CN101328210A

CN101328210A - Hiv肽，抗原，疫苗组合物，检测hiv所诱导的抗体的免疫测定试剂盒及方法

Info

Publication number: CN101328210A
Application number: CNA2008100921326A
Authority: CN
Inventors: B·索伦森
Original assignee: Bionor AS
Current assignee: Bionor Immuno AS; Bionor AS
Priority date: 1999-03-04
Filing date: 2000-03-02
Publication date: 2008-12-24
Also published as: US6706859B1; HUP0200265A2; HK1044778B; NZ525751A; JP2014043468A; CN1346367A; DE60039036D1; NZ525752A; JP5814331B2; SK12402001A3; SK287382B6; HU229282B1; JP2011074081A; ZA200107072B; JP5695010B2; JP2013032384A; US20040259797A1; ID30497A; NO991078D0; CZ20013195A3

Abstract

本发明包含新的经修饰的肽，这种肽能诱导HIV－1特异免疫应答而不拮抗细胞毒性T－细胞的活性，从而获得一种有效的预防性和治疗性抗HIV疫苗。此肽以HIV gag p24蛋白的保守区域为基础，本发明描述了游离形式或载体结合形式的包含至少一种上述肽的抗原、包含至少一种该抗原的疫苗组合物、使用此抗原检测由HIV或HIV特异肽诱导的抗体的免疫测定试剂盒及方法。

Description

HIV肽，抗原，疫苗组合物，检测HIV所诱导的抗体的免疫测定试剂盒及方法

本申请是申请日为2000年3月2日、申请号为00805735.4、发明名称为“HIV肽，抗原，疫苗组合物，检测HIV所诱导的抗体的免疫测定试剂盒及方法”的发明专利申请的分案申请。

本发明涉及基于HIV gag p24保守区域的新肽、游离形式或载体结合形式的包含至少一种上述肽的抗原、包含至少一种该抗原的疫苗组合物、使用此抗原检测由人类免疫缺陷病毒(HIV)或HIV特异性肽诱导的抗体的免疫测定试剂盒和方法。

背景

HIV感染的全球性流行急需得到控制，而开发抗HIV的疫苗是AIDS研究中的一个主要目标。通常，疫苗应当激活抗原呈递细胞，克服T-细胞应答中的遗传限制并产生T-与B-记忆细胞。该病毒群体的可变性给获得有效的HIV疫苗造成更大的困难。目前还没有在试图开发HIV疫苗的过程中取得突破性进展的报导。现在普遍接受的是，诱导抗原特异性体液和细胞介导的免疫是开发有效的预防性和治疗性疫苗的关键。免疫系统的所有三种武器包括中和抗体、CD8+CTL和T辅助细胞1(TH1)细胞是对抗HIV的保护性免疫所必需的。已知CTL能够清除其它病毒的感染(Ada，免疫细胞生物学(Immunol.Cell Biol.)，72：447-454，1994)，并且CTL能够在病毒后代能够产生并通过细胞裂解释放之前于感染早期裂解受感染的靶标(Ada等，同前)。焦点集中在抗原的选择及不同佐剂的设计和评价上。在不同的体内和体外研究中使用的抗原均来自主要源于gp160及在某种程度上源于p24的粗蛋白和各种合成肽。对gp120的V3环已进行了大量的研究。观察到T和B细胞应答的诱导，然而，一项体外研究报导，源于gp41保守区的肽显示了对感染的增强(Bell S.J.等，临床实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)，87(1)：37-45，(1992年1月)。

侯选疫苗中天然存在的HIV病毒序列由于该病毒所固有的通过改变存在于感染细胞表面的表位外观特征而隐藏的能力而不能刺激稳定的免疫应答。免疫系统误认为与一种特定的氨基酸序列相关而实际上重要的氨基酸却被隐藏起来。

最近的一项关于抗gag p24蛋白抗体效价的研究显示，慢AIDS发展进程与高效价相关，而快AIDS发展进程与低效价相关。已经显示具有低p24抗体效价的人比具有高p24抗体效价的人其AIDS的发展快得多(Zwart G.等，病毒学(Virology)，201，第285-93页，1994年6月)，这表明p24能够在控制AIDS的发展中起着关键的作用。

在WO91/13360中描述了新的HIV p24肽，其中在一种鉴别所诊断的HIV阳性血清样品真假的方法中使用了该肽。

Johnson R.P.等(免疫学杂志(The Journal of Immunology)，第147卷，第1512-1521页，No.5，1991年9月1日)描述了在三个HIV-1血清反应阳性个体中对gag特异性CTL应答的良好特异性进行的分析，发现该gag特异性CTL应答是由I型HLA限制的CD3+CD8淋巴细胞介导的。

EP-A-0 356 007公开了抗原决定簇，具体地它涉及到与HIV-1中存在的蛋白质相关并且能够作为潜在的抗AIDS疫苗的基础使用的合成多肽序列。

Rosenberg E.S.等，科学(Science)，第278卷，1997年11月21日，第1447-1450页描述了，病毒特异性CD4+T辅助淋巴细胞是在许多慢性病毒的感染中维持有效免疫的关键，但具有特征性的是在1型慢性人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的感染中不能检测到该细胞。相反地，相应于p24的HIV-1特异性增殖应答与病毒的携带有关。他们推断HIV-1特异性辅助细胞在免疫治疗干涉及疫苗开发中可能是重要的。

F.Hoffmann-La Roche & Co.Aktiengesellschaft的EP 0 230 222、EP 0 270 114、DE 37 11 016和GB 2 188 639涉及到HTLVIII Gag/Env基因的蛋白或融合蛋白的重组表达和纯化。可以将这些由天然序列组成的蛋白质纯化至均一并作为用于检测抗AIDS相关病毒的抗体的诊断测试的基础。也可以对该gag/env蛋白进行配制，以用作通过预防免疫防止AIDS的疫苗。

从诊断和治疗的观点看，使用p24作为测定或治疗一部分的主要问题和p24上许多刺激产生大量低特异性抗体的表位有关，这些表位通过在潜在的突变序列上的重复加强能产生自身抗体(HIV感染中α/βT细胞受体的自身抗体，调节异常和模仿.Lake D.F.，等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，(23)：10849-53，1994年11月8日)。此外，据报道，p24的抗体效价达不到与包膜蛋白(gp120和gp41)的抗体效价一样高的水平。通常p24的抗体在感染极早期产生，但在最初感染期后它的效价很快达到稳定。之后p24的效价逐渐下降，而gp160发生相反情况。在细胞毒T-细胞活性受到天然存在的HIV-1 gag变种抑制的有关最近报导中，也观察到这些发现(Klenerman P.等.，自然(Nature)，2：369(6479)，第355页，1994年6月2日)。这可能是为什么会观察到p24效价很快稳定和后来开始下降的原因之一。

