DE69310734T2

DE69310734T2 - Peptid für die stimulierung von für hepatitis c virus spesifischen cytotoischen t lymphozyten

Info

Publication number: DE69310734T2
Application number: DE69310734T
Authority: DE
Inventors: Toshitaka S Park Aven Akatsuka; Jay Berzofsky; Stephen Feinstone; Mutsunori Idai Ikenobe Shirai
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1992-06-10
Filing date: 1993-06-10
Publication date: 1998-01-15
Anticipated expiration: 2013-06-11
Also published as: DE69310734D1; DK0644894T3; EP0644894B1; US5980899A; GR3024462T3; WO1993025575A1; ATE153031T1; CA2135278C; AU4530093A; ES2104156T3; CA2135278A1; JP3510249B2; EP0644894A1; JPH08501282A; AU669193B2

Description

GRUNDLAGE DER ERFINDUNG

Das Hepatitis C-Virus (HCV) wurde vor kurzem als Verursacher parenteral übertragener Non-A-Non-B-Hepatitis (NANB-Hepatitis) erkannt. Das RNA-Genom des Virus wurde aus dem Plasma eines experimentell infizierten Schimpansen molekular geklont (siehe das Dokument Nr. 8 in der Liste der am Ende der Beschreibung aufgezählten Dokumente). Die Analyse der Genomsequenz zeigte, daß es sich um eine einfache, positive RNA von ungefähr 9500 Nucleotiden Länge handelt. Es wurde ein einfacher, langer, offener Leserahmen von 9033 Nucleotiden gefunden, welcher für ein Polyprotein mit 3011 Aminosäureresten codiert. Diese Genommerkmale und Sequenzvergleiche, verbunden mit dem Wissen über die Größe und die Unbeständigkeit gegenüber Lipidlösungsmitteln wiesen darauf hin, daß das Virus möglicherweise ein Mitglied der Flavivirusfamilie ist (6,22). Es kann jedoch mit dem Pestivirusstamm enger verwandt sein als klassische Flaviviren (27,60).
Basierend auf den Ähnlichkeiten der Sequenz sowohl des Genoms als auch des vorhergesagten Polyproteins, sowie auf bestimmten Merkmalen des Polyproteins, wie den Hydrophobizitätsprofilen und dem Gehalt an sauren/basischen Aminosäuren, wird vorhergesagt, daß HCV-Proteine in den gleichen allgemeinen Regionen des Genoms codiert sind, wie sie für die Flaviviren ermittelt wurden. Bei den Flaviviren und den verwandten Pestiviren stellt etwa das Amino-terminale Drittel des Polyproteins die Strukturproteine des Virus dar. Diese bestehen aus einem hochbasischen Nucleocapsidprotein, welches als "C" bezeichnet wird, einem mit der Hülle-assozierten Glykoprotein, welches als "M" bezeichnet wird, und einem zweiten Hüllenglykoprotein "E". Die Nichtstrukturproteine werden als NS1 bis NS5 bezeichnet, aber lediglich die Funktionen von NS3 und NS5 sind mit Sicherheit zugeordnet worden. NS3 stellt die virale Protease dar und ist möglicherweise eine Helicase und NS5 ist die virale, RNA- abhängige RNA-Polymerase.
Das HCV-Polyprotein wird in einer Reihe von proteolytischen Verdauungen durch eine Kombination aus der viralen Protease und der Wirtssignalase verarbeitet. Die Verarbeitung des Pestivirus-Polyproteins ist im Detail von jener der Flaviviren verschieden, aber sie ist in ihrem allgemeinen Schema ähnlich. Die HCV-Proteine sind zum größten Teil durch Analogie mit den Flavivirus-Proteinen ermitteln worden und sie können sich, wie diejenigen der Pestiviren auch in Details wie der Größe, der Zahl und der Verarbeitung von denjenigen der Flaviviren unterscheiden. Mit diesem Einschränkungen wird zu Nomenklaturzwecken, jedoch nicht um eine Übereinstimmung in der Funktion oder der Verarbeitung nahezulegen, die zu untersuchende Nichtstruktur-Region, welche der Flavivirus-NS5-Region RNA-Polymerase analog ist, hierin nachstehend als die "NS5-Region" oder das "NS5-Protein" von HCV bezeichnet.
Es sind auf exprimierten viralen Antigenen basierende Diagnoseteste entwickelt worden und es wurden seroepidemiologische Untersuchungen unter Verwendung dieser Teste durchgeführt (33). Die Immunantwort gegenüber HCV-Infektionen betreffende Studien sind noch im Entwicklungsstadium. Bei dem im Handel verfügbaren Antikörper-Assay wird der Antikörper auf durch rekombinante DNA-Technologie in Hefe exprimiertes HCV-Antigen ermittelt. Dieses Antigen, welches als "C100-3" bezeichnet wird, wird aus der für die Nichtstrukturproteine codierenden Region des viralen Genoms erhalten und stellt möglicherweise einen Teil von NS4 dar (33). Neuere Versionen des Assays umfassen Antigene aus NS3 (Protease/Helicase) und dem internen Nucleocapsidprotein C (64). Von keinem dieser Antikörper wird angenommen, daß er Schutzfunktion besitzt, aber jeder wird üblicherweise in chronisch infizierten Individuen gefunden.
HCV ist nicht nur der Verursacher der meisten Fälle von parenteral übertragener Non-B-Hepatitis, sondern auch für einen Großteil der sporadischen, allgemein übertragenen, akuten viralen Hepatitis, der chronischen Hepatitis unbekannten Ursprungs, sowie für kryptogenetische Zirrhose und möglicherweise das hepatocelluläre Karzinom verantwortlich (2,16,31,50). Es ist die Neigung dieses Virus chronische Infektionen und chronische Lebererkrankungen zu verursachen, welche es zu solch einem medizinisch bedeutenden Problem macht. Die Behandlung von chronischer HCV-Lebererkrankung durch eine α-Interferon-Therapie wurde von kurzem durch die Food and Drug Administration (FDA) in den Vereinigten Staaten zugelassen. Es sprechen jedoch weniger als die Hälfte der Patienten an und von den ansprechenden Patienten erleiden ungefähr 50% nach der Beendigung der Behandlung einen Rückfall (16).
Es besteht daher ein immenser Bedarf an einem Vaccin zum Schutz vor durch dieses Virus verursachten Infektionen. Obwohl die gegenwärtigen Diagnoseteste auf der Ermittlung von Serumantikörper gegen exprimierte virale Proteine basieren, stellen gegenwärtig alle durch derartige Antikörper erkannten Proteine entweder virale Nichtstrukturproteine oder interne Komponenten des Virusteilchens dar. Es ist nicht klar, ob wirksame neutralisierende Antikörper gegen HCV von Individuen, welche mit dem Virus infiziert sind, üblicherweise produziert werden.
Es wurde festgestellt, daß cytotoxische T-Lymphocyten (CTL) in vivo Schutz vor bestimmten Virusinfektionen vermitteln (17,47,48). Bei der Hepatitis B-Infektion wird angenommen, daß die CTL für die Pathogenese von chronischer Hepatitis vom Typ B verantwortlich sind und die durch das Hepatitis B-Virus infizierten Hepatocyten durch Erkennen des viralen Antigens, welches in infizierten Zellen exprimiert wird, lysieren (39,42). Im Fall von HCV gibt es keine Information über die Pathogenese von viralen Infektionen. Sowohl der chronische Charakter von HCV-Infektionen als auch die histopathologischen Befunde weisen darauf hin, daß das Virus in Hepatocyten möglicherweise nicht direkt cytopathisch (oder cytolytisch) ist. Es ist möglich, daß die mit HCV-Infektionen verbundene chronische Lebererkrankung durch das Immunsystem vermittelt wird.
Diese Beobachtungen liefern Grund anzunehmen, daß für HCV spezifische CTL kausal in der Pathogenese von mit HCV verbundenen Erkrankungen involviert sein können, oder daß die celluläre Immunität für den Schutz vor oder die Wiederherstellung nach einer Infektion wichtig ist. Frühere Studien haben gezeigt, daß CD8&spplus; CTL Hepatocyten bei Patienten mit chronischer NANB-Hepatitis erkennen (28). Bis heute wurde jedoch kein von T-Zellen erkennbares Epitop von HCV in irgendeinem HCV-Protein identifiziert.
Es besteht daher ein Bedarf, ein HCV-Epitop zu identifizieren, welches von T-Zellen erkannt wird. Solche Epitope umfassende Peptide können verwendet werden, um die Rolle von CTL in HCV-Infektionen und in der Pathogenese zu bestimmen. Solche Peptide können daher verwendet werden, um die HCV spezifische CTL-Antwort in der Behandlung von Hepatitis oder anderen mit HCV-verbundenen Erkrankungen zu verändern, indem die Schutzwirkung erhöht oder eine pathogene Wirkung blockiert wird. Zusätzlich können derartige Peptide in einem Vaccin eingesetzt werden, um durch die Stimulierung einer schützenden CTL-Antwort eine Infektion zu verhindern.
In anderen viralen Modellen sind die internen Proteine die Hauptziele für die CTL-Antwort (3,30,49,62,69). In früheren Untersuchungen der Erfinder und anderer wurden die Peptide von einem internen HIV-Protein, der reversen Transcriptase, sowie Hüllenglykoprotein und Gag- und Nef-Proteine von den CTL in der Maus und beim Menschen erkannt (10,14,24,32,43,57,65). Die Immunisierung mit dem Hüllenprotein kann für HCV nicht durchführbar sein, da die Hülle in der Sequenz verhältnismäßig höchstvariabel ist (27). CTL-Klone können daher zwischen verschiedenen HCV-Isolaten unterscheiden, wie es in HIV-1 Studien gezeigt worden ist (41,58,59).
Im Gegensatz zu der beträchtlichen Aminosäuresequenzvariation in den vorhergesagten HCV-Hüllenglykoproteinen (welche als "E1" und "E2/NS1" bezeichnet werden) zeigen die internen Nucleocapsidproteine C, die Nichtstruktur-(NS)-Region 3, die NS4- und die NS5-Proteine alle eine größere Sequenzkonservierung in HCV-Isolatgruppen (27). Von der codierenden Region des HCV-Genoms, welche der NS5 der Flaviviren sowohl auf Grund ihrer Stellung im Genom als auch ihrer Sequenzähnlichkeiten analog ist, wird angenommen, daß sie die virale Replicase darstellt.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Peptid bereitzustellen, welches für HCV spezifische, cytotoxische T-Zellen induziert. Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung ein Verfahren zur Detektion cytotoxischer T-Lymphocyten bereitzustellen, welche ein Epitop des NS5-Proteins von Hepatitis C- Virus erkennen. Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung ein Verfahren bereitzustellen, durch welches in einem Säugetier eine Immunantwort auf NS5-Protein von Hepatitis C-Virus hervorgerufen wird. Schließlich ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Vaccin zum Schutz vor einer durch das Hepatitis C-Virus hervorgerufenen Infektion bereitzustellen.
Um diese Ziele zu erreichen, ist gemäß einem Aspekt dieser Erfindung ein gereinigtes Peptid bereitgestellt worden, welches ein T-Zellen-Epitop zeigt, das in Säugetierlymphocyten eine cytotoxische T-Zellenantwort gegen Zellen induziert, welche das Hepatitis C-Virus NS5-Protein exprimieren, wobei das genannte Peptid wenigstens etwa acht aufeinanderfolgende Reste einer Aminosäuresequenz umfaßt, die aus der MSYSWTGALVTPCAAE (SEQ ID NO:1), MSYTWTGALVTPCAAE (SEQ ID NO:2) und MSYTWTGALITPCAAE (SEQ ID NO:3) bestehenden Gruppe und immunologischen Äquivalenten hievon ausgewählt ist. In verschiedenen Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung zeigt das Peptid ferner ein weiteres T-Zellen-Epitop, entweder für eine cytotoxische T-Zelle oder eine T-Helferzelle, oder ein B-Zellen-Epitop (Antikörper-Erkennungsstelle).
Gemäß einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird ein Verfahren zur Detektion von cytotoxischen T-Zellen in Säugetierlymphocyten bereitgestellt, welche T-Zellen auf ein T- Zellen-Epitop von NS5-Protein des Hepatitis C-Virus ansprechen, das die Schritte: (a) Kontaktieren von Target-Zellen mit einem Peptid nach Anspruch 1, wobei die Target-Zellen mit den auf die cytotoxischen T-Zellen zu testenden Lymphocyten MHC-kompatibel sind; (b) Inkubieren der auf die cytotoxischen T-Zellen zu testenden Lymphocyten mit einem Peptid nach Anspruch 1; und (c) Bestimmen, ob die Lymphocyten auf die Target-Zellen einen cytotoxischen Effekt ausüben, wodurch das Vorliegen von Lymphocyten angezeigt wird, die ein T-Zellen-Epitop des NS5-Proteins von Hepatitis C-Virus erkennen, umfaßt.
In noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Hervorrufen einer Immunantwort in einem Säugetier auf das NS5-Protein von Hepatitis C-Virus bereitgestellt, welches Verfahren einen Schritt der Verabreichung von einer Menge eines Peptids nach Anspruch 1 an das genannte Säugetier umfaßt, welches Peptid zum Hervorrufen einer cytotoxischen T-Zellenantwort gegenüber Zellen, welche Hepatitis C- Virus NS5-Protein exprimieren, wirksam ist.
In noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Vaccin bereitgestellt, welches vor Infektionen durch Hepatitis C-Virus schützt oder die pathogenen Wirkungen von Hepatitis C-Virus verringert, wobei das Vaccin ein Peptid nach dieser Erfindung umfaßt.
Zusätzliche Ziele und Vorteile der Erfindung werden zum Teil in der folgenden Beschreibung angeführt und zum Teil werden sie aus der Beschreibung offensichtlich sein oder sie können bei der Durchführung der Erfindung erkannt werden. Die Ziele und die Vorteile dieser Erfindung können mittels der Zusammensetzungen und Verfahren, welche insbesondere in den nachfolgenden Ansprüchen angeführt sind, realisiert und erreicht werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Figur 1A veranschaulicht die Sequenzen (SEQ ID NO. 4- 17, 1-3, und 18-31) von einer Reihe von 28 Peptiden, welche durch einen Amphipatizitäts-Algorithmus als Kandidaten für T- Zellen-Epitope aus der HCV NS5-Region ausgewählt wurden. Die Sequenzen der synthetisierten Peptide basieren auf dem Isolat der Chiron Corporation, welches in den USA hergestellt wurde (26), mit Ausnahme der beiden P17-Varianten, P17FDA, welche auf einem von der US-FDA hergestellten Isolat beruht, und P17JPN, welche auf zwei Isolaten beruht, die unabhängig voneinander in verschiedenen japanischen Laboratorien erhalten wurden. Die Reste, in welchen sich das FDA-Isolat von der Chiron-Sequenz unterscheidet, sind unter den Originalsequenzen durch Unterstreichungen gezeigt. Es sind die amphipatischen Werte (35) der Peptide angegeben.
Die Figur 1B zeigt cytotoxische T-Lymphocytenantworten auf Peptide von HCV NS5 in BALB/c und BALB.B Mäusen. Die Mäuse wurden intravenös mit 10&sup7; Plaque-bildenden Einheiten von rekombinantem Vacciniavirus, welches die HCV NS5-Region exprimiert, (vHCV), vorbehandelt. Die Immunmilzzellen wurden in vitro mit Peptiden in einer Konzentration von 4µM (3 unterschiedliche Peptide für jede Kultur) in Gegenwart eines Überstandes von Lymphocyten, welche mit Con A stimuliert worden waren (der IL-2 enthält), und mit T-Zellen als Kontrolle restimuliert, welche Zellen mit IL-2 behandelt worden waren, aber kein Peptid enthielten. Die CTL-Aktivität wurde gegen 3T3 Fibroblast-Zellen gemessen, welche Zellen mit einem Neo-Resistenzgen (18Neo, H-2d Klasse I positiv, Klasse II negativ) in BALB/c und mit EL-4 (G.2b) in BALB.B transfiziert wurden. Die Ziele wurden mit 10µM von jedem Peptid oder ohne Peptid während 6 Stunden sensibilisiert. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt. Das Effektor:Ziel (Target)-Verhältnis (E:T-Verhältnis) = 100:1, 5.000 Target-Zellen/Vertiefung. Die Lysis in Abwesenheit des Peptids betrug 2,2 bis 7,7% in BALB/c (4,2% für P17 stimulierte Immunzellen) und weniger als 2% in BALB.B. Im allgemeinen waren die Standardfehler der Triplikate < 5% der Werte und es wurden vergleichbare Ergebnisse in einem nochmaligen Experiment erzielt.
Die Figur 2 zeigt die Cytotoxizität von für P17 und P17FDA spezifischen CTL-Linien gegenüber jedem spezifischen Peptid und anderen P17-Varianten. Es wurden die Auswirkungen der Mutation einer einzigen Aminosäure auf die Erkennung von Epitop-Varianten untersucht. Es wurden 5x10³ mit &sup5;¹Cr-markierte Target-Zellen (18Neo) mit Effektor-Zellen aus Langzeit-CTL-Linien, welche wiederholt mit spezifischen Peptiden stimuliert wurden, in Anwesenheit von jedem spezifischen Peptid, anderen P17-Varianten, P18IIIB (negatives Kontrollpeptid), oder ohne ein Peptid kultiviert. E:T, Effektor:Ziel-Verhältnis. Die Lysis in Abwesenheit des Peptids war < 1%. Die Standardfehler von Triplikaten waren im allgemeinen < 5% der Werte und es wurden vergleichbare Ergebnisse in drei unabhängigen Experimenten erzielt.
Die Figur 3 zeigt die Ergebnisse von Untersuchungen von für P17 und P17FDA spezifischen CTL-Linien, welche durch H-2d restringiert sind, hinsichtlich ihrer Cytotoxizität gegenüber den 18Neo-Zellen (BALB/c 3T3 Fibroblast), die mit NS5 exprimierendem vHCV Vacciniavirus infiziert wurden (1 Stunde, 3700, Multiplizität der Infektion 10:1, dreimaliges Waschen vor der Verwendung), sowie gegenüber 18Neo, welche mit jedem spezifischen Peptid (10µM) behandelt worden waren. Als negative Kontrollziele wurden mit dem Kontroll-vSC8-Vacciniavirus infizierte 18Neo (Neo-Gen transfizierte BALB/c 3T3), mit P18IIIB (1 µM) behandelte und unbehandelte 18Neo eingesetzt. Die Standardfehler von Triplikaten waren im allgemeinen < 5% der Werte und es wurden vergleichbare Ergebnisse in drei unabhängigen Experimenten erhalten.
Die Figur 4 zeigt eine Analyse des Phenotyps, der H-2d CTL-Linie, welche für P17 spezifisch ist. Das CTL-Assay, wie es in Figur 2 beschrieben ist, wurde in Gegenwart von anti-L3T4 (GK1.5) (anti-CD4) oder anti-Lyt 2.2 (2.43) (anti-CD8) monoklonalen Antikörpern (Kulturüberstand) in der angegebenen Verdünnung oder ohne Antikörper während 6 Stunden durchgeführt. 18Neo wurde über Nacht mit P17 (10µM) behandelt und dreimal gewaschen. Die Standardfehler von Triplikaten waren im allgemeinen < 5% der Werte und es wurden vergleichbare Ergebnisse in drei unabhängigen Experimenten erhalten.
Die Figur 5 illustriert die Identifizierung der Klasse I- MHC-Moleküle, welche für die Darstellung von P17 gegenüber der CTL-Linie im H-2d Stamm verantwortlich sind. Die Target-Zellen wurden über Nacht mit P17 (10µM) behandelt und dreimal gewaschen. Effektor:Target-Verhältnis = 10:1. TM: Transmembran-Teil des Dd Moleküls. Der Ursprung von α1 α2 α3 TM für jedes transfizierende Mittel ist DdDdDdDd, T4.8.3; LdLdLdLd, T1.1.1; - DdDdDd, DMT26.551; DdDdLdLd, T37.2.1; LdLdDdDd, T37.1.3.; DdLd- LdLd, T9.10.3; und LdDdDdDd, DMT34.5. Die Standardfehler von Triplikaten betrugen im allgemeinen < 5% der Werte und es wurden vergleichbare Ergebnisse in zwei unabhängigen Experimenten erhalten. L28: DAP3 L Zelle (H-2k), ausschlißelich transfiziert mit pSV2Neo-Gen; 18Neo: BALB/c 3T3 Fibroplast (H-2d) ausschließlich transfiziert mit pSV2Neo.

