂对照组且另一组接受包含具有一羧基端酰胺化以代替羧酸端α羧酸基的SEQ ID NO：1氨基酸序列的胜肽。
接受胜肽的老鼠，相较于赋形剂对照组，其每一组的体重是于研究过程中稳定下降。然而，如图36所示，接受mt-261或mt-345为10奈摩尔/公斤的老鼠体重总变化最为显著(约20％)。施予胰高血糖素酰胺胜肽的老鼠亦证实有如同mt-261及mt-345的一相似的体重总下降，尽管胰高血糖素酰胺的剂量为mt-261及mt-345的三倍。在体重的效果明显地比利拉鲁肽(liraglutide)的效果更显著。
由老鼠组别的食物摄取量亦在研究期间评估。接受mt-261或mt-345的老鼠证实有最低的食物摄取量。
老鼠的血糖值亦研究。施予利拉鲁肽(liraglutide)、mt-261或mt-345的老鼠证实在第七天(胜肽首次施予后的第七天)有一血糖值总下降。然而当第14天测量时其下降程度较小。
实施例56
基本上如本文所述制得包含一经酰基化羧基端延伸的胰高血糖素胜肽。胜肽mt-278、mt-261、mt-297以及mt-358包含具有下列氨基酸修饰的SEQ ID NO：1的氨基酸序列：第1号位置的酪氨酸、第2及20号位置的胺基异丁酸、第16号位置的赖氨酸、第12号位置的异亮氨酸、第17号位置的谷氨酰胺、第18号位置的丙氨酸、第21号位置的谷氨酸、第29号位置的甘氨酸、SEQ ID NO：26羧基端至第29号位置的氨基酸以及一第40号位置处的经酰基化的赖氨酸。胜肽mt-364藉由包含一第1号位置的组氨酸、第16号位置的谷氨酸、以及一第20号位置的赖氨酸而与其他胜肽不同。此类胜肽结构的详细叙述以此处所附的序列表叙述：mt-364(SEQ ID NO：669)、mt-261(SEQID NO：270)、mt-278(SEQ ID NO：271)、mt-297(SEQ ID NO：272)以及mt-358(SEQ IDNO：673)。
基本上如实施例14所述测试胜肽于胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1及胃抑胜肽受体的体外活性。该胜肽的活性与天然激素于指示受体的比较显示于表36。
表36
Figure BDA0000121349000001821
％相对活性是相对于指示受体的天然激素。
该胜肽接着活体内测试已8个月大且经喂食致糖尿病饮食6个月的C57B1/6老鼠在体重、食物摄取量、血糖值以及脂肪质量上的效果。8只老鼠有11组以每日以10奈摩尔/公斤的胜肽皮下注射历时一周。老鼠的初始体重为53克。
以mt-278、mt-261或mt-364注射的老鼠体重相较于仅以赋形剂注射的老鼠组，其体重是于研究过程中稳定下降。如图37所示，经注射mt-364的老鼠证实在一周长的研究结束前有最大的体重下降，达到大于15％的体重减低。经注射mt-278或mt-261的老鼠亦证实有大幅的(大于10％)体重减低。
监控老鼠的总食物摄取量且研究结束前，由老鼠注射mt-364或mt-261的总食物摄取量证实其总食物摄取量比老鼠注射仅含赋型剂者少15％。
在整个研究中测量老鼠的脂肪质量。以mt-364、mt-278或mt-261注射的老鼠显示一小于仅以赋形剂注射的老鼠者的脂肪重量。
在血糖值上的效果额外地评估。在研究的最后一天(第7天)，以mt-364或mt-261注射的老鼠显示比在第0天测量的血糖值超过60％的一血糖值下降。经注射mt-278的老鼠额外地证实有大幅的(下降超过40％)血糖值下降。
实施例57
基本上如本文所述制得具有一羧基端酰胺以取代羧基端α羧酸基的类似物。
胜肽83包含具有第2号位置的胺基异丁酸、第16号位置的胺基异丁酸以及第10号位置赖氨酸的SEQ ID NO：1的结构，其中赖氨酸通过一γ-谷氨酸-γ-谷氨酸双肽间隔物包含一C16脂肪酰基。
胜肽900包含具有第2号位置的胺基异丁酸、第16号位置的胺基异丁酸、包含SEQID NO：26的一羧基端延伸以及第40号位置赖氨酸的SEQ ID NO：1的结构，其中赖氨酸通过一γ-谷氨酸-γ-谷氨酸双肽间隔物包含一C16脂肪酰基。
胜肽901包含具有第2号位置的胺基异丁酸、第16号位置的胺基异丁酸、包含SEQID NO：26的一羧基端延伸以及第10号位置赖氨酸的SEQ ID NO：1的结构，其中赖氨酸通过一γ-谷氨酸-γ-谷氨酸双肽间隔物包含一C16脂肪酰基。
胜肽mt-364包含SEQ ID NO：669的结构。
基本上如本文所述测试胜肽于胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1及胃抑胜肽受体中每一个的体外活性。结果显示于表37。
表37
nd＝未测定
