CN101146785A - 靶向于兰诺定受体(ryr2)渗漏的新的抗心律失常和心力衰竭药物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新的1，4－苯并硫氮杂类中间体和衍生物，合成该物质的方法，和分析该物质的方法。本发明也提供一种使用这些新化合物限制或预防患者与RyR2结合的FKBP12.6的水平下降；预防患者运动－诱导的心源性猝死；和治疗或预防患者心力衰竭、心房纤颤或运动诱导的心律失常。本发明进一步提供鉴定增强RyR2和FKBP12.6结合的试剂的方法，和通过这些方法鉴定的试剂。此外，本发明提供鉴定用于治疗或预防心力衰竭、心房纤颤或运动诱导的心律失常以及预防运动诱导的心源性猝死的试剂的方法。还提供了通过这些方法鉴定的试剂。

Description

靶向于兰诺定受体(RYR2)渗漏的新的抗心律失常和心力衰竭药物
相关申请的交叉参考
本申请要求2005年3月23日提交的U.S.临时专利申请号(还未指定)的优先权；后者要求2004年1月22日提交的U.S.连续部分专利申请序列号10/763,498的优先权；10/763,498要求2003年10月7日提交的U.S.连续部分专利申请序列号10/680,988的优先权；10/680,988要求2003年6月26日提交的U.S.连续部分专利申请序列号10/608,723的优先权；10/608,723要求2002年11月5日提交的U.S.连续部分专利申请序列号10/288,606的优先权；10/288,606要求2000年5月10日提交的U.S.专利申请序列号09/568,474，现在是2002年12月3日公布的U.S.6,489,125B1的优先权；将其内容通过参考引入本文。
政府利益的声明
本发明是在NIH Grant No.PO 1 HL 67849-01的政府支持下完成的。这样美国政府在本发明中享有一定的权利。
发明背景
尽管治疗不断发展，但充血性心力衰竭仍然是西方国家死亡率的重要原因。心力衰竭仅在美国就影响了5百万人，特征在于5年死亡率为～50％(Levy等人，Long-term trends in the incidence of andsurvival with heart failure.N.Engl.J.Med.，347：1397-402，2002)。心力衰竭的重要标志是心肌收缩力降低(Gwathmey等人，Abnormal intracellular calcium handling in myocardium frompatients with end-stage heart failure.Circ.Res.，61：70-76，1987)。
在健康的心肌和其他横纹肌中，肌质网(SR)上的钙释放通道包括ryanodine受体(RyRs)促进了动作电位与肌细胞收缩的偶合(即，兴奋-收缩(EC)偶合)。当钙(Ca2+)从SR中释放到周围的细胞质中时开始收缩。在心力衰竭中，异常收缩至少部分是由于信号级联的改变，这使得心脏的动作电位触发了收缩。特别地，在衰竭的心脏中，全细胞的Ca2+暂态过程的幅度降低(Beuckelmann等人，Intracellular calciumhandling in isolated ventricular myocytes from patients withterminal heart failure.Circ，85：1046-55，1992；Gomez等人，Defective excitation-contraction coupling in experimentalcardiac hypertrophy and heart failure.Science，276：800-06，1997)，持续时间延长(Beuckelmann等人，Intracellular calciumhandling in isolated ventricular myocytes from patients withterminal heart failure.Circ，85：1046-55，1992)。
心率失常是心力衰竭的一个常见特征，会导致许多与该疾病有关的死亡。心房纤颤(AF)是人最常见的心律失常，代表了发病率和死亡率的主要原因(Chugh等人，Epidemiology and natural history ofatrial fibrillation：clinical implications.J Am.Coll.Cardiol，37：371-78，2001；Falk，R.H.，Atrial fibrillation.N.Engl.J.Med.，344：1067-78，2001)。尽管AF在临床上是重要的，但该心律失常的分子机制还未能了解，且治疗选择十分有限。
已经很好地确定了结构和电重塑—包括心房不应性的缩短、不应性的频率相关的适应的缺失(Wijffels等人，Atrial fibrillationbegets atrial fibrillation：a study in awake chronicallyinstrumented goats.Circulation，92：1954-68，1995；Morillo等人，Chronic rapid atrial pacing：structural，functional，andelectrophy siological characteristics of a new model ofsustained atrial fibrillation.Circulation，91：1588-95，1995；Elvan等人，Pacing-induced chronic atrial fibrillation impairssinus node function in dogs：electrophysiological remodeling.Circulation，94：2953-60，1996；Gaspo等人，Functionalmechanisms underlying tachycardia-induced sustained atrialfibrillation in a chronic dog model.Circulation，96：4027-35，1997)，伴随持续心动过速的折返子波的波长缩短(Rensma等人，Length of excitation wave and susceptibility to reentrantatrial arrhythmias in normal conscious dogs.Circ.Re s.，62：395-410，1988)。该重塑在心房纤颤的发生、维持和发展中可能是重要的。
先前的研究表明，钙处理可以在心房纤颤的电重塑中发挥作用(Sun等人，Cellular mechanisms of atrial contractiledysfunction caused by sustained atrial tachycardia.Circulation，98：719-27，1998；Goette等人，Electricalremodeling in atrial fibrillation：time course and mechanisms。Circulation，94：2968-74，1996；Daoud等人，Effect of verapamiland procainamide on atrial fibrillation-induced electricalremodeling in humans.Circulation，96：1542-50，1997；Yu等人，Tachycardia-induced change of atrial refractory period inhumans：rate dependency and effects of antiarrhythmic drugs。Circulation，97：2331-37，1998；Leistad等人，Atrial contractiledysfunction after short-term atrial fibrillation is reduced byverapamil but increased by BAY K8644.Circulation，93：1747-54，1996；Tieleman等人，Verapamil reduces tachycardia-inducedelectrical remodeling of the atria.Circulation，95：1945-53，1997)。但是，在心房纤颤期间RyR2的调节还未有报道。
所有心脏病患者中约有50％死于致命性的心律失常。在一些情况中，心脏的室律不齐可以快速致命—该现象称作“心源性猝死”(SCD)。年轻人、其他还未知道有结构性心脏病的健康人也可以发生致命性室律不齐(和SCD)。事实上，室率不齐是其他健康人突然死亡的最常见的原因。
儿茶酚胺性多形性室性心动过速(CPVT)是具有结构正常的心脏的患者的遗传性疾病。其特征在于应激-诱导的室性心动过速—一种可以导致SCD的致命性心律失常。在患CPVT的患者中，强体力活动和/或应激诱导了双向的和/或多形性室性心动过速，这会在没有可检测的结构性心脏病的情况下导致SCD(Laitinen等人，Mutations of thecardiac ryanodine receptor(RyR2)gene in familial polymorphicventricular tachycardia.Circulation，103：485-90，2001；Leenhardt等人，Catecholaminergic polymorphic ventriculartachycardia in children：a 7-year follow-up of 21 patients.Circulation，91：1512-19，1995；Priori等人，Clinical andmolecular characterization of patients with catecholaminergicpolymorphic ventricular tachycardia.Circulation，106：69-74，2002；Priori等人，Mutations in the cardiac ryanodine receptorgene(hRyR2)underlie catecholaminergic polymorphicventricular tachycardia.Circulation，103：196-200，2001；Swan等人，Arrhythmic disorder mapped to chromosome Iq42-q43causes malignant polymorphic ventricular tachycardia instructurally normal hearts.J.Am.Coll.Cardiol，34：2035-42，1999)。
CPVT主要是常染色体显性型遗传的。当在运动而非休息时发生心律失常时，患CPVT的个体具有室性心率失常。连接研究和直接测序法已经在CPVT患者的人RyR2基因、染色体Iq42-q43中鉴定了突变(Laitinen等人，Mutations of the cardiac ryanodinereceptor(RyR2)gene in familial polymorphic ventriculartachycardia.Circulation，103：485-90，2001；Priori等人，Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene(hRyR2)underlie catecholaminergic polymorphic ventriculartachycardia.Circulation，103：196-200，2001；Swan等人，Arrhythmic di sorder mapped to chromosome Iq42-q43causesmalignant polymorphic ventricular tachycardia in structurallynormal hearts.J.Am.Coll.Cardiol，34：2035-42，1999)。
有三种类型的ryanodine受体，它们都是高度相关的Ca2+通道：RyR1、RyR2和RyR3。在骨骼肌中发现了RyR1，在心脏中发现了RyR2，RyR3位于脑中，2型兰诺定受体(RyR2)是心脏横纹肌的EC偶合和肌肉收缩需要的主要Ca2+-释放通道。
在释放细胞内Ca2+贮存的SR的特定区域，RyR2通道被包裹成稠密排列，由此触发肌肉收缩(Marx等人，Coupled gating betweenindividual skeletal muscle Ca2+ release channels(r yanodinereceptors).Science，281:818-21,1998)在EC偶合期间，在动作电位的0相下心肌细胞膜的去极化激活了电压门控Ca2+通道，接着经RyR2，以已知称作Ca2+诱导的Ca2+释放的方法，Ca2+流动通过这些通道引发了Ca2+从SR中的释放(Fabiato，A.，Calcium-induced release ofcalcium from the cardiac sarcoplasmic reticulum.Am.J.Physiol，245:C1-C14,1983；Nabauer等人.，Regulation of calcium releaseis gated by calcium current，not gating charge，in cardiacmyocytes.Science，244:800-03，1989)。然后RyR2-介导的、Ca2+-诱导的Ca2+释放激活了负责心肌收缩的收缩蛋白。
RyR2是一种蛋白复合物，包含4个565,000-道尔顿的RyR2多肽并与4个12,000-道尔顿的FK506结合蛋白(FKBPs)、特别是FKBP12.6(calstabin)连接。FKBPs是顺-反式肽基-脯氨酰异构酶，其被广泛地表达，并发挥不同的细胞功能(Marks，A.R.，Cellular functions ofimmunophilins.Physiol.Rev.，76：631-49，1996)。FKBP12蛋白紧密地连接到下列受体上，并调节其功能：骨骼ryanodine受体RyR1(Brillantes等人，Stabilization of calcium release channel(ryanodine receptor)function by FK506-binding protein.Cell，77:513-23,1994；Jayaraman等人，FK506 binding proteinassociated with the calcium release channel(ryanodinereceptor).J.Biol.Chem.，267：9474-77，1992)；心脏兰诺定受体，RyR2(Kaftan等人，Effects of rapamycin on ryanodinereceptor/Ca(2+)-release channels from cardiac muscle.Circ.Res.，78：990-97，1996)；相关的细胞内Ca2+-释放通道，即I型肌醇1，4，5-三磷酸受体(IP3R1)(Cameron等人，FKBP 12 binds theinositol 1，4，5-trisphosphate receptor at leucine-proline(1400-1401)and anchors calcineurin to this FK506-like domain.J Biol.Chem.，272：27582-88，1997)；和I型转化生长因子β(TGFβ)受体(TβRI)(Chen等人，Mechanism of TGF beta receptorinhibition by FKBP12.EMBO J，16：3866-76，1997)。FKBP12.6结合到RyR2通道上(每个RyR2亚单元一个分子)，稳定RyR2-通道的功能(Brillantes等人，Stabilization of calcium release channel(ryanodine receptor)function by FK506-binding protein.Cell，77：513-23，1994)，并促进相邻RyR2通道之间的偶合门控(Marx等人，Coupled gating betweenind ividual skeletal muscle Ca2+ releasechannel(ryanodine receptors).Science，281：818-21,1998)，因此防止了在心动周期的静止期期间通道的异常活化。
