WO2020076079A2 - 락토바실러스 카제이 유래의 두 종류 프로모터를 이용한 두 가지 목적단백질의 동시 표면발현벡터 및 이를 이용한 단백질의 미생물표면 발현 방법 - Google Patents
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Definitions
- the second promoter may be characterized by being represented by SEQ ID NO: 2.
- a linker is inserted into a terminal region of a gene encoding the polygammaglutamic acid synthetase complex, and a gene encoding a target protein is inserted into the inserted linker.
- the present invention also provides a method for expressing a cell surface of a target protein comprising culturing the transformed microorganism to express the target protein on the cell surface and recovering the cell expressing the target protein on the surface.
- the present invention also provides a microorganism transformed with the surface expression vector.
- the microorganism used for transformation may be characterized in that it is modified so as not to produce intracellular or extracellular proteolytic enzymes involved in decomposing the expressed target protein so as to favor the cell surface expression of the target protein. .
- Figure 8 shows the genetic map of the surface expression vector (pKV-Pald-pgsA3), PgsA motif 1-80 a.a -EGFP using the Lactobacillus casei according to the present invention as a host.
- Figure 10 shows the genetic map of the surface expression vector (pKV-Pald-pgsA5), pKV-PgsA 1-188 a.a-EGFP using the Lactobacillus casei according to the present invention as a host.
- Figure 13 shows the genetic map of the surface expression vector (pKV-Pald-pgsA8), PgsA motif 25-100 a.a -EGFP as a host of Lactobacillus casei according to the present invention.
- variants of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 are also included within the scope of the present invention.
- the first promoter of the present invention, the aldolase promoter and the second promoter, the galactose mutarotase promoter nucleic acid molecule are functional equivalents of nucleic acid molecules constituting the same, for example, the first promoter, the aldolase promoter and the second promoter.
- the microorganism used for transformation is transformed to be advantageous in favor of cell surface expression of the target protein, and is modified to prevent production of intracellular or extracellular proteases involved in decomposing the expressed target protein.
- Microorganisms are transformed to be advantageous in favor of cell surface expression of the target protein, and is modified to prevent production of intracellular or extracellular proteases involved in decomposing the expressed target protein.
- the present invention is a cell surface of a target protein comprising culturing a microorganism transformed with the surface expression vector to express the target protein on the cell surface and recovering cells expressing the target protein on the surface.
- the purpose is to provide an expression method.
- the surface expression vector of the present invention to express a foreign protein on the surface of a microorganism, it provides a method for producing a target protein that can efficiently use the target protein without going through a cell crushing or protein separation and purification process.
- the antigenic material In order for the vaccine to be effective in producing antibodies, the antigenic material must be released into the body so that the antibody-producing mechanism of the vaccinated subject can be realized. Therefore, for the immune response, the microorganism carrier of the gene product must first be introduced into the body. In order to stimulate the desired response by the antigen presented in the transformant of the present invention, administration methods such as intravenous injection, intramuscular injection, and subcutaneous injection are possible. It is preferred to administer.
- the present invention selects an extracellular membrane protein involved in the synthesis of polygamma glutamic acid derived from a strain of the genus Bacillus as a new surface expression parent capable of expressing a large amount of foreign protein on the surface of a microorganism, and uses it to microbial foreign protein or peptide It is an object of the present invention to provide a surface expression vector capable of expressing on a surface, and to provide a method for efficiently expressing a foreign protein on the surface of a transformant in various transformants transformed therewith.
- the fluorescence image was observed through a confocal microscope (Confocal microscopy, Carl Zeiss LSM800).
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Abstract
Description
Claims (27)
- 제1프로모터, 표면발현을 위한 폴리감마글루탐산 합성효소복합체를 코드 하는 유전자 및 목적단백질을 코드 하는 유전자; 및 제2프로모터, 표면발현을 위한 폴리감마글루탐산 합성효소복합체를 코드 하는 유전자 및 목적단백질을 코드 하는 유전자;를 포함하는 목적단백질의 표면발현벡터.
- 제1항에 있어서, 제1프로모터는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 표면발현벡터.