根据以上背景资料，为满足对有效的预防和治疗疫苗的需求，我们决定研究设计能模拟p24表位而又不拮抗细胞毒T-细胞活性的新合成肽的可能性。

最初的工作建立在Korber B.等人(人类逆转录酶病毒和AIDS，1997年编，理论生物学和生物物理学组，Los Alamos国家实验室，Los Alamos，NM)发表的一个表位上。该表位的氨基酸序列(203-222)是：

K A L G P G A T L E E M M T A C Q G V G

R R M R T K S I K D L S S S R R

G V R V

S A A

S E

Q Q

在本说明书给出的序列中定义氨基酸的单字母和三字母密码符合国际标准并在教科书例如，Lehninger A.L.《生物化学原理》(Principles ofBiochemistry)(Worth Publishers Inc.，纽约，1982)中有说明。在上述头一行序列下面给出的氨基酸是此序列的自然变异。在以下序列上对含有该修饰表位的序列进行初步研究：

其中X表示2-氨基己酸，而且半胱氨酸残基处于氧化状态，即形成链内二硫桥。用该肽作为诊断试剂盒的一部分的研究结果(未发表)显示对于一组预先选择的非洲人血清其特异性达到87％(n＝279)。对于一组包含了明显不同于其它亚型的HIV-10亚型血清的HIV-1阳性血清，其灵敏度惊人地高达100％。

为提高特异性，即确定对纯粹的非交叉反应性抗体应答有利的氨基酸，在一个明显短得多的而且经过进一步修饰的肽上进行了相似的研究：

其中X具有如上所述含义，且半胱氨酸残基形成一个链内二硫桥。

该研究的结果表明：实验的特异性提高到96％(n＝293)，而且与在不使用p24肽进行的实验中得到的特异性相似。因为在包含了第一个肽的实验中特异性为87％，所以如果将该肽用作候选疫苗，那么由于它能被非特异性的抗体所识别，则可能诱导针对一个以上表位的免疫应答。然而，后一个实验显示所用肽序列能获得仅对HIV-1特异的免疫应答。因此，如果在候选疫苗中使用以这个肽为基础的序列作为抗原，那么极有可能增强针对HIV-1的独特免疫应答。

为进一步增加T细胞表位的数量和减少逃避突变体形成的机率，在分别来自第264-284位残基，第253-271位残基和第166-186位残基的以下三个序列的基础上(这些序列发表在1997年“人类逆转录酶病毒和AIDS”上；核酸和氨基酸序列的编辑和分析(A Compilation and Analysisof Nucleic Acid and Amino Acid Sequences)，理论生物学和生物物理学组(编)，Los Alamos国家实验室，Los Alamos)，构建了另外三个肽序列：

R W I I L G L N K I V R M Y S P T S I L D

K G V V M M K C V G E

D M V V Q I G

S

A

N N P P I P V G E I Y K R W I I L G L

S Q A V K D M L R K G M V M

G G S N K V D V V

H G T

A

P

和

P E V I P M F S A L S E G A T P Q D L N T

R I T T T L T E A D I S Y N I Y M

L N A L V H V I

M L A

V

为确定对HIV-1特异且灵敏的独特序列，合成了几个修饰的肽。

本发明描述

根据本发明的肽来源于HIV-1核心蛋白p24的上述四个不同保守区域，且具有保持该HIV-1表位独特性(灵敏性和特异性)的性质。而且，根据本发明的该新肽对识别的细胞毒T淋巴细胞(CTL)不具有拮抗作用，并将具有至少一个潜在的CTL表位。

根据本发明，满足以上标准的肽选自：

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Ala Xaa₈ Xaa₉ Gln Thr Pro Trp Xaa₁₄ Xaa₁₅Xaa₁₆ Xaa₁₇ Xaa₁₈ Val Xaa₂₀(SEQ ID NO：1)

其中该链中的氨基酸可能具有以下含义：

该肽衍生物的第1位的Xaa是Lys或Arg，

第2位的Xaa是Ala、Gly、Ser或Arg，

第3位的Xaa是Leu或Met，

第4位的Xaa是Gly或Arg，

第5位的Xaa是Pro、Thr、Val、Ser、Gln或Ala，

第6位的Xaa是Gly、Ala、Lys、Arg、Gln或Glu，

第8位的Xaa是Thr或Ser，

第9位的Xaa是Leu或Ile，

第14位的Xaa是Thr、Ser或Val，

第15位的Xaa是Ala或Ser，

第16位的Xaa是Cys或Ser，

第17位的Xaa是Gln或Leu，

第18位的Xaa是Gly、Glu或Arg，

第20位的Xaa是Gly或Arg，

该肽含有SEQ ID NO：1序列的至少九个连续氨基酸，

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Gly Leu Asn Pro Leu Val [Gly]_n Xaa₁₂ Xaa₁₃ TyrXaa₁₅ Pro Xaa₁₇ Xaa₁₈ Ile Leu Xaa₂₁ Xaa₂₂(SEQ ID NO：4)

其中该链中的氨基酸具有以下含义：

第1位的Xaa是Arg、Lys、Asp或是没有，

第2位的Xaa是Trp、Gly、Lys或Arg，

第3位的Xaa是Ile、Leu、Val或Met，

第4位的Xaa是Ile、Val或Leu，

第5位的Xaa是Leu、Met、Val或Pro，

第12位的Xaa是Arg、Lys，

第13位的Xaa是Met或Leu，

第15位的Xaa是Ser、Cys或Gln，

第17位的Xaa是Thr、Val、Ile、Ser或Ala，

第18位的Xaa是Ser、Gly或Thr，

第21位的Xaa是Asp、Glu、Cys或Gly，

第22Xaa是Gly或没有，

其中SEQ ID NO：4的序列含有至少6个连续氨基酸，且n＝0，1，2或3，

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Pro Ile Pro Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂ [Gly]n Xaa₁₃Xaa₁₄ Xaa₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Xaa₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ Xaa₂₂ Xaa₂₃ Xaa₂₄(SEQ IDNO：9)