8只DIO老鼠中九组(品是：C57B16 WT)每日以表37的胜肽的一种的10奈摩尔/公斤皮下注射历时七天。该老鼠的初始平均体重为57.6g。该老鼠约10个月大且以高脂肪含量食物喂食约8个月。
于研究的第7天测量体重的总变化。如图38所示，所有经注射表37的胜肽的老鼠证实与赋形剂对照组相较有一体重下降。在胜肽83、900及901间，所有胜肽具有一相似的胜肽结构，胜肽900及901证实有最大的体重下降。有趣的是，相较于83(经酰基化但不包含羧基端延伸)，胜肽900及901中每一个包含有一羧基端延伸并经酰基化。于第10号位置经酰基化的胜肽901证实下降(约15％下降)较于第40号位置经酰基化的胜肽900(约10％下降)更大。然而，此类胜在体重上的活体内效果仍未如同MT-364者显著。经以MT-364注射的老鼠证实有约20％的下降。
将文中引述的所有参考文献，包括公告、专利申请案、及专利，以如同各参考文献经个别且明确地指示为经并入本文为参考数据且以其全体记述于文中的相同程度并入本文为参考数据。
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上述实施例仅是为了方便说明而举例而已，本发明所主张的权利范围自应以申请专利范围所述为准，而非仅限于上述实施例。
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Figure IDA0000130682120006061
Figure IDA0000130682120006071
Figure IDA0000130682120006081

Claims (58)

1.一种胰高血糖素胜肽的类似物，该类似物包含：
(i)具有至少一个至最多10个氨基酸改变的SEQ ID NO：1，其中该至少一个的氨基酸的改变使得类似物的C-末端部分被赋予了一个稳定化的α螺旋结构；
(ii)羧基端至第29号位置的氨基酸的1至21个氨基酸的延伸；以及
(iii)下列的至少一种：
(a)位于第37至43号位置(根据SEQ ID NO：1的编号)中任何位置的该延伸的氨基酸中至少一个包含有：对自然发生的氨基酸来说是非自然的一酰基或一烷基；
(b)该延伸的1至6个氨基酸为带正电氨基酸；
(c)在所述的同系物的第10号位置上为包含酰基或烷基的氨基酸，其中该酰基或烷基对自然发生的氨基酸来说是非自然的，或
(d)(a)、(b)及(c)的组合；
其中当该类似物缺少一亲水性基团时，该类似物于胃抑胜肽(GIP)受体显现至少约0.1％的天然胃抑胜肽(GIP)的活性；
2.如权利要求1所述的类似物，其中(i)该类似物包含一分子内架桥，是介于第i及i+4号位置的氨基酸的侧链之间或第j及j+3号位置的氨基酸侧链之间，其中i为12、13、16、17、20或24，且j为17，(ii)该类似物的第16、20、21、及24号位置中一、二、三或多个位置被取代为α，α-双取代氨基酸，或(iii)(i)及(ii)两者。
3.如权利要求1或2所述的类似物，包含第16号位置的谷氨酸及第20号位置的赖氨酸，其中可选择的有一内酰胺架桥连接至该谷氨酸及该赖氨酸。
4.如权利要求3所述的类似物，是进一步包含一或多个的：第17号位置的谷氨酰胺、第18号位置的丙氨酸、第21号位置的谷氨酸、第23号位置的异亮氨酸、第24号位置的丙氨酸或半胱氨酸，或其一或多个保守性取代。
5.如权利要求1至4任一项所述的类似物，包含一羧基端酰胺。
6.如权利要求1至5中任一项所述的类似物，是包含于第1号位置、第2号位置或第1号及2号位置处的氨基酸取代，其中该氨基酸取代获得了第四型双胜肽蛋白水解酶(DPP-IV protease)的抗性。
7.如权利要求6所述的类似物，其中在第1号位置的组氨酸被一氨基酸所取代，所述的氨基酸是选自于包含：D-组氨酸、α，α-双甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸(imidazole acetic acid)、脱胺基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸及高组氨酸所组成的群。
8.如权利要求6或7所述的类似物，其中在第2号位置的丝氨酸被一氨基酸所取代，所述的氨基酸是选自于包含：D-丝氨酸、丙氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸以及胺基异丁酸(AIB)所组成的群。
9.如权利要求1至8中任一项所述的类似物，其中在第1号位置的氨基酸包含一咪唑环(imidazole ring)。
10.如权利要求9所述的类似物，其中在第1号位置的氨基酸为组氨酸。