通过蛋白激酶(PKA)进行的心脏RyR2的磷酸化是“斗争或逃跑”应答的重要部分，其通过增加对于给定触发剂释放的Ca2+的量增加心脏EC的偶合增益(Marks，A.R.，Cardiac intracellular calciumrelease channels：role in heart failure.Circ.Re s.，87:8-11，2000)。该信号通道提供了一种机制，通过该机制激活了交感神经系统，对应激应答，导致了满足应激应答的代谢需要所需要的心脏输出的增加。当与儿茶酚胺类结合时，β1-和32-肾上腺素能受体通过刺激G-蛋白，Gαs激活了腺苷酸环化酶。腺苷酸环化酶提高了细胞内cAMP水平，从而激活了cAMP-依赖性PKA。RyR2的PKA磷酸化通过从通道复合物中解离calstabin2(FKBP12.6)而增加通道的开放概率。这样，接着提高了RyR2对Ca2+-依赖性激活的敏感性(Hain等人，Phosphorylation modulates the function of the calcium releasechannel of sarcoplasmic reticulum from cardiac muscle.J BiolChem.，270：2074-81,1995；Valdivia等人，Rapid adaptation ofcardiac ryanodine receptors：modulation by Mg2+ andphosphorylation.Science，267：1997-2000,1995；Marx等人，PKAphosphorylati on dissociates FKBP12.6 from the calcium releasechannel(ryanodiner eceptor)：defective regulation in failinghearts.Cell，101：365-76,2000)。
衰竭的心脏(例如，心力衰竭的患者和心力衰竭的动物模型)的特征是包括慢性过度肾上腺素能刺激的不适当的应答(Bristow等人，Decreased catecholamine sensitivity andbeta-adrenergic-receptor density in failing human hearts.N.Engl.J.Med，307:205-11,1982)。在心力衰竭中该刺激的病原性意义得到了治疗策略的支持，所述治疗策略是减少β肾上腺素刺激和左心室心肌壁应激，和有效地逆转心室重塑(Barbone等人，Comparison of right and left ventricular responses to leftventricular assist device support in patients with severe heartfailure：a primary role of mechanical unloading underlyingreverse remodeling.Circulation，104：670-75,2001；Eichhorn和Bristow，Medical therapy can improve the biologicalproperties of the chronically failing heart.A new era in thetreatment of heart failure.Circulation，94：2285-96,1996)。在心力衰竭中，慢性β肾上腺素刺激与心脏中β肾上腺素受体的激活有关，其通过与G-蛋白偶合，激活腺苷酸环化酶，并因此提高了细胞内cAMP的浓度。CAMP激活cAMP-依赖性PKA，其已经显示可以诱导RyR2的超磷酸化(hyperphosphorylation)。因此，慢性心力衰竭是一种慢性过度肾上腺素能状态(Chidsey等人，Augmentation of plasmanorepinephrine response to exercise in patients with congestiveheart failure.N.Engl.J.Med.，267：650,1962)，其导致了数种病理学后果，包括RyR2的PKA超磷酸化(Marx等人，PKAphosphorylation dissociates FKBP12.6from the calcium releasechannel(ryanodine receptor)：defective regulation in failinghearts.Cell，101：365-76,2000)。
已经提出，RyR2的PKA超磷酸化是一种促成心力衰竭中收缩功能降低和心律失常发生的因素(Marks等人，Progression of heartfailure：is protein kinase a hyperphosphorylation of theryanodine receptor a contributing factor？Circulation，105：272-75，2002；Marx等人，PKA phosphorylation dissociatesFKBP 12.6 from the calcium release channel(ryanodine receptor)：defective regulation in failing hearts.Cell，101：365-76,2000)。与该假说相符合，已经在体内动物模型和经历心脏移植的心力衰竭的患者中证实了在衰竭的心脏中RyR2的PKA超磷酸化(Antos等人，Dilated cardiomyopathy and sudden death resulting fromconstitutive activation of protein kinase A.Circ.Res.，89:997-1004,2001；Marx等人，PKA phosphorylation dissociatesFKBP12.6from the calcium release channel(ryanodine receptor)：defective regulation in failing hearts.Cell，101：365-76,2000；Ono等人，Altered interaction of FKBP12.6with ryanodinereceptor as a cause of abnormal Ca2+ release in heart failure.Cardiovasc.Res.，48：323-31，2000；Reiken等人，Beta-adrenergicreceptor blockers restore cardiac calcium release channel(ryanodine receptor)structure and function in heart failure.Circulation，104：2843-48，2001；Semsarian等人，The L-typecalcium channel inhibitor diltiazem prevents cardiomyopathy ina mouse mode l.J.Clin.Invest.，109：1013-20，2002；Yano等人，Altered stoichiometry of FKBP12.6versus ryanodine receptoras a cause of abnormal Ca2+leak through ryanodine receptor inheart failure.Circulation，102：2131-36，2000)。
在衰竭的心脏中，RyR2的PKA超磷酸化导致了调节性FKBP12.6亚单元从RyR2通道中解离(Ma rx等人，PKA phosphorylationdissociates FKBP 12.6 from the calcium release channel(ryanodine receptor)：defective regulation in failing hearts。Cell，101：365-76，2000)。这导致了RyR2通道的生物物理学性质的显著改变。这些改变可以通过下列事实得到证实：由于对Ca2+-依赖性激活的敏感度增加而开放几率(Po)提高(Brillantes等人，Stabilization of calcium release channel(ryanodine receptor)function by FK506-binding protein.Cell，77:513-23，1994；Kaftan等人，Effects of rapamycin on ryanodine receptor/Ca2+-release channels from cardiac muscle.Circ.Res.，78：990-97，1996)；通道去稳定化，导致亚电导状态(subcouductance)；和修复了通道的偶合门控，导致不完全的EC偶合和心脏机能障碍(Marx等人.，Coupled gating between individual skeletal muscle Ca2+release Channels(ryanodine receptors).Science，281：818-21，1998)。因此，PKA-超磷酸化的RyR2对于低水平的Ca2+刺激是非常敏感的，这表明它们本身是通过超磷酸化通道的SR Ca2+渗漏。
在心力衰竭中对应激的不适当的应答导致从通道大分子复合物中FKBP12.6的排空。这导致RyR2对Ca2+-诱导的Ca2+释放的敏感性的向左位移，产生了对低度到中度[Ca2+]更为有效的通道(Marx等人，PKAphosphorylation dissociates FKBP 12.6 from the calcium releasechannel(ryanodine receptor)：defective regulation in failinghearts.Cell，101：365-76，2000；Yamamoto等人，Abnormal Ca2+release from cardiac sarcoplasmic reticulum intachycardia-induced heart failure.Cardiovasc.Res.，44：146-55，1999；Yano等人，Altered stoichiometry of FKBP12.6versusryanodine receptor as a cause of abnormal Ca2+leak throughryanodine receptor in heart failure.Circulation，102：2131-36，2000)。随着时间的过去，通过RyR2的增强的“渗漏”导致了SR Ca2+含量恢复到较低的水平，接着降低了EC偶合增益并有助于修复的心脏收缩期的收缩性(Marx等人，PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6from the calcium release channel(ryanodine receptor)：defective regulation in failing hearts.Cell，101：365-76，2000)。
此外，特别是“渗漏”的RyR2亚群可以在心动周期的静止期期间，即舒张期释放SR Ca2+。这导致心肌细胞膜去极化，即称作延迟后除极(DADs)，已知其会触发致命的心室性心律失常(Wehrens等人，FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel(ryanodine receptor)function linked to exercise-inducedsudden cardiac death.Cell，113：829-40，2003)。
在结构正常的心脏中，可以发生类似的现象。特别地，已知运动和应激诱导儿茶酚胺类的释放，所述儿茶酚胺类激活心脏中的β-肾上腺素能受体。β-肾上腺素能受体的激活导致了RyR2通道的超磷酸化。证据也表明，由β-肾上腺素能受体激活而导致的RyR2的超磷酸化产生了突变的RyR2通道，其在心动周期的舒张期更可能是开放的，增加了心律失常的可能性。
已知在结构正常的心脏中，心律失常与SR Ca2+渗漏有关。在这些情况中，诱导和维持室性心动过速的最常见机制是自主性异常。一种形式的自主性异常称作触发性心律失常，与SR Ca2+的异常释放有关，其引发了DADs(Fozzard，H.A.，After depolarizations andtriggered activity.Basic Res.Cardiol.，87：105-13，1992；Wit和Rosen，Pathophysiologic mechanisms of cardiac arrhythmias。Am.Heart J，106：798-811，1983)。DADs是心肌细胞的异常去极化，其在心脏动作电位复极化后发生。导致DADs的异常SR Ca2+释放的分子基础还没有完全阐明。但是已知DADs可以被兰诺定阻断，提供的证据是RyR2可以在异常Ca2+释放的发病中发挥关键作用(Marban等人，Mechanisms of arrhythmogenic delayed and earlyafterdepolarizations in ferret ventricular muscle.J Clin.Invest.，78:1185-92，1986；Song和Belardinelli，ATP promotesdevelopment of afterdepolarizations and triggered activity incardiac myocytes.Am.J.Physiol，267：H2005-11，1994)。
基于上述观点，清楚地表明，RyR2通道中的渗漏与很多—不论是在病态心脏还是在结构正常的心脏中的病理学状态有关。因此，在数以百万的患者中修复RyR2的渗漏的方法可以预防心力衰竭、致命性心律失常和纤维性颤动。
JTV-519(4-[3-(4-苄基哌啶-1-基)丙酰基]-7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂革类单盐酸化物；也称作k201或ICP-Calstan100，1，4-苯并硫氮杂类的一种衍生物是一种新的钙离子通道调节剂。除了调节心肌细胞中的Ca2+水平，JTV-519也在豚鼠室细胞中调节Na+电流和内部整流K+电流，并在豚鼠房细胞中抑制延迟整流K+电流。研究表明，JTV-519具有强烈的心脏保护作用，对抗儿茶酚胺诱导的心肌损伤、心肌损伤诱导的肌纤维过度收缩和缺血/再灌注损伤。在实验性肌纤维过度收缩模型中，JTV-519显示了比普萘洛尔、维拉帕米和地尔硫卓更大的心脏保护作用。实验数据也表明，在动物模型中JTV-519通过降低细胞内Ca2+超负荷水平而有效地预防了心室缺血/再灌注。
发明概述
本发明是基于下列出人意料的发现：RyR2是治疗和预防心力衰竭和心律失常、包括导致运动诱导的心源性猝死(SCD)的心房纤颤和心律失常的靶点。如上所述，本发明人制备了具有7种不同CPVT突变的突变型RyR2通道，并研究了它们的功能。所有的7种突变体都具有功能缺陷，导致了在运动期间刺激时变得渗漏(钙渗漏)的通道。本发明人的研究首先鉴定了一种机制，通过该机制，SR钙渗漏导致了DADs。值得注意的是，在患末期心力衰竭—一种特征是致命性心律失常发病率较高的疾病的患者的心脏中，突变CPVT通道的缺陷使得通道像是有渗漏的通道。因此，发明人证明了在CPVT中VT的机制与在心力衰竭中VT的机制相同。
本发明人还发现，药物JTV-519(k201或ICP-Calstan100)是1，4-苯并二氮卓类家族化合物的一员，其可以修复RyR2通道的渗漏。如本发明人所示，JTV-519增强了FKBP12.6与PKA-磷酸化RyR2和变异型RyR2s的结合，这样降低了与FKBP12.6的亲和力，或者不与FKBP12.6结合。JTV-519的该作用修复了RyR2的渗漏，而RyR2的渗漏可触发致命性心律失常(心源性死亡)并促成了在心力衰竭中的房/室纤维性颤动和心肌功能障碍。