Detaillierte Beschreibung spezifischer Ausführungsformen

Wie vorstehend erwähnt, war es bis jetzt bekannt, daß CTL- Schutz in vivo gegenüber bestimmten Virusinfektionen vermitteln, aber es wurden bis jetzt keine CTL-Epitope in irgendeinem HCV-Protein definiert. Es wurde dennoch festgestellt, daß das Nichtstrukturprotein von HCV, welches dem Flavivirus-Gen (NS5) entspricht, das eine Homologie zu RNA-Polymerase aufweist, ein verhältnismäßig konservatives Target-Protein für CTL ist und tatsächlich ein Epitop besitzt, welches eine cytotoxische T- Zellenantwort in Lymphocyten hervorruft.
Um die Epitopspezifität von für HCV NS5-Protein spezifischen CTL zu untersuchen, wurden 28 Peptide aus diesem Protein in Mäuse-CTL untersucht. Die Mäuse wurden mit einem rekombinanten Vacciniavirus, welches das HCV NS5-Gen exprimiert, immunisiert, und die vorbehandelten Milzzellen wurden in vitro mit Peptiden restimuliert. Die CTL von H-2d Mäusen sprachen auf ein einzelnes, 16 Reste aufweisendes synthetisches Peptid an, welches hierin als "P17" bezeichnet wird und den Resten 2422-2437 des offenen HCV-Leserahmens entspricht. Dieses verhältnismäßig konservative Epitop wurde durch H-2d Klasse I Haupt-Histokompatibilitätskomplex-Moleküle (MHC) auf herkömmlichen CD4&supmin;CD8&spplus; CTL dargestellt, aber es wurde nicht bei CTL festgestellt, die durch H-2d restringiert waren. Darüber hinaus zeigten Exon- Shuffle-Experimente unter Verwendung verschiedener transfizierender Mittel, welche recombinante Dd/Ld und Kd exprimieren, daß dieses Peptid in Verbindung mit den α1- und α2-Domänen des Dd Klasse I-MHC-Moleküls gesehen wird.
Die Aminosäuresequenz des P17-Peptids unterscheidet sich durch einen Rest von homologen Segmenten dieser Nichtstrukturregion aus drei anderen HCV-Isolaten. Es wurden Peptidvarianten mit Substitution einer einzigen Aminosäure hergestellt, um die Auswirkung von jedem Rest auf die Fähigkeit zur Sensibilisierung von Zielen zu überprüfen. Keine Substitution beeinflußte die Erkennung. Diese konservativen Mutationen beeinflußten die Peptidwechselwirkung daher weder mit dem Dd Klasse I-MHC-Molekül noch mit dem T-Zellenrezeptor.
Mäuse-CTL kreuzreagieren mit Peptiden, welche alle vier sequenzierten HCV-Isolate aus den USA und Japan darstellen. Wenn menschliche CTL eine ähnliche Kreuzreaktivität besitzen, sollten die Peptide dieser Erfindung daher für die HCV-Diagnose und zur Entwicklung eines Vaccins wertvoll sein. Die Peptide dieser Erfindung wären daher Kandidaten für Komponenten eines HCV-Vaccins, um die Virusinfektion zu verhindern oder zu behandeln. Zusätzlich wären diese Peptide zur Entwicklung von Diagnose- und Prognoseverfahren nützlich, welche auf der Ermittlung basieren, ob das celluläre Immunsystem eine Antwort auf das NS5-Protein von HCV feststellt.
Details der Peptide und anderer Aspekte dieser Erfindung sind nachstehend angegeben.

A. Definitionen

Die folgenden Definitionen werden für einige der in dieser Beschreibung verwendeten Ausdrücke angewandt.

Aminosäurereste,

welche hierin identifiziert sind, liegen in der natürlichen L-Konfiguration vor. Es werden die folgenden Abkürzungen für Aminosäurereste verwendet:
Alle Aminosäuresequenzen sind hierin durch Formeln mit der Orientierung von links nach rechts in der herkömmlichen Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus dargestellt.

Pedtid

wird hierin verwendet, um eine lineare Reihe von Aminosäureresten zu bezeichnen, welche durch Peptidbindungen zwischen den α-Amino- und den Carboxygruppen benachbarter Reste aneinander gebunden sind. Ein Peptid, so wie es hierin verwendet wird, umfaßt kein natürlich auftretendes Protein, wie das NS5-Protein von HCV.

Antikörper

wird hierin in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen als kollektives Substantiv verwendet, welches sich auf eine Population von Immunoglobulinmolekülen oder immunologisch wirksamen Teilen von Immunoglobulinmolekülen, d.s. Moleküle, welche eine "Antigen-Bindungsstelle" oder Paratop umfassen, beziehen. Eine Antigen-Bindungsstelle ist jener Strukturteil eines Antikörpermoleküls, welcher sich bei einem B-Zellen-Epitop spezifisch an ein Antigen bindet.