11.如权利要求1至6中任一项所述的类似物，其中在第1号位置的氨基酸为非大的、芳香族氨基酸。
12.如权利要求11所述的类似物，其中在第1号位置的氨基酸并非酪氨酸。
13.如权利要求1至12中任一项所述的类似物，包含在27、28或29号位置中一、二或所有处的氨基酸修饰。
14.如权利要求13所述的类似物，其中(a)第27号位置的甲硫氨酸被取代为大的脂肪族氨基酸，可选择的为亮氨酸，(b)第28号位置的天冬酰氨酸取代为小的脂肪族氨基酸，可选择的为丙氨酸，(c)第29号位置的苏氨酸取代为小的脂肪族氨基酸，可选择的为甘氨酸，或(d)(a)、(b)及(c)中两种或所有的组合。
15.如权利要求14所述的类似物，包含第27号位置的亮氨酸、第28号位置的丙氨酸以及第29号位置的甘氨酸或苏氨酸。
16.如权利要求15所述的类似物，是包含一或多个下列修饰：
a.第2号位置的丝氨酸替换为为丙氨酸；
b.第3号位置的谷氨酰胺替换为谷氨酸或谷氨酰胺类似物；
c.第7号位置的苏氨酸替换为异亮氨酸；
d.第10号位置的酪氨酸替换为色氨酸或包含对自然生成的氨基酸来说是非自然的一酰基或烷基的一氨基酸；
e.第12号位置的赖氨酸替换为异亮氨酸；
f.第15号位置的天冬氨酸替换为谷氨酸；
g.第16号位置的丝氨酸替换为谷氨酸；
h.第20号位置的谷氨酰胺替换为丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或胺基异丁酸；
(i)第24号位置的谷氨酰胺替换为丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或胺基异丁酸；
j.第27号位置的甲硫氨酸替换为亮氨酸或正亮氨酸(Nle)；
k.第29号位置的天冬酰氨酸替换为一带电荷氨基酸，可选择的为天冬氨酸或谷氨酸；以及
(l)第29号位置的苏氨酸替换为甘氨酸或一带电荷氨基酸，可选择的为天冬氨酸或谷氨酸。
17.如权利要求1至16中任一项所述的类似物，是包含(i)GPSSGAPPPS(SEQID NO：26)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：674)的氨基酸序列，其中X为任何氨基酸，(ii)与SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：674氨基酸序列相比具有至少80％序列相似度的氨基酸序列，或(iii)具有一或多个保守性氨基酸替换的(i)或(ii)的该氨基酸序列，其中该氨基酸序列是类似物的羧基端至第29号位置。
18.如权利要求17所述的类似物，包含GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：26)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：674)的氨基酸序列，其中X为任何氨基酸，C-末端至类似物第29号位置的氨基酸。
19.权利要求1至18中任一项所述的类似物，其中包含一酰基或烷基的该氨基酸是为化学式I、II或III所示的氨基酸。
20.如权利要求19所述的类似物，其中该包含一酰基或烷基的该氨基酸为赖氨酸。
21.如权利要求1至20中任一项所述的类似物，其中包含一酰基或烷基的该氨基酸是位于该类似物的第37、38、39、40、41、42及43号位置中任何位置。
22.如权利要求21所述的类似物，其中包含一酰基或烷基的该氨基酸是位于该类似物的第40号位置。
23.如权利要求1至22中任一项所述的类似物，其中该酰基为一C4至C30脂肪酰基。
24.如权利要求1至23中任一项所述的类似物，其中该酰基或烷基是通过一间隔物共价性连接至该氨基酸的该侧链。
25.如权利要求24所述的类似物，其中该间隔物是为3至10个原子长度。
26.如权利要求25所述的类似物，其中该间隔物为氨基酸或双肽。
27.如权利要求26所述的类似物，其中该间隔物为六-胺基己酸(6-aminohexanoic acid)。
28.如权利要求26所述的类似物，其中该间隔物为一双肽，选自于由：丙氨酸-丙氨酸、β-丙氨酸-β-丙氨酸、亮氨酸-亮氨酸及脯氨酸-脯氨酸所组成的群。
29.如权利要求24至28中任一项所述的类似物，其中该间隔物及该酰基的总长度为约14至28个原子长度。
30.如权利要求1至29中任一项所述的类似物，其中该酰基为一C12至C18脂肪酰基。
31.如权利要求30所述的类似物，其中该酰基为C14或C16脂肪酰基。
32.如权利要求1至31中任一项所述的类似物，根据SEQ ID NO：1的编号，该1至6个带正电氨基酸是位于该类似物的第37、38、39、40、41、42及43号位置中任何位置。
