CN104350045B - 用于治疗涉及调节兰诺定受体的调节障碍的活性剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及1，4-苯并噻吖庚因衍生物及其在治疗与调节在细胞中起作用的钙通道的兰诺定受体(RyRs)相关的病症、障碍和疾病中的用途。本发明还公开了包含所述化合物的药物组合物及其在治疗与RyRs相关的疾病和病症、特别是心脏障碍、肌肉骨骼障碍和中枢神经系统(CNS)障碍中的用途。

Description

用于治疗涉及调节兰诺定受体的调节障碍的活性剂
发明领域
本发明涉及1，4-苯并噻吖庚因衍生物及其在治疗与调节在细胞中起作用的钙通道的兰诺定受体(RyRs)相关的障碍和疾病中的用途。本发明还公开了包含这些化合物的药物组合物及其在治疗与RyRs相关的疾病和病症、特别是心脏障碍、肌肉骨骼障碍和中枢神经系统(CNS)障碍中的用途。
发明背景
肌浆网(SR)细胞中作为专用胞内钙(Ca2+)储存起作用等的结构。RyRs是SR中开放和闭合以调节Ca2+从SR释放入细胞的胞内细胞质的通道。Ca2+从SR释放入细胞质增加胞质Ca2+浓度。RyRs的开放几率是指RyR在任意指定时刻开放且由此能够使Ca2+从SR释放入细胞质的可能性。
存在3种类型的RyR，其全部是高度同源性的：RyR1、RyR2和RyR3。RyR1主要在骨骼肌和其它组织内发现，RyR2主要在心脏和其它组织内发现，且RyR3在脑和其它组织内发现。RyR是四聚体。RyR复合物的部分由4种RyR多肽与4种FK506结合蛋白(FKBPs)(钙通道稳定蛋白(calstabins))、特别是FKBP12(钙通道稳定蛋白1)和FKBP12.6(钙通道稳定蛋白2)结合形成。钙通道稳定蛋白1结合RyR1和RyR3，而钙通道稳定蛋白2结合RyR2。钙通道稳定蛋白结合RyR(1个分子/RyR亚单位)、稳定RyR功能、有利于相邻RyRs之间的偶联门控和通过稳定通道闭合状态防止通道异常活化(Ca2+渗漏)。
兰诺定受体2和心脏疾病
在心脏横纹肌中，RyR2是兴奋-收缩(EC)偶联和肌肉收缩所需的主要的Ca2+释放通道。在EC偶联期间，动作电位零相过程中心肌细胞膜活化电压门控Ca2+通道。Ca2+通过开放电压门控通道流入由此启动Ca2+从SR中经RyR2释放。该过程称作Ca2+-诱导的Ca2+释放。RyR2-介导的Ca2+-诱导的Ca2+释放随后活化心脏细胞中的收缩蛋白质，从而导致心肌收缩。
蛋白激酶A(PKA)使RyR2磷酸化是″斗争或逃逸″响应的重要组成部分，其通过增加对于指定触发物释放的Ca2+的量增加心脏EC偶联增益。这种信号传导途径提供了一种机制，通过该机制，交感神经系统(SNS)活化导致心输出量增加作为对应激的响应。PKA使RyR2磷酸化导致钙通道稳定蛋白2从通道中部分解离，由此导致开放几率增加和Ca2+从SR释放入胞内细胞质增加。
心力衰竭(HF)的特征在于持续的高肾上腺素能状态，其中血清儿茶酚胺水平长期升高。这种长期高肾上腺素能状态的结果是RyR2持续的PKA高度磷酸化，使得每个同型四聚化RyR2通道中的4个Ser2808中的3-4个长期磷酸化(Marx SO等人Cell，2000；101(4)：365-376)。特别地，RyR2的长期PKA高度磷酸化与通道-稳定亚单位钙通道稳定蛋白2从RyR2通道大分子复合物中耗尽相关。钙通道稳定蛋白耗尽导致SR Ca2+从RyR复合物中舒张性“渗漏”，这促成了收缩力受损(Marx等人，2000)。由于内向去极化电流活化，所以这种舒张性SR Ca2+“渗漏”还与致命性心律不齐相关(Lehnart等人，J Clin Invest.2008；118(6)：2230-2245)。实际上，用缺乏PKA磷酸化位点的RyR2改造的小鼠的心肌梗死(MI)后HF进展得以预防(Wehrens XH等人Proc NatlAcad Sci USA.2006；103(3)：511-518)。此外，HF中RyR2的长期PKA高度磷酸化与RyR2大分子复合物重建相关，所述RyR2大分子复合物包括磷酸酶(Marx等人2000)PP1和PP2a(Ser2808的去磷酸化受损)和cAMP-特异性4型磷酸二酯酶(PDE4D3)从RyR2复合物中耗尽。PDE4D3从RyR2复合物中耗尽导致局部cAMP水平持续升高(Lehnart SE等人，Cell2005；123(1)：25-35)。因此，舒张性SR Ca2+渗漏促成HF进展和心律失常。此外，近期的报告已经证实模拟RyR2的组成型PKA高度磷酸化的RyR2-S2808D+/+(天冬氨酸替代丝氨酸2808)敲除小鼠显示钙通道稳定蛋白2耗尽和渗漏性RyR2。RyR2-S2808D+/+小鼠发生年龄依赖性心肌病，显示RyR2氧化和亚硝基化升高即减少的SR Ca2+储存含量和舒张性SR Ca2 +渗漏增加。心肌梗死后，RyR2-S2808D+/+小鼠显示与WT同窝出生仔畜相比死亡率增加。用稳定RyR2-钙通道稳定蛋白2相互作用(WO 2007/024717)的S107即1，4-苯并噻吖庚因衍生物治疗抑制了RyR2-介导的舒张性SR Ca2+渗漏且减少了WT和RyR2-S2808D+/+小鼠中的HF进展(Shah等人J Clin Invest.2010Dec 1；120(12)：4375-87)。
此外，RyR2包含约33个游离硫氢基残基，其赋予细胞氧化还原状态高度敏感性。半胱氨酸氧化有利于RyR开放和SR Ca2+渗漏。Shan等人，2010证实RyR2的氧化和亚硝基化和稳定亚单位钙通道稳定蛋白2从RyR2中解离诱导SR Ca2+渗漏。
儿茶酚胺依赖性室性心动过速(CPVT)是具有结构正常心脏的个体中的遗传性疾病。超过50种不同的RyR2突变与CPVT相关。CPVT患者从幼儿到成年期间经历晕厥和心脏形猝死(SCD)，且截至到35岁时的死亡率达50％。具有CPVT的个体在进行锻炼时存在室性心律失常，但在休息时不发生心律不齐。CPVT-相关RyR2突变因钙通道稳定蛋白2亚单位结合减少而导致“渗漏性”RyR2通道(Lehnart等人，2008)。因RyR2中R2474S突变产生的杂合型小鼠(RyR2-R2474S小鼠)显示自发性泛发性强直阵挛性癫痫发作(在无心律不齐的存在下发生)、锻炼诱导的室性心律失常和SCD。用S107治疗增强了钙通道稳定蛋白2与突变型RyR2-R2474S通道结合，抑制了该通道渗漏，防止了心律失常，并且升高了癫痫发作阈值(Lehnart等人，2008)。
兰诺定受体1和骨骼肌疾病
骨骼肌收缩通过SR Ca2+经RyR1的释放而被活化。横向(T)-小管膜的去极化活化二氢吡啶受体电压感受器(Cav1.1)，由此通过直接蛋白-蛋白相互作用活化RyR1通道，导致SRCa2+储存释放。Ca2+结合肌钙蛋白C，从而允许肌动蛋白-肌球蛋交叉桥连发生和肌原纤维节缩短。
在肌肉紧张延长(例如马拉松长跑期间)或疾病例如心力衰竭的情况下，两者的特征均在于SNS长期活化，骨骼肌功能受损，可能归因于EC偶联改变。特别地，每次肌肉收缩过程中Ca2+从SR中释放的量减少，异常Ca2+释放事件可能发生，且Ca2+再摄取减缓(Reiken，S，等人2003.J.Cell Biol.160：919-928)。这些观察结果启示骨骼肌上SNS长期活化的有害作用可能至少部分归因于Ca2+信号传导缺陷。
RyR1大分子复合物由560-kDa RyR1亚单位的四聚体组成，所述560-kDa RyR1亚单位形成调节通道功能PKA和磷酸二酯酶4D3(PDE4D3)、蛋白质磷酸酶1(PP1)和钙通道稳定蛋白1的蛋白质的骨架。A-激酶锚定蛋白(mAKAP)使PKA和PDE4D3靶向RyR1，而亲棘蛋白使PP1靶向通道(Marx等人2000；Brillantes等人，Cell，1994，77，513-523；Bellinger等人J.Clin.Invest.2008，118，445-53)。PKA、PP1和PDE4D3的催化和调节亚单位调节PKA-介导的RyR1在Ser2843(小鼠中的Ser2844)的磷酸化。已经证实PKA-介导的RyR1在Ser2844的磷酸化增加了该通道对胞质Ca2+的敏感性，降低了钙通道稳定蛋白1对RyR1的结合亲和力，并且使该通道的闭合状态失去稳定性(Reiken等人，2003；Marx，S.O.等人，Science，1998，281：818-821)。据报道钙通道稳定蛋白1在骨骼肌中的浓度约200nM，且RyR1的PKA磷酸化降低了钙通道稳定蛋白1对RyR1的结合亲和力，从约100-200nM至600nM以上。因此，在生理学条件下，因RyR1在Ser2843的PKA磷酸化导致的钙通道稳定蛋白1对RyR1结合亲和力的降低足以基本上减少了钙通道稳定蛋白1存在于RyR1复合物中的量。RyR1在Ser2843的长期PKA高度磷酸化(定义为存在于每个RyR1同型四聚体中的4个PKA Ser2843位点的3或4个的PKA磷酸化)导致“渗漏性，，通道(即易于在休息时开放的通道)，这促成了与持续性高肾上腺素能状态相关的骨骼肌功能障碍，例如发生在具有心力衰竭的个体中(Reiken等人，2003)。
