CN101815521A - 新siRNA结构 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有新序列和结构基序的siRNA化合物，所述siRNA化合物下调特定人类基因的表达。本发明还涉及包含此类化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明还提供了治疗和/或预防与所述基因相关的各种疾病或病症和/或与此类疾病或病症相关的症状的发病率或严重程度的方法，所述方法包括给需要治疗此类疾病或病症和/或症状的受试者施用治疗有效剂量的该化合物或所述药物组合物从而治疗受试者。

Description

新siRNA结构
贯穿本申请引用了各种专利和科学出版物。这些出版物的公开内容以其整体在此通过引用并入本申请，以更完整地描述本发明所属领域的现有技术。
发明领域
本发明涉及新化合物、包含该化合物的药物组合物以及使用其抑制某些哺乳动物基因包括TP53BP2、LRDD、CYBA、CASP2、NOX3、HRK、RAC1、RHOA和DUOX1的方法。所述化合物和组合物因此在治疗其中基因表达具有不良后果的疾病或病症和/或与该疾病或病症相关的症状的受试者时是有用的。在具体实施方案中，本发明提供包含该化合物的组合物及其使用方法。本发明还提供在制备化学修饰的siRNA寡核苷酸中有用的新结构基序、包含它的组合物及其使用方法。
发明背景
siRNA和RNA干扰
RNA干扰(RNAi)是涉及双链(ds)RNA-依赖的基因特异性转录后沉默的现象。由于存在响应于长链dsRNA分子激活的主动的、非特异性抗病毒防御机制，研究该现象和实验性操作哺乳动物细胞的最初尝试均以失败告终(Gil等人Apoptosis，2000.5：107-114)。随后发现21个核苷酸RNA的合成双链体可在哺乳动物细胞中介导基因特异性RNAi，而不刺激通用抗病毒防御机制。(参见Elbashir等人Nature 2001，411：494-498和Caplen等人PNAS USA2001，98：9742-9747)。因此，小干扰RNA(siRNA)已成为尝试理解基因功能的有力工具。
RNA干扰(RNAi)在哺乳动物中是由小干扰RNA(siRNA)(Fire等人Nature 1998，391：806)或微小RNA(miRNA)(Ambros，Nature 2004，431(7006)：350-355；Bartel，Cell 2004，116(2)：281-97)介导的。在植物中相应的过程通常称为特异性转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并在真菌中也可称为压抑(quelling)。
siRNA是下调或沉默(阻止)其内源性(细胞内)对应物(counterpart)的基因/mRNA表达的双链RNA或修饰的RNA分子。RNA干扰的机制在下文详述。
若干研究显示siRNA疗法在哺乳动物和人类二者中都是有效的。Bitko等人表明当鼻内施用时，针对呼吸道合胞病毒(RSV)核壳体N基因的特异性siRNA分子有效治疗小鼠(Nat.Med.2005，11(1)：50-55)。讨论siRNA疗法的近期综述是可获得的(Barik等人J.Mol.Med 2005，83：764-773；Dallas和Vlassov，Med.Sci.Monitor 2006，12(4)：RA67-74；Chakraborty，Current Drug Targets 2007，8(3)：469-82；Dykxhoorn等人Gene Therapy 2006.13：541-552)。
Mucke(IDrugs 200710(1)：37-41)发表了目前疗法用于治疗眼部疾病例如年龄相关性黄斑变性(AMD)和青光眼的综述，包括针对各种靶的siRNA。
siRNA结构
与已知基因对应的siRNA的选择和合成已经被广泛报道；(参见例如Ui-Tei等人J Biomed Biotech.2006；2006：65052；Chalk等人BBRC.2004，319(1)：264-74；Sioud和Leirdal，Met.Mol Biol.；2004，252：457-69；Levenkova等人Bioinform.2004，20(3)：430-2；Ui-Tei等人NAR.2004，32(3)：936-48)。
修饰的siRNA的利用和制备的实例，参考例如，Braasch等人Biochem.2003，42(26)：7967-75，Chiu等人RNA，2003，9(9)：1034-48；PCT公布WO2004/015107(atugen AG)和WO 02/44321(Tuschl等人)。美国专利号5,898,031和6,107,094，教导了化学合成低聚物。美国专利公布号2005/0080246和2005/0042647分别涉及具有交替基序的低聚化合物和具有化学修饰的核苷间键合的dsRNA化合物。
其他修饰已经公开。结果表明5′-磷酸部分的并入增强siRNA在果蝇胚胎中的活性(Boutla等人Curr.Biol.2001，11：1776-1780)和是人类HeLa细胞中siRNA功能所必需的(Schwarz等人Mol.Cell，2002，10：537-48)。Amarzguioui等人(NAR，2003，31(2)：589-95)显示siRNA活性取决于2′-O-甲基修饰的位置。Holen等人(NAR.2003，31(9)：2401-07)报道了具有少数2′-O-甲基修饰核苷的siRNA与野生型相比产生高活性，但随着2′-O-甲基修饰的核苷数量的增加其活性降低。Chiu和Rana(RNA.2003，9：1034-48)教导了相对于未修饰的siRNA，在有义链或反义链(完全修饰链)中并入2′-O-甲基修饰核苷的siRNA活性严重降低。据报道在反义链5′-末端放置2′-O甲基将严重限制其活性，而在反义链3′-末端和有义链的两个末端的放置则是耐受的(Czauderna等人NAR.2003，31(11)：2705-16；WO2004/015107)。本发明提供的分子的优势在于其无毒性和可用于制备用于治疗各种疾病的药物组合物。
促凋亡基因
促凋亡基因通常定义为在凋亡性细胞死亡中起作用的基因。本发明中有用的促凋亡基因的非限制性列表如下：肿瘤蛋白p53结合蛋白2(TP53BP2)；含有富含亮氨酸重复序列和死亡结构域(leucine-rich repeats anddeath domain containing，LRDD)；细胞色素b-245，α多肽(CYBA，p22phox)；激活转录因子3(ATF3)；半胱天冬酶2，凋亡相关半胱氨酸肽酶(CASP2)；NADPH氧化酶3(NOX3)；harakiri，BCL2相互作用蛋白(HRK，BID3)；补体成分1，q子成分结合蛋白(C1QBP)；BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3(BNIP3)；丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8，JNK1)；丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14，p38)；ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1(Rho家族小GTP结合蛋白RAC1)；糖原合酶激酶3β(GSK3B)；嘌呤能受体P2X，配体门控离子通道7(P2RX7)；瞬时受体电位阳离子通道，亚家族M，成员2(TRPM2)；聚(ADP-核糖)糖原水解酶(poly(ADP-ribose)glycohydrolase，PARG)；CD38分子(CD38)；STEAP家族成员4(STEAP4)；骨形态发生蛋白2(BMP2)；间隙连接蛋白，α1，43kDa(连接蛋白43，GJA1)；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白(TYROBP)；结缔组织生长因子(CTGF)；分泌磷蛋白1(骨桥蛋白，SPP1)；ras同源物基因家族，成员A(RHOA)和双氧化酶1(DUOX1)。
转让给本发明受让人的PCT专利申请号PCT/IL2007/001278(PCT公布号WO 2008/050329)和美国序列号11/978,089涉及上述基因的抑制剂，并通过引用以其整体并入。
听力损失
化学诱导的耳毒性
各种治疗药物对听细胞和螺旋神经节神经元的耳毒性效应经常是限制它们治疗有用性的因素。常用的耳毒性药物包括广泛使用的化疗药物顺铂及其类似物、氨基糖苷类抗生素如庆大霉素、奎宁及其类似物、水杨酸及其类似物和环利尿剂(loop-diuretics)。
例如，已知抗细菌氨基糖苷类如庆大霉素、链霉素、卡那霉素、妥布拉霉素等有严重的毒性副作用，特别是耳毒性和肾毒性，这降低了它们作为治疗剂的价值(参见Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis ofTherapeutics(治疗剂的药理学基础)，第6版，A.Goodman Gilman等人编辑；Macmillan Publishing Co.，Inc.，1980.New York，第1169-71页)。因此，耳毒性是公认的抗生素施用的剂量限制性副作用。研究表明，每天接受1克超过1周后，4-15％患者发展可测量的听力损失，如果继续治疗，则逐渐恶化并可能导致永久性耳聋。
耳毒性也是顺铂的严重的剂量限制性副作用，顺铂是已证明对各种人类癌症包括睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈癌有效的铂配合物。已显示顺铂(
Figure GPA00001081159600041
)损害听觉系统和前庭系统。水杨酸类，例如阿斯匹林，由于其抗炎、镇痛、解热和抗血栓效应而成为最常用的治疗药物。不幸的是，它们也有耳毒性的副作用，并可导致耳鸣(“耳中鸣响”)和暂时性听力损失。此外，如果长期高剂量使用该药物，可出现慢性的和不可逆转的听力损伤。
不限于理论，顺铂药物和其他潜在的耳毒性药物通过内耳组织中细胞凋亡诱导耳毒性效应，尤其是内耳毛细胞(Zhang等人Neuroscience 2003，120(1)：191-205；Wang等人2003，J.Neuroscience，23(24)：8596-8607)。长期高剂量使用耳毒性药物会导致持久性和不可逆转的听力损伤。哺乳动物的听毛细胞的只在胚胎发育时产生并如果在出生后损失则不可再生。因此，毛细胞的损失将导致完全的和不可逆转的耳聋。
不幸的是，目前没有有效治疗耳蜗使耳聋好转的疗法。因此，防止听毛细胞死亡的有效治疗会有很大的治疗价值。转让给本发明申请人的美国序列号11/655,610涉及治疗受试者听力损伤的方法，所述方法包括给受试者施用包含有效量p53多核苷酸抑制剂和任选地促凋亡基因抑制剂的组合物。
老年性耳聋
另一种类型的听力损失是老年性耳聋，它是老年人逐渐发生的听力损失。约30-35％年龄介于65-75岁之间的成年人和40-50％年龄在75岁和以上的人经历听力损失。因此，存在对预防、降低或治疗牵涉内耳组织特别是内耳毛细胞的内耳疾患和听力损伤的发病率和/或严重程度的措施的需要。
声损伤
声损伤是长期暴露于高噪音所导致的听力损失类型。不希望限于理论，暴露于高噪音导致耳蜗上的毛细胞敏感性降低。对于更加严重的暴露，损伤可从相邻支持细胞的损失发展到柯替器(organ of Corti)的完全破坏。感觉细胞死亡可导致渐进性沃勒变性(Wallerian degeneration)和初级听神经纤维的损失。
因此，存在对预防、降低或治疗化学毒性导致的疾病或疾患包括内耳疾患及听力损伤、肾损害(肾毒性)和神经损伤(神经毒性)的发病率和/或严重程度的措施的需要。
急性肾功能衰竭
急性肾功能衰竭(ARF)是特征为在数天内发生肾功能的快速恶化的临床综合征。ARF的主要特征是肾小球滤过率(GFR)突然下降，导致含氮废物(尿素、肌酐)滞留。在世界范围内，每年每1百万人中约170-200人发生严重的ARF。现今，还没有对确定的ARF的特异疗法。已发现一些药物在动物模型中改善毒性和缺血性实验性ARF，如降低的血清肌酐水平，减少的组织学损害和更快恢复肾功能所表现的。这些药物包括抗氧化剂、钙通道阻滞剂、利尿剂、血管活性物质、生长因子、抗炎剂等。然而，当这些药物进行临床试验时则表现出没有益处，并且未批准其对治疗ARF有用。
大多数住院的ARF患者中，ARF是由急性肾小管坏死(ATN)引起的，性肾小管坏死由缺血和/或肾毒性损害引起。肾灌注不足是由低血容量休克、心源性休克和感染性休克，由施用血管收缩药物或肾损伤造成的。肾毒素包括外源性毒素如造影剂和氨基糖苷类以及内源性毒素如肌红蛋白。最近的研究表明，肾组织细胞凋亡在大多数人类ARF病例中是突出的。凋亡性细胞死亡的主要位点是远端肾单位。在缺血性损伤的初始阶段，肌动蛋白细胞骨架的完整性丧失导致上皮扁平，和刷状缘丧失，焦点细胞接触丧失，以及随后细胞从深层基底脱离。已经建议，凋亡性肾小管细胞死亡可能比坏死性细胞死亡更多地预测功能变化(Komarov等人1999，Science.285(5434)：1733-7；Supavekin等人2003，Kidney Int.63(5)：1714-24)。综上所述，目前还没有预防和/或治疗急性肾功能衰竭的理想治疗模式，而且显然需要为此研发新化合物。
肾移植
移植物功能延迟
移植物功能延迟(Delayed graft function，DGF)是肾移植中手术后早期最常见的并发症，并且导致不理想的移植结果(Moreso等人Nephrol.Dial.Transplant.1999.14(4)：930-35)。虽然移植物功能延迟的发生率和定义在移植中心之间不同，但结果是不变的并包括延长的住院、其他侵入性程序以及对患者和医疗保健系统的额外成本。
急性移植排斥反应
急性移植排斥反应可分为三类，取决于移植物破坏(graft destruction)的发作。超急性排斥是应用于极早期移植物破坏通常在最初的48小时内的术语。急性排斥反应在移植后几天到几个月或甚至几年发作，并可涉及体液和/或细胞的机制。慢性排斥反应与慢性同种异体免疫反应有关。
青光眼
青光眼是世界上引起失明的主要原因之一。它影响了全世界大约6680万人。每年至少有12,000美国人因这种疾病所致盲(Kahn和Milton，Am JEpidemiol.1980，111(6)：769-76)。青光眼的特征是视神经头部的轴突变性，主要是由于升高的眼压(IOP)。原发性开角型青光眼(POAG)是青光眼最常见的形式之一，由于小梁网(TM)中房水外流的阻力增加，造成IOP升高和最终的视神经损伤。Mucke(IDrugs 2007，10(1)：37-41)综述了目前的疗法，包括用于治疗眼部疾病例如年龄相关性黄斑变性(AMD)和青光眼的针对各种靶的siRNA。
急性呼吸窘迫综合征
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，也称为呼吸窘迫综合征(RDS)或成人呼吸窘迫综合征(相对于婴儿呼吸窘迫综合征，IRDS)是对各种形式肺损伤的严重反应。其为造成增加通透性的肺水肿的最严重的疾患。
ARDS是各种直接和间接损害引起的严重肺部疾病。其特征是肺实质炎症，该肺实质炎症导致气体交换受损与伴随的炎症介质的全身释放，所述炎症介质引起炎症、缺氧，并经常导致多器官功能衰竭。这种情况会危及生命而且往往致命的，通常需要机械通气并进入加护病房。急性呼吸窘迫综合征不太严重的形式称为急性肺损伤(ALI)。
器官移植后缺血再灌注损伤
缺血再灌注损伤(IRI)是器官同种异体移植物接受者死亡的主要原因之一。重大IRI发生在从死亡捐赠者的每个器官移植病例和在从活体捐赠者的一些器官移植病例。它导致急性排斥反应增加和长期同种异体移植功能损害。肺移植是终末期肺部疾病病人的唯一最终治疗(definitive therapy)，在所有固体同种异体移植接受者中存活率差。
急性肺移植排斥反应
急性同种异体移植排斥反应仍然是肺移植中严重的问题，尽管免疫抑制药物有所进展。缺血再灌注(I/R)损伤和缺氧损伤可造成排斥反应和最终早期发病和死亡。
脊髓损伤
脊髓损伤，是导致感觉和/或运动丧失的脊髓障碍，也称为脊髓病。两种最常见的类型是创伤引起的脊髓损伤和疾病引起的脊髓损伤。创伤常常是由车祸、跌倒、枪击、潜水事故等引起的。可影响脊髓的疾病包括脊髓灰质炎、脊柱裂、肿瘤、弗里德赖希共济失调(Friedreich’s ataxia)。
压疮
压疮(Pressure sore)，通常称为褥疮或压迫性溃疡，为损坏的皮肤和组织部位。随着长期受压，可发展组织缺血，造成间质组织中代谢废物的积累，造成缺氧和细胞死亡。这种压力引起的缺血还导致过度组织缺氧，进一步促使细菌繁殖和组织破坏。
年龄相关性黄斑变性
超过65岁的美国人中最佳矫正视力下降的最常见的原因是称为年龄相关性黄斑变性(AMD)的视网膜疾患。受AMD影响的眼部区域是黄斑区，为视网膜中心的一个小区域，主要是感光细胞组成。随着AMD的进展，该病的特征是尖锐的中央视力的丧失。所谓的“干性”AMD占AMD患者的约85-90％并涉及由于细胞的整体萎缩所致的眼色素分布改变、光感受器损失和视网膜功能减弱。“湿性”AMD涉及异常脉络膜血管增殖导致视网膜下空间形成凝块或伤痕。因此，“湿性”AMD的发作是由于神经视网膜下方异常脉络膜新生血管网络的形成(脉络膜新生血管形成，CNV)。新形成的血管过度泄漏，导致视网膜下积液和血液积聚导致视敏度损失。最终，随着包括脉络膜和视网膜的大盘状疤痕的形成，有关区域功能性视网膜完全丧失。干性AMD患者可以维持质量下降的视力，而湿性AMD常常导致失明(Hamdi和Kenney，Frontiers in Bioscience，e305-314，May2003)。
糖尿病性视网膜病
糖尿病性视网膜病变(DR)被认为是表现过度的毛细血管通透性、血管闭合和新血管增殖的视网膜血管病。DR以两个阶段发生：非增殖阶段和增殖阶段。在非增殖阶段该疾病的特征是视网膜毛细血管周细胞丧失、基底膜增厚和微动脉瘤的发展、圆点状和污点状出血和硬性渗出物。在增殖阶段该疾病的特征是大量新生血管发生、血管侵入到玻璃体、出血和纤维化随后的视网膜牵引，视网膜牵引导致视力严重损伤。转让给本发明的受让人的美国专利号6740738和相关专利和申请涉及抑制RTP801基因和蛋白质用于治疗视网膜病变以及其他病变的方法。
口腔粘膜炎
口腔黏膜炎，也称为口腔炎，是化学治疗和放射线疗法常见和衰弱副作用，其表现为红斑和口腔和咽喉溃疡性病变部位疼痛。口腔粘膜炎患者日常活动如吃饭、喝水、吞咽和说话都可能困难或难以做到。姑息性疗法包括施用止痛药和局部清洗。
干眼综合征
干眼综合征是由于润滑眼睛的泪膜减少所致的常见问题。大多数干眼病患者会有不适感，和没有视力损失；尽管在严重的情况下，角膜可能受到损伤或感染。润湿滴液(人工眼泪)可用于治疗干眼综合征，润滑膏可用于更严重的情况。
缺血性眼病
缺血性视神经病变(ION)包括各种视神经缺血产生的疾病。根据定义，ION定义为眼前病变如果存在急性视神经盘水肿，表明最接近眼球的一部分视神经梗死。缺血性视神经病变也可是眼后，位于眼球的背后几厘米。缺血性视神经病变通常只发生在60岁以上的人。多数病例是非动脉炎性和可归因于视神经灌注动脉粥样硬化、糖尿病或高血压的影响。颞动脉炎导致约有5％的病例(动脉性ION)。
症状和体征是突然、部分或完全丧失视力，伴随着视盘肿胀，而且往往出血。视野缺损可能表现为丧失一半的横向划分视野或有中央或中心外(环绕生理盲点)盲点。视力下降紧接着视盘苍白。更有效治疗上述疾病和病症的疗法，将有很大的治疗价值。
发明概述
本发明提供新TP53BP2、LRDD、CYBA、CASP2、NOX3、HRK、RAC1、RHOA和DUOX1 siRNA，以及新的化学和/或结构修饰的siRNA化合物，以抑制一般基因表达和特别是哺乳动物基因TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、NOX3、HRK、CIQBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、RAC1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、CX43、TYROBP、CTGF、SPP1、RHOA和DUOX1的表达。(关于基因的详情参见以下表A)。
进一步提供具有有利性质并可应用于任何靶序列的siRNA，特别是在此公开的siRNA寡核苷酸，的新双链寡核苷酸结构。本发明所公开的化学修饰的siRNA基序在制备用于RNA干扰(RNAi)的稳定和活性化合物中是有用的。
本发明还提供包括一种或多种所述寡核苷酸的药物组合物。本发明进一步涉及在需要其的受试者中治疗或预防疾病或病症的发病率或严重程度的方法，其中所述疾病或病症和/或与之相关的症状与靶基因的表达相关。在一些实施方案中所述疾病或病症选自由听力损失，急性肾功能衰竭(ARF)，青光眼，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及其他急性肺和呼吸损伤，肺移植后缺血再灌注损伤，眼缺血病症，器官移植包括肺、肝脏、心脏、胰腺和肾脏移植，肾毒性和神经毒性，脊髓损伤，压疮，年龄相关性黄斑变性(AMD)，干眼综合征，口腔粘膜炎，缺血性眼神经病变(ION)和慢性阻塞性肺病(COPD)组成的组。该方法涉及给需要所述治疗的哺乳动物施用预防或治疗有效量的一种或多种所述化合物，其抑制或降低至少一种所述基因的表达或活性。
因此，本发明一方面提供新寡核苷酸序列用于抑制选自LRDD、CYBA、CASP2、NOX3、HRK、RAC1、RHOA和DUOX1的基因，所述基因的mRNA多核苷酸序列分别如SEQ ID NOS：1-2、3-5、6、10-11、12、13、24-26、46和47-48所示。表D(D1-D34)提供本发明的19、21和23-mer有义寡核苷酸和相应的反义寡核苷酸。本发明的另一方面提供用于抑制一般基因表达或选自TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、NOX3、HRK、CIQBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、RAC1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、CX43、TYROBP、CTGF、SPP1、RHOA或DUOX1的基因的基因表达的化学和/或结构修饰的核酸化合物。在不同实施方案中修饰的化合物包含存在于表B(B1-B74)和C(C1-C3)的如SEQ ID NOS：97-68654所示的寡核苷酸序列(在美国序列号11/978,089和PCT专利申请号PCT/IL 2007/001278中公开，在此通过引用整体并入)。
在某些实施方案中，化学和/或结构修饰的siRNA化合物包含存在于表D(D1-D34；SEQ ID NOS：68，655-87，088)的寡核苷酸序列。
本发明一方面提供化合物，该化合物具有如下所列的结构(A)：
(A) 5′(N)x-Z        3′(反义链)
    3′Z′-(N′)y    5′(有义链)
其中N和N′中的每一个是选自以下的核苷酸：未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续的N或N′通过共价键与下一个N或N′连接的寡核苷酸；
其中x和y中的每一个是介于18和40之间的整数；
其中Z和Z′中的每一个可存在或不存在，但是如果存在，则是共价连接到其所存在的链的3′末端的1-5个连续核苷酸；
其中(N)x的序列包括存在于表D(D1-D34)中的一个或多个反义序列。
在某些实施方案中，(N)x和(N′)y完全互补。在其他实施方案中(N)x和(N′)y基本上互补。在某些实施方案中(N)x与靶序列完全互补，在其他实施方案中(N)x与靶序列基本上互补。根据某些优选实施方案本发明提供siRNA化合物，该siRNA化合物包含一个或多个修饰的核苷酸，其中修饰的核苷酸在糖基部分、碱基部分或核苷酸间键合部分具有修饰。
本发明一方面提供化合物，该化合物具有如下所列的结构(IX)：
(IX)5′(N)x-Z        3′(反义链)
    3′Z′-(N′)y-z″5′(有义链)
其中N和N′中的每一个为可以是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续的N或N′通过共价键与下一个N或N′连接的寡核苷酸；
其中Z和Z′可存在或不存在，但是如果存在，则独立地是共价连接到其所存在的链的3′末端的1-5个连续核苷酸；
其中z″可存在或不存在，但是如果存在，则是共价连接到(N′)y的5′末端的加帽部分；
其中x＝18到27；
其中y＝18到27；
其中(N)x包含修饰的和未修饰的核糖核苷酸，每个修饰的核糖核苷酸在其糖基上具有2′-O-甲基，其中在(N)x的3′末端的N是修饰的核糖核苷酸，(N)x包含从3′末端开始的至少5个交替的修饰的核糖核苷酸和共计至少9个修饰的核糖核苷酸，并且每个剩余的N是未修饰的核糖核苷酸；
其中在(N′)y中存在至少一个非常规部分，该非常规部分可能是脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、修饰的或未修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸，和通过2′-5′核苷酸间磷酸键与相邻核苷酸连接的核苷酸；和
其中(N)x的序列与(N′)y的序列基本上互补；并且(N′)y的序列与靶基因编码的mRNA的序列基本上相同。
在一些实施方案中x＝y＝19。在其他实施方案中x＝y＝23。在一些实施方案中至少一个非常规部分存在于(N′)y中的位置15、16、17或18。在一些实施方案中所述非常规部分选自镜像核苷酸、脱碱基核糖部分和脱碱基脱氧核糖部分。在一些优选实施方案中所述非常规部分是镜像核苷酸，优选L-DNA部分。在一些实施方案中L-DNA部分位于位置17，位置18或位置17和18。
在其他实施方案中所述非常规部分是脱碱基部分。在不同实施方案中(N′)y包含至少5个脱碱基核糖部分或脱碱基脱氧核糖部分。
在又其他实施方案中(N′)y包含至少5个脱碱基核糖部分或脱碱基脱氧核糖部分，并且至少1个N′是LNA。
在结构(IX)的一些实施方案中，(N)x包含9个交替的修饰的核糖核苷酸。在结构(IX)的其他实施方案中(N)x包含9个交替的修饰的核糖核苷酸，还包含位于位置2的2′O修饰的核苷酸。在一些实施方案中(N)x包含位于奇数位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19的2′O Me修饰的核糖核苷酸。在其他实施方案中(N)x还包含位于位置2和18中一个或两个位置的2′O Me修饰的核糖核苷酸。在又其他实施方案中(N)x包含位于位置2、4、6、8、11、13、15、17、19的2′O Me修饰的核糖核苷酸。
在不同实施方案中z″存在，并且选自脱碱基核糖部分、脱氧核糖部分、反向脱碱基核糖部分、脱氧核糖部分、C6-氨基-Pi、镜像核苷酸。
本发明另一方面提供化合物，该化合物具有如下所列的结构(X)：
(X) 5′(N)x-Z        3′(反义链)
    3′Z′-(N′)y-z″5′(有义链)
其中N和N′中的每一个为可以是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续的N或N′通过共价键与下一个N或N′连接的寡核苷酸；
其中Z和Z′可存在或不存在，但是如果存在，则独立地是共价连接到其所存在的链的3′末端的1-5个连续核苷酸；
其中z″可存在或不存在，但是如果存在，则是共价连接到(N′)y的5′末端的加帽部分；
其中x＝18到27；
其中y＝18到27；
其中(Nx包括修饰的或未修饰的核糖核苷酸，和任选地至少一个非常规部分；
其中在(N′)y中存在至少一个非常规部分，该非常规部分可以是脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、修饰的或未修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸，和非碱基配对的核苷酸类似物或通过2′-5′核苷酸间磷酸键与相邻核苷酸连接的核苷酸；和
其中(N)x的序列与(N′)y的序列基本上互补；并且(N′)y的序列与靶基因编码的mRNA的序列基本上相同。
在一些实施方案中x＝y＝19。在其他实施方案中x＝y＝23。在一些优选实施方案中(N)x包含修饰的和未修饰的核糖核苷酸，和至少一个非常规部分。在不同实施方案中(N)x包含与所述mRNA互补的少于15个连续核苷酸。
在一些实施方案中，位于(N)x的3′末端的N是修饰的核糖核苷酸，并且(N)x包括至少8个修饰的核糖核苷酸。在其他实施方案中所述至少8个修饰的核糖核苷酸中的至少5个交替开始于3′端。在一些实施方案中(N)x包含位于位置5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15之一的脱碱基部分。
在一些实施方案中，(N′)y中的所述至少一个非常规部分位于位置15、16、17或18。在一些优选实施方案中所述非常规部分选自镜像核苷酸，优选L-DNA部分。在一些实施方案中L-DNA部分位于位置17，位置18或位置17和18。在其他实施方案中，(N′)y中的所述至少一个非常规部分是脱碱基核糖部分或脱碱基脱氧核糖部分。在某些实施方案中，(N)x和(N′)y之间有少于15个碱基对。
