JPH08501282A

JPH08501282A - Ｃ型肝炎ウイルスに特異的な細胞障害性ｔ細胞を刺激するためのペプチド

Info

Publication number: JPH08501282A
Application number: JP6501656A
Authority: JP
Inventors: ベルゾフスキー，ジエイ・エイ; 睦訓白井; アカツカ，トシタカ; フエインストーン，ステイーブン・エム
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1992-06-10
Filing date: 1993-06-10
Publication date: 1996-02-13
Anticipated expiration: 2019-03-22
Also published as: US5980899A; JP3510249B2; DE69310734D1; ATE153031T1; EP0644894B1; AU669193B2; CA2135278A1; WO1993025575A1; AU4530093A; DE69310734T2; CA2135278C; DK0644894T3; EP0644894A1; GR3024462T3; ES2104156T3

Abstract

(57)【要約】Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５領域によってコードされたタンパク質に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を、両親媒性アルゴリズムによってＴ細胞エピトープの候補として選択されたＮＳ５由来の２８個のぺプチドを用いて決定した。ＢＡＬＢ/ｃマウスにおいては、１６残基の合成ぺプチドによって示される比較的保存された１つのエピトープがＤ^dクラスＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によって定型のＣＤ４^-ＣＤ８⁺ＣＴＬに提供された。ChironのＨＣＶ１単離物のポリタンパク質のアミノ酸残基２４２２−２４３７を示す例示ぺプチドは、アミノ酸配列ＭＳＹＳＷＴＧＡＬＶＴＰＣＡＡＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を有していた。このぺプチドに特異的なＣＴＬ系は、各々が保存性置換を有する既知の２つのＮＳ５配列変異体を認識した。従って、ＣＴＬはモデル標的細胞上のクラスＩのＭＨＣ分子と結合して、ＲＮＡポリメラーゼと推定されるＨＣＶのＮＳ５遺伝子の産物を認識し、ウイルスに感染した肝細胞またはその他の任意の細胞の同じエピトープを認識し得る。

Description

【発明の詳細な説明】Ｃ型肝炎ウイルスに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を剌激するためのペプチド発明の背景Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、非経口的に伝播する非Ａ非Ｂ（ＮＡＮＢ）型肝炎の最近認識された原因物質である。実験的に感染させたチンパンジーの血漿からウイルスのＲＮＡゲノムを分子クローニングした（明細書末尾の番号付き文献リストの文献番号８を参照されたい）。ゲノムの配列の分析によれば、このゲノムは長さ約９５００ヌクレオチドの一本鎖のプラスセンスＲＮＡであることが判明した。３０１１個のアミノ酸残基から成るポリタンパク質をコードする９０３３ヌクレオチドの長い単一読み取り枠が知見された。これらのゲノムの特徴及び配列比較と大きさ及び脂質溶媒に対する不安定性に関する知識との総合的な考察から、ウイルスがフラビウイルス科（６，２２）の一員である可能性が示唆された。しかしながら、このウイルスは典型的なフラビウイルスよりもペスチウイルス属のほうに近縁であるとも考えられる（２７，６０）。ゲノムと予測されたポリタンパク質との配列類似性、並びにポリタンパク質の疎水性プロフィール及び酸性／塩基性アミノ酸含量などのいくつかの特徴に基づいて考察すると、ＨＣＶのタンパク質はフラビウイルスに関して決定されたゲノムの普遍領域と同じ領域にコードされていると推測される。フラビウイルス及び近縁ペスチウイルスにおいては、ポリタンパク質のアミノ末端の約１／３がウイルスの構造タンパク質を構成している。これらは、“Ｃ” と呼ばれる高塩基性ヌクレオキャプシドタンパク質と、“Ｍ”と呼ばれるエンベロープ関連糖タンパク質と、第二のエンベロープ糖タンパク質“Ｅ”とから成る。非構造タンパク質はＮＳ１〜ＮＳ５と命名されているが、ＮＳ３とＮＳ５との機能だけが確実に判明している。ＮＳ３はウイルスプロテアーゼであり、恐らくはヘリカーゼである。ＮＳ５はウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。ウイルスプロテアーゼと宿主シグナラーゼとを併用した一連のタンパク質分解性消化によってＨＣＶポリタンパク質はプロセシングを受ける。ペスチウイルスポリタンパク質のプロセシングとフラビウイルスポリタンパク質のプロセシングとは細部に違いを有しているがその様式の概要は同じである。ＨＣＶのタンパク質も、おおむねフラビウイルスタンパク質との類似性によって決定されたが、ペスチウイルスと同様に大きさ、数及びプロセシングなどの細部ではフラビウイルスとの違いを有している。これらの前提に基づいて、研究中の非構造領域、即ちフラビウイルスＮＳ５領域ＲＮＡポリメラーゼに類似の非構造領域を、以後の記載ではＨＣＶの「ＮＳ５領域」または「ＮＳ５タンパク質」と呼ぶ。但し、これは便宜上の命名であり、機能及びプロセシングが同一であることを意味しない。発現したウイルス抗原に基づく診断検査が開発され、これらのアッセイを使用して血清疫学の分野における様々な研究が遂行されている（３３）。ＨＣＶ感染症に対する免疫応答に関する研究は未だ発展途上段階にある。市販の抗体アッセイは、組換えＤＮＡ手法によって酵母内で発現されたＨＣＶ抗原に対する抗体を測定する。「Ｃ１００−３」と呼ばれるこの抗原は、ウイルスゲノムの非構造タンパク質のコーディング領域に由来しており、恐らくはＮＳ４の一部分を表している（３３）。アッセイのより新しい変法では、ＮＳ３（プロテアーゼ／ヘリカーゼ）由来の抗原と内部ヌクレオキャプシドタンパク質Ｃとを使用する（６４）。これらの抗体はいずれも防御性であるとは考えられないが、各々が慢性感染個体中に共通に検出される。ＨＣＶは、非経口的に感染する非Ｂ型肝炎の多くの症例の原因であるだけでなく、散発的に集団感染する急性ウイルス性肝炎、未解明起原の慢性肝炎、特発性肝硬変、及び、恐らくは肝細胞性癌の大部分の原因である（２，１６，３１，５０）。このウイルスは慢性感染症及び慢性肝臓病を発症させる傾向を有し、このため医学的に重要な問題となっている。α−インターフェロン療法による慢性ＨＣＶ肝臓病の治療は、米国食品医薬省（ＦＤＡ、Food and Drug Administration ）によって最近認可された。しかしながら、この療法に対する応答患者の数は過半数を割り、応答患者の約５０％が治療中止後に再発する（１６）。従って、このウイルスの感染を防御するワクチンの必要性は大きい。現行の診断検査は、発現したウイルスタンパク質に対する血清抗体の検出に基づいて行われているが、今日まで、かかる抗体によって認識されたすべてのタンパク質は、非構造ウイルスタンパク質を示すかまたはウイルス粒子の内部成分を示していた。ＨＣＶに対する有効な中和抗体がウイルス感染個体によって共通に産生されるか否かは明らかでない。細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）がある種のウイルス感染に対するin vivo防御を媒介することは知見されていた（１７，４７，４８）。Ｂ型肝炎感染の場合、ＣＴＬは、慢性Ｂ型肝炎の病理発生の主因であり、感染細胞上で発現したウイルス抗原を認識することによってＢ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞を溶解させると考えられる（３９，４２）。ＨＣＶの場合、ウイルス感染症の病理発生に関する情報は全く存在しない。ＨＣＶ感染症の慢性化傾向及び組織病理学的所見からは、ウイルスが肝細胞中で直接細胞変性（または細胞溶解性）を生起させるのではないと考えられる。ＨＣＶ感染症関連の慢性肝臓病は免疫媒介されるという可能性も考えられる。これらの観察は、ＨＣＶ特異的ＣＴＬがＨＣＶ関連疾患の病理発生の因果関係に関与すること、または、感染防御のためもしくは回復のためには細胞性免疫が重要であることを信じるさせるだけの十分な理由となる。従来の研究ではＣＤ８⁺ ＣＴＬが慢性ＮＡＮＢ肝炎患者の肝細胞を認識すると報告されている（２８）。しかしながら今日まで、いかなるＨＣＶタンパク質中でも、Ｔ細胞によって認識されるＨＣＶのエピトープが同定されたことはない。従って、Ｔ細胞によって認識されるＨＣＶのエピトープを同定する必要がある。このようなエピトープを含むペプチドは、ＨＣＶ感染及び病理発生におけるＨＣＶ中のＣＴＬの役割を決定するために使用できる。かかるペプチドは、防御作用を増進するかまたは発病作用を阻害することによって、肝炎またはその他のＨＣＶ関連疾患治療中のＨＣＶ特異的ＣＴＬ応答を変調するために使用し得る。更に、この種のペプチドは、防御性ＣＴＬ応答を剌激することによって、感染を阻止するワクチンに使用し得る。別のウイルスモデルにおいては、内部タンパク質がＣＴＬ応答の主要標的である（３，３０，４９，６２，６９）。本発明者及び他の研究者らによる従来の研究においては、ＨＩＶの内部タンパク質、逆転写酵素、並びにエンベロープ糖タンパク質及びｇａｇ及びｎｅｆタンパク質に由来のペプチドがマウス及びヒトのＣＴＬによって認識された（１０，１４，２４，３２，４３，５７，６５）。ＨＣＶの場合においては、エンベロープの配列が比較的高度な可変性を有するので（２７）、エンベロープタンパク質による免疫感作は実施できないであろう。従って、ＣＴＬクローンは、ＨＩＶ-１の研究で判明したように（４１，５８，５９）、ＨＣＶの種々の単離物を識別するであろう。ＨＣＶの予測エンベロープ糖タンパク質（“Ｅ１”及び“Ｅ２／ＮＳＩ”と命名）中にはかなりのアミノ酸配列変異が存在するのと対照的に、内部ヌクレオキャプシドタンパク質Ｃ、非構造（ＮＳ）領域３、ＮＳ４及びＮＳ５タンパク質はいずれも、ＨＣＶ単離物群中でもより高い配列保存性を示す（２７）。ゲノム内の位置及びその配列相似性の双方がフラビウイルスのＮＳ５に類似したＨＣＶゲノムのコーディング領域はウイルスレプリカーゼを示すと考えられる。