此外，已经报道，通过非磷酸化的翻译后修饰、例如通过半胱氨酸残基上游离硫氢基的亚硝基化(S-亚硝基化)和通道氧化调节RyR1增加RyR1通道活性。经证实RyR1的S-亚硝基化和氧化各自减少了钙通道稳定蛋白1与RyR1结合。
预先Bellinger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.2008，105(6)：2198-2002)报道，在小鼠和人中的极端锻炼期间，RyR1进行性PKA-高度磷酸化，S-亚硝基化和PDE4D3和钙通道稳定蛋白1耗尽，导致“渗漏性”通道，其导致小鼠中的运动能力下降。用S107治疗防止了钙通道稳定蛋白1从RyR1复合物中耗尽，改善了力的产生和运动能力，并且降低了Ca2+-依赖性中性蛋白酶卡配因的活性和血浆肌酐激酶水平。
杜兴肌营养不良(DMD)是主要致命性儿童遗传疾病之一。DMD是X-连锁的，其在3,500个男性初生婴儿中就侵害1个，且典型地导致截至到～30岁死于呼吸或心力衰竭。与DMD相关的肌营养不良蛋白中的突变导致肌营养不良蛋白完全缺失，由此破坏了肌膜下细胞骨架与胞外基质之间的连锁。这种连锁是保护和稳定肌肉收缩诱导的损伤所必需的。目前，无法治愈DMD且临床中的大部分治疗是治标性的。在I/II期临床试验中新出现的干预措施是外显子跳跃、筒箭毒碱抑制和增量调节肌营养不良蛋白相关蛋白质。然而，使用全身递送、支持性外显子跳跃和增量调节肌营养不良蛋白相关蛋白质存在问题。此外，在I/II期临床试验中，增加肌肉尺寸的筒箭毒碱失活未显示肌肉强度或功能改善。因肌营养不良蛋白中的突变导致的肌浆不稳定存在级联效应。一种主要的效应在于细胞溶质Ca2+浓度增加，这导致Ca2+-依赖性蛋白酶(卡配因)活化。另一种效应在于炎症和升高的iNOS活性，这可以导致蛋白质、脂质和DNA的氧化/亚硝基化。DMD肌肉病理学情况是进行性的且远超过肌膜的不稳定性。因此，这种病理学情况与增加对进一步损伤的易感性的肌膜不稳定性一致。近期证实RyR1的过渡氧化或亚硝基化可以破坏钙通道稳定蛋白1与RyR1复合物之间的相互作用，导致肌营养不良症(mdx)小鼠模型中的RyR1渗漏和肌无力，且用S107治疗改善了这种小鼠模型中的肌肉功能指数(Bellinger，A.等人2009，Nature Medicine，15：325-330)。
与年龄相关的肌肉量和力缺失(少肌症)促成了残疾和死亡率增加。Andersson，D.等人(Cell Metab.2011Aug 3；14(2)：196-207)报道，来自衰老(24个月)的小鼠的RyR1与来自较年轻(3-6个月)成年鼠的RyR1相比被氧化，半胱氨酸-亚硝基化且钙通道稳定蛋白1耗尽。这种RyR1通道复合物重建导致具有开放几率增加的“渗漏性”通道，导致骨骼肌中胞内钙渗漏。用S107治疗衰老小鼠稳定了钙通道稳定蛋白1与RyR1结合，减少了胞内钙渗漏，减少了活性氧(ROS)，并且增强了强直性Ca2+释放、肌肉-特异性力和运动能力。
PCT国际专利公开WO 2005/094457、WO 2006/101496和WO2007/024717公开了1，4-苯并噻吖庚因衍生物及其在治疗心脏、骨骼肌和认知障碍等中的用途。
PCT国际专利公开WO 2008/060332涉及1，4-苯并噻吖庚因衍生物在治疗和/或预防患有例如肌营养不良症这样的病理学情况的个体或患有肌疲劳作为持续、长期和/或大强度运动或长期紧张结果的个体中的肌疲劳中的用途。
PCT国际专利公开WO 2008/021432涉及1，4-苯并噻吖庚因衍生物在治疗和/或预防侵害神经系统的疾病、障碍和病症中的用途。
PCT国际专利公开WO 2012/019076涉及1，4-苯并噻吖庚因衍生物在治疗和/或预防心肌缺血/再灌注损伤中的用途。Fauconnier等人，Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(32)：13258-63报道了半胱天冬酶-8活化介导的RyR渗漏导致心肌缺血-再灌注后左心室损伤，且用S107治疗抑制了SR Ca2+渗漏，减少了室性心律失常、梗塞面积和再灌注后15天时的左心室重建。
PCT国际专利公开WO 2012/019071涉及1，4-苯并噻吖庚因衍生物在治疗和/或预防少肌症中的用途。
PCT国际专利公开WO 2012/037105涉及1，4-苯并噻吖庚因衍生物在治疗和/或预防应激诱发的神经元障碍和疾病中的用途。
对鉴定用于有效治疗与RyRs相关的障碍和疾病包括骨骼肌肉和心脏障碍和疾病的新化合物存在需求。更具体地，仍然需要鉴定新的活性剂，其可以用于例如通过修复RyR通道中的渗漏和增强钙通道稳定蛋白与PKA-磷酸化/氧化/亚硝基化RyRs结合治疗RyR-相关障碍，并且使RyRs突变，否则，它们对钙通道稳定蛋白具有的亲和力减少或不与之结合。
发明概述
本发明提供了新的1，4-苯并噻吖庚因衍生物及其药学可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的化合物是兰诺定受体(RyR)钙通道稳定剂，有时称作″RycalsTM″。本发明还提供了这些化合物在治疗与RyRs相关的障碍和疾病中的使用方法。
本发明的化合物选自WO 2007/024717中所述的1，4-苯并噻吖庚因衍生物。WO2007/024717描述了结构类似的化合物，然而，正如本文进一步所述的，已经发现这些化合物高度不稳定且因此其作为药物的治疗用途受限。基于本申请的问题因此在于提供可选的1，4-苯并噻吖庚因衍生物，其不仅具有药理学活性-而且具有有利的特性，例如高度代谢稳定性，且因此适合于作为治疗与RyR相关的疾病和病症例如心脏、骨骼肌肉和中枢神经系统(CNS)障碍的药物。已经令人意外地发现，式(I)的化合物是稳定的并且具有药理学活性，因此对基于本发明的问题提供了技术解决方案。
本发明的化合物表示为式(I)的结构：
其中
R是COOH；
及其药学可接受的盐。
式(I)的化合物可以以与药学可接受的酸或碱的盐的形式存在。这种盐优选自钠盐、钾盐、镁盐、半富马酸盐、盐酸盐和氢溴酸盐，其中每种可能性代表本发明的一个单独的实施方案。一种目前优选的盐是钠盐。另一种目前优选的盐是半富马酸盐。
在一些具体的实施方案中，所述化合物选自化合物1、化合物4和化合物6及其药学可接受的盐。这些化合物的结构如下文中所述。
在一个优选的实施方案中，所述化合物表示为化合物(1)的结构：
或其药学可接受的盐。
在一些实施方案中，提供作为母体化合物的化合物1。然而，在其它实施方案中，以与药学可接受的酸或碱的盐形式提供化合物1。优选地，这种盐选自钠盐、钾盐、镁盐、半富马酸盐、盐酸盐和氢溴酸盐，其中每种可能性代表本发明的一个单独的实施方案。一种目前优选的盐是钠盐。另一种目前优选的盐是半富马酸盐。
本发明还提供了合成本发明化合物及其盐的方法。
本发明还提供了包含本发明化合物的一种或多种和至少一种添加剂或赋形剂的药物组合物，所述添加剂或赋形剂例如填充剂、稀释剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、着色剂、乳化剂、味道改善剂、胶凝剂、助流剂、防腐剂、增溶剂、稳定剂、助悬剂、甜味剂、张度剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、溶胀剂、阻滞剂、润滑剂、吸收剂和粘度增加剂。可以将该组合物制成胶囊、颗粒、粉末、溶液、小药囊、混悬液或片剂剂型。
本发明还提供了治疗或预防各种与RyRs相关的障碍、疾病和病症例如心脏、肌肉骨骼、认知、CNS和神经肌肉障碍和疾病的方法，包括对需要这种治疗的个体施用有效预防或治疗与RyR相关的障碍或疾病的用量的式(I)的化合物或其盐。本发明还提供了预防或治疗个体中RyR(包括RyR1、RyR2和RyR3)渗漏的方法，包括对所述个体施用有效预防或治疗RyR渗漏的用量的式(I)的化合物或其盐。
此外，本发明提供了调节个体中RyRs和钙通道稳定蛋白结合的方法，包括对所述个体施用有效调节RyR-结合的钙通道稳定蛋白的用量的式(I)的化合物或其盐。
本发明还涉及式(I)的化合物在制备用于治疗和/或预防与RyRs相关的障碍、疾病和病症例如心脏、肌肉骨骼和认知/CNS障碍和疾病的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物在制备用于预防和/或治疗RyR渗漏的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物在制备用于调节RyR-结合的钙通道稳定蛋白的量的药物中的用途。
本发明的方法可以对体外系统(例如培养的细胞或组织)或体力(例如非人的动物或人中)实施。
在一些实施方案中，提供了本发明的化合物与外显子跳跃疗法例如反义寡核苷酸类(AOs)的组合，以便增强在所关注的mRNA例如如本文进一步描述的DMD基因中的外显子跳跃。本发明的其它特征和优点从如下详细描述和附图中显而易见。
附图简述