其中第1位的Xaa是Asn、Ser、Gly、His、Ala、Pro、Arg或没有

第2位的Xaa是Asn、Ala或Lys

第3位的Xaa是Pro、Gln、Gly、Ile或Leu

第7位的Xaa是Val或Ala

第8位的Xaa是Gly或Lys

第9位的Xaa是Glu、Asp、Lys、Phe或Thr

第10位的Xaa是Ile、Met、Val或Leu

第11位的Xaa是Tyr、Leu或没有

第12位的Xaa是Ser或没有

第13位的Xaa是Arg或没有

第14位的Xaa是Asp、Arg、Trp、Ala或没有

第15位的Xaa是Ile或没有

第16位的Xaa是Tyr或没有

第17位的Xaa是Lys或Arg

第18位的Xaa是Arg、Lys或Asp

第19位的Xaa是Trp或Gly

第20位的Xaa是Ile、Met、Val、Gln或Ala

第21位的Xaa是Ile、Val或Ala

第22位的Xaa是Leu、Met或Val

第23位的Xaa是Gly或Cys

第24位的Xaa是Leu或没有

其中SEQ ID NO：9的序列由至少六个连续氨基酸组成，且n＝1，2或3，

Xaa₁ Xaa₂ Ile Ile Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Leu Xaa₁₁ [Gly]_n [Arg]_m Xaa₁₂Xaa₁₃ Xaa₁₄ Xaa₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Xaa₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ Xaa₂₂ Xaa₂₃ Xaa₂₄ Xaa₂₅(SEQ IN NO：15)

其中第1位的Xaa是Pro、Lys、Arg或没有

第2位的Xaa是Glu、Arg、Phe或Lys

第5位的Xaa是Pro或Thr

第6位的Xaa是Met、Thr或Nleu

第7位的Xaa是Phe或Leu

第8位的Xaa是Ser、Thr、Ala或Met

第9位的Xaa是Ala、Glu或Leu

第11位的Xaa是Ser或没有

第12位的Xaa是Ala、Arg或没有

第13位的Xaa是Ile、Leu或没有

第14位的Xaa是Ser、Ala、Leu或没有

第15位的Xaa是Tyr、Glu或Asp

第16位的Xaa是Gly或Asp

第17位的Xaa是Ala或Leu

第18位的Xaa是Thr、Ile、Val、Leu或Asn

第19位的Xaa是Pro、Thr或Ser

第20位的Xaa是Tyr、Phe、Nleu、His或Gln

第21位的Xaa是Asp、Asn、Leu或Ala

第22位的Xaa是Leu、Ile、Val或Asn

第23位的Xaa是Asn、Tyr、Cys或Gly

第24位的Xaa是Thr、Met、Ile、Ala、Val或没有

第25位的Xaa是Gly或没有

其中SEQ ID NO：15的序列由至少六个连续氨基酸组成，n＝1，2或3且m＝0，1，2或3，

这些序列的末端可以是游离的羧基或氨基基团、酰胺、酰基、乙酰基或它们的盐，

两个或多个半胱氨酸残基可以形成链内或链间二硫键(disulphidebinding)，-S-(CH₂)_p-S-或-(CH₂)_p-桥的部分，其中p＝1-8，任选插入一个或多个杂原子如O、N或S，而且/或者将该所述肽序列固定在固相支持物上。

这些新肽序列具有充当良好抗原的潜力，其中该抗原含有至少一种选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：15的肽。可以通过例如二聚化或多聚化和/或固定在固相上，调整不同肽的比例或浓度或这些肽的大小，以调节抗原性。该抗原包含两个或多个根据本发明的多肽序列，它们或者通过桥如这些链的半胱氨酸残基之间的二硫桥、或可能插入了一个或多个杂原子(如O、S、或N)的C₁-C₈亚烷基桥等连接在一起，或者优选地它们并不相接。这些链可以以单体、二聚体或寡聚体的形式被固定在固相上。可以在末端加上其它的氨基酸，以便形成利于固定的“臂”。

尽管优选自然存在的L-型氨基酸，但本发明肽中的所有氨基酸均可以是D-或L-型的。

这些肽序列的C-末端及N-末端可以因对末端NH₂基团和/或COOH基团的修饰而与天然序列不同，例如，它们可以被酰化、乙酰化、酰胺化、或修饰以便为载体或另一分子提供结合位点。

根据本发明的肽由6-50个氨基酸，优选10-30个氨基酸组成。它们覆盖了己鉴定位置中所有天然的氨基酸变异。

根据本发明的多肽抗原可以是游离形式的或载体结合形成的。可以从多种已知的载体中选择该多肽任选结合的载体或固相。应当根据该固定化多肽作为诊断抗原或作为疫苗中的免疫成分的预期用途来进行选择。

能够用于例如诊断目的的载体的实例有磁珠或共聚物(如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、羟化苯乙烯-二乙烯基苯共聚物)、聚苯乙烯或羧化聚苯乙烯的胶乳、炭黑珠、未活化的或聚苯乙烯或聚氯乙烯活化的玻璃、环氧活化的多孔磁性玻璃、明胶或多糖颗粒或其它蛋白质微粒、红细胞、单克隆抗体或多克隆抗体或这些抗体的fab片段。

根据本发明的又一实施方案，这些抗原可以和载体、佐剂联合或和其它免疫刺激因子如携带env基因的金丝雀痘苗病毒联合，形成疫苗的部分。用于疫苗目的的载体或/和佐剂的例子是其它蛋白质，如人或牛的血清白蛋白及匙孔血蓝蛋白。可以将免疫刺激物质分成三组：佐剂、抗原的载体和赋形剂。佐剂的实例有氢氧化铝、铝盐、皂苷、胞壁酰二肽或三肽、单磷酰基脂A、副百日咳博德特氏菌(B.pertussis)，及各种细胞因子，包括Th1细胞因子IL-12和IL-1。许多蛋白质毒素可以用以携带过客蛋白(passenger protein)穿过细胞膜进入细胞质，这在开发CTL疫苗中是有用的。载体包括细菌毒类素如灭活的破伤风和霍乱毒素、经遗传改造脱毒的细菌毒素如来自大肠杆菌的热不稳定性肠毒素、脂肪酸、活的载体如脊髓灰质炎病毒嵌合体(polio chimeras)、和形成颗粒的杂合蛋白如酵母逆转录转座子杂合TY颗粒和HBcAg颗粒。现代疫苗中经常存在的成分赋形剂由矿物油乳剂、弗氏完全和不完全佐剂、植物油乳剂、非离子嵌段共聚物表面活性剂、角鲨烯或角鲨烷、脂质体和生物可降解微球体构成。对于新疫苗的开发具有显著潜力的两种新佐剂包括水包油型微乳剂(MF59)和聚合物微粒。任何能提高该抗原的免疫原性的物质都可以被采用，而且，在美国和欧洲药典上还给出了载体或佐剂的几种其它替代物。

用于免疫刺激用途的该抗原的适合制剂还可以含有干扰素如INF-γ、抗病毒性趋化因子或造血生长因子，如粒细胞巨噬细胞生长因子。

为了增强刺激和例如肠道内的吸收，另一个方法是与小肽例如二、三或四肽一起施用本发明的肽。这些肽可以在本发明的肽之外施用，也可以与本发明的肽联合起来施用。优选地，本发明的肽与由D-型或L-型氨基酸、优选D-型氨基酸组成的三肽YGG一起施用。