在结构(X)的不同实施方案中z″存在，并且选自脱碱基核糖部分、脱氧核糖部分、反向脱碱基核糖部分、脱氧核糖部分、C6-氨基-Pi、镜像核苷酸。
在另一方面本发明提供化合物，该化合物具有如下所列的结构(XI)：
(XI) 5′ (N)x-Z       3′(反义链)
     3′Z′-(N′)y-z″5′(有义链)
其中N和N′中的每一个为可以是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续的N或N′通过共价键与下一个N或N′连接的寡核苷酸；
其中Z和Z′可存在或不存在，但是如果存在，则独立地是共价连接到其所存在的链的3′末端的1-5个连续核苷酸；
其中z″可存在或不存在，但是如果存在，则是共价连接到(N′)y的5′末端的加帽部分；
其中x＝18到27；
其中y＝18到27；
其中(N)x包含修饰的或者未修饰的核糖核苷酸和非常规部分的组合，任何修饰的核糖核苷酸在其糖基上具有2′-O-甲基；
其中(N′)y包含修饰的或者未修饰的核糖核苷酸和任选地非常规部分，任何修饰的核糖核苷酸在其糖基上具有2′OMe；
其中(N)x的序列与(N′)y的序列基本上互补；并且(N’)y的序列与靶基因编码的mRNA的序列基本上相同；其中存在与所述mRNA互补的少于15个连续核苷酸。
在一些实施方案中x＝y＝19。在其他实施方案中x＝y＝23。在一些优选实施方案中所述至少一个优选的非常规部分存在于(N)x中，并且是脱碱基核糖部分或脱碱基脱氧核糖部分。在其他实施方案中，所述至少一个非常规部分存在于(N)x，并且是非碱基配对的核苷酸类似物。在不同实施方案中(N)x包含与所述mRNA互补的少于15个连续核苷酸。在不同实施方案中(N′)y包含未修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中(N)x包含至少5个脱碱基核糖部分或脱碱基脱氧核糖部分或其组合。在某些实施方案中(N)x和/或(N′)y包含不与(N′)y和/或(N)x中相应的修饰的或未修饰的核糖核苷酸碱基配对的修饰的核糖核苷酸。
结构(IX)，(X)和(XI)基序用于针对哺乳动物或非哺乳动物基因的任何寡核苷酸对(有义和反义链)。在一些实施方案中哺乳动物基因是人类基因。在不同实施方案中人类基因的mRNA如SEQ ID NOS：1-41，46-48之一所示。
在一些实施方案中结构(IX)、(X)和(XI)基序与表B(B1-B74)，C(C1-C3C4)和表D(D1-D34)(SEQ ID NOS：97-87，178)所示的寡核苷酸对组合使用。
在不同实施方案中本发明提供有结构(IV)所列的siRNA：
(IV) 5′(N)x-Z        3′(反义链)
     3′Z′-(N′)y    5′(有义链)
其中N和N′中的每一个是选自以下的核苷酸：未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸，未修饰的脱氧核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续的N或N′通过共价键与下一个N或N′连接的寡核苷酸；
其中Z和Z′不存在；
其中x＝y＝19；
其中在(N′)y中位置15、16、17、18和19的至少一个位置的核苷酸包含选自以下的核苷酸：脱碱基假核苷酸、镜像核苷酸、脱氧核糖核苷酸和通过2′-5′核苷酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸；
其中(N)x包含交替的修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸，每个修饰的核糖核苷酸经修饰使得在其糖基上具有2′-O-甲基，并且位于(N)x的中间位置的核糖核苷酸是修饰的或未修饰的，优选地未修饰的；和
其中(N)x的序列与(N′)y的序列基本上互补；并且(N′)y的序列与靶基因的mRNA基本上相同。
在结构(IV)的一些实施方案中，位于(N′)y的位置17和18中一个或两个位置的核苷酸包含选自以下的核苷酸：脱碱基假核苷酸、镜像核苷酸和通过2′-5′核苷酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸。在一些实施方案中镜像核苷酸选自L-DNA和L-RNA。在不同实施方案中镜像核苷酸是L-DNA。
在不同实施方案中(N′)y包含位于位置15的修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸选自镜像核苷酸和脱氧核糖核苷酸。
在某些实施方案中(N′)y还包含位于位置2的修饰的核苷酸或者假核苷酸，其中假核苷酸可能是脱碱基假核苷酸类似物，并且修饰的核苷酸任选地是镜像核苷酸。
在不同实施方案中反义链(N)x包含位于奇数位置(从5′到3′；位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19)的2′O-Me修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中(N)x还包含位于位置2和18中一个或两个位置的2′O-Me修饰的核糖核苷酸。在其他实施方案中(N)x包含在位置2、4、6、8、11、13、15、17、19的2′O Me修饰的核糖核苷酸。
考虑了结构(IV)、(IX)和(X)的其他实施方案，其中x＝y＝21或其中x＝y＝23；在这些实施方案中，对上文论述过的(N′)y修饰不是在位置17和18而是在21-mer寡核苷酸的位置19和20以及23-mer寡核苷酸的位置21和22；类似地，在位置15、16、17、18或者19的修饰为在21-mer寡核苷酸的位置17、18、19、20或21和23-mer寡核苷酸的位置19、20、21、22、或23。反义链上的2′O Me修饰做出类似的调整。在一些实施方案中(N)x包含在奇数位置(5′到3′，21-mer寡核苷酸的位置1、3、5、7、9、12、14、16、18、20[位置11的核苷酸未修饰]和23-mer寡核苷酸的位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23[位置12的核苷酸未修饰])的2′O Me修饰的核糖核苷酸。在其他实施中(N)x包含在21-mer寡核苷酸的位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、20[位置11的核苷酸未修饰]和23-mer寡核苷酸的位置2、4、6、8、10、13、15、17、19、21、23[位置12的核苷酸未修饰]的2′O Me修饰的核糖核苷酸。
在一些实施方案中(N′)y还包含5′末端加帽核苷酸。在不同实施方案中末端加帽部分选自脱碱基假核苷酸类似物、反向脱碱基假核苷酸类似物、L-DNA核苷酸和C6-亚胺磷酸酯。
结构(IV)基序用于针对哺乳动物或非哺乳动物基因的任何寡核苷酸对(有义和反义链)。在一些实施方案中哺乳动物基因是人类基因。在不同实施方案中人类基因的mRNA如SEQ ID NOS：1-41，46-48之一所示。
在一些实施方案中结构(IV)基序与表B(B1-B74)、C(C1-3C4)和表D(D1-D34)(SEQ ID NOS：97-87，178)所示的寡核苷酸对组合使用。
在其他实施方案中本发明提供化合物，该化合物具有如下所列的结构V：
5′(N)x-Z  3′(反义链)
3′Z′-(N′)y    5′(有义链)
其中N和N′中的每一个选自假核苷酸和核苷酸；
其中每个核苷酸选自未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续的N或N′通过共价键与下一个N或N′连接的寡核苷酸；
其中Z和Z′不存在；
其中x＝18到27；
其中y＝18到27；
其中(N)x的序列与(N′)y的序列基本上互补；并且(N′)y的序列与靶基因的mRNA基本上相同；
其中至少一个N选自脱碱基假核苷酸、非配对的核苷酸类似物和(N)x的位置中与靶基因mRNA错配的核苷酸，而使(N)x包含与靶基因mRNA互补的少于15个连续核苷酸。
在其他实施方案中本发明提供双链化合物，该双链化合物具有如下所列的结构(VI)：
(VI)5′(N)x-Z  3′(反义链)
3′Z′-(N′)y    5′(有义链)
其中N和N′中的每一个是选自以下的核苷酸：未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续的N或N′通过共价键与下一个N或N′连接的寡核苷酸；
其中Z和Z′不存在；
其中x和y中的每一个是介于18和40之间的整数；
其中(N)x的序列与(N′)y的序列基本上互补；并且(N′)y的序列与靶基因的mRNA基本上相同；
其中(N)x、(N′)y或(N)x和(N′)y包含非碱基配对的修饰的核苷酸，而使(N)x和(N′)y在双链化合物中形成小于15个碱基对。
在其他实施方案中本发明提供化合物，该化合物具有如下所列的结构(VII)：
(VII)5′(N)x-Z        3′(反义链)
     3′Z′-(N′)y    5′(有义链)
其中每个N是选自以下的核苷酸：未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中每个N′是选自六元糖核苷酸、七元糖核苷酸、吗啉代部分、肽核酸及其组合的核苷酸类似物；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续的N或N′通过共价键与下一个N或N′连接的寡核苷酸；
其中Z和Z′不存在；
其中x和y中的每一个是介于18和40之间的整数；
其中(N)x的序列与(N′)y的序列基本上互补；并且(N′)y的序列与靶基因的mRNA基本上相同。
在其他实施方案中本发明提供化合物，该化合物具有如下所列的结构(VIII)：
(VIII)  5′(N)x-Z        3′(反义链)
        3′Z′-(N′)y    5′(有义链)
其中N和N′中的每一个是选自以下的核苷酸：未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续的N或N′通过共价键与下一个N或N′连接的寡核苷酸；
其中Z和Z′不存在；
其中x和y中的每一个是介于18和40之间的整数；
其中(N)x或(N′)y内部位置的一个N或N′，或位于(N)x或(N′)y的末端位置的一个或多个N或N′包含脱碱基部分或2′修饰的核苷酸；
其中(N)x的序列与(N′)y的序列基本上互补；并且(N′)y的序列与靶基因的mRNA基本上相同。
在结构(V)-(VIII)的一些实施方案中，(N)x包含交替的修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸；每个修饰的核糖核苷酸经修饰使得其糖基上具有2′-O-甲基。在一些实施方案中位于(N)x中间位置的N是未修饰的。
在结构(IV)的一些实施方案中，(N′)y的位置17和18中的一个或两个位置的核苷酸包含选自以下的核苷酸：脱碱基假核苷酸、镜像核苷酸和通过2′-5′核苷酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸。在一些实施方案中镜像核苷酸选自L-DNA和L-RNA。在不同实施方案中镜像核苷酸是L-DNA。
在不同实施方案中(N′)y包含位于位置15的修饰的核苷酸，其中修饰的核苷酸选自镜像核苷酸和脱氧核糖核苷酸。
在某些实施方案中(N′)y还包含位于位置2的修饰的核苷酸，其中修饰的核苷酸选自镜像核苷酸和脱碱基假核苷酸类似物。
在不同实施方案中反义链(N)x包括位于奇数位置(5′到3′；位置1、3，5、7、9、11、13、15、17、19)的2′O-Me修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中(N)x还包含位于位置2和18中的一个或两个位置的2′O-Me修饰的核糖核苷酸。在其他实施方案中(N)x包括位于位置2、4、6、8、11、13、15、17、19的2′O Me修饰的核糖核苷酸。
考虑了结构(IV)的其他实施方案，其中x＝y＝21或其中x＝y＝23；在这些实施方案中，对上文论述过的(N′)y修饰不是在位置17和18而是在21-mer寡核苷酸的位置19和20以及23-mer寡核苷酸的位置21和22；类似地位置15、16、17、18或19的修饰为21-mer寡核苷酸的位置17、18、19、20或21和23-mer寡核苷酸的位置19、20、21、22或23。反义链上的2′O Me修饰做类似调整。在一些实施方案中(N)x包含在奇数位置(5′到3′；21-mer寡核苷酸的位置1、3、5、7、9、12、14、16、18、20[位置11的核苷酸未修饰]和23-mer寡核苷酸的位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23[位置12的核苷酸未修饰]的2′O Me修饰的核糖核苷酸。在其他实施方案中(N)x包含在21-mer寡核苷酸的位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、20[位置11的核苷酸未修饰]和23-mer寡核苷酸的位置2、4、6、8、10、13、15、17、19、21、23[位置12的核苷酸未修饰]的2′O Me修饰的核糖核苷酸。
在一些实施方案中(N′)y还包含5′末端加帽核苷酸。在不同实施方案中末端加帽部分选自脱碱基假核苷酸类似物、反向脱碱基假核苷酸类似物、L-DNA核苷酸和C6-亚胺磷酸酯。
结构(IV)基序用于针对哺乳动物或非哺乳动物基因的任何寡核苷酸对(有义和反义链)。在一些实施方案中哺乳动物基因是人类基因。在不同实施方案中人类基因的mRNA如SEQ ID NOS：1-41，46-48之一所示。
在一些实施方案中结构(IV)基序与表B(B1-B74)、C(C1-C4)和表D(D1-D34)中所示的寡核苷酸对组合使用。
本发明的第二方面提供基于本文公开的结构(C)-(H)以及相关结构(I)-(XI)的化学和/或结构修饰的siRNA化合物。在不同实施方案中siRNA化合物基于表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和/或表D(D1-D34)所示的有义寡核苷酸和相应的反义寡核苷酸中的一个。
本发明的另一方面提供药物组合物，其包含有效抑制人类基因表达的量的本发明的修饰的或未修饰的化合物和药学上可接受的载体，其中该化合物包含存在于表D(D1-D34)的反义序列，(N)x。
本发明又一方面提供药物组合物，其包含有效抑制人类基因表达的量一种或多种本发明的修饰的化合物和药学上可接受的载体，其中该化合物包含表B(B1-B74)或表C(C1-C4)和/或表D(D1-D34)所示的反义序列，(N)x。
本发明另一个方面涉及给需要治疗的受试者治疗与基因表达相关的疾病或病症和/或与该疾病或病症相关的症状的方法，其中所述基因的miRNA多核苷酸序列如SEQ ID NOS：1-41，46-48中的任一个所示，所述方法包括给受试者施用治疗有效剂量的量的根据本发明的siRNA从而治疗受试者。
更具体地，本发明提供用于治疗患有急性肾功能衰竭(ARF)，听力损失，青光眼，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及其他急性肺和呼吸损伤，器官移植包括肺、肾、骨髓、心脏、胰腺、角膜或肝脏移植损伤(例如缺血再灌注损伤)和包括移植物功能延迟(DGF)肾毒性，脊髓损伤，压疮，干眼综合征，口腔粘膜炎，缺血性视神经病变(ION)和慢性阻塞性肺病(COPD)的受试者的方法和组合物。
本发明的方法包含给受试者施用抑制基因表达的一种或多种siRNA化合物，其中所述基因的mRNA多核苷酸序列如SEQ ID NOS：1-41，46-48中的任一个所示。在此公开的新结构，当整合到任何靶基因的反义和相应有义核酸序列时提供siRNA化合物，所述siRNA化合物用于降低靶基因表达。靶基因是哺乳动物或者非哺乳动物基因。在特定实施方案中，靶基因是具有选自SEQ ID NOS：1-41，或46-48中的任一个的mRNA的哺乳动物基因。
转让给本发明的受让人的PCT公布号WO2008/050329中公开了如表B和C所示的有义和相应反义核苷酸序列，该公布在此通过引用整体并入。
本发明排除序列和修饰均已知的siRNA化合物。
附图简述
图1A和1B呈现了19-mer siRNA结构和用本发明的2′-O-甲基化化合物得到的实验结果；
图2显示了在有义链和反义(AS)链上都具有交替甲基化模式的23-mer siRNA化合物的实例；
图3A和3B呈现了包含2′-O甲基化单体的23-mer CASP2siRNA结构和用这些化合物得到的实验结果；
图4A和4B呈现了包含2′-O甲基化单体的23-mer CASP2siRNA结构和用这些化合物得到的实验结果；
图5A和5B呈现了包含2′-O甲基化单体的23-mer CASP2siRNA结构和用这些化合物得到的实验结果；
图6A和6B呈现了包含2′5′桥接核苷酸的19-mer QM5(靶向p53)siRNA结构和用这些化合物得到的实验结果；
图7A和7B呈现了包含2′5′桥接核苷酸的19-mer CASP2siRNA结构和用这些化合物得到的实验结果；
图8A和8B分别呈现了包含2′5′桥接核苷酸的19-mer REDD2和QM5siRNA结构。
图9A和9B呈现了包含2′5′桥接核苷酸(星号)和2′-O甲氧基核糖核苷酸(粗体，下划线)的组合的19-mer QM5siRNA结构，和图9C-9E显示了这些化合物的活性。
图10A和10B呈现了包含2′5′桥接核苷酸(星号)和2′-O甲氧基核糖核苷酸(粗体，下划线)的组合的19-mer QM5siRNA结构和用这些化合物得到的实验结果。图10C和10D显示了血清稳定性结果；
图11A和11B呈现了包含2′5′桥接核苷酸(星号)和2′-O甲氧基核糖核苷酸(粗体，下划线)的组合的23-mer CASP2siRNA结构，及用这些化合物得到的实验结果；
图12A和12B呈现了包含2′5′桥接核苷酸(星号)的23-mer CASP2siRNA结构和用这些化合物得到的实验结果；
图13A显示了包含L-DNA核苷酸的QM5siRNA结构；和图13B显示了用这些化合物得到的实验结果；图13C显示了血清稳定性，和图13D显示了包含L-DNA核苷酸的siRNA与包含交替2′甲氧基模式的siRNA相比的IC50值；
图14A显示了包含LNA核苷酸的QM5siRNA结构；而图14B显示了用这些化合物得到的实验结果；
图15显示了串联siRNA化合物的实例及其血清稳定性结果；
图16显示了星形(star)siRNA化合物的实例及其血清稳定性结果；
图17A-17C显示了包含修饰组合的siRNA化合物的实例；
图18描述了RNA/DNA嵌合寡核苷酸；
图19A-19D显示了包含单独的或与附加修饰组合的L-DNA基序的寡核苷酸的实例；
图20描述了在制备根据本发明的双链体化合物中有用的另外的寡核苷酸结构；
图21举例说明了用于本文详述的各种结构的非碱基配对的核苷酸单体的实例；
图22提供了本发明中用作5′加帽结构的C6-氨基-磷酸(C6-氨基-Pi)部分的化学结构的图像；
图23提供了用于RNAi的包含根据本发明序列和结构基序的化合物表。
发明详述
本发明总体上涉及下调各种基因的表达的化合物，特别地涉及新的小干扰RNA(siRNA)以及这些新siRNA在治疗遭受各种医学病症的受试者中的应用。
因此，本发明一方面提供用于抑制选自LRDD、CYBA、CASP2、NOX3、HRK、RAC1、RHOA和DUOX1的基因的新寡核苷酸序列，所述基因的mRNA多核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-2、3-5、6、10-11、12、13、24-26、46和47-48所示。寡核苷酸序列呈现于表D(D1-D34)，其中有义链与互补的反义链配对。还提供了在针对任何靶基因的siRNA的制备中有用的新结构基序。表B(B1-B74)、C(C1-C4)和D(D1-D34)提供了本发明使用的优选siRNA的列表。对于每个基因有19-mer，21-mer和23-mer序列的独立表，所述序列基于它们在专有性算法中作为靶向人类基因表达的最佳序列的得分按优先次序列出。
在此详细讨论了抑制本发明基因的分子和组合物，并且所述分子和/或组合物的任一个可有益地用于遭受所述病症的任一种的受试者的治疗。
本发明的siRNA化合物具有可例如增强活性，增加稳定性，和/或最小化毒性的结构和修饰；本发明的新修饰siRNAs有益地应用于在预防或削弱靶基因表达中有用的双链RNA，特别地是此处论述的靶基因。
在下面的表A中呈现了某些靶基因和优选的适应症的详情。
表A：本发明的靶基因
  序号   基因   全称和人类基因ID   优选的疾病/病症
  1   TP53BP2   肿瘤蛋白p53结合蛋白，2gi|112799848|ref|NM_001031685.2(SEQ ID NO：1)gi|112799845|ref|NM_005426.2(SEQ ID NO：2)：  ARF、肾毒性、青光眼、干眼、ION、DGF、肾移植、听力损失、声损伤、口腔粘膜炎
  2   LRDD   含有富含亮氨酸重复序列和死亡结构域gi|61742781|ref|NM_018494.3(SEQ ID NO：3)gi|61742783|ref|NM_145886.2(SEQ ID NO：4)gi|61742785|ref|NM_145887.2(SEQ ID NO：5)   ARF、青光眼、听力损失、SCI、口腔粘膜炎；干眼、肾或肺移植、ION、缺血再灌注肺损伤
  序号   基因   全称和人类基因ID   优选的疾病/病症
  3   CYBA   细胞色素b-245，α多肽gi|68509913|ref|NM_000101.2|(SEQ ID NO：6)   ARF、ARDS、听力损失、SCI、青光眼、肾移植、肺移植和缺血再灌注肺损伤、ION
  4   ATF3   激活转录因子3gi|95102484|ref|NM_001030287.2|(SEQ ID NO：7)gi|71902534|ref|NM_001674.2|(SEQ ID NO：8)gi|95102480|ref|NM_004024.4|(SEQ ID NO：9)   ARF、青光眼、听力损失、SCI、口腔粘膜炎
  5   CASP2   半胱天冬酶2，凋亡相关半胱氨酸肽酶gi|39995058|ref|NM_032982.2(SEQ ID NO：10)gi|39995060|ref|NM_032983.2(SEQ ID NO：11)   ARF、青光眼、听力损失、SCI、干眼、肾移植、肺移植和缺血再灌注肺损伤、口腔粘膜炎，ION
  6   NOX3   NADPH氧化酶3Gi|11136625|ref|NM_015718.1(SEQ ID NO：12)   听力损失、声损伤
  7   HRK   harakirigi|4504492|ref|NM_003806.1(SEQ ID NO：13)   ARF、青光眼、听力损失、SCI、ARDS、ION
  8   C1QBP   补体成分1，q子成分结合蛋白gi|28872801|ref|NM_001212.3(SEQ ID NO：14)   ARF、COPD、听力损失、脊髓损伤、压疮
  9   BNIP3   BCL2/腺病毒E1B 19kD-相互作用蛋白3Gi|7669480|ref|NM_004052.2(SEQ ID NO：15)   ARF、青光眼、听力损失、声损伤、ION、SCI、ARDS、COPD、移植(肺)和缺血再灌注肺损伤
  序号   基因   全称和人类基因ID   优选的疾病/病症
  10   MAPK8   丝裂原激活蛋白激酶8gi|20986493|ref|NM_002750.2(SEQ ID NO：16)gi|20986522|ref|NM_139049.1(SEQ ID NO：17)gi|20986518|ref|NM_139046.1(SEQ ID NO：18)gi|20986520|ref|NM_139047.1(SEQ ID NO：19)   ARF、青光眼、听力损失、SCI、ARDS
  11   MAPK14   丝裂原激活蛋白激酶14gi|20986511|ref|NM_139012.1(SEQ ID NO：20)gi|20986515|ref|NM_139014.1(SEQ ID NO：21)gi|4503068|ref|NM_001315.1(SEQ ID NO：22)gi|20986513|ref|NM_139013.1(SEQ ID NO：23)   ARF、青光眼、听力损失、SC、ARDS
  12   Rac1   Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1(rho家族，小GTP结合蛋白)gi|38505164|ref|NM_198829.1(SEQ ID NO：24)gi|156071511|ref|NM_018890-3(SEQ ID NO：25)gi|156071503|ref|NM_006908.4(SEQ ID NO：26)   ARF、青光眼、听力损失、声损伤、SCI、ARDS、AMD、压疮，肺移植和缺血再灌注肺损伤
  13   GSK3B   糖原合酶激酶3βgi|21361339|ref|NM_002093.2(SEQ ID NO：27)   ARF、听力损失、SCI、COPD、压疮、ARDS、移植
  序号   基因   全称和人类基因ID   优选的疾病/病症
  14   P2RX7   嘌呤能受体P2X，配体门控离子通道，7gi|34335273|ref|NM_002562.4(SEQ ID NO：28)   ARF、听力损失、SCI、COPD、压疮、ARDS、移植
  15   TRPM2   瞬时受体电位阳离子通道，亚家族M，成员2gi|67906811|ref|NM_001001188.3(SEQ ID NO：29)gi|67906812|ref|NM_003307.3(SEQ ID NO：30)   ARF、听力损失、SCI、COPD、压疮、ARDS、移植
  16   PARG   聚(ADP-核糖)糖原水解酶gi|70610135|ref|NM_003631.2(SEQ ID NO：31)   ARF、听力损失、SCI、COPD、压疮、ARDS、移植
  17   CD38   CD38分子Gi|38454325|ref|NM_001775.2(SEQ ID NO：32)   ARF、听力损失、SCI、COPD、压疮
  18   STEAP4   STEAP家族成员4Gi|13375867|ref|NM_024636.1(SEQ ID NO：33)   ARF、听力损失，SCI，COPD，压疮
  19   BMP2   骨形态发生蛋白2gi|80861484|ref|NM_001200.2(SEQ ID NO：34)   ARF、听力损失、SCI、COPD、压疮
  序号   基因   全称和人类基因ID   优选的疾病/病症
  20   GJA1   间隙连接蛋白，α1，43kDagi|4755136|ref|NM_000165.2(SEQ ID NO：35)   ARF、听力损失、SCI、COPD、压疮
  21   TYROBP   TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白gi|38157998|ref|NM_003332.2(SEQ ID NO：36)gi|38158004|ref|NM_198125.1(SEQ ID NO：37)   ARF、听力损失、SCI、COPD、压疮
  22   CTGF   结缔组织生长因子gi|4503122|ref|NM_001901.1(SEQ ID NO：38)   ARF、听力损失、SCI、COPD
  23   SPP1   分泌磷蛋白1gi|91206461|ref|NM_001040058.1(SEQ ID NO：39)gi|38146097|ref|NM_000582.2(SEQ ID NO：40)gi|91598938|ref|NM_001040060.1(SEQ ID NO：41)   ARF、青光眼、ARDS、骨关节炎
  24   RTN4R   浆膜蛋白(reticulon)4受体gi|47519383|ref|NM_023004.5(SEQ ID NO：42)   SCI
  25   ANXA2   膜联蛋白A2gi|50845387|ref|NM_001002858.1|(SEQ ID NO：43)gi|50845389|ref|NM_004039.2|(SEQ ID NO：44)gi|50845385|ref|NM_001002857.1(SEQ ID NO：45)   ARF、听力损失、SCI、COPD
  26   RHOA   Ras同源基因家族成员Agi|50593005|ref|NM_001664.2(SEQ ID NO：46)   SCI、青光眼、ION
  27   DUOX1   双氧化酶1gi|28872749|ref|NM_017434.3(SEQ ID NO：47)gi|28872750|ref|NM_175940.1(SEQ ID NO：48)   ARDS、COPD
ARDS：急性呼吸窘迫综合征；AMD：年龄相关性黄斑变性；COPD：慢性阻塞性肺病；ARF：急性肾功能衰竭；SCI：脊髓损伤；ION：缺血性眼神经病变.