B. Die Peptide

Um ein, ein T-Zellen-Epitop aufweisendes Peptid zu konstruieren, welches in Säugetierlymphocyten eine cytotoxische T- Zellenantwort gegen ein bestimmtes Protein exprimierende Zellen zeigt, ist es erforderlich, empirisch eine Reihe von Peptiden zu untersuchen, welche Kandidaten für T-Zellen-Epitope umfassen. Derartige Kanditaten werden durch amphipatische Werte (35) identifiziert, welche auf die Neigung einer Aminosäuresequenz zur Ausbildung einer amphipatischen Helix hinweisen. Die Korrelation zwischen Klasse II restringierten T-Zellen-Epitopen und Regionen mit amphipatischen Werten > 4 bleibt im höchsten Maße statistisch signifikant, sogar bei einer Bewertung hinsichtlich der 1991 bekannten 92 Epitope (12,13) (p< 0,0003) und sie ist bei einer geringeren Reihe von untersuchten CTL- Epitopen ebenso signifikant. Eine Korrelation zwischen der Größe des Wertes über diesem Schwellenwert und der Möglichkeit, daß eine Stelle durch T-Zellen erkannt werden wird, ist aber nicht gefunden worden.
Durch den vorstehenden Ansatz ist festgestellt worden, daß ein Peptid, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die von der aus MSYSWTGALVTPCAAE [SEQ ID NO: 1], MSYTWTGALVTPCAAE [SEQ ID NO:2] und MSYTWTGALITPCAAE [SEQ ID NO: 3] bestehenden Gruppe ausgewählt ist, eine cytotoxische T-Zellenantwort in Säugetierlymphocyten gegenüber Zellen zeigt, welche Hepatitis C-Virus NS5-Protein exprimieren. Es kann daher gemäß der vorliegenden Erfindung ein Peptid synthetisiert werden, welches ein T- Zellen-Epitop aufweist, das eine cytotoxische T-Zellenantwort in Säugetierlymphocyten gegenüber Zellen hervorruft, welche Hepatitis C-Virus NS5-Protein exprimieren. Ein Peptid der vorliegenden Erfindung kann eine gesamte, vorstehend beispielhaft angeführte Aminosäuresequenz oder einen Teil davon oder ein immunologisches Äquivalent einer beispielhaften Sequenz umfassen. Insbesondere kann ein Peptid dieser Erfindung Sequenzen der Aminosäurereste 2422-2437 eines HCV-Polyproteins umfassen, welche Reste in der NS5-Region des HCV-Polyproteins enthalten sind, oder immunologische Äquivalente der Aminosäurereste 2422- 2437 eines HCV-Polyproteins.
Die Wendung "immunologisches Äquivalent" bezieht sich auf die Tatsache, daß bestimmte Aminosäuresubstitutionen oder deletionen in einem immunogenen Peptid, welches eine natürliche Aminosäuresequenz der Reste 2422-2437 eines HCV-Polyproteins aufweist, vorgenommen werden können, und daß das entstehende Peptid dennoch eine Immunantwort hervorrufen wird, welche jener des immunogenen Originalpeptids im wesentlichen äquivalent ist. Derartige Substitutionen oder Deletionen können gemäß eingeführter Prinzipien vorgenommen werden, von welchen einige nachstehend erörtert sind.
In dieser Hinsicht werden Peptide, welche die Fähigkeit besitzen, eine cytotoxische T-Zellenantwort gegenüber Zellen hervorzurufen, welche die Reste 2422-2437 eines HCV-Polyproteins exprimieren, als immunologisch aquivalent zu dem Peptid dieser Erfindung angesehen. Um zu den Resten 2422-2437 eines HCV-Polyproteins immunologisch äquivalent zu sein, muß ein Peptid genauer (1) durch eine ein MHC-Molekül aufweisende Target- Zelle darstellbar sein, welche den betreffenden Teil eines HCV NS5-Proteins darstellt, und (2) in Verbindung mit jenem MHC- Molekül durch cytotoxische T-Lymphocyten erkennbar sein, welche mit NS5-Protein von Hepatitis C-Virus behandelt wurden.
Um ein "immunologisches Äquivalent" zu sein, ist es daher nicht notwendig, daß jeder Rest der natürlichen HCV-Epitopsequenz oder jedes Fragments hievon durch einen immunologisch aquivalenten Rest ersetzt ist, sondern daß das Peptid als Ganzes eine im wesentlichen aquivalente Immunantwort hervorruft. Es werden daher entweder konservative oder nicht-konservative Substitutionen von einer Aminosäure durch eine andere bei der Durchführung berücksichtigt, wo derartige Änderungen bestimmte Vorteile bei deren Anwendung gewährleisten. Konservative Substitutionen sind jene, worin ein Aminosäurerest durch einen anderen, biologisch ähnlichen Rest ersetzt ist. Beispiele von konservativen Substitutionen umfassen die Substitutionen von einem hydrophoben Rest, wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, durch einen anderen oder die Substitution von einem polaren Rest durch einen anderen, wie von Arginin und Lysin, von Glutamin und Asparaginsäure oder von Glutamin und Asparagin oder dgl. Konservative Substitutionen umfassen auch die Anwendung einer substituierten Aminosäure anstelle einer unsubstituierten Stammaminosäure, vorausgesetzt, daß solch ein Peptid auch die erforderliche Bindungsaktivität zeigt.
Systematische Verfahren zur Ermittlung, welche Reste einer linearen Aminosäuresequenz zur Bindung an ein spezifisches MHC Protein benötigt werden, sind bekannt. Siehe beispielsweise Allen, P.M. et al., Nature 327:713-717 (1987); Sette, A. et al., Nature 328:395-399 (1987); Takahashi, H. et al., J. Exp. Med. 170:2023-2035 (1989); Maryanski, J.L. et al., Cell 60:63- 72 (1990).
In ähnlicher Weise sind systematische Verfahren zur Ermittlung, welche Reste einer linearen Aminosäuresequenz zur Bindung an einen spezifischen Antikörper benötigt werden, bekannt, und im wesentlichen können die gleichen Verfahren angewandt werden, um zu ermitteln, welche Reste einer Sequenz zur Erkennung durch einen T-Zellen-Rezeptor erforderlich sind. Siehe beispielsweise die PCT-Anmeldung WO 8403564 für "Determination of amino acid sequence antigenicity for location of active sequence in a protein" von H.M. Geysen, deren gesamte Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. In dieser Anmeldung ist ein Verfahren zur Ermittlung einer Antigen-wirksamen Aminosäuresequenz innerhalb einer bekannten Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Teils davon beschrieben, welches umfaßt (1) das Synthetisieren von Peptiden mit überlappenden Aminosäuresequenzen, wovon jedes eine Sequenz umfaßt, welche einer Sequenz innerhalb der bekannten Aminosäuresequenz entspricht; (2) das Inkontaktbringen der Peptide mit Antikörper gegen das Protein oder den interessierenden Teil; und (3) das Ermitteln oder Bestimmen der Anwesenheit oder des Fehlens einer Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen jedem Peptid und dem Antikörper, um festzustellen, ob das Peptid eine Antigen-Wirksamkeit besitzt.
Die Anwendung dieses Ansatzes zur Identifizierung immunologischer Äquivalente der Sequenz des Peptids dieser Erfindung, beispielhaft veranschaulicht durch ein Peptid, welches die Reste 2422-2437 der Chiron HCV1-Polyproteinsequenz umfaßt, erfordert die Substitution des Antikörpers gegen das interessierende Protein durch eine cytotoxische T-Zelle, welche für HCV NS5-Protein exprimierende Target-Zellen spezifisch ist. Für diesen Zweck geeignete cytotoxische T-Zellen umfassen beispielsweise Lymphocyten aus einem. Säugetier, welches mit HCV infiziert oder mit einem rekombinanten Vacciniavirus, welches ein HCV NS5-Protein exprimiert, immunisiert wurde, oder cytotoxische T-Zellen-Klone, welche aus derartigen Immunocyten durch wiederholte Stimulierung mit einem Peptid dieser Erfindung, wie nachstehend in Beispiel 2 beschrieben, erhalten werden. Die cytotoxische T-Zelle kann zur Identifizierung immunologischer Äquivalente eines beispielhaften Peptids dieser Erfindung durch weiteres Definieren jener Reste innerhalb der beispielhaften Sequenz verwendet werden, welche zur Darstellung einer T-Zellen-Epitop-Funktion des HCV NS5-Proteins erforderlich sind, beispielsweise nach dem vorstehenden Verfahren von Geysen, welches durch Substitution eines Antikörpers durch T- Zellen modifiziert wurde, oder wie es von Takahashi, H. et al., J. Exp. Med. 170:2023-2035 (1989a), Science 246:118-121 (1989b) und Science 255:333-336 (1992) beschrieben ist.
Von der Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren wird erwartet, daß eine lineare Untergruppe der Sequenz der Reste 2422-2437 eines HCV-Polyproteins identifiziert wird, welche für die T-Zellen-Epitop-Wirksamkeit gemäß dieser Erfindung benötigt wird. Es ist bekannt, daß eine T-Zellen-Epitop- Funktion, welche fähig ist, von einem MHC-Molekül dargestellt und von einem T-Zellen-Rezeptor erkannt zu werden, üblicherweise eine lineare Sequenz von 9 Aminosäuren umfaßt, obwohl einige lineare Epitope bekannt sind, welche 8 oder 10 Aminosäuren umfassen. Siehe beispielsweise Falk, K. et al., Nature 351:290 (1991); Jardetzky, T.F. et al., Nature 353:326-329 (1991); Hunt, D.F. et al., Science 255:1261-1263 (1992) und Romero, P. et al., J. Exp. Med. 174:603-612 (1991).
Es wird daher angenommen, daß eine Sequenz, welche immunologisch äquivalent der Sequenz eines exemplarischen Peptids der vorliegenden Erfindung ist, mindestens 8 Aminosäuren, beispielsweise 8 aufeinanderfolgende Reste einer beispielhaften Sequenz von 16 Aminosäuren besitzen muß, von welchen gezeigt wurde, daß sie für die vorstehend beschriebene T-Zellen-Epitop- Funktion erforderlich sind. Es könnte durch die vorstehend beschriebenen Verfahren jedoch möglicherweise festgestellt werden, daß ein Peptid von weniger als 8 Aminosäuren mit beispielsweise 7 oder 6 Aminosäuren ein immunologisches Äquivalent zu einem beispielhaften Peptid dieser Erfindung ist und solch ein Peptid wäre noch immer im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Zusammengefaßt, enthält das Peptid dieser Erfindung wenigstens etwa 8 Aminosäuren, was so wenige wie 6 Aminosäuren umfaßt.
Abgesehen von der Mindestzahl an Resten, welche für eine T-Zellen-Epitop-Funktion erforderlich sind, kann die Länge des Peptids dieser Erfindung variieren, beispielsweise in Abhängigkeit vom Typ des für die Immunisierung verwendeten Trägers. Es ist im allgemeinen bevorzugt, daß das Peptid eine Länge aufweist, welche die Zahl von Epitopen, die nicht das gewünschte Epitop sind, minimiert, sodaß die Chancen einer Wechselwirkung zwischen den Epitopen so gering wie möglich sind. Darüber hinaus werden bei der Herstellung von Peptiden durch chemische Synthesen zusätzliche Reste im allgemeinen die für die Herstellung der Peptide erforderliche Dauer verlängern und die Kosten erhöhen und die Reinheit und Ausbeute des Endproduktes verringern. Es sind daher synthetische Peptide von weniger als 50 Resten bevorzugt und weniger als 30 Reste sind stärker bevorzugt. Peptide, welche Epitope zusätzlich zu jenem des HCV P17- Epitops aufweisen, liegen jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Routineversuche werden die optimale Länge (die optimalen Längen) für derartige Peptide ergeben.
Beispiele von Peptiden, welche die Ziele dieser Erfindung gewährleisten, umfassen ein 16 Reste enthaltendes Peptid, welches ein T-Zellen-Epitop aufweist, das eine cytotoxische T- Zellenantwort in Säugetierlymphocyten gegenüber Hepatitis C- Virus NS5-Protein exprimierenden Zellen zeigt, welches die folgende Aminosäuresequenz aufweist: [SEQ ID NO:2] MSYTWTGALVTPCAAE. Diese Sequenz wurde aus den Resten 2422-2437 des NS5-Proteins eines HCV-Isolats erhalten, welches von der US-FDA stammt und daher als "P17FDA" bezeichnet wurde. Die P17FDA-Sequenz unterscheidet sich in einem Rest von der entsprechenden NS5-Sequenz eines weiteren US-Isolats, der Chiron HCV1-Sequenz [SEQ ID NO:1] MSYSWTGALVTPCAAE (26), welche als P17 bezeichnet wird. Die P17FDA-Sequenz unterscheidet sich auch durch einen weiteren einzigen Rest von einer Sequenz, welcher an dieser Stelle in zwei unabhängigen japanischen Isolaten enthalten ist [SEQ ID NO:3] MSYTWTGALITPCAAE (29,60), die als P17JPN bezeichnet werden. Die als P17, P17FDA und P17JPN bezeichneten Peptide stellen daher drei natürliche Varianten des Teils des HCV NS5-Proteins dar, welcher den Resten 2422-2437 des Chiron HCV1-Polyproteins entspricht, wobei jedes ein Epitop aufweist, welches eine cytotoxische T-Zellenantwort in Säugetierlymphocyten gegenüber Zellen zeigt, die Hepatitis C-Virus NS5-Protein exprimieren.
Zusätzliche Peptide dieser Erfindung können natürliche Sequenzen von Teilen von NS5-Protein oder von anderen HCV-Isolaten umfassen, welche der P17-Sequenz des Chiron HCV1-Isolats entsprechen. Solche zusätzlichen natürlichen NS5-Sequenzen können ermittelt werden, wie es nachstehend in Beispiel 2 beschrieben ist. So wird virale RNA von HCV aus infiziertem Gewebe extrahiert (19). Die RNA wird revers transkribiert und durch die Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung spezifischer HCV-Primer, wie früher beschrieben, verstärkt (9). Anschließend wird das PCR-Produkt in einen zur Verstärkung und Sequenzierung der NS5-DNA geeigneten Klonierungsvektor ligiert.
Es ist in der Technik bekannt, daß Polyproteine aus verschiedenen HCV-Isolaten mehr oder weniger als die 3011 Aminosäuren des Chiron HCV1-Isolats enthalten können. Beispielsweise bestehen die Polyproteine der japanischen Isolate, welche die als P17JPN bezeichnete Sequenz enthalten, aus nur 3010 Resten, wovon die P17JPN-Sequenz die Reste 2422-2436 umfaßt. Um Sequenzen aufzufinden, welche strukturell der P17-Sequenz dieser Erfindung (den Resten 2422-2437 der Chiron HCV1-Sequenz) entsprechen, werden daher neu ermittelte NS5-Sequenzen mit homologen Teilen bekannter NS5-Sequenzen, beispielsweise der Chiron HCV1-Sequenz, zusammengeschlossen, um jene Reste der neuen Sequenz zu identifizieren, welche den Resten 2422-2437 des bekannten HCV-Polyproteins entsprechen. Peptide mit Sequenzen, welche der P17-Sequenz entsprechen, wie sie durch Analyse des klonierten PCR-Produkts ermittelt werden, werden anschließend hergestellt und auf die T-Zellen-Epitop-Funktion, wie nachstehend in Beispiel 2 beschrieben, untersucht.
Die vorstehend angeführten Verfahren können nicht nur dazu dienen, Reste in der linearen Sequenz eines NS5-Proteins zu identifizieren, welche für eine T-Zellen-Epitop-Wirksamkeit benötigt werden, sondern auch um das zulässige Ausmaß an Aminosäuresubstitutionen in jenen Positionen zu bestimmen, welche für die Darstellung des T-Zellen-Epitops erforderlich sind. Daher können zusätzlich zu natürlichen HCV NS5-Aminosäuresequenzen andere Aminosäuresequenzen in einem Peptid dieser Erfindung enthalten sein, um im wesentlichen das gleiche Epitop des HCV NS5-Proteins darzustellen. Diese nicht-natürlichen Aminosäuresequenzen können durch Substituieren der Aminosäuren in einer natürlichen Sequenz von NS5-Resten, welche für die T-Zellen- Epitop-Funktion erforderlich sind, durch verschiedene Aminosäuren und Überprüfen der entstehenden Sequenzen auf die Beibehaltung einer derartigen Funktion, wie in Beispiel 2 beschrieben, identifiziert werden.
Beispielsweise ist in der POT-Anmeldung WO 8606487 ein Verfahren zur Entwicklung von "Mimotopen" beschrieben, welche beispielsweise ein Epitop in einem Protein nachahmen. Siehe auch das Dokument (71). Dieses Verfahren umfaßt das Ermitteln oder Bestimmen einer Monomersequenz, welche ein topographisches Äquivalent eines Liganden, z.B. eines Epitops, darstellt, die zu einem besonderen, interessierenden Rezeptor (z.B. einem Antikörper) komplementär ist. Das Verfahren umfaßt (a) das Synthetisieren von Oatameren der Formel D2-D1, worin D1 ein bestimmtes Monomer (wie eine natürliche L-Aminosäure oder eine synthetische D-Form oder eine in anderer Weise modifizierte Aminosäure) ist, welches von einer ersten Gruppe von Monomeren ausgewählt ist, und D2 ein bestimmtes Monomer ist, das aus einer zweiten Gruppe von Monomeren ausgewählt ist, welche der ersten Gruppe entsprechen kann. Diese Catamere umfassen Catamere, worin jedes bestimmte Monomer systematisch variiert wird, um Mitglieder der jeweiligen Gruppe von Monomeren zu enthalten. Das Verfahren umfaßt ferner (b) das Inkontaktbringen jedes Catamers mit dem interessierenden Rezeptor und (c) das Ermitteln oder Bestimmen der Anwesenheit oder des Fehlens einer Bindung zwischen jedem Catamer und dem Rezeptor. Die vorstehend erwähnte PCT-Anmeldung Nr. WO 8600991 und das Dokument (71) beschreiben weitere Details zur Identifizierung von Aminosäuresequenzen, welche einem Epitop topologisch äquivalent sind (d.i. ein Mimotop) durch Untersuchen von Catameren mit zum Teil definierter Struktur auf ihre Antikörperbindung.
Durch die Anwendung von cytotoxischen T-Lymphocyten und deren Rezeptoren gemäß dieser Erfindung und den hierin vorstehend beschriebenen Verfahren zur Entwicklung von Mimotopen, kann ein Fachmann daher ein Peptid dieser Erfindung entwickeln, welches ein Epitop aufweist, das immunologisch äquivalent zum HCV NS5 T-Zellen-Epitop ist, welches von den beispielhaften, hierin beschriebenen Peptiden dargestellt wird. Die Mimotope dieser immunologisch äquivalenten "Peptide" müssen keine natürliche Aminosäuresequenz von HCV enthalten oder tatsächlich überhaupt keine natürlichen Aminosäuren aufweisen.
Ein Peptid gemäß dieser Erfindung, welches eine Sequenz aufweist, die zum Teil mit der natürlichen Sequenz des T-Zellen-Epitops von HCV NS5 identisch ist (da eine oder mehrere konservative oder nicht-konservative Substitutionen oder Deletionen vorgenommen wurden) wird üblicherweise, aber nicht notwendigerweise, eine Substitution oder Deletion von nicht mehr als etwa 30 Zahlenprozent, vorteilhafterweise nicht mehr als etwa 20 Zahlenprozent und vorzugsweise nicht mehr als etwa 10 Zahlenprozent der Aminosäurereste aufweisen, welche das gesamte NS5 T-Zellen-Epitop oder einen Teil davon darstellen, mit Ausnahme derjenigen, worin zusätzliche Reste an irgendeinem Ende angefügt wurden, beispielsweise um einen "Linker" bereitzustellen, durch welchen die Peptide dieser Erfindung zweckmäßigerweise an eine weitere Substanz wie einen Marker, eine feste Matrix oder einen Träger gebunden werden können.
Zusätzlich kann sich die Aminosäuresequenz eines Peptids gemäß dieser Erfindung von der natürlichen Sequenz des HCV NS5- Epitops durch die Sequenz unterscheiden, welche durch eine terminale-NH&sub2;-Acylierung, z.B. eine Acetylierung, modifiziert worden ist. Eine derartige Acylierung wird verwendet, um die Ladung des synthetischen Peptids gemäß den in der Technik gut bekannten Prinzipien zu verringern.
Ein Peptid gemäß dieser Erfindung kann durch irgendeines der den Fachleuten in der Peptid-Technik bekannten Verfahren synthetisiert werden, einschließlich rekombinanter DNA-Verfahren. Synthetische chemische Verfahren, wie eine Festphasensynthese vom Merrifield-Typ, sind aus Gründen der Reinheit, der Antigenspezifität, dem Frei-Sein von unerwünschten Nebenprodukten, der Leichtigkeit der Herstellung und dergleichen bevorzugt. Eine exzellente Zusammenfassung der vielen verfügbaren Verfahren kann in J.M. Steward & J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco (1969); M. Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2. Auflage, (1976); und J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Bd. 2, S. 46, Academic Press, New York (1983), für Festphasenpeptidsynthesen, und in E. Schroeder & K. Kubke, 1 The Peptides; Academic Press, New York (1965), für klassische Lösungsmittelsynthesen gefunden werden, wobei die gesamte Offenbarung von jedem dieser Dokumente hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. Geeignete Schutzgruppen, welche in derartigen Synthesen anwendbar sind, sind in den vorstehenden Dokumenten und in J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York (1973), beschrieben, dessen gesamte Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Im allgemeinen umfassen die hierin berücksichtigten Festphasensynthesen die sequentielle Addition von einem oder mehreren Aminosäureresten oder von in geeigneter Weise geschützten Aminosäureresten an eine wachsende Peptidkette. Üblicherweise ist entweder die Aminogruppe oder die Carboxylgruppe des ersten Aminosäurerestes durch eine geeignete, selektiv entfernbare Schutzgruppe geschützt. Eine davon verschiedene, selektiv entfernbare Schutzgruppe wird für Aminosäuren wie Lysin angewandt, welche eine reaktive Seitengruppe enthalten.
Unter Anwendung einer Festphasensynthese als Anschauungsbeispiel wird die geschützte oder derivatisierte Aminosäure mittels ihrer ungeschützten Carboxyl- oder Aminogruppe an einen inerten festen Träger gebunden. Die Schutzgruppe der Amino- oder Carboxylgruppe wird anschließend selektiv entfernt und die nächste Aminosäure in der Sequenz, welche die in geeigneter Weise geschützte komplementäre Gruppe (Aminogruppe oder Carboxylgruppe) besitzt, wird zugemischt und unter den zur Ausbildung der Amidbindung geeigneten Bedingungen mit dem bereits an den festen Träger gebundenen Rest umgesetzt. Die Schutzgruppe der Amino- oder Carboxylgruppe wird anschließend aus diesem neu addierten Aminosäurerest entfernt und die nächste (in geeigneter Weise geschützte) Aminosäure wird anschließend zugesetzt und so weiter. Nachdem alle gewünschten Aminosäuren in der genauen Sequenz aneinandergebunden wurden, werden irgendwelche verbliebenen, das Ende und die Nebengruppen schützenden Gruppen (und der feste Träger) nacheinander oder gleichzeitig entfernt, um das fertige Peptid zu liefern.
Vereinfachte Verfahren zur Festphasensynthese von Peptiden in kleinem Maßstab sind ebenfalls bekannt. Siehe beispielsweise Houghten, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:5131-5135 (1985); und Houghton, M., Q.-L.Choo & G. Kuo, Europäische Patentanmeldung 88310922 (1988).