近来用于疫苗的非肠胃外递送(non-parenteral delivery)如通过粘膜递送的方法包括：产生非毒性粘膜佐剂衍生物的基因融合技术、在必需基因中带有缺失的遗传失活抗原、抗原与对于粘膜免疫应答的调节和控制重要的特定细胞因子的共表达、以及允许DNA或RNA摄取的遗传物质本身及其在寄主细胞中的内源性表达。

在需要细胞介质的免疫的情况下，产生持久应答的一种方法是接种编码一种或多种特异抗原的质粒DNA。

为了防止HIV感染，疫苗应该诱导粘膜和全身免疫应答，并且能够通过任何方便的途径肠胃外或非肠胃外施用，如皮下、皮内、静脉内、肌内、口服、经粘膜或鼻内施用。

在一个根据本发明的疫苗的优选实施方案中，它包含含有SEQ IDNO：1、4、9和15的肽的抗原，更优选地这些肽以1∶1∶1∶1的比例存在。

在另一个优选实施方案中，该疫苗组合物含有抗原：

R A L G P A A T L Q T P W T A S L G V G-NH₂(SEQ ID NO：3)

R W L L L G L N P L V G G G R L Y S P T S I L G-NH₂(SEQ ID NO：6)

R A I P I P A G T L L S G G G R A I Y K R T A I L G-NH₂(SEQ ID NO：11)

和

R F I I P NI F T A L S G G R R A L L Y G A T P Y A I G-NH₂(SEQ ID NO：18).

这些序列中的一个含有B细胞表位并将激活体液免疫系统，而其它的序列提供CTL表位，在该CTL表位框架中设计氨基酸改变以实现增强的结合。为了便于该肽的合成和/或增加该肽的溶解性，进行其它的氨基酸改变。

本发明的再一个实施方案是，采用本发明的抗原在体液样品中检测由HIV-1或HIV-1特异性肽或蛋白质诱导的抗体的方法。设计用于该检测的免疫测定试剂盒和能够选择性地与所述抗原反应的抗体也包括在本发明中。

肽制备的描述

本发明的肽可以通过任何已知的制备线性氨基酸序列的方法，如重组DNA技术来产生。将编码本发明肽或该所述肽的多聚体的核酸序列引入表达载体中。适合的表达载体有例如含有复制和表达所必需的控制序列的质粒、粘粒、病毒和YAC(酵母人工染色体)。可以在宿主细胞中刺激该表达载体表达。适合的宿主细胞是例如细菌、酵母细胞和哺乳动物细胞。这些技术是本领域所熟知的，并描述于例如Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1989。其它熟知的技术有降解，或通过在液相或优选在固相(树脂)上把一个氨基酸残基与下一个氨基酸残基偶联起来的合成技术，例如所谓的Merrifield合成。参见例如Barany和Merrifield，《肽分析合成生物学》(Peptides，Analysis，Synthesis，Biology)，第2卷，E，Gross和Meinhofer编(Aead.Press，纽约，1980)；Kneib-Coronier和Mullen，国际肽蛋白研究杂志(Int.J.Peptide Protein Res.)，30，第705-739(1987)；和Fields和Norble，国际肽蛋白研究杂志，35，第161-214页(1990)。

如果期望连接的或环状的肽，则当合成适合的线性氨基酸序列后，对该氨基酸序列采取化学氧化步骤，以便实现环化或将一个肽序列内或两个肽序列之间的两个半胱氨酸残基连接起来，参见Akaji等，TetrahedronLetter，33，8，第1073-1076页，1992。

合成的一般性描述

在以下给出的实施例中制备的所有肽衍生物均是按标准程序在Milligen 9050型肽合成仪上合成的。所用树脂是具有0.20meq/g理论负载量的Tenta Gel P RAM(RAPP POLYMERE GmbH，Tübingen)。合成的最终产物在真空中干燥过夜。在存在作为清除剂的乙二硫醇(ethandithiol)(5％)和水(5％)的情况下用90％三氟乙酸处理(室温下1.5小时)，使该肽从树脂上裂解下来。然后过滤该树脂，用其它的三氟乙酸(100％)(2×20ml)在滤器上清洗。将合并的滤出液在真空中蒸发(室温下水浴)，剩余物用乙醚(200ml)研制，过滤出沉淀物。立即在滤器上用冰乙酸(100ml)溶解该固体，将其加入1.5升在甲醇中的20％乙酸中，并用甲醇中的0.1M碘溶液处理直到剩余微弱的褐色。然后加入醋酸盐形式的Dowex 1×8离子交换剂(15g)(Bio-Rad，Richmond，CA)，之后过滤混合物。蒸发滤液，残余物冰冻干燥除去乙酸。然后在含有溶于0.1％三氟乙酸水溶液的乙腈的适合系统中，在装有

100-5C8(EKANobel，Surte，瑞典)的柱子上，通过反向相液相色谱纯化该产物。通过配备了

100-5 C8柱(EKA Nobel，Surte，瑞典)的分析性高效液相色谱仪(HPLC)分析从柱子中收集的样品。合并含有纯物质的组分，蒸发溶剂，将产物冰冻干燥除去乙酸。对终产物进行最终的HPLC分析，通过氨基酸分析和质谱分析(LDI-MS)验证该肽的结构。

在合成中用到的所有氨基酸均是L-氨基酸，并用芴甲氧基羰基对其α-氨基功能进行保护。侧链按以下方式进行保护：

Cys(Trt)，Gln(Trt)，Glu(OtBu)，Thr(tBu).

括号内的缩写词是：

Trt＝三苯甲基

t-Bu＝叔丁基

OtBu＝叔丁酯

这些氨基酸衍生物由Bachem AG，瑞士提供。

实施例1

K A L G P G A T L Q T P W T A C Q G V G-NH₂(SEQ ID NO：2)的制备。

根据合成的一般性描述，从相应的原材料，以酰胺形式合成该肽。纯度用HPLC分析测定，结构通过氨基酸分析和质谱分析(LDI-MS)来验证。纯度(HPLC)：87％

实施例2

R A L G P A A T L Q T P W T A S L G V G(SEQ ID NO：3)的制备。

根据合成的一般性描述，从相应的原材料，以酰胺形式合成该肽。纯度用HPLC分析测定，结构通过氨基酸分析和质谱分析(LDI-MS)来验证。

纯度(HPLC)：＞95％

分子量(游离碱(free base))：1966

分子式：C₈₈H₁₄₄O₂₅N₂₆

实施例3

W I I P G L N P L V G G G K L Y S P T S I L C G-NH₂(SEQ ID NO：3)的制备。

纯度(HPLC)：95％

质谱分析：理论分子量：2454.9

实验分子量：2454.8 ES+

实施例4

W L L L G L N P L V G G G R L Y S P T S I L G R A L G(SEQ ID NO：6)的制备。

纯度(HPLC)：＞95％

分子量(游离碱)：2552

分子式：C₁₁₉H₁₉₅O₂₉N₃₃

实施例5

K I L L G L N P L V G G G R L Y S P T S I L G(SEQ ID NO：7)，

R L L L G L N P L V G G G R L Y S P T T I L G(SEQ ID NO：8)