表A提供如SEQ ID NO：1-48所示mRNA的多核苷酸序列的gi(GeneInfo identifier，基因信息标识符)和登录号。相应多肽如SEQ IDNO：49-96所示。下面详述前面表A所列的基因：
(1)肿瘤蛋白p53结合蛋白，2(TP53BP2)：
基因别名：BBP；53BP2；ASPP2；p53BP2；PPP1R13A，AI746547，X98550。
该基因编码p53相互作用蛋白的ASPP(p53凋亡刺激蛋白)家族成员。相应的蛋白含有参与蛋白-蛋白相互作用的4个锚蛋白重复序列和1个SH3结构域。该蛋白定位于细胞质核周区域，并且通过与其他调节分子包括p53家庭成员相互作用来调节凋亡和细胞生长。已经发现编码不同同种型的该基因的多个转录变体。人TP53BP2miRNA转录变体1和2的多核苷酸序列分别是SEQ ID NOS：1和2，并且其相应的多肽序列分别如SEQ IDNOS：49-50所示。
(2)含有富含亮氨酸重复序列和死亡结构域(LRDD)
基因别名：PIDD；MGC16925；DKFZp434D229，1200011D09Rik，AU042446
该基因编码的蛋白含有富含亮氨酸重复序列和死亡结构域(阿leucine-rich repeat and a death domain，LRDD)。已证明该蛋白与其他死亡结构域蛋白相互作用，如经由死亡结构域与Fas(TNFRSF6)缔合的(Fas(TNFRSF6)-associated via death domain，FADD)和含有激活MAP-激酶的死亡结构域蛋白(MAP-kinase activating death domain-containing protein，MADD)，并因此在细胞死亡相关信号过程中可作为接头蛋白起作用。已发现该基因的小鼠对应物的表达能被肿瘤抑制蛋白p53正向调节，并诱导响应于DNA损伤的细胞凋亡，提示该基因作为p53-依赖的细胞凋亡效应物的作用。已报道了编码不同同种型的3个可变剪接转录变体。人LRDD转录变体2、1和3的多核苷酸序列分别如SEQ ID NOS：3-5所示，其相应的多肽序列分别如SEQ ID NOS：51-53所示。
国际专利公布WO 01/18037公开了LRDD多核苷酸和多肽序列。国际专利公布WO 03/087368教导抑制基因的组合物和方法。
(3)细胞色素b-245，α多肽(CYBA)
基因别名：细胞色素b轻链；细胞色素b(558)α-亚基；细胞色素b，α多肽；黄细胞色素(flavocytochrome)b-558α多肽；p22-phox。
细胞色素b包含轻链(α)和重链(β)。该基因编码轻链，α亚基，其已被认为是吞噬细胞杀微生物氧化酶体系的主要组成成分。该基因的突变与常染色体隐性遗传性慢性肉芽肿病(CGD)有关，该疾病以激活的吞噬细胞不能产生超氧化物为特征，这对这些细胞的杀微生物活性是重要的。人类CYBA mRNA的多核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，并且其相应的多肽序列如SEQ ID NO：54所示。
国际专利公布WO2005/103297讲授了p22phox活性的调节。
(4)激活转录因子3(ATF3)
基因别名：ATF3deltaZip2；ATF3deltaZip2c；ATF3deltaZip3，LRG-21，LRF-I
ATF3是转录因子的哺乳动物激活转录因子/cAMP响应元件-结合(CREB)蛋白家族的成员。已发现该基因的多个转录变体，这些变体编码两种不同同种型。较长的同种型具有ATF结合元件，其抑制而不是激活启动子后的转录。较短的同种型(deltaZip 2)没有亮氨酸拉链蛋白-二聚化基序，不能结合到DNA，推测其通过使抑制性辅因子远离启动子来激活转录。可变剪接可能在靶基因调节中有生理学上的重要作用。人类ATF3转录变体3、1和2的多核苷酸序列分别如SEQ ID NOS：7-9所示，并且相应的多肽序列分别如SEQ ID NOS：55-57所示。
美国专利公布号2003/0125277教导了ATF3的反义。国际专利公布号WO2005/103297涉及治疗神经元疾病的方法。
(5)半胱天冬酶2，凋亡相关半胱氨酸肽酶(神经前体细胞表达的，发育下调2(CASP2)
基因别名：CASP-2，ICH-1L，ICH-1L/1S，ICH1，NEDD 2；ICH-1蛋白酶；NEDD 2凋亡调节基因；半胱天冬酶2，凋亡相关半胱氨酸蛋白酶。
该基因编码为半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(半胱天冬酶)家族成员的蛋白。半胱天冬酶的顺序激活在细胞凋亡的执行阶段起关键作用。半胱天冬酶作为非活性酶原存在，其经过在保守的天冬氨酸残基上的蛋白酶解加工产生大小二个亚基，所述二个亚基通过二聚化形成具有活性的酶。该蛋白的蛋白水解由多种凋亡刺激物诱导。该基因的可变剪接产生编码不同同种型的多个转录变体。人类CASP2转录变体1和3的多核苷酸序列分别如SEQ ID NOS：10-11所示，并且相应的多肽序列分别如SEQ ID NOS：58-59所示。
美国专利号6,083,735涉及Casp2的可变剪接产物。美国专利号5,929,042和7,223,856公开了用于神经退行性疾患治疗的特异性Casp2反义化合物。国际专利公布WO 02/024720教导了Casp 2反义。国际专利公布WO 02/034201公开了糖尿病性视网膜病的治疗方法；WO 03/05821涉及凋亡相关基因的抑制；WO 2004/009797教导了Casp 2反义链；和WO2004/103389涉及防止细胞死亡的方法。
(6)NADPH氧化酶3(NOX3)
基因别名：GP91-3，MGC124289，het，nmf250；NADPH氧化酶催化亚基-样3，NADPH氧化酶1；head-tilt
NADPH氧化酶，如NOX3，是在许多细胞类型中被发现的质膜相关酶。这些酶利用NADPH作为电子供体通过氧的1-电子还原催化超氧化物的产生。人类NOX 3mRNA的多核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，并且相应的多肽序列如SEQ ID NO：60所示。
国际专利公布号WO 2005/119251涉及治疗听力损失的方法。
(7)harakiri，BCL2相互作用蛋白(仅包含BH3结构域)(HRK)
基因别名：DP5，Bid3；BCL 2-相互作用蛋白质；凋亡激活因子Hrk；BH3相互作用(与BCL2家族)结构域，凋亡激动剂。
作为凋亡激活因子，Hrk通过与死亡阻遏蛋白Bcl-2和Bcl-X(L)相互作用调节凋亡。除了与BIK的BCL2同源性结构域-3(BH3)相类似的8-氨基酸区域之外，HRK蛋白质与其他BCL2家族成员没有明显同源性。HRK经BH3结构域与BCL2和BCLXL相互作用，而不与促进死亡的BCL2-相关蛋白BAX、BAK或BCLXS相互作用。HRK与先前报道的BCL2和BCLXL以相类似的模式定位于胞内细胞器的膜上。人HRK mRNA的多核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，并且相应的多肽序列如SEQ ID NO：61所示。
(8)补体成分1，q子成分结合蛋白(C1QBP)
基因别名：GC1QBP，HABP1，SF2p32，gC1Q-R，gC1qR，p32，RP23-83I13.1，AA407365，AA986492，D11Wsul82e，MGC91723，C1q球状结构域结合蛋白；透明质烷结合蛋白1；剪接因子SF2-相关蛋白。
人补体子成分C1q与C1r和C1s缔合以产生血清补体系统的第一成分。已知该基因编码的蛋白结合到C1q分子的球状头部，并抑制C1激活。该蛋白还被鉴别为前-mRNA剪接因子SF2的p32亚单位和透明质酸-结合蛋白。人C1QBP mRNA的多核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，并且相应的多肽序列如SEQ ID NO：62所示。
(9)BCL2/腺病毒E1B 19kD相互作用蛋白3(BNIP3)
基因别名：NIP3，MGC93043，BCL2/腺病毒E1B 19kD-相互作用蛋白3；线粒体产物的BCL2/腺病毒E1B19kDa-相互作用蛋白3核基因。
该基因是BCL2/腺病毒E1B 19kd-相互作用蛋白(BNIP)家族的成员。它与E1B 19kDa蛋白以及BCL2的E1B19kDa-样序列相互作用，E1B19kDa蛋白负责保护病毒-诱导的细胞死亡，BCL2的E1B19kDa-样序列也是凋亡保护者。所述基因包含BH3结构域和跨膜结构域，其与促凋亡功能有关。已知该基因编码的二聚线粒体蛋白即使在BCL2存在时也诱导细胞凋亡。人BNIP3mRNA的多核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，并且相应的多肽序列如SEQ ID NO：63所示。
美国专利号5,858,678涉及BNIP 3多核苷酸和多肽序列。国际专利公布号WO 2004/009780公开了防止缺血诱导的细胞损伤的方法。
(10)丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)
基因别名：JNK；JNK1；PRKM8；SAPK1；JNK1A2；JNK21B1/2；JNK1α蛋白激酶；c-Jun N-末端激酶1；丝裂原活化蛋白蛋白激酶8转录变体2；蛋白激酶JNK1；应激-激活蛋白激酶JNK1。
该基因编码的蛋白是MAP激酶家族成员。MAP激酶充当多种生物化学信号的集合点，且参与各式各样的细胞过程，如增殖、分化、转录调节和发育。该激酶由各种细胞刺激物激活，并靶向特定转录因子，因此响应于细胞刺激物介导极早期基因表达。已发现肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对该激酶的激活是肿瘤坏死因子-α诱导的凋亡所需要的。该激酶还参与紫外辐射诱导的凋亡，其被认为与细胞色素c-介导的细胞死亡路径有关。对该基因的小鼠对应物的研究提示其在T细胞增殖、凋亡和分化中的作用。已报道了4个编码不同同种型的可变剪接转录变体。MAPK8的转录变体2、1、3和4的多核苷酸序列分别如SEQ ID NOS：16-19所示，并且相应的多肽序列分别如SEQ ID NO：64-67所示。
国际专利公布WO 99/09214和美国专利号5,877,309公开了JNK家族成员的反义。
(11)丝裂原激活蛋白激酶14(MAPK14)
基因别名：CSBP1；CSBP2；CSPB1；EXIP；Mxi2；PRKM 14；PRKM15；RK；SAPK2A；p38；p38ALPHA；MGC 102436；p38MAPK；CSBP；Exip；Hog；MGC 105413；p38Hog；Csaids结合蛋白；MAP激酶Mxi2；MAX--相互作用蛋白2；细胞因子抑制性抗炎药结合蛋白；p38MAP激酶；p38有丝分裂原激活蛋白激酶；p38αExip；应激-激活蛋白激酶2A；tRNA合成酶辅因子p38。
该基因编码的蛋白是MAP激酶家族的成员，其充当多种生物化学信号的集成点，并参与各式各样的细胞代谢过程，如增殖、分化、转录调节和发育。该激酶由各种环境应激和促炎细胞因子激活。该激活需要经MAP激酶激酶(MKK)对其磷酸化，或经其与MAP3K7IP1/TAB1蛋白相互作用引发其自身磷酸化。该激酶的底物包括转录调节因子ATF2、MEF2C、和MAX，细胞周期调节因子CDC25B，和肿瘤抑制因子p53，这提示其在应激相关转录和细胞周期调节以及基因毒性应激响应中的作用。已报道了该基因编码不同同种型的4个可变剪接转录变体。人MAPK1转录变体2、4、1和3的多核苷酸序列分别如SEQ ID NOS：20-23所示，并且相应的多肽序列如SEQ ID NO：68-71所示。
国际专利公布WO 2000/59919和WO 2005/016947和美国专利号6,140,124和6,448,079教导了p38的反义抑制。
(12)Ras-相关C3肉毒杆菌毒素底物1(rho家族，小GTP结合蛋白Rac1；RAC1)
基因别名：MGC111543，MIG5，TC-25，p21-Rac1，迁移-诱导基因5；迁移-诱导蛋白5；ras-相关C3肉毒杆菌毒素底物1；rho家族，小GTP结合蛋白Rac1，ras-相关C3肉毒杆菌毒素底物1(rho家族小GTP结合蛋白Rac1)
该基因编码的蛋白是GTP酶，其属于小GTP-结合蛋白的RAS超家族。该超家族的成员调节多样化的细胞事件，包括控制细胞生长、重构细胞骨架和激活蛋白激酶。已描述过该基因的若干可变剪接转录变体，但是这些变体中的一些的全长性质还尚未确定。人RAC1转录变异体1c、1b和1的多核苷酸序列分别如SEQ ID NOS：24-26所示，并且相应的多肽序列如SEQ ID NO：72-74所示。
美国专利号6,180,597涉及增加内皮细胞氧化氮合酶水平的rho GTP酶抑制剂。国际专利公布WO 01/15739教导了Rho家庭成员的反义调节。国际专利公布WO 2004/042052教导了抑制TNF-α分泌的方法。
(13)糖原合酶激酶3β(GSK3B)
基因别名：7330414F15Rik，8430431H08Rik，C86142，GSK-3，GSK-3β，GSK3
糖原合酶激酶-3(GSK3)是脯氨酸指导的丝氨酸-苏氨酸激酶，该酶最初确定为磷酸化和灭活糖原合酶。有两种同种型，α(GSK3A；MIM606784)和β，显示出高度氨基酸同源性(Stambolic和Woodgett，BiochemJ.1994 303(Pt3)：701-4)。GSK3B参与能量代谢、神经细胞发育、和身体格局形成(Plyte等人，BiocbimBiophys Acta.1992.1114(2-3)：147-62)。人GSK3B mRNA的多核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示，并且相应的多肽序列如SEQ ID NO：75所示。
美国专利号6,323,029涉及GSK3B的反义抑制。
(14)嘌呤能受体P2X，配体门控离子通道，7(P2RX7)
基因别名：MGC20089，P2X7，AI467586；腺苷三磷酸受体；P2X嘌呤受体7；P2X7受体；P2Z受体；嘌呤能受体P2X7。
该基因的产物属于ATP的嘌呤受体家族。该受体具有配体门控离子通道功能，并通过形成能渗透大分子的膜孔引起巨噬细胞的ATP-依赖性溶解。细胞质中ATP对该核受体的激活可能是可借以将细胞活动与基因表达改变相偶联的机制。已经鉴定可编码不同的同种型的多种可变剪接变体，尽管一些符合无义介导的降解(NMD)标准。人P2RX7mRNA的多核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示，并且相应的多肽序列如SEQ ID NO：76所示。
(15)瞬时受体电位阳离子通道，亚族M，成员2(TRPM2)
基因别名：EREG1，KNP3，LTRPC2，MGC133383，NUDT9H，NUDT9L1，TRPC7，9830168K16Rik，C79133，Trp7，Trrp7；雌激素响应元件相关基因1；长瞬时受体电位通道2；瞬时受体电位通道7，瞬时受体电位阳离子通道，亚族M，成员2(Trpm2)；瞬时受体电位通道7；瞬时受体蛋白7。
该基因编码的蛋白是钙渗透性阳离子通道，其由游离的胞内ADP-核糖调节。该基因的编码蛋白通过氧化应激激活，并赋予对细胞死亡的易感性。人TRPM2的多核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示，并且相应的多肽序列如SEQ ID NO：77所示。(已发现该基因的编码不同同种型S和L的两种转录变体。S变体(SEQ ID NO：30)由于其含有序列错误并且不存在，所以被NCBI删除)。
(16)聚(ADP-核糖)糖原水解酶(PARG)
基因别名：PARG99；多聚(ADP-核糖)糖原水解酶
PARG是多聚(ADP-核糖)分解代谢的主要酶，是染色体蛋白的可逆共价-改性剂。发现该蛋白存在于许多组织中，并且可经蛋白水解生成更小的活性产物。人PARG mRNA的多核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示，并且相应的多肽序列如SEQ ID NO：79所示。
(17)CD38分子(CD38)
基因别名：T1O，Cd38-rs1；ADP-核糖基环化酶/环化ADP核糖水解酶；CD38抗原；CD38抗原(p45)；环化ADP-核糖水解酶。
CD38是广泛表达于细胞和组织，特别是白细胞中的新多功能胞外酶。CD38还在细胞粘着、信号转导和钙信号中起作用。人CD38mRNA的多核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示，并且相应的多肽序列如SEQ ID NO：80所示。
(18)STEAP家族成员4(STEAP4)
基因别名：DKFZp666D049，FLJ23153，STAMP2，TIARP，TNFAIP9，1110021O17Rik，AI481214，dudulin 4；六跨膜前列腺蛋白2；肿瘤坏死因子，α-诱导蛋白9；肿瘤坏死-α-诱导的脂肪-相关蛋白，TNFa-诱导的脂肪相关蛋白；肿瘤坏死因子，α-诱导蛋白9。
在脂肪组织中由TNF-α和IL-6诱导的膜蛋白。IL-6和肿瘤坏死因子-α在脊髓损伤模型中显示未调节(Ahn等人，BBRC 2006348(2)：560-70)，并被认为促进凋亡事件。人STEAP4mRNA的多核苷酸序列如SEQ IDNO：33所示，并且相应的多肽序列如SEQ ID NO：81所示。
(19)骨形态发生蛋白2(BMP2)
基因别名：BMP2A，AI467020，BC069214CR618407，M22489
该基因编码的蛋白属于转化生长因子-β(TGFB)超家族。编码蛋白作为二硫化物-连接的同型二聚体起作用，并诱导骨和软骨形成。人BMP2mRNA的多核苷酸序列如SEQ ID NO：34所示，并且对应多肽序列如SEQID NO：82所示。
共同转让给本发明受让人的国际专利公布号WO 2005/041857涉及用以治疗局部缺血和神经系统疾病的BMP抑制。
(20)间隙连接蛋白，α1，43kDa(连接蛋白43，GJA1)
基因别名：CX43，DFNB38，GJAL，ODD，ODDD，ODOD，SDTY3，MGC93610，AU042049，AW546267，Cnx43，CX43α1，Gja-1，Npm1，间隙连接蛋白，α-样；眼齿指发育不良(并指III型)，间隙连接蛋白α1 43kD；间隙连接蛋白，α1，43kD，α1连接蛋白。
间隙连接蛋白，α1是蛋白质连接蛋白基因家族的成员和心脏缺隙连接点的成分，并被认为在心脏同步收缩和胚胎发育中有关键作用。若干调节心肌细胞-细胞偶联的蛋白激酶靶向连接蛋白43。相关的无内含子(intron-less)的连接蛋白43假基因，GJA1P，已被绘制于5号染色体。人GJA1mRNA的多核苷酸序列如SEQ ID NO：35所示，并且相应的多肽序列如SEQ ID NO：83所示。
美国专利7,098,190教导了特别用于治疗创伤和脊髓损伤的反义化合物。
(21)TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白(TYROBP)
基因别名：DAP12，KARAP，PLOSL，Ly83；DNAX-激活蛋白12；杀伤激活受体相关蛋白。
该基因编码跨膜信号多肽，该多肽在细胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的激活基序(ITAM)。该蛋白可与膜糖蛋白的杀伤-细胞抑制受体(KIR)家族相关联，并可作为激活信号转导元件。该蛋白可结合ζ-链(TCR)相关蛋白激酶70kDa(ZAP-70)和脾酪氨酸激酶(SYK)，并在信号转导、骨成型、脑髓鞘形成和炎症中起作用。该基因内的突变已经与多囊脂肪膜性骨发育不良并发硬化性脑白质病(PLOSL)，也称为Nasu-Hakola病相关联。其推定受体，表达于骨髓细胞的触发受体2(TREM2)，也引起PLOSL。已鉴定该基因的编码不同同种型的两种可变转录变体。其它可变剪接转录变体已被描述，但其全长性质还没有被确定。人TYROBP转录变体1和2的多核苷酸序列分别如SEQ ID NO：36-37所示，并且相应的多肽序列如SEQ ID NO：84-85所示。
(22)结缔组织生长因子(CTGF)
基因别名：CCN2，HCS24，IGFBP8，MGC102839，NOV2，CTGRP，Fispl2，HCS24，fisp-12，肥大软骨细胞-特异蛋白24，胰岛素-样增长因素-结合蛋白8，FISP-12蛋白；成纤维细胞可诱导的分泌蛋白；成纤维细胞可诱导的分泌蛋白质；肥大软骨细胞-特异基因产物24。
由血管肉皮细胞分泌的主要结缔组织有丝分裂引诱剂(mitoattractant)。促进软骨细胞的增殖和分化。人CTGF mRNA的多核苷酸序列如SEQ IDNO：38所示，并且相应的多肽序列如SEQ ID NO：86所示。
(23)分泌磷蛋白1(SPP1)
基因别名：AA960535，AI790405，Apl-1，BNSP，BSPI，Bsp，ETA-1，Eta，OP，Opn，Opnl，Ric，Spp-1，minopontin，OSP；44kDa骨磷蛋白；44kDa骨磷蛋白；骨唾液蛋白I；骨桥蛋白，早期T淋巴细胞激活1。
SSP1是分泌性蛋白，其作为细胞因子参与增强干扰素-γ和白细胞介素-12的产生，并降低白细胞介素-10的产生，导致I型免疫的途经中非常重要。人SPP1转录变体1、2和3的多核苷酸序列分别如SEQ ID NOS：39-41所示，并且对应多肽序列如SEQ ID：87-89所示。
美国专利号6,458,590和美国专利公布号2004/0142865和2006/0252684涉及骨桥蛋白的抑制。
(24)浆膜蛋白4受体(RTN4R)
基因别名：NGR，NOGOR，NgR1，Nogo-66受体，UNQ 330/PRO526；Nogo受体，浆膜蛋白4受体前体。
该基因编码浆膜蛋白4、少突神经胶质细胞髓磷脂糖蛋白和髓磷脂-相关糖蛋白的受体。该受体介导轴突生长抑制，并可在调节成人中枢神经系统中的轴突再生和可塑性中起作用。人RTN4R mRNA的多核苷酸序列如SEQ ID NO：42所示，并且相应的多肽序列如SEQ ID NO：90所示。
(25)膜联蛋白A2(ANXA2)
基因别名：ANX2，ANX2L4，CAL1H，LIP2，LPC2，LPC2D，P36，PAP-IV，膜联蛋白II，依钙结合蛋白I重链多肽；嗜铬粒结合蛋白8；脂皮质蛋白II；胎盘抗凝蛋白IV。
该基因编码膜联蛋白家族成员。此钙-依赖性磷脂-结合蛋白家族的成员在调节细胞生长和信号转导途径中起作用。该蛋白用作自泌因子，其增强破骨细胞形成和骨吸收。该基因有分别位于染色体4、9和10的3个假基因。已发现该基因编码不同同种型的多个可变剪接转录变体。人ANXA2转录变体1、3和2的多核苷酸序列如SEQ ID NOS：43-45所示，且对应多肽序列如SEQ ID NOS：91-93所示。
(26)ras同源基因家族，成员A(RHOA)
基因别名：ARH12，ARHA，RHO12，RHOH12，雨虎属(Aplysia)ras-相关同系物12；致癌基因RHOH12；小GTP结合蛋白RhoA。
RHOA是已知在应激纤维形成中调节肌动蛋白细胞骨架的小GTP酶蛋白。其作用于效应物蛋白：Rho激酶(ROCK)，Rho激酶最终抑制轴突再生。体外研究中用Rho-A拮抗剂C3转移酶增强在髓磷脂基质的轴突生长，而体内试验并没有效果。人RHOA mRNA的多核苷酸序列如SEQ IDNO：46所示，且对应多肽序列如SEQ ID NO：94所示。
(27)双氧化酶1(DUOX1)
基因别名：LNOX1，MGC138840，MGC138841，NOXEF1，THOX1，NADPH甲状腺氧化酶1；黄素蛋白NADPH氧化酶；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶。
该基因编码的蛋白是糖蛋白，并且是NADPH氧化酶家族的成员。甲状腺激素的合成是由位于甲状腺卵泡细胞顶膜的蛋白质复合物催化的。该复合物包含碘转运体、甲状腺过氧化物酶，和含有该编码蛋白和DUOX2的过氧化物生成系统。该蛋白具有过氧化物酶同源结构域和gp91phox结构域。已描述了该基因编码相同蛋白的两种可变剪接转录变体。人DUOX1转录变体1和2的多核苷酸序列分别如SEQ ID NOS：47-48所示，且对应多肽序列如SEQ ID NOS：95-96所示。
“促凋亡多肽”指任何上述所列基因包括转录变体、同种型、直系同源物或旁系同源物和类似形式编码的多肽。
根据本发明的一方面提供包含未修饰的和修饰的核苷酸的抑制性寡核苷酸化合物。该化合物包含选自由糖修饰、碱基修饰和核苷酸间键合修饰组成的组的至少一种修饰的核苷酸，并可含有DNA，和修饰的核苷酸，如LNA(锁核酸)包括ENA(亚乙基-桥接核酸)、PNA(肽核酸)、阿拉伯糖苷、PACE(磷乙酸及其衍生物)、镜像核苷酸或具有六元糖类似物(例如己糖或吗啉)的核苷酸。
在一个实施方案中该化合物包含至少一个核糖核苷酸的糖基上的2′修饰。在某些实施方案中该化合物包含2′O烃基(alkyl)或2′-氟或2′O-烯丙基或任何其它2′糖修饰。任选地在交替位置。优选的2′修饰是2′O-甲基(2′甲氧基，2′O Me)。
其它稳定修饰也是可能的(例如，加到寡聚体3′或5′末端的修饰的核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸的主链是修饰的，并包含磷酸酯-D-核糖实体，但还可包含硫代磷酸酯-D-核糖实体、磷酸二酯L-核糖实体、三酯、硫酯、2′-5′桥接主链(也可称为5′-2′)、PACE修饰的核苷酸间键合或任何其它类型的修饰。
其它修饰包括寡核苷酸5′和/或3′末端的加成。这样的末端修饰可以是脂质、肽、糖或其它分子。
本发明还涉及下调各种基因表达的化合物，特别涉及新的小干扰RNA(siRNA)，以及这些新siRNA在各种疾病和医学病症治疗中的用途。需治疗的特别疾病和病症是急性肾功能衰竭(ARF)，听力损失，青光眼，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及其他急性肺和呼吸损伤，器官移植包括肺、肾、骨髓、心脏、胰腺、角膜或肝脏移植中的损伤(例如缺血再灌注损伤)，眼缺血病症，器官移植肾毒性，脊髓损伤，压疮，眼干综合征，口腔粘膜炎，ION和慢性阻塞性肺病(COPD)。
本发明所用的优选siRNA列表提供于表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)中。对于每个基因有一个单独的19-mer，21-mer和23-mer序列的列表，以其在专有算法中的得分为基准，按靶向人基因表达的最佳序列优先次序列出。21-或23-mersiRNA序列也通过此处公开的19-mer序列在5′和/或3′延伸得到。该延伸优选与相应mRNA序列互补。某些23-mer寡聚体通过如下方法设计：该方法的优先化次序是相应19-mer的次序。
结构基序
根据本发明siRNA化合物是根据在结构(A)-(H)中所列的修饰之一化学和/或结构修饰的或是串联siRNA或RNAstar。
本发明一个方面提供有如结构(A)所列的化合物：
(A) 5′(N)x-Z        3′(反义链)
    3′Z′-(N′)y    5′(有义链)
其中N和N′中的每一个是选自以下的核苷酸：未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中(N)x和N)y中的每一个是其中每个连续的N或N′通过共价键与下一个N或N′连接的寡核苷酸；
其中x和y中的每一个是介于18和40之间的整数；
其中Z和Z′中的每一个可存在或不存在，但是如果存在，则是共价连接到其所存在的链的3′末端的1-5个连续核苷酸；和
其中(N)x的序列如表D(D1-D34)中的任一个所示；并以(N)x和(N′)y中的每一个不包含超过50％的未修饰的脱氧核糖核苷酸或修饰的脱氧核糖核苷酸为条件。
本发明优选的反义序列是针对TP53BP2、LRDD、CYBA、CASP2、NOX3、HRK、RAC1、RHOA和DUOX1的新siRNA化合物，所述基因的mRNA多核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-2、3-5、6、10-11、12、13、24-26、46和47-48所示。
在某些实施方案中，本发明提供了具有结构B的化合物(在表D的两条链上具有交替的2′-O-甲基修饰的结构)：
(B)5′(N)x 3′  反义链
   3′(N′)y 5′有义链
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续N或N′是通过共价键与下一个N或N′连接的未修饰的核糖核苷酸或修饰的核糖核苷酸的寡聚体；
其中x和y中的每一个＝19，21或23并且(N)x和(N′)y完全互补；
其中(N)x和(N′)y中的每一个上的交替核糖核苷酸被修饰以导致核糖核苷酸的糖残基上2′-O-甲基修饰；
其中(N′)y的序列与(N)x的序列互补；和其中(N)x的序列存在于表D中的任一表格。
在一些实施方案中(N)x和(N′)y中的每一个在3′和5′末端各自磷酸化或非磷酸化。
在本发明的某些实施方案中，该化合物在反义链和有义链两条链上都有交替核苷酸修饰；
在某些实施方案中其中x和y中的每一个＝19或23，(N)x的5′和3′末端的每个N是修饰的；和
(N′)y的5′和3′末端的每个N′是未修饰的。
在某些实施方案中其中x和y中的每一个＝21，(N)x的5′和3′末端的每个N是未修饰的；和
(N′)y的5′和3′末端的每个N′是修饰的。
在特定实施方案中，当x和y＝19时，siRNA被修饰以使2′-O-甲基(2′-OMe)基团存在于反义链(N)x的第1、3、5、7、9、11、13、15、17和19核苷酸，并据此同样修饰，例如，2′-O Me基团，存在于有义链(N′)y的第2、4、6、8、10、12、14、16和18核苷酸。在不同实施方案中这些特定siRNA化合物的两个末端都是平端。
siRNA的新结构C-H
以下结构基序可用于设计siRNA化合物。
在一些实施方案中，本发明提供具有结构(C)的化合物：
(C) 5′(N)x-Z 3′     反义链
    3′Z′-(N′)y  5′有义链
其中N和N′中的每一个是独立地选自以下的核苷酸：未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续核苷酸通过共价键与下一个核苷酸连接的寡聚体并且x和y中的每一个是介于18和40之间的整数；
其中在(N)x中核苷酸是未修饰的或(N)x包含交替的修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸；每个修饰的核糖核苷酸被修饰以在其糖上有2′-O-甲基并且位于(N)x的中间位置的核糖核苷酸是修饰的或未修饰的优选未修饰的；
其中(N′)y包含未修饰的核糖核苷酸，还包含一个位于末端或末端倒数第二位的修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸选自由以下组成的组：镜像核苷酸，双环核苷酸，2′-糖基修饰的核苷酸，阿卓糖醇核苷酸，或通过选自2′-5′磷酸二酯键、P-烃氧基(alkoxy)键合或PACE键合的核苷酸间键合与相邻核苷酸连接的核苷酸；
其中如果(N′)y中有多于1个修饰的核苷酸，修饰的核苷酸可以是连续的；
其中Z和Z′中的每一个可存在或不存在，但如果存在，则是共价连接到其所连接的任一寡聚体的3′末端的1-5个脱氧核糖核苷酸；
其中(N′)y的序列包含基本上与(N)x互补的序列；并且其中(N)x的序列包含与从基因转录的mRNA上约18至约40个连续核糖核苷酸基本上互补的反义序列。
在某些实施方案中(N)x的序列存在于表A-D中的任一表格。
在特定实施方案中，x＝y＝19和(N)x中每个修饰的核糖核苷酸是修饰的因此在其糖基上有2′-O-甲基并且位于(N)x中间的核糖核苷酸是未修饰的。因此，在其中x＝19的化合物中，(N)x包含在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17和19的2′-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置2、4、6、8、11、13、15、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置5的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置2、4、8、11、13、15、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置6的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置2、4、6、8、11、13、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置15的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置2、4、6、8、11、13、15、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置14的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置1、2、3、7、9、11、13、15、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置5的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置1、2、3、5、7、9、11、13、15、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置6的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置1、2、3、5、7、9、11、13、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置15的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置1、2、3、5、7、9、11、13、15、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置14的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置2、4、6、7、9、11、13、15、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置5的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置1、2、4、6、7、9、11、13、15、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置5的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置2、4、6、8、11、13、14、16、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置15的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置1、2、3、5、7、9、11、13、14、16、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置15的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸例如在位置15。在其他实施方案中，(N)x包含在位置2、4、6、8、11、13、15、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置7的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置2、4、6、11、13、15、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置8的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置2、4、6、8、11、13、15、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置9的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置2、4、6、8、11、13、15、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置10的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置2、4、6、8、13、15、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置11的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置2、4、6、8、11、13、15、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置12的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在其他实施方案中，(N)x包含在位置2、4、6、8、11、15、17和19的2′O Me修饰的核糖核苷酸，并且还可包含例如在位置13的至少一个脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。