発明の概要従って本発明の目的は、ＨＣＶに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘発するペプチドを提供することである。本発明の別の目的は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５タンパク質のエピトープを認識する細胞障害性Ｔリンパ球の検出方法を提供することである。本発明の更に別の目的は、哺乳動物中でＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５タンパク質に対する免疫応答を誘発する方法を提供することである。本発明の最後の目的は、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染を防御するワクチンを提供することである。これらの目的を達成するために、本発明の１つの目的に従って、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５タンパク質を発現する細胞に対して哺乳動物のリンパ球中で細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発するＴ細胞エピトープを示す精製ペプチドが提供される。該ペプチドは、ＭＳＹＳＷＴＧＡＬＶＴＰＣＡＡＥ〔ＳＥＱＩＤＮＯ：１〕、ＭＳＹＴＷＴＧＡＬＶＴＰＣＡＡＥ〔ＳＥＱＩＤＮＯ：２〕、ＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰＣＡＡＥ〔ＳＥＱＩＤＮＯ：３〕及びその免疫学的に等価の配列から成るグループから選択されたアミノ酸配列の少なくとも約８個の連続残基から成る。本発明の目的を果たす種々の実施態様によれば、ペプチドは更に、細胞障害性Ｔ細胞もしくはヘルパーＴ細胞に対する付加的なＴ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープ（抗原認識部位）を示す。本発明の別の目的に従って、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５タンパク質のＴ細胞エピトープに応答する細胞障害性Ｔ細胞を哺乳動物のリンパ球中で検出する方法が提供される。この方法は、（ａ）細胞障害性Ｔ細胞の試験対象リンパ球にＭＨＣ適合性の標的細胞を請求項１のペプチドと接触させ、（ｂ）細胞障害性Ｔ細胞の試験対象リンパ球を請求項１のペプチドと共にインキュベートし、（ｃ）該標的細胞に対する該リンパ球の細胞障害作用の有無を決定し、これにより、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５タンパク質のＴ細胞エピトープを認識するリンパ球の存在を示す段階から成る。本発明の更に別の目的に従って、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５タンパク質に対する免疫応答を哺乳動物中で誘発する方法が提供される。この方法は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５タンパク質を発現する細胞に対する細胞障害性Ｔ細胞の応答を誘発するために有効な量の請求項１のペプチドを哺乳動物に投与する段階を含む。本発明の最後の目的によれば、Ｃ型肝炎ウイルスの感染を防御するかまたはＣ型肝炎ウイルスの発病作用を軽減するワクチンが提供される。このワクチンは本発明のペプチドから成る。本発明のその他の目的及び利点は、ある程度は以下の記載に開示されており、ある程度は以下の記載から理解されるかまたは本発明の実施によって判明するであろう。本発明の目的及び利点は、添付の請求の範囲に詳細に説明した物質組成物及び方法によって実現及び達成される。図面の簡単な説明図１Ａは、ＨＣＶＮＳ５領域に由来のＴ細胞エピトープの候補として両親媒性アルゴリズムによって選択した２８個のペプチド群の配列（ＳＥＱＩＤＮＯＳ．４−１７，１−３及び１８− ３１）を示す。合成ペプチドの配列はＵ．Ｓ．Ａ．で作製されたChiron Corpora tion（２６）の単離物に基づくが、例外としてｐ１７の２つの変異体、ｐ１７ＦＤＡはＵ．Ｓ．ＦＤＡで作製された単離物に基づき、Ｐ１７ＪＰＮは別々の日本の研究所で別々に得られた２つの単離物に基づく。ＦＤＡ単離物とChiron配列とで違っている残基は原配列に下線を付けて示す。ペプチドの両親媒性スコア（３５）も示す。図１Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃ及びＢＡＬＢ．ＢマウスにおけるＨＣＶＮＳ５由来のペプチドに対する細胞障害性Ｔリンパ球の応答を示す。ＨＣＶＮＳ５領域（ｖＨＣＶ）を発現する組換えワクシニアウイルスを１０⁷プラーク形成単位の量で静注してマウスを初回抗原剌激する。ＣｏｎＡ（ＩＬ−２含有）で刺激したリンパ球の上清の存在下に免疫脾細胞を４μＭのペプチド（各培養物毎に３種類の異なるペプチド）でin vitro再刺激し、また対照としては、細胞をペプチド非含有のＩＬ−２で処理した。ＢＡＬＢ／ｃ中ではｎｅｏ耐性遺伝子（１８Ｎｅｏ、Ｈ−２^dクラスＩ陽性、クラスII陰性）で、また、ＢＡＬＢ．Ｂ中ではＥＬ− ４（Ｈ−２^d）でトランスフェクトした３Ｔ３線維芽細胞に対するＣＴＬ活性を測定した。標的を１０μＭの各ペプチド添加またはペプチド非添加で６時間感作した。三重実験を実施した。エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比＝１００：１とし、５０００標的細胞／ウエルを使用した。ペプチド非存在下の溶解はＢＡＬＢ／ｃで２．２〜７．７％（Ｐ１７剌激免疫細胞では４．２％）、ＢＡＬＢ．Ｂでは２％未満であった。概して、三重実験の標準誤差は値の＜５％であり、反復実験で同等の結果が得られた。図２は、Ｐ１７及びＰ１７ＦＤＡに特異的なＣＴＬ系が各特異的ペプチド及びその他のＰ１７変異体に対して示す細胞障害性を示す。１つのアミノ酸の突然変異が変異エピトープの認識に与える効果を試験した。５×１０³個の⁵¹Ｃｒ標識した標的細胞（１８Ｎｅｏ）を長期ＣＴＬ系に由来のエフェクター細胞と共に培養し、各特異的ペプチド、その他のＰ１７変異体、Ｐ１８IIIＢ（陰性対照ペプチド）の存在下またはペプチド非存在下に特異的ペプチドで反復的に刺激した。Ｅ：Ｔはエフェクター：標的比である。ペプチド非存在下の溶解は＜１％であった。三重実験の標準誤差は概して値の＜５％であり、独立した３つの試験で同等の結果が得られた。図３は、Ｈ−２^dによって制限されたＰ１７及びＰ１７ＦＤＡに特異的なＣＴＬ系について、ＮＳ５を発現するｖＨＣＶワクシニアウイルスに感染させた（１時間、３７℃、感染多重度１０：１、使用以前に３回洗浄）１８Ｎｅｏ細胞（ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞）と特異的ペプチド（１０μＭ）の各々でパルスした１８Ｎｅｏとに対する細胞障害性試験の結果を示す。陰性対照標的としては、対照ｖＳＣ８ワクシニアウイルスに感染させた１８Ｎｅｏ（ｎｅｏ遺伝子をトランスフェクトしたＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３）並びにＰ１８IIIＢ（１μＭ）でパルスした１８Ｎｅｏ及び非パルスの１８Ｎｅｏを使用した。三重試験の標準誤差は概して値の＜５％であり、独立した３つの試験で同等の結果が得られた。図４は、Ｐ１７に特異的なＨ−２^dＣＴＬ系の表現型の分析を示す。図２に記載したようなＣＴＬアッセイを、指示した希釈度の抗Ｌ３Ｔ４（ＧＫ１．５）（抗ＣＤ４）モノクローナル抗体または抗Ｌｙｔ２．２（２．４３）（抗ＣＤ８）モノクローナル抗体の存在下または抗体非存在下に６時間行った。１８ＮｅｏをＰ１７（１０μＭ）で一夜パルスし、３回洗浄した。三重試験の標準誤差は概して値の＜５％であり、独立した３つの試験で同等の結果が得られた。図５は、Ｈ−２^d株中のＣＴＬにＰ１７を提示する役割を果たすＭＨＣクラスＩ分子の同定を示す。標的細胞をＰ１７（１０μＭ）で一夜パルスし、３回洗浄した。エフェクター：標的比＝１０：１とした。ＴＭ：Ｄ^d分子のトランスメンブラン部分。各トランスフェクタントに対するα１ α２α３ＴＭの起原は、Ｄ^dＤ^dＤ^dＤ^d，Ｔ４．８．３；Ｌ^dＬ^dＬ^dＬ^d，Ｔ１．１．１；−Ｄ^dＤ^dＤ^d，ＤＭＴ２６．５Ｓ１；Ｄ^dＤ^dＬ^dＬ^d，Ｔ３７．２．１；Ｌ^dＬ^dＤ^dＤ^d，Ｔ３７．１．３；Ｄ^dＬ^dＬ^dＬ^d，Ｔ９．１０．３；及びＬ^dＤ^dＤ^dＤ^d，ＤＭＴ３４．５である。三重試験の標準誤差は概して値の＜５％であり、独立した２つの試験で同等の結果が得られた。Ｌ２８：ｐＳＶ２ｎｅｏ遺伝子単独でトランスフェクトされたＤＡＰ３Ｌ細胞（Ｈ−２^k）；１８Ｎｅｏ：ＰＳＶ２ＮＥＯ単独でトランスフェクトされたＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞（Ｈ−２^d）。特定実施態様の詳細な説明前述のごとく、ある種のウイルス感染症に対するin vivo防御をＣＴＬが媒介することは従来から知られていたが、いかなるＨＣＶタンパク質中でもＣＴＬエピトープが確定されたことはない。しかしながら、ＲＮＡポリメラーゼに相同性を有するフラビウイルス遺伝子に対応するＨＣＶの非構造タンパク質（ＮＳ５）が比較的保存されたＣＴＬの標的タンパク質であり、実際にリンパ球中の細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発するエピトープを提供することは知見されていた。ＨＣＶＮＳ５タンパク質に特異的なＣＴＬのエピトープ特異性を研究するために、このタンパク質に由来の２８ペプチドをマウスのＣＴＬ中で試験した。ＨＣＶＮＳ５遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスによってマウスを免疫感作し、初回抗原剌激した牌細胞をペプチドによってin vitroで再剌激した。Ｈ− ２^dマウスに由来のＣＴＬは１６残基から成る１つの合成ペプチドに応答した。このペプチドは本明細書でＰ１７として同定され、ＨＣＶ読み取り枠の残基２４２２〜２４３７に対応する。この比較的保存されたエピトープはＨ−２^dクラスＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によって定型のＣＤ４^-ＣＤ８⁺ＣＴＬには提示されたが、Ｈ−２^bで制限されたＣＴＬによって認識されなかった。更に、組換えＤ^d／Ｌ^d及びＫ^dを発現する複数のトランスフェクタントを用いるエキソン-シャッフル実験は、このペプチドがＤ^dクラスＩＭＨＣ分子のα１及びα２ドメインと関連して認識されることを示した。