C. Assays und diagnostische Verfahren.

Die vorliegende Erfindung berücksichtigt verschiedene Assaymethoden zur Detektion von cytotoxischen T-Zellen in Säugetierlymphocyten, welche auf ein T-Zellen-Epitop von Hepatitis C-Virus NS5-Protein ansprechen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt dieses Assay einen ersten Schritt (a) des Inkontaktbringens von Target-Zellen mit einem Peptid dieser Erfindung. Vorzugsweise ist von diesen Target-Zellen bekannt, daß sie mit den Lymphocyten MHC- verträglich sind, welche Lymphocyten auf die HCV spezifischen cytotoxischen T-Zellen hin zu untersuchen sind. In einem zweiten Schritt (b) ist die Inkubation der auf die genannten cytotoxischen T-Zellen zu untersuchenden Lymphocyten mit einem Peptid dieser Erfindung unter in vitro Bedingungen erforderlich, welche ausreichen, um die HSV NS5 spezifischen CTL zu restimulieren, damit diese auf geeignete Target-Zellen ansprechen. In einem dritten Schritt (c) ist die Überprüfung erforderlich, ob die untersuchten Lymphocyten eine cytotoxische Wirkung auf die Target-Zellen ausüben, wodurch auf das Vorhandensein von CTL hingewiesen wird, welche ein T-Zellen-Epitop von Hepatitis C- Virus NS5-Protein erkennen.
Obwohl hierin beispielhafte Assayverfahren unter Verwendung von Mäuselymphocyten beschrieben sind, ist die Erfindung nicht darauf beschränkt. Beispielsweise berücksichtigt die vorliegende Erfindung die Detektion von menschlichen CTL zum Beispiel im Blut oder anderen Geweben von Patienten, von denen bekannt ist oder von denen angenommen wird, daß sie mit HCV infiziert sind, durch in geeigneter Weise adaptierte Verfahren, die zur Detektion anderer menschlicher CTL bekannt sind. Siehe beispielsweise Clerici, M. et al., J. Imm. 146:2214-2219 (1991).
Das Assay dieser Erfindung dient zur Ermittlung, ob das Immunsystem eines Säugetiers durch das NS5-Protein von HCV provoziert wurde, um so festzustellen, ob das Vorhandensein und die Größe solch einer Antwort mit entweder dem Vorhandensein einer HCV-Infektion (d.h. zur Diagnose) oder der Schwere der pathogenen Wirkung des Virus (d.h. als ein prognostischer Indikator) korreliert werden kann.