图1A使用在没有(-)或有100nM化合物1的存在下显示钙通道稳定蛋白2与PKA-磷酸化RyR2结合的钙通道稳定蛋白2抗体的免疫印迹。(+)：钙通道稳定蛋白结合非-PKA磷酸化RyR2。S36(US 7,544,678)用作阳性对照。
图1B使用在没有(-)或有100nM化合物2、化合物3或化合物4的存在下显示钙通道稳定蛋白2与PKA-磷酸化RyR2结合的钙通道稳定蛋白2抗体的免疫印迹。(+)：钙通道稳定蛋白结合非-PKA磷酸化RyR2。S36用作阳性对照。
图1C使用在没有(Neg)或有所示浓度的化合物1或化合物4的存在下显示钙通道稳定蛋白1与PKA-磷酸化RyR1结合的钙通道稳定蛋白1抗体的免疫印迹。(Pos)：钙通道稳定蛋白结合非-PKA磷酸化RyR1。S36用作阳性对照。
图2图2A：使用钙通道稳定蛋白1抗体的免疫印迹，所述抗体显示施用溶媒(50：50DMSO/PEG)、单独的异丙肾上腺素(ISO)或在渗透泵中的异丙肾上腺素与所示浓度的化合物1的小鼠中的胫骨裂解物的免疫沉淀的RyR1复合物中钙通道稳定蛋白1的水平。S36在3.6mM用作对照。图2B：％钙通道稳定蛋白1再结合RyR1的定量。
图3缺血性-再灌注(I/R)损伤诱导的大鼠慢性心力衰竭模型。对于I/R方案，闭合左前降支(LAD)冠状动脉1h。
图4用化合物1以5mg/kg/d(5MK)或10mg/kg/d(10MK)在饮用水与溶媒(H2O)-处理的和模拟操作的动物中治疗的大鼠中比较的左心室(LV)容量和射血分数(EF)。通过缺血性-再灌注(I/R)损伤诱导慢性心力衰竭。闭合LAD动脉1h；再灌注后1周开始治疗且持续3个月。治疗1、2或3个月后得到超声心动图参数。图4A：LV心脏舒张末期容积；图4B：LV心脏收缩末期容积；图4C：EF。图4A和4B：§与模拟相比P＜0.001；＊与溶媒相比P＜0.05；与溶媒相比P＜0.001。图4C：§与模拟相比P＜0.001，与溶媒相比P＜0.001。
图5图5A-C描述了体重(BW)(5A)、梗塞面积(5B)和LV重量(5C)，且图5D描述了用化合物1以5mg/kg/d(5MK)和10mg/kg/天(10MK)在饮用水与溶媒(H2O)-处理的和模拟操作的动物中比较治疗的大鼠中的胶原蛋白含量。通过缺血性-再灌注(I/R)损伤诱导慢性心力衰竭。闭合LAD动脉1h；再灌注后1周开始治疗且持续3个月。治疗3个月后测量参数。图5A-C：不显著。图5D：与模拟相比P＜0.001；＊与溶媒相比P＜0.05。
图6侵害性血流动力学：用化合物1以5mg/kg/d(5MK)或10mg/kg/天(10MK)在饮用水与溶媒(H2O)-处理的和模拟操作的动物中比较治疗的大鼠中的左心室收缩压(LV SP)(6A)、dP/dtmax(6B)；和dP/dtmin(6C)。通过缺血性-再灌注(I/R)损伤诱导慢性心力衰竭。闭合LAD动脉1h；再灌注后1周开始治疗且持续3个月。治疗3个月后测量血液动力学参数。图6A：不显著。图6B：§与模拟相比P＜0.05；＊与溶媒相比P＜0.05。图6C：与模拟相比P＜0.01；＊与溶媒相比P＜0.05。
图7化合物1血浆浓度(μM)与以天计的时间的关系。
图8用化合物1或化合物A以5mg/kg/d(5MK)在饮用水与溶媒(H2O)-处理的和模拟操作的动物中比较治疗的大鼠中的EF。闭合LAD动脉1h；再灌注后1周开始治疗且持续3个月。治疗1、2或3个月后得到超声心动图参数。§P与模拟相比＜0.001；＊与溶媒相比P＜0.05；与溶媒相比P＜0.001。
图9 mdx和WT小鼠与溶媒(H2O)-处理的对照组相比化合物1对自发体力活动的作用。在饮用水中施用的10和50mg/kg/天(目标剂量)施用的mdx小鼠中的第1-19天活动与溶媒对照组相比P＜0.001。
图10 EDL肌肉的特异性力-频率相关性。(A)在饮用水中施用的化合物1(5、10和50mg/kg/d(目标剂量))治疗的mdx小鼠中的第1-19天活动与溶媒(H2O)-处理的对照组(n＝5)相比较。对于50mg/kg/d剂量，150Hz和以上频率，p＜0.05。(B)在饮用水中施用的化合物1(5、10和50mg/kg/d(目标剂量))治疗的WT、C57BL/6小鼠与溶媒(H2O)-处理的对照组(n＝4)相比较。
图11用在饮用水中施用的溶媒(H2O)或化合物1(50mg/kg/d(目标剂量)治疗的mdx和WT小鼠的平均体重(12A)和平均水消耗量(12B)。
发明详述
应理解，在表示本发明各种实施方案同时给出详细描述和具体实施例仅作为示例，因为本领域技术人员显然可以根据这种详细描述在本发明精神和范围内进行各种改变和变型。
除非另有清楚地表述，否则本文和在待批权利要求中所用的单数形式″一种(a)"、″一种(an)″和″该(the)"包括复数对应物。将本文举出的全部出版物、专利申请和其它参考文献完整地引入作为参考。
术语″RycalsTM″是指兰诺定受体钙通道稳定剂，表示为作为本发明提供的式(I)或(IA)的化合物，以及作为本发明提供的数字编号指定的具体化合物，且在本文中共同称作″本发明的化合物″。
化合物
在一些实施方案中，本发明的化合物表示为式(IA)的结构：
其中
R是COOH或其生物电子等排体、COOR1或CN；且
R1是C1-C4烷基；
及其药学可接受的盐。
在一些优选的实施方案中，式(IA)中的R是羧酸(COOH)。在其它优选的实施方案中，式(IA)中的R是羧酸生物电子等排体，例如四唑。或者，所述羧酸生物电子等排体可以是酸性杂环，例如1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮、1，2，4-噻二唑-5(4H)-酮、1，2，4-噁二唑-5(4H)-硫酮、1，3，4-噁二唑-2(3H)-硫酮、4-甲基-1H-1，2，4-三唑-5(4H)-硫酮、5-氟乳清酸等。另外的羧酸生物电子等排体描述在例如Hamada，Y.等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.2006；16：4354-4359；Herr，R.J.等人，Bioorg.Med.Chem.2002；10：3379-3393；Olesen，P.H.，Curr.Opin.Drug Discov.Devel.2001；4：471；Patani.G.A.等人，J.Chem.Rev.1996；96：3147；Kimura，T.等人Bioorg.Med.Chem.Lett.2006；16：2380-2386；和Kohara，Y.等人Bioorg.Med.Chem.Lett.1995；5(17)：1903-1908中。将上述举出的参考文献各自的内容引入本文作为参考。
在一个优选的实施方案中，本发明的化合物表示为式(IA)的结构，其中R是COOH，及其药学可接受的盐(即式(I)的化合物)。
在其它优选的实施方案中，式(IA)中的R位于苯环的4位上(即苯并噻吖庚因环的7位上)。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。式(IA)或(I)的化合物可以以与药学可接受的酸或碱的盐的形式存在。这种盐优选自钠盐、钾盐、镁盐、半富马酸盐、盐酸盐和氢溴酸盐，其中每种可能性代表了本发明单独的实施方案。一种目前优选的盐是钠盐。另一种目前优选的盐是半富马酸盐。
在一些具体的实施方案中，所述化合物选自化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12及其药学可接受的盐。这些化合物表示为如下结构：
化学发义：
本文所用的术语″烷基″是指具有1-4个碳原子的直链或支链饱和烃(“C1-C4烷基”)。有代表性的烷基包括、但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基和叔丁基。烷基可以是未取代的或被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、卤代烷基、羟基、烷氧基、卤代烷氧基、环烷基、芳基、杂环基、杂芳基、酰氨基、烷基酰氨基、二烷基酰氨基、硝基、氨基、氰基、N3、氧代、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、硫代、硫代烷基和硫代芳基。
本发明的化合物可以以其互变异构体形式存在。所有这样的互变异构体形式在本文中都关注为本发明的组成部分。
本发明的化合物的所有立体异构体(例如，因在不同取代基上的不对称碳而存在的那些)包括对映异构体形式和对映异构体形式都关注为在本发明范围内。例如，本发明化合物的各立体异构体可以基本上不含其它异构体(例如作为具有指定活性的纯的或基本上纯的光学异构体)或可以例如混合为外消旋体或富含一种立体异构体的混合物。本发明的手性中心可以具有如IUPAC 1974推荐定义的S或R构型。可以通过物理方法例如分级结晶、分离或结晶非对映异构体衍生物或通过手性柱色谱法分离来拆分外消旋形式。可以通过任意适合的方法从外消旋体中得到各光学异构体，包括、但不限于常规方法，例如与旋光酸或碱成盐，然后结晶。