因此，在一个方面，本发明提供一种新的1，4-苯并硫氮杂革类中间体和衍生物，以及合成该物质的方法和分析该物质的方法。在一些实施方案中，这些新的1，4-苯并硫氮杂革类中间体和衍生物包括：
Figure A20058004924600201
其中R＝芳基、烯基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；
Figure A20058004924600202
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；
Figure A20058004924600203
其中R＝CO(CH2)nXR′2、SO2(CH2)nXR′2或SO2NH(CH2)nXR′2，并且X＝N或S，并且n＝1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；并且其中m＝1或2；
Figure A20058004924600211
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；并且其中X＝NH或O；和
Figure A20058004924600212
其中R1＝在苯环2，3，4或5位的OR′、SR′、NR′、烷基或卤化物，并且R′＝烷基、芳基或H；其中R2＝H、烷基或芳基；并且其中R3＝H、烷基或芳基。其他的实施方案也包括下列化合物：S7、S-20、S-25、S-27和S36(在附图8中列出)。
还提供新的1，4-苯并硫氮杂革类化合物在限制或预防患者与RyR2-结合的FKBP12.6水平降低的方法；在治疗或预防患者心力衰竭、心房纤颤或运动诱导的心律失常的方法；在预防患者运动诱导的心源性猝死的方法中的应用。
在一个进一步的方面，本发明提供一种鉴定增强RyR2和FKBP12.6结合的试剂，包括下列步骤：(a)得到或产生一种RyR2源；(b)在候选试剂存在下将RyR2暴露在FKBP12.6下；和(c)确定该试剂是否增强RyR2和FKBP12.6结合。在一些实施方案中，RyR2可以是未磷酸化的、PKA-磷酸化的或PKA-超磷酸化的。还提供一种通过该方法鉴定的试剂，该试剂在限制或预防患者与RyR2-结合的FKBP12.6水平降低的方法中的应用；在治疗或预防患者心力衰竭、心房纤颤或运动诱导的心律失常的方法中的应用；以及在预防患者运动诱导的心源性猝死的方法中的应用。
在另一个方面，本发明提供一种鉴定增强RyR2和FKBP12.6结合的试剂的方法，包括下列步骤：(a)得到或产生一种FKBP12.6源；(b)在候选试剂存在下将FKBP12.6暴露在RyR2下；和(c)确定该试剂是否增强RyR2和FKBP12.6结合。在一些实施方案中，RyR2可以是未磷酸化的、PKA-磷酸化的或PKA-超磷酸化的。还提供一种通过该方法鉴定的试剂，和该试剂在限制或预防患者与RyR2-结合的FKBP12.6水平降低的方法中的应用；在治疗或预防患者心力衰竭、心房纤颤或运动诱导的心律失常的方法中的应用；在预防患者运动诱导的心源性猝死的方法中的应用。
本发明的其他方面通过下文的描述将会显而易见。
附图简述
附图1显示的是在FKBP12.6+/-小鼠中JTV-519预防运动诱导的心律失常。(A)未治疗的FKBP12.6+/-小鼠、用JTV-519治疗的FKBP12.6+/小鼠，用JTV-519治疗的FKBP12.6-/-小鼠的代表性动态心电图。心律和测定的任意ECG参数没有显著的差异。(B)上部的图：持续的多形性室性心动过速的例子，是在进行运动实验并用1.0mg/kg肾上腺素注射的未治疗FKBP12.6+/-小鼠中记录的，中部的图：在相同实验方案后JTV-519治疗的FKBP12.6+/-小鼠的心电图；没有检测到心律失常，底部的图：在用JTV-519治疗的FKBP12.6-/-小鼠中运动诱导的心律失常(VT)。虚线表示在附图中没有显示的16.31秒的VT。“P”表示P-波，其表示室性心动过速后的窦性节律。(C)条形图表示在分别用JTV-519治疗或未治疗的FKBP12.6+/-和FKBP-/-小鼠中心源性猝死(左)、持续室性心动过速(>10次心搏，中间)、和非持续室性心动过速(3-10次异常心搏，右)的量。应当注意的是，与未治疗的FKBP12.6+/-小鼠(n＝10)或JTV-519治疗的FKBP12.6-/-小鼠(n＝5)相比，在FKBP12.6+/-小鼠(n＝9)中用JTV-519治疗完全防止了运动和肾上腺素-诱导的心律失常，提示JTV-519通过再结合FKBP12.6和RyR2在FKBP12.6+/-小鼠中预防了心律失常和猝死。
附图2显示的是在FKBP12.6+/-小鼠中通过增强FKBP12.6与RyR2的亲和力预防运动诱导的心源性猝死(SCD)。(A-B)用RyR2-5029抗体免疫沉淀心脏兰诺定受体。显示的是免疫印迹(A)和条形图(B)，其代表分别在JTV-519不存在或存在下在静止条件并接着运动时野生型(FKBP12.6+/+)小鼠、FKBP12.6+/-小鼠和FKBP12.6-/-的RyR2、PKA-磷酸化的RyR2(RyR2-pSer2809抗体)和FKBP12.6的定量。在静止条件下，在FKBP12.6+/-小鼠中～70％的FKBP12.6与RyR2结合。接着在运动实验中，在FKBP12.6+/-小鼠中FKBP12.6与RyR2复合物的量戏剧性地降低，但是这可以用JTV-519治疗来挽救。(C)从运动实验和肾上腺素注射后得到的心脏中分离RyR2单通道。显示的是在用和不用JTV-519预治疗下来自FKBP12.6+/-小鼠的通道和在用JTV-519预治疗后来自FKBP12.6-/-小鼠的通道。应当注意的是，在用JTV-519治疗的运动的FKBP12.6+/-小鼠中RyR2-通道的功能被标准化。在JTV-519治疗后运动的FKBP12.6+/-小鼠的代表性单通道表明，心脏中的FKBP12.6需要JTV-519的作用。虚线代表不完全的通道开放或“亚电导”开放，表示的是排空了FKBP12.6的Ry R2通道。左图示踪表示5.0秒，而右图示踪表示500毫秒。在该附图中，Po＝开放概率；To＝平均开放时间；Tc＝平均关闭时间；并且c＝通道的封闭状态。(D)简要的条形图表示的是单RyR2通道的平均开放概率(见上文)。在舒张期钙浓度(150nM)下，JTV-519戏剧性地降低了FKBP12.6+/-小鼠在运动实验后RyR2的开放概率。
附图3显示的是通过增强FKBP12.6对PKA-磷酸化的Ry R2通道的结合亲和力，JTV-519使RyR2-通道门控正常化。如前所述制备(A，B)犬科心脏SR膜(A)和重组表达的RyR2通道(B)(Kaftan等人，Effects of rapamycin on ryanodine receptor/Ca2+-releasechannels from cardiac muscle.Circ.Res.，78：990-97，1996)。(A)在存在或不存在PKA抑制剂，PKI5-24时在磷酸化缓冲液(8mMMgCl2，10mM EGTA，和50mM Tris/PIPES；pH6.8)中用PKA催化亚单元(40U；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)磷酸化Ryanodine受体(RyR2)。以100,000x g离心样品10分钟，在咪唑缓冲液(10mM咪唑；pH7)中洗涤3次。在不存在或存在不同浓度的JTV-519下，将重组表达的FKBP12.6(最终浓度＝250nM)加入到样品中。在培养60分钟后，以100,000x g将样品离心10分钟，并在咪唑缓冲液中洗涤2次。将样品加热至95℃，并用SDS-PAGE按大小分级。如前所述用抗-FKBP12.6抗体(1∶1,000)和抗-RyR2-5029抗体(1∶3,000)进行SR微粒体的免疫印迹(Jayaraman等人，FK506 binding proteinassociated with the calcium release channel(ryanodinereceptor).J Biol.Chem.，267：9474-77，1992)。该附图表明，JTV-519能够使FKBP12.6结合：(A)PKA-磷酸化的RyR2(在100nM下部分结合；在1000nM下完全结合)，或(B)RyR2-S2809D突变通道，其构成了PKA-磷酸化的RyR2通道。(C-E)单-通道研究表明了，与在特定PKA抑制剂，PKI5-24(C)存在下的PKA磷酸化相比，在PKA磷酸化后RyR2的开放概率提高(D)。在JTV-519存在下，用FKBP12.6温育的PKA-磷酸化的RyR2的单-通道功能被标准化(E)。通道开放提高，短条表示完全开放的水平(4pA)，后者“c”表示封闭状态。显示的是在收缩(5秒，上图示踪)和舒张(500毫秒，下图示踪)时程中的通道，在0mV下记录。在PKA-磷酸化的RyR2中，幅度直方图(右)显示了活动增强和亚电导开放增加，但不是在用JTV-519和FKBP12.6治疗后。(F)开放概率作为细胞溶质[Ca2+]的函数的标准化图。在JTV-519存在下用FKBP12.6温育PKA-磷酸化的RyR2使RyR2激活的Ca2+-依赖性向右位移，这使得它与未磷酸化通道的Ca2+-依赖性类似。
附图4显示的是实验方案，用于测定本发明人的新JTV-519-相关的化合物(本文公开)对于hERG-通道电流的作用。在室温下在用hERG通道转染的CHO细胞中用生理溶液进行全细胞膜片箝试验。在下面的图中显示了电压箝试验的实验方案。在载体中，如上面的图所示在相同时间的实验方案中使用0.1％DMSO的外部溶液。
附图5显示的是JTV-519和本发明人的新JTV-519-相关化合物，S36(本文公开)对于由80-mV去极化引发的hERG-通道电流的作用。在使用1μM JTV-519(左图)或1μM JTV-S36(右图)前(空白环)和后(封闭环)从CHO细胞中记录代表性的hERG-通道电流(I(Kr))。在电流痕量下显示的是电压箝的实验方案。在从保持电位-90mV的400-毫秒去极化至+80mV期间引发了电流。应当注意的是，当400-毫秒去极化(其模拟人动作电位持续时间(APD))时，hERG通道只通过非常小的外向电流，因为它们会迅速失活。在整个开放状态下从失活中恢复时，通过膜电位恢复到-40mV可以引发在电流痕量中环标记的尾电流。因为尾电流是控制APD的主要贡献者，所以可以通过在-40mV下的尾电流评价药物的作用：JTV-519＝83％阻断；JTV-S36＝39％阻断。
附图6显示的是JTV-519、E4031和本发明人的新JTV-519-相关化合物，S36(本文公开)对于hERG-通道激活的作用(痕量)。显示是在使用0.1％DMSO(载体；上部中央的图)，1μM JTV-519(中部中央的图)和1μM JTV-S36(下部中央的图)前(对照，左图)和后(中央的图)代表性的hERG-通道I-V的关系。右图显示的是5μME4031(一类已知阻断hERG通道的III型抗心律失常药)完全阻断了hERG-通道电流。(注意-40mV的尾电流)。电压箝试验方案如附图4所示，作为I-V的关系。
附图7显示的是JTV-519和本发明人的新JTV-519-相关化合物，S36(本文公开)对于hERG-通道电流的激活的作用。显示的是在使用0.1％DMSO(载体；上图)，1μM JTV-519(下左图)和1μM JTV-S36(下右图)前(空白方块)和后(封闭方块)峰尾电流(激活)的hERG-通道I-V的关系。用空白三角形描述药物的清除。压箝试验方案如附图4所示，作为I-V的关系。应当注意的是，在负电位(0mV；20mV去极化)下JTV-S36不会阻断hERG电流，显示了电压依赖性的I(Kr)阻断。
附图8显示的是衍生物的结构。
发明详述
如上述讨论，儿茶酚胺多形性室性心动过速(CPVT)是在具有结构正常的心脏的个体中的一种遗传疾病。其特征在于可以导致心源性猝死(SCD)的应激诱导的室性心动过速，一种致命性心律失常。位于肌质网(SR)的RyR2通道的突变与CPVT有关。为了确定CVPT中致命性心律失常的分子基础，本发明人研究了与CPVT-有关的突变RyR2通道(例如，S2246L、R2474S、N4104K、R4497C)。
具有CPVT的所有个体都具有运动诱导的心律失常。先前，本发明人表明了运动诱导的心律失常和猝死(在具有CPVT的患者中)是由FKBP12.6对RyR2的亲和力降低导致的。其中，本发明人已经证明了，运动激活了Ry R2，作为被腺苷3′，5′-单磷酸(cAMP)-依赖性蛋白激酶(PKA)磷酸化的结果。突变RyR2通道在基础条件下在平面脂双层中具有正常功能，通过PKA磷酸化其对于激活更加敏感—与野生型通道相比，显示出活动(开放概率)增强和开放状态时间延长。此外，PKA-磷酸化的突变RyR2通道对于通道的生理学抑制剂Mg2+的抑制是耐受的，并显示出与FKBP12.6(其在封闭状态下稳定通道)结合减少。这些发现表明，在运动期间，当RyR2被PKA-磷酸化时，突变CPVT通道更可能是在心动周期的舒张期(心舒期)开放，提高SR Ca2+渗漏触发的心律失常的可能性。由于心力衰竭在全世界是死亡的首要原因。因此，修复RyR2的渗漏可以在数以百万的患者中预防致命性心律失常。
本发明人进一步证明了苯并硫氮杂类衍生物JTV-519在杂合FKBP12.6基因的小鼠中可以预防致命性室性心律失常。通过增加FKBP12.6对PKA-磷酸化的RyR2的亲和力，JTV-519降低了从运动后死亡的FKBP12.6+/-小鼠中分离的RyR2的开放概率，此外，通过增强FKBP12.6的结合亲和力，JTV-519使与CPVT-相关的突变Ry R2通道的门控标准化。这些数据表明，JTV-519可以通过增强FKBP12.6-RyR2结合亲和力预防致命性室性心律失常。
治疗和预防的新方法
如前所述，本发明提供一种限制或预防在患者的细胞中降低与RyR2结合的FKBP12.6的水平的方法。在本文中使用的“FKBP12.6”包括“FKBP12.6蛋白”和“FKBP12.6类似物”。除非另有说明，“蛋白”包括蛋白质、蛋白质域、多肽或肽及其任意片段。“FKBP12.6类似物”是FKBP12.6蛋白的功能性变异体，具有FKBP12.6的生物活性，与FKBP12.6蛋白具有60％或更高的氨基酸序列同一性。如本文进一步所使用，术语“FKBP12.6的生物活性”是指尽管与FKBP12.6的亲和力不同，但在本文所述的分析条件下，显示出与未磷酸化或非超磷酸化的RyR2(即，超出阴性对照的背景结合约2倍，或更优选地约5倍)物理连接或结合的能力的蛋白质或肽的活性。
此外，本文使用的“RyR2”包括“RyR2蛋白”和“RyR2类似物”。“RyR2类似物”是RyR2蛋白的功能性变异体，具有RyR2的生物活性，与RyR2蛋白具有60％或更高的氨基酸序列同一性。如本文所使用，“RyR2类似物”包括RyR2的RyR1-骨骼肌同种型。本发明的RyR2可以是未磷酸化的，磷酸化的(例如，通过PKA)或超磷酸化的(例如，通过PKA)。如本文进一步所使用，术语“RyR2的生物活性”是指尽管与RyR2的亲和力不同，但在本文所述的分析条件下，显示出与FKBP12.6(即，超出阴性对照的背景结合约2倍，或更优选地约5倍)物理连接或结合的能力的蛋白质或肽的活性。
如上所述，心脏ryanodine受体，RyR2是一种蛋白质复合物，包含4个565,000-道尔顿的RyR2多肽并与4个12,000-道尔顿的FKBP
12.6蛋白连接。FK506结合蛋白(FKBPs)是顺-反式肽基-脯氨酰异构酶，其被广泛地表达，并发挥不同的细胞功能。FKBP12蛋白紧密地连接到RyR2上并调节其功能。FKBP12.6与RyR2通道结合，每个RyR2亚单元一个分子，稳定了RyR2-通道的功能，促进了相邻RyR2通道之间的偶合门控，由此，防止在心动周期的静止期异常激活该通道。因此，本文中使用的术语“与RyR2结合的FKBP12.6”包括与RyR2蛋白亚单元结合的FKBP12.6蛋白的分子，或与RyR2的四聚体连接的FKBP12.6的四聚体。
根据本发明的方法，在患者的细胞中与RyR2结合的FKBP12.6的水平“降低”是指可检测地降低、减小或减少了患者的细胞中与RyR2结合的FKBP12.6的水平。当通过施用JTV-519(如下所述)以任意方式停止、阻碍、妨碍、阻塞或减少了这种降低时，在患者细胞中这样的降低受到限制或阻止，以使在患者的细胞中与RyR2结合的FKBP12.6的水平高于在没有JTV-519的情况。