在又其他实施方案中(N)x包含相对于靶基因的至少一个核苷酸错配。在某些优选实施方案中，(N)x包含在位置5、6或14的单核苷酸错配。在结构(C)的一个实施方案中，(N′)y的5′和3′末端的任一末端或两个末端的至少两个核苷酸通过2′-5′磷酸二酯键连接。在某些优选实施方案中x＝y＝19或x＝y＝23；(N)x中核苷酸交替为修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸，每个修饰的核糖核苷酸被修饰以在其糖上有2′-O-甲基并且位于(N)x的中间位置的核糖核苷酸是未修饰的；并且(N′)y的3′末端的三个核苷酸通过两个2′-5′磷酸二酯键连接(在此如结构I所示)。在其他优选实施方案中，x＝y＝19或x＝y＝23；(N)x中核苷酸交替为修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸，每个修饰的核糖核苷酸被修饰以在其糖上有2′-O-甲基并且位于(N)x的中间位置的核糖核苷酸是未修饰的；并且(N′)y的5′末端的四个连续核苷酸通过三个2′-5′磷酸二酯键连接，在另一实施方案中，位于(N)y中间位置的另外的核苷酸可在其糖基上用2′-O-甲基修饰。在另一优选实施方案中，(N)x中核苷酸交替为2′-O-甲基修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸，并(N′)y的5′末端的四个连续核苷酸通过三个2′-5′磷酸二酯键连接并且5′末端核苷酸或5′末端的2或3个连续核苷酸包含3′-O-甲基修饰。
在结构C的某些优选实施方案中，x＝y＝19并且在(N′)y中至少一个位置包含脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸，优选地五个位置包含脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸。在不同实施方案中，下列位置包含脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸：位置1和16-19，位置15-19，位置1-2和17-19，位置1-3和18-19，位置1-4和19以及位置1-5。(N′)y还可包含至少一个LNA核苷酸。
在结构C的某些优选实施方案中，x＝y＝19并且在(N′)y中至少一个位置的核苷酸包含镜像核苷酸、脱氧核糖核苷酸和通过2′-5′核苷酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸；
在结构C的某些优选实施方案中，x＝y＝19并且(N′)y包含镜像核苷酸。在不同实施方案中，所述镜像核苷酸为L-DNA核苷酸。在某些实施方案中，所述L-DNA是L-脱氧核糖胞苷。在一些实施方案中(N′)y包含在位置18的L-DNA。在其他实施方案中(N′)y包含在位置17和18的L-DNA。在某些实施方案中(N′)y包含在位置2和在位置17和18中的一个或两个位置的L-DNA取代。在某些实施方案中(N′)y还包含5′末端加帽核苷酸例如5′-O-甲基DNA或脱碱基的或反向脱碱基的假核苷酸作为突出端。
在又其他实施方案中(N′)y包含相对于靶基因的至少一个核苷酸错配，在某些优选的实施方案中，(N′)y包含在位置6、14或15的单核苷酸错配。
在又其他实施方案中(N′)y包含在位置15的DNA和在位置17和18中的一个或两个位置的L-DNA。在该结构中，位置2还可包含L-DNA或脱碱基的假核苷酸。
考虑了结构C的其他实施方案，其中x＝y＝21或其中x＝y＝23；在这些实施方案中上述讨论的(N′)y的修饰不是位于位置15、16、17、18，而是位于21-mer的位置17、18、19、20或23-mer的位置19、20、21、22；类似地，位于位置17和18中的一个或两个位置的修饰位于21-mer的位置19或20中的一个或两个位置和23-mer的位置21或22中的一个或两个位置。19-mer的所有修饰可类似地进行调整以用于21-mer和23-mer。
根据结构(C)的不同实施方案，(N′)y中位于3′末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸通过2′-5′核苷酸间键合连接。在一个优选实施方案中，(N′)y的3′末端的四个连续核苷酸通过三个2′-5′磷酸二酯键连接，其中形成2′-5′磷酸二酯键的2′-5′核苷酸中的一个或多个还包含3′-O-甲基糖修饰。优选地(N′)y的3′末端的核苷酸包含2′-O-甲基糖修饰。在结构C的某些优选实施方案中，x＝y＝19并且(N′)y中在位置15、16、17、18和19的两个或多个连续核苷酸包含通过2′-5′核苷酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸。在不同实施方案中形成2′-5′核苷酸间键的核苷酸包含3′脱氧核糖核苷酸或3′甲氧基核苷酸。在一些实施方案中位于(N′)y位置17和18的核苷酸通过2′-5′核苷酸间键连接。在其他实施方案中(N′)y中位于位置16、17、18、16-17、17-18或16-18的核苷酸通过2′-5′核苷酸间键连接。
在某些实施方案中(N′)y包含位于位置2的L-DNA和位于位置16、17、18、16-17、17-18或16-18的2′-5′核苷酸间键。在某些实施方案中(N′)y包含位于位置16、17、18、16-17、17-18或16-18的2′-5′核苷酸间键和5′末端加帽核苷酸。
根据结构(C)的不同实施方案，(N′)y中位于任一末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸或位于5′和3′末端的每个末端的2-8个修饰的核苷酸独立地为镜像核苷酸。在一些实施方案中所述镜像核苷酸是L-核糖核苷酸。在其他实施方案中所述镜像核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸。镜像核苷酸还可在糖基部分或碱基部分或核苷酸间键合上修饰。
在结构(C)的一个优选实施方案中，(N′)y的3′末端核苷酸或位于(N′)y的3′末端的2或3个连续核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸。
在结构(C)的其他优选实施方案中，(N′)y中位于任一末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸或5′和3′末端的每个末端的2-8个修饰的核苷酸独立地是2′-糖基修饰的核苷酸，在一些实施方案中所述2′-糖基修饰包含氨基酸、氟、烃氧基或烃基(alkyl)部分的存在。在某些实施方案中所述2′-糖基修饰包含甲氧基部分(2′-O Me)。
在一系列优选实施方案中，(N′)y的5′末端的3、4或5个连续核苷酸包含2′-O Me修饰。在另一个优选实施方案中，(N′)y的3′末端的三个连续核苷酸包含2′-O-甲基修饰。
在结构(C)的一些实施方案中，(N′)y中位于任一末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸或位于5′和3′末端的每个末端的2-8个修饰的核苷酸独立地为双环核苷酸。在不同实施方案中所述双环核苷酸是锁核酸(LNA)。2′-O，4′-C-亚乙基桥接核酸(ENA)是LNA种类(参见如下)。
在不同实施方案中，(N′)y包含在5′末端或在3′和5′末端的两端的修饰的核苷酸。
在结构(C)的一些实施方案中，位于(N′)y的5′和3′末端的任一末端或两个末端的至少两个核苷酸通过P-乙氧基主链修饰连接。在某些优选实施方案中x＝y＝19或x＝y＝23；(N)x中核苷酸交替为修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸，每个修饰的核糖核苷酸被修饰以在其糖基有2′-O-甲基并且位于(N)x的中间位置的核糖核苷酸是未修饰的；并且位于(N′)y的3′末端或5′末端的四个连续核苷酸通过三个P-乙氧基主链修饰连接。在另一个优选实施方案中，(N′)y中位于3′末端或5′末端的三个连续核苷酸通过两个P-烃氧基主链修饰连接。
在结构(C)一些实施方案中，(N′)y中5′和3′末端的每个末端的2、3、4、5、6、7或8连续核糖核苷酸独立地是镜像核苷酸、通过2′-5′磷酸二酯键连接的核苷酸、2′糖修饰的核苷酸或双环核苷酸。在一个实施方案中，(N′)y的5′和3′末端的修饰相同。在一个优选实施方案中，(N′)y的5′末端的四个连续核苷酸通过三个2′-5′磷酸二酯键连接和(N′)y的3′末端的三个连续核苷酸通过两个2′-5′磷酸二酯键连接。在另一个实施方案中，(N′)y的5′末端的修饰与(N′)y的3′末端的修饰不同。在一个特定实施方案中，(N′)y的5′末端的修饰的核苷酸是镜像核苷酸和(N′)y的3′末端的修饰的核苷酸通过2′-5′磷酸二酯键连接。在另一个特定实施方案中，(N′)y的5′末端的三个连续核苷酸是LNA核苷酸和(N′)y的3′末端的三个连续核苷酸通过2′-5′磷酸二酯键连接。(N)x中的核苷酸交替为修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸，每个修饰的核糖核苷酸被修饰以在其糖基上有2′-O-甲基并且位于(N)x的中间的核糖核苷酸是未修饰的，或(N)x中的核糖核苷酸是未修饰的。
在结构(C)的另一个实施方案中，本发明提供化合物，其中x＝y＝19或x＝y＝23；(N)x的核苷酸交替为修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸，每个修饰的核糖核苷酸被修饰以在其糖基上有2′-O-甲基并且位于(N)x的中间的核糖核苷酸未被修饰；(N′)y的3′末端的三个核苷酸通过两个2′-5′磷酸二酯键连接并且(N′)y的5′末端的三个核苷酸是LNA例如ENA。
在结构(C)的另一个实施方案中，(N′)y的5′末端的五个连续核苷酸包含2′-O-甲基糖修饰并且(N′)y的3′末端的两个连续核苷酸是L-DNA。
在又一个实施方案中，本发明提供化合物，其中x＝y＝19或x＝y＝23；(N)x由未修饰的核糖核苷酸组成；(N′)y的3′末端的三个连续核苷酸通过两个2′-5′磷酸二酯键连接并且(N′)y的5′末端的三个连续核苷酸是LNA例如ENA。
根据结构(C)的其他实施方案，(N′)y的5′或3′末端的核苷酸，或任一末端的2、3、4、5或6个连续核苷酸或5′和3′末端的每个末端的1-4个修饰的核苷酸独立地为膦酰基羧酸酯核苷酸或亚膦酰基羧酸酯核苷酸(PACE核苷酸)。在一些实施方案中PACE核苷酸是脱氧核糖核苷酸。在一些优选实施方案中，(N′)y的5′和3′末端的每个末端的1或2个连续核苷酸是PACE核苷酸。美国专利号6,693,187和7,067,641中公开的PACE核苷酸和类似物的实施例，所述两个专利通过引用并入。
在另外的实施方案中，本发明提供具有结构(D)的化合物：
(D)5′(N)x-Z 3′    反义链
   3′Z’-(N’)y 5′有义链
其中N和N′中的每一个是选自以下的核苷酸：未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸或修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续核苷酸通过共价键与下一个核苷酸连接的寡聚体并且x和y中的每一个是介于18和40之间的整数；
其中在(N)x包含未修饰的核糖核苷酸，还包含一个位于3′末端或末端倒数第二位的修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸选自由以下组成的组：双环核苷酸，2′-糖基修饰的核苷酸，镜像核苷酸，阿卓糖醇核苷酸，或通过选自2′-5′磷酸二酯键、P-烃氧基键合或PACE键合的核苷酸间键合与相邻核苷酸连接的核苷酸；
其中(N′)y包含未修饰的核糖核苷酸，还包含一个位于5′末端或末端倒数第二位的修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸选自由以下组成的组：双环核苷酸，2′-糖基修饰的核苷酸，镜像核苷酸，阿卓糖醇核苷酸，或通过选自2′-5′磷酸二酯键、P-烃氧基键合或PACE键合的核苷酸间键合与相邻核苷酸连接的核苷酸；
其中在(N)x和(N′)y中的每一个中修饰的和未修饰的核苷酸不是交替的；
其中Z和Z′中的每一个可存在或不存在，但如果存在，则是共价连接到其所连接的任一寡聚体的3′末端的1-5个脱氧核糖核苷酸；
其中(N′)y的序列与(N)x的序列基本上互补；并且其中(N)x的序列包含与从基因转录的mRNA上约18至约40个连续核糖核苷酸具有基本同一性的反义序列。
在某些实施方案中(N)x的序列和互补的(N′)y的序列存在于表A-D中的任一表格。
在结构(D)的一个实施方案中，x＝y＝19或x＝y＝23；(N)x包含未修饰的核糖核苷酸，其中3′末端的两个连续核苷酸通过一个2′-5′核苷酸间键合连接；并且(N′)y包含未修饰的核糖核苷酸，其中5′末端的两个连续核苷酸通过一个2′-5′核苷酸间键合连接。
在一些实施方案，x＝y＝19或x＝y＝23；(N)x包含未修饰的核糖核苷酸，其中3′末端的三个连续核苷酸通过两个2′-5′磷酸二酯键连接在一起；并且(N′)y包含未修饰的核糖核苷酸，其中5′末端的四个连续核苷酸通过三个2′-5′磷酸二酯键连接在一起(在此如结构II所示)。
根据结构(D)的不同实施方案，起始于(N)x的3′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸和起始于(N′)y的5′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸通过2′-5′核苷酸间键合连接。
根据结构(D)的一个优选实施方案，(N′)y的5′末端的四个连续核苷酸通过三个2′-5′磷酸二酯键连接和(N′)x的3′末端的三个连续核苷酸通过两个2′-5′磷酸二酯键连接。(N′)y的5′末端的三个核苷酸和(N′)x的3′末端的两个核苷酸也可以包含3′-O-甲基修饰。
根据结构(D)的不同实施方案，起始于(N)x的3′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸和起始于(N′)y的5′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸独立地为镜像核苷酸。在一些实施方案中所述镜像核苷酸是L-核糖核苷酸。在其他实施方案中所述镜像核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸。
在结构(D)的其他实施方案中，起始于(N)x的3′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸和起始于(N′)y的5′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸独立地为2′-糖基修饰的核苷酸。在一些实施方案中所述2′-糖基修饰包含氨基、氟、烃氧基或烃基部分的存在。在某些实施方案中所述2′-糖基修饰包含甲氧基部分(2′-O Me)。
在结构(D)的一个优选实施方案中，位于(N′)y的5′末端的五个连续核苷酸包含2′-O-甲基修饰和位于(N′)x的3′末端的五个连续核苷酸包含2′-O-甲基修饰。在结构(D)的另一个优选实施方案中，位于(N′)y的5′末端的十个连续核苷酸包含2′-O-甲基修饰和位于(N′)x的3′末端的五个连续核苷酸包含2′-O-甲基修饰，在结构(D)的另一个优选实施方案中，位于(N′)y的5′末端的十三个连续核苷酸包含2′-O-甲基修饰和位于(N′)x的3′末端的五个连续核苷酸包含2′-O-甲基修饰。
在结构(D)的一些实施方案中，(N′)y中起始于(N)x的3′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸和起始于(N′)y的5′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸独立地为双环核苷酸。在不同实施方案中所述双环核苷酸是锁核酸(LNA)例如2’-O，4’-C-亚乙基桥接核酸(ENA)。
在结构(D)的不同实施方案中，(N′)y包含选自以下的修饰的核苷酸：双环核苷酸，2′-糖基修饰的核苷酸，镜像核苷酸，阿卓糖醇核苷酸，或通过选自2′-5′磷酸二酯键、P-烃氧基键合或PACE键合的核苷酸间键合与相邻核苷酸连接的核苷酸；
在结构(D)的不同实施方案中，(N)x包含选自以下的修饰的核苷酸：双环核苷酸，2′-糖基修饰的核苷酸，镜像核苷酸，阿卓糖醇核苷酸，或通过选自2′-5′磷酸二酯键、P-烃氧基键合或PACE键合的核苷酸间键合与相邻核苷酸连接的核苷酸；
在其中相同链的3′和5′末端的每个末端包含修饰的核苷酸的实施方案中，5′和3′末端的修饰是相同的。在另一个实施方案中，5′末端的修饰与相同链3′末端的修饰不同，在一个特定实施方案中，5′末端的修饰的核苷酸是镜像核苷酸，且相同链3′末端的修饰的核苷酸通过2′-5′磷酸二酯键连接。
在结构(D)一个特定实施方案中，(N′)y的5′末端的五个连续核苷酸包含2′-O-甲基修饰和(N′)y的3′末端的两个连续核苷酸是L-DNA。此外，该化合物还包含(N′)x的3′末端五个连续的2′-O-甲基修饰的核苷酸。
在结构(D)的不同实施方案中，(N)x中的修饰的核苷酸与(N′)y中的修饰的核苷酸不同。例如，(N)x中的修饰的核苷酸是2′-糖基修饰的核苷酸和(N′)y中的修饰的核苷酸是通过2′-5′核苷酸间键合连接的核苷酸。在另一个实例中，(N)x的修饰的核苷酸是镜像核苷酸和(N′)y的修饰的核苷酸是通过2′-5′核苷酸间键合连接的核苷酸。在另一个实例中，(N)x的修饰的核苷酸是通过2′-5′核苷酸间键合连接的核苷酸和(N′)y的修饰的核苷酸是镜像核苷酸。
在另外的实施方案中，本发明提供具有结构(E)的化合物：
(E)5′(N)x-Z 3′     反义链
   3′Z′-(N′)y  5′有义链
其中N和N′中的每一个是选自以下的核苷酸：未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续核苷酸通过共价键与下一个核苷酸连接的寡聚体并且x和y中的每一个是介于18和40之间的整数；
其中(N)x包含未修饰的核糖核苷酸，还包含一个位于5′末端或末端倒数第二位的修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸选自由以下组成的组：双环核苷酸，2′-糖基修饰的核苷酸，镜像核苷酸，阿卓糖醇核苷酸，或通过选自2′-5′磷酸二酯键、P-烃氧基键合或PACE键合的核苷酸间键合与相邻核苷酸连接的核苷酸；
其中(N′)y包含未修饰的核糖核苷酸，还包含一个位于3′末端或末端倒数第二位的修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸选自由以下组成的组：双环核苷酸，2′-糖基修饰的核苷酸，镜像核苷酸，阿卓糖醇核苷酸，或通过选自2′-5′磷酸二酯键、P-烃氧基键合或PACE键合的核苷酸间键合与相邻核苷酸连接的核苷酸；
其中在(N)x和(N′)y中的每一个中修饰的和未修饰的核苷酸不是交替的；
其中Z和Z′中的每一个可存在或不存在，但如果存在，则是共价连接到其所连接的任一寡聚体的3′末端的1-5个脱氧核糖核苷酸；
其中(N′)y的序列与(N)x的序列基本上互补；并且其中(N)x的序列包含与从基因转录的mRNA上约18至约40个连续核糖核苷酸具有基本同一性的反义序列。
在某些实施方案中(N)x和互补(N′)y的序列存在于表A-D中的任一表格。
在某些优选实施方案中(N)x的5′末端的最末端的核苷酸是未修饰的。
根据结构(E)的不同实施方案，起始于(N)x的5′末端的最末端或末端倒数第二位，优选地起始于5′末端倒数第二位，的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸和起始于(N′)y的3′的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸通过2′-5′核苷酸间键合连接。
根据结构(E)的不同实施方案，起始于(N)x的5′末端的最末端或末端倒数第二位，优选地起始于5′末端倒数第二位，的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14连续核糖核苷酸和起始于(N′)y的3′的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸独立地为镜像核苷酸。在一些实施方案中所述镜像核苷酸是L-核糖核苷酸。在其他实施方案中所述镜像核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸。
在结构(E)的其他实施方案中，起始于(N)x的5′末端的最末端或末端倒数第二位，优选起始于5′末端倒数第二位，的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸和起始于(N′)y的3′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸独立地为2′-糖基修饰的核苷酸。在一些实施方案中所述2′-糖基修饰包含氨基、氟、烃氧基或烃基部分的存在。在某些实施方案中所述2′-糖基修饰包含甲氧基部分(2′-O Me)。
在结构(E)的一些实施方案中，(N′)y中起始于(N)x的5′末端的最末端或末端倒数第二位，优选地起始于5′末端倒数第二位，的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸和起始于(N′)y的3′的末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14连续核糖核苷酸独立地为双环核苷酸。在不同实施方案中所述双环核苷酸是锁核酸(LNA)例如2’-O，4’-C-亚乙基桥接核酸(ENA)。
在结构(E)的不同实施方案中，(N′)y包含位于3′末端或3′和5′末端的每个末端的修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸选自双环核苷酸，2′-糖基修饰的核苷酸，镜像核苷酸，阿卓糖醇核苷酸或通过P-烃氧基主链修饰与相邻核苷酸连接的核苷酸，或通过选自2′-5′磷酸二酯键、P-烃氧基键合或PACE键合的核苷酸间键合与相邻核苷酸连接的核苷酸。
在结构(E)的不同实施方案中，(N′)y包含位于5′末端或3′和5′末端的每个末端的修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸选自双环核苷酸，2′-糖基修饰的核苷酸，镜像核苷酸，阿卓糖醇核苷酸，或通过选自2′-5′磷酸二酯键、P-烃氧基键合或PACE键合的核苷酸间键合与相邻核苷酸连接的核苷酸；
在其中相同链的3′和5′两个末端都包含修饰的核苷酸的一个实施方案中，5′和3′末端的修饰相同。在另一个实施方案中，5′末端的修饰与相同链3′末端的修饰不同。在一个特定实施方案中，5′末端的修饰的核苷酸是镜像核苷酸并且相同链3′末端的修饰的核苷酸通过2′-5′磷酸二酯键连接。
在结构(E)的不同实施方案中，(N)x的修饰的核苷酸与(N′)y的修饰的核苷酸不同。例如，(N)x的修饰的核苷酸是2′-糖基修饰的核苷酸并且(N′)y的修饰的核苷酸是通过2′-5′核苷酸间键合连接的核苷酸。在另一个实例中，(N)x的修饰的核苷酸是镜像核苷酸并且(N′)y的修饰的核苷酸是通过2′-5′核苷酸间键合连接的核苷酸，在另一个实例中，(N)x的修饰的核苷酸是通过2′-5′核苷酸间键合连接的核苷酸并且(N′)y的修饰的核苷酸是镜像核苷酸。
在另外的实施方案中，本发明提供具有结构式(F)的化合物：
(F)  5′(N)x-Z 3′     反义链
     3′Z′-(N′)y  5′有义链
其中N和N′中的每一个是选自以下的核苷酸：未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续核苷酸通过共价键与下一个核苷酸连接的寡聚体并且x和y中的每一个是介于18和40之间的整数；
其中(N)x和(N′)y中的每一个包含未修饰的核糖核苷酸，其中(N)x和(N′)y中的每一个独立地包含位于3′末端或末端倒数第二位的修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸选自由双环核苷酸、2′-糖基修饰的核苷酸、镜像核苷酸、或通过P-烃氧基主链修饰与相邻核苷酸连接的核苷酸、或通过2′-5′磷酸二酯键与相邻核苷酸连接的核苷酸组成的组；
其中在(N)x和(N′)y中的每一个中修饰的和未修饰的核苷酸不是交替的；
其中Z和Z′中的每一个可存在或不存在，但如果存在，则是共价连接到其所连接的任一寡聚体的3′末端的1-5个脱氧核糖核苷酸；
其中(N′)y的序列与(N)x的序列基本上互补；并且其中(N)x的序列包含与从基因转录的mRNA上约18至约40个连续核糖核苷酸具有基本同一性的反义序列。
在某些实施方案中(N)x和互补(N′)y的序列存在于表A-D中的任一表格。
在结构(F)的一些实施方案中，x＝y＝19或x＝y＝23；(N′)y包含未修饰的核糖核苷酸，其中3′末端的两个连续核苷酸包含两个连续的镜像脱氧核糖核苷酸；和(N)x包含未修饰的核糖核苷酸，其中3′末端的一个核苷酸包含镜像脱氧核糖核苷酸(如结构III所示)
根据结构(F)的不同实施方案，独立地起始于(N)x和(N′)y的3′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸通过2′-5′核苷酸间键合连接。
根据结构(F)的一个优选实施方案，(N′)y的3′末端的三个连续核苷酸通过两个2′-5′磷酸二酯键连接和(N′)x的3′末端的三个连续核苷酸通过两个2′-5′磷酸二酯键连接。
根据结构(F)的不同实施方案，独立地起始于(N)x和(N′)y的3′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸独立地为镜像核苷酸。在一些实施方案中所述镜像核苷酸是L-核糖核苷酸。在其他实施方案中所述镜像核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸。
在结构(F)的其他实施方案中，独立地起始于(N)x和(N′)y的3′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸独立地是2′-糖基修饰的核苷酸。在一些实施方案中所述2′-糖基修饰包含氨基、氟、烃氧基或烃基部分的存在。在某些实施方案中所述2′-糖基修饰包含甲氧基部分(2′-O Me)。
在结构(F)的一些实施方案中，独立地起始于(N)x和(N′)y的3′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸独立地是双环核苷酸。在不同实施方案中所述双环核苷酸是锁核酸(LNA)例如2’-O，4’-C-亚乙基桥接核酸(ENA)。
在结构(F)的不同实施方案中，(N′)y包含位于3′末端或3′和5′两个末端的修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸选自双环核苷酸，2′-糖基修饰的核苷酸，镜像核苷酸，阿卓糖醇核苷酸，或通过选自2′-5′磷酸二酯键、P-烃氧基键合或PACE键合的核苷酸间键合与相邻核苷酸连接的核苷酸。
在结构(F)的不同实施方案中，(N)x包含位于5′末端或3′和5′末端的每个末端的修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸选自双环核苷酸，2′-糖基修饰的核苷酸，镜像核苷酸，阿卓糖醇核苷酸，或通过选自2′-5′磷酸二酯键、P-烃氧基键合或PACE键合的核苷酸间键合与相邻核苷酸连接的核苷酸。
在其中相同链的3′和5′末端的每个末端包含修饰的核苷酸的一个实施方案中，5′和3′末端的修饰相同。在另一个实施方案中，5′末端的修饰与相同链3′末端的修饰不同。在一个特定实施方案中，5′末端的修饰的核苷酸是镜像核苷酸并且相同链3′末端的修饰的核苷酸通过2′-5′磷酸二酯键连接。
在结构(F)的不同实施方案中，(N)x的修饰的核苷酸与(N′)y的修饰的核苷酸不同。例如，(N)x的修饰的核苷酸是2′-糖基修饰的核苷酸并且(N′)y的修饰的核苷酸是通过2′-5′核苷酸间键合连接的核苷酸。在另一个实例中，(N)x的修饰的核苷酸是镜像核苷酸并且(N′)y的修饰的核苷酸是通过2′-5′核苷酸间键合连接的核苷酸。在另一个实例中，(N)x的修饰的核苷酸是通过2′-5′核苷酸间键合连接的核苷酸并且(N′)y的修饰的核苷酸是镜像核苷酸。
在另外的实施方案中，本发明提供具有结构(G)的化合物：
(G)5′(N)x-Z 3′反义链
3′Z′-(N′)y  5′有义链
其中N和N′中的每一个是选自以下的核苷酸：未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸或修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续核苷酸通过共价键与下一个核苷酸连接的寡聚体并且x和y中的每一个是介于18和40之间的整数；
其中(N)x和(N′)y中的每一个包含未修饰的核糖核苷酸，其中(N)x和(N′)y中的每一个独立地包含一个位于5′末端或末端倒数第二位的修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸选自由双环核苷酸、2′-糖基修饰的核苷酸、镜像核苷酸、或通过P-烃氧基主链修饰与相邻核苷酸连接的核苷酸、或通过选自2′-5′磷酸二酯键与相邻核苷酸连接的核苷酸组成的组；
其中(N)x的修饰的核苷酸优选地位于末端倒数第二位；
其中在(N)x和(N′)y中的每一个中修饰的和未修饰的核苷酸不是交替的；
其中Z和Z′中的每一个可存在或不存在，但如果存在，则是共价连接到其所连接的任一寡聚体的3′末端的1-5个脱氧核糖核苷酸；
其中(N′)y的序列与(N)x的序列基本上互补；并且其中(N)x的序列包含与从基因转录的mRNA上约18至约40个连续核糖核苷酸具有基本同一性的反义序列。
在某些实施方案中(N)x和互补(N′)y的序列存在于表A-D中的任一表格。
在结构(G)的一些实施方案中，x＝y＝19或x＝y＝23。
根据结构(G)的不同实施方案，独立地起始于(N)x和(N′)y的5′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸通过2′-5′核苷酸间键合连接。对于(N)x修饰的核苷酸优选地起始于5′末端的末端倒数第二位。
根据结构(G)的不同实施方案，独立地起始于(N)x和(N′)y的5′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸独立地是镜像核苷酸。在一些实施方案中，所述镜像核苷酸是L-核糖核苷酸。在其他实施方案中，所述镜像核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸。对于(N)x，所述修饰的核苷酸优选地起始于5′末端的末端倒数第二位。
在结构(G)的其他实施方案中，独立地起始于(N)x和(N′)y的5′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸独立地是2′-糖基修饰的核苷酸。在一些实施方案中所述2′-糖基修饰包含氨基、氟、烃氧基或烃基部分的存在。在某些实施方案中所述2′-糖基修饰包含甲氧基部分(2′-O Me)。在一些优选实施方案中连续的修饰的核苷酸优选起始于(N)x的5′末端的末端倒数第二位。
在结构(G)的一个优选实施方案中，位于(N′)y的5′末端的五个连续核糖核苷酸包含2′-O-甲基修饰和位于(N′)x的5′末端倒数第二位的一个核糖核苷酸包含2′-O-甲基修饰。在结构(G)的另一个优选实施方案中，位于(N′)y的5′末端的五个连续核糖核苷酸包含2′-O-甲基修饰和位于(N′)x的5′末端的两个连续核糖核苷酸包含2′-O-甲基修饰。