本发明的化合物优选在其制备后分离并且纯化以得到组合物，其包含按重计等于或大于约90％的化合物、约95％的化合物且甚至更优选大于约99％的化合物(″基本上纯的″化合物)，然后如本文所述使用或配制。这种″基本上纯的"本发明的化合物在本文中也被关注为本发明的组成部分。
治疗用途
本发明提供了能够治疗与RyRs相关的病症、障碍和疾病的化合物。更具体地，本发明提供了能够将在RyR通道中的渗漏进行修理的化合物，所述RyR通道可以是RyR1、RyR2和/或RyR3通道。在一个实施方案中，本发明的化合物增强RyR和钙通道稳定蛋白(例如RyR1和钙通道稳定蛋白1；RyR2和钙通道稳定蛋白2；和RyR3和钙通道稳定蛋白1)结合和/或抑制其分离。″与RyRs相关的病症、障碍和疾病″是指可以通过调节RyRs治疗和/或预防的障碍和疾病，且包括、但不限于心脏障碍和疾病、肌疲劳、肌肉骨骼障碍和疾病、CNS障碍和疾病、认知功能障碍、神经肌肉疾病和障碍、认知功能受损、骨障碍和疾病、癌症恶病质、恶性体温过高、糖尿病、心脏型猝死和婴儿猝死综合征。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及治疗或预防选自心脏障碍和疾病、肌疲劳、肌肉骨骼障碍和疾病、CNS障碍和疾病、认知功能障碍、神经肌肉疾病和障碍、骨障碍和疾病、癌症恶病质、恶性体温过高、糖尿病、心脏型猝死和婴儿猝死综合征的病症或改善认知功能的方法，该方法包括对有此需要的个体施用治疗有效量的如本文所述的式(I)或(IA)的化合物或其盐的步骤，以完成这种治疗。目前优选的化合物是式(1)的化合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及有效量的如本文所述的式(I)或(IA)的化合物或其盐在制备用于治疗或预防选自心脏障碍和疾病、肌疲劳、骨骼肌肉障碍和疾病、CNS障碍和疾病、神经肌肉疾病和障碍、认知功能障碍、骨障碍和疾病、癌症恶病质、恶性体温过高、糖尿病、心脏型猝死和婴儿猝死综合征的病症或改善认知功能的药物中的用途。目前优选的化合物是式(1)的化合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及如本文所述的式(I)或(IA)的化合物或其盐，其用于制备治疗或预防选自心脏障碍和疾病、肌疲劳、骨骼肌肉障碍和疾病、CNS障碍和疾病、认知功能障碍、神经肌肉疾病和障碍、骨障碍和疾病、癌症恶病质、恶性体温过高、糖尿病、心脏型猝死和婴儿猝死综合征的病症或改善认知功能的药物。目前优选的化合物是式(1)的化合物。
在一个实施方案中，所述病症、障碍或疾病与RyR1异常功能相关。在另一个实施方案中，所述病症、障碍或疾病与RyR2异常功能相关。在另一个实施方案中，所述病症、障碍或疾病与RyR3异常功能相关。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方案。
心脏障碍和疾病包括、但不限于不规则心脏跳动障碍和疾病、锻炼诱发的不规则心脏跳动障碍和疾病、心力衰竭、充血性心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭、收缩性心力衰竭、舒张性心力衰竭、急性代偿性心力衰竭、心肌缺血/再灌注(I/R)损伤(包括冠状动脉血管成形术后或心肌梗死(MI)期间的溶栓后I/R损伤)、慢性阻塞性肺疾病和高血压。不规则心脏跳动障碍和疾病包括、但不限于房性和室性心律失常、房性和心室颤动、房性和室性快速型心律失常、房性和室性心动过速、儿茶酚胺依赖性室性心动过速(CPVT)和锻炼诱发的其变化形式。
本发明的化合物还用于治疗肌疲劳，其可以归因于延长的锻炼或高强度锻炼或可以因肌肉骨骼疾病导致。肌肉障碍和疾病的实例包括、但不限于骨骼肌疲劳、中央核疾病、锻炼诱发的骨骼肌疲劳、膀胱障碍、失禁、与年龄相关的肌疲劳、少肌症、先天性肌病、骨骼肌肌病和/或萎缩、癌症恶病质、带有核和杆的肌病、线粒体肌病[例如基-塞二氏综合征、MELAS(线粒体性肌病、脑病、乳酸酸中毒和中风)综合征和MERRF(肌阵挛性癫痫合并破碎红纤维)综合征]、内分泌性肌病、糖原贮积病[例如庞佩氏病、安德森病和Cori病]、肌红蛋白尿[例如McArdle病、Tarui病和DiMauro病]、皮肌炎、骨化性肌炎、家族性周期性麻痹、多肌炎、包涵体肌炎、神经性肌强直、僵人综合征、恶性体温过高、普通肌肉痉挛、抽搐、重症肌无力、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊柱和延髓肌肉萎缩(SBMA，也称作脊髓延髓肌萎缩、延髓萎缩、X-连锁的延髓神经病(XBSN)、X-连锁的脊髓性肌萎缩1型(SMAX1)和肯尼迪病(KD))和肌营养不良症。优选的骨骼肌肉障碍包括、但不限于锻炼诱发的骨骼肌疲劳、先天性肌病、肌营养不良症、与年龄相关的肌疲劳、少肌症、中央核疾病、癌症恶病质、膀胱障碍和失禁。
肌营养不良症的实例包括、但不限于杜兴肌营养不良(DMD)、贝克尔肌营养不良症(BMD)、角膜缘带肌营养不良(LGMD)、先天性肌营养不良症(CMD)、远侧肌营养不良、面肩肱型营养不良、肌强直性肌营养不良、埃-德二氏肌营养不良和眼咽肌营养不良，目前优选DMD。
本文所用的先天性肌营养不良症是指出生时存在的肌营养不良症。基于遗传突变分类CMD：1)编码骨骼肌纤维基底膜或胞外基质的结构蛋白的基因；2)编码推定或经证实的糖基转移酶的基因，所述糖基转移酶由此影响肌营养不良蛋白聚糖糖基化，所述肌营养不良蛋白聚糖即基底膜的外膜蛋白；和3)其它。CMD的实例包括、但不限于层粘连蛋白-α2-缺陷型CMD(MDC1A)、Ullrich CMG(UCMDs 1、2和3)、沃克-沃伯格综合征(WWS)、眼部肌肉脑疾病(MEB)、Fukuyama CMD(FCMD)、CMD+二级层粘连蛋白缺陷1(MDC1B)、CMD+二次层粘连蛋白缺陷2(MDC1C)、具有精神发育迟滞和巨脑回的CMD(MDC1D)和具有肌营养不良症1型的强直性脊柱(RSMD1)。
认知功能障碍可能与记忆丧失、依赖年龄的记忆丧失、创伤后精神紧张性精神障碍(PTSD)、注意力缺陷伴多动障碍(ADHD)、孤独癖谱群疾病(ASD)、一般焦虑症(GAD)、强迫性障碍(OCD)、精神分裂症、双相情感障碍或严重抑郁相关或包括、但不限于它们。
CNS障碍和疾病包括、但不限于阿尔茨海默病(AD)、神经病、癫痫症、帕金森病(PD)和亨廷顿病(HD)。
神经肌肉障碍和疾病包括、但不限于脊髓小脑性共济失调(SCA)和肌萎缩侧索硬化(ALS、Lou Gehrig病)。
在一些实施方案中，本发明的化合物改善认知功能，其可以选自短期记忆、长期记忆、注意力、学习及其任意的组合。
在一些实施方案中，本发明的化合物用于治疗癌症恶病质，即一般与癌症相关的肌无力，且优选转移癌例如骨转移中的肌无力。肌无力和肌萎缩(恶病质)是癌症患者中常见的癌旁症状。这些病症导致显著的疲劳且显著地降低患者的生活质量。本发明提供了治疗和预防癌症患者中肌肉无力的方法，其部分基于如下发现：在一些癌症类型中，例如具有骨转移的前列腺和乳腺癌，RyR1被氧化，其被诱导变成“渗漏性”的。还发现，通过施用Rycal化合物预防渗漏改善了肌肉功能。示例性癌症包括、但不限于乳腺癌、骨癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌和胃肠癌。
外显子跳跃疗法：
在一些实施方案中，本发明的化合物通过增强反义-介导的外显子跳跃调节(例如增强)mRNA剪接。这种剪接的调节在反义寡核苷酸(AOs)的存在下完成，所述反义寡核苷酸对所关注的剪接序列具有特异性。在本发明的一些实施方案中，化合物式(I)的或(IA)和AO可以协同起作用，其中化合物式(I)的或(IA)增强AO介导的外显子跳跃。因此，在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗或预防本文所述的与渗漏性RyR相关的任意病症的药物组合物，还包含应用对mRNA序列中的剪接序列具有特异性的反义AO，用于增强所关注的mRNA中的外显子跳跃。