D. Vaccin und therapeutische Zusammensetzungen

Es wird angenommen, daß die Peptide dieser Erfindung für ein Vaccin zur Verhinderung einer HCV-Infektion oder zu therapeutischen Zwecken bei mit HCV infizierten Individuen nützlich sind. Beispielsweise können die Peptide als solche verwendet werden oder sie können angewandt werden, um immunogene Konjugate herzustellen, worin ein Peptid an ein Mittel konjugiert ist, das eine Immunantwort an einen Komplex hervorruft, welcher das gemäß den in der Technik bekannten Verfahren an ein Trägerprotein gebundene konjugierte Peptid umfaßt. Siehe beispielsweise M.F. Good, Science 235:1059-1062 (1987); und Palker, T.J., J. Imm. 142:3612-3619 (1989). Mittel, welche an Peptide konjugiert werden können, um eine Immunantwort hervorzurufen, umfassen Toxoide wie Diphtheria-Toxoid oder Tetanus-Toxoide, welche üblicherweise vom Körper (immunisierter Personen) erkannt und durch das Immunsystem eliminiert werden. In alternativer Weise kann eine für das Peptid codierende Gensequenz in einem rekombinanten Gen einverleibt sein und als Teil eines Vektors, beispielsweise eines rekombinanten Virus, wie dem Vacciniavirus exprimiert werden, welches durch das Verfahren von Chakrabarti, S. et al., Nature 320:535-537 (1986), hergestellt wird.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung kann auch in einem größeren Peptid einverleibt sein, welches zusätzliche Epitope, entweder andere T-Zellen-Epitope oder B-Zellen-Epitope umfaßt. Das Peptid kann daher als Teil eines multivalenten Vaccins verwendet werden, welches cytotoxische T-Zellenantworten auf multiple HCV-Epitope oder auf HCV und andere Viren hervorruft. Zusätzlich kann das multivalente Vaccinpeptid T-Helferzellen- Epitope und B-Zellen-Epitope von HCV oder einem anderen Virus umfassen, um eine Antikörperantwort sowie eine cytotoxische T- Zellenantwort zu induzieren.
Beispielsweise könnte ein T-Helferzellen-Epitop von HIV daran gebunden werden, wie jenes, welches in Cease, K.B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4249-4253 (1987), beschrieben ist, um eine T-Zellen-Hilfe für die CTL-Antwort zu gewährleisten. Siehe auch Berzofsky, J.A. et al., J. Clin. Invest. 88:876-884 (1991); für Peptide, welche antivirale cytotoxische T-Lymphocyten ausbilden, Hart, M. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9448-9452 (1991); und für Peptide welche eine Antikörperantwort induzieren, Hart M.K. et al., J. Immunol 145:2677-2685 (1990).
Die Fachleute in der Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen werden erkennen wie diese Peptide und die Konjugate, welche vorstehend beschrieben sind, für die pharmazeutische Anwendung in annehmbare pharmazeutische Träger enthaltenden Zusammensetzungen herzustellen sind.

Grundprinzip eines Vaccins

HCV ist möglicherweise ein Mitglied der Flaviviridae-Familie, welche sowohl die klassischen Flaviviren wie das Gelbfiebervirus als auch die Pestiviren von Tieren wie auch das Virus der viralen Rinderdiarrhö umfaßt (11). Die klassischen Flaviviren besitzen arthropode Vektoren und rufen nur akute Erkrankungen hervor. Die Pestiviren andererseits besitzen keine bekannten arthropoden Vektoren und können sowohl chronische Infektionen als auch akute Erkrankungen hervorrufen. HCV verursacht akute, sich selbst beschränkende Infektionen, aber ähnlich den Pestiviren ruft es üblicherweise auch chronische Infektionen und Lebererkrankungen hervor, welche die chronische aktive Hepatitis, die Zirrhose und möglicherweise das hepatocelluläre Karzinom umfassen. Der Mechanismus des Chronisch-Seins und der Pathogenese der chronischen Lebererkrankung ist nicht klar. Es ist nicht wahrscheinlich, daß die chronische Virusinfektion direkt cytopathisch ist, da dies zu einer viel größeren Leberzerstörung führen würde. Es wurde daher wie bei Hepatitis B- Infektionen ein Immunmechanismus vorgeschlagen.
Die neutralisierenden Antikörper auf die meisten Flaviviren richten sich gegen Epitope im Hüllenglykoprotein. Entweder werden derartige Antikörper üblicherweise nicht von HCV infizierten Personen ausgebildet oder es ist noch kein Assay verfügbar, um diese zu detektieren. Die Ergebnisse der Sequenzanalyse der beiden vermuteten Hüllenglykoproteine von HCV haben beträchtliche Stammvariabilitäten gezeigt (23,27,67), welche Versuche zur Bereitstellung eines Antigens zur Induzierung neutralisierender Antikörper mit breiter Reaktivität weiter zunichte machen können.
Genauer ermöglichen vor kurzem veröffentlichte Berichte über die HCV-Sequenzdiversität einen Vergleich mehrerer Isolate (9,23,37,44,67), ein Überblick ist in (27) enthalten. Es ist erwähnenswert, daß die C-, NS3-, NS4- und NS5-Regionen von HCV eine größere Sequenzkonservierung zeigen, im Gegensatz zu der Hypervariabilität der vermeintlichen Hüllenglykoproteine, welche durch die E1 und E2/NS1 Gene codiert sind, und die größere Heterogenität von NS2. Diese Hypervariabilität des HCV-Hüllenproteins legt nahe, daß diese Region unter einem besonders selektiven Druck zur Variation eines schützenden B-Zellen- oder T-Zellen-Epitops sein kann, wie es im Fall der HIV-1 Hüllenprotein V3 Schleife vorgeschlagen wird, welche die prinzipielle neutralisierende Domäne sowie eine immunodominante Determinante für CTL sowohl beim Menschen als auch bei der Maus ist (10,21,46,53,57).
Die Hypervariabilität legt eine Fähigkeit dieses Virus nahe, dem Immunsystem durch schnelle Mutation zu entkommen. Innerhalb der Gruppe von Isolaten, welche durch Vergleich aller beschriebenen HCV-Sequenzen breit unterteilt ist, zeigt NS5 95% bis 100% Homologie (27). Die Variabilität ist auch hinsichtlich der mehrfachen Infektion mit verschiedenen HCV-Isolaten relevant. Eine vor kurzem durchgeführte Sequenzanalyse des HBV- Genoms aus plötzlich ausbrechender Hepapitis legte nahe, daß natürlich auftretende virale Mutationen den infizierten Wirt für schwerere Leberschäden prädisponieren können (34,45). Daher sind die Kreuzneutralisation von Varianten durch Antikörper und die Kreuzerkennung von Varianten durch T-Zellen wichtige Ziele in der Entwicklung von Vaccinen, um die Vermehrung von Mutanten, welche vom Immunsystem nicht wirksam bekämpft werden, zu verhindern.
Aus diesem Grund haben die Erfinder Untersuchungen zur Frage durchgeführt, ob T-Zellen-Epitope von HCV in der Pathogenese oder zum Schutz vor Infektionen wichtig sind, insbesondere T-Zellen-Epitope, welche von dem verhältnismäßig konservierten NS5-Protein dargestellt werden. Frühere Studien haben gezeigt, daß CD8&spplus; CTL&supmin; Hepatocyten von Patienten mit chronischer NANB- Hepatitis in einer Nicht-MHC restringierten Weise erkennt (28). Es wurde angenommen, daß CTL gegen durch Viren infizierte Zellen am häufigsten das Nucleoprotein der Viren erkennen, welches in den infizierten Zellen exprimiert wird, und die Zellen lysieren (52). Bei der Hepatitis B-Infektion wird beispielsweise angenommen, daß CTL für die Pathogenese der chronischen Hepatitis vom Typ B verantwortlich sind und durch Hepatitis B- Virus infizierte Hepatozyten durch Erkennen des viralen Antigens, welches in den infizierten Zellen exprimiert wird, lysiert (39,42).
Die Klasse I- und Klasse II-MHC-Moleküle ermöglichen es den T-Zellen, Polypeptidfragmente von Proteinen, welche der Verarbeitung von fremden Antigenen folgen, zu erkennen (4,51,55,61,70). Es sollte daher die Entwicklung von Peptiden möglich sein, welche T-Zellen-Epitope aufweisen, die jenen ähnlich sind, die auf durch eine Verarbeitung entstehenden Proteinfragmenten vorhanden sind. Synthetische Peptidvaccine, welche solche Epitope umfassen, können weniger schädliche Immunantworten hervorrufen als das vollständige Protein oder das abgeschwächte oder abgetötete Virus (6).
Die hierin beschriebenen experimentellen Ergebnisse, welche auf Studien unter Verwendung von Mäusen als Modell für das menschliche Immunsystem basieren, weisen darauf hin, daß CTL das Produkt des Gens der vermuteten HCV RNA-Polymerase, einer Nichtstrukturregion, in mit dem Virus infizierten Zellen in Verbindung mit Klasse I-MHC-Molekülen erkennen kann. Da Mäusezellen nicht durch HCV infiziert werden können, kann diese Annahme nicht direkt in HCV infizierten Mäusen überprüft werden. Dennoch bieten die vorliegenden Ergebnisse eine vernünftige Grundlage für die Annahme, daß das Peptid dieser Erfindung in vivo eine cytotoxische T-Zellenantwort gegen HCV NS5 infizierte Zellen in einem Säugetier hervorrufen wird. So hat das Peptid Mäuse-CTL-Linien mit der Fähigkeit produziert, syngenische Target-Zellen, welche das HCV NS5 exprimieren, sowie mit Peptid P17 (Reste 2422-2437 aus HCV NS5) behandelte Target-Zellen abzutöten.
Das Peptid induzierte eine CTL-Antwort bei Lymphocyten von H-2d Mäusen, aber nicht bei H-2b Mäusen, was darauf hinweist, daß H-2d ein Immunantwortgenresponder (Ir-Genresponder) vom Haplotyp gegenüber P17 ist, wogegen H-2b keinen Responder darstellt. Darüber hinaus ist die Antwort auf P17 von HCV NS5 sowohl von der al- als auch von der a2-Domäne der Dd Klasse I- Moleküle abhängig, wie es durch Antworten auf acht L-Zellen (H-2k) transfizierende Mittel mit verschiedenen Exon-Shuffles von Dd bis Ld gezeigt wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden für die wirksame Darstellung der Peptide P18 (58) und HP53 aus HIV-1 gp160 (56) erzielt. Im Zusammenhang mit der Vaccinentwicklung ist es von Interesse, daß P17 und die HIV-1-gp160 Peptide P18 und HPS3, welche alle von dem gleichen Dd Klasse I-MHC-Molekül dargestellt werden, keine offensichtliche Ähnlichkeit in den Sequenzen teilen, mit Ausnahme der Ähnlichkeit in den amphipatischen Hydrophobizitätsprofilen, wenn jedes als kurze, in höchstem Maße amphipatische α-Helix gefaltet ist. Obwohl keine ausreichende Homologie vorhanden ist, um ein offensichtliches Motiv für die Dd Bindung zu definieren, sollte die Analyse von Resten, welche in der Dd Bindung involviert sind (58), für jedes Peptid Licht auf die Strukturerfordernisse für die Dd Spezifität werfen.
Um die maximale Lysis zu erzielen, scheint die Peptidkonzentration, welche zur Stimulierung von CTL in vitro sekundär oder für die Sensibilisierung der Ziele erforderlich ist, für P17 sehr niedrig zu sein (0,1-1µM). Dieses Ergebnis weist darauf hin, daß sich P17 mit einer verhältnismäßig hohen Affinität an Klasse I-MHC-Moleküle in H-2d bindet, was in der Praxis ein wichtiges Charakteristikum eines Peptidimmunogens darstellt, beispielsweise zur Minimierung der Kosten pro Dosierung. P17 zeigte auch keine Toxizität, welche seine Wirksamkeit bei der CTL-Stimulierung oder seine Nützlichkeit in vivo beeinträchtigen könnte.
Die Verfügbarkeit von drei unterschiedlichen Sequenzen von HCV-Varianten (USA und Japan) dieses verhältnismäßig konservierten Epitops (26,29,60) erlaubte die Synthese von zwei Peptidvarianten dieser Erfindung, wovon sich jede in einem oder zwei Resten von der P17-Sequenz des Chiron-Isolats (26) unterscheidet, um die Wirkung von natürlich auftretender viraler Mutation auf die Peptiddarstellung durch das Dd Molekül und die CTL-Erkennung zu bestimmen. Die Substitution einer einzigen Aminosäure in Position 2424 (T-)S) und in Position 2431 (VTI) verringerte die CTL-Erkennung des Peptids P17 in BALB/c Mäusen nicht. Diese Punktmutationen, in welchen sich alle vier klonierten HCV-Isolate aus den USA und aus Japan unterscheiden, scheinen daher die Peptidwechselwirkung weder mit dem Dd Klasse I-MHC-Molekül noch mit dem T-Zellenrezeptor zu beeinflussen. Wenn menschliche CTL eine ähnliche Kreuzreaktivität für diese Stelle zeigt, kann dieses Peptid als ein CTL-Epitop für die Vaccinentwicklung nützlich sein, trotz der wenigen konservativen Substitutionen, die in der Natur gefunden werden.
Was die erwartete Wirksamkeit solch eines Vaccins betrifft, gibt es viele Hinweise darauf, daß CTL das Wachsen des Virus in Zellen, welche früher infiziert wurden, blockieren kann (17,28,39,42,47,48,63,66). In ähnlicher Weise wird angenommen, daß ein Vaccin, welches HCV spezifische CTL spaltet, vor HCV schützen kann. In der vorliegenden Arbeit wurde P17 aus der HCV NS5-Region durch Klasse I-MHC-Moleküle für CD8&spplus;CD4&supmin; CTL dargestellt. Die hohe Konservierung und die Kreuzreaktivität des Peptids P17 legt nahe, daß dieses Peptid als eine Komponente eines breitwirksamen Vaccins für HCV dienen kann, wenn dies auch bei menschlicher CTL der Fall ist.
In einer früheren Arbeit mit den HIV-1 Proteinen gp160 und diverser Transkriptase, wurden Epitope, welche von Mäuse-CTL erkannt wurden, auch von menschlichen CTL erkannt (10,24,57). Es wurde ein T-Zellen-Wachstum, aber keine Cytotoxizität als Antwort auf P17 Stimulation in einem chronisch infizierten Schimpansen beobachtet. Dieser Primat stellt das einzige bestätigte Tiermodell für durch HCV verursachte Hepatitis dar.
Ob die P17 Stelle durch eine Diversität von menschlichen Klasse I-MHC Allelen dargestellt wird und ob P17 auch durch Klasse II-MHC-Moleküle für die CD4&spplus; CTL dargestellt wird, wird gemäß den technikbekannten Verfahren ermittelt. Siehe beispielsweise Clerici, M.J., Imm. 146:2214-2219 (1991); Clerici et al., Nature 339:383-385 (1989). Diese Information wird nicht nur für die Vaccinentwicklung nützlich sein, sondern auch für die Analyse der Beweglichkeit von viralen Peptiden gegenüber bindenden MHC-Molekülen. Die Identifizierung von zur Bindung an MHC und dem T-Zellen-Rezeptor kritischen Aminosäuren im Peptid kann neue Informationen auf molekularer Basis liefern, um sowohl der HCV-Mutation als auch dem chronischen Charakter der HCV-Infektion zu entkommen.
Die folgenden Beispiele sind ausschließlich zu Veranschaulichungszwecken angeführt und schränken diese Erfindung in keiner Weise ein.