和N I P I P V G D I Y G G G D I Y K R W Q A L C L(SEQ ID NO：24)的制备。

根据合成的一般性描述，从相应的原材料，以酰胺形式合成这些肽。纯度用HPLC分析测定，结构通过氨基酸分析和质谱分析(LDI-MS)来验证。

实施例6

R N I P I P V G D I Y G G G D I Y K R W Q A L C L(SEQ ID NO：10)的制备。

纯度(HPLC)：85％

质谱分析：理论分子量：2817.3

实验分子量：2813.7 ES+

实施例7

R A I P I P A G T L L S G G G R A I Y K R W A I L G(SEQ ID NO：11)的制备。

纯度(HPLC)：＞95％

分子量(游离碱)：2707

分子式：C₁₂₅H₂₀₈O₂₉N₃₈

实施例8

A L P I PA G F I Y G G G R I Y K R W Q A L G(SEQ ID NO：12)，KI P I P V G F I G G G W I Y K R W A I L G(SEQ ID NO：13)和K IP I P V G T L L S G G G R I Y K R W A I L G(SEQ ID NO：14)的制备。

实施例9

K F I I P Nl F S A L G G A I S Y D L N T Nl L N C I(SEQ ID NO：16)的制备。

根据合成的一般性描述，从相应的原材料，以酰胺形式合成该肽。序列中的Nl是正亮氨酸。纯度用HPLC分析测定，结构通过氨基酸分析和质谱分析(LDI-MS)来验证。

纯度(HPLC)：＞80％

质谱分析：理论分子量：2783.3

实验分子量：2783.3 ES+

实施例10

K F I I P Nl F S A LS G G G A I S Y D L N T F L N C I G(SEQ IDNO：17)的制备。

根据合成的一般性描述，从相应的原材料，以酰胺形式合成该肽。序列中的Nl是正亮氨酸。纯度用HPLC分析测定，结构通过氨基酸分析和质谱分析(LDI-MS)来验证。纯度(NPLC)：＞80％

质谱分析：理论分子量：2932.4

实验分子量：2931.8 ES+

实施例11

R F I I P Nl F T A L S G G R R A L L Y G A T P Y A I G(SEQ ID NO：18)的制备。

纯度(HPLC)：＞95％

分子量(游离碱)：2894

分子式：C₁₃₇H₂₁₇O₃₂N₃₇

实施例12

K I I P Nl F S A L G G G R L L Y G A T P Y A I G(SEQ ID NO：19)，R I I P Nl F T A L S G G G R L L Y G A T P Y A I G(SEQ ID NO：20)和W I I P Nl F S A L G G A I S Y D L N T Nl L N C I(SEQ ID NO：25)的制备。

实施例13

通过二硫桥二聚化

通过氧化步骤将实施例1和3的肽序列连接起来形成二肽，其中半胱氨酸残基形成二硫桥，该桥可以按以下两种方式的任何一种形成：

A)用I₂氧化。等量的这两个肽溶解在乙酸/甲醇(1∶4)中，加入溶于甲醇的0.1M I₂产生二聚体的混合物。或

B)通过[Cys(Spy)¹⁶]-SEQ ID NO：2进行氧化。用2，2-二硫二吡啶(2，2-dithiodipyridin)(3当量)处理溶解在2M AcOH(aq)和2-丙醇(1∶1)中的2.3mM SEQ ID NO：2的肽，产生[Cys(Spy)¹⁶]-SEQ ID NO：2。将等量的[Cys(Spy)¹⁶]-SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5的肽溶解在10mM NH₄Oac(aq pH＝6.5)和甲醇(5∶2)中，产生SEQ ID NO：21的二聚体。

此肽的纯度用HPLC分析测定，肽结构用氨基酸分析验证，肽含量(氨基酸游离碱)为80％

纯度(HPLC)：92％

实施例14

制备含有SEQ ID NO：3、6、11和18的肽的疫苗。将冰冻干燥的这些肽以4mg/ml的终浓度溶解在无菌水中。最终盐浓度是0.9％。依据厂家的使用说明，将粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)制剂配制成0.3mg/ml的终浓度。这两种溶液均进行皮内给药，一个典型的注射剂量是100μl。

实施例15

将抗原溶液或悬浮液与等份的Bering弗氏完全或不完全佐剂混合，然后通过注射器的抽吸和用力推出，或采用匀浆器使其良好地乳化。该乳化液应保持稳定至少30分钟。此抗原-佐剂乳化液最好皮下注射作为贮存。

实施例16

毒性数据

将实例13中的二肽在0.9％NaCl中稀释到4mg/ml的试验溶液浓度。此二肽以每公斤体重100μg的剂量注入NMFI雌性小鼠体中。没有观察到毒性作用，因此该肽被认为是无毒的。

在小鼠和大鼠中对实例14中疫苗的肽组合物进行毒性研究。选择小鼠用于本研究，以提供来自第二种常用啮齿类动物物种的比较数据。测试物质是以含有冻干物的小瓶形式提供的4种肽的混合物，用于和生理盐水进行重构，剂量水平以总的肽量来表示。这4种肽以1∶1∶1∶1的比例存在，使每种肽的剂量水平是0.0075mg/kg体重、0.075mg/kg体重和0.75mg/kg体重，该剂量水平高达预期的人体剂量的500倍。将测试动物分成4组，每组10只动物(5只雄性和5只雌性)：盐水对照组以及低、中和高剂量组。通过以3ml/分钟的剂量速度静脉内输注至尾静脉的方式，施用一次该测试组合物。通过腹膜内注射戊巴比妥钠在第15和16天处死动物。

这些研究的结果显示，给小鼠和大鼠施用的这些剂量水平没有引起不良反应，而且无作用剂量超过3mg/kg。

实施例17

用于检测HIV-1所诱导的抗体的免疫测定

依据厂家推荐的操作方案制备磁性微粒试剂。所用Dynabeads的生产商是Dynal AS。将包被了配体的磁性微粒称作试剂1。将根据本发明的肽与该磁性颗粒的预先激活表面共价偶联。也可以将该肽物理吸附在该磁性微粒的表面。试剂1中颗粒的浓度在1mg/ml到15mg/ml之间。颗粒大小在0.2μm至15μm之间。肽的浓度范围从0.01mg/mg颗粒到1mg/mg颗粒。