本发明的化合物用于外显子跳跃增强的一个具体的实施方案涉及杜兴肌营养不良(DMD)。DMD是致命性X-连锁隐性疾病，其特征在于在患者的寿命期内进行性肌无力。DMD主要因去除肌营养不良蛋白产生的DMD基因中异读框多-外显子缺失导致。单独的肌营养不良蛋白表达缺失无法解释DMD病理生理学。肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物(DGC)的破坏也导致氧化性应激、线粒体Ca2+过载和细胞凋亡、Ca2+流入肌肉增加和病理性Ca2+信号传导。没有治愈DMD的疗法且仅显示药物治疗是皮质类固醇，其可以延长离床活动，但存在显著的副作用。反义寡核苷酸-介导的外显子跳跃是富有希望的治疗方法，其目的在于恢复DMD读框和允许完整肌营养不良蛋白糖蛋白复合物的表达。迄今为止，使用该方法已经在人体中产生了低水平的肌营养不良蛋白。Kendall等人(Sci Transl Med，2012，4(164)，p.164ra160)报道，一些小分子例如丹曲林和其它RyR调节剂增强反义寡聚体-引导的外显子跳跃，以增加外显子跳跃，从而恢复mdx小鼠即DMD小鼠模型骨骼肌中mRNA读框、肌浆肌营养不良蛋白和肌营养不良蛋白糖蛋白复合物。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及治疗DMD的方法，通过对有此需要的个体施用本发明式(I)或(IA)的化合物与反义寡核苷酸(AO)来进行，所述反义寡核苷酸对DMD基因的一个或多个外显子例如DMD基因的外显子23、45、44、50、51、52和/或53的剪接序列具有特异性。优选的AOs包括、但不限于靶向DMD基因的DMD外显子23、50和/或51的AOs，例如2'-O-甲基(2’OMe)硫代磷酸或磷酸二酰胺化物(phosphorodiamidate)吗啉代(PMO)AOs。这种AOs的实例包括、但不限于Pro051/GSK2402968、AVI4658/Eteplirsen和PMO E23吗啉代(5′-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3′)。
本文所用的术语活性剂的″有效量″、″足量″或″治疗有效量″可以互换使用，即足以引起有益或期望效果包括临床效果的用量，照此，″有效量″或其变化形式依赖于其所适用的环境。在一些实施方案中，响应是预防性的，在其它实施方案中，是治疗性的，在另外的实施方案中，是它们的组合。术语″有效量″还包括属于″治疗有效的"且避免或基本上减弱不期望的副作用的本发明化合物的用量。
正如本文使用的和本领域充分理解的，"治疗″是用于得到有益或期望效果包括临床效果的方法。有益或期望效果可以包括、但不限于缓解或改善一种或多种症状或病症、减轻疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状态、预防疾病扩散、延迟或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态和消除(无论是部分还是总体)，无论是可检测到的还是不可检测到的。″治疗″还可以指与如果不接受治疗的预期存活相比延长存活。
药物组合物
将本发明的化合物配制成药物组合物，其以适合于体内施用的生物学相容性形式施用于人体个体。根据另一个方面，本发明提供了包含本发明化合物与药学可接受的稀释剂和/或载体的药物组合物。所述药学可接受的载体优选是″可接受的″，其含义是与组合物的其它成分相容且对其接受者而言无害。
可以单独施用化合物，但优选将其与一种或多种药学可接受的载体一起施用。本文使用的药学可接受的载体可以选自各种有机或无机材料，其为用作药物制剂的材料且作为填充剂、稀释剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、着色剂、乳化剂、味道-改善剂、胶凝剂、助流剂、防腐剂、增溶剂、稳定剂、助悬剂、甜味剂、张度剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、溶胀剂、阻滞剂、润滑剂、吸收剂和增粘剂的任意一种或多种掺入。
通过已知方法将本发明的化合物施用于人体或动物个体，包括、但不限于口服、舌下、口含、胃肠外(静脉内、肌内或皮下)、透皮、经皮或经皮肤、鼻内、阴道内、直肠、眼部和呼吸道(通过吸入施用)。还可以通过递送至个体肌肉包括、但不限于个体心肌或骨骼肌将本发明的化合物施用于个体。在一个实施方案中，通过经插入个体心脏的导管靶向递送至心肌将化合物施用于个体。在其它实施方案中，将化合物直接施用于CNS，例如通过腰椎内注射或将化合物直接心室内(intreventricular)输注入脑脊髓液(CSF)或通过心室内、鞘内或间质施用。目前优选口服施用。
用于固态口服施用的本发明药物组合物尤其是包括片剂或锭剂、舌下片、小药囊、胶囊包括明胶胶囊、粉末和颗粒；而用于液体口服、鼻部、口含或眼部施用的那些尤其是包括乳剂、溶液、混悬液、滴剂、糖浆剂和气雾剂。还可以将化合物作为混悬液或溶液通过饮用水或食物一起施用。可接受的药用载体的实例包括、但不限于纤维素衍生物，包括羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素和微晶纤维素；糖类，例如甘露糖醇、蔗糖或乳糖；明胶、阿拉伯树胶、硬脂酸镁、硬脂酰醇富马酸钠、盐水、藻酸钠、淀粉、滑石粉和水等。
用于胃肠外注射的本发明药物组合物尤其是包括无菌溶液，其可以是水性或非水的分散液、混悬液或乳剂，且还可以是用于再溶解成可注射溶液或分散液的无菌粉末。本发明的化合物可以与和个体血液等渗的无菌水溶液合并。这种制剂通过将固体活性成分溶于包含生理学相容性物质的水制备，所述生理学相容性物质例如氯化钠、甘氨酸等，并且具有与生理学条件相容的缓冲的pH，以便产生水溶液，然后使得该溶液无菌。将制剂以单位或多-剂量容器形式提供，例如密封安瓿或小瓶。通过任意注射模式递送制剂，包括、但不限于筋膜上、囊内、颅内、皮内、肌内、眶内、腹膜内、脊柱内、胸骨内、血管内、静脉内、实质内、皮下或舌下或通过进入个体心脏的导管。
用于直肠或阴道施用的药物组合物优选是栓剂，且用于经皮或经皮肤施用的那些尤其是包括粉末、气雾剂、霜剂、软膏剂、凝胶和贴剂。
为了进行透皮施用，将本发明的化合物与皮肤渗透促进剂合并，例如丙二醇、聚乙二醇、异丙醇、乙醇、油酸、N-甲基吡咯烷等，它们增加皮肤对本发明化合物的渗透性且允许该化合物通过皮肤透入并且进入血流。化合物/促进剂组合物还可以进一步与聚合物合并，例如乙基纤维素、羟丙基纤维素、乙烯/醋酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮等，得到凝胶形式的组合物，将其溶于溶剂，蒸发至期望粘度，然后涂布于裱褙材料上，得到贴剂。
本发明的药物制剂通过制药领域众所周知的方法制备，包括、但不限于湿法制粒和干法制粒或通过直接压制。载体的选择根据化合物的溶解度和化学性质、选择的施用途径和标准制药实践确定。
上述药物组合物示例本发明，但不以任何方式限定本发明。
根据本发明的方法，可以将任意这些化合物施用于个体(或接触个体的细胞)，其用量有效地限制或防止个体中、特别是个体细胞中RyR-结合的钙通道稳定蛋白的水平降低。该用量易于由本领域技术人员基于已知方法确定，包括分析体内建立的滴定曲线和本文公开的方法和测定法。有效限制或防止个体中RyR-结合的钙通道稳定蛋白的水平降低的化合物的适合量在约0.01mg/kg/天-约100mg/kg/天(例如1、2、5、10、20、25、50或100mg/kg/天)和/或足以使血浆水平在约300ng/ml-约5,000ng/ml的用量。或者，本发明化合物的用量在约1mg/kg/天-约50mg/kg/天的范围。或者，本发明化合物的用量在约10mg/kg/天-约20mg/kg/天。还包括可以以约0.01mg/kg/天或0.05mg/kg/天-约5mg/kg/天或约10mg/kg/天施用的用量。
合成方法
本发明在另一个方面中提供了制备本发明化合物及其盐的方法。更具体地，本发明提供了制备化合物式(I)的或(IA)例如化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12或其盐的方法。所述化合物的不同合成路线如实施例中所述。一般合成路线(ROS)如下方案1中所述：
方案1
在方案1中，Ra是COOR1或CN；R1是C1-C4烷基，且L是离去基，作为实例，为卤素、磺酸酯(OSO2R'，其中R’是烷基或芳基，例如OMs(甲磺酸酯)、OTs(甲苯磺酸酯))等。使胺原料与烷基化剂(如上所示的苄基衍生物)、优选在碱的存在下反应，得到期望的产物或其前体(R＝Ra)。如果期望，则这种前体可以进一步反应，将基团Ra转化成如下文实验部分示例的或通过本领域技术人员公知的任意其它方法的基团R。例如，可以根据已知方法，通过在酸性或碱性条件下水解将酯前体(Ra＝COOR1，其中R1是C1-C4烷基)转化成相应的羧酸(R＝COOH)。或者，可以通过在适合的条件下叠氮化钠反应将腈前体(Ra＝CN)转化成四唑(羧酸电子等排体)或通过水解转化成羧酸(R＝COOH)。
可以根据WO 2009/111463或WO 2007/024717中所述的方法或通过本领域技术人员公知的任意其它方法制备胺原料。将所有上述参考文献的内容引入本文作为参考。对于碱的性质没有具体限定。优选的碱包括、但不限于氢化物(例如氢化钠或氢化钾)和N，N-二异丙基乙胺。其它适合的碱包括、但不限于有机碱，例如叔胺，其选自无环胺类(例如三甲胺、三乙胺、二甲基苯胺、二异丙基乙胺和三丁胺)、环胺类(例如N-甲基吗啉)和芳族胺类(二甲基苯胺、二甲基氨基吡啶和吡啶)。
反应可以在有溶剂或没有溶剂的存在下进行。如果使用，则对溶剂的性质没有具体限定，实例包括溶剂，例如酯(例如乙酸乙酯)、醚(例如THF)、氯化溶剂(例如二氯甲烷或氯仿)、二甲基甲酰胺(DMF)和其它溶剂，例如乙腈或甲苯或这些溶剂彼此或与水的混合物。
式(I)的化合物(其中R＝COOH)的盐可以通过使母体分子与适合的碱例如NaOH或KOH反应制备，得到相应的碱金属盐，例如钠盐或钾盐。或者，可以通过与适合的碱反应将酯类(R＝COOR1)直接转化成盐。