在结构(G)的一些实施方案中，独立地起始于(N)x和(N′)y的5′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸是双环核苷酸。在不同实施方案中所述双环核苷酸是锁核酸(LNA)例如2’-O，4’-C-亚乙基桥接核酸(ENA)。在一些优选的实施方案中连续的修饰的核苷酸优选地起始于(N)x的5′末端的末端倒数第二位。
在结构(G)的不同实施方案中，(N′)y包含位于5′末端或3′和5′末端的每个末端的修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸选自双环核苷酸，2′-糖基修饰的核苷酸，镜像核苷酸，阿卓糖醇核苷酸，或通过选自2′-5′磷酸二酯键、P-烃氧基键合或PACE键合的核苷酸间键合与相邻核苷酸连接的核苷酸。
在结构(G)的不同实施方案中，(N)x包含位于5′末端或3′和5′末端的每个末端的修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸选自双环核苷酸，2′-糖基修饰的核苷酸，镜像核苷酸，阿卓糖醇核苷酸，或通过选自2′-5′磷酸二酯键、P-烃氧基键合或PACE键合的核苷酸间键合与相邻核苷酸连接的核苷酸。
在其中相同链的3′和5′末端的每个末端包含修饰的核苷酸的一个实施方案中，5′和3′末端的修饰相同。在另一个实施方案中，5′末端的修饰与相同链3′末端的修饰不同。在一个特定实施方案中，5′末端的修饰的核苷酸是镜像核苷酸并且相同链3′末端的修饰的核苷酸通过2′-5′磷酸二酯键连接。在结构(G)的不同实施方案中，(N)x的修饰的核苷酸和(N′)y的修饰的核苷酸不同。例如，(N)x的修饰的核苷酸是2′-糖基修饰的核苷酸并且(N′)y的修饰的核苷酸是通过2′-5′核苷酸间键合连接的核苷酸。在另一个实例中，(N)x的修饰的核苷酸是镜像核苷酸并且(N′)y的修饰的核苷酸是通过2′-5′核苷酸间键合连接的核苷酸。在另一实例中，(N)x的修饰的核苷酸是通过2′-5′核苷酸间键合连接的核苷酸并且(N′)y的修饰的核苷酸是镜像核苷酸。
在另外的实施方案中，本发明提供具有结构(H)的化合物：
(H)5′(N)x-Z 3′反义链
3′Z′-(N′)y  5′有义链
其中N和N′中的每一个是选自以下的核苷酸：未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸或修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续核苷酸通过共价键与下一个核苷酸连接的寡聚体并且x和y中的每一个是介于18和40之间的整数；
其中在(N)x包含未修饰的核糖核苷酸，还包含一个位于3′末端或末端倒数第二位的或5′末端或末端倒数第二位的修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸选自由以下组成的组：双环核苷酸，2′-糖基修饰的核苷酸，镜像核苷酸，阿卓糖醇核苷酸，或通过选自2′-5′磷酸二酯键、P-烃氧基键合或PACE键合的核苷酸间键合与相邻核苷酸连接的核苷酸；
其中(N′)y包含未修饰的核糖核苷酸，还包含位于内部位置的一个修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸选自由以下的组成的组：双环核苷酸，2′-糖基修饰的核苷酸，镜像核苷酸，阿卓糖醇核苷酸，或通过选自2′-5′磷酸二酯键、P-烃氧基键合或PACE键合的核苷酸间键合与相邻核苷酸连接的核苷酸；
其中在(N)x和(N′)y中的每一个中修饰的和未修饰的核苷酸不是交替的；
其中Z和Z′中的每一个可存在或不存在，但如果存在，则是共价连接到其所连接的任一寡聚体的3′末端的1-5个脱氧核糖核苷酸；
其中(N′)y的序列与(N)x的序列基本上互补；并且其中(N)x的序列包含与从基因转录的mRNA上约18至约40个连续核糖核苷酸具有基本同一性的反义序列。
在某些实施方案中(N)x和互补(N′)y的序列存在于表A-D中的任一表格。
在结构(H)的一个实施方案中，独立地起始于(N)x的3′末端或5′末端或两个末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸独立地是2′-糖基修饰的核苷酸、双环核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过2′-5′磷酸二酯键与相邻核苷酸连接的核苷酸，并且(N′)y中2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续的内部核糖核苷酸独立地为2′-糖基修饰的核苷酸、双环核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过2′-5′磷酸二酯键与相邻核苷酸连接的核苷酸。在一些实施方案中所述2′-糖基修饰包含氨基、氟、烃氧基或烃基部分的存在。在某些实施方案中，所述2′-糖基修饰包含甲氧基部分(2′-O Me)。
在结构(H)的另一个实施方案中，独立地起始于(N′)y的3′末端或5′末端的最末端或末端倒数第二位的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸或(N′)y的5′和3′末端的每个末端的2-8个连续核苷酸独立地是2′-糖基修饰的核苷酸、双环核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过2′-5′磷酸二酯键与相邻核苷酸连接的核苷酸，并且(N)x的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续的内部核糖核苷酸独立地为2′-糖基修饰的核苷酸、双环核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过2′-5′磷酸二酯键与相邻核苷酸连接的核苷酸。
在其中相同链的3′和5′末端的每个末端包含修饰的核苷酸的一个实施方案中，5′和3′末端的修饰相同。在另一个实施方案中，5′末端的修饰与相同链3′末端的修饰不同。在一个特定实施方案中，5′末端的修饰的核苷酸是镜像核苷酸并且相同链3′末端的修饰的核苷酸通过2′-5′磷酸二酯键连接。
在结构(H)的不同实施方案中，(N)x的修饰的核苷酸与(N′)y的修饰的核苷酸不同。例如，(N)x的修饰的核苷酸是2′-糖基修饰的核苷酸并且(N′)y的修饰的核苷酸是通过2′-5′核苷酸间键合连接的核苷酸。在另一个实例中，(N)x的修饰的核苷酸是镜像核苷酸并且(N′)y的修饰的核苷酸是通过2′-5′核苷酸间键合连接的核苷酸。在另一个实例中，(N)x的修饰的核苷酸是通过2′-5′核苷酸间键合连接的核苷酸并且(N′)y的修饰的核苷酸是镜像核苷酸。
在结构(H)的一个优选实施方案中，x＝y＝19；(N′)y的9-11核苷酸位置9-11的三个连续核糖核苷酸包含2′-O-甲基修饰并且(N′)x的3′末端的五个连续核糖核苷酸包含2′-O-甲基修饰。
对于所有上述结构(A)-(H)，在不同实施方案中x＝y并且x和y中的每一个是19、20、21、22或23。在某些实施方案中，x＝y＝19。在又其他实施方案中x＝y＝23。在另外的实施方案中该化合物包含位于交替位置的修饰的核糖核苷酸，其中(N)x的5′和3′末端的每个N是糖残基修饰的并且中间的核糖核苷酸是未修饰的，例如，19-mer链的位置10、21-mer的位置11、23-mer链的位置12的核糖核苷酸。
在其中x＝y＝21或x＝y＝23的一些实施方案中，19-mer的修饰位置进行调整以用于21mer和23mer，条件是反义链的中间核苷酸优选是未修饰的。
在一些实施方案中，(N)x和(N′)y都没有在3′和5′末端磷酸化。在其他实施方案中(N)x和(N′)y的任一个或两个都在3′末端磷酸化。在又一个实施方案中，(N)x和(N′)y的任一个或两个都使用不可裂解的磷酸基团在3′末端磷酸化。在又一个实施方案中，(N)x和(N′)y的任一个或两个都使用可裂解的磷酸基团或不可裂解的磷酸基团在末端的2′末端位置磷酸化。这些特殊的siRNA化合物也是平端和末端非磷酸化的；然而，对比实验表明，在一个或两个3′末端磷酸化的siRNA化合物与非磷酸化的化合物的活性具有相似的体内活性。
在所有上述结构的某些实施方案中，该化合物是平端的，例如其中Z和Z′二者都不存在。在可选择的实施方案中，该化合物包含至少1个3′突出端，其中Z或Z′中的至少1个存在。Z和Z′独立地包含一个或多个共价连接的修饰的或未修饰的核苷酸，例如反向dT或dA、dT、LNA、镜像核苷酸和类似核苷酸。在一些实施方案中Z和Z′中的每一个独立地选自dT和dTdT。其中存在Z和/或Z′的siRNA与其中不存在Z和Z′的siRNA有相似的活性和稳定性。
在所有上述结构的某些实施方案中，该化合物包含一个或多个膦酰基羧酸酯和/或亚膦酰基羧酸酯核苷酸(PACE核苷酸)。在一些实施方案中PACE核苷酸是脱氧核糖核苷酸和膦酰基羧酸酯核苷酸是膦酰基醋酸酯核苷酸。美国专利号6,693,187和7,067,641公开了PACE核苷酸和类似物的实例，二者在此通过引用并入。
在所有上述结构的某些实施方案中，该化合物包含一个或多个锁核酸(LNA)也称为桥接核酸或双环核酸。优选地锁核酸是2′-O，4-C-亚乙基核苷(ENA)或T-O，4-C-亚甲基核苷。WO 98/39352，WO 00/47599和WO 99/14226公开了LNA和ENA核苷酸的其他实施例，其全部在此通过引用并入。
在所有上述结构的某些实施方案中，该化合物包含一个或多个阿卓糖醇单体(核苷酸)，也称为1，5酐-2-脱氧-D-阿卓糖醇-己糖醇(参见例如Allart等人，1998.Nucleosides&Nucleotides 17：1523-1526；Herdewijn等人，1999.Nucleosides&Nucleotides 18：1371-1376；Fisher等人，2007，NAR 35(4)：1064-1074；其全部在此通过引用并入)。
本发明明确地排除N和/或N′中的每一个是脱氧核糖核苷酸(D-A、D-C、D-G、D-T)的化合物。在某些实施方案中(N)x和(N′)y可独立地包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中本发明提供化合物，其中每个N是未修饰的核糖核苷酸并且(N′)y的3′末端核苷酸或3′末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸是脱氧核糖核苷酸。在又其他的实施方案中，每个N是未修饰的核苷酸并且(N′)y的5′末端核苷酸或5′末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸是脱氧核糖核苷酸。在进一步的实施方案中，(N)x的5′末端核苷酸或5′末端的2、3、4、5、6、7、8或9个连续核苷酸和3′末端的1、2、3、4、5或6个连续核苷酸是脱氧核糖核苷酸并且每个N′是未修饰的核糖核苷酸。在又进一步的实施方案中，(N)x包含未修饰的核糖核苷酸和独立地位于5′和3′末端的每个末端的1或2、3或4个连续的脱氧核糖核苷酸和内部位置的1或2、3、4、5或6个连续的脱氧核糖核苷酸，并且每个N′是未修饰的核糖核苷酸。在某些实施方案中，(N′)y的3′末端核苷酸或3′末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸或(N)x的5′末端核苷酸或5′末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸是脱氧核糖核苷酸。本发明的化合物排除其中N和/或N′中的每一个是脱氧核糖核苷酸的化合物。在一些实施方案中5′末端核苷酸N或2或3个连续的N和1、2、或3个N′是脱氧核糖核苷酸。美国专利公布2005/0004064和Ui-Tei，2008(NAR 36(7)：2136-2151)公开了活性DNA/RNA siRNA嵌合体的某些实例，其在此通过引用整体并入。
除非另有说明，在本文讨论的结构的优选实施方案中每个连续的N或N′之间的共价键是磷酸二酯键。
由本发明提供的另外一种新分子是寡核苷酸，所述寡核苷酸包括连续的核苷酸，其中该核苷酸的第一区段编码第一个抑制RNA分子，该核苷酸的第二区段编码第二个抑制RNA分子，并且该核苷酸的第三区段编码第三个抑制RNA分子。所述第一区段、第二区段和第三区段中的每一个可包含双链RNA的一条链并且所述第一区段、第二区段和第三区段可通过连接体连接起来。此外，寡核苷酸可包含通过一个或多个连接体连接起来的三个双链区段。
因此，本发明提供的一种分子是寡核苷酸，所述寡核苷酸包含编码三个抑制RNA分子的连续的核苷酸；所述寡核苷酸可具有三链结构，因此三个双链臂通过一个或多个连接体连接起来，例如在上文出现的任何一个连接体。该分子形成“星”状结构，并且也可在本文称为RNAstar。所述三链寡核苷酸可能是具有以下整体结构的寡核糖核苷酸：
5′Oligo1(有义)    连接体A Oligo2(有义)    3′
3′Oligo1(反义)    连接体B Oligo3(有义)    5′
3′Oligo3(反义)    连接体C Oligo2(反义)    5′
或
5′Oligo1(有义)    连接体A Oligo2(反义)    3′
3′Oligo1(反义)    连接体B Oligo3(有义)    5′
3′Oligo3(反义)    连接体C Oligo2(有义)    5′
或
5′Oligo1(有义)    连接体A Oligo3(反义)    3′
3′Oligo1(反义)    连接体B Oligo2(有义)    5′
3′Oligo3(有义)    连接体C Oligo2(反义)    3′
其中存在连接体A、连接体B或连接体C中的一个或多个；两个或多个寡核苷酸和连接体A-C中的一个或多个的任何组合是可能的，只要保持链的极性和分子的整体结构。此外，如果存在连接体A-C中的两个或多个，其可相同或不同。
因此，形成三臂结构，其中每个臂包含有义链和基本上互补的反义链(即Oligo1反义碱基配对Oligo1有义等)。三臂结构可以是三链，其使每个臂具有碱基配对。
此外，上述三链结构可在一个或多个链中具有缺口而不是连接体。这种带有缺口的分子是技术上四链的而非三链；插入额外的缺口或切口将导致分子具有额外的链。由本发明的发明人获得的初步结果显示所述有缺口的分子比类似的但是无缺口的分子在抑制某些靶基因中更具活性。这也可能是有切口的分子的情况。
共价键是指连接一个核苷酸单体到相邻核苷酸单体的核苷酸间键合。共价键包括，例如，磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、P-烃氧基键、P-羧基键和类似键。RNA和DNA正常的核苷酸间键合是3′到5′磷酸二酯键合。在某些优选实施方案中共价键是磷酸二酯键。共价键涵盖不含磷的核苷酸间键合，如尤其是在WO 2004/041924中公开的那些。除非另有说明，在本发明讨论的结构的优选实施方案中，每个连的续N或N′之间的共价键是磷酸二酯键。
对于上述所有结构，在一些实施方案中(N)x的寡核苷酸序列与(N′)y的寡核苷酸序列完全互补。在其他实施方案中(N)x与(N′)y基本上互补。在某些实施方案中(N)x与靶序列完全互补。在其他实施方案中(N)x与靶序列基本上互补。
定义
为了方便起见，在此描述了说明书、实施例和权利要求中使用一些术语。
应当注意的是，除非内容明确规定相反，否则在此作为单数形式使用的“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。
本发明的观点或实施方案以马库什群组或其他替代群组的方式来描述，本领域技术人员将理解，本发明还可因此以该群组的任何个体成员或成员子群来描述。
“促凋亡多肽”指任何上述所列基因包括剪接变体、同种型、直系同源物、或旁系同源物和类似形式编码的多肽。
“抑制剂”是能降低基因表达或该基因产物活性到足以达到所需生物学或者生理效应程度的化合物。在此所使用的术语“抑制剂”指一个或多个寡核苷酸抑制剂，包括siRNA、shRNA、miRNA和核酶。抑制也可被称为下调，或对于RNAi称为沉默。
在此所使用的术语“抑制”指降低基因表达或该基因产物活性到足以达到期望的生物学或者生理效应。抑制可以是完全或部分抑制。
在此所使用的术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，并指包含脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的核苷酸序列。该术语也应理解为等同地包含由核苷酸类似物制成的RNA或DNA类似物。贯穿本申请列出mRNA序列以描述相应基因的靶标。术语“mRNA多核苷酸序列”和mRNA可互换使用。
“寡核苷酸”或“寡聚体”指从约2到约50个核苷酸的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列。每个DNA或RNA核苷酸可以独立地为天然的或合成的，和/或修饰的或未修饰的。修饰包括糖部分、碱基部分和/或寡核苷酸中核苷酸间键合的变化。本发明的化合物包括含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸及其组合的分子。
在此所使用的术语“非配对的核苷酸类似物”是指包含非碱基配对的部分的核苷酸类似物，该非碱基配对的部分包括但不限于：6脱氨基腺苷(水粉蕈素)、4-Me-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me核糖U、N3-Me核糖T、N3-Me dC、N3-Me-dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-乙基-dC、N3-Me dC。在一些实施方案中非碱基配对的核苷酸类似物是核糖核苷酸。在其他实施方案中非碱基配对核苷酸类似物是脱氧核糖核苷酸。
本发明提供抑制体内靶基因表达的方法和组合物。通常，该方法包括施用寡核糖核苷酸，特别是小干扰RNA(例如siRNA)或是可以在细胞中产生siRNA的核酸材料，以靶向SEQ ID NOS：1-41、46-48中的任一个所示的mRNA，其以通过RNA干扰机制足以下调靶基因表达的量施用。特别地，该方法用于抑制基因表达以治疗患有与该基因表达相关的疾病的受试者。根据本发明，靶基因的siRNA分子或抑制剂用作药物治疗以各种病变。
“核苷酸”是指包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，其可以是天然的或合成的，和修饰的或未修饰的。修饰包括糖部分、碱基部分和/或核苷酸间键合的变化和置换。
核苷酸/寡核苷酸的所有类似物或修饰可在本发明中使用，条件是所述类似物或修饰不显著不利地影响核苷酸/寡核苷酸的功能。可接受的修饰包括糖部分的修饰、碱基部分的修饰、核苷酸间键合的修饰和其组合。
本发明中有时被称为“脱碱基核苷酸”或“脱碱基核苷酸类似物”的化合物更恰当地是指假核苷酸或非常规部分。核苷酸是核酸的单体单元，由核糖或脱氧核糖、磷酸酯、和碱基(在DNA中是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶；在RNA中是腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶)组成。修饰的核苷酸包括在糖基、磷酸酯和或碱基中的一个或多个上的修饰。脱碱基假核苷酸没有碱基，因此不是严格的核苷酸。
在此使用的术语“加帽部分”包括脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、修饰脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分包括2′O烃基修饰，反向脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分及其修饰；C6-亚氨基-Pi；镜像核苷酸，包括L-DNA和L-RNA；5′O Me核苷酸；和核苷酸类似物，包括4′，5′-亚甲基核苷酸，1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸，4′-硫代核苷酸，碳环核苷酸，磷酸5′-氨基烃基酯，磷酸1，3-二氨基-2-丙酯，磷酸3-氨基丙酯，磷酸6-氨基己酯，磷酸12-氨基十二烷基酯，磷酸羟丙酯，1，5-失水己糖醇核苷酸，α-核苷酸，苏-戊呋喃糖基核苷酸，无环3′，4′-开环核苷酸，3，4-二羟基丁基核苷酸，3，5-二羟基戊基核苷酸，5′-5′-反向脱碱基部分，1，4-丁二醇磷酸，5′-氨基；和桥接或非桥接的甲基膦酸酯和5′-巯基部分。
某些优选加帽部分是脱碱基核糖或脱碱基脱氧核糖部分，反向脱碱基核糖或者脱碱基脱氧核糖部分，C6-氨基-Pi，包括L-DNA和L-RNA的镜像核苷酸。图22所示为C6-氨基磷酸酯5′加帽部分及其与5′末端(N′)的连接点的化学结构。
在此使用的术语“非常规部分”是指脱碱基核糖部分，脱碱基脱氧核糖部分，脱氧核糖核苷酸，修饰的脱氧核糖核苷酸，镜像核苷酸，非碱基配对的核苷酸类似物和通过2′-5′核苷酸间磷酸键与相邻核苷酸连接的核苷酸；包括LNA和亚乙基桥接核酸的桥接核酸。
脱碱基脱氧核糖部分包括例如脱碱基脱氧核糖-3′-磷酸酯、1，2-双脱氧-D-呋喃核糖-3-磷酸酯、1，4-脱水-2-脱氧D-核糖醇-3-磷酸酯。反向脱碱基脱氧核糖部分包括反向脱氧核糖脱碱基、3′，5′反向脱氧脱碱基5′-磷酸酯。
镜像核苷酸包括例如L-DNA(L-脱氧核糖腺苷-3′-磷酸酯(镜像dA)、L-脱氧核糖胞苷-3′-磷酸酯(镜像dC)、L-脱氧核糖鸟苷-3′-磷酸酯(镜像dG)、L-脱氧核糖胸苷-3′-磷酸酯(镜像dT))和L-RNA(L-核糖腺苷-3′-磷酸酯(镜像rA)、L-核糖胞苷-3′-磷酸酯(镜像rC)；L-核糖鸟苷-3′-磷酸酯(镜像rG)、L-核糖尿嘧啶-3′-磷酸酯(镜像dU))。
修饰的脱氧核糖核苷酸包括，例如5′O Me DNA(5-甲基-脱氧核糖鸟苷-3′-磷酸酯)其可用作5′末端位置(位置编号1)的核苷酸；PACE(脱氧核糖胸苷3′磷乙酸，脱氧核糖胞苷3′磷乙酸，脱氧核糖鸟苷3′磷乙酸，脱氧核糖胸苷3′磷乙酸。
桥接核酸包括LNA(2′-O，4′-C-亚甲基桥接核酸腺苷3′单磷酸酯，2′-O，4′-C-亚甲基桥接核酸5-甲基-胞苷3′单磷酸酯，2′-O，4′-C-亚甲基桥接核酸鸟苷3′单磷酸酯，5-甲基-尿苷(或胸苷)3′单磷酸酯)；和ENA(2′-O，4′-C-亚乙基桥接核酸腺苷3′单磷酸′，2′-O，4′-C-亚乙基桥接核酸5-甲基-胞苷3′单磷酸酯，2′-O，4′-C-亚乙基桥接核酸鸟苷3′单磷酸酯，5-甲基-尿苷(或胸苷)3′单磷酸酯)。
在本发明的一些实施方案中，优选的非常规部分是脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸，和通过2′-5′核苷酸间磷酸键与相邻核苷酸连接的核苷酸。
核苷酸选自天然生成或合成的修饰碱基。天然生成碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核苷酸的修饰碱基包括次肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基及其他烃基腺嘌呤、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫脲嘧啶、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-巯基腺嘌呤、8-硫烃基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤及其他8-取代腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、8-硫烃基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤及其他取代鸟嘌呤、其他氮杂和脱氮腺嘌呤、其他氮杂和脱氮鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。本发明包括脱碱基假核苷酸，和包含交替的RNA和DNA核苷酸的分子。包含修饰的碱基的核苷酸单体，包括脱碱基假核苷酸单体，可取代寡核苷酸的一个或多个核糖核苷酸。脱碱基假核苷酸单体可包含于一个或多个末端位置或作为5′末端加帽。5′末端加帽也可选自反向脱碱基假核苷酸类似物、L-DNA核苷酸和C6-亚胺磷酸酯。
此外，制备了多核苷酸的类似物，其中一个或多个核苷酸的结构基本改变并较好地适于用作治疗或试验的试剂。核苷酸类似物的实例是肽核酸(PNA)，其中在DNA(或RNA)的脱氧核糖(或核糖)磷酸酯主链包含与多肽中发现的主链相似的聚酰胺主链。已证明PNA类似物对酶促降解有抗性，并在体内和体外具有延长的寿命。
糖残基上的可能修饰是多样的，并包括2′-O烃基、锁核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、阿拉伯糖苷、阿卓糖醇(ANA)及其他6-元糖包括吗啉和环己炔基(cyclohexinyls)。
LNA化合物公开于国际专利公布号WO 00/47599，WO 99/14226，和WO 98/39352。包含LNA核苷酸的siRNA化合物的实例公开于Elmen等人(NAR 2005.33(1)：439-447)和国际专利公布号WO 2004/083430。六元环核苷酸类似物公开于Allart等人(Nucleosides&Nucleotides，1998，17：1523-1526，和Perez-Perez等人1996，Bioorg and Medicinal Chem Letters6：1457-1460)。国际专利申请公布号WO 2006/047842公开了包含6-元环核苷酸类似物的寡核苷酸，所述6-元环核苷酸类似物包括己六醇和阿卓糖醇核苷酸单体)。
本发明的化合物利用一种或多种反向核苷酸，如反向胸苷或反向腺嘌呤(例如，参见Takei等人，2002.JBC 277(26)：23800-06)合成。
本发明上下文中，“镜像”核苷酸(也称为镜像异构体)，是具有与天然生成或常用核苷酸相反的手性，即为天然生成或常用核苷酸的镜像，的核苷酸类似物。镜像核苷酸是核糖核苷酸(L-RNA)或脱氧核糖核苷酸(L-DNA)，并还可包含至少一个糖或者碱基修饰和/或主链修饰，比如磷硫酰或膦酸酯部分。美国专利号6,602,858公开了包含至少一个L-核苷酸取代的核酸催化剂。
主链修饰，如乙基(产生磷酸-乙基三酯)，丙基(产生磷酸-丙基三酯)，和丁基(产生磷酸-丁基三酯)也是可以的。其他主链修饰包括聚合物主链、环状主链、非环状主链、硫代磷酸-D-核糖主链、酰胺化物、磷乙酸衍生物。某些结构包括具有一个或多个2′-5′核苷酸间键合(桥接或主链)的siRNA化合物。
在一些实施方案中，(N)x和(N′)y都没有在3′和5′末端磷酸化。在其他实施方案中(N)x和(N′)y中的任一个或两个在3′末端磷酸化(3′Pi)。在又一实施方案中，(N)x和(N′)y任一个或两个都使用不可裂解的磷酸基团在3′末端磷酸化。在又一实施方案中，(N)x或/和(N′)y的任一个或两个都使用可裂解的磷酸基团或不可裂解的磷酸基团在末端的2′末端位置磷酸化。此外，本发明的抑制性核酸分子可包含一个或多个缺口和/或一个或多个切口和/或一个或多个错配。不希望受限于理论，缺口、切口和错配有在使所述核酸/siRNA部分不稳定优点，因此其可由内源细胞结构，如DICER、DROSHA或RISC更容易地加工成其抑制性组分。
本发明的上下文中，核酸中的缺口指一条链中一个或多个内部核苷酸的缺失，而核酸中的切口指一条链中两个相邻核苷酸间核苷酸间键合的缺失。本发明的任何分子可包含一个或多个缺口和/或一个或多个切口。
寡核苷酸
表B(B1-B74)，表C(C1-C4)和表D(D1-D34)包含在制备siRNA化合物中有用的有义寡聚体的核酸序列和对应反义寡聚体的核酸序列。这些化合物用作化学和/或结构修饰的化合物。
与已知基因相应的siRNA的筛选和合成已有广泛报道，参见例如Ui-Tei等人，J Biomed Biotechnol.2006：65052；Chalk等人，BBRC.2004，319(1)：264-74；Sioud&Leirdal，Met.Mol Biol.2004，252：457-69；Levenkova等人，Bioinform.2004，20(3)：430-2；Ui-Tei等人，NAR.2004，32(3)：936-48。关于修饰的siRNA的用途和生产的实例参见如Braasch等人Biochem.2003，42(26)：7967-75；Chiu等人，RNA.2003，9(9)：1034-48；PCT公布号WO2004/015107和WO02/44321和美国专利号5,898031和6,107,094。
本发明提供双链寡核苷酸(例如siRNA)，该双链寡核苷酸下调所需基因的表达。本发明的siRNA是双链体寡核糖核苷酸，其中有义链源自于所需基因的mRNA序列，且反义链至少基本与有义链互补。通常，与靶mRNA序列的一些偏差是允许的而不妨害siRNA活性(参见如Czauderna等人NAR.2003，31(11)：2705-2716)。本发明的siRNA在转录后水平上抑制基因表达，该过程伴随或不伴随mRNA的破坏。不限于理论，siRNA可使mRNA靶向特异切割和降解，和/或可抑制所靶向的信息的翻译。
在一些实施方案中，选自表D(D1-D34)的寡核苷酸对包含修饰的siRNA，该修饰的siRNA具有一个或多个在此公开的任何修饰。在不同实施方案中siRNA包含含有第一链和第二链的RNA双链体，第一链包含与靶核酸的约18到约40个连续核苷酸至少部分互补的核糖核苷酸序列，所述靶核酸为从靶基因转录的mRNA，且第二链包含与第一链至少部分互补的核糖核苷酸序列，并且其中所述第一链和/或所述第二链包含修饰的核糖核苷酸的许多组，任选地具有在糖部分的2′-位置上的修饰，由此在每条链内每个修饰的核糖核苷酸组的一侧或两侧的侧翼为一个侧翼核苷酸组，任选地核糖核苷酸，形成侧翼核糖核苷酸组的每个核糖核苷酸选自未修饰的核糖核苷酸或具有不同于所述修饰的核糖核苷酸组中的修饰的修饰的核糖核苷酸。
在一些实施方案中修饰的核糖核苷酸组和/或侧翼核苷酸组包含选自由从1到12的整数组成的组的数量的核糖核苷酸。因此该组包含一个核苷酸，二个核苷酸，三个核苷酸，四个核苷酸，五个核苷酸，六个核苷酸，七个核苷酸，八个核苷酸，九个核苷酸，十个核苷酸，十一个核苷酸或十二个核苷酸。
修饰的核苷酸和侧翼核苷酸的组可以在一条链或两条链上的模式组织。在一些实施方案中反义和有义链包含交替的未修饰的和2′糖修饰的核糖核苷酸。在一些优选的实施方案中，反义链的中间核糖核苷酸是未修饰的核苷酸。例如，在19-寡聚体反义链中，位置10的核糖核苷酸是未修饰的；在21-寡聚体反义链中，位置11的核糖核苷酸是未修饰的；和在23-寡聚体反义链中，位置12的核糖核苷酸是未修饰的。siRNA的修饰或修饰模式，如果有的话，必须设计成允许这样。在偶数寡聚体，例如22mer，中间核苷酸可在位置11或12。
在糖基2′部分的可能修饰包括氨基，氟，甲氧烃氧基，烃基，氨基，氟，氯，溴，CN，CF，咪唑，羧酸酯，硫酯(thioate)，C1到C10的低级烃基，取代的低级烃基，烃芳基(alkaryl)或者芳烃基，OCF3，OCN，O-，S-，或N-烃基；O-，S，或N-链烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2，N3；杂环烃基(heterozycloalkyl)；杂环芳基(heterozycloalkaryl)；氨基烃胺基；聚烃胺基或者取代的甲硅烷基，尤其如描述于欧洲专利EP 0 586 520B1或者EP 0 618 925B1中的。在本发明的化合物中一个或多个脱氧核糖核苷酸也是允许的。如在此所用，在描述用于在此公开的分子、RNAi或者RNAi的任何实施方案的设计的任何策略时，术语“末端修饰”意思是加到有义和/或反义链的末端5′或者3′核苷酸的化学实体。这种末端修饰的实例包括但不局限于3′或者5′磷酸酯、反向脱碱基、脱碱基、氨基、氟、氯、溴、CN、CF3、甲氧基、咪唑基、羧酸酯、硫代磷酸酯、C1到C22和低级烃基、脂质、糖和聚氨基酸(即肽)、取代的低级烃基、烃芳基或者芳烃基、OCF3、OCN、O-、S-、或N-烃基；O-、S-、或N-链烯基；SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、杂环烃基、杂环芳基、氨基烃胺基、聚烃胺基或者取代的甲硅烷基，尤其如描述于欧洲专利EP 0 586 520B1或EP 0 618 925B1中的。
在一些实施方案中siRNA是在一端或两端为平端的，即Z和Z′不存在。更具体地说，siRNA可能在由第一链的5′末端和第二链的3′末端定义的末端，和/或由第一链的3′末端和第二链的5′末端定义的末端是平端的。
在其他实施方案中两条链中的至少一个在5′-末端可具有至少一个核苷酸的突出端；该突出端可由至少一个脱氧核糖核苷酸组成。所述链的至少一个也可任选地在3-末端具有至少一个核苷酸的突出端。该突出端可由从大约1到大约5个的核苷酸组成。
RNA双链体的长度从大约18到大约40个核糖核苷酸，优选19、21或者23个核糖核苷酸。此外，每条链的长度可独立地具有选自由大约15到大约40个碱基，优选18到23个碱基，更优选19、21或者23个核糖核苷酸组成的组。
在某些实施方案中所述第一链和靶核酸间的互补性可以是完全的。在一些实施方案中，链是基本上互补的，即，在所述第一链和靶mRNA之间或第一链和第二链之间有一个，两个或多达五个错配。基本上互补指与另一序列的互补性大于大约70％，并小于100％。例如在由19个碱基对组成的双链体区域，一个错配产生94.7％的互补性，两个错配产生大约89.5％的互补性，三个错配产生大约84.2％的互补性，四个错配产生大约79％的互补性和五个错配产生大约74％的互补性，表现为双链体区域基本上互补。因此，基本等同指与另一序列具有大于大约70％的同一性。
第一链和第二链可以由环结构连接，该环结构可包括非核酸聚合体比如，尤其是聚乙二醇。可选择地，该环结构可包括核酸，包括修饰的和非修饰的核糖核苷酸以及修饰的和非修饰的脱氧核糖核苷酸。
此外，siRNA第一链的5′末端可连接到第二链的3′-末端，或者第一链的3′-末端可连接到第二链的5′-末端，所述连接经由核酸连接体连接，该连接体典型地具有2-100个核酸碱基，优选大约2到大约30个核酸碱基长度。
在本发明化合物的优选实施方案中，该化合物在其反义和有义链的至少一条上具有交替的核糖核苷酸修饰，对于19mer和23mer寡聚体，在反义链5′和3′末端的核糖核苷酸的糖基上是修饰的，并且在有义链5′和3′末端的核糖核苷酸的糖基上是未修饰的。对于21mer寡聚体，在有义链的5′和3′末端的核糖核苷酸上的糖基是修饰的，和在反义链5′和3′末端核糖核苷酸上的糖基是未修饰的，或者可具有在3′末端的任选的另外的修饰。如上所述，优选反义链的中间核苷酸是未修饰的。
根据本发明的一个优选实施方案，寡核苷酸/siRNA的反义和有义链仅在3′末端而不在5′-末端磷酸化。根据本发明的另一优选实施方案，反义和有义链是非磷酸化的。根据本发明的又一优选实施方案，有义链最5′端的核糖核苷酸是修饰的，以取消体内5′-磷酸化的任何可能性。
在此公开的任何siRNA序列制备成具有在此公开的任何修饰或结构。序列和结构的组合是新颖的，并且在本文所公开的病症的治疗中有用的。