Ｐ１７ペプチドのアミノ酸配列は、別の３つのＨＣＶ単離物のこの非構造領域の相同セグメントに比べて１残基の違いを有している。標的感作能に対する各残基の効果を試験するために１個のアミノ酸が置換された変異ペプチドを作製した。どの置換も認識に全く影響しなかった。従って、これらの保存性突然変異は、ペプチドとＤ^dクラスＩＭＨＣ分子との相互作用に対してもＴ細胞受容体との相互作用に対しても全く影響しなかった。マウスのＣＴＬは、米国及び日本で作製された４つの配列決定されたＨＣＶ単離物全部を表すペプチドと交差反応する。従って、ヒトＣＴＬが同様の交差反応性を示すならば、本発明のペプチドはＨＣＶ診断及びワクチン開発に有効なはずである。その場合、本発明のペプチドは、ウイルス感染を予防または治療するためのＨＣＶワクチンの成分の候補になり得る。更に、これらのペプチドは、細胞性免疫系がＨＣＶのＮＳ５タンパク質に対する応答を示すか否かの判定に基づく診断方法または予防方法の開発に有用であろう。本発明のペプチドの詳細及びその他の特徴を以下に記載する。Ａ．定義本明細書で使用したいくつかの用語を以下のごとく定義する。アミノ酸残基：本文中で同定されたアミノ酸残基は天然のＬ立体配置である。アミノ酸残基に関しては以下の略号を使用する。本文中ですべてのアミノ酸配列は、定型のアミノ末端からカルボキシ末端の方向を左から右の方向で示す式によって示されている。ペプチド：本文中で使用されたペプチドなる用語は、隣り合う残基のα−アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって１つずつ連結されたアミノ酸残基の直鎖系列を示す。本文中で使用されたペプチドなる用語は、ＨＣＶのＮＳ５のような天然発生タンパク質を包含しない。抗体：本文中で種々の文法的形態で使用された抗体なる用語は、免疫グロブリン分子の集団を示すか、または、免疫グロブリン分子、即ち「抗原結合部位」もしくはパラトープを含む分子の免疫学的活性部分を示す集合名詞である。抗原結合部位なる用語は、抗原のＢ細胞エピトープに特異的に結合する抗体分子の構造部分を意味する。Ｂ．ペプチド哺乳動物のリンパ球中で特定タンパク質を発現する細胞に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発するＴ細胞エピトープを示すペプチドを構築するためには、Ｔ細胞エピトープの候補を含む一連のペプチドを実験的に試験する必要がある。このような候補は、両親媒性螺旋を形成する傾向を示すアミノ酸配列の両親媒性スコア（３５）によって同定される。クラスII制限されたＴ細胞エピトープと両親媒性スコア＞４の領域との間の相関関係は、１９９１年に９２個の公知のエピトープに関して評価したときでさえも統計的に高度に有意であり（１２，１３）（ｐ＜０．０００３）、本発明で研究したより小さいセットのＣＴＬエピトープに関しても有意である。しかしながら、この閾値を上回る桁のスコアと１つの部位がＴ細胞によって認識される確率との間の相関関係は知見されていない。上述の方法によって、ＭＳＹＳＷＴＧＡＬＶＴＰＣＡＡＥ〔ＳＥＱＩＤＮＯ：１〕，ＭＳＹＴＷＴＧＡＬＶＴＰＣＡＡＥ〔ＳＥＱＩＤＮＯ：２〕及びＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰＣＡＡＥ〔ＳＥＱＩＤＮＯ：３〕から成るグループから選択されたアミノ酸配列を有するペプチドが哺乳類リンパ球中でＣ型肝炎ウイルスＮＳ５タンパク質を発現する細胞に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発することが知見された。従って、哺乳動物のリンパ球中でＣ型肝炎ウイルスＮＳ５タンパク質を発現する細胞に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発するＴ細胞エピトープを示すペプチドを本発明によって合成し得る。本発明のペプチドは、上記の例示アミノ酸配列または例示配列の免疫学的等価物の全部または一部を含み得る。特に、本発明のペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ５領域に含まれているＨＣＶポリタンパク質アミノ酸残基２４２２〜２４３７の配列、またはＨＣＶポリタンパク質アミノ酸残基２４２２〜２４３７の免疫学的等価物を含み得る。「免疫学的に等価」なる表現は、ＨＣＶポリタンパク質の残基２４２２〜２４３７から成る天然アミノ酸配列を有する免疫原性ペプチド中にはいくつかのアミノ酸置換または欠失が生じ得るが、置換または欠失を有するペプチドが出発免疫原性ペプチドと実質的に等価の免疫応答を誘発することを意味する。このような置換または欠失は複数の確定した理論に基づいて生じ得る。これらのいくつかに関しては後述する。この観点から、ＨＣＶポリタンパク質の残基２４２２〜２４３７を発現する細胞に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発する能力を有するペプチドは、本発明のペプチドの免疫学的等価物であると考えられる。より詳細には、ＨＣＶポリタンパク質の残基２４２２〜２４３７の免疫学的等価物であるためには、ペプチドが、（１）ＨＣＶＮＳ５タンパク質の主要部を提示するＭＨＣ分子を有する標的細胞によって提供されることが可能であり、（２）このようなＭＨＣ分子の存在下に、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５タンパク質によって初回抗原剌激された細胞障害性Ｔリンパ球によって認識されることが可能でなければならない。即ち、「免疫学的に等価」であるためには、天然ＨＣＶエピトープ配列またはそのフラグメントの各残基が免疫学的に等価の残基で置換される必要はなく、ペプチドが全体として実質的に等価の免疫応答を誘発すればよい。従って、保存性または非保存性にかかわりなく、１つのアミノ酸を別のアミノ酸で置換し、この変化が使用中に何らかの利点を与えるものであるならば、本発明を実施する際にこのような置換を計画してもよい。保存性置換とは、１つのアミノ酸残基が生物学的に同様の別の残基によって置換されることを意味する。保存性置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの疎水性残基による別の残基の置換、または、アルギニンとリシンとの間、グルタミン酸とアスパラギン酸との間、もしくはグルタミンとアスパラギンとの間で行われるような１つの極性残基による別の残基の置換がある。保存性置換はまた、ペプチドが必要な結合活性を示すことができるという条件で、未置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用する場合も包含する。特異的ＭＨＣタンパク質に結合するために必要な直鎖状アミノ酸配列の残基を決定する系統的な方法は公知である。例えば、Allen,P.M.ら，Nature 327:713-7 17(1987);Sette,A.ら，Nature 328:395-399(1987);Takahashi,H.ら，J.Exp.Med. 170:2023-2035(1989);Maryanski,J.L.ら,Cell 60:63-72(1990)を参照するとよい。同様にして、特異的抗体に結合するために直鎖状アミノ酸配列のどの残基が必要であるかを決定する系統的方法も公知であり、Ｔ細胞受容体によって認識されるには配列のどの残基が必要であるかを決定するためにも本質的に同じ方法を応用し得る。例えば、H.M.GeysenのＰＣＴ出願ＷＯ８４０３５６４，「タンパク質中の活性配列を検出するためのアミノ酸配列抗原性の決定（Determination of aminoacid sequence antigenicity for Iocation of activ e sequence in a protein）」を参照するとよい。該特許出願の全記載内容が本明細書に含まれるものとする。該出願は、タンパク質またはタンパク質の一部分の既知のアミノ酸配列内部の抗原的活性アミノ酸配列を決定する方法を開示しており、（１）既知のアミノ酸配列内部の１つの配列に対応する１つの配列を各々が含む複数のオーバーラップアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、（２）当該タンパク質またはその一部分に対する抗体とペプチドとを接触させ、（３）各ペプチドと抗体との間の抗原抗体反応の有無を検出または決定することによってペプチドの抗原活性の有無の指標とする段階から成る。 ChironのＨＣＶ１ポリタンパク質配列の残基２４２２-２４３７から成るペプチドによって例示される本発明のペプチドの配列の免疫学的等価物を同定するためにこの方法を応用する場合は、当該タンパク質に対する抗体の代わりにＨＣＶＮＳ５タンパク質を発現する標的細胞に特異的な細胞障害性Ｔ細胞を用いる必要がある。この目的に適した細胞障害性Ｔ細胞の例としては、ＨＣＶ感染した哺乳動物もしくはＨＣＶＮＳ５タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスで免疫感作した哺乳動物のリンパ球、または、実施例２において後述するように本発明のペプチドで反復刺激することによってかかる免疫細胞から誘導した細胞障害性Ｔ細胞クローンがある。例示配列の内部でＨＣＶＮＳ５タンパク質の機能性Ｔ細胞エピトープの提示に必要な残基を更に限定することによって本発明の例示ペプチドの免疫学的等価物を同定するために細胞障害性Ｔ細胞を使用することができ、このために前出のGeysen の方法を、例えば１つの抗体をＴ細胞で置換することによって修正した方法またはTakahashi,H.ら、J.Exp.Med.170:2023-2035(1989a),Science 246:118-121(198 9b)及びScience 255:333-336(1992)の記載に従って修正した方法を使用し得る。また、これらの方法を応用することによって、Ｔ細胞エピトープ活性に必要な本発明のＨＣＶポリタンパク質の残基２４２２−２４３７の配列の直鎖状サブセットを同定することも期待できる。ＭＨＣ分子によって提示されＴ細胞受容体によって認識され得る機能性Ｔ細胞エピトープは、通常は９個のアミノ酸の直鎖状配列から構成されるが、８個または１０個のアミノ酸から成る直鎖状エピトープもいくつか知られている。例えばFa lk,K.ら，Nature,351:290(1991);Jardetzky,T.F.ら，Nature 353:326-329(1991) ;Hunt,D.F.ら，Science 255:1261-1263(1992);及びRomero,P.ら，J.Exp.Med.174 :603-612(1991)を参照するとよい。