33.如权利要求32所述的类似物，包含于第40号位置的一带正电氨基酸。
34.如权利要求1至33中任一项所述的类似物，其中该带正电氨基酸包含化学式IV的该结构：
Figure FDA0000121348990000051
[化学式IV]，
其中n为1至16、或1至10、或1至7、或1至6、或2至6、或2、或3、或4、或5，每一R1及R2是分别选自包含：氢、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳香族羟基)R7及(C1-C4烷基)(C3-C9杂环芳香基)所组成的群，其中R7为H或OH，且化学式IV的氨基酸侧链包含一游离胺基。
35.如权利要求34所述的类似物，其中该化学式IV的氨基酸为鸟氨酸、二胺基丁酸(Dab)、赖氨酸或高赖氨酸。
36.如权利要求1-35中任一项所述的类似物，当该类似物不包含一亲水性基团时，该类似物于胰高血糖素样肽-1受体具有至少约4％的胰高血糖素样肽-1(SEQ IDNO：2)的活性。
37.如权利要求1-36中任一项所述的类似物，其中当该类似物不包含一亲水性基团时，该类似物于胰高血糖素受体具有至少约20％的胰高血糖素的活性。
38.如权利要求1-36中任一项所述的类似物，其中当该类似物不包含一亲水性基团时，该类似物包含在第3号位置的氨基酸修饰且于胰高血糖素受体具有少于1％的胰高血糖素的活性。
39.如权利要求1-35、37、38中任一项所述的类似物，其中当该类似物不包含一亲水性基团时，该类似物包含在第7号位置的氨基酸修饰且于胰高血糖素样肽-1受体具有少于10％的胰高血糖素样肽-1的活性。
40.如权利要求1-39中任一项所述的类似物，其中该胰高血糖素胜肽是共价性连接至在第19、20、23、24、27、32、43号位置处或该羧基端的氨基酸任何位置的亲水性基团。
41.如权利要求40所述的类似物，其中该胰高血糖素胜肽是共价性连接至于第24或40号位置处的氨基酸的亲水性基团。
42.如权利要求40或41所述的类似物，其中该亲水性基团是共价性键结至赖氨酸、半胱氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸。
43.如权利要求40至42中任一项所述的类似物，其中该亲水性基团为聚乙二醇(PEG)。
44.如权利要求43所述的类似物，其中该聚乙二醇链分子量为约1,000道尔顿至约40,000道尔顿。
45.如权利要求43所述的类似物，其中该聚乙二醇链的分子量为约20,000道尔顿至约40,000道尔顿。
46.如权利要求40至45中任一项所述的类似物，其中对于胃抑胜肽受体活化的该类似物EC50为约10nM或更少。
47.如权利要求40至46中任一项所述的类似物，其中该类似物于胃抑胜肽受体具有至少约0.01％的野生型胃抑胜肽(SEQ ID NO：4)的活性。
48.如权利要求40至47中任一项所述的类似物，其中该类似物于胰高血糖素样肽-1受体具有至少约0.4％的胰高血糖素样肽-1(SEQ ID NO：2)的活性。
49.如权利要求40至48中任一项所述的类似物，其中该类似物于胰高血糖素受体具有至少约2％的胰高血糖素的活性。
50.如权利要求1-38、权利要求40-47中任一项所述的类似物，其中该类似物于胰高血糖素样肽-1受体的EC50与该类似物于胃抑胜肽受体的EC50的比值约少于0.01。
51.如权利要求1-50中任一项所述的类似物，其中该类似物的胃抑胜肽效能是在该类似物的胰高血糖素样肽-1效能的约500倍内。
52.如权利要求1-51中任一项所述的类似物，其中该类似物的胃抑胜肽效能是在该类似物的胰高血糖素效能的约500倍内。
53.一种包含两胰高血糖素胜肽的二聚体，其中该胰高血糖素胜肽中至少一个如权利要求1至52中任一项所述的类似物，通过一连接物连接至另一者。
54.一种药学组合物，包括如权利要求1至52中任一项所述的类似物、权利要求53所述的二聚体以及其药学可接受盐类，及药学可接受载体。
55.一种使用预调配水性组合物治疗低血糖症的方法，该方法包括施予一有效量的如权利要求54项所述的药学组合物的步骤。
56.一种治疗糖尿病的方法，该方法包括施予一有效量的如权利要求54项所述的药学组合物的步骤。
57.一种诱发肠道暂时麻痹的方法，该方法包括施予一有效量的如权利要求54项所述的药学组合物的步骤。
58.一种减少体重增加或导致体重降低的方法，该方法包括施予一有效量的如权利要求54项所述的药学组合物的步骤。
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