式(I)的化合物的盐还可以通过使母体分子与适合的酸例如HCl、富马酸或对-甲苯磺酸反应制备，得到相应的盐，例如盐酸盐、甲苯磺酸盐或半富马酸盐。
实施例
提供下列实施例作为本发明一些优选实施方案的示例。
实施例1：合成
仪器：
NMR：Bruker AVANCE III 400或Varian Mercury 300
LC/MS：安装自动采样器17Plus、光敏二极管阵列检测器2996和质量检测器3100的Waters Delta 600，或Shimadzu 210
7-甲氧基-2，3，4，5-四氢苯并[f][1，4]噻吖庚因(“胺”)烷基化的一般方法
胺
将胺(如上所示的结构)(1mmol)溶于3ml二氯甲烷。向该溶液中加入烷基化试剂(1mmol)，然后加入N，N-二异丙基乙胺(0.34ml，2mmol)。将该混合物在室温搅拌过夜。使该溶液直接上柱，用己烷/EtOAc(2∶1，v/v)洗脱。
化合物2
3-((7-甲氧基-2，3-二氢苯并[f][1，4]噻吖庚因-4(5H)-基)甲基)苯甲酸甲酯：1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.96(m，2H)，7.46(m，3H)，6.70(dd，J＝8.4Hz，3.0Hz，1H)，6.50(d，J＝2.7Hz，1H)，4.09(s，2H)，3.90(s，3H)，3.72(s，3H)，3.57(s，2H)，3.35(m，2H)，2.72(m，2H)。MS：344(M+1)。
化合物3
4-((7-甲氧基-2，3-二氢苯并[f][1，4]噻吖庚因-4(5H)-基)甲基)苯甲酸甲酯：1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.99(d，J＝8.4Hz，2H)，7.46(d，J＝8.4Hz，1H)，7.37(d，J＝8.7Hz，2H)，6.70(dd，J＝8.4Hz，3.0Hz，1H)，6.50(d，J＝2.7Hz，1H)，4.09(s，2H)，3.90(s，3H)，3.72(s，3H)，3.57(s，2H)，3.35(m，2H)，2.72(m，2H)。MS：344(M+1)。
化合物5
2-((7-甲氧基-2，3-二氢苯并[f][1，4]噻吖庚因-4(5H)-基)甲基)苯甲酸甲酯：用2M HCl的乙醚溶液将该化合物转化成盐酸盐。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：10.33(br，1H)，8.08(d，J＝7.5Hz，1H)，7.80-7.65(m，3H)，7.51(d，J＝8.1Hz，1H)，7.14(s，1H)，6.99(dd，J＝8.4，2.1Hz，1H)，4.90-4.40(m，br，4H)，3.88(s，3H)，3.78(s，3H)，3.40(m，2H)，3.26(m，1H)，3.11(m，1H)。MS：344(M+1)。
化合物7
2-((7-甲氧基-2，3-二氢苯并[f][1，4]噻吖庚因-4(5H)-基)甲基)苄腈：1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.67-7.26(m，5H)，6.73(d，J＝2.7Hz，1H)，6.74(dd，J＝2.7，8.4Hz，1H)，4.14(s，2H)，3.78(s，3H)，3.70(s，2H)，3.36(m，2H)，2.76(m，2H)。MS：311(M+1)。
化合物8
3-((7-甲氧基-2，3-二氢苯并[f][1，4]噻吖庚因-4(5H)-基)甲基)苄腈：1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.64-7.42(m，5H)，6.74(dd，J＝2.7，8.4Hz，1H)，6.48(d，J＝2.7Hz，1H)，4.08(s，2H)，3.75(s，3H)，3.57(s，2H)，3.36(m，2H)，2.76(m，2H)。MS：311(M+1)。
化合物9
4-((7-甲氧基-2，3-二氢苯并[f][1，4]噻吖庚因-4(5H)-基)甲基)苄腈：1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.64(d，J＝7.2Hz，2H)，7.42(m，3H)，6.74(dd，J＝2.7，8.4Hz，1H)，6.48(d，J＝2.7Hz，1H)，4.08(s，2H)，3.75(s，3H)，3.58(s，2H)，3.36(m，2H)，2.76(m，2H)。MS：311(M+1)。
酯的水解(一般方法)
将甲酯(3mmol)溶于30ml THF/甲醇/1M NaOH(1∶1∶1，v/v)。将该混合物搅拌8小时，TLC显示所述酯完全消失。加入1ml浓HCl以调节酸性pH。除去有机溶剂，通过过滤收集形成的固体。风干该固体。
化合物4
3-((7-甲氧基-2，3-二氢苯并[f][1，4]噻吖庚因-4(5H)-基)甲基)苯甲酸：通过用EtOAc作为溶剂萃取得到该化合物。1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.10(s，1H)，8.04(d，J＝8.4Hz，1H)，7.80(br，1H)，7.46(m，2H)，6.80(m，2H)，4.40(s，2H)，3.90(s，2H)，3.76(s，3H)，3.42(s，2H)，2.86(s，2H)。MS：330(M+1)，328(M-1)。
化合物1
4-((7-甲氧基-2，3-二氢苯并[f][1，4]噻吖庚因-4(5H)-基)甲基)苯甲酸：通过用EtOAc作为溶剂萃取得到该化合物。1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.02(d，J＝8.4Hz，2H)，7.46(d，J＝8.4Hz，1H)，7.42(d，J＝8.7Hz，2H)，6.70(dd，J＝8.4Hz，3.0Hz，1H)，6.50(d，J＝3.0Hz，1H)，4.11(s，2H)，3.72(s，3H)，3.62(s，2H)，3.35(m，2H)，2.76(m，2H)。MS：330(M+1)，328(M-1)。
化合物1，钠盐：
使用1当量的NaOH的EtOH溶液由母体分子制备化合物1的钠盐(盐的m.p.：＞290℃)。
1HNMR(DMSO-D6，600MHz)，δ(ppm)：7.77(2H，m)，7.41(1H，d)，7.13(2H，m)，6.75(1H，dd)，6.63(1H，d)，4.00(2H，s)，3.70(3H，s)，3.49(2H，s)，3.18(2H，m)，2.70(2H，m)。
化合物1，半富马酸盐：
将1.6g化合物1(中性形式)和265mg富马酸导入圆底烧瓶。在添加18mL丙酮和2mL水后，回流该反应混合物。观察到部分增溶(但不完全澄清)，随后沉淀。然后将该反应混合物回流过夜。冷却后，通过过滤分离残余固体，用3mL丙酮洗涤，真空干燥(40℃/10mbars)4小时。
1HNMR(DMSO-D6，600MHz)，δ(ppm)：12.97(2H，bs)，7.90(2H，m)，7.43(1H，d)，7.40(2H，m)，6.77(1H，dd)，6.64(1H，d)，6.62(1H，s)，4.03(2H，s)，3.70(3H，s)，3.58(2H，s)，3.20(2H，m)，2.72(2H，m)。
化合物6
2-((7-甲氧基-2，3-二氢苯并[f][1，4]噻吖庚因-4(5H)-基)甲基)苯甲酸：用2MHCl的乙醚溶液将化合物转化成盐酸盐。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：10.10(br，1H)，8.08(d，J＝7.5Hz，1H)，7.66-7.51(m，4H)，7.17(d，J＝2.1Hz，1H)，6.99(dd，J＝8.4，2.1Hz，1H)，4.80-4.40(m，br，4H)，3.78(s，3H)，3.46(m，2H)，3.13(m，2H)。MS：330(M+1)，328(M-1)。
四唑的合成(一般方法)
将腈前体(3.22mmol)、叠氮化钠(830mg，12.9mmol)和三乙胺盐酸盐(1.72g，12.9mmol)在40ml无水DMF中在100℃搅拌5天。高度真空除去DMF，将残余物与水混合。用二氯甲烷(3x 100ml)萃取水溶液。通过柱色谱法纯化纯化合物(EtOAc/甲醇)。
化合物10
4-(2-(1H-四唑-5-基)苄基)-7-甲氧基-2，3，4，5-四氢苯并[f][1，4]噻吖庚因：1HNMR(300MHz，CDCl3和1滴CD3OD)：8.30(d，J＝8.7Hz，1H)，7.53(m，2H)。7.14(t，J＝7.8Hz，1H)，7.20(d，J＝7.5Hz，1H)，6.84(dd，J＝2.7，8.4Hz，1H)，6.69(d，J＝2.7Hz，1H)，4.46(s，2H)，3.80(s，2H)，3.75(s，2H)，3.43(m，2H)，2.96(m，2H)。MS：354(M+1)，352(M-1)。