药物组合物
虽然本发明的化合物可以以化学原料形式施用，但优选将其作为药物组合物施用。因此本发明提供包含一种或多种本发明的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。该组合物可包含两种或多种不同寡核苷酸/siRNA的混合物。
本发明进一步提供药物组合物，该药物组合物包含有效抑制上文公开的一种或多种基因的量的与一种或多种本发明的化合物共价或非共价连接的至少一种化合物，和药学上可接受的载体。该化合物可经内源细胞复合物胞内处理产生一种或多种本发明的寡核糖核苷酸。
本发明还提供药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体和有效下调细胞中靶基因表达的量一种或多种本发明的化合物，该化合物包含与(N)x的序列基本互补的序列。在某些实施方案中，靶基因是病毒、细菌或哺乳动物的基因。在不同实施方案中靶基因是哺乳动物的基因，优选人类基因。
因此，本发明提供与对照相比抑制靶基因表达至少50％的方法，该方法包括将靶基因的mRNA转录物与一种或多种本发明的化合物接触。在一些实施方案中与对照相比，活性siRNA化合物以至少50％、60％或70％的水平抑制基因表达。在某些优选实施方案中与对照相比的抑制水平为至少75％、80％或90％。在一些实施方案中靶基因是在此公开的促凋亡基因。
在一个实施方案中寡聚核糖核苷酸抑制一种或多种本发明的促凋亡基因，其中抑制选自由抑制基因功能、抑制多肽和抑制mRNA表达组成的组。
在一个实施方案中化合物抑制靶基因编码的多肽的表达，其中抑制选自由抑制功能(其可通过尤其是酶测定或与天然基因/多肽的已知相互作用物的结合测定来检验)，抑制蛋白(其可通过尤其是蛋白质印迹、ELISA或免疫沉淀检验)和抑制mRNA表达(其可通过尤其是RNA印迹、定量RT-PCR、原位杂交或微阵列杂交检验)组成的组。
在另外的实施方案中本发明提供治疗患有伴有本发明的促凋亡基因水平上升的疾病的受试者的方法，该方法包括给受试者施用治疗有效剂量的本发明的化合物从而治疗受试者。
更特别地，本发明提供寡聚核糖核苷酸，其中一条链包含从5′到3′具有如表B所示的序列的连续核苷酸或其同源物，其中多达两个核糖核苷酸与互补链的核糖核苷酸不配对。
此外，根据本发明的另外的核酸包含如表B(表B1-B74)所示的任一多核苷酸寡聚体的至少14个连续核苷酸，并且更优选地包含如上所述第一链和第二链的双链结构的任何末端的14个连续核苷酸碱基对。
递送
本发明的siRNA分子可通过直接应用与载体或稀释剂制备的裸分子而递送于靶组织。
术语“裸siRNA”是指无作为协助、促进或便于其进入细胞的任何运载体(vehicle)的siRNA分子，所述运载体包括病毒序列、病毒粒子、脂质体制剂、脂质体或沉淀剂和类似运载体。例如溶于PBS的siRNA是“裸siRNA”。
然而，在一些实施方案中本发明的siRNA分子在脂质体或脂质体制剂等中递送并通过本领域技术人员所熟知的方法制备。这些方法描述于如美国专利号5,593,972，5,589,466，和5,580,859，其在此通过引用并入。
已开发了专门为提高和改善siRNA递送入哺乳动物细胞的递送系统，(参见，例如Shen等人FEBS Let.2003，539：111-114；Xia等人，2002，20：1006-1010；Reich等人，Mol.Vision 2003，9：210-216；Sorensen等人，J.Mol.Biol.2003.327：761-766；Lewis等人，Nat.Gen.2002，32：107-108和Simeoni等人，NAR 2003，31，11：2717-2724)。最近siRNA已被成功用于灵长类基因表达的抑制(参见，例如Tolentino等人，Retina 24(4)：660.)。
药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和溶媒以及植入载体通常是指不与本发明的活性成分起作用的惰性非毒性的固态或液态填充剂、稀释剂或封装材料，并且其包括脂质体和微球体。用于本发明的递送系统的实例包括美国专利号5,225,182；5,169,383；5,167,616；4,959,217；4,925,678；4,487,603；4,486,194；4,447,233；4,447,224；4,439,196；和4,475,196。许多其他类似的植入体、递送系统和模块是本领域技术人员所熟知的。在本发明一个具体实施方案中可选择局部和经皮制剂。本发明的siRNA或药物组合物根据良好的医学惯例、考虑患者个体的临床病症、要治疗的疾病、施用的部位和方法、施用时间安排、患者年龄、性别、体重和医生已知的其他因素来施用和定剂量。
用于本文目的的“治疗有效剂量”由此通过本领域已知的此类因素决定。剂量必须有效实现改善，包括但不限于提高存活率或更迅速恢复，或改善或消除症状和本领域技术人员选择作为适当措施的其他指标。
一般来说，对人类化合物的有效剂量为每天从1ng/kg到约20-100mg/kg体重，优选每天约0.01mg到约2-10mg/kg体重，在以下方案中：每天1个剂量、或每天2次或3次或更多次，持续1-4周或更久。
本发明的化合物可以通过任何传统的施用路径施用。应该注意的是，所述化合物作为化合物本身或作为药学上可接受的盐施用，并且单独施用或作为活性成分与药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和溶媒联合施用。该化合物口服、局部，皮下，或胃肠外包括静脉内、动脉内、肌肉内、腹腔内和鼻内，吸入，经鼓膜内施用以及鞘内注射和灌输技术施用。该化合物的植入体也是有用的。可制备液体形式以用于注射，该术语包括皮下、经皮、静脉内、肌肉内、鞘内和其他胃肠外施用路径。液体组合物包括水溶液，含或不含有机共溶剂、水或油悬浮液、食用油乳剂以及类似的药学溶媒。在特定实施方案中，施用包含静脉内施用。在另一个实施方案中施用包含局部(topical)或区域(local)施用。
此外，在某些实施方案中用于本发明的新治疗的组合物可以配制为气溶胶，例如用于鼻内施用。
在某些实施方案中，口腔组合物(如片剂、悬浮液、溶液)可对口腔局部递送是有效的，如适于作为漱口水用于治疗口腔粘膜炎的口腔组合物。
在优选实施方案中接受治疗的受试者是温血动物和特别是哺乳动物包括人类。
在另外的实施方案中，修饰是磷酸部分的修饰，其中修饰的磷酸部分选自包含磷硫酰的基团或无磷酸基团。
本发明的分子包含siRNA、合成siRNA、合成shRNA，以及编码此类分子或其他抑制性核苷酸分子的其他核酸序列或分子。
进一步的末端修饰是生物素基团。该生物素基团可优选结合于第一和/或第二链最5′或3′核苷酸或两个末端。在更优选实施方案中生物素与多肽或蛋白质偶联。通过任何其他前述末端修饰结合多肽或蛋白质也在本发明的范围内。
在此公开的各种末端修饰优选位于根据本发明的核酸的核苷酸的核糖部分。更特别地，末端修饰可结合或置换核糖部分的任何OH-基，包括但不限于2′OH、3′OH和5′OH位置，条件是因此修饰的核苷酸是末端核苷酸。反向脱碱基或脱碱基是无核碱基部分的核苷酸，无论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。这种化合物尤其是Sternberger，M等人描述的(2002，Antisense Nucleic Acid Drug Dev，12，131-43)。siNA化合物描述于国际专利申请WO 03/070918。
应理解，在本发明的情况下，在此公开的任何siRNA分子，或任何长双链RNA分子(通常25-500个核苷酸长度)，其由内源细胞复合体(如DICER，参见上文)加工以形成在此公开的siRNA分子，或包含在此公开的siRNA分子的分子，包括在本发明的分子内以形成其他新分子，和用于治疗在此描述的疾病或疾患。
特别地，考虑包含一个或多个茎和环结构的长寡核苷酸(通常约80-500个核苷酸长度)，其中茎区域包含本发明的寡核苷酸，可由载体递送，优选药学上可接受的载体，或可通过内源细胞复合体(例如通过上文描述的DROSHA和DICER)在细胞内加工以产生为本发明的寡核苷酸的一个或多个更小的双链寡核苷酸(siRNA)。此寡核苷酸称为串联shRNA结构。考虑此长寡核苷酸是包含一个或多个茎和环结构的单链寡核苷酸，其中每个茎区域包含有义和相应的反义siRNA序列。任何分子，例如包含在此公开的抑制序列的反义DNA分子(具有合适的核酸修饰)是特别需要的，并可以与相应的RNA/siRNA相同的能力用于在此公开的所有用途和方法。
此外，可制备多核苷酸的类似物，其中核苷酸的结构根本地改变和更适合作为治疗或实验试剂。核苷酸类似物的实例是肽核酸(PNA)其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸主链包含与肽中发现的主链类似的聚酰胺主链。PNA类似物已显示酶降解抗性并在体内和体外具有延长的寿命。另外，已显示PNA比DNA分子更强地结合互补的DNA序列。这个发现被归因于PNA链和DNA链之间缺乏电荷排斥。用于合成寡核苷酸的其他修饰的单体包括具有聚合物主链、环主链或无环主链的部分。
治疗方法
本发明的另一方面涉及需要治疗的受试者的与靶基因，即表A的促凋亡基因，的异常表达相关的疾病或疾患的治疗方法，该方法包括给受试者施用减少或抑制这些基因表达的量的抑制剂。
在优选实施方案中，治疗的受试者是温血动物和特别是哺乳动物包括人类。
本发明的方法包括以治疗有效剂量给受试者施用下调表A中的促凋亡基因表达的一种或多种抑制性化合物，并且特别是siRNA从而治疗受试者。
术语“治疗”指治疗方法和预防治疗或预防措施，其中受试者能够被阻止或延迟(减少)在此所列的疾患。需要治疗的受试者包括已经经历该疾病或病症的人，易患该疾病或病症的人，和要预防该疾病或病症的人。本发明的化合物在该疾病或病症或与其相关的症状发作之前、之中或之后施用。在以预防为目的的治疗的情况中，本发明涉及延迟该疾病或疾患发作或防止该疾病或疾患发展的方法。
本发明涉及下调本发明促凋亡基因表达的化合物特别是新的小干扰RNA(siRNA)在治疗下列疾病或病症中的用途，其中抑制所述促凋亡基因表达有益于治疗所述疾病或病症：听力损失，急性肾功能衰竭(ARF)，青光眼，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及其他急性肺和呼吸损伤，肺移植后缺血再灌注损伤，器官移植包括肺、肝脏、心脏、骨髓、胰腺、角膜和肾移植包括DGF，脊髓损伤，压疮，年龄相关性黄斑变性(AMD)，干眼综合征，包括ION和AION的眼缺血病症，口腔粘膜炎和慢性阻塞性肺病(COPD)。其他适应症包括化学诱导的肾毒性和化学诱导的神经毒性，如由顺铂和顺铂样化合物、氨基糖苷、环利尿剂以及对苯二酚及其类似物诱导的毒性。
在此详述本发明的抑制促凋亡基因的方法、分子和组合物，且任何所述分子和/或组合物可有利地用于治疗患有任何所述病症的受试者。
本发明也提供制备药物组合物的方法，该方法包括：
提供一种或多种本发明的化合物；和
将所述化合物与药学上可接受的载体混合。
本发明还提供包含制备药物组合物的方法，该方法包括将一种或多种本发明的化合物与药学上可接受的载体混合。
在优选实施方案中，用于制备药物组合物的化合物以药学有效剂量与载体混合。在特别实施方案中本发明的化合物轭合到类固醇或脂质或其他合适的分子例如胆固醇。
修饰的化合物的合成
本发明的化合物可通过本领域已知的用于合成核糖核酸(或脱氧核糖核酸)寡核苷酸的任何方法来合成。其中这些合成描述于Beaucage和Iyer，Tetrahedron 1992；48：2223-2311；Beaucage和Iyer，Tetrahedron1993；49：6123-6194和Caruthers等人，Methods Enzymol.1987；154：287-313；其中硫酯的合成描述于Eckstein，Annu.Rev.Biochem.1985；54：367-402，RNA分子的合成描述于Sproat，Humana Press2005Herdewijn P.编著；Kap.2：17-31和其中相应的下游过程描述于Pingoud等人，IRL Press 1989OliverR.W.A.编著；Kap.7：183-208。
其他合成方法是本领域已知的，例如描述于Usman等人，J.Am.Chem.Soc，1987，109：7845；Scaringe等人，NAR，1990，18：5433；Wincott等人，NAR 1995，23：2677-2684；和Wincott等人，Methods Mol.Bio.，1997，74：59的方法，并且这些方法可使用常见的核酸保护和偶联基团，如5′-末端的二甲氧三苯甲基，和3′-末端的亚磷酰胺。修饰的(例如2′-O-甲基化)核苷酸和未修饰的核苷酸依照需要并入。
本发明的寡核苷酸可单独合成，并在合成后连接在一起，例如通过连接反应(Moore等人，Science 1992，256：9923；国际专利公布号WO93/23569；Shabarova等人，NAR 1991，19：4247；Bellon等人，Nucleosides&Nucleotides，1997，16：951；Bellon等人，Bioconjugate Chem 1997，8：204)，或通过合成和/或脱保护后的杂交反应。
应该注意的是可使用市场上可获得的设备(可获得的，特别是来自Applied Biosystems)；根据本文公开的序列制备寡核苷酸。通过本领域已知的方法连接化学合成片段的重叠对(例如参见美国专利号6,121,426)。单独合成链然后在试管中互相退火。然后，经HPLC将双链siRNA与没有退火(例如由于其中之一过量)的单链寡核苷酸中分离出来。关于本发明的siRNA或siRNA片段，可合成两个或多个这样的序列并连接到一起以供本发明使用。
本发明的化合物也可通过串联合成方法合成，例如美国专利公布号2004/0019001(McSwiggen)所描述，其中两条siRNA链作为单一的连续寡核苷酸片段或是通过可裂解的连接体分开的链，随后裂解该连接体以提供分离的siRNA片段或是杂交并允许siRNA双链体纯化的链。该连接体选自多核苷酸连接体或者非核苷酸连接体。
本发明进一步提供包含用于治疗本文提到的任何疾病和病症的两种或多种siRNA分子的药物组合物，其中所述两个分子可在药物组合物中物理混合到一起以产生相同或其他有益活性的量，或可共价或非共价地结合，或通过长度介于2-100，优选2-50或2-30个核苷酸，的核酸连接体连接到一起。在一个实施方案中，siRNA分子包含在此描述的双链核酸结构，其中两个siRNA序列选自表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)。
因此，siRNA分子可能共价或非共价地结合或通过连接体连接以形成串联siRNA化合物。包含两个siRNA序列的该串联siRNA化合物通常为约38-150个核苷酸长度，更优选38或40-60个核苷酸长度，并且如果串联分子中含有两个以上siRNA序列则相应的更长。还考虑了包含编码由内部细胞过程产生的siRNA的两个或多个更长的序列的更长的串联化合物，以及编码两个或多个shRNA的串联分子。合成的修饰的串联分子也被认为是本发明的部分。考虑了包含两个或多个本发明siRNA序列的串联化合物。
靶向本发明促凋亡基因的siRNA分子可以是药物组合物中的主要活性成分，或可以是是含有两个或以上siRNA(或者编码或内源产生两个或多个siRNA的分子，分子混合物或编码两个或多个siRNA的一个或多个串联分子)的药物组合物中的一种活性成分，所述药物组合物还包含靶向一个或多个其他基因的一个或多个其他siRNA分子组成。所述其他基因的同时抑制可能对在此公开疾病的治疗具有加成或协同效应。
另外，为了实现对在此公开疾病治疗的增强的靶向，在此公开的促凋亡siRNA或包含该siRNA的任何核酸分子或编码该siRNA的任何核酸分子可任选地连接或结合(共价或者非共价)到针对表达于靶细胞的细胞表面内化分子的抗体(包括适体分子)。例如抗-Fas抗体(优选中和抗体)可与任何促凋亡siRNA结合(共价或者非共价)。
本发明的化合物例如作为双链化合物、作为双链发夹化合物或作为串联化合物递送。还考虑包含一个或多个茎和环结构的长寡核苷酸(典型地25-500个核苷酸长度)，其茎区域包含本发明的寡核苷酸序列，可在载体优选药学上可接受的载体中递送，并且可通过内源细胞复合物在胞内加工(例如通过上述DROSHA和DICER)以产生为本发明的寡核苷酸的一个或多个更小的双链寡核苷酸(siRNA)。该寡核苷酸称为串联shRNA结构。考虑该长寡核苷酸是包含一个或多个茎和环结构的单链寡核苷酸，其中每个茎区域包含本发明促凋亡基因的有义和相应反义siRNA序列。特别地，考虑该寡核苷酸包含描述于表B-D(B1-B74；C1-C4，D1-D34)的如SEQID NOS：97-87，178所示的有义和反义siRNA序列。
RNA干扰
最近公开了许多涉及RNAi现象的PCT申请。这些包括：PCT公布WO00/44895、PCT公布WO00/49035、PCT公布WO00/63364、PCT公布WO01/36641、PCT公布WO01/36646、PCT公布WO99/32619、PCT公布WO00/44914、PCT公布WO01/29058和PCT公布WO01/75164。
RNA干扰(RNAi)是基于dsRNA物类(species)进入胞质蛋白复合物的能力，然后dsRNA在该复合物中靶向互补的细胞RNA并将其特异性降解。RNA干扰反应的特征是包含siRNA的核酸内切酶复合物，该复合物通常称为RNA-诱导的沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解可发生在互补于siRNA双链体的反义链的区域的中间位置(Elbashir等人，Genes Dev.2001，15(2)：188-200)。更详细地，长dsRNA被III型核糖核酸酶(DICER、DROSHA等；Bernstein等人，Nature，2001，409(6818)：363-6；Lee等人，Nature，2003，425(6956)：415-9)消化成短(17-29bp)dsRNA片段(也称为短抑制性RNA，“siRNA”)。RISC蛋白质复合物识别这些片段和互补的mRNA。整个过程以核酸内切酶裂解靶mRNA结束(McManus和Sharp，Nature Rev Genet，2002，3(10)：737-47；Paddison和Hannon，Curr Opin MolTher.2003，5(3)：217-24)。(关于这些术语和建议机理的更多信息，参见例如Bernstein等人，RNA 2001，7(11)：1509-21；Nishikura，Cell 2001，107(4)：415-8和PCT公布WO01/36646)。
一些团体已描述了具有在细胞内生成siRNA能力的基于DNA的载体的开发。方法通常包括在细胞内经有效处理以形成siRNA的短发夹RNA的转录(Paddison等人，PNAS USA 2002，99：1443-1448；Paddison等人，Genes&Dev 2002，16：948-958；Sui等人，PNAS USA 2002，8：5515-5520；和Brummelkamp等人，Science 2002，296：550-553)。这些报道描述了具有特异性靶向众多内源和外源表达基因的siRNA的生成方法。
以例证性方式描述了本发明，并且应理解为使用的专业术语目的在于描述的文字的本质，而不是限制。
明显地，根据上述教导本发明的许多修饰和变化是可能的。因此，应理解在所附权利要求的范围内，本发明可不同于特定的描述而实施。
本发明以实施例为参考详细说明如下，但是不应视为是对其的限制。
本文所引用的任何文献并不是对该文献作为相关先有技术的承认，或者认为是本申请的任何权利要求的取得专利可能性的材料。关于任何文献内容和日期的任何声明是基于申请人在申请时可获得的信息，并且不构成承认关于该声明的正确性。
实施例
无需进一步阐述，相信本领域的技术人员可以利用前面的描述，最大程度地使用本发明。以下优选的具体实施方案因此仅视为是说明性的，而不以任何方式限制所要求保护的发明。
在此没有专门描述的本领域已知的标准分子生物学方案，通常基本遵循如Sambrook等人，Molecular cloning：A laboratory manual(分子克隆实验手册)，Cold Springs Harbor Laboratory，New-York(1989，1992)，和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1988)，和如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)，JohnWiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)，和如Perbal，A Practical Guideto Molecular Cloning(分子克隆实践指南)，John Wiley & Sons，New York(1988)，和如Watson等人，Recombinant DNA(重组DNA)，ScientificAmerican Books(科学美国人丛书)，New York和Birren等人(编辑)，Genome Analysis：A Laboratory Manual Series(基因组分析：实验室手册系列)，第1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)和如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5，192,659和5,272,057中所述的方法，并在此通过引用并入。聚合酶链式反应(PCR)通常遵循PCRProtocols：A Guide To Methods And Applications(PCR方案：方法与应用指南)，Academic Press，San Diego，CA(1990)。原位(细胞内)PCR结合流式细胞术用于检测含有特定DNA和mRNA序列的细胞(Testoni等人，Blood 1996，87：3822)。执行RT-PCR的方法也是本领域公知的。
细胞培养
HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心)的培养如Czauderna等人(NAR，2003.31：670-82)所描述。人角质形成细胞在37℃培养于含有10％FCS的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)。小鼠细胞系B16V(美国菌种保藏中心)在37℃培养于含有10％FCS的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)。培养条件描述于(Methods Find Exp Clin Pharmacol.1997May；19(4)：231-9)。
在每一种情况下，用的受试细胞以约50,000个细胞/孔的密度经受在此描述的试验，并且以20nM添加根据本发明的双链核酸，用1μg/ml如下所述的专用脂质复合双链核酸。
缺氧样(hypoxia-like)状况的诱导
用CoCl2处理细胞以诱导缺氧样状况，如下所示：在10-cm平板(30-50％融合度)中进行siRNA转染，如Czauderna等人，2003；Kretschmer等人，2003所描述。简要地说，通过向完全培养基中的细胞添加在无血清培养基中预制的GB和脂质的10x浓缩复合物(complex)进行siRNA转染。总转染量为10ml。除另有说明外，最终脂质浓度为1.0μg/ml，最终siRNA浓度为20nM。通过在溶解前24h直接向组织培养基中添加CoCl2(100μM)来诱导低氧反应。
细胞提取物的制备和免疫印迹
细胞抽提物的制备和免疫印迹分析基本如所述地进行(Klippel等人，Mol Cell Biol，1998.18：5699-711；Klippel，A等人，Mol Cell Biol，1996.16：4117-27)。
实施例1：siRNA化合物的体外测试
约1.5-2×105个测试细胞(对于靶向人基因的siRNA为HeLa细胞和/或293T细胞，对于靶向大鼠/小鼠基因的siRNA为NRK 52细胞和/或NMUMG细胞)接种于6孔板(70-80％融合度)的每孔中。
24小时后，利用终浓度为5nM或20nM的LipofectamineTM2000试剂(Invitrogen)以siRNA化合物转染细胞。细胞在37℃于CO2培养箱中培养72h。
用PTEN-Cy-3标记的siRNA化合物作为转染的阳性对照。使用的其他阳性对照为平端19-mer siRNA，即x＝y＝19其中Z和Z′二者都不存在。该siRNA是非磷酸化的，并且具有在反义链和有义链两条链上的糖残基2′位置上修饰的交替的核糖核苷酸，其中在2′位置的部分是甲氧基(2′-O-甲基)，并且其中在反义链5′和3′末端的核糖核苷酸在其糖残基上是修饰的，和在有义链5′和3′末端的核糖核苷酸在其糖基上是未修饰的。
用GFP siRNA化合物作为siRNA活性的阴性对照。
转染后72h，收获细胞，并从细胞中抽提RNA。通过荧光显微镜测试转染率。
利用特定的优选siRNA结构时的基因表达抑制百分比通过使用qPCR分析表达所述内在基因的细胞中的靶基因来测定。
通常，选择用于体外测试的具有特定序列的siRNA对人和第二物种如大鼠或兔基因是特异的。利用具有这些RNA序列并如本文所述地修饰的siRNA获得了相似的结果。用其他siRNA寡聚体得到特定基因表达降低的相似结果，该siRNA寡聚体的序列列于表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)。表B中的siRNA寡聚体如SEQ ID NOS：97-68654所示(公开于美国序列号11/978,089和PCT专利申请号PCT/IL2007/001278，其在此以其整体通过引用并入)。
下面的表C1、C2、C3和C4公开了优选的siRNA序列，发现所有这些siRNA在上述测定中具有活性(表C1、C3和C4-19mer siRNA分子；表C2-23mer siRNA分子)，通常，选定用于体外测试的有特定序列的siRNA对人类和大鼠/兔基因都是特异的。利用具有这些RNA序列并如本文所述地修饰的siRNA得到了相似结果。用其他siRNA寡聚体得到特定基因表达降低的相似结果，该siRNA寡聚体的序列列于表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)。
表C1：优选的19-mer siRNA序列。
  靶基因   细胞系*   受试siRNA   序列
  TP53BP2   293T   TP53BP2_1SEQ ID NOS：97-98   SS：GAGGGUGAAAUUCAACCCCAS：GGGGUUGAAUUUCACCCUC
  TP53BP2   293T   TP53BP2_2SEQ ID NOS：99-100   SS：CACCCAGAGAACAUUUAUUAS：AAUAAAUGUUCUCUGGGUG
  TP53BP2   293T   TP53BP2_3SEQ ID NOS：101-102   SS：GGGUGAAAUUCAACCCCCUAS：AGGGGGUUGAAUUUCACCC
  TP53BP2   293T   TP53BP2_4SEQ ID No.103-104   SS：AGGGUGAAAUUCAACCCCCAS：GGGGGUUGAAUUUCACCCU
  TP53BP2   293T   TP53BP2_5SEQ ID NOS：105-106   SS：AGGGAGUGUUUGAAUAAGCAS：GCUUAUUCAAACACUCCCU
  TP53BP2   293T   TP53BP2_6SEQ ID NOS：107-108   SS：ACCCAGAGAACAUUUAUUCAS：GAAUAAAUGUUCUCUGGGU
  靶基因   细胞系*   受试siRNA   序列
  TP53BP2   293T   TP53BP2_8SEQ ID NOS：109-110   SS：CGCUGAGGGAGAAAGAGAAAS：UUCUCUUUCUCCCUCAGCG
  LRDD   PC-3   LRDD_1SEQ ID NOS：111-112   SS：CGCACCUGAAGAAUGUGAAAS：UUCACAUUCUUCAGGUGCG
  LRDD   PC-3   LRDD_2SEQ ID NOS：113-114   SS：GUCUUCUACUCGCACCUGAAS：UCAGGUGCGAGUAGAAGAC
  LRDD   PC-3   LRDD_3SEQ ID NOS：115-116   SS：GACUGUUCCUGACCUCAGAAS：UCUGAGGUCAGGAACAGUC
  LRDD   PC-3   LRDD_5SEQ ID NOS：117-118   SS：ACCUCAGAUUUGGACAGCUAS：AGCUGUCCAAAUCUGAGGU
  CYBA   MDA-MB-4   CYBA_15SEQ ID NOS：119-120   SS：UGGGGACAGAAGUACAUGAAS：UCAUGUACUUCUGUCCCCA
  CYBA   MDA-MB-4   CYBA_16SEQ ID NOS：121-122   SS：GGGCCCUUUACCAGGAAUUAS：AAUUCCUGGUAAAGGGCCC
  CYBA   MDA-MB-4   CYBA_17SEQ ID NOS：123-124   SS：CCCUUUACCAGGAAUUACUAS：AGUAAUUCCUGGUAAAGGG
  ATF3   293T   ATF3_2SEQ ID NOS：125-126   SS：GAAGGAACAUUGCAGAGCUAS：AGCUCUGCAAUGUUCCUUC
  ATF3   293T   ATF3_3SEQ ID NOS：127-128   SS：ACAGAUAAAAGAAGGAACAAS：UGUUCCUUCUUUUAUCUGU
  ATF3   293T   ATF3_4SEQ ID NOS：129-130   SS：AUCCUAGUAUUCCUAACCUAS：AGGUUAGGAAUACUAGGAU
  ATF3   293T   ATF3_5SEQ ID NOS：131-132   SS：AUCCCAGUAUUCCUAGCCUAS：AGGCUAGGAAUACUGGGAU
  CASP2   HeLa-   CASP2_1SEQ ID NOS：133-134   SS：GCACUCCUGAAUUUUAUCAAS：UGAUAAAAUUCAGGAGUGC
  靶基因   细胞系*   受试siRNA   序列
  CASP2   HeLa-   CASP2_2SEQ ID NOS：135-136   SS：GCACAGGAAAUGCAAGAGAAS：U CUCUUGCAUUUCCUGUGC
  CASP2   HeLa-   CASP2_3SEQ ID NOS：137-138   SS：GGGCUUGUGAUAUGCACGUAS：ACGUGCAUAUCACAAGCCC
  CASP2   HeLa-   CASP2_4SEQ ID NOS：139-140   SS：GCCAGAAUGUGGAACUCCUAS：AGGAGUUCCACAUUCUGGC
  NOX3   293   NOX_4SEQ ID NOS：141-142   SS：UCCUGGAACUUCACAUGAAAS：UUCAUGUGAAGUUCCAGGA
  NOX3   293   NOX_5SEQ ID NOS：143-144   SS：GGUGUUCAUUUCUAUUACAAS：UGUAAUAGAAAUGAACACC
  NOX3   293   NOX_6SEQ ID NOS：145-146   SS：ACACACACCAUGUUUUCAUAS：AUGAAAACAUGGUGUGUGU
  NOX3   293   NOX_7SEQ ID NOS：147-148   SS：GGUACACACACCAUGUUUUAS：AAAACAUGGUGUGUGUACC
  NOX3   293   NOX_8SEQ ID NOS：149-150   SS：CACUUUCUGAGUUAUCAUAAS：UAUGAUAACUCAGAAAGUG
  NOX3   293   NOX_9SEQ ID NOS：151-152   SS：CUGAAAUCUAUAUGGUACAAS：UGUACCAUAUAGAUUUCAG
  NOX3   293   NOX_10SEQ ID NOS：153-154   SS：CUGGCGAUUUCAACAAGAAAS：UUCUUGUUGAAAUCGCCAG
  NOX3   293   NOX_11SEQ ID NOS：155-156   SS：UCUGGCGAUUUCAACAAGAAS：UCUUGUUGAAAUCGCCAGA
  HRK   MDA-MB-468   HRK_1SEQ ID NOS：157-158   SS：CCCCAAUGCUAUUUACAUAAS：UAUGUAAAUAGCAUUGGGG
  HRK   MDA-MB-468   HRK_2SEQ ID NOS：159-160   SS：AUGCUAUUUACAUACAGCUAS：AGCUGUAUGUAAAUAGCAU
  靶基因   细胞系*   受试siRNA   序列
  CIQBP   HeLa-   CIQBP_1SEQ ID NOS：161-162   SS：CCCCAAUGCUAUUUACAUAAS：UAUGUAAAUAGCAUUGGGG
  CIQBP   HeLa-   CIQBP_2SEQ ID NOS：163-164   SS：AUGCUAUUUACAUACAGCUAS：AGCUGUAUGUAAAUAGCAU
  CIQBP   HeLa-   CIQBP_3SEQ ID NOS：165-166   SS：GAGCCUGAACUGACAUCAAAS：UUGAUGUCAGUUCAGGCUC
  BNIP3   293T   BNIP3_1SEQ ID NOS：167-168   SS：GAGACAUGGAAAAAAUACUAS：AGUAUUUUUUCCAUGUCUC
  BNIP3   293T   BNIP3_2SEQ ID NOS：169-170   SS：GACAUGGAAAAAAUACUGCAS：GCAGUAUUUUUUCCAUGUC
  BNIP3   293T   BNIP3_3SEQ ID NOS：171-172   SS：ACCCUCAGCAUGAGGAACAAS：UGUUCCUCAUGCUGAGGGU
  BNIP3   293T   BNIP3_4SEQ ID NOS：173-174   SS：GAAAAACUCAGAUUGGAUAAS：UAUCCAAUCUGAGUUUUUC
  BNIP3   293T   BNIP3_11SEQ ID NOS：175-176   SS：CUGCAUUGGUGAAUUUAAUAS：AUUAAAUUCACCAAUGCAG
  BNIP3   293T   BNIP3_12SEQ ID NOS：177-178   SS：CAGGUUGUCUACUAAAGAAAS：UUCUUUAGUAGACAACCUG