在患者中与RyR2结合的FKBP12.6的水平可以通过标准分析和技术来检测，包括从已知领域很容易即可确定的那些(例如，免疫技术、杂交分析、免疫沉淀、蛋白印迹分析、荧光显像技术和/或辐射检测等等)，以及本文所述的任意分析和检测。例如，可以用本领域已知的标准技术从患者的细胞中分离和纯化蛋白质，包括但不限于，当必要时从细胞中提取(例如，用可增溶该蛋白质的洗涤剂)，然后用柱、色谱(例如，FTLC和HPLC)、免疫沉淀(用抗体)和沉淀法(例如，用异丙醇和试剂例如Trizol)亲和纯化。蛋白质的分离和纯化后可以进行电泳(例如，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上)。在患者中与RyR2结合的FKBP12.6水平的降低或对其进行的限制或预防可以通过比较在施用JTV-519前检测的与RyR2结合的FKBP12.6的量(根据下面所述的方法)和在施用JTV-519后适当时间检测的量来确定。
在本发明的方法中，例如可以通过抑制在患者的细胞中FKBP12.6和RyR2的解离；或通过增加在患者的细胞中FKBP12.6和RyR2之间的结合；或通过在患者的细胞中稳定RyR2-FKBP12.6复合物，限制或预防在患者的细胞中与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低。本文使用的术语“抑制解离”包括阻断、降低、抑制、限制或防止在患者的细胞中FKBP12.6亚单元从RyR2分子中物理解离或分离，或阻断、降低、抑制、限制或防止在患者的细胞中RyR2分子从FKBP12.6亚单元中解离或分离。在本文中进一步使用的术语“增强抑制”包括增强、增加或改善在患者的细胞中磷酸化的RyR2与FKBP12.6物理连接的能力(例如结合超过阴性对照的背景结合约2倍，或更优选地，约5倍)，以及增强、增加或改善在患者的细胞中FKBP12.6与磷酸化的RyR2物理连接的能力(例如结合超过阴性对照的背景结合约2倍，或更优选地，约5倍)。此外，在本发明的方法中，通过直接降低患者的细胞中磷酸化的RyR2的水平，或通过间接降低细胞中磷酸化的RyR2的水平(例如，通过靶向于调节或改变细胞中磷酸化的RyR2的功能或水平的酶(例如PKA)或其他内源性分子)，可以限制或预防在患者的细胞中与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低。优选地，通过本发明的方法可以将细胞中磷酸化的RyR2的水平降低至少10％。更优选地，磷酸化的RyR2的水平降低了至少20％。
根据本发明的方法，在患者中，特别是患者的细胞中限制或预防了与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低。本发明的患者可以是任意的动物，包括两栖动物、鸟、鱼、哺乳动物和有袋类动物，但优选是哺乳动物(例如，人；家畜，例如猫、狗、猴子、小鼠或兔子；或商业化动物，例如奶牛或猪)。此外，本发明的患者是运动诱导的心律失常的候选者。运动诱导的心律失常是一种在患者体育运动期间/后发生的心脏疾病(例如，心室纤颤或室性心动过速，包括可以导致心源性猝死的任意疾病)。运动诱导的心律失常的“候选者”是这样一种患者，其已知或据信或可能有在体育运动期间/后发生心律失常的危险。运动诱导的心律失常的候选者的例子包括但不限于，已知具有儿茶酚胺多形性室性心动过速(CPVT)的动物/人；可能具有CPVT的动物/人；和已知或据信或可能有在体育运动期间/后发生心律失常的危险的动物/人，和将会运动，正在运动或刚刚结束运动的动物/人。如上述讨论，CPVT是具有结构正常的心脏的个体的遗传性疾病。其特征在于可以导致心源性猝死的应激诱导的室性心动过速，一种致命性心律失常。在CPVT患者中，强体力活动和/或应激诱导了导致心源性猝死(SCD)的双向性和/或多形性室性心动过速，而无可检测的结构性心脏病。但患者运动时CPVT患者会发生室性心律失常，而在休息时则不会发生心律失常。
在本发明的方法中，患者的细胞优选是横纹肌细胞。横纹肌是一种肌肉，其中收缩性肌原纤维的重复单元(肌节)排列在整个细胞中，产生了可以在光学显微镜水平观测到的横向或斜向的条纹。横纹肌细胞的例子包括但不限于，随意(骨骼)肌细胞和心肌细胞。在一个优选的实施方案中，在本发明的方法中使用的细胞是人心肌细胞。本文使用的术语“心肌细胞”包括心肌纤维，例如在心脏的心肌膜中发现的那些。心肌纤维是由在闰盘头尾相连的邻近的心脏-肌肉细胞或心肌细胞的链组成的。这些盘具有2种细胞接点：沿着它们的横向部分延伸的展开性桥粒，和缝隙连接，其中最大的沿着它们的纵向部分排列。
在本发明的方法中，通过给患者施用JTV-519限制或预防在患者的细胞中与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低；这也将允许患者的细胞与JTV-519接触。JTV-519(4-[3-(4-苄基哌啶-1-基)丙酰基]-7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂类单盐酸化物)也称作k201，是1，4-苯并硫氮杂革类的衍生物和钙离子通道的调节剂。除了调节心肌细胞中的Ca2+水平，JTV-519还在豚鼠室细胞中调节Na+电流和内部整流K+电流，在豚鼠房细胞中抑制延迟整流K+电流。FK506和雷帕霉素是可以用于设计在作为运动诱导的心律失常的候选者的患者的细胞中稳定RyR2-FKBP12.6结合的其他化合物的药物。FK506和雷帕霉素都会从RyR2中解离FKBP12.6。能够用于设计和/或筛选与这些药物结构相关但作用相反的化合物。
在本发明的方法中，可以以包含JTV-519和药学可接受的载体的治疗性组合物的方式将JTV-519施用于患者。药学可接受的载体必须是在与所述组合物的其它成分相容，并对受者无害的意义上是“可接受的”。在本文中使用的药学可接受的载体选自各种有机或无机物质，其可以用作药物制剂的材料，并且其可以掺入作为止痛剂、缓冲剂、粘合剂、崩解剂、稀释剂、乳化剂、赋形剂、膨胀剂、助流剂、增溶剂、稳定剂、悬浮剂、张力剂、载体和增粘剂。如果必要，可以加入药学添加剂，例如抗氧化剂、芳香剂、着色剂、香味改善剂、防腐剂和甜味剂。可接受的药物载体的例子包括羧甲基纤维素、微晶纤维素、甘油、阿拉伯胶、乳糖、硬脂酸镁、甲基纤维素、粉末、盐水、海藻酸钠、蔗糖、淀粉、滑石和水等。
本发明的药物制剂可以通过药学领域的公知方法来制备。例如，可以将JTV-519与载体或稀释剂混合，作为混悬液或溶液。任选地，也可以加入一种或多种助剂成分(例如，缓冲剂、调味剂、表面活性剂等)。载体的选择将取决于给药途径。
可以通过将患者体内的靶细胞(例如，心肌细胞)与JTV-519接触以将JTV-519施用于患者。可以使用用于引入和施用蛋白质、核酸和其他药物的已知技术将JTV-519与患者的细胞接触(例如，引入)。JTV-519与细胞接触(即，用它治疗该细胞)的方法的例子包括但不限于，吸收、电穿孔、浸入、注射、引入、脂质体递送、转染、输注、载体载入(vector)和其他药物递送载体和方法。当靶细胞位于患者的特定部分时，需要将JTV-519直接引入到细胞中，包括注射或以其他方法(例如，将JTV-519引入到血液或其他体液中)。靶细胞可以包含在患者的心脏组织中，其可以通过已知技术容易确定的标准检测方法在患者的心脏组织中被检测，其例子包括但不限于，免疫技术(例如，免疫组织化学染色)、荧光显象技术和显微镜技术。
此外，可以通过已知技术，包括但不限于口服、胃肠外施用和经皮施用将本发明的JTV-519施用于人或动物患者。优选地，通过筋膜、囊内、颅内、皮内、鞘内、肌内、眶内、腹膜内、椎内、胸骨内、血管内、静脉内、薄壁组织(parenchymatous)、皮下或舌下注射或通过导管来经胃肠外施用JTV-519。在一个实施方案中，经插入到患者心脏的导管，通过靶向递送于心肌细胞的方法将该试剂施用于患者。
对于口服，JTV-519制剂可以作为胶囊、片剂、粉末、颗粒或作为混悬液存在。制剂可以含有常规添加剂，例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉。该制剂也可以与粘合剂，例如微晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶存在。此外，该制剂可以与崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠存在。该制剂也可以与二碱价无水磷酸钙或羟乙酸淀粉钠存在。最后，该制剂可以与润滑剂例如滑石或硬脂酸镁存在。
对于胃肠外施用(即，通过注射经消化道以外的途径施用)，JTV-519可以和优选与患者的血液等张的无菌水溶液混合。制备该制剂，其包括将固体活性成分溶解于包含生理相容性物质例如氯化钠、甘氨酸等的水中，并且其缓冲pH与生理条件相容，以制备水溶液，然后将所述溶液灭菌。该制剂可以存在于单位或多剂量容器例如密封的安瓿或玻璃瓶中。该制剂可以通过任何方式的注射来递送，包括但不限于，筋膜、囊内、颅内、皮内、鞘内、肌内、眶内、腹膜内、椎内、胸骨内、血管内、静脉内、薄壁组织、皮下或舌下或通过导管进入患者的心脏。
对于经皮施用，JTV-519可以与皮肤渗透增强剂例如丙二醇、聚乙二醇、异丙醇、乙醇、油酸、N-甲基吡咯烷酮等结合，它们可以增强皮肤对于JTV-519的渗透性，允许JTV-519渗透通过皮肤，并进入血流。JTV-519/增强剂组合物也可以进一步与聚合物质如乙基纤维素、羟丙基纤维素、乙烯/醋酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮等混合，以提供凝胶形式的组合物，其可以溶解于溶剂例如二氯甲烷中，蒸发至需要的粘度，然后应用于背材上，得到贴剂。
根据本发明的方法，JTV-519可以以某一量施用于患者(并且JTV-519可以与患者的细胞接触)，所述量可以有效地限制或预防在患者中特别是患者的细胞中与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低。该量是技术人员根据已知方法很容易可确定的，其中已知方法包括体内建立的滴定曲线的分析，和本文所公开的方法和分析。有效地在患者中限制或预防与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低的JTV-519的适当量的范围是约5mg/kg/日到约20mg/kg/日，和/或可以是足以达到血浆水平范围为约300ng/ml到约1000ng/ml的量。优选地，JTV-519的量的范围是约10mg/kg/日到约20mg/kg/日。
在本发明的一个实施方案中，患者还没有发生运动诱导的心律失常。在该情况中，有效地在患者中限制或预防与RyR2结合的FKBP12·6的水平降低的JTV-519的量可以是有效预防患者运动诱导的心律失常的JTV-519的量。心律失常是一种心脏的电活动性紊乱，其表现为心率或心节律的异常。本文使用的“有效预防运动诱导的心律失常”JTV-519的量包括有效预防运动诱导的心律失常的临床损伤或症状(例如，心悸、晕厥、心室纤颤、室性心动过速和心源性猝死)的JTV-519的量。在患者中有效预防运动诱导的心律失常的JTV-519的量将由于每种情况的特定因素而各异，这些因素包括运动诱导的心律失常的类型、患者体重、患者情况的严重度和施用JTV-519的方式。该量是技术人员根据已知方法、包括临床试验和本文所述的方法很容易即可确定的。在一个优选的实施方案中，有效预防运动诱导的心律失常的JTV-519的量是在患者中有效预防运动诱导的心源性猝死的JTV-519的量。在另一个实施方案中，JTV-519在患者中预防运动诱导的心律失常和运动诱导的心源性猝死。
由于它稳定与RyR2结合的FKBP12.6，并维持和恢复动态PKA磷酸化和RyR2去磷酸化之间的平衡，JTV-519也可以用于治疗已经开始发生运动诱导的心律失常的临床症状的患者。如果足够早地观测到患者心律失常的症状，JTV-519可以有效地限制或预防患者中与RyR2结合的FKBP12.6水平的进一步降低。
因此，在本发明的另一个实施方案中，患者已经运动或正在运动，并已经发生运动诱导的心律失常。在该情况中，有效地在患者中限制或预防与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低的JTV-519的量可以是在患者中有效治疗运动诱导的心律失常的JTV-519的量。在本文中使用的“有效治疗运动诱导的心律失常”JTV-519的量包括有效减轻或改善运动诱导的心律失常的的临床损伤或症状(例如，心悸、晕厥、心室纤颤、室性心动过速和心源性猝死)的JTV-519的量。在患者中有效治疗运动诱导的心律失常的JTV-519的量将由于每种情况的特定因素而各异，这些因素包括运动诱导的心律失常的类型、患者体重、患者情况的严重度和施用JTV-519的方式。该量是技术人员根据已知方法、包括临床试验和本文所述的方法很容易即可确定的。在一个优选的实施方案中，JTV-519在患者中治疗运动诱导的心律失常。
本发明进一步提供一种在患者中治疗运动诱导的心律失常的方法。该方法包括将JTV-519以有效在患者中治疗运动诱导的心律失常的量施用于患者。在患者中有效治疗运动诱导的心律失常的JTV-519的适当的量的范围是约5mg/kg/日到约20mg/kg/日，和/或可以是足以达到血浆水平范围为约300ng/m l到约1000ng/ml的量。本发明也提供一种在患者中预防运动诱导的心律失常的方法。该方法包括将JTV-519以有效在患者中预防运动诱导的心律失常的量施用于患者。在患者中有效预防运动诱导的心律失常的JTV-519的适当的量的范围是约5mg/kg/日到约20mg/kg/日，和/或可以是足以达到血浆水平范围为约300ng/ml到约1000ng/ml的量。此外，本发明也提供一种在患者中预防运动诱导的心源性猝死的方法。该方法包括将JTV-519以有效在患者中预防运动诱导的心源性猝死的量施用于患者。在患者中有效预防运动诱导的心源性猝死的JTV-519的适当的量的范围是约5mg/kg/日到约20mg/kg/日，和/或可以是足以达到血浆水平范围为约300ng/ml到约1000ng/ml的量。
在上述方法的各种实施方案中，患者中运动诱导的心律失常与VT有关。在优选的实施方案中，VT是CPVT。在这些方法的其他实施方案中，该患者是运动诱导的心律失常的候选者，包括运动诱导的心源性猝死的候选者。
根据上述方法，本发明还提供JTV-519在作为运动诱导的心律失常的候选者的患者中在限制或预防与RyR2结合的FKBP12.6水平降低的方法中的应用。本发明还提供JTV-519在治疗或预防患者运动诱导的心律失常的方法中的应用。此外，本发明还提供JTV-519在预防患者运动诱导的心源性猝死的方法中的应用。
如上述和本文所讨论，本发明人的数据表明，在丝氨酸2809上的心脏ryanodine受体，RyR2的蛋白激酶A(PKA)磷酸化通过释放FK506结合蛋白，即FKBP12.6激活了通道。在衰竭的心脏(包括人的心脏和心力衰竭的动物模型)中，RyR2是PKA超磷酸化的，产生了降低结合的FKBP12.6的量并且对钙诱导的激活敏感性增强的缺陷性通道。这些改变的净结果是RyR2通道成为有“渗漏”的。这些通道的渗漏会导致细胞内贮存的钙排空至这样的程度，以至于在肌质网(SR)不再有足够的钙来提供肌肉收缩的强烈刺激。这导致心肌的收缩变弱。作为通道渗漏的第二个结果，在心动周期的静止期，即“舒张期”RyR2通道释放出钙。在舒张期中钙的释放可以触发心脏发生导致心源性猝死(SCD)的致命性心律失常(例如，室性心动过速和心室纤颤)。
本发明人也显示了用机械泵装置、即左心室辅助装置(LVAD)治疗心力衰竭，在休息室将其放到心脏上，可以恢复正常的功能，这与RyR2的PKA磷酸化减少和通道的正常功能有关。此外，本发明人已经表明了，用β-肾上腺素能阻断剂(β阻断剂)治疗狗(其患有起搏诱导的心力衰竭)逆转了RyR2的PKA磷酸化。β阻断剂抑制了激活PKA的途径。从本发明人工作的结果中可以得出的结论是，RyR2的PKA磷酸化增强了通道的活动，导致在给定的通道触发剂(激活剂)下可以向细胞中释放出更多的钙。
如本文进一步公开，本发明人已经确定了，运动诱导的心源性猝死与RyR2蛋白(特别是与CPVT连接的RyR2突变蛋白)的磷酸化的增加和与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低有关。可以使用该机制来设计预防运动诱导的心源性猝死的有效药物。作为其限制或预防活性的结果，具有限制或预防与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低的能力的候选试剂可以对与RyR2有关的生物学事件具有作用，从而预防运动诱导的心源性猝死。