従って、本発明の例示ペプチド配列に免疫学的に等価の配列は、少なくとも８個のアミノ酸、例えば上述のＴ細胞エピトープ機能に必要であることが判明している１６個の例示アミノ酸中の８個の連続残基を必要とすると考えられている。しかしながら、８個未満のアミノ酸から成るペプチド、例えば７個または６個のアミノ酸から成るペプチドも上述の方法によって本発明の例示ペプチドに免疫学的に等価であることが証明されており、かかるペプチドも本発明の範囲内に包含される。要するに、本発明のペプチドは少なくとも約８個のアミノ酸から成り、これは最小６個のアミノ酸をも含んでいることを意味する。本発明のペプチドの長さは、例えば免疫感作に使用されるキャリアの種類次第で、機能性Ｔ細胞エピトープの最小所要残基数以上に可変である。ペプチドの長さは通常は、エピトープ間の干渉の機会が最小になるように、所望エピトープ以外のエピトープの数を最小限に抑えた長さが好ましい。更に、化学合成によってペプチドを調製するとき、付加的な残基はペプチド調製の所要時間を延長し経費を増加させ最終産物の純度及び収率を低下させるであろう。従って、合成ペプチドは好ましくは５０残基未満、より好ましくは３０残基未満である。しかしながら、ＨＣＶＰ１７エピトープのペプチドに加えていくつかのエピトープを提示するペプチドも勿論本発明の範囲内に包含される。かかるペプチドの最適長さは慣用の実験方法によって得られるであろう。本発明の目的に適うペプチドの例としては、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５タンパク質を発現する細胞に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を哺乳動物のリンパ球中で誘発するＴ細胞エピトープを示す１６残基のペプチドがあり、このペプチドはアミノ酸配列ＭＳＹＴＷＴＧＡＬＶＴＰＣＡＡＥ〔ＳＥＱＩＤＮＯ：２〕を有している。この配列は、Ｕ．Ｓ．ＦＤＡによって得られたＨＣＶ単離物のＮＳ５タンパク質の残基２４２２−２４３７に由来し、従って、“Ｐ１７ＦＤＡ”と命名された。Ｐ１７ＦＤΛ配列は、別のＵ．Ｓ．単離物の対応するＮＳ５配列、即ちＰ１７と命名されたChironのＨＣＶ１配列ＭＳＹＳＷＴＧＡＬＶＴＰＣＡＡＥ〔ＳＥＱＩＤＮＯ：１〕（２６）に比べて１残基の違いを有している。Ｐ１７ＦＤＡ配列はまた、Ｐ１７ＪＰＮと命名された２つの異なる日本の単離物のこの部位に保存された配列ＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰＣＡＡＥ〔ＳＥＱＩＤＮＯ：３〕（２６，６０）に比べて別の１残基の違いを有している。従って、ペプチドＰ１７、Ｐ１７ＦＤＡ及びＰ１７ＪＰＮはChironのＨＣＶ１ポリタンパク質の残基２４２２-２４３７に対応するＨＣＶＮＳ５タンパク質部分の３つの天然変異体を示し、各々が、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５タンパク質を発現する細胞に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を哺乳動物のリパ球中で誘発するＴ細胞エピトープを示す。本発明のペプチドは更に、別のＨＣＶ単離物のＮＳ５タンパク質中のChironのＨＣＶ１単離物のＰ１７配列に対応する部分から成る天然配列を含み得る。このような追加の天然ＮＳ５配列は実施例２において後述する方法で決定され得る。即ち、ＨＣＶのウイルスＲＮＡを感染組織から抽出する（１９）。ＲＮＡを逆転写し、従来技術の特異的ＨＣＶプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する（９）。次に、ＰＣＲ産物をＮＳ５ＤＮＡの増幅及び配列決定用の適当なクローニングベクターに結合する。ＨＣＶの種々の単離物に由来のポリタンパク質がChironのＨＣＶ１単離物の３０１１個前後のアミノ酸を含み得ることは当業界で公知である。例えば、Ｐ１７ＪＰＮと呼ばれる配列を含む日本単離物のポリタンパク質は、３０１０残基だけを含み、そのＰ１７ＪＰＮ配列は残基２４２１-２４３６から成る。従って、本発明のＰ１７配列（ChironのＨＣＶ１配列の残基２４２２-２４３７）に構造的に対応する配列を見出すためには、新しく決定したＮＳ５配列を既知のＮＳ５配列例えばChironのＨＣＶ１配列の相同部分に位置合わせし、新しい配列の残基のうちで既知のＨＣＶポリタンパク質の残基２４２２-２４３７に対応する残基を同定する。次に、クローン化したＰＣＲ産物の解析によってＰ１７配列に対応する配列を有することが決定されたペプチドを作製し、実施例２で後述する方法でＴ細胞エピトープ機能を試験する。上記方法を使用すると、Ｔ細胞エピトープ活性に必要なＮＳ５タンパク質の直鎖状配列中の残基を同定することもでき、また、Ｔ細胞エピトープを示すために必要な位置のアミノ酸置換の許容範囲を限定することもできる。従って本発明のペプチドは、天然のＨＣＶＮＳ５アミノ酸配列に加えて、ＨＣＶＮＳ５タンパク質と実質的に同じ機能性エピトープを提供する別のアミノ酸配列も含み得る。これらの非天然アミノ酸配列は、天然配列中のＴ細胞エピトープ機能に必要なＮＳ５の残基のアミノ酸配列を種々のアミノ酸残基によって置換し、得られた配列の機能保持を実施例２に記載された方法で試験することによって同定できる。例えばＰＣＴ出願ＷＯ８６０６４８７は、例えばタンパク質上のエピトープを模倣する「ミモトープ」の開発方法を開示している。文献（７１）参照。この方法では、特定の対象受容体（例えば抗体）に相補的なリガンド（例えばエピトープ）の局所的等価物であるモノマーの配列を検出または決定する。この方法では、（ａ）式Ｄ２−Ｄ１のカタマーを合成する〔式中、Ｄ１は第一セットのモノマーから選択された（天然Ｌ-アミノ酸または合成Ｄ-形またはその他の修飾アミノ酸のような）指定モノマーを示し、Ｄ２は第一セットと同じでもよい第二セットのモノマーから選択された指定モノマーを示す〕。これらのカタマーの内部では、指定モノマーの各々が夫々のモノマーセットから選択されたモノマーを含むように系統的に変異している。方法は更に、（ｂ）各カタマーを対象受容体と接触させ、（ｃ）各カタマーと受容体との結合の有無を検出または判定する段階を含む。前出のＰＣＴ出願Ｎｏ．ＷＯ８６００９９１及び文献（７１）は更に、部分的に規定された構造のカタマーの抗体結合を試験することによってエピトープ（即ちミモトープ）に局所的に等価のアミノ酸配列を同定する詳細な方法を開示している。従って、当業者は、本発明の細胞障害性Ｔリンパ球及びそれらの受容体と上記のミモトープ開発方法とを使用することによって、本文中に開示した例示ペプチドによって提供されるＨＣＶＮＳ５Ｔ細胞エピトープに免疫学的に等価のエピトープを提供する本発明のペプチドを開発し得るであろう。これらの免疫学的に等価の「ペプチド」のミモトープは、ＨＣＶの天然アミノ酸配列を含む必要はなく、実際、いかなる天然アミノ酸配列も含む必要は全くない。ＨＣＶＮＳ５のＴ細胞エピトープの天然配列に部分的に等しい配列（１つまたは複数の保存性または非保存性置換または欠失がある配列）を有する本発明のペプチドは、通常はＮＳ５のＴ細胞エピトープの全部または一部を含むアミノ酸残基の数の約３０％以下、好ましくは約２０％以下、より好ましくは約１０％以下が置換または欠失しているが、必ずしもそうでもない。例えば本発明のペプチドをラベル、固体マトリックスまたは担体のような別の物質に適切に固定する「リンカー」として作用する追加の残基を各末端に付加した場合には上記の割合にならない。更に、本発明のペプチドのアミノ酸配列は、末端-ＮＨ₂アシル化、例えばアセチル化により修飾されることによってＨＣＶＮＳ５エピトープの天然配列とは違うものになる。このようなアシル化は、当業界でよく知られた理論に従って合成ペプチドの電荷を減少させるために使用される。本発明のペプチドは、組換えＤＮＡ手法を含むペプチド業界の業者に公知の手法のいずれかによって合成され得る。純度、抗原特異性、不要な副生物の不在、生成容易性、などの理由から固相メリフィールド型合成のような合成化学技術が好ましい。利用可能な多くの技術の優れた要約が、J.M.Steward & J.D.Yo ung,SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS,W.H.Freeman Co.,San Francisco,(1969);M .Bodanszkyら，PEPTIDE SYSTHESIS,John Wiley & Sons,Second Edition,(1976) 、などの文献に記載されており、固相ペプチド合成に関してはJ.Meienhofer,HOR MONAL PROTEINS AND PEPTIDES,Vol.2,p.46,Academic Press,New York(1983)、従来の溶液合成に関してはE.Schroder & K.Kubke,1 THE PEPTIDES,Academic Press , New York(1965)、に記載されている。これらの各文献の全記載内容が本明細書に含まれるものとする。かかる合成に使用可能な適当な保護基は、上記の文献及びJ.F.W.McOmie,PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC CHEMISTRY,Plenum Press,New Y ork(1973)に記載されている。この文献の全記載内容も本明細書に含まれるものとする。考察された固相合成法は概して、１つまたは複数のアミノ酸残基または適正に保護されたアミノ酸残基を伸長ペプチド鎖に順次付加する段階から成る。通常は、第一アミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基を選択的除去可能な適当な保護基によって保護する。リシンのような反応性側基を含むアミノ酸には選択的に除去できる別の保護基を使用する。例えば典型的な固相合成方法によれば、保護または誘導体化されたアミノ酸をその非保護カルボキシル基またはアミノ基を介して不活性固体支持体に固定する。次にアミノ基またはカルボキシル基の保護基を選択的に除去し、適正に保護された相補性（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列中の次のアミノ酸を付加し、固体支持体に既に固定された残基とのアミド結合を形成するために適当な条件下に反応させる。次に、この新しく付加されたアミノ酸残基からアミノ基またはカルボキシル基の保護基を除去し、次いで（適正に保護された）次のアミノ酸を付加し、以後同様に処理する。