  BNIP3   293T   BNIP3_13SEO ID NOS：179-180   SS：GCCUUAUAUAUCACACUAUAS：AUAGUGUGAUAUAUAAGGC
  BNIP3   293T   BNIP3_15SEQ ID NOS：181-182   SS：GGAAUUAAGUCUCCGAUUAAS：UAAUCGGAGACUUAAUUCC
  BNIP3   293T   BNIP3_22SEQ ID NOS：183-184   SS：AGGUUGUCUACUAAAGAAAAS：UUUCUUUAGUAGACAACCU
  BNIP3   293T   BNIP3_23SEQ ID NOS：185-186   SS：GAGAAAAACAGCUCACAGUAS：ACUGUGAGCUGUUUUUCUC
  靶基因   细胞系*   受试siRNA   序列
  BNIP3   293T   BNIP3_24SEQ ID NOS：187-188   SS：CCAAGAUAGAGCUACAAACAS：GUUUGUAGCUCUAUCUUGG
  BNIP3   293T   BNIP3_25SEQ ID NOS：189-190   SS：CACUCUGCAUUGGUGAAUUAS：AAUUCACCAAUGCAGAGUG
  BNIP3   293T   BNIP3_26SEQ ID NOS：191-192   SS：CCUUAAUUCAGCUGAAGUAAS：UACUUCAGCUGAAUUAAGG
  BNIP3   293T   BNIP3_27SEQ ID NOS：193-194   SS：GUUCAACUUUUGUGUGCUUAS：AAGCACACAAAAGUUGAAC
  BNIP3   293T   BNIP3_28SEQ ID NOS：195-196   SS：UCCUUUGUGUUCAACUUUUAS：AAAAGUUGAACACAAAGGA
  MAPK8   293T   MAPK8_1SEQ ID NOS：197-198   SS：ACCACAGAAAUCCCUAGAAAS：UUCUAGGGAUUUCUGUGGU
  MAPK8   293T   MAPK8_2SEQ ID NOS：199-200   SS：GCCGACCAUUUCAGAAUCAAS：UGAUUCUGAAAUGGUCGGC
  MAPK8   293T   MAPK8_3SEQ ID NOS：201-202   SS：GGACUUACGUUGAAAACAGAS：CUGUUUUCAACGUAAGUCC
  MAPK8   293T   MAPK8_4SEQ ID NOS：203-204   SS：UGGAUGCAAAUCUUUGCCAAS：UGGCAAAGAUUUGCAUCCA
  MAPK14   A431   MAPK14_1SEQ ID NOS：205-2-6   SS：GACCAUUUCAGUCCAUCAUAS：AUGAUGGACUGAAAUGGUC
  MAPK14   A431   MAPK14_2SEQ ID NOS：207-208   SS：GAGGUCUAAAGUAUAUACAAS：UGUAUAUACUUUAGACCUC
  MAPK14   A431   MAPK14_3SEQ ID NOS：209-210   SS：GUGCUGCUUUUGACACAAAAS：UUUGUGUCAAAAGCAGCAC
  RAC-1   293T   RAC1_1SEQ ID NOS：211-212   SS：UUGGUGCUGUAAAAUACCUAS：AGGUAUUUUACAGCACCAA
  靶基因   细胞系*   受试siRNA   序列
  RAC-1   293T   RAC1_2SEQ ID NOS：213-214   SS：GAGUCCUGCAUCAUUUGAAAS：UUCAAAUGAUGCAGGACUC
  RAC-1   293T   RAC1_3SEQ ID NOS：215-216   SS：GAUGUGUUCUUAAUUUGCUAS：AGCAAAUUAAGAACACAUC
  BMP2   Hela   BMP2_5SEQ ID NOS：217-218   SS：GUCAAGCCAAACACAAACAAS：UGUUUGUGUUUGGCUUGAC
  SPP1   HEPG2   SPP1_1SEQ ID NOS：219-220   SS：GUCCAGCAAUUAAUAAAACAS：GUUUUAUUAAUUGCUGGAC
  SPP1   HEPG2   SPP1_2SEQ ID NOS：221-222   SS：GUGCCAUACCAGUUAAACAAS：UGUUUAACUGGUAUGGCAC
  SPP1   HEPG2   SPP1_3SEQ ID NOS：223-224   SS：GCAAAAUGAAAGAGAACAUAS：AUGUUCUCUUUCAUUUUGC
  SPP1   HEPG2   SPP1_5SEQ ID NOS：225-226   SS：GCAUUUCUCAUGAAUUAGAAS：UCUAAUUCAUGAGAAAUGC
  SPP1   HEPG2   SPP1_6SEQ ID NOS：227-228   SS：CCGCAUUUCUCAUGAAUUAAS：UAAUUCAUGAGAAAUGCGG
  RHOA   293T-人类   RHOA_1SEQ ID NOS：229-230   SS：GUACCAGUUAAUUUUUCCAAS：UGGAAAAAUUAACUGGUAC
  RHOA   293T-人类   RHOA_2SEQ ID NOS：231-232   SS：UAGAAAACAUCCCAGAAAAAS：UUUUCUGGGAUGUUUUCUA
  RHOA   293T-人类   RHOA_3SEQ ID NOS：233-234   SS：ACCAGUUAAUUUUUCCAACAS：GUUGGAAAAAUUAACUGGU
  RHOA   293T-人类   RHOA_4SEQ ID NOS：235-236   SS：GCCACUUAAUGUAUGUUACAS：GUAACAUACAUUAAGUGGC
  RHOA   293T-人类   RHOA_5SEQ ID NOS：237-238   SS：GGGCAGUUUUUUGAAAAUGAS：CAUUUUCAAAAAACU GCCC
  靶基因   细胞系*   受试siRNA   序列
  RHOA   293T-人类   RHOA_6SEQ ID NOS：239-240   SS：GGCUAAGUAAAUAGGAAUUAS：AAUUCCUAUUUACUUAGCC
  RHOA   293T-人类   RHOA_7SEQ ID NOS：241-242   SS：CCUGUGGAAAGACAUGCUUAS：AAGCAUGUCUUUCCACAGG
  RHOA   293T-人类   RHOA_8SEQ ID NOS：243-244   SS：GUGCUCUUUUCUCCUCACUAS：AGUGAGGAGAAAAGAGCAC
  RHOA   293T-人类   RHOA_9SEQ ID NOS：245-246   SS：GGGCUAAGUAAAUAGGAAUAS：AUUCCUAUUUACUUAGCCC
  RHOA   293T-人类   RHOA_10SEQ ID NOS：247-248   SS：GUGGGCAGUUUUUUGAAAAAS：UUUUCAAAAAACUGCCCAC
  RHOA   293T-人类   RHOA_11SEQ ID NOS：249-250   SS：GGUGCCUUGUCUUGUGAAAAS：UUUCACAAGACAAGGCACC
  RHOA   293T-人类   RHOA_12SEQ ID NOS：251-252   SS：CCCAAGUUCAUGCAGCUGUAS：ACAGCUGCAUGAACUUGGG
  RHOA   293T-人类   RHOA_13SEQ ID NOS：253-254   SS：GGCACUCAGUCUCUCUUCUAS：AGAAGAGAGACUGAGUGCC
  RHOA   293T-人类   RHOA_14SEQ ID NOS：255-256   SS：CACUUUGGAAGAUGGCAUAAS：UAUGCCAUCUUCCAAAGUG
  Duox1   外源表达   Duox1_1SEQ ID NOS：257-258   SS：GAGAGAAGUUCCAACGCAGAS：CUGCGUUGGAACUUCUCUC
  Duox1   外源表达   Duox1_2SEQ ID NOS：259-260   SS：CGAGAGAAGUUCCAACGCAAS：UGCGUUGGAACUUCUCUCG
  Duox1   外源表达   Duox1_3SEQ ID NOS：261-262   SS：ACCGAGAGAAGUUCCAACGAS：CGUUGGAACUUCUCUCGGU
  Duox1   外源表达   Duox1_4SEQ ID NOS：263-264   SS：AGAUCCCCAAGGAGUAUGAAS：UCAUACUCCUUGGGGAUCU
  靶基因   细胞系*   受试siRNA   序列
  Duox1   外源表达   Duox1_6SEQ ID NOS：265-266   SS：UUGCCUCCAUCCUCAAAGAAS：UCUUUGAGGAUGGAGGCAA
表C2：优选的23-mer siRNA序列。
  靶基因   细胞系   受试siRNA   序列
  CASP2   HeLa-   CASP2_1-1SEQ ID No.267-268   SS：CCUUGCACUCCUGAAUUUUAUCAAS：UGAUAAAAUUCAGGAGUGCAAGG
  CASP2   HeLa-   CASP2_1-2SEQ ID No.269-270   SS：CUUGCACUCCUGAAUUUUAUCAAAS：UUGAUAAAAUUCAGGAGUGCAAG
  CASP2   HeLa-   CASP2_1-3SEQ ID No.271-272   SS：UUGCACUCCUGAAUUUUAUCAAAAS：UUUGAUAAAAUUCAGGAGUGCAA
  CASP2   HeLa-   CASP2_1-4SEQ ID No.273-274   SS：UGCACUCCUGAAUUUUAUCAAACAS：GUUUGAUAAAAUUCAGGAGUGCA
  CASP2   HeLa-   CASP2_1-5SEQ ID No.275-276   SS：GCACUCCUGAAUUUUAUCAAACAAS：UGUUUGAUAAAAUUCAGGAGUGC
表C3：另外的优选的19-mer siRNA序列。
  靶基因   细胞系*   受试siRNA   序列
  P2RX7   Nalm6   P2RX7_6SEQ ID NOS：50971-50972   SS：CCGAGAAACAGGCGAUAAUAS：AUUAUCGCCUGUUUCUCGG
  P2RX7   Nalm6   P2RX7_7SEQ ID NOS：50973-50974   SS：CCAGACGCCAUUUAAAAGUAS：ACUUUUAAAUGGCGUCUGG
  P2RX7   Nalm6   P2RX7_8SEQ ID NOS：50975-50976   SS：GUGGCUCUGAUUGCUUUAUAS：AUAAAGCAAUCAGAGCCAC
  靶基因   细胞系*   受试siRNA   序列
  P2RX7   Nalm6   P2RX7_9SEQ ID NOS：50977-50978   SS：CCAAAGGGAAAUAUGCUUUAS：AAAGCAUAUUUCCCUUUGG
  P2RX7   Nalm6   P2RX7_10SEQ ID NOS：50979-50980   SS：CACAACUACACCACGAGAAAS：UUCUCGUGGUGUAGUUGUG
  TRPM2   Nalm6   TRPM2_5SEQ ID NOS：50981-50982   SS：GACAAUGCCUGGAUCGAGAAS：UCUCGAUCCAGGCAUUGUC
  TRPM2   Nalm6   TRPM2_6SEQ ID NOS：50983-50984   SS：CCAAGAACUUCAACAUGAAAS：UUCAUGUUGAAGUUCUUGG
  PARG   Nalm6   PARG_2SEQ ID NOS：50985-50986   SS：GACAGAGUCUUGAAGAUUUAS：AAAUCUUCAAGACUCUGUC
  PARG   Nalm6   PARG_3SEQ ID NOS：50987-50988   SS：GUGGCAUAUUCUAAGAAAUAS：AUUUCUUAGAAUAUGCCAC
  PARG   Nalm6   PARG_5SEQ ID NOS：50989-50990   SS：CCCAGACAUUAACUUCAAUAS：AUUGAAGUUAAUGUCUGGG
  CD38   Nalm6   CD38_5SEQ ID NOS：50991-50992   SS：GGGUGCAUUUAUUUCAAAAAS：UUUUGAAAUAAAUGCACCC
表C4：另外的优选的19-mer siRNA序列。
  靶基因   siRNA SEQ ID NOS：   SS(有义链5’＞3’)AS(反义链5’＞3’)
  HRK   HRK_7 SEQ ID NOS：87089-87090   CGAUCGUAGAAACACAGAAUUCUGUGUUUCUACGAUCG
  HRK   HRK_8 SEQ ID NOS：87091-87092   AGGCGGAACUUGUAGGAACGUUCCUACAAGUUCCGCCU
  HRK   HRK_9   SEQ ID NOS：87093-87094   CCUGGAGCGAUCGUAGAAAUUUCUACGAUCGCUCCAGG
  靶基因   siRNA SEQ ID NOS：   SS(有义链5’＞3’)AS(反义链5’＞3’)
  HRK   HRK_10   SEQ ID NOS：87095-87096   CUGGAGCGAUCGUAGAAACGUUUCUACGAUCGCUCCAG
  HRK   HRK_11   SEQ ID NOS：87097-87098   CCUUGGAGAAAGCUGGUUCGAACCAGCUUUCUCCAAGG
  HRK   HRK_12   SEQ ID NOS：87099-87100   UGGAAAUCCAGCUGCAGAAUUCUGCAGCUGGAUUUCCA
  RAC1   RAC1_9   SEQ ID NOS：87101-87102   GGGAUGAUAAAGACACGAUAUCGUGUCUUUAUCAUCCC
  RAC1   RAC1_10   SEQ ID NOS：87103-87104   GUCUUCUUGAUUUGCUUUUAAAAGCAAAUCAAGAAGAC
  RAC1   RAC1_11   SEQ ID NOS：87105-87106   CCAAUACUGACCCUCUUUAUAAAGAGGGUCAGUAUUGG
  RAC1   RAC1_12   SEQ ID NOS：87107-87108   CCUUCUUAAAGCCUUAUUUAAAUAAGGCUUUAAGAAGG
  RAC1   RAC1_13   SEQ ID NOS：87109-18110   GGAGAUUGGUGCUGUAAAAUUUUACAGCACCAAUCUCC
  RAC1   RAC1_14   SEQ ID NOS：87111-87112   GGGCAUUUAAUUCAUCUUUAAAGAUGAAUUAAAUGCCC
  RAC1   RAC1_15   SEQ ID NOS：87113-87114   CGAGUUUUCUGACCAGCUUAAGCUGGUCAGAAAACUCG
  RAC1   RAC1_16   SEQ ID NOS：87115-87116   GCAGAAUUGUGGAGUGUUUAAACACUCCACAAUUCUGC
  RAC1   RAC1_17   SEQ ID NOS：87117-87118   GGUGUAAAAAUCAUGUGUUAACACAUGAUUUUUACACC
  靶基因   siRNA SEQ ID NOS：   SS(有义链5’＞3’)AS(反义链5’＞3’)
  STEAP4   STEAP4_3   SEQ ID NOS：87119-87120   GUGAUUCCUAUUCGAUAUUAAUAUCGAAUAGGAAUCAC
  RHOA   RHOA_15   SEQ ID NOS：87121-87122   GGCCUUUUUCAUUUAUCUAUAGAUAAAUGAAAAAGGCC
  RHOA   RHOA_16   SEQ ID NOS：87123-87124   UGAGAGAGGUUUUUGAAAUAUUUCAAAAACCUCUCUCA
  RHOA   RHOA_17   SEQ ID NOS：87125-87126   GGUGGGCAGUUUUUUGAAAUUUCAAAAAACUGCCCACC
  RHOA   RHOA_18   SEQ ID NOS：87127-87128   CAGAAAAGCCCAAGUUCAUAUGAACUUGGGCUUUUCUG
  RHOA   RHOA_19   SEQ ID NOS：87129-87130   CUAAUACUGUCAUCCUCAAUUGAGGAUGACAGUAUUAG
  RHOA   RHOA_20   SEQ ID NOS：87131-87132   GCUAGACGUGGGAAGAAAAUUUUCUUCCCACGUCUAGC
  RHOA   RHOA_21   SEQ ID NOS：87133-87134   CAACUACUAAUAGAAUAAAUUUAUUCUAUUAGUAGUUG
  RHOA   RHOA_22   SEQ ID NOS：87135-87136   GUGUAUUGGUUUUUUAAAAUUUUAAAAAACCAAUACAC
  RHOA   RHOA_23   SEQ ID NOS：87137-87138   CGGAAUGAUGAGCACACAAUUGUGUGCUCAUCAUUCCG
  RHOA   RHOA_24   SEQ ID NOS：87139-87140   GAAGGAUCUUCGGAAUGAUAUCAUUCCGAAGAUCCUUC
  RHOA   RHOA_25   SEQ ID NOS：87141-87142   CCAGCUGACUAAACUUUUUAAAAAGUUUAGUCAGCUGG
  靶基因   siRNA SEQ ID NOS：   SS(有义链5’＞3’)AS(反义链5’＞3’)
  RHOA   RHOA_26   SEQ ID NOS：87143-87144   UCGGAAUGAUGAGCACACAUGUGUGCUCAUCAUUCCGA
  RHOA   RHOA_27   SEQ ID NOS：87145-87146   AGUCAGAUGGAAAAUUCAUAUGAAUUUUCCAUCUGACU
  RHOA   RHOA_28   SEQ ID NOS：87147-87148   GUCAGAUGGAAAAUUCAUUAAUGAAUUUUCCAUCUGAC
  RHOA   RHOA_29   SEQ ID NOS：87149-87150   UCGACAGCCCUGAUAGUUUAAACUAUCAGGGCUGUCGA
  RHOA   RHOA_30   SEQ ID NOS：87151-87152   GCUGUGGCAGAGUUACAGUACUGUAACUCUGCCACAGC
  CASP2   CASP2_16   SEQ ID NOS：87153-87154   GGAUCAUGUAAAUGCUCAAUUGAGCAUUUACAUGAUCC
  CASP2   CASP2_18   SEQ ID NOS：87155-87156   CCCUUACUAUUCCCACUUUAAAGUGGGAAUAGUAAGGG
  CASP2   CASP2_19   SEQ ID NOS：87157-87158   CCUGACAAGUGAAGUUGUAUACAACUUCACUUGUCAGG
  CASP2   CASP2_20   SEQ ID NOS：87159-17160   CCUUAUUGAUCUUUGCCCAUGGGCAAAGAUCAAUAAGG
  CASP2   CASP2_21   SEQ ID NOS：87161-87162   CAGGAAUGUUUCAGCUGCAUGCAGCUGAAACAUUCCUG
  CASP2   CASP2_22   SEQ ID NOS：98162-87164   GACUGCACAGGAAAUGCAAUUGCAUUUCCUGUGCAGUC
  CASP2   CASP2_23   SEQ ID NOS：87165-87166   CUACAGAACAAACCAAAAAUUUUUGGUUUGUUCUGUAG
  靶基因   siRNA SEQ ID NOS：   SS(有义链5’＞3’)AS(反义链5’＞3’)
  CASP2   CASP2_25   SEQ ID NOS：87167-87168   GAAUGUGGAACUCCUCAACGUUGAGGAGUUCCACAUUC
  CASP2   CASP2_26   SEQ ID NOS：87169-87170   UCUUCAAGCUUUUGGGCUAUAGCCCAAAAGCUUGAAGA
  CASP2   CASP2_27   SEQ ID NOS：87171-87172   GAACAAACCAAAAAUGUUCGAACAUUUUUGGUUUGUUC
  CASP2   CASP2_37   SEQ ID NOS：87173-87174   CAGAAUGUGGAACUCCUCAUGAGGAGUUCCACAUUCUG
  CASP2   CASP2_38   SEQ ID NOS：87175-87176   CAGAACAAACCAAAAAUGUACAUUUUUGGUUUGUUCUG
  CASP2   CASP2_39   SEQ ID NOS：87177-87178   CAGAAUUUUGCACAGUUACGUAACUGUGCAAAAUUCUG
化合物的某些活性和或稳定性的实例示于图23，该化合物包含根据表C1-C4的反义序列和有义序列和结构修饰。
实施例2：急性肾功能衰竭(ARF)模型系统
ARF是以肾功能急性退化为特征的临床综合征，该急性退化发生在几天内。不受理论束缚，急性肾损伤可能是肾缺血再灌注损伤引起的，如进行大手术(major surgery)如大心脏手术的病人中的肾缺血再灌注损伤。ARF的主要特征是肾小球滤过率(GFR)突然下降，导致含氮废物(尿素，肌酐)滞留。最近的研究支持肾组织中细胞凋亡在大多数人类ARF病例中是显著的。凋亡性细胞死亡的主要位点是远端肾单位。在缺血性损伤的初始阶段，肌动蛋白细胞骨架的完整性丧失导致上皮扁平，和刷状缘丧失，焦点细胞接触丧失，以及随后细胞从深层基底脱离。
利用缺血再灌注诱导的ARF的动物模型来进行活性siRNA化合物的测试。
缺血-再灌注诱导的ARF的预防
在双侧肾动脉夹紧45分钟及随后解除夹紧以允许再灌注之后，于大鼠中诱导缺血-再灌注损伤。在再灌注之后七天处死大鼠。12mg/kg的Casp2_4 siRNA化合物(Casp 2_4：有义序列：GCCAGAAUGUGGAACUCCU，SEQ ID NO：139；反义序列：AGGAGUUCCACAUUCUGGC，SEQ ID NO：140)在夹紧之后4小时注入颈静脉。ARF进程通过测量手术之前(0天)和手术之后1天、3天、5天和7天的血清肌酐水平来监测。在实验末期，大鼠经留置的股骨线灌注温和的PBS，继之以4％仲甲醛。手术移除左侧肾，并保存于4％仲甲醛以用于随后的组织学分析。急性肾功能衰竭经常被定义为血清肌酐水平从基线急剧增加。血清肌酐至少0.5mg/dL或者44.2μmol/L的增加被认为指示急性肾功能衰竭。血清肌酐在手术前时间零点和ARF手术后1天、3天、5天和7天测量。
用于本试验的治疗和预防ARF的特别优选的化合物是根据结构(IV)的实施方案的CASP2_4siRNA化合物，其中(N′)y(有义链)包含在位置18的L-DNA(结果示于下文标题为“组2”的表)或者其中(N′)y(有义链)包含在位置17和18的L-DNA(结果示于下文标题为“组3”的表)，并且其中(N)x(反义链)包含交替的修饰的和未修饰的核糖核苷酸，其中所述修饰的核糖核苷酸包含2′OMe修饰。使用安慰剂的结果示于下文标题为“组1”的表中。SiRNA化合物还可包含(N′)y中在位置15的DNA核苷酸和/或位置2的L-DNA核苷酸。如下文结果所显示，在缺血-再灌注损伤后1和3天，继夹紧后4小时施用的Casp 2_4siRNA化合物降低了肌酐水平的升高。发现在夹紧前施用siRNA化合物对缺血再灌注也有预防作用。
组1：在夹紧后4小时注射安慰剂的动物的血清肌酐水平(mg/dL)。
  动物编号   试验前体重(g)   第0天   第1天   第3天   第5天   第7天   试验后体重(g)
  1   286   0.2   3.8   1.9   0.9   0.1   265
  2   294   0.3   4.9   2.4   0.7   0.4   271
  3   281   0.3   3.9   2.0   0.6   0.5   252
  4   273   0.1   4.5   1.8   0.7   0.5   255
  5   264   0.1   4.0   1.9   0.6   0.2   247
  6   287   0.2   4.0   2.0   1.0   0.5   269
  平均值   281   0.2   4.2   2.0   0.7   0.4   260
组2：在夹紧后4小时注射CASP 2_4siRNA(L-DNA位于有义链的位置18，12mg/kg)治疗的动物的血清肌酐水平。
  动物编号   试验前体重(g)   第0天   第1天   第3天   第5天   第7天   试验后体重(g)
  1   290   0.2   1.9   1.1   0.8   0.7   276
  2   303   0.1   3.4   1.4   0.9   0.8   282
  3   298   0.3   4.0   1.6   0.9   0.8   238
  动物编号   试验前体重(g)   第0天   第1天   第3天   第5天   第7天   试验后体重(g)
  4   310   0.3   2.0   1.2   0.5   0.4   296
  5   288   0.1   1.8   1.1   0.7   0.8   269
  6   293   0.3   1.9   1.0   0.7   0.8   261
  平均值   297   0.2   2.5   1.2   0.8   0.7   270
组3：在夹紧后4小时注射CASP 2_4siRNA(L-DNA位于有义链的位置17和18，12mg/kg)治疗的动物的血清肌酐水平。
  动物编号   试验前体重(g)   第0天   第1天   第3天   第5天   第7天   试验后体重(g)
  1   311   0.3   2.9   1.1   0.8   0.6   288
  2   304   0.2   2.0   0.9   0.4   0.4   271
  3   303   0.4   3.5   2.1   1.0   0.6   282
  4   301   0.4   3.6   1.7   1.1   0.6   280
  5   296   0.3   3.1   1.5   1.2   0.5   276
  6   294   0.4   2.5   1.3   1.0   0.5   284
  平均值   281   0.3   2.9   1.4   0.9   0.5   280
在上述模型系统中测试了表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)的siRNA化合物，特别是针对表A的特异性促凋亡基因，尤其是基因TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、HRK、CIQBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、RAC1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、CX43、TYROBP、CTGF和SPP1)的siRNA，并发现其对缺血再灌注有预防作用。
实施例3：压疮或压迫性溃疡模型系统
压疮或压迫性溃疡包括糖尿病性溃疡，是在持续的压力(通常来自床或轮椅)将循环截留到身体易损部分，尤其是臀部(buttock)、髋部(hip)和脚跟上的皮肤时，形成的损伤的皮肤和组织区域。缺乏充足血流致使受影响的组织的缺血性坏死和溃疡。压疮最常发生于知觉减弱或缺失的病人，或者是虚弱、消瘦、瘫痪或长期卧床的人。覆盖骶骨、坐骨、大转子(greatertrochanters)、外踝和脚跟的组织是尤其易受影响的；视病人的情况而定，可包括其他位点。
在小鼠模型中测试用于治疗压疮、溃疡及类似创伤的本发明的活性抑制剂(比如siRNA化合物)，该模型描述于Reid等人，J Surg.Res.116：172-180，2004。
此外的兔模型描述于Mustoe等人JCI，1991.87(2)：694-703；Ahn和Mustoe，Ann Pl Surg，1991.24(1)：17-23，并被用于测试本发明的siRNA化合物。根据表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)的siRNA化合物并且特别是针对基因CIQBP、RAC1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、CX43或TYROBP的化合物在动物模型中测试，该测试显示这些siRNA化合物治疗和预防压疮和溃疡。
实施例4：慢性阻塞性肺病(COPD)模型系统
慢性阻塞性肺病(COPD)的主要特征是肺气肿，肺气肿是末端细支气管远侧的外周气室的永久性损坏。肺气肿也以炎性细胞如巨噬细胞和中性粒细胞在细支气管和肺泡结构中的积聚为特征。肺气肿和慢性支气管炎可作为慢性阻塞性肺病的部分发生或独立地发生。
在如下文所公开的动物模型中测试用于治疗COPD/肺气肿/慢性支气管炎的本发明的活性抑制剂(比如siRNA)：
Starcher和Williams，1989.Lab.Animals，23：234-240；Peng等，2004；Am J Respir Crit Care Med，169：1245-1251；Jeyaseelan等，2004.Infect。Immunol，72：7247-56。其他的模型描述于PCT专利公布WO 2006/023544，其转让给本申请的受让人，其在此通过引用并入本申请。
根据表B(B1-B74)，表C(C1-C4)和表D(D1-D34)的siRNA，并且特别是针对基因CIQBP、BNIP3、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、CX43、TYROBP、CTGF和DUOX1的siRNA在这些动物模型中进行了测试，该测试表明这些siRNA化合物可治疗和/或预防肺气肿、慢性支气管炎和COPD。
实施例5：脊髓损伤模型系统
脊髓损伤，或脊髓病，是脊导致感觉和/或运动丧失的髓障碍。两种最常见的类型是创伤引起的脊髓损伤和疾病引起的脊髓损伤。创伤常常是由车祸、跌倒、枪击、潜水事故等引起的，并且可影响脊髓的疾病包括脊髓灰质炎、脊柱裂、肿瘤和弗里德赖希共济失调。
注射到损伤脊索后神经元对siRNA分子的吸收：
在脊髓挫伤后和未受伤大鼠中检察了不同类型细胞中Cy3标记的siRNA(注射到受伤脊索)的吸收。制备低温切片，并利用四种不同抗体组进行免疫染色，以测定神经元、星形神经胶质、少突胶质细胞和/或巨噬细胞/小神经胶质是否发生了吸收。神经元的标志物包括NeuN或GAP43；星形神经胶质和潜能神经干细胞的标志物包括GFAP、巢蛋白或波形蛋白；少突胶质细胞的标记物包括NG2或APC；巨噬细胞/小神经胶质的标志物包括ED1或Iba-1(Hasegawa等人，2005.Exp Neurol 193：394-410)。
大鼠被注入两种不同剂量的Cy3标记siRNA(1μg/μl，10μg/μl)，放置1天和3天后处死。组织学分析表明许多长的细丝状侧影(filamentousprofile)吸收标记的siRNA及其他突起(process)和细胞体。用针对MAP2的抗体免疫染色识别标记被吸收进入到树突和神经元包括运动神经元的细胞体。用对星形细胞或巨噬细胞特异的其他抗体的染色揭示与神经元相比有较低的Cy3标记siRNA的吸收。这些结果表明注射到损伤脊索的siRNA分子将到达神经元包括运动神经元的细胞体和树突。
根据表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)的siRNA化合物，并且特别是针对基因LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、HRK、CIQBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、RAC1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、CX43、TYROBP、CTGF和RHOA的siRNA在所述动物模型中进行测试，该测试显示这些siRNA化合物促进脊髓损伤后的功能恢复，并因此可用来治疗脊髓损伤。
实施例6：青光眼模型系统
在动物模型中测试用于治疗或预防青光眼的本发明的活性抑制剂，例如如Pease等人J.Glaucoma，2006，15(6)：512-9所描述(Manometriccalibration and comparison of TonoLab and TonoPen tonometers in rats withexperimental glaucoma and in normal mice(具有实验性青光眼的大鼠和正常小鼠中的压力计校正以及TonoLab和TonoPen眼压计的比较))。
根据表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)的siRNA，特别是针对基因TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、HRK、BNIP3、MAPK8、MAPK14、RAC1和RHOA的siRNA在所述动物模型中进行测试，该测试显示这些siRNA化合物治疗和/或预防青光眼。