BEISPIEL 1

Konstruktion und Synthese von Peptiden, welche Kandidaten für T-Zellen-Epitope von Hepatitis C-Virus NS5-Protein umfassen

Peptidkonstruktion.

Basierend auf der Sequenz der NS5-Region eines HCV-Isolats, welches von Mitarbeitern der Chiron Corporation veröffentlicht wurde (26), hierin nachstehend als "Chiron HCV1 Sequenz" bezeichnet, wurde eine Reihe von 28 Peptiden synthetisiert, einschließlich einiger überlappender Peptide, welche einen Großteil der vermuteten HCV RNA-Polymerasesequenz abdeckt, welche durch die NS5 artige Region codiert wird. Die Peptidsequenzen wurden auf Basis ihrer Amphipatizität als potentielle T-Zellen-Epitope ausgewählt (12,13,15,35).
Das darauffolgende Sequenzieren der gesamten von der FDA isolierten NS5-Region des HCV, welche zur Konstruktion des rekombinanten Vaccinavirus verwendet wurde, zeigte, daß verglichen mit der veröffentlichten Chiron HCV1 Sequenz 13 von 28 Peptiden Mutationen in bis zu 3 Resten aufwiesen (FIG. 1A, SEQ ID NO. 8, 9, 10, 14, 15, 20, 21, 23, 26, 27, 28 und 31).

Peptidsynthese und Reinigung.

HCV NS5-Peptide wurden durch das in (25) beschriebene simultane Mehrfachpeptidverfahren der Festphasenpeptidsynthese in "Tee-Beuteln" mit Polypropylenmaschen hergestellt. Die Peptide wurden durch Umkehrphasenchromatographie in C18 Sep-Pak-Säulen (Waters Associates, Milford, MA) entsalzen und durch HP1C analysiert. Einige Peptide wurden mittels einer automatischen Peptidsynthesevorrichtung (Modell 430A; Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) unter Verwendung der t-Boc-Chemie hergestellt und durch HPLC gereinigt. Das Peptid HIV P18 wurde unter GMP Bedingungen von Peninsula Labs (Belmont, CA) hergestellt.

BEISPIEL 2

Identifizierung eines Peptids, welches eine cytotoxische T-Zellenantwort gegenüber Hepatitis C-Virus NS5-Protein exprimierenden Zellen hervorruft

Übersicht.

Um ein mögliches T-Zellen-Epitop von Hepatitis C-Virus NS5-Protein zu identifizieren, wurden die Peptide aus Beispiel 1 in BALB/c und in BALB/B Mäusen auf ihre Fähigkeit zur Bildung von für die HCV NS5-Region spezifischen CTL hin untersucht. Die Milzzellen von Mäusen, welche 4 Wochen zuvor mit dem NS5 exprimierenden rekombinanten Vacciniavirus (vHVC) (10&sup7; PFU i.v.) infiziert worden waren, wurden in vitro mit 4 µM Peptiden in Anwesenheit von IL-2 (Medium, welches 10 % Überstand von mit Con A stimulierten, aus Ratten gewonnenen kultivierten Lymphocyten enthielt) stimuliert.
Die BALB/c Mäuse, welche mit vHCV immunisiert worden waren, entwickelten CTL-Antworten gegenüber dem Peptid P17, aber nicht gegenüber irgendeinem der anderen Peptide (Fig. 1B). Da keine für die HCV-Region spezifischen, in Vaccinia klonierten Antikörper verfügbar waren, gibt es keinen direkten Hinweis für die Expression von Proteinsequenzen zu der Carboxy-terminalen Stelle von P17. Obwohl kein Hinweis darauf vorliegt, daß solche Sequenzen nicht exprimiert werden, ist es möglich, daß die fehlende Antwort auf die P17 folgenden Petide auf das Fehlen der Expression von Sequenzen Carboxy-terminal zu P17 zurückzuführen sein könnte.
Es ist auch möglich, daß negative Antworten in 11 der Peptide auf den Unterschieden zwischen den auf der veröffentlichten Sequenz basierenden Sequenzen und der Sequenz des HCV-Isolats, welche im Vacciniavirus geklont worden war, beruhen. Da diese und andere Gründe zu den negativen Antworten führen könnten, sind nur positive Antworten im Hinblick auf die Ermittlung, ob ein bestimmter Teil des NS5-Proteins ein T-Zellen-Epitop besitzt, welches eine CTL-Antwort gegenüber dem NS5-Protein hervorrufen kann, signifikant.
BALB.B (H-2b) Mäuse zeigten keine Antwort auf irgendeines der untersuchten Peptide. Es kann jedoch kein rekombinantes Vacciniavirus verwendet werden, um Milzzellen aus mit dem rekombinanten Mittel immunisierten Mäusen zu stimulieren, ohne eine für Vacciniavirus spezifische Antwort zu aktivieren, welche die Antwort auf das eingeführte Genprodukt überdeckt, wenn mit Vaccinia infizierte Ziele verwendet werden. Mit vHCV infizierte BALB.B Zellen, welches vHCV das gesamte NS5-Protein exprimiert, können daher nicht herangezogen werden, um zu überprüfen, ob BALB.B Mäuse auch auf andere HCV-Epitope antworten würden, welche nicht mit den vorliegenden Peptiden untersucht wurden.

Mäuse.

Die BALB/c Mäuse wurden von den Charles River Laboratories bezogen und die BALB.B Mäuse wurden in der eigenen Kolonie von Zuchttieren weitergezüchtet, die freundlicherweise von Dr. F. Lilly (Albert Einstein College of Medicine, New York) zur Verfügung gestellt wurden. Die verwendeten Mäuse waren 8 Wochen alt.

NS5 - Protein exprimierendes rekombinantes Vacciniavirus.

Die für die Aminosäuren 1959 bis 2872 codierende Region des HCV-Genoms, welche den Großteil der in Analogie zu den Flaviviren vorhergesagten NS5-Region darstellt, wurde im Vacciniavirus unter dem P7.5 Promotor, wie von Chakrabarti et al. (7) beschrieben, kloniert. Das entstehende rekombinante Vacciniavirus wurde als vHCV Nr. 3 bezeichnet. Die virale RNA von HCV wurde aus der Leberbiopsie eines Schimpansen, welcher mit dem H-Stamm von HCV akut infiziert war (FDA-Isolat des HCV/H (19)) extrahiert. Die RNA wurde revers transkribiert und durch die Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung eines spezifischen HCV-Primers wie zuvor beschrieben (9), verstärkt. Der 5'-Primer enthielt eine ATG-Sequenz an seinem 5'-Ende. Dieses PCR-Produkt wurde in die StuI-Stelle des pSC11ss-Transfervektors ligiert und anschließend im Vacciniavirus durch homologe Rekombinierung eingeführt. Das Vaccinia wurde in BS-C-1-Zellen verstärkt und zur Immunisierung der Mäuse verwendet, um HCV NS5 spezifische CTL zu bilden.
vSCA (rekombinantes Vacciniavirus, welches das Escherichia coli lacZ-Gen enthält) und vSC25 (rekombinantes Vacciniavirus, welches das HIV-1 IIIB gp160-Hüllenglykoprotein ohne weitere Struktur- oder Regulationsproteine von HIV enthält), welches von Dr. Bernard MOSS, NIAID, NIH, bereitgestellt wurde, sind beschrieben worden (7) und sie wurden als Kontrollvaccinia zur Immunisierung der Mäuse eingesetzt.

CTL-Bildung.

Die Mäuse wurden intravenös mit 10&sup7; PFU von rekombinantem Vacciniavirus immunisiert. Vier bis sechs Wochen später wurden die Immunmilzzellen (5x10&sup6;/ml in Kulturplatten mit 24 Vertiefungen in vollständigem T-Zellenmedium (CTM; 1:1- Gemisch von RPMI 1640 und EHAA-Medium mit 10 % FCS, 2mM L- Glutamin, 100U/ml Penicillin, 100 µm/ml Streptomycin und 5x10&supmin;&sup5; M 2-ME)) während 6 Tagen in vitro mit Peptiden und 10 % Con A Überstand enthaltendem Medium (Ratten-T-Zellen-Monoklon; Collaborative Research, Inc., Bedford, MA) restimuliert.
Die Lymphocyten wurden eher mit Peptiden als mit dem zur Immunisierung verwendeten rekombinanten Vacciniavirus restimuliert, da Versuche mit anderen Antigenen zeigten, daß die Restimulierung von rekombinanten Vaccinia-Immunmilzzellen mit rekombinantem Vacciniavirus zu einer überwiegenden Antwort auf das Vaccinia und zu Schwierigkeiten bei der Detektion schwächerer CTL-Antworten auf Peptide aus dem insertierten rekombinanten Gen führt. Dieses Problem trat jedoch, wie in Tabelle 1 (nachstehend) gezeigt, mit P17 nicht auf.
Logischerweise war es nicht zweckmäßig, ein Experiment durchzuführen, worin alle 28 Peptide zur Stimulierung einzelner Effektorpopulationen eingesetzt wurden. Es wurden daher Gemische von jeweils 3 Peptiden (4 µm) verwendet, um getrennte Populationen von Lymphocyten zu stimulieren. Jede resultierende Population von Effektor-Zellen wurde gegenüber den drei Peptiden in den entsprechenden Gemischen einzeln getestet. Die Stimulierung mit einem Gemisch aller Peptide, welche Kandidaten für T-Zellen-Epitope darstellen, wurde jedoch vermieden, um fehlende Stellen zu vermeiden, welche miteinander zur Bindung von MHC konkurrieren (20).
Die Erfahrung hat gezeigt, daß die Häufigkeit von Peptiden, welche an ein gegebenes Klasse I-Molekül binden, ausreichend gering ist, und daß die Häufigkeit des Auffindens eines Peptides, welches bei einer so geringen Konzentration von 4 µm konkurrieren kann, ausreichend gering ist, sodaß es unwahrscheinlich ist, daß eine positive Antwort aufgrund des Wettbewerbs zwischen zwei Peptiden aus einem Gemisch von drei Peptiden bei 4 µm übersehen würde. Ein derartiger Wettbewerb kann jedoch als eine von vielen möglichen Ursachen für negative Ergebnisse bei einigen der Peptide formal nicht ausgeschlossen werden.
Es wurden auch Langzeit-CTL-Linien durch wiederholte Stimulierung von Immunzellen in einem Medium gebildet, welches Ratten-IL-2 mit einer Kombination von 0,5-1 µM Peptid und syngenischen Milzzellen (2,5x10&sup6; Zellen/ml) enthielt, die mit Peptiden in einer Konzentration von 10 µM während 4 Stunden behandelt und anschließend bestrahlt wurden.