所望のアミノ酸全部が適正配列に結合されると、残存する末端基及び側基の保護基（及び固体支持体）を順次または同時に除去して最終ペプチドを得る。より簡単な小規模のペプチドの固相合成方法も公知である。例えば、Houghten ,R.A.,Proc.Nat1.Acad.Sci.U.S.A.82:5131-5135(1985);及びHoughton,M.,Q.-L.C hoo, & G.Kuo,European Patent Application 88310922(1988)を参照するとよい。Ｃ．アッセイ及び診断方法本発明の目的は、哺乳動物のリンパ球中でＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５タンパク質のＴ細胞エピトープに応答する細胞障害性Ｔ細胞を検出するための種々のアッセイ方法を開発することである。好ましい実施態様によれば、このアッセイは、標的細胞を本発明のペプチドと接触させる第一段階（ａ）を含む。これらの標的細胞は、ＨＣＶ特異的細胞障害性Ｔ細胞の試験対象リンパ球にＭＨＣ適合性であることがわかっているのが好ましい。第二段階（ｂ）では、ＨＳＶＮＳ５特異的ＣＴＬが適正な標的細胞に応答するように、細胞障害性Ｔ細胞の試験対象リンパ球を再剌激するに十分なin v itro条件下に本発明のペプチドと共にインキュベートする必要がある。第三段階（ｃ）では、試験リンパ球が標的細胞に作用させた細胞障害効果を判定し、これを、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５タンパク質のＴ細胞エピトープを認識するＣＴＬの存在の指標とする。本文中では、例示アッセイ方法をマウスのリンパ球を用いて記載しているが、本発明はこれに限定されない。例えば、本発明によれば、別のヒトＣＴＬを検出する公知方法を適当に応用することによって、例えばＨＣＶ感染が判明した患者または感染の疑いがある患者の血液またはその他の組織中でヒトＣＴＬを検出することも考えられる。例えば、Clerici,M.,ら,J.Imm.146:2214-2219(19 91)参照。本発明のアッセイは、哺乳動物の免疫系がＨＣＶのＮＳ５タンパク質によって誘発されたか否かを判定し、次いで、かかる応答の発生及び量がＨＣＶ感染の発生（例えば診断用）またはウイルスの発病作用の軽重（例えば予後の指標として）と相関し得るか否かを決定するために有用である。Ｄ．ワクチン及び治療用組成物本発明のペプチドは、ＨＣＶ感染予防ワクチン用またはＨＣＶ感染個体の治療目的用に有用であると考えられる。例えば、ペプチドを単独で使用してもよく、または、キャリアタンパク質に結合した接合ペプチドを含む複合体に対する免疫応答を誘発する物質にペプチドを接合した免疫原性結合体を調製するために当業界で公知の方法で使用してもよい。例えば、M.F.Good,Science 235:1059-1062(1 987);Palker,T.J.,J.Imm.142:3612-3619(1989)を参照するとよい。免疫応答を誘発するためにペプチドに接合され得る物質は、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドのような、（免疫感作したヒトの）身体によって共通に認識され免疫系によって除去されるトキソイドを含む。または、ペプチドをコードする遺伝子配列を組換え遺伝子に組み込んでベクターの一部として発現させてもよい。ベクターの例としては、Chakrabarti,S.ら,Nature,320:535-537(1986)の方法によって作製されたワクシニアウイルスのような組換えウイルスがある。本発明のペプチドはまた、別のＴ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープのような付加的エピトープを含むもっと大きいペプチドに組み込まれてもよい。従って、ＨＣＶの多数エピトープまたはＨＣＶと別のウイルスとの多数エピトープに対して細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発する多価ワクチンの一部としてペプチドを使用してもよい。更に、抗体応答と細胞障害性Ｔ細胞応答との双方を誘発するように、多価ワクチンのペプチドがＨＣＶまたは別のウイルスのヘルパーＴ細胞エピトープ及びＢ細胞エピトープを含んでいてもよい。例えば、ＣＴＬ応答をＴ細胞で支援するために、CeaseK.B.,ら,Proc.Nat1.Aca d.Sci.USA 84:4249-4253(1987)に記載されているようなＨＩＶ由来のヘルパーＴ細胞エピトープを結合してもよい。Berzofsky,J.A.,ら,J.Clin.Inves t.88:876-884(1991);抗ウイルス性細胞障害性Ｔリンパ球を生成するペプチドに関してはHart,M.K.,ら,Proc Nat1 Acad Sci USA88:9448-9452(1991);抗体応答を誘発するペプチドに関してはHart M.K.,ら,J.Immunol.145:2677-2685(1990)を参照するとよい。医薬用の上記ペプチド及び結合体と許容された医薬担体とを含む組成物の調製方法は、医薬組成物の製剤業者に明らかであろう。ワクチンの理論的根拠ＨＣＶは恐らくは、黄熱病ウイルスのような典型的なフラビウイルスとウシウイルス性下痢ウイルスのような動物のペスチウイルスとの双方を含むフラビウイルス科の一員であろう（１１）。典型的なフラビウイルスは、節足動物ベクターを有し、急性疾患だけを発症させる。他方、ペスチウイルスは既知の節足動物ベクターは無く、慢性感染症と急性疾患との双方を発症させる。ＨＣＶは急性の自己限定性感染症であるが、ペスチウイルスと同様に慢性感染症並びに慢性活動性肝炎、肝硬変及び恐らくは肝細胞癌などの肝臓病を発症させる。慢性肝臓病の慢性化及び病理発生のメカニズムは解明されていない。慢性ウイルス感染が直接に細胞変性を生じさせるとは考え難い。その場合にはいっそう重大な肝臓破壊が生じるはずである。従って、Ｂ型肝炎感染症の場合のように、免疫メカニズムが考えられるわけである。多くのフラビウイルスに対する中和抗体は、エンベロープ糖タンパク質中のエピトープに対する抗体である。このような抗体はＨＣＶ感染個体によって普通には生成されないか、または、これらを検出し得る利用可能なアッセイがまだ存在していない。ＨＣＶの２つの推定エンベロープ糖タンパク質の配列解析の結果から、かなりの菌株可変性が判明し（２３，２７，６７）、このことは、広い反応性を有する中和抗体を誘発する抗原を産生させる研究を更に錯綜させることになる。より特定的には、文献（２７）に概説されているように、ＨＣＶ配列多様性に関する最近の報告に基づいて、複数の単離物を比較し得る（９，２３，３７，４４，６７）。Ｅ１及びＥ２／ＮＳＩ遺伝子によってコードされている推定エンベロープ糖タンパク質の超可変性及びＮＳ２のより大きい不均質性と対照的に、ＨＣＶのＣ、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５領域はより大きい配列保存性を示すことは注目に値する。このようなＨＣＶエンベロープタンパク質の超可変性は、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質Ｖ３ループの場合に示唆されたように、この領域が防御性Ｂ細胞またはＴ細胞エピトープの変異に対して選択的圧力下にあるらしいことを示唆する。Ｖ３ループというのはヒト及びマウスの双方においてＣＴＬに対する主要中和ドメイン及び免疫優性決定基である（１０，２１，４６，５３，５７）。超可変性は、このウイルスが速やかな突然変異によって免疫系から逃れる能力があることを示唆する。報告されたすべてのＨＣＶ配列の比較によって大まかに再分割された単離物のグループ内で、ＮＳ５は９５％−１００％の相同性を示す（２７）。可変性はまた、種々のＨＣＶ単離物による多重感染の問題にも関連する。劇症肝炎に由来のＨＢＶゲノムに関する最も新しい配列解析の多くは、天然発生のウイルス突然変異が感染宿主のより重症の肝臓障害の原因となり得ることを示唆している（３４，４５）。従って、抗体による変異体の交差中和及びＴ細胞による変異体の交差認識は、免疫系から逃れる突然変異体の増加を防止するワクチンの開発において重要な問題である。これらの理由から、本発明者らは、ＨＣＶのＴ細胞エピトープ、特に比較的保存されたＮＳ５タンパク質によって示されるＴ細胞エピトープが病理発生または感染防御において重要であるか否かを決定できるような研究に着手した。従来の研究では、ＣＤ８⁺ＣＴＬが慢性ＮＡＮＢ型肝炎患者の肝細胞をＭＨＣ非制限的に認識することが証明されていた（２８）。ウイルス感染細胞に対するＣＴＬは多くの場合、感染細胞上で発現したウイルスのヌクレオタンパク質を認識して細胞を溶解させると考えられていた（５２）。例えば、Ｂ型肝炎感染の場合には、ＣＴＬは慢性Ｂ型肝炎の病理発生の原因であり、肝炎Ｂ型ウイルスに感染した肝細胞を感染細胞中で発現されたウイルス抗原を認識することによって溶解させると考えられていた（３９，４２）。クラスＩ及びクラスIIのＭＨＣ分子は、外来抗原のプロセシング後にタンパク質のポリペプチドフラグメントをＴ細胞に認識させ得る（４，５１，５５，６１，７０）。従って、プロセシング後のタンパク質のフラグメント上に存在するエピトープと同様のＴ細胞エピトープを示すペプチドを開発しなければならない。かかるエピトープを含む合成ペプチドワクチンは、全タンパク質または弱毒もしくは致死ウイルスよりも害の少ない免疫応答を誘発するであろう（５）。ヒト免疫系のモデルとしてマウスを用いた研究に基づく本文中に記載の実験結果は、ＣＴＬがクラスＩＭＨＣ分子と協調してウイルス感染細胞上で、ＨＣＶＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の産物、非構造領域を認識するらしいことを示している。マウスの細胞はＨＣＶ感染できないので、この推測をＨＣＶ感染マウスで直接試験することはできない。しかしながら、この結果は、本発明のペプチドが哺乳動物においてＨＣＶＮＳ５感染細胞に対する細胞障害性Ｔ細胞応答をin vivo誘発するであろうと推測させる妥当な根拠になり得る。従って、ペプチドは、ＨＣＶＮＳ５を発現する同系標的細胞及びペプチドＰ１７（ＨＣＶＮＳ５内部の残基２４２２−２４３７）でパルスした標的細胞を致死させる能力を有するマウスのＣＴＬ系を産生した。ペプチドは、Ｈ−２^dマウスのＣＴＬ応答リンパ球を誘発したが、Ｈ−２^bマウスのは誘発しなかった。これは、Ｈ-２^dがＰ１７に対する免疫応答（Ｉｒ）遺伝子レスポンダハプロタイプであるがＨ-２^bはレスポンダでないことを示す。