因此，本发明进一步提供一种鉴定用于预防运动诱导的心源性猝死的试剂的方法。该方法包括下列步骤：(a)得到或产生一种包含RyR2的细胞培养物；(b)将细胞与候选试剂接触；(c)将细胞暴露于已知增强细胞中Ry R2的磷酸化的一种或多种条件中；和(d)确定该试剂是否限制或预防细胞中与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低。本文使用的术语“试剂”应当包括蛋白质、多肽、肽、核酸(包括DNA或RNA)、抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、分子、化合物、抗生素、药物和其任意一种或多种组合。限制或预防与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低的试剂可以是天然或合成的，并可以是与RyR2和/或FKBP12.6反应的试剂(即，一种与RyR2和/或FKBP12.6具有亲和力、与之结合或直接对抗的试剂)。本文进一步使用的“包含RyR2”的细胞是这样一种细胞(优选心肌细胞)，其中RyR2或其衍生物或同系物是自然表达的或天然存在的。已知在细胞中增强RyR2的磷酸化的条件包括但不限于PKA。
在本发明的方法中，可以通过任意的有效接触药物/试剂和细胞的标准方法，包括本文所述的任意方式的引入和施用将细胞和候选试剂接触。通过已知方法测定或检测细胞中与RyR2结合的FKBP12.6的水平，这些方法包括本领域或本文所述的任意方法、分子技术和本领域技术人员或本文所述的已知分析法。在本发明的一个实施方案中，该试剂在细胞中限制或预防了与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低。
如本文所述，RyR2与横纹肌细胞中的很多生物学事件有关。例如，已经表明，RyR2通道在心肌细胞中EC偶合和收缩性中发挥重要作用。因此，其清楚地表明，设计用于在细胞、特别是心肌细胞中限制或预防与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低的预防性药物可以用于调节很多与RyR2有关的生物学事件，包括EC偶合和收缩性。因此，当已经筛选出本发明的候选试剂并确定了对与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低具有适当的限制或预防作用，其可以评价其在细胞，特别是心肌细胞中对于EC偶合和收缩性的作用。预期本发明的预防性药剂将用于预防运动诱导的心源性猝死。
因此，本发明的方法进一步包括下列步骤：(e)将候选试剂与包含RyR2的细胞培养物接触；和(f)确定该试剂是否对细胞中与RyR2有关的生物学事件具有作用。本文使用的“与RyR2有关的生物学事件”包括其中涉及RyR2水平或活性的生物化学或生理学过程。如本文所公开，与RyR2有关的生物学事件的例子包括但不限于心肌细胞中的EC偶合和收缩性。根据本发明的此方法，候选试剂可以在体外与一个或多个细胞(优选，心肌细胞)接触。例如，用包含候选试剂的制品温育细胞培养物。然后通过本领域已知的任何生物鉴定或方法，包括免疫印迹、单-通道记录和本文公开的其他任意方法来评价候选试剂对与RyR2有关的生物学事件的作用。
本发明进一步涉及通过上述鉴定方法鉴定的试剂以及包含该试剂和药学可接受的载体的组合物。该试剂可以用于在患者中预防运动诱导的心源性猝死，和用于治疗或预防其他与RyR2有关的病症。本文使用的“与RyR2有关的病症”是其中涉及RyR2水平或活性的病症、疾病或障碍，包括与RyR2有关的生物学事件。可以通过给患者施用有效治疗或预防患者与RyR2有关的病症的量的试剂在患者中治疗或预防与RyR2有关的病症。该量是本领域技术人员容易确定的。在一个实施方案中，本发明提供一种在患者中预防运动诱导的心源性猝死的方法，包括给患者施用有效预防患者运动诱导的心源性猝死的量的试剂。
本发明也提供一种鉴定用于预防运动诱导的心源性猝死的试剂的体内方法。该方法包括：(a)得到或产生一种包含RyR2的动物；(b)将候选试剂施用于该动物；(c)将该动物暴露于已知增强细胞中RyR2的磷酸化的一种或多种条件中；和(d)确定该试剂是否在动物中限制或预防与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低。该方法可以进一步包括下列步骤：(e)将该试剂施用于包含RyR2的动物；和(f)确定该试剂是否在动物中对与RyR2有关的生物学事件具有作用。还提供通过该方法鉴定的试剂；包含该试剂的药物组合物；和在患者中预防运动诱导的心源性猝死的方法，包括将有效预防患者运动诱导的心源性猝死的量的试剂施用于患者。
本发明人的工作已经证明，阻断PKA激活的化合物有望减少RyR2通道的激活，导致钙较少释放到细胞中。在FKBP12.6结合位点与RyR2通道结合、但在当通道被PKA磷酸化时不会离开该通道的化合物也有望响应PKA激活或激活RyR2通道的其他触发剂而降低通道的活性。这样的化合物也会导致钙较少释放到细胞中。基于这些发现，本发明进一步提供鉴定可以用于预防运动诱导的心源性猝死，阻断或抑制RyR2激活的试剂的其他分析方法。
仅仅是举例，本发明的诊断分析可以用钙-敏感性荧光染料(例如，Fluo--3、Fura-2等等)筛选经RyR2通道进入细胞中的钙释放。可以用所选择的荧光染料负载细胞，然后用RyR2激活剂刺激以确定加入到细胞中的化合物是否减少了钙依赖性荧光信号(Brillantes等人，Stabilization of calcium release channel(ryanodine receptor)function by FK506-binding protein.Cell，77：513-23，1994；Gillo等人，Calcium entry during induced differentiation in murineerythroleukemia cells.Blood，81：783-92，1993；Jayaraman等人，Regulation of the inositol 1，4，5-trisphosphate receptorby tyrosine phosphorylation.Science，272：1492-94，1996)。可以用光电倍增管监测钙依赖性荧光信号，并如前所述用适当的软件分析(Brillantes等人，Stabilization of calcium release channel(ryanodine receptor)function by FK506-binding protein.Cell，77：513-23，1994；Gillo等人，Calcium entry during induceddifferentiation in murine erythroleukemia cells.Blood，81：783-92，1993；Jayaraman等人，Regulation of the inositol1，4，5-trisphosphate receptor by tyrosine phosphorylation。Science，272：1492-94，1996)。该分析可以用多孔盘容易地自动筛选数量庞大的化合物。
为了鉴定抑制RyR2-介导的细胞内钙释放的PKA-依赖性激活，分析可以涉及在异源表达系统例如Sf9、HEK293或CHO细胞中重组RyR2通道的表达(Brillantes等人，Stabilization of calcium releasechannel(ryanodine receptor)function by FK506-binding protein.Cell，77：513-23，1994)。RyR2也可以与β-肾上腺素能受体共表达。这将允许评价在响应加入的β-肾上腺素能受体激动剂时，化合物对于RyR2激活的作用。
也可以分析与心力衰竭程度相关的RyR2的PKA磷酸化水平，然后用于确定化合物阻断RyR2通道的PKA磷酸化的效力。这种分析可以是基于使用对RyR2蛋白具有特异性的抗体。例如，RyR2-通道蛋白可以是免疫沉淀的，然后用PKA和[gamma32P]-ATP背面磷酸化的(back-phosphorylated)。然后用磷光计测定转移到RyR2蛋白上的放射性[32P]标记物的量(Marx等人，PKA phosphorylationdissociates FKBP12.6from the calcium release channel(ryanodine receptor)：defective regulation in failing hearts.Cell，101：365-76，2000)。
本发明的另一种分析方法包括使用磷表位-特异性抗体，其可以检测在Ser2809上PKA磷酸化的RyR2。使用该抗体的免疫印迹可以用于评价治疗心力衰竭和心律失常的效力。此外，敲除RyR2 S2809A和RyR2 S2809D的小鼠可以用于评价治疗心力衰竭和心律失常的效力。通过显示RyR2 S2809A突变抑制心力衰竭和心律失常，该小鼠进一步提供了证据，表明RyR2的PKA磷酸化是心力衰竭和心律失常的贡献因素，并表明RyR2 S2809D突变使心力衰竭和心律失常恶化。
新化合物，合成相同物质的方法和相同物质的应用
1，4-苯并硫氮杂革类衍生物，特别是2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂类衍生物在制备生物活性分子、包括JTV-519中是重要的结构单元。本发明人开发出了新的制备1，4-苯并硫氮杂类中间体化合物，例如7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂类的方法。本发明人的方法使用的是容易得到和便宜的原料，提供了高产率的关键1，4-苯并硫氮杂类中间体。
在1990s早期，Kaneko等人(US Patent5,416,066；WO92/12148；JP4230681)披露了可以通过使7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂类(1，4-苯并硫氮杂类中间体)和丙烯酰氯反应，然后将所得到得产品与4-苄基哌啶反应来制备JTV-519。
在文献中已经报道了制备7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂类和类似化合物的两种方法。Kaneko等人(U.S.5,416,066)公开的第一种方法为从2，5-二羟基苯甲酸开始的6个步骤的合成途经。在该方法中，2，5-二羟基苯甲酸选择性地被硫酸二甲酯甲基化。然后将所得到的化合物与二甲基硫氨基甲酰氯反应20小时，然后高温(270℃)加热9小时。将该步骤的产品与甲醇钠在甲醇中回流20小时。然后将回流步骤的产品与2-氯乙胺在碱性和高温条件下反应，产生环状的酰胺。用Li Al H4还原该环状的酰胺，得到7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂类(1，4-苯并硫氮杂革类中间体)。
Hitoshi在日本专利(JP10045706)中公开了制备7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂类的第二种方法。该方法由2-溴-5-甲氧基苯甲醛起始。用NaSMe取代溴化物，并用氯氧化所得到的产品，然后在水中回流，得到二硫化二醛(disulfide dialdhyde)。用2-氯乙胺处理该二醛，并用还原剂，例如NaBH4还原所得到的产品。环化所得到的化合物，得到7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂类。
开始时，本发明人试图用上述方法制备1，4-苯并硫氮杂类中间体，7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂类。但是，他们发现，Kaneko等人(U.S.5,416,066)所述的第一种方法涉及高温的合成步骤和较长的反应时间。此外，本发明人发现在第三硫化中间体中硫基容易被空气氧化而成为二硫化合物，使得不可能合成随后的环状产品。本发明人也确定，Hitoshi(JP10045706)所述的方法涉及Cl2，除了用NaSMe取代溴化物外，必须使用其他的专利方法来制备第一种中间体。
为了克服上述问题，本发明人开发出了从容易获得和便宜的原料制备7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂类的新方法。本发明人的方法简化了分离和纯化步骤，可以用于制备各种1，4-苯并硫氮杂类中间体，包括7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂类和具有下列所示通式的其他化合物：
Figure A20058004924600401
R1＝n-MeO、n-MeS、n-烷基，n＝6，7，8，9
R2＝烷基
R3＝烷基
该方法也可以用于制备JTV-519。
因此，基于上述内容，本发明提供一种合成具有下列通式的化合物的方法：
Figure A20058004924600402
其中R＝OR′、SR′、NR′、烷基或卤化物并且R′＝烷基、芳基或H，其中R可以在2，3，4或5位，所述方法包括下列步骤：
(a)在任选催化剂存在下，用还原剂处理具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600411
其中R如上定义，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600412
其中R如上定义；
(b)用重氮化剂和二硫化物处理在步骤(a)中形成的化合物，以形成具有下列通式的化合物：
其中R如上定义；
(c)用活化剂和氯乙胺处理在步骤(b)中形成的化合物，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600414
其中R如上定义；
(d)用还原剂和碱处理在步骤(c)中形成的化合物，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600421
其中如上定义；和
(e)用还原剂处理在步骤(d)中形成的化合物，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600422
其中R如上定义。
根据本发明的方法，在步骤(a)中的还原剂可以是H2。此外，在步骤(b)中的重氮化剂可以是NaNO2，在步骤(b)中的二硫化物可以是Na2S2。此外，在步骤(c)中的氯可以是SOCl2。在步骤(d)中的还原剂可以是三甲基膦(PMe3)，而在步骤(d)中的碱是三乙胺。在另一个实施方案中，在步骤(e)中的还原剂可以是LiAlH4。
本发明进一步提供一种合成具有下列通式的化合物的方法：
Figure A20058004924600423
其中R＝OR′、SR′、NR′、烷基或卤化物和R′＝烷基、芳基或H，其中R可以在2，3，4或5位，所述方法包括下列步骤：
(a)用3-溴丙酰氯和具有下列通式的化合物：
处理具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600425
其中R如上定义
以形成具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600431
其中R如上定义。
仅仅是举例，具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600432
其中R＝OR′、SR′、NR′、烷基或卤化物和R′＝烷基、芳基或H，其中R可以在2，3，4或5位，可以如下合成：
Figure A20058004924600433
R＝OR′、SR′、NR′、烷基、卤化物；R′＝烷基、芳基或H，
R可以在2，3，4或5位