根据Dako AS公司推荐的方案，制备抗人Ig碱性磷酸酶(AP)偶联的抗体试剂。该方案是本领域的标准程序，这个试剂被称作试剂2。

根据Fluka AG推荐的方案，制备底物溶液酚酞-单磷酸盐。该方案是本领域的标准程序，这个试剂被称作试剂3。

所用的洗涤和孵育缓冲液是含有以下添加成分的标准0.05M tris碱缓冲液：Tween 20(0.01％到0.1％)、甘油(0.1％到10％)和氯化钠(0.2％到0.1％)。

该测定程序包括一个孵育步骤，其中在每个孔将1滴试剂1和2滴洗涤缓冲液混合。混合后，加入30μl样品并孵育该溶液5分钟。可以利用磁铁吸附住磁性微粒，并在将该磁铁分离开之前除去液体。然后在与试剂2一起孵育前，每个孔用4滴洗涤溶液清洗两次。加入1滴试剂2和2滴洗涤缓冲液，并孵育该溶液5分钟。可以利用磁铁吸附住磁性微粒，并在将该磁铁分离开之前除去液体。然后在与试剂3一起孵育之前，重复洗涤步骤。每个孔加入2滴试剂3，并将溶液孵育3分钟。可以在白色背景下读取结果，阳性结果呈红色((3+＝鲜红)，而阴性结果与阴性对照中所获得一样是清楚的淡黄/褐色溶液。

该免疫测定试剂盒可以用于检测由HIV病毒或HIV特异性肽或蛋白质，例如本发明的肽诱导的抗体。

上面的实施例仅用来举例说明本发明，我们必须理解：本领域的技术人员能对这里所描述的肽、抗原和疫苗进行修改，而不背离权利要求书中阐述的本发明的概念和范围。

本发明的多肽能以选自序列SEQ ID NO：1、SEQID NO：4、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：15每一组的至少一种肽的组合使用，以形成抗原和目的在于防治1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的预防性或治疗性疫苗的有效成分。该疫苗可以包括对于保护或刺激宿主(人类或脊椎动物)免疫系统具有有利作用的化合物，如白介素、干扰素、粒细胞巨噬细胞生长因子、造血生长因子等。优选地，该疫苗组合物进一步含有佐剂或赋形剂，更优选地该佐药或赋形剂是可能与明矾、弗氏佐剂(完全或不完全)或氢氧化铝一起的单磷酰基脂A(Monophosphoryl Lipid A)

佐药/赋形剂的最佳量将取决于所选择的类型。

该肽或疫苗制剂可以在保存前冻干。该疫苗可以优选在低温下保存在含有一个或多个剂量单位的小瓶中备用。根据本发明的肽的典型剂量单位在每公斤体重1μg-1mg的浓度范围内，优选在每公斤体重2μg-0.15mg内。本领域的技术人员将明了：适合的剂量将取决于患者的体重、疾病的类型、病症的严重性、给药途径以及几个其它的因素。该疫苗可以通过注射施用多达12次，典型地施用大约3次。在制备注射溶液时，将这些肽以每种肽1mg/ml和0.9％氯化钠的终浓度溶解在无菌氯化钠溶液中。典型地注射体积从100μl到200μl(2×100μl)。该肽优选与合适的佐药和/或粒细胞巨噬细胞生长因子如

《Shering Plough》一起施用。适合的施用方式可以是皮内、皮下、静脉内、口服、肌内、鼻内、粘膜途径或任何其它合适的途径。为了维持保护作用，可能需要进行加强施用。本领域技术人员将明了，根据本发明的该疫苗组合物不仅在感染的预防中有用，而且在感染的治疗中也是有用的。

序列表

(1)一般信息

(i)申请者(对于除美国之外的所有国家)：

(A)姓名：Bionor A/S

(B)街区：

4，信箱号码1868 Gulset

(C)城市：Skien

(E)国家：挪威

(F)邮编(ZIP)：N-3705

(G)电话：+47 35 50 57 50

(H)传真：+47 35 50 57 01

(i)发明者和申请人(仅限于美国)

(A)姓名：Birger

(B)街区：Meierlia 3

(C)城市：3727 Skien

(D)国家：挪威

(ii)发明名称：HIV肽，抗原，疫苗组合物，检测HIV所诱导的抗体的免疫测定和方法。

(iii)序列数：25

(iv)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM兼容机

(C)操作系统：Windows 95

(D)软件：Word 7.0

(v)目前的申请资料：

优先权来自2000年三月四日提交的NO 19991078

申请号：

(2)SEQ ID NO：1的信息

(i)序列特性：

(A)长度：20个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(v)片段类型：内在的

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/注＝“第1位的Xaa是Lys或Arg”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：2

(D)其它信息：/注＝“第2位的Xaa是Ala，Gly，Ser或Arg”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：3

(D)其它信息：/注＝“第3位的Xaa是Leu或Met”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：4

(D)其它信息：/注＝“第4位的Xaa是Gly或Arg”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：5

(D)其它信息：/注＝“第5位的Xaa是Pro，Thr，Val，Ser，Gln或Ala”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/注＝“第6位的Xaa是Gly，Ala，Lys，Arg，Gln或Glu”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：8

(D)其它信息：/注＝“第8位的Xaa是Thr或Ser”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：9

(D)其它信息：/注＝“第9位的Xaa是Leu或Ile”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：14

(D)其它信息：/注＝“第14位的Xaa是Thr，Ser或Val”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：15

(D)其它信息：/注＝“第15位的Xaa是Ala或Ser”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：16

(D)其它信息：/注＝“第16位的Xaa是Cys或Ser，任选地Cys形成二硫键的部分”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：17

(D)其它信息：/注＝“第17位的Xaa是Gln或Leu”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：18

(D)其它信息：/注＝“第18位的Xaa是Gly，Glu或Arg”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：20

(D)其它信息：/注＝“第20位的Xaa是Gly或Arg”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Ala Xaa₈ Xaa₉ Gln Thr Pro Trp Xaa₁₄ Xaa₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇

1 5 10 15

Xaa₁₈ Val Xaa₂₀

20

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特性：

(A)长度：20个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iv)假设：无

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：16

(D)其它信息：/注＝“任选地第16位的Cys形成二硫键桥的部分”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Lys Ala Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Gln Thr Pro Trp Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly

1 5 10 15 20

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征

(A)长度：20个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

Arg Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Gln Thr Pro Trp Thr Ala Ser Leu Gly Val Gly