化合物11
4-(3-(1H-四唑-5-基)苄基)-7-甲氧基-2，3，4，5-四氢苯并[f][1，4]噻吖庚因：1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.16(s，1H)，7.90(d，J＝7.5Hz，1H)，7.40(d，J＝8.4Hz，1H)，7.20(m，2H)，6.74(dd，J＝2.7，8.4Hz，1H)，6.58(d，J＝2.7Hz，1H)，4.18(s，2H)，3.75(s，5H)，3.36(m，2H)，2.76(m，2H)。MS：354(M+1)，352(M-1)。
化合物12
4-(4-(1H-四唑-5-基)苄基)-7-甲氧基-2，3，4，5-四氢苯并[f][1，4]噻吖庚因：1HNMR(300MHz，CDCl3和1滴CD3OD)：7.99(d，J＝7.2Hz，2H)，7.42(m，3H)，6.74(dd，J＝2.7，8.4Hz，1H)，6.53(d，J＝2.7Hz，1H)，4.10(s，2H)，3.71(s，3H)，3.58(s，2H)，3.36(m，2H)，2.76(m，2H)。MS：354(M+1)，352(M-1)。
7-甲氧基-2，3，4，5-四氢苯并[f][1，4]噻吖庚因(“胺”)的合成
2-(4-甲氧基苯硫代)乙胺(1)
将4-甲氧基苯硫酚(50g，0.357mol)、2-氯乙胺一盐酸盐(39.8g，0.343mol.)、K2CO3(78.8g，0.57mol)和二异丙基乙胺(32mL，0.178mol)在200mL THF中混合。给该混合物减压脱气5min，在氩气气氛中回流过夜。除去水，将水(300mL)加入到烧瓶中。用二氯甲烷(3x200mL)萃取该混合物。收集有机层，除去二氯甲烷，加入50mL浓HCl，随后加入200mL水。用1∶1EtOAc/己烷(3x 200mL)萃取该溶液。用2M NaOH将水层调整至pH10，用二氯甲烷(3x200mL)萃取。用无水硫酸钠干燥合并的有机层。除去溶剂，得到61g目标化合物，为无色液体，收率为97％。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：7.35(d，J＝8.7Hz，2H)，6.81(d，J＝8.7Hz，2H)，3.77(s，3H)，2.88-2.80(m，4H)，1.44(s，2H)。
2-(4-甲氧基苯硫代)乙基氨基甲酸苄酯(2)
第一种方法
在0℃向包含化合物1(8.0g，43.7mmol)、碳酸氢钠(12.1g，144mmol)、水(100mL)和二氯甲烷(200mL)的烧瓶中滴加氯甲酸苄酯(8.2g，48.1mmol，用100mL二氯甲烷稀释)。添加后，将该混合物在r.t.搅拌5hr。收集有机层，用100mL二氯甲烷萃取水溶液。用硫酸钠干燥合并的有机溶液。除去溶剂，将得到的固体与200mL THF/己烷(1∶10)一起研磨。收集固体，干燥，得到目标产物(12.9g)，收率为93％。
可选方法
在0℃向化合物1(10g，54.6mmol)和三乙胺(15mL，106mmol)在200mL二氯甲烷中的溶液中滴加氯甲酸苄酯(7.24mL，51.5mmol，用100mL二氯甲烷稀释)。添加后，将该溶液在r.t.搅拌1小时。通过过滤除去固体。用100mL0.1M HCl和100mL饱和碳酸钠萃取该溶液，用无水硫酸钠干燥。除去溶剂，将得到白色固体，在200mL THF/己烷(1∶20)中搅拌3小时。通过过滤收集固体，得到14.2g目标化合物，收率为87％。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：7.35(m，7H)，6.83(d，J＝8.7Hz，2H)，5.07(m，3H)，3.77(s，3H)，3.10(q，J＝6.3Hz，2H)，2.92(t，J＝6.3Hz，2H)。
7-甲氧基-2，3--二氢苯并[f][1，4]噻吖庚因-4(5H)-甲酸苄酯(3)
将化合物2(7.3g，23mmol)、低聚甲醛(6.9g 0.23mol)和对-甲苯磺酸(1.45g，7.6mmol)在250mL甲苯中的混合物在70℃搅拌过夜。冷却至r.t.后，过滤出固体。用饱和碳酸钠(100mL)萃取该溶液，用无水硫酸钠干燥有机层。得到目标产物(7.4g)，除去溶剂后为液体，收率为97％。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：7.44(d，J＝8.1Hz，0.77H)，7.32(m，5.60H)，7.07(d，J＝2.7Hz，0.33H)，6.68(m，1.30H)，5.04(s，2H)，4.59(ss，2H)，3.96(br，1.80)，3.80(ss，1.23H)，3.55(s，1.97H)，2.76(m，2H)。
7-甲氧基-2，3，4，5-四氢苯并[f][1，4]噻吖庚因氢溴酸盐(胺)(4HBr盐)
第一种方法
将HBr的溶液(33％的乙酸溶液，10mL)加入到化合物3(4.2g，12.8mmol)中。添加后，开始放出二氧化碳，形成白色固体。将该混合物在r.t.再静置2小时。将乙醚(150mL)加入到该混合物中，将其搅拌30min。通过过滤收集固体，用乙醚洗涤。真空干燥固体，得到3.40g目标化合物，收率为91.8％。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：9.02(br，2H)，7.52(d，J＝8.1Hz，1H)，7.27(d，J＝3.3Hz，1H)，6.92(dd，J＝8.4，2.7Hz，1H)，4.41(s，2H)，3.77(s，3H)，3.53(m，2H)，2.96(m，2H)。
可选方法(游离碱4a)
将化合物3(10g，30mmol)与50mL浓HCl、50mL水和30mL二噁烷混合。将该混合物在100℃搅拌过夜。冷却至r.t.后，减压除去大部分溶剂和HCl。将水(100mL)加入到该溶液中，过滤出固体。用EtOAc/己烷(1∶1，3x100mL)萃取水溶液，通过添加15g NaOH碱化。用二氯甲烷(3x150mL)萃取该混合物。用无水硫酸钠干燥合并的溶液。除去溶剂，得到液体，在rt.静置后固化，得到6.2g目标化合物。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：7.42(d，J＝8.1Hz，1H)，6.78(d，J＝2.7Hz，H)，6.68(dd，J＝2.7，8.1Hz，1H)，4.08(s，2H)，3.96(br，1.80)，3.76(s，3H)，3.38(m，2H)，2.68(m，2H)。
实施例2：钙通道稳定蛋白2与PKA-磷酸化RyR2的结合
如上所述制备心脏SR膜(Marx等人，2000；Kaftan等人，Circ.Res.，1996，78：990-97)。如所述的，在室温使用抗-钙通道稳定蛋白抗体(1∶1,000)(Jayaraman等人，J.Biol.Chem.，1992，267：9474-77)对微粒体(50μg)进行免疫印迹1hr(Reiken等人，Circulation，107：2459-66，2003)。与HRP-标记的抗-家兔IgG(1∶5,000稀释；TransductionLaboratories，Lexington，Ky.)一起温育后，使用ECL展开印迹(Amersham Pharmacia，Piscataway，N.J.)，在x-光片上检测或暴露于用红外染料标记的二次抗体，用来自Li-CorBiosciences(型号Odyssey)的设备显影。除非另有描述，否则化合物的测试浓度为100nM。有代表性的钙通道稳定蛋白2结合测定如下所示。
A.心脏肌浆网(CSR)的PKA磷酸化
将反应混合物装入1.5ml微量离心管。将200μg心脏SR加入到激酶缓冲液、PKA和ATP的反应混合物中，直到最终体积为100μl(如下的反应混合物)。最终加入ATP以启动反应。
反应混合物：
20μl＝样品(心脏SR，2或10μg/μl)
10μl＝10x激酶缓冲液(80mM MgCl2，100mM EGTA，500mM Tris/PIPES)，pH＝7.0
20μl＝PKA(2个单位/ul)(Sigma#P2645)
10μl＝10x ATP(1.0mM)(Sigma A 9187)
40μl＝蒸馏H2O
1.将试管在30℃温育30分钟。
2.然后将该反应混合物转入0.5ml厚壁玻璃试管。
3.将包含该反应混合物的玻璃试管在使用转子S120AT3转子的Sorvall离心机RCM120EX中以50,000xg离心10min。以50,000x g离心10min足以分离微粒体。
4.用结合缓冲液(10mM咪唑，300mM蔗糖，pH＝7.4)将得到的沉淀洗涤4次。每次将100μl1x结合缓冲液加入到试管中以洗涤沉淀。通过使用吸管端上下冲洗(nush)重新混悬沉淀。最终旋转后，加入50μl结合缓冲液，收集来自全部试管的沉淀。将该反应体系保存在-20℃。