实施例6A：缺血性视神经病变(ION)模型系统
使用视神经压轧伤(crush injury)方案在成年Wistar大鼠中建立缺血性视神经病变的动物模型。视神经压轧前七天，通过向上丘施用逆向示踪剂FluoroGold(2％，Fluorochrome，Englewood，CO)选择性标记视网膜神经节细胞(RGC)。示踪剂通过沿RGC轴突的逆向运输而运输，致使所有RGC在荧光示踪剂注射后1周内完全和特异的标记。在逆向示踪后7天，动物接受视神经压轧。眶内视神经通过眶上方法暴露，并且通过在距筛板2mm处用镊子压轧10秒横切视神经中的所有轴突。在视神经压轧的同时，将Casp2_4siRNA化合物的PBS以20μg/5μl的单一剂量用玻璃微量吸液管显微注射到距视神经乳头前2mm的玻璃体(Casp2_4：有义序列：GCCAGAAUGUGGAACUCCU，SEQ ID NO：139；反义序列：AGGAGUUCCACAUUCUGGC，SEQ ID NO：140；有义链包含在位置17和18的L-DNA并且反义链包含交替的修饰的和未修饰的核糖核苷酸，其中所述修饰的核糖核苷酸包含2′OMe修饰)。视神经压轧后7天通过计算平铺的视网膜上FluoroGold-标记的RGC测定RGC的存活率。实验动物在视神经压轧后1周用4％仲甲醛进行快速灌注(perfused transcardially)。解剖出两个视网膜，另外固定30min，并平铺在载玻片上，以定量神经节细胞层，在各视网膜的16个不同区计算出荧光性RGC的数量，测定与样品相比的RGC的存活百分比，该样品获自根本未经视神经压轧伤的大鼠，或获自在视神经压轧伤以外注射PBS、对照siRNA或GFP siRNA的大鼠。其可能在染色RGC的吞噬后结合FluoroGold的小神经胶质细胞通过其特征形态学区分，并排除于定量分析。下表所示的结果揭示与非相关siRNA化合物治疗的动物相比，用Casp2_4化合物治疗的动物中RGC的存活％的超过两倍的增加。
RGC存活率的定量：
  N＝4视网膜/处理 PBS siGFP   Casp2_4siRNA 对照siRNA
  RGC的存活％   25.52577   26.12142   59.04197   25.44345
  N＝4视网膜/处理 PBS siGFP   Casp2_4siRNA 对照siRNA
  SD   1.408675   1.07731   1.13383   1.19296
利用另一视神经轴突切断(axotomy)模型获得相似的结果，在该模型中通过横断接近于眼的视神经而轴突切断RGC的整个群体(Cheng L、SapiehaP、Kittlerova P、Hauswirth WW、Di Polo A TrkB Gene Transfer ProtectsRetinal Ganglion Cells from Axotomy-Induced Death In Vivo(基因转移在体内保护视网膜神经节细胞免于轴突切断诱导的死亡).J.Neurosci.May 15，2002 2002；22：3977-3986)。
实施例7：大鼠中肺移植后缺血/再灌注损伤的模型系统
用于治疗或预防肺移植后缺血/再灌注损伤或缺氧损伤的本发明的活性抑制剂的测试是在一个或多个实验动物模型中完成的，例如如以下所描述的：Mizobuchi等，2004年，J.Heart Lung Transplant，23：889-93；Huang等，1995，J.Heart Lung Transplant.14：S49；Matsumura等，1995，Transplantation 59：1509-1517；Wilkes等，1999.Transplantation 67：890-896；Naka等1996，Circulation Research，79：773-783。
在这些动物模型中测试根据表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)的siRNA，且特别是针对TP53BP2、LRDD、CYBA、CASP2、BNIP3、RAC1、和DUOX1的siRNA，该测试显示这些siRNA化合物治疗和/或预防肺移植后缺血-再灌注损伤，并因此可与移植手术联合使用。
实施例8：急性呼吸窘迫综合征模型系统
在动物模型中测试用于治疗急性呼吸窘迫综合征的本发明的活性抑制剂，该动物模型如Chen等人描述(J Biomed Sci.2003：10(6Pt1)：588-92)。根据表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)的siRNA化合物，特别是针对基因CYBA、HRK、BNIP3、MAPK8、MAPK14、RAC1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、SPP1和DUOX1的siRNA化合物在该动物模型中测试，该测试显示这些siRNA治疗和/或预防急性呼吸窘迫综合征并因此可用于治疗该病症。
实施例9：听力损失病症的模型系统
(i)在耳圆窗局部应用后耳蜗中Cy3-PTEN siRNA的分布
1μg/100μl的Cy3-PTEN siRNA(总计0.3-0.4μg)PBS溶液应用于南美洲栗鼠的圆窗。处死南美洲栗鼠后，分析圆窗施用siRNA后24-48小时治疗的耳蜗中Cy3-标记的细胞。在24h和48h后耳蜗中标记模式相似且包括耳蜗底转、耳蜗中转和耳蜗顶转中的标记。Cy3-PTEN siRNA在鼓阶上的应用揭示标记主要位于耳蜗底转和耳蜗中转。Cy3信号持续到施用Cy3-PTEN siRNA后的15天。本发明的siRNA化合物在动物模型中测试，该测试显示这些siRNA化合物向耳蜗底转、中转和顶转的显著渗透，而且这些化合物可用于听力损失的治疗。
(ii)碳铂诱导的或顺铂诱导的耳蜗毛细胞死亡的南美洲栗鼠模型
通过向每只动物的左耳直接施用溶于盐水中的特异性siRNA对南美洲栗鼠进行预处理。向各动物右耳施用盐水作为安慰剂。在本发明的特异性siRNA化合物施用后两天，用碳铂(75mg/kg ip)或顺铂(腹膜内灌输13mg/kg持续30分钟)处理动物。在南美洲栗鼠处死(碳铂处理后两周)后，计算左耳(siRNA处理)和右耳(盐水处理)内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)中死细胞的％。计算结果是左耳(siRNA处理)中内毛细胞(IHC)和外毛细胞的死细胞％比右耳(盐水处理)低。
(iii)声音诱导的耳蜗毛细胞死亡的南美洲栗鼠模型
在南美洲栗鼠中研究声损伤模型中特异性siRNA的活性。动物暴露于105dB的居中于4kHz的噪声倍频带2.5h。暴露于噪音的南美洲栗鼠的左耳用～10μL盐水中的30μg siRNA预处理，右耳用溶媒(盐水)预处理。化合物的动作电位(CAP)是测定从耳蜗传播的神经活动的方便和可靠的电生理学方法。为了检测当声刺激，如咔哒声或短纯音突然打开时产生的局部场电位，用安置在接近耳蜗基底的电极记录CAP。声损伤后2.5周评定各耳的功能状况。特别地，为了测定siRNA-处理的耳朵的阈值是否比未经处理的(盐水)耳朵的阈值低(好)，在声损伤后2.5周测定从圆窗记录的化合物动作电位的平均阈值。另外，测定siRNA-处理和对照耳朵中内毛细胞和外毛细胞的损失水平。
在该动物模型中测试根据表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)的siRNA分子，特别是针对基因TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、NOX3、HRK、CIQBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、RAC1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、CX43、TYROBP和CTGF的siRNA分子，该测试显示siRNA-处理耳朵的阈值比未经处理的(盐水)耳朵的低(好)。另外在siRNA-治疗耳朵中内毛细胞和外毛细胞损失的数量比对照耳朵低。
实施例10：骨关节炎(OA)动物模型
胶原诱导的关节炎(CIA)：小鼠中CIA描述于Trentham等(1977.J.Exp.Med.146：857-868)。佐剂诱导的关节炎(AA)：AA描述于Kong等(1999.Nature，402：304-308)。半月软骨切除术(menisectomy)模型描述于Han等(1999.Nagoya J Med Sci 62(3-4)：115-26)。
用除本领域中已知的体外模型以外，使用上述模型中的一种或多种来评价不同siRNA抑制剂如针对SSP1的siRNA对OA相关的参数，如软骨细胞增殖、末端分化和关节炎发展的效应。在这些动物模型中测试针对表A中特定的促凋亡基因，特别是针对SSP1的siRNA化合物，该测试显示这些siRNA治疗和/或预防OA并因此可用来治疗该病症。
实施例11：移植-相关急性肾损伤的大鼠模型系统
热缺血-切除测试大鼠中的左肾，继之以自体移植产生45分钟的热肾移植保存期。继自体移植之后，切除同一大鼠的右肾。在收获肾移植物之前(模拟供体治疗)(“前”)，或肾自体移植后(模拟受体治疗)，或在收获前和移植后(联合的供体和受体治疗)(“前-后”)，经股静脉静脉内施用针对靶的化学修饰的siRNA。
冷缺血-切除供体动物的左肾，然后低温保存(在冰上)收获的肾5小时的时间段。这一时间段结束时，对受体大鼠进行双侧肾切除，继之以移植低温保存的肾移植物。热缺血时间总计(包括手术过程)为约30分钟。或在肾收获前(“前”)向供体动物，或在移植后15分钟(15min后)或4小时(4小时后)向受体动物经股静脉静脉内施用化学修饰的siRNA。
为评价siRNA在改善移植后肾功能中的效力，测量热缺血和冷缺血模型中移植后1、2和7天的血清肌酐水平。
实施例12针对促凋亡基因的活性siRNA化合物序列的产生及siRNA的 产生
利用专有算法和任何基因，任选地此处公开的促凋亡基因的已知序列，形成许多潜在siRNA的序列。除算法外，23-mer寡聚体序列中的一些是通过5′和/或3′延伸19-mer序列产生的。用该方法产生的序列与相应mRNA序列完全互补。
表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)显示以下促凋亡基因的siRNA：肿瘤蛋白p53结合蛋白，2(TP53BP2)；含有富含亮氨酸重复序列和死亡结构域(LRDD)；细胞色素b-245，α多肽(CYBA)；激活转录因子3(ATF3)；半胱天冬酶2，凋亡相关半胱氨酸肽酶(神经前体细胞表达，发育下调2)(CASP2)；NADPH氧化酶3(NOX3)；harakiri，BCL2相互作用蛋白(只包括BH3结构域)(HRK)；补体成分1，q子成分结合蛋白(C1QBP)；BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3(BNIP3)；丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)；丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)；ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1(Rho家族小GTP结合蛋白Rac1)；糖原合酶激酶3β(GSK3B)；嘌呤能受体P2X，配体门控离子通道，7(P2RX7)；瞬时受体电位阳离子通道，亚家族M，成员2(TRPM2)；聚(ADP-核糖)糖原水解酶(PARG)；CD38分子(CD38)；STEAP家族成员4(STEAP4)；骨形态发生蛋白2-BMP2；间隙连接蛋白，α1，43kDa(连接蛋白43)(GJA1)；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白(TYROBP)；结缔组织生长因子(CTGF)；分泌磷蛋白1(骨桥蛋白，SPP1)；ras同源基因家族成员A(RHOA)；双氧化酶1(DUOX1)。对于每个基因有独立的19-mer、21-mer和23-mer siRNA序列的列表，所述序列基于它们在专有性算法中作为靶向人类基因表达的最佳序列的得分按优先次序列出。
实施例13：修饰的siRNA
用于siRNA化合物中的某些结构基序已被测试，并显示具有活性或稳定性。对于表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)中所示的任一序列，结构C-H被证明有活性和或稳定性。
其它活性结构包括具有根据结构(IX)-(XI)的结构基序的siRNA。包含如表B(B1-B74)，表C(C1-C4)和表D(D1-34)所示的序列和如结构(I)-(XI)所示的基序的化合物显示于本文的图23。
在一实例中，用不同的结构基序测试其中x＝y＝19的CASP2siRNA并比较活性和稳定性。在第一个化合物(CASP2-i)中(N)x(反义)由交替的2′-O Me修饰的和未修饰的核糖核苷酸组成；位于(N′)y(有义链)3′末端的三个连续核苷酸通过两个2′-5′磷酸二酯键连接并且在(N′)y的5′末端的三个核苷酸是LNA。在第二个化合物(CASP2-ii)中(N)x由未修饰的核糖核苷酸组成；在(N′)y的3′末端的三个连续核苷酸通过两个2′-5′磷酸二酯键相连并且在(N′)y的5′末端的三个连续核苷酸是LNA。在第三个化合物(Casp 2-iii)中，位于(N)x的5′末端的两个连续核苷酸(最末端和倒数第二位的核苷酸)是2′-OMe修饰的核糖核苷酸并且在(N′)y的3′末端的三个连续核苷酸通过2′-5′磷酸二酯键相连并且在(N′)y的5′末端的三个连续核苷酸是LNA。这些分子显示于下表E并且其活性由人HeLa细胞中的％抑制表示，而且IC50显示于表F。该化合物在HeLa细胞中被证明具有活性(＞50％抑制)。进一步测试该化合物的血清稳定性。结构CASP2-i在人血清中稳定24小时。CASP2-ii和CASP2-iii显示出超过24小时的稳定性，只鉴定出低水平的降解产物。寡聚体是基于CASP2的序列，其可被示于表B(B1-B74)、表C(C1-C4)或表D(D1-D34)的任何有义和反义对或多个有义和反义对替代。
表E：
Figure GPA00001081159601021
表F：
  化合物   ％抑制20nM  ％抑制5nM   IC50(nM)
  Casp2-i   89   81   0.50
  Casp2-ii   90   87   0.12
  Casp2-iii   78   55   2.58
表G显示基于结构(E)的19-mer和23-mer siRNA化合物(大鼠p53)，其中加下划线的核苷酸是L-DNA核苷酸。在这些化合物中，(N)x和(N′)y中的每一个包含未修饰的核糖核苷酸，其中3′倒数第二位的核苷酸或3′倒数第二位的两个连续核苷酸是L-DNA核苷酸。寡聚体是基于p53的序列，该序列可被示于表B(B1-B74)、表C(C1-C4)或表D(D1-D34)的任何有义和反义对或多个有义和反义对替代。
表G
  _S1AS1   5′-GAAGAAAAUUUCCGCAAAA-3′5′-UUUUGCGGAAAUUUUCUUC-3′   AAU   (L-DNA)(L-DNA)
  _S2AS2   5′-GAAGAAAAUUUCCGCAAAA-3′5′-UUUUGCGGAAAUUUUCUUC-3′   AU   (L-DNA)(L-DNA)
  _S3AS3   5′-GAAGAAAAUUUCCGCAAAA-3′5′-UUUUGCGGAAAUUUUCUUC-3′   AUU   (L-DNA)(L-DNA)
  _S4AS4   5′-GAAGAAAAUUUCCGCAAAA-3′5′-UUUUGCGGAAAUUUUCUUC-3′   AAUU   (L-DNA)(L-DNA)
  _S1AS1   5′-GAAGAAAAUUUCCGCAAAA-3′5′-UUUUGCGGAAAUUUUCUUC-3′   AAU   (L-DNA)(L-DNA)
  _S5AS5   5′-GGAAGAAGAAAAUUUCCGCAAAA-3′5′-UUUUGCGGAAAUUUUCUUCUUCC-3   AAC   (L-DNA)(L-DNA)
  _S6AS6   5′-GGAAGAAGAAAAUUUCCGCAAAA-3′5′-UUUUGCGGAAAUUUUCUUCUUCC-3   AC   (L-DNA)(L-DNA)
  _S7AS7   5′-GGAAGAAGAAAAUUUCCGCAAAA-3′5′-UUUUGCGGAAAUUUUCUUCUUCC-3   AUC   (L-DNA)(L-DNA)
  _S8AS8   5′-GGAAGAAGAAAAUUUCCGCAAAA-3′5′-UUUUGCGGAAAUUUUCUUCUUCC-3   AAUC   (L-DNA)(L-DNA)
实施例14：本发明2′-O-甲基化结构的实验结果
a)在表达内源p53的细胞中，测试了具有如所示的以下结构的针对p53基因的siRNA(20nM)抑制基因表达的能力。
图1A显示其中5＝2′O-甲基化核糖尿苷；6＝2′O-甲基化核糖腺嘌呤；7＝2′O-甲基化核糖胞嘧啶；和8＝2′O-甲基化核糖鸟嘌呤的结构。小写字母指未修饰的核糖核苷酸。
结果
结构号#2；#4、#5、#6、#8和#11转染后观察到85-90％抑制。
结构号#1转染后观察到75％抑制。
结构号#3；#7，#10和#12转染后观察到60％抑制。
结构号#9转染后观察到50％抑制。
图1B表示某些上述结构中的一些结构#4、#5、#8和#11的血清稳定性。
b)本发明的23-mer 2′-O-Me结构的进一步的实验结果
在上述测定中测试了针对p53的图2所示的siRNA化合物。具有2′-O-甲基修饰的核苷酸经加下划线的大写字母标示。
用结构#4、#5、#6、#8和11达到90％或更高的抑制；用结构#2达到75％抑制。
c)在上述测定中测试图3所示的针对CASP2的siRNA化合物。具有2′-O-甲基修饰的核苷酸用加下划线的大写字母显示。
活性结果呈现于图3B中；所有上述分子产生大约75-95％抑制。
d)图4A所示的siRNA化合物是针对CASP2的，并在上述测定中进行测试。具有2′-O-甲基修饰的核苷酸用加下划线的大写字母显示。
结果呈现于图4B；所有上述分子产生大约75-95％抑制。
e)在上述测定中测试针对CASP2并显示于图5A的siRNA化合物。2′O-Me修饰的核苷酸用加下划线的大写字母显示。
结果显示于图5B；所有上述分子产生大约75-90％抑制。
实施例15：2′-5′桥接结构的进一步实验结果
a)在表达内源p53的细胞中，测试了具有图6A所示结构的针对p53基因的siRNA化合物(20nM)抑制基因表达的能力。
在图6A中：5＝2′-5″桥接核糖尿苷；6＝2′-5″桥接核糖腺嘌呤；7＝2′-5″桥接核糖胞嘧啶；和8＝2′-5″桥接核糖鸟嘌呤。下划线表明2′-O-甲基化核苷。
结果
结构号1-3、10和12转染后观察到90-95％抑制。
结构#4和#15转染后观察到80-85％抑制。
其它结构有较小活性。图6B显示上述结构中的一些结构的血清稳定性。
b)与CASP2有关的2′-5′结构的结果
在上述测定中测试针对CASP2的图7A所示的siRNA化合物。由2′-5′桥连接的核苷酸用在它们之间的星号(*)显示。
结果示于图7B，表明针对CASP2的全部4个siRNA有活性并产生75-92％抑制。
c)与DDIT4(REDD2)有关的2′-5′结构的结果
在上述测定中测试针对DDIT4并显示于图8A的siRNA化合物。由2′-5′桥连接的核苷酸用它们之间的星号显示。
在上述测定中siRNA化合物1和3是有活性的，并且产生内源基因的60％抑制。
d)与QM5有关的2′-5′结构的结果：
在上述测定中测试针对小鼠p53的图8B所示的siRNA化合物。由2′-5′桥连接的核苷酸用它们之间的星号显示。
结构1和3产生90-95％抑制；结构4产生70％抑制和结构2产生大约50％抑制。
e)具有2′-5′和2′-O-甲基组合修饰的其他结构
在上述测定中测试针对p53(QM5siRNA)的图9A-9B所示的siRNA化合物。经2′-5′桥连接的核苷酸用它们之间的星号表明。2′-OMe修饰的核苷酸加下划线显示。
结果表示于图9C、9D和9E；上述结构中的许多结构引起超过90％抑制。
f)具有2′-5′和2′-O-甲基组合修饰的其他23-mer结构
在上述测定中测试针对p53的图10A所示的siRNA化合物。用2′-5′桥连接的核苷酸用它们之间的星号显示。2′-OMe修饰的核苷酸加下划线显示。
结果表示于图10B。结构1-3引起80-95％抑制。图10C和10D表示在SS具有2′5′键合并在AS有交替的甲基化模式的结构的血清稳定性结果。
g)在上述测定中测试针对CASP2的图11A所示的siRNA化合物。2′-OMe修饰的核苷酸用下划线显示并且经2′-5′桥连接的核苷酸用它们之间的星号显示。
结果显示于图11B，并且表明结构3-5引起大约70-95％抑制。
h)在上述测定中测试针对CASP2的图12A所示的siRNA化合物。由2′-5′桥连接的核苷酸用它们之间的星号显示。
结果表示于图12B，并且表明结构3-5引起大约80-95％抑制。
实施例16：包含镜像核苷酸的结构的进一步实验结果
在表达内源p53的细胞中，测试了针对p53基因并具有如图13A所示结构的siRNA化合物(5nM和20nM)抑制基因表达的能力。
注意下划线显示的核苷酸是镜像DNA核苷酸即L-脱氧核糖核苷酸。
结果
在结构1-3、10、12和15转染后观察到80-95％抑制。在两条链上包含交替的核苷酸的结构16作为阳性对照。
其它结构显示低到中等活性。结果显示于图13B。图13C显示了包含L-DNA核苷酸单体(以共价键连接到相邻核苷酸单体)的siRNA化合物的血清稳定性。用siRNA#1的活性测定的更多结果表明0.09nM的IC50。该活性水平比在两条链上有交替的甲基化结构的相同序列大2倍，该相同序列具有0.23nM的IC50(参见图13D)。
实施例17：包含LNA的结构的进一步实验结果
在表达内源p53的细胞中，测试了针对p53基因并具有如图14A所示结构的siRNA化合物(5nM和20nM)抑制基因表达的能力。注意下划线显示的是LNA核苷酸。使用实施例1中呈现的相同测定。
结果
在结构10、12和15转染后观察到80-95％抑制。
其它结构显示低到中等活性。结果显示于图14B。
实施例18：串联和星形结构
图15和16分别显示了串联siRNA和“星形”siRNA结构的实例和血清稳定性。
实施例19：具有多重修饰类型的siRNA化合物
图17A-17C显示了包含在多个位置的修饰的核苷酸单体(以共价键与相邻核苷酸单体连接)的CASP2siRNA化合物，及测量于20nM并显示％靶基因敲低(knock down，KD)的该化合物的活性。在图17A中，粗体下划线字母表示2′甲氧基修饰的核苷酸；大写斜体字母表示包含2′5′核苷酸间键合和3′甲氧基修饰的核苷酸。在图17B中粗体下划线字母表示2′甲氧基修饰的核苷酸；大写斜体字母表示包含P-乙氧基核苷酸间键合的核苷酸。在图17C中粗体下划线字母表示2′甲氧基修饰的核苷酸；大写斜体字母表示包含2′5′核苷酸间键合的核苷酸，斜体字小写字母表示L-DNA修饰的核苷酸，并且小写字母表示LNA(2′O-4′C)核苷酸。
实施例20：包含脱氧核糖核苷酸的结构
图18显示CASP2_4siRNA反义链(AS)和有义链(S)的实例，其链包含在多个位置的DNA单体(粗斜体字母，并共价连接到相邻核苷酸单体)。siRNA化合物通过组合任何有义链和任何反义链而合成。在图18中：5＝2′O甲基化核糖尿苷；6＝2′O甲基化核糖腺嘌呤；7＝2′O甲基化核糖胞嘧啶；和8＝2′O甲基化核糖鸟嘌呤。图19A-19D表示以CASP2_4和RhoA_24序列为例说明的L-DNA基序的实例。
图19A显示了在RNAi中有用的靶向CASP2的两个优选的双链的双链体。图19B表示包含L-DNA核苷酸的CASP2_4双链体(n＝L-DNA(L-脱氧核糖核苷酸)；N(加下划线并大写)-2′-O Me核糖核苷酸；Lc-L-脱氧胞嘧啶核苷5′-突出端；ab-脱碱基假脱氧核糖核苷酸类似物。
图19C显示了包含未修饰核糖核苷酸、DNA核苷酸和L-DNA核苷酸类似物的组合的CASP2_4有义寡核苷酸和包含交替的未修饰的和修饰的核糖核苷酸的CASP 2_4反义寡核苷酸，它们用于制备展示出RNAi活性的双链体。
图19D显示了CASP2_4修饰的双链体的活性和稳定性。
图19E显示了以在一个或两个3′末端有和没有3′磷酸酯的RhoA_24序列为例说明的某些双链体基序。
实施例21：包含脱碱基、反向-脱碱基、2′0-甲基、错配碱基对及其他修 饰的结构
图20描述这样的结构，其在治疗在此公开的任何病症中是有效的。
在图20A-20G中核苷酸类似物和假核苷酸的图例如下所示：
加下划线的大写字母“N”-2′OMe核糖核苷酸；“ab“-脱碱基假核苷酸；I-反向脱碱基假核苷酸；斜体“5N”＝5′OMe DNA；白色大写“N”-LNA；斜体小写下划线n：L-DNA；删除线
Figure GPA00001081159601081
错配。
图20A：集合1显示包含靶序列的脱碱基错配的反义链；寡核苷酸缺少3′磷酸酯；
图20B：集合2显示用于制备在ds结构中具有少于15bp的双链体化合物的寡核苷酸；寡核苷酸缺少3′磷酸酯；
图20C：集合3显示具有至少一个靶序列错配的插入的寡核苷酸。
图20D-20E：集合4和5显示包含脱碱基假核苷酸或核苷酸(“ab”)的AS链，该链与集合1中的有义链配对。
图20F：集合6显示包含脱碱基假核苷酸或者核苷酸(“ab”)的AS链，该链与未修饰的有义链配对；
图20G：集合7显示与集合1中的有义链配对的未修饰的AS链。
图21显示在制备具有RNAi活性的寡核苷酸中有用的非碱基配对核苷酸类似物中碱基修饰的实例。(显示化学结构的列中，dR表示与脱氧核糖部分的连接点；R表示与核糖部分的连接点)。

Claims (37)

1.一种化合物，该化合物具有如下所列的结构(IX)：
(IX)    5′(N)x-Z        3′(反义链)
        3′Z′-(N′)y-z″5′(有义链)
其中N和N′中的每一个为可以是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续的N或N′通过共价键与下一个N或N′连接的寡核苷酸；
其中Z和Z′可存在或不存在，但是如果存在，则独立地是共价连接到其所存在的链的3′末端的1-5个连续核苷酸；
其中z″可存在或不存在，但是如果存在，则是共价连接到(N′)y的5′末端的加帽部分；
其中x＝18到27；
其中y＝18到27；
其中(N)x包含修饰的和未修饰的核糖核苷酸，每个修饰的核糖核苷酸在其糖基上具有2′-O-甲基，其中在(N)x的3′末端的N是修饰的核糖核苷酸，(N)x包含从3′末端开始的至少5个交替的修饰的核糖核苷酸和共计至少9个修饰的核糖核苷酸，并且每个剩余的N是未修饰的核糖核苷酸；
其中在(N′)y中存在至少一个非常规部分，该非常规部分可能是脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、修饰的或未修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸，和通过2′-5′核苷酸间磷酸键与相邻核苷酸连接的核苷酸；和
其中(N)x的序列与(N′)y的序列基本上互补；并且(N′)y的序列与靶基因编码的mRNA的序列基本上相同。
2.根据权利要求10所述的化合物，其中x＝y＝19。
3.根据权利要求10所述的化合物，其中x＝y＝23。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述至少一个非常规部分存在于位置15、16、17或18。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中所述至少一个非常规部分是镜像核苷酸。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中镜像核苷酸存在于位置17、位置18或位置17和18。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中(N′)y包含至少5个脱碱基核糖部分或脱碱基脱氧核糖部分。
8.根据权利要求7所述的化合物，其中至少一个N′是LNA。
9.根据权利要求1所述的化合物，其中(N)x包含9个交替的修饰的核糖核苷酸。
10.根据权利要求1所述的化合物，其中存在z″。
11.根据权利要求1所述的化合物，其中(N)y包含在位置17、位置18或两个位置17和18的镜像核苷酸；其中(N′)y包含在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19的2′O-Me修饰的核糖核苷酸；且其中所述靶基因是CASP2。
12.一种化合物，该化合物具有如下所列的结构(X)：
(X)5′(N)x-Z        3′(反义链)
   3′Z′-(N′)y-z″5′(有义链)
其中N和N′中的每一个为可以是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续的N或N′通过共价键与下一个N或N′连接的寡核苷酸；
其中Z和Z′可存在或不存在，但是如果存在，则独立地是共价连接到其所存在的链的3′末端的1-5个连续核苷酸；
其中z″可存在或不存在，但是如果存在，则是共价连接到(N′)y的5′末端的加帽部分；
其中x＝18到27；
其中y＝18到27；
其中(N)x包含修饰的或未修饰的核糖核苷酸，和任选地至少一个非常规部分；
其中在(N′)y中存在至少一个非常规部分，该非常规部分可能是脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、修饰的或未修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸、非碱基配对的核苷酸类似物或通过2′-5′核苷酸间磷酸键与相邻核苷酸连接的核苷酸；和
其中(N)x的序列与(N′)y的序列基本上互补；并且(N′)y的序列与靶基因编码的mRNA的序列基本上相同。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中x＝y＝19。
14.根据权利要求12所述的化合物，其中x＝y＝23。
15.根据权利要求12所述的化合物，其中(N)x包含修饰的和未修饰的核糖核苷酸，和至少一个非常规部分。
16.根据权利要求15所述的化合物，其中(N)x包含与所述mRNA互补的少于15个连续核苷酸。
17.根据权利要求15所述的化合物，其中在(N)x中，3′末端的N是修饰的核糖核苷酸，并且(N)x包含至少8个修饰的核糖核苷酸。
18.根据权利要求17所述的化合物，其中所述至少8个修饰的核糖核苷酸中的至少5个交替开始于3′末端。
19.根据权利要求12或15中任一项所述的化合物，其中(N′)y中所述至少一个非常规部分是镜像核苷酸。
20.根据权利要求19所述的化合物，其中镜像核苷酸存在于位置17、位置18或位置17和18。
21.根据权利要求12或15中任一项所述的化合物，其中(N′)y中所述至少一个非常规部分是脱碱基核糖部分或脱碱基脱氧核糖部分。
22.根据权利要求12所述的化合物，其中存在z″。
23.一种化合物，该化合物具有如下所列的结构(XI)：
(XI)    5′(N)x-Z        3′(反义链)
        3′Z′-(N′)y-z″5′(有义链)
其中N和N′中的每一个为可以是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中(N)x和(N′)y中的每一个是其中每个连续的N或N′通过共价键与下一个N或N′连接的寡核苷酸；
其中Z和Z′可存在或不存在，但是如果存在，则独立地是共价连接到其所存在的链的3′末端的1-5个连续核苷酸；
其中z″可存在或不存在，但是如果存在，则是共价连接到(N′)y的5′末端的加帽部分；
其中x＝18到27；
其中y＝18到27；
其中(N)x包含修饰的或未修饰的核糖核苷酸和非常规部分的组合，任何修饰的核糖核苷酸在其糖基上具有2′-O-甲基；
其中(N′)y包含修饰的或未修饰的核糖核苷酸和任选地非常规部分，任何修饰的核糖核苷酸在其糖基上具有2′OMe；
其中(N)x的序列与(N′)y的序列基本上互补；并且(N′)y的序列与靶基因编码的mRNA的序列基本上相同；和其中存在与所述mRNA互补的少于15个连续核苷酸。
24.根据权利要求23所述的化合物，其中x＝y＝19。
25.根据权利要求23所述的化合物，其中x＝y＝23。
26.权利要求23所述的化合物，其中至少一个非常规部分存在于(N)x，并且是脱碱基核糖部分或脱碱基脱氧核糖部分。
27.权利要求23所述的化合物，其中至少一个非常规部分存在于(N)x，并且是非碱基配对的核苷酸类似物。
28.权利要求26所述的化合物，其中(N′)y包含未修饰的核糖核苷酸。
29.权利要求27所述的化合物，其中(N′)y包含未修饰的核糖核苷酸。
30.根据权利要求23-29中任一项所述的化合物，其中(N)x包含与mRNA互补的少于15个连续核苷酸。
31.权利要求26所述的化合物，其中(N)x包含至少5个脱碱基核糖部分或者脱碱基脱氧核糖部分。
32.权利要求23所述的化合物，其中(N)x和/或(N′)y包含不与(N′)y和/或(N)x中相应的修饰的或未修饰的核糖核苷酸碱基配对的修饰的核糖核苷酸。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的化合物，其中所述靶基因选自哺乳动物和非哺乳动物基因。
34.根据权利要求33所述的化合物，其中所述哺乳动物基因是人类基因，其中该基因编码的mRNA如SEQ ID NO：1-41或46-48之一所示。
35.根据权利要求34所述的化合物，其中(N)x和(N′)y的寡核苷酸序列如表B(B1-74)、C(C1-C4)和D(D1-D34)(SEQ ID NO：97-87，178)所示。
36.一种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求1-35中任一项所述的化合物，和药学上可接受的载体。
37.一种在需要其的受试者中治疗或预防疾病或病症的发病率或严重程度的方法，其中所述疾病或病症和/或与之相关的症状选自由听力损失，急性肾功能衰竭(ARF)，青光眼，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及其他急性肺和呼吸损伤，肺移植后缺血再灌注损伤，眼缺血病症包括前部缺血性视神经病变，器官移植包括肺、肝脏、心脏、胰腺和肾脏移植和包括DGF，肾毒性和神经毒性，脊髓损伤，压疮，年龄相关性黄斑变性(AMD)，干眼综合征，ION，口腔粘膜炎和慢性阻塞性肺病(COPD)组成的组，所述方法包括给受试者施用有效预防或治疗所述疾病或病症的量的根据权利要求36所述的药物组合物。
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