CTL-Assay.

Die cytolytische Wirksamkeit von in vitro sekundären CTL oder CTL-Linien wurde wie vorstehend beschrieben unter Verwendung eines 6-Stunden-Assays mit &sup5;¹Cr-markierten Zielen ermittelt (57,62). Zur Überprüfung der Peptidspezifität von CTL wurden Effektor-Zellen und &sup5;¹Cr-markierte Ziele mit verschiedenen Peptidkonzentrationen vermischt, oder die Effektor-Zellen wurden gemeinsam mit Peptid behandelten Zielen kultiviert. Die Prozent an spezifischer &sup5;¹Cr-Freisetzung wurden als 100 x [(experimentelle Freisetzung - spontaner Freisetzung)/(maximale Freisetzung - spontaner Freisetzung)] berechnet. Die maximale Freisetzung wurde aus Überständen von Zellen ermittelt, welche durch Zugabe von 5 % Triton-X 100 lysiert worden waren. Die spontane Freisetzung wurde aus Target-Zellen ermittelt, die ohne zugesetzte Effektor-Zellen inkubiert wurden. 18Neo (H-2d; Klasse I-MHC&spplus;, Klasse II-MHC&supmin;, Neomycin-Resistenzgen) transfizierte 3T3 Fibroblasten (57), L-Zellen (L28; H-2k) und ELA-Thymoma-Zellen (H.2b) wurden als Ziele eingesetzt.

BEISPIEL 3

Spezifität des T-Zellen-Epitops, welches eine cytotoxische T- Zellenantwort gegen Hepatitis C-Virus NS5-Protein exprimierende Zellen hervorruft

Identifizierung der Klasse von MHC-Molekülen, welche das Pedtid 17 darstellt.

Da Klasse II negative Fibroblast-Ziele zur Detektion von CTL verwendet wurden und die Lysis unter einer MHC gebundenen Kontrolle beschränkt war, wurde P17 wahrscheinlich durch Klasse I-MHC-Moleküle gegenüber den CTL in den Lymphocyten dargestellt, welche aus H-2d Mäusen entnommen wurden, die mit NS5-Protein exprimierenden Vacciniavirus immunisiert worden waren. Das fehlende Ansprechen der BALB.B (H-2b) Mäuse auf irgendwelche der untersuchten Peptide legt nahe, daß H-2b Klasse I-MHC-Moleküle dieses Peptid nicht darstellen können.

Kreuzreaktivität von natürlichen Sequenzvarianten des NS5 T-Zellen-Epitops.

Es wurde festgestellt, daß sich das FDA-Isolat (SEQ ID NO:2) von HCV, welches verwendet wurde, um das rekombinante Vaccinia vHCV herzustellen, in der P17-Sequenz (SEQ ID NO:1) von der Chiron HCV1 Sequenz (26) durch einen Rest unterscheidet, und daß es sich von einer japanischen Sequenz (SEQ ID NO:3), welche an dieser Stelle in zwei unabhängigen japanischen Isolaten konserviert worden war (29,60), durch einen einzigen weiteren Rest unterschied (Fig.1A SEQ ID NO. 1-3). Da Mäuse mit vHCV immunisiert wurden, welche die FDA-Sequenz exprimierten, aber die CTL mit Target-Zellen restimuliert und auf Target-Zellen untersucht wurden, welche mit dem P17-Peptid behandelt worden waren, welches gemäß der Chiron-Sequenz hergestellt wurde, wurde erwartet, daß die CTL mit diesen beiden Varianten von HCV kreuzreagieren.
Um diese Kreuzreaktivität direkt zu zeigen, wurden zwei P17-Peptidvarianten hergestellt, mit Aminosäure-Substitutionen in der Position 2425 und/oder 2431, entsprechend dem FDA-Isolat (P17FDA SEQ ID NO:2) und den japanischen Isolaten (P17JPN SEQ ID NO:3) (Fig. 1A SEQ ID NO. 2 UND 3). Die Antwort auf solche Peptidvarianten, welche sich in einem oder zwei Resten unterscheiden, würde die Wirkung von natürlich auftretender viraler Mutation auf die Peptiddarstellung durch die H-2d Klasse I-MHC- Moleküle und auf die Erkennung durch den T-Zellenrezeptor der NS5 spezifischen CTL bestimmen.
Die Spezifität von CTL für NS5 wurde auf dem Niveau einer Behandlung mit Lymphocyten in vivo, einer Restimulierung in vitro und einer Expression in den Target-Zellen im CTL-Assay gezeigt (Tabelle 1, unten). Nur das das NS5-Gen exprimierende rekombinante Vacciniavirus (vHCV), aber nicht die Kontroll- Vacciniaviren (vSC8, VSC25), prägte die Mäuse für die Entwicklung von für P17 oder P17-Varianten spezifischen CTL (Tabelle 1, unten). TABELLE 1 Behandlungs- und Verstärkungserfordernisse für die CTL-Induzierung in H-2d Mäusen
Spezieller wurde die Fähigkeit von rekombinanten Vacciniaviren zum Primen und Stimulieren von für die Produkte von insertierten viralen Genen spezifischen CTL verwendet, um für HCV NS5 spezifische CTL in BALB/c (H-2d) Mäusen zu bilden. Nichimmunisierte oder immunisierte Milzzellen wurden mit P17 oder P17-Varianten in einer Konzentration von 10 µM (oder bei den in Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen; 0,1 µm oder 1 µM P17), P18IIIB in einer Konzentration von 0,1 µM, oder Vaccinia (vHCV, vSC8 oder vSC25) restimuliert und gegen mit Vacciniavirus infizierten 18Neo, 18Neo behandelt mit P18IIIB in einer Konzentration von 1 µM (einer immunodominanten CTL-Stelle, 315- 329, von HIV-1 gp160 IIIB Isolat) und unbehandeltem 18Neo in Anwesenheit des P17-Peptids, der P17-Peptidvarianten (10 µM) oder ohne Peptid in einem E:T-Verhältnis von 100:1 getestet. Die Lysis ohne Peptid betrug < 4 %. Es wurde keine Toxizität von Peptiden gegenüber den Target-Zellen beobachtet. Die spontane Freisetzung betrug weniger als 20 % der maximalen Freisetzung. Die Abkürzungen in Tabelle 1 sind wie folgt: vHCV, rekombinantes Vacciniavirus, welches NS5 von HCV exprimiert; vSC8 und vSC2S, Kontrollvacciniavirus bzw. rekombinantes Vacciniavirus, welches HIV-1 gp160 exprimiert; 18Neo, BALB/c 3T3 Fibroblast, H-2d.
Die Titration der für die Stimulierung von immunisierten Milzzellen verwendeten Peptidkonzentrationen zeigte, daß die für P17 spezifische Lysis bei einer geringen Peptidkonzentration, 0,1 µM, induziert wurde (Tabelle 1). P17 benötigte ungefähr 1-10 µM Peptid für die Stimulierung von Immunmilzzellen, um das höchste Maß an Lysis gegenüber H-2-entsprechenden, Peptid behandelten Target-Zellen zu zeigen. P17, P17FDA und P17JPN waren sowohl für die CTL-Stimulierung als auch für die Sensibilisierung von Target-Zellen nahezu austauschbar (Tabelle 1). Es wurden ähnliche Ergebnisse in zwei unabhängigen Experimenten erzielt. Es wurde daher eine vollständige Kreuzreaktivität zwischen diesen Varianten beobachtet.
Langzeit-CTL-Linien, welche für P17 und P17FDA spezifisch waren, wurden durch wiederholte Stimulierung von Milzzellen von vHCV immunisierten Mäusen mit Peptid behandelten, bestrahlten syngenischen Milzzellen und IL-2 (Con A Überstand) erhalten (Fig. 2). Die mit P17 oder P17FDA (Position 2425, STT) stimulierten CTL-Linien zeigten jeweils eine im hohen Maße spezifische Lysis von Zielen bei jedem Peptid. In der Titrationsstudie sensibilisierten P17 und P17-Varianten Target-Zellen in ähnlichen Konzentrationen für die Lysis durch die CTL-Linien (zwischen 0,01 und 10 µM; Fig.2).
Das Ausmaß der Lysis erreichte ein Plateau in Gegenwart von jedem Peptid in Konzentrationen über 0,1 µM. Die maximal erzielbare Lysis mit P17 war vergleichbar mit der maximal erzielbaren Lysis mit zwei anderen P17-Varianten in ähnlichen Peptidkonzentrationen unter Verwendung der beiden verschiedenen Zellinien, welche für P17 und P17FDA spezifisch sind. Diese mutierten Reste haben daher die Größe der Antwort oder die Konzentrationsabhängigkeit nicht beeinflußt und die Peptide waren zur Gänze kreuzreaktiv. CTL, welche in vitro mit irgendeiner der drei Varianten des P17-Peptids stimuliert wurden, lysierten Target-Zellen in Anwesenheit aller drei P17-Peptidvarianten gleich gut (Tabelle 1).
Die konservativen Punktmutationen in der P17-Sequenz, in welchen sich die vier Klone von HCV unterschieden, die in den USA und in Japan isoliert wurden, haben daher weder die Peptidwechselwirkung mit H-2d Klasse I-MHC-Molekülen noch die Erkennung durch den T-Zellenrezeptor beeinflußt.

Erkennung von verarbeitetem NS5-Protein durch mit Peptid induzierten CTL.

Von den CTL-Linien, welche durch wiederholte in vitro Stimulierung mit Peptid gebildet wurden, wurde gezeigt, daß sie Target-Zellen, welche die verarbeiteten Produkte von endogen synthetisiertem NS5-Protein darstellen, und nicht nur das Peptid, erkennen. So waren durch H-2d (BALB/c) restringierte CTL-Linien fähig, die vHCV-infizierten syngenischen Target-Zellen (18Neo-Zellen, BALB/c 3T3 Fibroblasten, transfiziert mit dem Neomycin-Resistenzgen), welche endogen NS5 exprimieren, sowie die 18Neo-Zellen, welche mit P17 oder P17FDA behandelt worden waren, aber nicht die Kontroll-Target-Zellen, unbehandelte oder mit P18IIIB behandelte 18Neo, abzutöten (Fig.3).
Die mit den Peptiden dieser Erfindung hervorgerufene CTL- Antwort ist daher auch für Target-Zellen spezifisch, welche verarbeitete Produkte von endogen synthetisiertem NS5 darstellen, und nicht nur für exogene Peptide.

Identifizierung des T-Zellentyps durch Blockieren der CTL- Antwort mit Antiköpern.

Die Behandlung der für P17 spezifischen CTL-Zellinien mit anti-CDB-monoklonalem Antikörper, aber nicht mit Anti-CD4-Antikörpern, verringerte oder schwächte die cytotoxische Wirksamkeit gegenüber Target-Zellen ab (Fig. 4). Der Kulturüberstand von Hybridoma GKL.5 oder 2.43, welcher Anti-L3T4 (Anti-CD4, IgG2b (68) oder Anti-Lyt 2.2 (Anti-CD8 (54)) Antikörper enthält, wurde in die 96 Vertiefungen aufweisenden Platten des CTL-Assays in den angegebenen Konzentrationen zugesetzt.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Effektor-Zellen, welche P17 erkennen, herkömmliche CD8&spplus;CD4&supmin; (Lyt2&spplus;L3T4&supmin;) CTL sind. Für H-2d restringierte Peptid spezifische CTL-Linien in BALB/c, wurden 18Neo-Zellen, welche Klasse I, aber keine Klasse II-MHC Genprodukte exprimieren, als Target-Zellen verwendet. Es ist daher wahrscheinlich, daß diese H-2d restringierten CTL-Linien Klasse I-MHC restringiert sind, wie es für die Lyt2&spplus; CD8&spplus; Effektor-T-Zellen erwartet wird. Die für P17FDA spezifische Linie zeigte ähnliche Ergebnisse.