更に、Ｄ^dとＬ^dとの間で種々にエキソンシャッフルした８つのＬ細胞（Ｈ-２^k）トランスフェクタントの応答によって示されるように、ＨＣＶＮＳ５のＰ１７に対する応答は、Ｄ^dクラスＩ分子の α１及びα２ドメインの双方に依存する。ＨＩＶ-１ｇｐ１６０に由来のペプチドＰ１８（５８）及びＨＰ５３（５６）の有効な提示に関しても同様の結果が得られた。ワクチン開発の場合に、いずれも同じＤ^dクラスＩのＭＨＣ分子によって提示されるＰ１７とＨＩＶ-１ｇｐ１６０のペプチドＰ１８及びＨＰ５３とが、各々を高度に両親媒性の短いα螺旋として折り畳んだときに両親媒性疎水性プロフィルに類似性を有する以外は、配列の顕著な類似性を共有しないことに注目すべきである。Ｄ^d結合の明白な動機を定義するためには不十分な相同性が存在しているが、各ペプチドのＤ^dに関与する残基の解析（５８）は、Ｄ^d特異性に関する構造的要件の解明の助けとなるであろう。最大溶解を達成すべく二次的にＣＴＬをin vitro剌激するためまたは標的を感作するために必要なペプチド濃度はＰ１７に関しては極めて低い（０．１-１μ Ｍ）値が観察された。この結果は、Ｐ１７が比較的高い親和性でＨ-２^d中のクラスＩＭＨＣ分子に結合することを示し、このことは、実用化の見地から、例えば投与量あたりの経費を最小に削減できるのでペプチド免疫原の重要な特徴である。また、Ｐ１７はＣＴＬのin v ivo剌激または使用中の活性に影響を与えるような毒性を全く示さなかった。Ｄ^d分子によるペプチド提示及びＣＴＬ認識に対して天然発生ウイルス突然変異が与える影響を明らかにするために、この比較的保存されたエピトープ（２６，２９，６０）のＨＣＶ変異体（米国及び日本）の異なる３つの配列が入手可能であったため、各々がChiron単離物（２６）のＰ１７配列に比べて１残基または２残基の違いを有する本発明の２つの変異ペプチドを合成することができたのである。２４２４位の１つのアミノ酸置換（Ｔ→Ｓ）及び２４３１位の１つのアミノ酸置換（Ｖ→Ｉ）はＢＡＬＢ／ｃマウス中のペプチドＰ１７のＣＴＬ認識を低下させなかった。従って、米国及び日本で得られた４つのクローン化ＨＣＶ単離物全部において異なっているこれらの点変異は、Ｄ^dクラスＩＭＨＣ分子とペプチドとの相互作用にもＴ細胞受容体とペプチドとの相互作用にも全く影響しないと考えられる。ヒトＣＴＬがこの部位に対して同様の交差反応性を示すならば、このペプチドは、現実に見出される保存性置換が少ないにもかかわらずワクチン開発用ＣＴＬエピトープとして有用であろう。このようなワクチンの予想効果に関しては、前以て感染していた細胞中のウイルスの増殖をＣＴＬが阻止し得ることが多数の論文において証明されている（１７，２８，３９，４２，４７，４８，６３，６６）。同様に、ＨＣＶ特異的ＣＴＬを誘発するワクチンはＨＣＶ防御性であろうと考えられている。本発明では、ＨＣＶＮＳ５領域に由来のＰ１７がクラスＩＭＨＣ分子によってＣＤ８⁺ＣＤ４^-ＣＴＬに提示された。ペプチドＰ１７の高い保存性及び交差反応性は、このペプチドがヒトＣＴＬによって見出されることができれば、広範囲に有効なＨＣＶ用ワクチンの一成分として役割を果たし得ることを示唆する。ＨＩＶ-１タンパク質ｇｐ１６０及び逆転写酵素に関するこれまでの研究において、マウスＣＴＬによって見出されるエピトープはヒトＣＴＬによっても見出された（１０，２４，５７）。慢性感染した一匹のチンパンジー中でＰ１７刺激に応答してＴ細胞増殖が観察されたが細胞障害性は観察されなかった。この霊長類はＨＣＶによって発症する肝炎の唯一の確認された動物モデルである。Ｐ１７部位が多様なヒトクラスＩＭＨＣ対立遺伝子によって提示されるか否か、及びＰ１７がクラスII ＭＨＣ分子によってＣＤ４⁺ ＣＴＬ細胞にも提示されるか否かは、当業界で公知の方法に従って判断されるであろう。例えば、Clerici,M.J.,Imm 146:2214-2219(1991);Clericiら，Nature33 9:383-385(1989)を参照するとよい。この情報は、ワクチン開発のためだけでなく、ＭＨＣ分子結合に対するウイルスペプチドの適応性を分析するためにも有用であろう。ＭＨＣ及びＴ細胞受容体に結合するためのペプチド中の必須アミノ酸の同定によって、免疫を逃れるＨＣＶ突然変異の分子基盤及びＨＣＶ感染の慢性性に関する新しい情報が得られるであろう。以下の実施例は例示目的でのみ与えられており、本発明を少しも限定するものではない。実施例１Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５タンパク質のＴ細胞エピトープの候補を含むペプチドの設計及び合成ペプチド設計本文中で、以後「ChironのＨＣＶ１配列」と呼ぶChironCorporationの研究者によって公表されたＨＣＶの単離物のＮＳ５領域の配列に基づいて（２６）、一連の２８個のペプチド群を合成した。これらのペプチドはいくつかのオーバーラップペプチドを含み、ＮＳ５様領域によってコードされたＨＣＶの推定ＲＮＡポリメラーゼ配列の大部分を包含する。両親媒性に基づいて（１２，１３，１５，３５）、ペプチド配列を潜在的Ｔ細胞エピトープとして選択した。その後に、組換えワクシニアウイルスを構築するために使用したＦＤＡ中で単離されたＨＣＶのＮＳ５の全領域を配列決定すると、２８ペプチドのうちの１３ペプチドが公表されたChironのＨＣＶ１配列に比べて３残基以下の突然変異を有していることが判明した（図１Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯＳ．８，９，１０，１４，１５，２０，２１，２３，２６，２７，２８及び３１）。ペプチド合成及び精製ＨＣＶＮＳ５ペプチドを、文献（２５）に記載されているようなポリプロピレンメッシュ「ティーバッグ」中で同時に多数のペプチドを合成する固相ペプチド合成法によって調製した。Ｃ１８Ｓｅｐ-Ｐａｋカラム（Waters Associates ,Milford,MA）を用いた逆相クロマトグラフィーによってペプチドを脱塩し、ＨＰＬＣで分析した。いくつかのペプチドはｔ-Ｂｏｃ技法を用いる全自動ペプチドシンセサイザー（430A型；Applied Biosystems,Inc., Foster City,CA）によって調製し、ＨＰＬＣによって精製した。ペプチドＨＩＶＰ１８はPeninsula Labs(Belmont,CA)によってＧＭＰ条件下に調製した。実施例２Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５タンパク質を発現する細胞に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発するペプチドの同定概論Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５タンパク質の予想されるＴ細胞エピトープを同定するために、ＢＡＬＢ／ｃ及びＢＡＬＢ．Ｂマウス中で実施例１のペプチドのＨＣＶＮＳ５領域に特異的なＣＴＬを産生する能力を試験した。４週前にＮＳ５発現性組換えワクシニアウイルス（ｖＨＣＶ）（１０⁷ＰＦＵ静注）で免疫感作したマウスの牌細胞をＩＬ-２の存在下に４μＭのペプチドでin vitro刺激した（培地はＣｏｎＡで刺激した培養ラットリンパ球の１０％上清を含む）。ｖＨＣＶで免疫感作したＢＡＬＢ／ｃマウスは、ペプチドＰ１７に対してはＣＴＬ応答を発現したが、他のペプチドのいずれに対しても免疫応答を発現しなかった（図１Ｂ）。ワクシニアにクローニングされたＨＣＶ領域に特異的な抗体は入手可能でないため、Ｐ１７のカルボキシ末端側のタンパク質配列の発現を直接証明することはできない。これらの配列が発現しないという証拠は存在しないが、Ｐ１７のカルボキシ末端配列の発現の欠如が、Ｐ１７に準じるペプチドに対する応答の欠如の原因である可能性も残っている。また、公表された配列とワクシニアにクローニングされたＨＣＶ単離物の配列との間に１１ペプチドの違いがあることが陰性応答の原因である可能性もある。陰性応答はこのように様々の理由から生じ得るので、ＮＳ５タンパク質の特定部分がＮＳ５タンパク質に対するＣＴＬ応答を誘発し得るＴ細胞エピトープを含むと決定するためには陽性応答のみが有意である。ＢＡＬＢ．Ｂ（Ｈ-２^b）マウスは、試験したいかなるペプチドにも応答を全く示さなかった。しかしながら、組換えワクシニアウイルスによって免疫感作したマウスの脾細胞を同じ組換えワクシニウイルスを使用して刺激すると、ワクシニア感染標的を使用したときの挿入遺伝子産物に対する応答を圧倒するようなワクシニアウイルス特異的応答が活性化される。従って、全ＮＳ５タンパク質を発現するｖＨＣＶに感染したＢＡＬＢ．Ｂ細胞は、ＢＡＬＢ．Ｂマウスが本発明のペプチドで試験しなかったＨＣＶの別のエピトープに応答するか否かを判断するために使用することはできない。マウスＢＡＬＢ／ｃマウスは、Charles River Laboratoriesから購入し、ＢＡＬＢ．Ｂマウスは、Dr.F.Lilly(Albert Einstein College of Medicine,New York）の好意によって提供された種畜を当方のコロニーで飼育した。８週齢のマウスを使用した。ＮＳ５タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスフラビノウイルスとの類似性に基づくＮＳ５領域の大部分を示すアミノ酸１９５９−２８７２をコードするＨＣＶゲノムの領域を、Chakrabartiらによって記載された方法（７）でＰ７．５プロモーター下にワクシニアウイルスにクローニングした。得られた組換えワクシニアウイルスをｖＨＣＶ＃３と命名した。ＨＣＶのＨ株（ＨＣＶ／ＨのＦＤＡ単離物（１９））に急性感染したチンパンジーの肝生検からＨＣＶウイルスＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを逆転写し、文献（９）に記載されているような特異的ＨＣＶプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。５’プライマーは、その５’末端にＡＴＧ配列を含んでいた。このＰＣＲ産物をｐＳＣｌｌｓｓトランスファーベクターのＳｔｕＩ部位に結合し、次いで相同組換えによってワクシニアウイルスに挿入した。ワクシニアをＢＳ-Ｃ-１細胞中で増殖させ、これを用いて、ＨＣＶＮＳ５特異的ＣＴＬを生成させるべくマウスを免疫感作した。 Dr.Bernard Moss,NIAID,NIHから得られたｖＳＣ８（大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含む組換えワクシニアウイルス）及びｖＳＣ２５（ＨＩＶ-１ IIIＢｇｐ１６０エンベロープ糖タンパク質を発現しＨＩＶの他の構造タンパク質または調節タンパク質を発現しない組換えワクシニアウイルス）は文献（７）に記載されており、マウスを免疫感作するための対照ワクシニアとして使用した。