仅仅是举例，如下文的实施例7和方案1所示，7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂革类可以由2-硝基-5-甲氧基苯甲酸来制备。用Pd/C作为催化剂，用H2还原2-硝基-5-甲氧基苯甲酸的硝基，得到2-氨基-5-甲氧基苯甲酸。2-氨基-5-甲氧基苯甲酸可以用NaNO2重氮化，然后用Na2S2处理，得到稳定的二硫化合物。无需进一步纯化，用SOCl2处理该稳定的二硫化合物，然后在Et3N存在下用2-氯乙胺处理，得到酰胺。然后通过如下的一罐式方法将酰胺化合物转化为环状化合物。可以向酰胺化合物的THF(四氢呋喃)溶液中加入还原剂(例如三甲基膦或三苯基膦)和碱(例如三乙胺)。然后将所得到的反应混合物回流3小时。还原剂(三甲基膦或三苯基膦)就地将二硫键(S-S)分解为单硫(-S)，经过与氯的分子内环化得到环状的酰胺。然后用LiAlH4还原环状的酰胺，得到1，4-苯并硫氮杂革类中间体，7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂类。然后可以从7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂类制备JTV-519，包括使7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂革类与3-溴丙酰氯反应，然后使所得到化合物与4-苄基哌啶反应。
本发明进一步提供一种组合物，包含放射标记的JTV-519。可以用本领域已知的各种不同放射性标记中的一种完成JTV-519的标记。本发明的放射性标记可以是，例如放射性同位素。放射性同位素可以是发射可检测辐射的任意同位素，包括但不限于，35S、125I、3H或14C。放射性同位素发射的放射性可以通过本领域公知的技术检测。例如，可以用γ显像技术，特别是闪烁成像检测放射性同位素的γ辐射。
仅仅是举例，如下文的实施例8和方案2所示，放射性标记的JTV-519可以如下制备。可以用BBr3将JTV-519在苯环上脱甲基化。然后在碱(例如NaH)存在下用放射性标记的甲基化剂(例如3H-硫酸二甲酯)将所得到的酚化合物再甲基化，得到3H-标记的JTV-519。
本发明进一步提供新的1，4-苯并硫氮杂革类中间体和衍生物，包括与JTV-519类似的2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂类。仅仅是举例，本发明提供具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600441
其中R＝芳基、烯基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；
Figure A20058004924600452
其中R＝CO(CH2)nXR′2、SOX(CH2)nXR′2或SO2NH(CH2)nXR′2，并且X＝N或S，并且n＝1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；并且其中m＝1或2；
Figure A20058004924600453
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；并且其中X＝NH或O。还提供另一种具有下列通式的2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂类化合物：
Figure A20058004924600454
其中R1＝在苯环2，3，4或5位的OR′、SR、NR′、烷基或卤化物，并且R′＝烷基、芳基或H；其中R2＝H、烷基或芳基；并且其中R3＝H、烷基或芳基。
本发明人的新1，4-苯并硫氮杂类化合物的例子包括但不限于，S7、S-20、S-25、S-27和S36。优选地，该化合物是S36。S7、S-20、S-25、S-27和S36的结构可以参见附图8。本发明的这些和其他任意的新化合可以与如上所述的药学可接受的载体结合，以形成药物组合物。
本发明人的新1，4-苯并硫氮杂类化合物与JTV-519具有相同的功能性质。例如，与J TV-519(mwt＝423)类似，化合物S36(mwt＝267)调节钙通道。确实，S36(一种羧酸)在调节钙通道方面比JTV-519强约10倍(数据未显示)。但与JTV-519不同，本发明人的新化合物显示了对hERGs较弱的阻滞活性。
快速的延迟整流(I(Kr))通道—钾通道对于心脏动作电位的复极化是重要的。HERG是I(Kr)通道的成孔亚单元。作为在hERG中有害的药物作用和/或遗传缺陷的结果，I(Kr)功能被抑制会导致长-QT(LQT)综合征，其会使危及生命的心律失常的危险增加。然后作为钾通道亚单元的hERGs当被阻滞时会导致心律失常和心源性猝死。
与JTV-519相比，本发明人的化合物能够显著降低hERG(I(Kr))通道的阻滞。例如附图4-7所示，本发明人的一种化合物S36具有比JTV-519的hERG阻滞活性低约5到10倍的hERG阻滞活性。由于本发明人的化合物具有较弱的hERG阻滞活性，因此它们有望比JTV-519的毒性更低。
基于上述理由，本发明人的新化合物比JTV-519更为有效，而且毒性降低。因此，可以相信，本发明人的新化合物在任何上述的在患者中限制或预防与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低的方法中是特别有用的，其中所述患者包括是心力衰竭、心房纤颤或运动诱导的心律失常的候选者的患者。也可以相信，本发明人的新化合物在治疗或预防患者心力衰竭、心房纤颤或运动诱导的心律失常的方法和预防患者运动诱导的心源性猝死的方法中是特别有用的。
因此，本发明提供一种在患者中限制或预防与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低的方法，包括给所患者施用有效在患者中限制或预防与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低量的试剂，其中所述试剂选自：
Figure A20058004924600471
其中R＝芳基、烯基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；
Figure A20058004924600472
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；
Figure A20058004924600473
其中R＝CO(CH2)nXR′2、SO2(CH2)nXR′2或SO2NH(CH2)nXR′2，并且X＝N或S，并且n＝1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；并且其中m＝1或2；
Figure A20058004924600474
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；并且其中X＝NH或O；和
Figure A20058004924600481
其中R1＝在苯环2，3，4或5位的OR′、SR、NR′、烷基或卤化物，并且R′＝烷基、芳基或H；其中R2＝H、烷基或芳基；并且其中R3＝H、烷基或芳基。如上所述，患者可以是任意的动物，但是优选是人。在一个实施方案中，患者具有儿茶酚胺多形性室性心动过速(CPVT)。在另一个实施方案中，患者是心力衰竭、心房纤颤或运动诱导的心律失常的候选者。在另一个实施方案，该试剂选自S4、S7、S-20、S-24、S-25、S-26、S-27和S36。这些试剂的结构可以参见附图8。
根据本发明的方法，可以通过降低患者中磷酸化的RyR2的水平来限制或预防与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低。在一个实施方案中，在患者中有效限制或预防与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低的试剂的量是在患者中治疗或预防心力衰竭、心房纤颤，和/或运动诱导的心律失常的试剂的量。在另一个实施方案中，在患者中有效限制或预防与RyR2结合的FKBP12.6的水平降低的试剂的量是在患者中有效预防运动诱导的心源性猝死的试剂的量。
基于上述内容，本发明进一步提供一种在患者中治疗或预防运动诱导的心律失常的方法，包括给患者施用如本文所述的新的1，4-苯并硫氮杂类化合物，其量可以有效地在患者中治疗或预防运动诱导的心律失常。类似地，本发明提供一种在患者中预防运动诱导的心源性猝死的方法，包括给患者施用如本文所述的新的1，4-苯并硫氮杂革类化合物，其量可以有效地在患者中预防运动诱导的心源性猝死。此外，本发明提供一种在患者中治疗或预防心房纤颤或心力衰竭的方法，包括给患者施用如本文所述的新的1，4-苯并硫氮杂类化合物，其量可以有效地在患者中治疗或预防心房纤颤或心力衰竭。在每一种方法中，新的1，4-苯并硫氮杂类化合物可以选自：
Figure A20058004924600482
其中R＝芳基、烯基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；
Figure A20058004924600491
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；
Figure A20058004924600492
其中R＝CO(CH2)nXR′2、SO2(CH2)nXR′2或SO2NH(CH2)nXR′2，并且X＝N或S，并且n＝1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；并且其中m＝1或2；
Figure A20058004924600493
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；并且其中X＝NH或O；和
其中R1＝在苯环2，3，4或5位的OR′、SR′、NR′、烷基或卤化物，并且R′＝烷基、芳基或H；其中R2＝H、烷基或芳基；并且其中R3＝H、烷基或芳基。
本发明进一步提供合成如本文所述的新的1，4-苯并硫氮杂类化合物的方法。例如，本发明提供一种合成具有下列通式的化合物的方法：
Figure A20058004924600501
其中R＝芳基、烯基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，
1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基，包括下列步骤：
(a)用磺酰氯化合物(包括任意的磺酰氯衍生物)和碱处理具有下列通
式的化合物：
Figure A20058004924600502
以形成具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600503
(b)任选地，用伯或仲胺处理步骤(a)形成的化合物，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600504
其中R如上定义。在一个实施方案中，在步骤(a)中的磺酰氯化合物选自烷基磺酰氯和芳基磺酰氯。在另一个实施方案中，在步骤(a)中的碱是Et3N。在另一个实施方案中，在步骤(b)中的伯或仲胺是4-苄基哌啶。
本发明的方法进一步包含用氧化剂氧化具有下列通式的化合物的步骤：
Figure A20058004924600505
其中R＝芳基、烯基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600511
其中R如上定义并且其中m＝1或2。在本发明的一个实施方案中，氧化剂是过氧化氢。
仅仅是举例，并且如实施例9和方案3所示，本发明人已经开发出了一种合成具有下列通式结构化合物的方法：
Figure A20058004924600512
其中R＝芳基、烯基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基。通过在碱例如Et3N存在下，使7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂与烷基磺酰氯或芳基磺酰氯反应，制备该通式结构的新化合物。接着进行其他反应(例如，4-苄基哌啶的加成)，以延伸出所需的侧链。如方案3所示，可以在0℃下将2-氯乙烷磺酰氯(例如，180mg；1.1mM)和Et3N(例如，140mg；1.1mM)加入到7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂革类(1)(例如，194mg；1mM)的CH2Cl2(例如，20m l)中。然后搅拌该混合物(例如，在0℃下搅拌2小时)并洗涤(例如，用H2O和饱和NaHCO3溶液)。除去溶剂得到粗产品，其可以在硅胶上通过色谱纯化。通过NMR证明其结构。方案3进一步表明，所得到的化合物的侧链可以通过该化合物(例如，28mg；0.1mM)与4-苄基哌啶(例如，21mg；0.13mM)在CH2Cl2中的反应而延伸。在反应完成后，通过碱清除剂(例如，3-(2-琥珀酸酐)丙基官能化硅胶，0.5g)除去过量的胺。
本发明进一步提供一种合成具有下列通式的化合物的方法：
Figure A20058004924600513
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基，包括下列步骤：在碱存在下用磺酰氯和伯或仲胺处理具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600521
以形成具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600522
其中R如上定义。在本发明的一个实施方案中，碱是Et3N。在另一个实施方案中，伯或仲胺是1-胡椒基哌嗪。
本发明的方法进一步包含氧化具有下列通式的化合物的步骤
Figure A20058004924600523
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600524
其中R如上定义且其中m＝1或2。在一个实施方案中，所述氧化剂是过氧化氢。
仅仅是举例，如实施例9和方案4所示，本发明人已经开发出了一种合成具有下列通式结构的化合物：
Figure A20058004924600525
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，且n＝0，1，2或3，且R′＝烷基或环烷基。通过在碱(例如Et3N)存在下使7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂与磺酰氯，然后与伯或仲胺反应，制备该通式结构的新化合物。如方案4所示，可以在0℃下将磺酰氯(例如，15.0mg；0.111mM)和Et3N(例如，28.0mg；0.22mM)加入到7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂类(例如，19.4mg；0.1mM)CH2Cl2(例如，20ml)中。搅拌该混合物(例如，在0℃下搅拌2小时)后可以加入1-胡椒基哌嗪(例如，27mg；0.12mM)。将混合物再搅拌2小时，并洗涤(例如，用H2O和饱和NaHCO3溶液)。通过加入碱清除剂(例如，3-(2-琥珀酸酐)丙基官能化硅胶，0.5g)除去过量的胺。
本发明进一步提供一种合成具有下列通式的化合物的方法：
Figure A20058004924600531
其中R＝CO(CH2)nXR′2、SO2(CH2)nXR′2或SO2NH(CH2)nXR′2，并且X＝N或S，并且n＝1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；且其中m＝1或2，包括用氧化剂处理具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600532
其中R如上定义，以形成具有下列通式的化合物：
其中R和m如上定义。在一个实施方案中，所述氧化剂是过氧化氢。该方法也可以用于氧化JTV-519。
本发明进一步提供一种合成具有下列通式的化合物的方法：
Figure A20058004924600534
其中R＝CO(CH2)nXR′2、SO2(CH2)nXR′2或SO2NH(CH2)nXR′2，且X＝N或S，且n＝1，2或3，且R′＝烷基或环烷基；且其中m＝1或2，包括用氧化剂处理具有下列通式的化合物：
以形成具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600542
其中R和m如上定义。在一个实施方案中，所述氧化剂是过氧化氢。该方法也可以用于氧化JTV-519。
仅仅是举例，如实施例9和方案5所示，本发明已经开发出了一种合成具有下列通式结构的化合物的方法：