Identifizierung von miteinander in Wechselwirkung tretenden Domänen des MHC-Moleküls unter Verwendung von Exon-Shuffle- und Wildtyp Klasse I-transfizierenden Mitteln.

Transfizierende Mittel, welche Kd, Dd oder Ld-Moleküle exprimieren, wurden verwendet, um festzustellen, welches MHC-Molekül zur Darstellung von P17 im Zusammenhang mit H-2d spezifisch erforderlich war. Maus-L-Zellen-transfizierende Mittel mit Dd, Ld, oder Exon-Shuffles zwischen diesen sind zuvor beschrieben worden (18,36,38,40) und wurden von Dr. David Margulies, NIAID, erhalten. Das Kd exprimierende transfizierende Mittel wurde von Abastado et al. entwickelt (1) und wurde von Dr. Keiko Ozato (NICHD) erhalten. Alle transfizierenden Zellinien wurden durch FACS Analyse mit einer geeigneten Gruppe von anti-H-2Dd, anti- H-2Kd, und anti-H-2Ld mAbs untersucht, um deren exprimierten Phenotyp zu bestätigen, bevor hierin über die Durchführung der funktionellen Studien berichtet wurde.
Die Target-Zellen wurden mit dem angegebenen Peptid behandelt und gleichzeitig mit &sup5;¹Cr markiert. Von T37.2.1.(α1 α2 von Dd) und T4.8.3 (Dd) wurde festgestellt, daß sie P17 nahezu so gut wie die positiven Kontrollzellen (18Neo BALB/c 3T3 Fibroblasten) darstellen, welche alle drei H-2d Klasse I- MHC-Moleküle exprimieren (Figur 5). Weder Kd noch Ld noch irgendein anderes Dd/Ld Exon-Shuffle Klasse I-Molekül stellte P17 für die CTL dar.
Die α1- und die α2-Domäne waren daher beide erforderlich und gemeinsam ausreichend, um das Peptid dieser Erfindung darzustellen. Es wurde eine identische Restriktion für P17FDA erkennende CTL in BALB/c gefunden.

BEISPIEL 4

Provozieren einer Immunantwort auf NS5-Protein von Hepatitis C- Virus durch Verabreichen eines Peptids von Hepatitis C-Virus NS5-Protein an ein Säugetier

Formulierung eines Vaccins und Immunisierungsvorgang. Die Peptidimmunisierung mit synthetischen Peptiden zur Induzierung von CD8&spplus; CTL kann unter Verwendung von 50 - 100 µg Peptid in vollständigem oder unvollständigem Freund's Reagenz gemäß den Verfahren von Aichele, P. et al., J. Exp. Med. 171:1815-1820 (1990), oder Kast, W.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2283-2287 (1991), oder in Milzzellen durch das Verfahren von Harty, J.T. et al., J. Exp. Med. 175:1531-1538 (1992), durchgeführt werden. Schutz gegen virale oder bakterielle Infektionen kann durch CTL erzielt werden, welche durch einen dieser Immunisierungsprozesse induziert wurden.
Es wird den Fachleuten klar sein, daß verschiedene Modifizierungen und Variationen am Erfindungsgegenstand und den Verfahren dieser Erfindung durchgeführt werden können. Es ist daher beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung die Modifikationen und Variationen dieser Erfindung umfaßt, vorausgesetzt, daß sie im Rahmen der nachstehenden Ansprüche und deren Äquivalente liegen.
Zum Zweck der Vervollständigung der Grundlagenbeschreibung und der vorliegenden Offenbarung sind alle veröffentlichten Artikel, Patente und Patentanmeldungen, welche vorstehend in dieser Beschreibung identifiziert ist, hierbei zur Gänze durch Bezugnahme in der Beschreibung aufgenommen.
Es wurden die folgenden Dokumente in der Beschreibung zitiert, welche durch Einfügung der folgenden Referenznummern in Klammer angegeben sind.
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SEQUENZLISTE

(1) Allgemeine Information:

(i) Anmelder: Berzofsky, Jay A. Shirai, Mutsunori Akatsuka, Toshitaka Feinstone, Stephen M.
(ii) Titel der Erfindung: Peptide for stimulation of cytotoxic T lymphocytes specific for hepatitis C virus
(iii) Zahl der Sequenzen: 30
(iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adressat: Foley & Lardner
(B) Straße: 3000 K Street, N.W., Suite 500
(C) Stadt: Washington, D.C.
(E) Land: USA
(F) ZIP: 20007-5109
(v) Computer-lesbare Form
(A) Medium Typ: Floppy Disk
(B) Computer: IBM PC kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn Release Nr.1.0 Version Nr.1.25
(vi) Vorliegende Anmeldungsdaten
(A) Anmeldenummer: PCT (unbekannt)
(B) Anmeldetag:
(C) Klassifikation
(vii)Daten einer früheren Anmeldung
(A) Anmeldenummer: US 07/894,063
(B) Anmeldetag: 10. Juni 1992
(viii) Information über Anwalt/Vertreter
(A) Name: Bent, Stephen A.
(B) Registrierungsnummer: 29,768
(C) Referenz/Akten-Nummer: 40399/162/NIHD
(ix) Telekommunikationsinformation
(A) Telefon: (202)672-5300
(B) Telefax: (202)672-5399

(2) Information für SEQ ID NO. 1:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 16 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 1:

(2) Information für SEQ ID NO. 2:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 16 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 2:

(2) Information für SEQ ID NO. 3:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 16 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 3

(2) Information für SEQ ID NO. 4:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 4

(2) Information für SEQ ID NO. 5:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 5

(2) Information für SEQ ID NO. 6:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 6

(2) Information für SEQ ID NO. 7:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 7

(2) Information für SEQ ID NO. 8:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ix) Merkmal:
(A) Name/Kennwort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 12
(C) Weitere Information: /note= "Xaa in Position 12 kann Gln oder Arg sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Kennort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 20
(C) Weitere Information: /note= "Xaa in Position 20 kann Thr oder Ser sein"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 8:

(2) Information für SEQ ID NO. 9:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ix) Merkmal:
(A) Name/Kennwort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 15
(C) Weitere Information: /note= "Xaa in Position 15 kann Thr oder Ser sein"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 9:

(2) Information für SEQ ID NO. 10:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ix) Merkmal:
(A) Name/Kennwort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 4
(C) Weitere Information: /note "Xaa in Position 4 kann Val oder Ile sein"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 10:

(2) Information für SEQ ID NO. 11:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 11:

(2) Information für SEQ ID NO. 12:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 16 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 12:

(2) Information für SEQ ID NO. 13:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 15 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 13:

(2) Information für SEQ ID NO. 14:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ix) Merkmal:
(A) Name/Kennwort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 3
(C) Weitere Information: /note= "Xaa in Position 3 kann Ala oder Glu sein"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 14:

(2) Information für SEQ ID NO. 15:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ix) Merkmal:
(A) Name/Kennwort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 1
(C) Weitere Information: /note= "Xaa in Position 1 kann Ala oder Glu sein"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 15:

(2) Information für SEQ ID NO. 16:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 16:

(2) Information für SEQ ID NO. 17:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 15 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 17:

(2) Information für SEQ ID NO. 18:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 18 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 18:

(2) Information für SEQ ID NO. 19:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 21 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 19:

(2) Information für SEQ ID NO. 20:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ix) Merkmal:
(A) Name/Kennwort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 2
(C) Weitere Information: /note "Xaa in Position 2 kann Ala oder Val sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Kennwort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 20
(C) Weitere Information: /note= "Xaa in Position 20 kann Asn oder Ser sein"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 20:

(2) Information für SEQ ID NO. 21:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ix) Merkmal:
(A) Name/Kennwort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 3
(C) Weitere Information: /note= "Xaa in Position 3 kann Thr oder Ala sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Kennwort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 16
(C) Weitere Information: Inote "Xaa in Position 16 kann Asn oder Ser sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Kennwort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 17
(C) Weitere Information: inote "Xaa in Position 17 kann Val oder Phe sein"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 21:

(2) Information für SEQ ID NO. 22:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 16 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 22:

(2) Information für SEQ ID NO. 23:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 15 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ix) Merkmal:
(A) Name/Kennwort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 8
(C) Weitere Information: /note= "Xaa in Position 8 kann Thr oder Ser sein"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 23:

(2) Information für SEQ ID NO. 24:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 16 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 24:
C2) Information für SEQ ID NO. 25:
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 19 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 25:

2) Information für SEQ ID NO. 26:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 16 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ix) Merkmal:
(A) Name/Kennwort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 3
(C) Weitere Information: /note "Xaa in Position 3 kann Cys oder Arg sein"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 26:

2) Information für SEQ ID NO. 27:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ix) Merkmal:
(A) Name/Kennwort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 14
(C) Weitere Information: /note= "Xaa in Position 14 kann Ala oder Val sein"
(xi) Merkmal:
(A) Name/Kennwort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 20
(C) Weitere Information: /note= "Xaa in Position 20 kann Ala oder Val sein"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 27:

(2) Information für SEQ ID NO. 28:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ix) Merkmal:
(A) Name/Kennwort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 12
(C) Weitere Information: /note= "Xaa in Position 12 kann Ala oder Val sein"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 28:

(2) Information für SEQ ID NO. 29:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 13 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 29:

(2) Information für SEQ ID NO. 30:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 15 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ix) Merkmal:
(A) Name/Kennwort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 4
(C) Weitere Information: Inote "Xaa in Position 4 kann Gly oder Ala sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Kennwort: modifizierte Stelle
(B) Stellung: 12
(C) Weitere Information: /note= "Xaa in Position 12 kann Leu oder Val sein"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 30:

Claims

1. Peptid, das ein erstes Segment aus wenigstens 8 aufeinanderfolgenden Resten aus einer Sequenz umfaßt, die aus der MSYSWTGALVTPCAAE CSEQ ID NO.1), MSYTWTGALVTPCAAE (SEQ ID NO.2) und MSYTWTGALITPCAAE (SEQ ID NO.3) bestehenden Gruppe ausgewählt ist, sodaß dieses Segment ein T-Zellen- Epitop ist, das eine cytotoxische T-Zellenantwort in Säugetierlymphocyten gegen Zellen induziert, die das Hepatitis C-Virus NS5-Protein exprimieren, wobei das Peptid eine Länge von wenigstens 8 Resten und weniger als 50 Resten aufweist.

2. Peptid nach Anspruch 1, das weiterhin ein zweites Segment umfaßt, das ein anderes T-Zellen-Epitop ist.

3. Peptid nach Anspruch 1, das weiterhin ein zweites Segment umfaßt, das ein B-Zellen-Epitop ist.

4. Peptid nach Anspruch 1, das weiterhin an einem Terminus des Peptids einen Linker und, fixiert an den Linker, eine Substanz umfaßt, die aus der aus einem Label, einer festen Matrix und einem Träger bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

5. Peptid nach Anspruch 1, das weiterhin ein mit dem Peptid konjugiertes Mittel umfaßt, das eine Immunantwort provoziert.

6. Verfahren zum Detektieren von cytotoxischen T-Zellen in Säugetierlymphocyten, welche T-Zellen auf ein T-Zellen- Epitop des NS5-Proteins von Hepatitis C-Virus ansprechen, welches Verfahren folgende Stufen umfaßt:

a) Kontaktieren von Target-Zellen mit einem Peptid nach Anspruch 1, wobei die Target-Zellen mit den auf die cytotoxischen T-Zellen zu testenden Lymphocyten MHC- kompatibel sind;

b) Kontaktieren der auf die cytotoxischen T-Zellen zu testenden Lymphocyten mit einem Peptid nach Anspruch 1; und

(c) Bestimmen, ob die Lymphocyten auf die Target-Zellen einen cytotoxischen Effekt ausüben, wodurch das Vorliegen von Lymphocyten angezeigt wird, die ein T- Zellen-Epitop des NS5-Proteins von Hepatitis C-Virus erkennen.

7. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Medikaments zum Hervorrufen einer Immunantwort in einem Säugetier auf das NS5-Protein von Hepatitis C-Virus, wenn das Medikament in einer Menge verabreicht wird, die zum Induzieren einer cytotoxischen T- Zellenantwort gegen Zellen wirksam ist, die das Hepatitis C-Virus NS5-Protein exprimieren.