ＣＴＬ生成１０⁷ＰＦＵの組換えワクシニアウイルスの静注によってマウスを免疫感作した。４-６週後に、免疫脾細胞（２４ウエルの培養プレートで完全Ｔ細胞培地中に５×１０⁶／ｍ１（完全Ｔ細胞培地ＣＴＭは、１０％のＦＣＳと２ｍＭのＬ-グルタミンと１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンと５×１０^-5Ｍの２-ＭＥとを含有するＲＰＭＩ１６４０培地とＥＨＡＡ培地との１：１混合物））を、ペプチドと１０％ＣｏｎＡ上清とを含有する培地（ラットＴ細胞モノクローン;Collaborative Research,Inc.,Bedford,MA）によって６日間in vitro再刺激した。リンパ球の再刺激には、免疫感作に使用した組換えワクシニアウイルスでなくペプチドを用いた。その理由は、別の抗原に関する経験から、組換えワクシニアで免疫感作した脾細胞をワクシニアウイルスによって再刺激した場合、ワクシニアに対する応答が優勢になり、挿入した組換え遺伝子に由来のペプチドに対する微弱なＣＴＬ応答の検出が難しいことが分かっていたからである。しかしながら、（以下の）表１に示すように、Ｐ１７に関してはこの問題は生じなかった。個々のエフェクター集団を刺激するために２８個のペプチド全部を使用する実験を行うことは論理的に実行可能ではない。従って、個別のリンパ球集団を刺激するために、各４μＭの３ペプチドの混合物を使用した。得られたエフェクター細胞集団の各々を、対応する混合物中の３ペプチドについて個々に試験した。しかしながら、ＭＨＣに対する結合に関して互いに競合する部位（２０）の見落としを防止するために、Ｔ細胞エピトープペプチドの全候補の混合物で刺激することはしなかった。実験によれば、所与のクラスＩ分子に対するペプチド結合の頻度が十分に低く、４μＭという低濃度で競合し得るペプチドの検出頻度が十分に低いので、４μ Ｍの３ペプチドの混合物中の２つのペプチド間の競合のために陽性応答が見落とされることは生じ難い。しかしながら、このような競合がいくつかのペプチドの陰性結果の多くの理由の１つである可能性をはっきりと除外することはできない。０．５-１μＭのペプチドと、１０μＭのペプチドで４時間パルスし次いで照射した同系脾細胞（２．５×１０⁶細胞／ｍｌ）とを併用してラットＩＬ-２含有培地中の免疫細胞を反復剌激すると長期ＣＴＬ系が生成した。ＣＴＬアッセイ in vitro二次ＣＴＬまたはＣＴＬ系の細胞溶解活性を、⁵¹Ｃｒ標識した標的に関する６時間アッセイを用いて文献（５７，６２）に記載されている方法で測定した。ＣＴＬのペプチド特異性を試験するために、エフェクターと⁵¹Ｃｒ標識した標的とを種々の濃度のペプチドと混合するか、または、ペプチドパルスした標的とエフェクターとを共生培養した。特異的⁵¹Ｃｒの放出パーセントを、１００ ×〔（実験放出−自発放出）／（最大放出−自発放出）〕によって算出した。最大放出は、５％トリトン-Ｘ１００の添加によって溶解した細胞の上清から決定した。自発放出は、エフェクター細胞非添加でインキュベートした標的細胞から決定した。１８Ｎｅｏ（Ｈ-２^d；クラスＩＭＨＣ⁺，クラスIIＭＨＣ^-ネオマイシン耐性遺伝子トランスフェクト３Ｔ３線維芽細胞（５７））と、Ｌ細胞（Ｌ２８；Ｈ-２^k）と、ＥＬ４胸腺腫細胞（Ｈ-２^b）とを標的として使用した。実施例３Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５タンパク質を発現する細胞に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発するＴ細胞エピトープの特異性ペプチド１７を提示するＭＨＣ分子のクラスの同定ＣＴＬを検出するためにクラスII陰性線維芽細胞を標的として使用し、ＭＨＣ結合対照下に溶解を制限したので、ＮＳ５タンパク質を発現するワクシニアウイルスによって免疫感作したＨ-２^dマウスから採取したリンパ球の場合、Ｐ１７がクラスＩＭＨＣ分子によってＣＴＬに提示されたと推測できる。ＢＡＬＢ．Ｂ（Ｈ-２^d）マウスが試験したいかなるペプチドにも応答しなかったことは、Ｈ- ２^bクラスＩＭＨＣ分子がこのペプチドを提示できないことを示唆する。ＮＳ５Ｔ細胞エピトープの天然配列変異体の交差反応性ワクシニア組換えｖＨＣＶを作製するために使用したＨＣＶのＦＤＡ単離物（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）はChironのＨＣＶＩ配列（２６）に由来のＰ１７配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に比べて１残基の違いを有しており、個別の２つの日本の単離物（２９，６０）中のこの部位に保存された日本配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）に比べて別の１残基の違いを有している（図１ＡＳＥＱＩＤＮＯＳ．１-３）。ＦＤＡ配列を発現するｖＨＣＶによってマウスを免疫感作したが、 Chiron配列に従って作製したＰ１７ペプチドによってＣＴＬを再剌激しかつこのペプチドでパルスした標的に関して試験したので、ＣＴＬはＨＣＶのこれらの２つの変異体と交差反応すると予想された。この交差反応性を直接証明するために、２つのＰ１７ペプチド変異体、即ち、２４２５位及び／または２４３１位にアミノ酸置換を有するＦＤＡに対応するＰ１７ペプチド変異体（Ｐ１７ＦＤＡＳＥＱＩＤＮＯ：２）と日本単離物に対応するＰ１７ペプチド変異体（Ｐ１７ＪＰＮＳＥＱＩＤＮＯ：３）とを調製した（図１ＡＳＥＱＩＤＮＯＳ．２及び３）。１残基または２残基の違いを有するこのような変異ペプチドに対する応答は、Ｈ-２^dクラスＩＭＨＣ分子によるペプチド提示及びＮＳ５特異的細胞のＴ細胞受容体による認識に対する天然発生ウイルス突然変異の影響を明らかにするであろう。ＮＳ５に対するＣＴＬの特異性は、ＣＴＬアッセイ中に、in vivoのリンパ球初回抗原剌激、in vitroの再剌激及び標的細胞上での発現によって証明された（以下の表１）。ＮＳ５遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルス（ｖＨＣＶ）だけがＰ１７またはＰ１７変異体に特異的なＣＴＬを増殖するようにマウスを活性化したが、対照ワクシニアウイルス（ｖＳＣ８、ｖＳＣ２５）は活性化しなかった（以下の表１）。より詳細には、挿入したウイルス遺伝子の産物に特異的なＣＴＬを活性化し剌激する組換えワクシニアウイルスの能力を使用して、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ-２^d）マウス中でＨＣＶＮＳ５に特異的なＣＴＬを生成させた。非免疫及び免疫脾細胞を１０μＭのＰ１７またはＰ１７変異体（または表１に示す濃度；０．１μＭまたは１μＭのＰ１７）、０．１μＭのＰ１８IIIＢまたはワクシニア（ｖＨＣＶ、ｖＳＣ８またはｖＳＣ２５）で再剌激し、ワクシニアウイルスに感染させた１８Ｎｅｏ、１μＭのＰ１８IIIＢでパルスした１８Ｎｅｏ（ＨＩＶ-１ｇｐ１６０ IIIＢ単離物の免疫優性ＣＴＬ部位３１５-３２９）、非パルスの１８Ｎｅｏに対して、Ｐ１７、Ｐ１７変異体ペプチド（１０μＭ）の存在下またはペプチド非存在下に、Ｅ：Ｔ比１００：１で試験した。ペプチド非存在下の溶解は＜４％であった。標的に対するペプチドの毒性は全く観察されなかった。自発放出は最大放出の２０％未満であった。表１の略号は以下を示す：ｖＨＣＶ：ＨＣＶのＮＳ５を発現する組換えワクシニアウイルス；ｖＳＣ８及びｖＳＣ２５：対照ワクシニアウイルス及びＨＩＶ-１ｇｐ１６０を夫々発現する組換えワクシニアウイルス；１８Ｎｅｏ：ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞Ｈ-２^d。免疫感作した脾細胞の刺激に使用したペプチド濃度の滴定によって、Ｐ１７に特異的な溶解が０．１μＭの低濃度のペプチドで誘発されることが判明した（表１）。Ｈ-２適合ペプチドでパルスした標的細胞に対して最高レベルの溶解を誘発するためには、Ｐ１７で免疫脾細胞を刺激した場合には約１-１０μＭのペプチドが必要であった。Ｐ１７、Ｐ１７ＦＤＡ及びＰ１７ＪＰＮはＣＴＬの剌激に関しても標的の感作に関してもほぼ同等であった（表１）。独立の２つの実験で同様の結果が得られた。即ち、これらの変異体の間では完全な交差反応性が観察された。ｖＨＣＶで免疫感作したマウスの脾細胞を、ペプチドでパルスし照射した同系脾細胞及びＩＬ-２（ＣｏｎＡ上清）（図２）で反復刺激することによってＰ１７及びＰ１７ＦＤＡに特異的な長期ＣＴＬ系を樹立した。Ｐ１７またはＰ１７ＦＤＡ（２４２５位、Ｓ→Ｔ）によって剌激したＣＴＬ系は、各ペプチドによって高度に特異的に標的を溶解した。滴定試験では、ＣＴＬ系による溶解を得るために同様のレベル（０．０１〜１０μＭ；図２）のＰ１７及びＰ１７変異体で標的細胞を感作した。０．１μＭ以上の濃度の各ペプチドの存在下に溶解の程度がプラトーに到達した。Ｐ１７及びＰ１７ＦＤＡに特異的な２つの異なる系を用いた場合、同様のペプチド濃度ではＰ１７によって達成され得る最大溶解は別の２つのＰ１７変異体によって達成され得る最大溶解と同等であった。従って、これらの突然変異残基は応答の量または濃度依存性には影響を与えず、ペプチドは完全に交差反応性であった。Ｐ１７ペプチドの３つの変異体のいずれかによってinvitro剌激したＣＴＬは３つのＰ１７ペプチド変異体全部の存在下に同様に十分に標的を溶解させた（表１）。従って、米国及び日本で単離されたＨＣＶの４つのクローンのＰ１７配列中で異なっている保存性点変異はＨ-２^dクラスＩＭＨＣ分子とのペプチド交差反応にもＴ細胞受容体による認識にも影響を与えていなかった。ペプチドで誘発されたＣＴＬによるプロセスされたＮＳ５タンパク質の認識ペプチドによるin vitro剌激の反復によって生成されたＣＴＬ系は、ペプチドだけでなく、内在的に合成されたＮＳ５タンパク質のプロセスシング産物を有する標的細胞を認識することが判明した。即ち、Ｈ-２^d（ＢＡＬＢ／ｃ）によって制限されたＣＴＬ系は、ＮＳ５を内在的に発現するｖＨＣＶ感染した同系標的細胞（１８Ｎｅｏ細胞、ネオマイシン耐性遺伝子でトランスフェクトされたＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞）及びＰ１７またはＰ１７ＦＤＡによってパルスされた１８Ｎｅｏ細胞を壊死させることはできたが、非パルスの対照標的またはＰ１８IIIＢでパルスした１８Ｎｅｏを壊死させることはできなかった（図３）。従って、本発明のペプチドによって生成されたＣＴＬ応答は、外因性ペプチドだけでなく内在的に合成されたＮＳ５のプロセスド産物を有する標的細胞に特異的である。