1 5 10 15 20

(2)SEQ ID NO：4的信息

(i)序列特征

(A)长度：23-24个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(ix)特征：

(A)名字/关键词：被修饰的位点

(B)位点：1

(D)其它信息：/注释＝“第1位的Xaa是Arg，Lys，Asp或没有

(ix)特征：

(A)名字/关键词：被修饰的位点

(B)位点：2

(D)其它信息：/注释＝“第2位的Xaa是Trp，Gly，Lys或Arg

(ix)特征：

(A)名称/关键词(ix)特征：：被修饰的位点

(B)位置：3

(D)其它信息：/注＝“第3位的Xaa是Ile，Leu，Val或Met”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：4

(D)其它信息：/注＝“第4位的Xaa是Ile，Val或Leu”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：5

(D)其它信息：/注＝“第5位的Xaa是Leu，Met，Val或Pro”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：12

(D)其它信息：/注＝“第12位的Xaa是Arg或Lys”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/注＝“第13位的Xaa是Met或Leu”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：15

(D)其它信息：/注＝“第15位的Xaa是Ser，Cys或Gln，任选地Cys形成二硫键的部分”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：17

(D)其它信息：/注＝“第17位的Xaa是Thr，Val，Ile，Ser或Ala”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：18

(D)其它信息：/注＝“第18位的Xaa是Ser，Gly或Thr”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：21

(D)其它信息：/注＝“第21位的Xaa是Asp，Glu，Cys或Gly，任选地Cys形成二硫键的部分”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：22

(D)其它信息：/注＝“第22位的Xaa是Gly或没有”

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：11..12

(D)其它信息：/注＝“任选地插入具有0、1、2或3个残基的Gly桥”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Gly Leu Asn Pro Leu Val [Gly]_n Xaa₁₂ Xaa₁₃ Tyr Xaa₁₅ Pro

1 5 10 15

Xaa₁₇ Xaa₁₈ Ile Leu Xaa₂₁ Xaa₂₂

20

(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24个氨基酸

(B)种类：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子种类：肽

(iii)假设：无

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：23

(D)其它信息：/注＝“第23位的Cys可以形成二硫桥的部分”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

Trp Ile Ile Pro Gly Leu Asn Pro Leu Val Gly Gly Gly Lys Leu Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu

1 5 10 15 20

Cys Gly

(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

Arg Trp Leu Leu Leu Gly Leu Asn Pro Leu Val Gly Gly Gly Arg Leu Tyr Ser Pro Thr Ser

1 5 10 15 20

Ile Leu Gly

(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：23个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

Lys Ile Leu Leu Gly Leu Asn Pro Leu Val Gly Gly Gly Arg Leu Tyr Ser Pro Thr Ser Ile

1 5 10 15 20

Leu Gly

(2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特性

(A)长度：23个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

Arg Leu Leu Leu Gly Leu Asn Pro Leu Val Gly Gly Gly Arg Leu Tyr Ser Pro Thr Thr Ile

1 5 10 15 20

Leu Gly

(2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：22-26个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/注＝“第1位的Xaa是Asn，Ser，Gly His，Ala，Pro，Arg或没有”

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：2

(D)其它信息：/注＝“第2位的Xaa是Ash，Ala或Lys

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：3

(D)其它信息：/注＝“第3位的Xaa是Pro，Gln，Gly，Ile或Leu

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：7

(D)其它信息：/注＝“第7位的Xaa是Val或Ala

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：8

(D)其它信息：/注＝“第8位的Xaa是Gly或Lys

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：9

(D)其它信息：/注＝“第9位的Xaa是Glu，Asp，Lys，Phe或Thr。

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：10

(D)其它信息：/注＝“第10位的Xaa是Ile，Met，Val或Leu。

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：11

(D)其它信息：/注＝“第11位的Xaa是Tyr，Leu或没有。

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：12

(D)其它信息：/注＝“第12位的Xaa是Ser或没有

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/注＝“第13位的Xaa是Arg或没有

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：14

(D)其它信息：/注＝“第14位的Xaa是Asp，Arg，Trp，Ala或没有

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：15

(D)其它信息：/注＝“第15位的Xaa是Ile或没有

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：16

(D)其它信息：/注＝“第16位的Xaa是Tyr或没有

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：17

(D)其它信息：/注＝“第17位的Xaa是Lys或Arg

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：18

(D)其它信息：/注＝“第18位的Xaa是Arg，Lys或Asp

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：19

(D)其它信息：/注＝“第19位的Xaa是Trp或Gly

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：20

(D)其它信息：/注＝“第20位的Xaa是Ile，Met，Val，Gln或Ala

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：21

(D)其它信息：/注＝“第21位的Xaa是Ile，Val或Ala

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：22

(D)其它信息：/注＝“第22位的Xaa是Leu，Met或Val

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：23

(D)其它信息：/注＝“第23位的Xaa是Gly或Cys

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/注＝“第24位的Xaa是Leu或没有

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：12..13

(D)其它信息：/注＝“选择地插入1、2或3残基的甘氨酸桥

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Pro Ile Pro Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂ [Gly]_n Xaa₁₃ Xaa₁₄ Xaa₁₅

1 5 10 15

Xaa₁₆ Xaa₁₇ Xaa₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ Xaa₂₂ Xaa₂₃ Xaa₂₄

20

(2)SEQ ID NO：10的信息

(i)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类性：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/注＝“第24位的半胱氨酸可以形成二硫键的部分

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

Arg Asn Ile Pro Ile Pro Val Gly Asp Ile Tyr Gly Gly Gly Asp Ile Tyr Lys Arg Trp Gln Ala

1 5 10 15 20

Leu Cys Leu

(2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：26个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：

Arg Ala Ile Pro Ile Pro Ala Gly Thr Leu Leu Ser Gly Gly Gly Arg Ala Ile Tyr Lys Arg Trp

1 5 10 15 20

Ala Ile Leu Gly

25

(2)SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：23个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：

Ala Leu Pro Ile Pro Ala Gly Phe Ile Tyr Gly Gly Gly Arg Ile Tyr Lys Arg Trp Gln Ala Leu

1 5 10 15 20

Gly

(2)SEQ ID NO：13的信息

(i)序列特征：

(A)长度：22个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：

Lys Ile Pro Ile Pro Val Gly Phe Ile Gly Gly Gly Trp Ile Tyr Lys Arg Trp Ala Ile Leu Gly

1 5 10 15 20

(2)SEQ ID NO：14的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：

Lys Ile Pro Ile Pro Val Gly Thr Leu Leu Ser Gly Gly Gly Arg Ile Tyr Lys Arg Trp Ala Ile

1 5 10 15 20

Leu Gly

(2)SEQ ID NO：15的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24-28个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/注＝“第1位的Xaa是Pro，Lys，Arg或没有