- 제1항에 있어서, 제2프로모터는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 표면발현벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리감마글루탐산 합성효소복합체를 코드 하는 유전자는 폴리감마글루탐산을 생산하는 바실러스 속 균주에서 유래한 것을 특징으로 하는 목적단백질의 표면발현벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리감마글루탐산 합성효소복합체를 코드 하는 유전자의 말단 부위에 링커가 삽입되어 있고, 상기 삽입된 링커에 목적단백질을 코드 하는 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 표면발현벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 목적단백질은 표면발현에 유리하도록 목적단백질의 아미노산 서열 중 일부분이 제거되거나 위치 특이적으로 돌연변이된 것임을 특징으로 하는 목적단백질의 표면발현벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 제1프로모터는 유산균 유래의 알돌레이즈 프로모터(Pald) 인 것을 특징으로 하는 목적단백질의 표면발현벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 제2프로모터는 유산균 유래의 갈락토오스 뮤타로테이즈 프로모터(Pgm) 인 것을 특징으로 하는 목적단백질의 표면발현벡터.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 그람음성균 또는 그람양성균에 적용되는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 표면발현벡터.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 표면발현벡터로 형질전환된 미생물.
- 제10항에 있어서, 형질전환에 사용된 미생물은 목적단백질의 세포 표면발현에 유리하도록, 발현된 목적단백질을 분해하는데 관련된 세포 내 또는 세포 외의 단백질 분해효소를 생산하지 못하도록 변형된 것임을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
- 제10항에 있어서, 미생물은 유산균인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코드하는 유전자는 pgsA로서, 서열번호 21 내지 24 및 32 내지 34 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 표면발현벡터.
- 제13항에 있어서, 상기 유전자 pgsA는 폴리감마글루탐산을 생산하는 바실러스 속 균주에서 유래한 것을 특징으로 하는 목적단백질의 표면발현벡터.
- 제13항에 있어서, 상기 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코드하는 유전자 pgsA는 서열번호 25의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 표면발현벡터.
- 제13항에 있어서, 상기 유전자 pgsA의 말단부위에 링커가 삽입되어 있고, 상기 삽입된 링커에 목적단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 표면발현벡터.
- 제13항에 있어서, 상기 목적단백질은 표면발현에 유리하도록 목적단백질의 아미노산 서열 중 일부분이 제거되거나 위치 특이적으로 돌연변이된 것임을 특징으로 하는 목적단백질의 표면발현벡터.
- 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 그람음성균 또는 그람양성균에 적용되는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 표면발현벡터.
- 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항의 표면발현벡터로 형질전환된 미생물.
- 제19항에 있어서, 형질전환에 사용된 미생물은 목적단백질의 세포 표면발현에 유리하도록, 발현된 목적단백질을 분해하는데 관련된 세포 내 또는 세포 외의 단백질 분해효소를 생산하지 못하도록 변형된 것임을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
- 제19항에 있어서, 미생물은 유산균인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
- 제10항의 형질전환된 미생물을 배양하여 목적단백질을 세포표면에 발현하는 단계 및 목적단백질이 표면에 발현된 세포를 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 세포표면 발현방법.
- 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 그람음성 또는 그람양성 숙주세포의 표면에 목적단백질을 발현시키는 방법:(a) 제9항의 미생물 표면발현용 벡터에 목적단백질을 코드 하는 유전자를 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;(b) 상기 재조합 벡터로 그람음성 또는 그람양성 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및(c) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적단백질을 숙주세포 표면에 발현하는 단계.
- 제19항의 형질전환된 미생물을 배양하여 목적단백질을 세포표면에 발현하는 단계 및 목적단백질이 표면에 발현된 세포를 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 세포표면 발현방법.
- 제24항에 있어서, 목적단백질은 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달 단백질 혹은 그 일부분, 항체 혹은 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질, 결합도메인, 펩타이드, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액응고 인자 및 식물 생체방어 유도 단백질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항의 방법에 의해 제조되고, 항원이 표면에 발현된 세포를 인간을 제외한 척추동물에 투여하여 체액성 면역 또는 세포성 면역을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 그람음성 또는 그람양성 숙주세포의 표면에 목적단백질을 발현시키는 방법 :(a) 제18항의 목적단백질의 표면발현벡터에 목적단백질을 코드하는 유전자를 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;(b) 상기 재조합 벡터로 그람음성 또는 그람양성 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및(c) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적단백질을 숙주세포 표면에 발현하는 단계.
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