ＣＴＬ応答の抗体阻害によるＴ細胞型の同定Ｐ１７に特異的なＣＴＬ細胞系を抗ＣＤ８モノクローナル抗体によって処理すると、標的細胞に対する細胞障害活性が減少または阻害されたが、抗ＣＤ４抗体によって処理しても同様の結果は生じなかった（図４）。抗Ｌ３Ｔ４抗体（抗ＣＤ４、ＩｇＧ２ｂ（６８））または抗Ｌｙｔ２．２抗体（抗ＣＤ８（５４））を夫々含むハイブリドーマＧＫ１．５または２．４３の培養上清をＣＴＬアッセイの９６ウエルプレートに指定濃度で添加した。これらの結果は、Ｐ１７を認識するエフェクター細胞が定型的なＣＤ８⁺ＣＤ４^-（Ｌｙｔ２⁺Ｌ３Ｔ４^-）ＣＴＬであることを示す。ＢＡＬＢ／ｃ中のＨ−２^d 制限されたペプチド特異的ＣＴＬ系に対しては、クラスＩＭＨＣ遺伝子産物を発現するがクラスII ＭＨＣ遺伝子産物を発現しない１８Ｎｅｏ細胞を標的として使用した。従って、これらのＨ−２^d制限ＣＴＬ系は、Ｌｙｔ２⁺ＣＤ８⁺エフェクターＴ細胞で予想されたようにクラスＩＭＨＣ制限されていると推測される。Ｐ１７ＦＤＡ特異的系も同様の結果を示した。エキソンシャッフルした野生型クラスＩトランスフェクタントを用いたＭＨＣ分子の相互作用ドメインの同定Ｋ^d、Ｄ^dまたはＬ^d分子を発現するトランスフェクタントを使用し、Ｈ−２^d関係でＰ１７の提示に特異的に必要なＭＨＣ分子を決定した。Ｄ^d、Ｌ^dまたは両者間のエキソンシャッフルを含むマウスＬ細胞トランスフェクタントは従来文献に記載されており（１８，３６，３８，４０）、Dr.DavidMargulies,NIAIDから得られた。Ｋ^dを発現するトランスフェクタントはAbastadoらによって開発され（１）、Dr.Keiko Ozato(NICHD)から得られた。ここで報告した機能性研究を行う前にそれらの発現された表現型を確認するために、すべてのトランスフェクタント細胞系を抗Ｈ-２Ｄ^d、抗Ｈ-２Ｋ^d及び抗Ｈ-２Ｌ^dｍＡｂｓの適当なパネルを用いたＦＡＣＳ分析によって試験した。標的を指定ペプチドでパルスし同時に⁵¹Ｃｒで標識した。Ｔ３７．２．１（Ｄ^d のα１α２）及びＴ４．８．３（Ｄ^d）は３つのＨ-２^dのクラスＩＭＨＣ分子全部を発現する陽性対照細胞（１８ｎｅｏＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞）とほぼ同様にＰ１７を提示することが知見された（図５）。Ｋ^d及びＬ^d及びその他のＤ^d／Ｌ^dエキソンシャッフルしたクラスＩＭＨＣ分子はいずれもＣＴＬにＰ１７を提示しなかった。従って、本発明のペプチドを提示するためには、α１及びα２の双方のドメインが必要であり、双方の存在で十分であった。ＢＡＬＢ／ｃ中のＰ１７ＦＤＡを認識するＣＴＬに関しても同様の制限が知見された。実施例４Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５タンパク質に由来のペプチドを哺乳動物に投与することによって行うＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５タンパク質に対する免疫応答の誘発ワクチンの調製及び免疫感作手順ＣＤ８⁺ＣＴＬを誘発するための合成ペプチドによるペプチド免疫感作は、Aic hele,P.,ら,J.Exp.Med.171:1815-1820(1990)またはKast,W.K.,ら,Proc Natl Aca d Sci USA88:2283-2287(1991)の方法に従って完全または不完全フロインドアジュバント中の５０-１００μｇのペプチドを用いて行ってもよく、あるいは、Har ty,J.T.,ら,J.Exp.Med.175:1531-1538(1992)の方法によって脾細胞に対して行ってもよい。これらの免疫感作手順のいずれかを用いて誘発されたＣＴＬによってウイルスまたは細菌感染に対する防御が得られる。本発明の物質組成物及び方法に対する種々の修正及び変更が可能であることは当業者に明らかであろう。従って、本発明は、請求の範囲及びその等価の範囲内に含まれている限りその修正及び変更を包含すると理解されたい。発明の背景に関する記載及び本明細書の開示を完全なものにするために、明細書中で言及した発表論文、特許及び特許出願の各々は本明細書で参照したことによってその記載内容全体が本発明に含まれるものとする。以下の参考文献に関しては、以下に示す参照番号を括弧内に挿入した場所でこれらの文献を本明細書中で引用したと理解されたい。本明細書中で引用した参考文献を以下に記載する。配列表（２）SEQ ID NO:1に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:16アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列:SEQ ID NO:1 （２）SEQ ID NO:2に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：16アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：SEQ ID NO:2 （２）SEQ ID NO:3に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：16アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：SEQ ID NO:3 （２）SEQ ID NO:4に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：20アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：SEQ ID NO:4 （２）SEQ ID NO:5に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：20アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：SEQ ID NO:5 （２）SEQ ID NO:6に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：20アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：SEQ ID NO:6 （２）SEQ ID 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/18 8318−4ＨＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2ＪＫ 8310−2Ｊ 33/569 Ｌ 8310−2Ｊ 33/576 Ｚ 8310−2Ｊ (72)発明者白井睦訓香川県木田郡三木町池戸1239−２医大池戸宿舎Ａ202 (72)発明者アカツカ，トシタカアメリカ合衆国、メリーランド・20815、チエビー・チエイス、サウス・パーク・アベニユー・4450、アパートメント・1718 (72)発明者フエインストーン，ステイーブン・エムアメリカ合衆国、ワシントン・デイー・シー・20008、ノース・ウエスト、キヤセドラル・アベニユー・3021

Claims

【特許請求の範囲】１．ＭＳＹＳＷＴＧＡＬＶＶＰＣＡＡＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、ＭＳＹＴＷＴＧＡＬＶＴＰＣＡＡＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）及びＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰＣＡＡＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）から成るグループから選択された配列の８個以上の連続残基から成る第一セグメントを含むペプチドであって、前記セグメントがＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５タンパク質を発現する細胞に対して哺乳動物のリンパ球中に細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発するＴ細胞エピトープであり、前記ペプチドの長さが８残基以上で５０残基未満であることを特徴とするペプチド。２．更に、別のＴ細胞エピトープである第二セグメントを含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチド。３．更に、Ｂ細胞エピトープである第二セグメントを含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチド。４．更に、前記ペプチドの末端にリンカーを含み、ラベル、固体マトリックス及び担体から成るグループから選択された物質が前記リンカーに結合されていることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。５．更に、免疫応答を誘発する物質が前記ペプチドに結合していることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。６．Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５タンパク質のＴ細胞エピトープに応答する細胞障害性Ｔ細胞を哺乳動物のリンパ球中で検出する方法であって、（ａ）前記細胞障害性Ｔ細胞の試験対象リンパ球にＭＨＣ適合性の標的細胞を請求項１のペプチドと接触させる段階と、（ｂ）前記細胞障害性Ｔ細胞の試験対象リンパ球を請求項１のペプチドと接触させる段階と、（ｃ）前記リンパ球が前記標的細胞に細胞障害効果を作用させたか否かを判定し、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５タンパク質のＴ細胞エピトープを認識する前記リンパ球の存在の指標とする段階とを含むことを特徴とする方法。７．Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５タンパク質に対する免疫応答を哺乳動物中で誘発する方法であって、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５タンパク質を発現する細胞に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発すべく有効な量の請求項１に記載のペプチドを前記哺乳動物に投与することを特徴とする方法。