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：2

(D)其它信息：/注＝“第2位的Xaa是Glu，Arg，Phe或Lys

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：5

(D)其它信息：/注＝“第5位的Xaa是Pro或Thr

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/注＝“第6位的Xaa是Met，Thr或Nle

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：7

(D)其它信息：/注＝“第7位的Xaa是Phe或Leu

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：8

(D)其它信息：/注＝“第8位的Xaa是Ser，Thr，Ala或Met

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：9

(D)其它信息：/注＝“第9位的Xaa是Ala，Glu或Leu

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：11

(D)其它信息：/注＝“第11位的Xaa是Ser或没有

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：12

(D)其它信息：/注＝“第12位的Xaa是Ala，Arg或没有

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/注＝“第13位的Xaa是Ile，Leu或没有

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：14

(D)其它信息：/注＝“第14位的Xaa是Ser，Ala，Leu或没有

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：15

(D)其它信息：/注＝“第15位的Xaa是Tyr，Glu或Asp

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：16

(D)其它信息：/注＝“第16位的Xaa是Gly或Asp

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：17

(D)其它信息：/注＝“第17位的Xaa是Ala或Leu

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：18

(D)其它信息：/注＝“第18位的Xaa是Thr，Ile，Val，Leu或Asn

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：19

(D)其它信息：/注＝“第19位的Xaa是Pro，Thr或Ser

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：20

(D)其它信息：/注＝“第20位的Xaa是Tyr，Phe，Nle，His或Gln

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：21

(D)其它信息：/注＝“第21位的Xaa是Asp，Asn，Leu或Ala

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：22

(D)其它信息：/注＝“第22位的Xaa是Leu，Ile，Val或Asn

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：23

(D)其它信息：/注＝“第23位的Xaa是Asn，Tyr，Cys或Gly

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/注＝“第24位的Xaa是Thr，Met，Ile，Ala，Val或没有

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：25

(D)其它信息：/注＝“第25位的Xaa是Gly或没有

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：23

(D)其它信息：/注＝“任选地第23位置的Cys形成二硫键的部分

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：11...12

(D)其它信息：/注＝“任选地在插入第11位Xaa和第12位Xaa之间一个Gly-Arg桥，其中n＝1，2和3，m独立于n，是0，1，2或3。

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：

Xaa₁ Xaa₂ Ile Ile Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Leu Xaa₁₁ [Gly]_n [Arg]_m Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄

1 5 10

Xaa₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Xaa₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ Xaa₂₂ Xaa₂₃ Xaa₂₄ Xaa₂₅

15 20 25

(2)SEQ ID NO：16的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/注＝“任选地第24位的Cys形成二硫键的部分

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：

Lys Phe Ile Ile Pro Nle Phe Ser Ala Leu Gly Gly Ala Ile Ser Tyr Asp Leu Asn Thr Nle

1 5 10 15 20

Leu Ash Cys Ile

(2)SEQ ID NO：17的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：28个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：26

(D)其它信息：/注＝“任选地第26位Cys形成二硫键的部分

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：

Lys Phe Ile Ile Pro Nle Phe Ser Ala Leu Ser Gly Gly Gly Ala Ile Ser Tyr Asp Leu Asn

1 5 10 15 20

Thr Phe Leu Asn Cys Ile Gly

25

(2)SEQ ID NO：18的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：27个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：

Arg Phe Ile Ile Pro Nle Phe Thr Ala Leu Ser Gly Gly Arg Arg Ala Leu Leu Tyr Gly Ala

1 5 10 15 20

Thr Pro Tyr Ala Ile Gly

25

(2)SEQ ID NO：19的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：

Lys Ile Ile Pro Nle Phe Ser Ala Leu Gly Gly Gly Arg Leu Leu Tyr Gly Ala Thr Pro Tyr Ala

1 5 10 15 20

Ile Gly

(2)SEQ ID NO：20的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：

Arg Ile Ile Pro Nle Phe Thr Ala Leu Ser Gly Gly Gly Arg Leu LeL Tyr Gly Ala Thr Pro Tyr

1 5 10 15 20

Ala Ile Gly

25

(2)SEQ ID NO：21的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：44个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：二聚体肽

(iii)假设：无

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：二硫键在SEQ ID NO：2的第16位和SEQ ID NO：5的第23位之间

(2)SEQ ID NO：22的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：40个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：二聚体肽

(iii)假设：无

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：二硫键在SEQ ID NO：2的第16位和SEQ ID NO：2的第16位之间

(D)其它信息：/注＝“

(2)SEQ ID NO：23的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：48个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：二聚体肽

(iii)假设：无

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：二硫键在SEQ ID NO：5的第23位和SEQ ID NO：5的第23位之间

(2)SEQ ID NO：24的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：23

(D)其它信息：/注＝“第23位的Cys可以形成二硫桥的部分

(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：

Asn Ile Pro Ile Pro Val Gly Asp Ile Tyr Gly Gly Gly Asp Ile Tyr Lys Arg Tyr Gln Ala

1 5 10 15 20

Leu Cys Leu

(2)SEQ ID NO：25的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

ix)特征：

(A)名称/关键词：被修饰的位点

(B)位置：23

(D)其它信息：/注＝“任选地第23位的Cys形成二硫键的部分

(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：

Trp Ile Ile Pro Nle Phe Ser Ala Leu Gly Gly Ala Ile Ser Tyr Asp Leu Asn Thr Nle

1 5 10 15 20

Leu Asn Cys Ile

Claims

1.来自HIV gag p24蛋白的肽，其特征在于其氨基酸序列为Arg Trp LeuLeu Leu Gly Leu Asn Pro Leu Val Gly Gly Gly Arg Leu Tyr Ser Pro ThrSer Ile Leu Gly(SEQ ID NO：6)，

其中所述序列的末端可以是游离羧基或氨基基团、酰胺、酰基、乙酰基或它们的盐类，任选地所述肽序列被固定在固相支持物上。

2.抗原，其特征在于它含有根据权利要求1的肽。

3.疫苗组合物，其特征在于它含有根据权利要求1的抗原和可药用稀释剂以及任选的佐剂、载体和/或赋形药和任选的其它一种或多种免疫刺激化合物。

4.根据权利要求3的疫苗组合物，其中这些肽被溶解在盐水溶液中，而且所述任选的免疫刺激化合物是粒细胞巨噬细胞生长因子。

5.根据权利要求3-4中任一项的疫苗组合物，其中该组合物含有选自单磷酰基脂A

弗氏完全或不完全佐剂或氢氧化铝的佐剂。

6.在体液样品中检测由HIV或HIV特异性肽或蛋白质诱导的抗体的方法，其特征在于将所述样品进行免疫测定，其中使用了抗原，所述抗原是权利要求1的肽。

7.用于在体液样品中检测由HIV或HIV特异性肽或蛋白质诱导的抗体的免疫测定试剂盒，其特征在于该试剂盒包含了诊断用抗原，该诊断用抗原是权利要求1的肽。