其中R＝CO(CH2)nXR′2、SO2(CH2)nXR′2或SO2NH(CH2)nXR′2，且X＝N或S，且n＝1，2或3，且R′＝烷基或环烷基；且其中m＝1或2。通过用过氧化氢氧化JTV-519或一种本文所述的新的1，4-苯并硫氮杂革类衍生物，制备该通式结构的新化合物，如方案5所示，可以将感兴趣的1，4-苯并硫氮杂革类化合物(例如，21mg；0.05mM)的MeOH(例如，5ml)溶液加入到H2O2(例如，0.1m l，过量)中。搅拌该混合物(例如，2天)，并可以在硅胶(例如，CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)上通过色谱法纯化所得到的产品。
此外，本发明提供一种合成具有下列通式的化合物的方法：
Figure A20058004924600544
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，且n＝0，1，2或3，且R′＝烷基或环烷基；且其中X＝NH或O，包括在碱存在下用碳酰氯化合物，和用伯或仲胺或醇处理具有下列通式的化合物的步骤：
Figure A20058004924600551
以形成具有下列通式的化合物：
其中R和X如上定义。在一个实施方案中，碳酰氯化合物是三光气。在另一个实施方案中，碱是Et3N。在另一个实施方案中，伯或仲胺是4-苄基哌啶。
仅仅是举例，如实施例9和方案6所示，本发明人已经开发出一种合成具有下列通式结构的化合物的方法：
Figure A20058004924600553
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，且n＝0，1，2或3，且R′＝烷基或环烷基；且其中X＝NH或O。通过在碱(例如，Et3N)存在下使7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂革与三光气反应，然后加入伯或仲胺或醇，制备该通式结构的新化合物。
本发明进一步提供一种合成具有下列通式的2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂化合物的方法：
Figure A20058004924600554
其中R1＝在苯环2，3，4或5位的OR′、SR′、NR′、烷基或卤化物，且R′＝烷基、芳基或H；其中R2＝H、烷基或芳基；且其中R3＝H、烷基或芳基，包括下列步骤：
(a)在任选催化剂存在下，用还原剂处理具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600555
其中R1如上定义，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600561
其中R1如上定义；
(b)用重氮化剂和二硫化物处理在步骤(a)中形成的化合物，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600562
其中R1如上定义；
(c)用活化剂和氯乙胺处理在步骤(b)中形成的化合物，以形成具有下列通式的化合物：
其中R1、R2和R3如上定义；
(d)用还原剂和碱处理在步骤(c)中形成的化合物，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600564
其中R1、R2和R3如上定义；和
(e)用还原剂处理在步骤(d)中形成的化合物，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A20058004924600571
其中R1、R2和R3如上定义。
本发明还提供新的分析方法，用于基于FKBP12.6和RyR2的再结合，规律性或高通量地筛选生物活性小分子。特别地，本发明提供一种鉴定增强FKBP12.6和RyR2结合的试剂的方法，包括下列步骤：(a)得到或产生一种RyR2源；(b)在候选试剂存在下将RyR2暴露在FKBP12.6下；和(c)确定该试剂是否增强RyR2和FKBP12.6结合。在一个实施方案中，RyR2是PKA-磷酸化的。在另一个实施方案中，RyR2是PKA-超磷酸化的。在另一个实施方案中，RyR2是未PKA-磷酸化的。
在本发明的方法中，将RyR2固定到固相上，例如盘或珠上。为了促进对RyR2-FKBP12.6结合的检测，FKBP12.6可以是放射性标记的(例如，用32S)。此外，可以用FKBP12.6-结合剂检测Ry R2和FKBP12.6的结合增强。在一个实施方案中，所述FKBP12.6-结合剂是抗-FKBP12.6抗体。本发明也提供一种通过该方法鉴定的试剂，以及该试剂在限制或预防患者与RyR2-结合的FKBP12.6水平降低的方法中的应用；在治疗或预防患者心力衰竭、心房纤颤或运动诱导的心律失常的方法中的应用；在预防患者运动诱导的心源性猝死的方法中的应用。
此外，本发明提供一种鉴定增强FKBP12.6和RyR2结合的试剂的方法，包括下列步骤：(a)得到或产生一种FKBP12.6源；(b)在候选试剂存在下将FKBP12.6暴露在RyR2下；和(c)确定该试剂是否增强RyR2和FKBP12.6结合。在一个实施方案中，RyR2是PKA-磷酸化的。在另一个实施方案中，RyR2是PKA-超磷酸化的。在另一个实施方案中，RyR2是未PKA-磷酸化的。
在本发明的方法中，将FKBP12.6固定到固相上，例如盘或珠上。为了促进对RyR2-FKBP12.6结合的检测，RyR2可以是放射性标记的(例如，用32P)。此外，可以用RyR2-结合剂检测Ry R2和FKBP12.6的结合增强。在一个实施方案中，RyR2-结合剂是抗-RyR2抗体。本发明也提供一种通过该方法鉴定的试剂，以及该试剂在限制或预防患者与RyR2-结合的FKBP12.6水平降低的方法中的应用；在治疗或预防患者心力衰竭、心房颤动或运动诱导的心律失常的方法中的应用；在预防患者运动诱导的心源性猝死的方法中的应用。
仅仅是举例，如下文实施例10所示，通过用标准方法在用谷胱甘肽包被的96-孔板上固定FKBP12.6{例如，野生型FKBP12.6或融合蛋白，例如GST-FKBP12.6}，已经开发出了高筛选小分子的高效分析法。PKA-磷酸化的2型兰诺定受体(RyR2)可以负载到FKBP12.6-包被的板上，并用不同浓度(10-100nM)的JTV-519类似物和其他1，4-苯并硫氮杂???衍生物温育30分钟。然后，可以洗涤该板除去未结合的RyR2，然后用抗-RyR2抗体温育(例如，30分钟)。再次洗涤该板除去未结合的RyR2，然后用荧光标记的次级抗体处理。可以通过自动荧光板读数器为该板的结合活性读数。
可替代地，可以在32P-ATP存在下将RyR2进行PKA-磷酸化。放射性的PKA-磷酸化的RyR2可以在不同浓度的JTV-519类似物和其他1，4-苯并硫氮杂衍生物存在下，在FKBP12.6-包被的96孔板上负载30分钟。洗涤该板除去未结合的RyR2，然后通过自动板读数器读数。也可以将PKA-磷酸化的RyR2包被到板上，并在类似物和衍生物存在下用32S-标记的FKBP12.6温育。
将在下面的实施例中描述本发明，其目的在于理解本发明，而不应当认为是以任何方式限制由下文的权利要求限定的本发明的范围。
实施例
实施例1-缺少FKBP12.6的小鼠
如前所述，产生缺少FKBP12.6的小鼠(Wehrens等人，FKBP12.6deficiency and defective calcium release channel(ryanodinereceptor)function linked to exercise-induced sudden cardiacdeath.Cell，113：829-40，2003)。简言之，用全长的鼠cDNA探针从DBA/1 lac J库中分离人FK506结合蛋白12.6(FKBP12.6)的鼠直系同源物的小鼠基因组λ-噬菌体克隆。设计从靶载体中删除外显子3和4，其包含鼠FKBP12.6的全部编码序列(Bennett等人，Identification and characterization of the murine FK506bindingprotein(FKBP)12.6gene.Marnm.Genome，9：1069-71，1998)，包括用PGK-neo的可选标记替代3.5kb的鼠基因组DNA。将5.0-kb5′片段和1.9-kb3′片段克隆到pJNS2中，后者是具有PGK-neo和PGK-TK盒的主链载体。用已确定的方案使DBA/lacJ胚胎系统(ES)细胞生长并被转染。通过Southern分析首先筛选靶向的ES细胞，通过PCR分析5种阳性ES细胞株以证实同源重组。将雄性嵌合体繁殖成DBA/llacJ雌性，通过棕色包衣色鉴定种系后代。用5′Southern分析遗传该种系后代。将阳性KBP12.6+/-雄性和雌性杂交并繁殖，结果产生了频率约25％的FKBP12.6-/-小鼠。繁殖FKBP12.6-/-小鼠。
所有研究均是用FKBP12.6-/-小鼠进行的，并用年龄和性别匹配的KBP12.6+/+小鼠作为对照。在下列背景下没有观测到FKBP12.6-/-小鼠的差异：DBA/C57BL6混合，纯DBA和纯C57BL6
实施例2-在小鼠中进行遥测记录和运动试验
根据Institutional Animal Care and Use Committee of ColumbiaUniversity认可的方案维持和研究FKBP12.6+/+和FKBP12.6-/-小鼠。用2.5％的异氟烷吸入麻醉来麻醉小鼠。在腹膜内植入>7天后得到可走动动物的ECG生物遥测记录(Data Sciences International，St.Paul，MN)(Wehrens等人，FKBP12.6 deficiency and defective calciumrelease channel(ryanodine receptor)function linked toexercise-induced sudden cardiac death.Cell，113：829-40，2003)。对于应激试验，让小鼠在倾泻的跑台上运动直至虚脱，然后用肾上腺素(0.5-2.0mg/kg)腹膜内注射(Wehr en s等人，FKBP12.6deficiency and defective calcium release channel(ryanodinereceptor)function linked to exercise-induced sudden cardiacdeath.Cell，113：829-40，2003)。将超过4小时的可走动动物的静息心率平均。
实施例3-野生型和RvR2-S2809D突变体的表达
如前所述，进行RyR2(RyR2-S28090)上的PKA靶位的诱变(Wehrens等人，FKBP12.6 deficiency and defective calcium releasechannel(ryanodine receptor)function linked toexercise-induced sudden cardiac death.Cell，113：829-40，2003)。用20μg的RyR2野生型(WT)或突变cDNA，和用5μg的FKBP12.6cDNA，使用Ca2+磷酸盐沉淀将HEK293细胞共转染。如前所述制备包含RyR2通道的囊泡(Wehrens等人，FKBP12.6 deficiencyand defective calcium release channel(ryanodine receptor)function linked to exercise-induced sudden cardiac death.Cell，113：829-40，2003)。
实施例4-RyR2 PKA磷酸化和FKBP12.6结合
如前所述制备心脏SR膜(Marx等人.，PKA phosphorylationdissociates FKBP12.6 from the calcium releasechannel(ryanodine receptor)：defective regulation in failinghearts.Cell，101：365-76，2000；Kaftan等人，Effects ofrapamyrin on ryanodine receptor/Ca2+-release channel fromcardiac muscle.Circ.Res.，78：990-97，1996)。用来自Promega(Madison，WI)的TNTTM快速偶合转录/翻译系统产生35S-标记的FKBP12.6。使用[3H]ryanodine结合来定量RyR2的水平。在100μl的10-mM咪唑缓冲液(pH6.8)中稀释100μg的微粒体，用250-nM(最终浓度)[35S]-FKBP12.6在37℃下温育60分钟，然后用500μl的冰冷咪唑缓冲液使反应停止。样品以100,000g离心10分钟，在咪唑缓冲液中洗涤3次。通过小丸沉淀物的液体闪烁计数确定结合的[35S]-FKBP12.6的量。
实施例5  免疫印迹
如所述，用抗-FKBP12/12.6(1∶1,000)、抗-RyR-5029(1∶3,000)(Jayaraman等人，FK506 binding protein associated withthe calcium release channel(ryanodine receptor).J.Biol.Chem.，267：9474-77，1992)或在室温下使用抗-phosphoRyR2-P2809(1∶5，000)1小时(Reiken等人，Beta-blockers restore calcium releasechannel function and improve cardiac muscle performance inhuman heart failure.Circulation，107:2459-66，2003)进行微粒体(50μg)的免疫印迹。P2809-磷表位-特异性抗-RyR2抗体是亲和力纯化的多克隆兔子抗体，由Zymed Laboratories(San Francisco，CA)用在Ser2809上与RyR2 PKA-磷酸化相对应的肽，CRTRRI-(pS)-QTSQ定制而成。在用HRP-标记的抗-兔IgG(1∶5,000稀释；TransductionLaboratories，Lexington，KY)温育后，用ECL(Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ)产生印迹。
实施例6-单-通道记录
如前所述，在0mV的电压箝条件下从小鼠心脏或重组RyR2中得到阴性RyR2的单-通道记录(Marx等人，PKA phosphorylationdissociates FKBP 12.6 from the calcium releasechannel(ryanodine receptor)：defective regulation in failinghearts.Cell，101:365-76，2000)。用于通道记录的均衡溶液是：反式室-HEPES，250mmol/L；Ba(OH)2，53mmo l/L(在一些实施方案中，用Ca(OH)2代替Ba(OH)2)；pH7.35；和顺式室-HEPES，250mmol/L；Tris-碱，125mmol/L；EGTA，1.0mmo l/L；和CaCl2，0.5mmol/L；pH7.35。除非另有说明，单通道记录是在顺式室中在150-nM[Ca2+]和1.0-mM[Mg2+]存在下完成的。将Ryanodine(5mM)应用于反式室，以证实对所有通道的鉴定。用Fetchan软件(Axon Instruments，UnionCity，CA)从数字化的电流记录中分析数据。所有数据用平均值±SE来表示。用不成对的Student′s t-检验对实验的平均值进行统计学比较。认为p<0.05的值是统计学显著的。
JTV-519对于RyR2通道的作用列于附图1-3和表1(下文)中。如附图3所示，单通道研究表明，与特异性PKA抑制剂PKI5-24存在下进行的PKA磷酸化(C)相比，在PKA磷酸化后RyR2的开放概率增加(D)。在JTV-519存在下，用FKBP12.6温育的PKA-磷酸化的RyR2使单通道功能正常化(E)。在PKA-磷酸化而不接着用JTV-519和FKBP12.6处理的RyR2中，幅度直方图(右)表明了活性和亚电导开放的增加。附图3表明在JTV-519存在下，用FKBP12.6温育PKA-磷酸化的RyR2使Ry R2激活的Ca2+依赖性向右位移，使得它与未磷酸化通道的Ca2+依赖性类似。
表1.在运动前、其间和运动后并且注射肾上腺素后可走动的ECG的数据
SCL(ms) HR(bpm) PR(ms) QRS(ms) QT(ms) QTc(ms)
基线FKBP12.6+/-FKBP12.6+/-+JTV-519FKBP12.6-/-+JTV-519最大运动FKBP12.6+/-FKBP12.6+/-+JTV-519FKBP12.6-/-+JTV-519运动后+肾上腺素FKBP12.6+/-FKBP12.6+/-+JTV-519FKBP12.6-/-+JTV-519 104±699±5116±980±290±783±394±4102±4103±4 586±36608±32527±43752±18676±49729±22645±28592±21585±20 32±1.533±0.633±0.428±0.729±1.829±235±2.637±2.635±3.8 9.9±0.49.3±0.310.0±0.38.7±0.49.6±0.49.3±0.39.3±0.49.9±0.611.1±0.5 30±1.032±2.733±1.330±1.734±2.030±1.233±1.832±2.336±1.2 29±0.632±1.930±1.133±1.636±0.933±0.934±1.932±1.736±1.3
用JTV-519(n＝8)或对照(n＝6)处理的FKBP12.6+/-小鼠和用JTV-519(n＝5)处理的FKBP12.6-/-小鼠中可走动的ECG的数据的汇总。SCL＝窦性周期长度；HR＝心率；ms＝毫秒；bpm＝每分钟心跳次数；FKBP12.6+/-＝FKBP12.6杂合小鼠；FKBP12.6-/-＝缺乏FKBP12.6的小鼠
实施例7-1,4-苯并硫氮杂中间体和JTV-519的合成
对于体内试验，本发明人需要几克的JTV-519。但是，在开始试图通过所报道的1，4-苯并硫氮杂中间体，7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂(方案1中的化合物6，下文)制备该化合物时没有成功。该中间体的硫基容易被空气氧化成二硫化合物，这使得合成环状产物(5)变得不可能。为了解决这个问题，本发明人发展出了从容易获得和便宜的2-硝基-5-甲氧基苯甲酸(1)开始的新方法。该方法如下文的方案1所示。
以Pd/C作为催化剂，用H2还原化合物(1)的硝基，定量得到2-氨基-5-甲氧基苯甲酸(2)。用NaNO2重氮化化合物(2)，然后用Na2S2处理，得到收率为80％的稳定的二硫化合物(3)。无需进一步纯化，用SOCl2处理该稳定的二硫化合物(3)，然后在Et3N存在下与2-氯乙胺反应，得到收率为90％的酰胺(4)。经一罐式方法，通过在THF中与三甲基膦和Et3N回流将化合物(4)转化为环状化合物(5)。然后用LiAlH4还原环状的酰胺(5)，得到7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂(6)。
通过将化合物(6)与3-溴丙酰氯反应，然后将所得到的产品与4-苄基哌啶反应，制备JTV-519。通过1H NMR确定JTV-519的结构。
方案1
Figure A20058004924600631
实施例8-放射标记的JTV-519的合成
本发明人的新的合成放射标记的JTV-519的方法如下文方案2所示。为了制备放射标记的JTV-519，用BBr3在苯环上将JTV-519脱甲基化，得到酚化合物(21)。在碱(NaH)存在下用放射标记的甲基化剂(3H-硫酸二甲酯)将酚化合物(21)再次甲基化，得到3H-标记的JTV-519(方案2)。
方案2
Figure A20058004924600641
实施例9-新的1，4-苯并硫氮杂衍生物和合成它们的方法
本发明已经发展出了用于治疗和预防心律失常的新的1，4-苯并硫氮杂衍生物。特别地，本发明人制备了具有下列通式结构的化合物：
Figure A20058004924600642
其中R＝芳基、烯基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，且n＝0，1，2或3，且R′＝烷基使或环烷基。通过在碱例如Et3N存在下，使7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂与烷基磺酰氯或芳基磺酰氯反应，制备该通式结构的新化合物。接着进行其他反应(例如，4-苄基哌啶的加成)，以延伸出所需的侧链。该一般性方法的代表性合成如下文方案3所示。
如方案3所示，可以在0℃下将2-氯乙烷磺酰氯(180mg；1.1mM)和Et3N(140mg；1.1mM)加入到7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂(1)(194mg；1mM)的CH2Cl2(20ml)中。然后混合物在0℃下搅拌2小时并用H2O和饱和NaHCO3溶液洗涤。除去溶剂得到粗产品(Ia)，其可以在硅胶上通过色谱(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)纯化。该合成的收率是280mg或95％。通过NMR证实其结构。
方案3进一步表明，化合物(Ia)侧链可以通过使化合物(Ia)(28mg；0.1mM)与4-苄基哌啶(例如，21mg；0.13mM)在CH2Cl2中的反应而延伸。在反应完成(通过TLC)后，通过碱清除剂(3-(2-琥珀酸酐)丙基官能化硅胶，0.5g)除去过量的胺。1HNMR和HPLC表明，产品(Ib)的纯度>98％。
方案3
Figure A20058004924600651
此外，本发明人制备了具有下列通式结构的化合物：
Figure A20058004924600652
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，且n＝0，1，2或3，且R′＝烷基或环烷基。通过在碱(Et3N)存在下，使7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂与磺酰氯，然后与伯或仲胺反应，制备该通式结构的新化合物。该一般性方法的代表性合成如下文方案4所示。
如方案4所示，可以在0℃下将磺酰氯(15.0mg；0.111mM)和Et3N(28.0mg；0.22mM)加入到7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂(1)(19.4mg；0.1mM)CH2Cl2(20ml)中。在混合物在0℃下搅拌2小时后加入1-胡椒基哌嗪(27mg；0.12mM)。将混合物再搅拌2小时，并用H2O和饱和NaHCO3溶液洗涤。通过加入碱清除剂(例如，3-(2-琥珀酸酐)丙基官能化硅胶，0.2g)除去过量的胺。该合成的收率是36mg或77％。
方案4
本发明人也制备了具有下列通式结构的化合物：
Figure A20058004924600661
其中R＝CO(CH2)nXR′2、SO2(CH2)nXR′2或SO2NH(CH2)nXR′2，且X＝N或S，且n＝1，2或3，且R′＝烷基或环烷基；且其中m＝1或2。通过用过氧化氢氧化JTV-519或一种本文所述的新的1，4-苯并硫氮杂衍生物，制备该共同结构的新化合物。该一般性方法的代表性合成如下文方案5所示。
如方案5所示，将化合物(Ib)(21mg；0.05mM)的MeOH(例如，5ml)加入到H2O2(0.1ml，过量)中。搅拌该混合物2天，在硅胶(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)上通过色谱法纯化产品III。该合成的收率是19mg或91％。
方案5
最后，本发明人也制备了具有下列通式结构的化合物：
Figure A20058004924600663
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，且n＝0，1，2或3，且R′＝烷基或环烷基；和其中X＝NH或O。通过在碱(Et3N)存在下，使7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂(1)与三光气反应，然后加入伯或仲胺或醇，制备该共同结构的新化合物。该一般性方法的代表性合成如下文方案6所示。
方案6
Figure A20058004924600664
实施例10-高通量筛选的分析法
本发明人已经发展出了筛选生物活性小分子的分析法。这些分析是基于FKBP12蛋白与RyR2的再结合。
高通量筛选小分子的高度有效的分析法可以通过将FKBP12.6(GST-融合蛋白)固定在谷胱甘肽包被的96孔板上来实现。PKA-磷酸化的2型RYANODINE受体(RyR2)可以负载到FKBP12.6-包被的板上，并用不同浓度(10-100nM)的JTV-519类似物温育30分钟。然后，洗涤该板除去未结合的RyR2，然后用抗-RyR2抗体温育30分钟。再次洗涤该板除去未结合的RyR2，然后用荧光标记的次级抗体处理。可以通过自动荧光板读数器给该板的结合活性读数。
在一个可替代的分析法中，RyR2是在32P-ATP存在下被PKA-磷酸化的。在不同浓度(10-100nM)的JTV-519类似物存在下，将放射性PKA-磷酸化的RyR2负载到FKBP12.6-包被的96-孔板上。洗涤该板除去未结合的放射性标记的RyR2，然后通过自动板读数器读数。
尽管出于清楚和理解的目的，已经描述了上述发明，但通过阅读所述内容，本领域技术人员将会理解，在不脱离附属的权利要求的本发明的真实范围的前提下，可以做出各种形式和内容的改变。

Claims (22)

1.具有下列通式的化合物：
Figure A2005800492460002C1
其中R＝芳基、烯基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基。
2.具有下列通式的化合物：
Figure A2005800492460002C2
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基。
3.具有下列通式的化合物：
Figure A2005800492460002C3
其中R＝CO(CH2)nXR′2、SO2(CH2)nXR′2或SO2NH(CH2)nXR′2，并且X＝N或S，并且n＝1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；并且其中m＝1或2。
4.具有下列通式的化合物：
Figure A2005800492460002C4
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；并且其中X＝NH或O。
5.化合物，选自S7、S-20、S-25、S-27和S36。
6.合成具有下列通式的化合物的方法：
Figure A2005800492460003C1
其中R＝芳基、烯基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基，包括下列步骤：
(a)用磺酰氯化合物和碱处理具有下式的化合物：
Figure A2005800492460003C2
以形成具有下式的化合物：
Figure A2005800492460003C3
(b)任选地，用伯或仲胺处理步骤(a)中形成的化合物，以形成具有下式的化合物：
Figure A2005800492460003C4
其中R如上定义。
7.权利要求6的方法，其中步骤(a)中的磺酰氯化合物选自烷基磺酰氯和芳基磺酰氯。
8.权利要求7的方法，其中步骤(a)中的碱是Et3N。
9.权利要求6的方法，其中步骤(b)中的伯或仲胺是4-苄基哌啶。
10.权利要求6的方法，进一步包含用氧化剂氧化具有下列通式的化合物的步骤：
Figure A2005800492460003C5
其中R＝芳基、烯基，烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基，以形成具有下列通式的化合物：
其中R如上定义，并且其中m＝1或2。
11.权利要求10的方法，其中所述的氧化剂是过氧化氢。
12.合成具有下列通式的化合物的方法：
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基，包括在碱存在下，用磺酰氯和伯或仲胺处理具有下式的化合物的步骤：
Figure A2005800492460004C3
以形成具有下列通式的化合物：
Figure A2005800492460004C4
其中R如上定义。
13.权利要求12的方法，其中所述的碱是Et3N。
14.权利要求12的方法，其中所述的伯或仲胺是1-胡椒基哌嗪。
15.权利要求12的方法，进一步包含氧化具有下列通式的化合物的步骤：
Figure A2005800492460005C1
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A2005800492460005C2
其中R如上定义并且其中m＝1或2。
16.合成具有下列通式的化合物的方法：
Figure A2005800492460005C3
其中R＝CO(CH2)nXR′2、SO2(CH2)nXR′2或SO2NH(CH2)nXR′2，并且X＝N或S，并且n＝1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；并且其中m＝1或2，包含用氧化剂处理具有下列通式的化合物的步骤：
Figure A2005800492460005C4
其中R如上定义，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A2005800492460005C5
其中R和m如上定义。
17.权利要求16的方法，其中所述的氧化剂是过氧化氢。
18.合成具有下列通式的化合物的方法：
Figure A2005800492460005C6
其中R＝芳基、烷基、-(CH2)nNR′2或-(CH2)nSR′，并且n＝0，1，2或3，并且R′＝烷基或环烷基；并且其中X＝NH或O，包含在碱存在下用碳酰氯化合物，和用伯或仲胺或醇处理具有下式的化合物的步骤：
Figure A2005800492460006C1
以形成具有下列通式的化合物：
其中R和X如上定义。
19.权利要求18的方法，其中所述的碳酰氯化合物是三光气。
20.权利要求18的方法，其中所述的碱是Et3N。
21.权利要求18的方法，其中所述的伯或仲胺是4-苄基哌啶。
22.合成具有下列通式的2，3，4，5-四氢-1，4-苯并硫氮杂类化合物的方法：
Figure A2005800492460006C3
其中R1＝在苯环2，3，4或5位的OR′、SR′、NR′、烷基或卤化物，并且R′＝烷基、芳基或H；其中R2＝H、烷基或芳基；并且其中R3＝H、烷基或芳基，包括下列步骤：
(a)在任选催化剂存在下，用还原剂处理具有下列通式的化合物：
Figure A2005800492460006C4
其中R1如上定义，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A2005800492460007C1
其中R1如上定义；
(b)用重氮化剂和二硫化物处理在步骤(a)中形成的化合物，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A2005800492460007C2
其中R1如上定义；
(c)用活化剂和氯乙胺处理在步骤(b)中形成的化合物，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A2005800492460007C3
其中R1、R2和R3如上定义；
(d)用还原剂和碱处理在步骤(c)中形成的化合物，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A2005800492460007C4
其中R1、R2和R3如上定义；和
(e)用还原剂处理在步骤(d)中形成的化合物，以形成具有下列通式的化合物：
Figure A2005800492460007C5
其中R1、R2和R3如上定义。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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