5.通过用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离约10μgCSR并且分析总RyR(5029Ab，1∶3000稀释液；或单克隆Ab，来自Affinity Bioreagents，Cat#MA3-916，1∶2000稀释液)和PKA磷酸化RyR2(P2809Ab，1∶10000稀释液)的免疫印迹证实磷酸化。
6.将等分部分保存在-80C。
B.钙通道稳定蛋白再结合测定
1.将PKA-磷酸化CSR(约20μg)与250nM钙通道稳定蛋白2的100μl结合缓冲液溶液(如上所述)与或不予化合物一起温育。
2.将该反应体系装入0.5ml厚壁玻璃试管(Hitachi离心机仪器，Catalog#B4105)。
3.将钙通道稳定蛋白2作为最终试剂加入到反应混合物中。使反应在室温进行30mins。
4.反应后，将试管以100,000g离心10min(带有S120AT3转子的Sorvall RCM120EX离心机)。
5.在4℃将得到的沉淀在1x结合缓冲液中洗涤4次。每次洗涤后，将试管在4℃以50,000g离心10mins。
6.最终洗涤后，弃去上清液。
7.加入20μl样品缓冲液(2x)[下述6x样品缓冲液]，用尖端和/或通过简单涡旋再混悬沉淀。将该混悬液转入1.5ml微量离心管。
8.将试管在90℃加热4min。
9.使用15％SDS/PAGE分离蛋白质。
10.使用抗-FKBP(Jayaraman等人，J.Biol.Chem.1992；267：9474-77，1∶2000)初级抗体和适合的二次抗体检测钙通道稳定蛋白2结合。
6x样品缓冲液
7.0ml 4x Tris-HCl/SDS，pH6.8
3.0ml甘油(30％终浓度)
1.0g SDS(10％终浓度)
0.93g DTT(0.6M最终)
1mg溴酚蓝(0.001％终浓度)
蒸馏水至10ml最终体积。
1ml等分部分贮存在-70℃。
结果：
图1A描述了使用在没有(-)或有100nM化合物1的存在下显示钙通道稳定蛋白2与PKA-磷酸化RyR2结合的钙通道稳定蛋白2抗体的免疫印迹。(+)：钙通道稳定蛋白结合非-PKA磷酸化RyR2。S36(US 7,544,678中所述的苯并噻吖庚因)用作阳性对照。正如所示的，100nM浓度的化合物1防止钙通道稳定蛋白2从PKA-磷酸化RyR2中解离和/或增强钙通道稳定蛋白2与PKA-磷酸化RyR(再)结合。
正如图1B中所示的，还发现，当以100nM在上述钙通道稳定蛋白2再结合测定中测试时，下列有代表性的化合物防止钙通道稳定蛋白2从PKA-磷酸化RyR2中解离和/或增强钙通道稳定蛋白2与PKA-磷酸化RyR(再)结合：化合物2、化合物3和化合物4。
实施例3：钙通道稳定蛋白1与PKA-磷酸化RyR1的结合
按照与实施例2类似的方式和进一步如美国专利申请公开号2004/0224368中所述由骨骼肌制备SR膜，将该文献的内容引入本文作为参考。如所述的使用抗-钙通道稳定蛋白1抗体(Zymed)(1∶1,000)对微粒体(50μg)进行免疫印迹。展开印迹并且如实施例2中所述定量。
图1C描述了使用在没有(Neg)或有所示浓度的化合物1或化合物4的存在下显示钙通道稳定蛋白1与PKA-磷酸化RyR1结合的钙通道稳定蛋白1抗体的免疫印迹。(Pos)：钙通道稳定蛋白结合非-PKA磷酸化RyR1。S36用作对照。正如所示的，化合物1和化合物4以剂量依赖性方式防止钙通道稳定蛋白1从PKA-磷酸化RyR1中解离和/或增强钙通道稳定蛋白1与PKA-磷酸化RyR1(再)结合，其中估计的EC50分别约为100nM和150nM。
实施例4：异丙肾上腺素治疗小鼠中钙通道稳定蛋白1与RyR1的再结合
异丙肾上腺素，即β肾上腺素能受体激动剂通过过度刺激β肾上腺素能受体诱导小鼠中的心力衰竭。与之同时发生的是PKA活化、SR上的RyR2磷酸化和钙通道稳定蛋白2(FKBP12.6)与RyR2相互作用减少。类似的级联事件发生在骨骼肌中，其中RyR1被磷酸化，导致钙通道稳定蛋白1(FKBP12)与RyR1结合减少。
正如国际公开号WO2008/064264中详细描述的，将该文献的内容引入本文参考，长期异丙肾上腺素治疗野生型小鼠提供了用于诱导易于定量的RyR生物化学改变的快速和可靠的方法。这些改变包括RyR磷酸化增加和伴随的钙通道稳定蛋白结合减少。
动物和试剂
根据经批准的方案维护和研究C57B1/6小鼠。合成的β肾上腺素能激动剂异丙肾上腺素(ISO)得自Sigma(I65627)并且制备成100mg/ml储备水溶液。通过添加蔗糖(1mM)、二硫苏糖醇(320mM)和1蛋白酶抑制剂片剂(10X)至10ml储备溶液(10mM HEPES，1mM EDTA，20mMNaF，2mM Na3VO4)制成裂解缓冲液。
渗透泵准备和手术植入
通过皮下植入的渗透输注泵(Alzet MiniOsmotic泵，Model 2001，DurectCorporation，Cupertino，CA)给小鼠连续输注5天10mg/ml异丙肾上腺素(1μlhr)。
为了药物加载，垂直固定渗透泵并且将200μl药物溶液通过包含过量药物溶液(～250-300μl)的注射器(连接套管)注入泵。缓慢地向下注射药物溶液，同时缓慢地升起注射器，直到泵被过度充满。封盖泵时移动的流体流出证实泵适度充满。
通过下列步骤将载药的渗透泵经皮下植入。用1.5-2％异氟烷在以0.6L/min施用的O2中麻醉接受小鼠，然后测量其体重并且记录。然后将小鼠胸向下放在泡沫聚苯乙烯上，其面部在鼻椎体上。在颈背部上修剪皮毛，从耳部后扩展至头顶部。用70％的酒精轻轻地擦拭所述区域并且在头/颈项上的中线处做小切口。用酒精擦拭缝合固定物，插入切口，并且开放以使皮肤从下面的组织中松弛。为了适应泵，将该开口向后扩展至侧后半。将载药的泵插入开口，使其释放位置远离切口，并且允许用最低的张力沉降至皮肤下。用5.0号尼龙缝合线封闭切口，需要约5-6根缝合线。并且用70％的酒精轻轻地擦拭该区域。手术后，将小鼠放入各自的笼中，以便将损伤和交感神经系统可能的激活降至最低。
骨骼肌分离
如下分离小鼠骨骼肌。通过切下踝关节处的皮肤并且向上拉出暴露腿肌。将组织用Tyrode缓冲液(10mM HEPES，140mM NaCl，2.68mM KCl，0.42mM Na2HPO4，1.7mM MgCl2，11.9mM NaHCO3，5mM葡萄糖，1.8mM CaCl2，通过添加20mg CaCl2至由不含CaCl2的10X溶液制成的100ml 1X缓冲液中制备)保持湿润。分离如下肌肉并且冷冻在液氮中。通过在侧筋腱与EDL和胫骨肌筋腱形成的X之间插入剪刀分离趾长伸肌(EDL)，向上对着膝切下；切下腓骨肌肉以暴露腓肠肌肌腱的扇形筋腱；在X和肌肉中插入钳子以松弛EDL筋腱；切下EDL筋腱并且向上拉出肌肉；且最终切下松弛的EDL。通过下列步骤分离比目鱼肌：从腓肠肌肌腱顶端除去腓骨肌肉；通过切下和举起跟腱将比目鱼肌暴露于腓肠肌下面；在膝后面的肌肉顶端切下比目鱼肌；且最终拉出比目鱼肌并且在远离腓肠肌切下它。通过下列步骤分离胫骨肌：从踝前部切下胫骨肌筋腱，向上拉出该筋腱，并且远离胫骨将其切下。通过切下恰好高于膝的肌肉并且除去肌束从腿中分离股肌(大腿肌肉)。将样品冷冻在液氮中。
来自组织裂解物中的RyR1免疫沉淀
通过在4℃将200-500μg匀化物与2μl抗-RyR1抗体(Zymed)在0.5ml改性的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.4)，0.9％NaCl，5.0mM NaF，1.0mM Na3VO4，0.5％Triton-X100和蛋白酶抑制剂)中一起温育1.5hr对RyR1进行免疫沉淀。然后将样品与蛋白质A琼脂糖珠(Amersham Pharmacia Biotech，Piscatawy，NJ)一起在4℃温育1小时，此后，用冰冷RIPA将该珠洗涤3次。将样品加热至95℃，并且通过SDS-PAGE(用于钙通道稳定蛋白的15％SDS-PAGE)进行大小分级分离。使用抗-FKBP抗体(FKBP12/12.6，Jayaraman等人，J.Biol.Chem.1992；267：9474-77)以1∶2,000稀释度展开免疫印迹。用5％牛奶或TBS-T(20mM Tris-HCl，pH7.5，0.5M NaCl，0.05％20，0.5％Triton X-100)稀释抗体。
结果
如上所述在小鼠中植入包含异丙肾上腺素与或不与测试化合物的渗透泵。给小鼠以渗透方式灌注5天单独的溶媒(DMSO/PEG)、单独的异丙肾上腺素(ISO)(0.5mg/kg/hr)或异丙肾上腺素(0.5mg/kg/hr)和所示浓度的化合物1的组合。在第6天时，处死每只小鼠，并且分离骨骼肌组织并且用于分析RyR1免疫沉淀物中的钙通道稳定蛋白1结合。
化合物1对增强分离自异丙肾上腺素治疗小鼠的骨骼肌中钙通道稳定蛋白1结合RyR1的作用描述在图2A(免疫印迹)和2B(图解量化)中。正如所示的，化合物1增强骨骼肌膜中结合RyR1的钙通道稳定蛋白1的水平，该水平与通过施用3.6mM S36即用作阳性对照的另一种苯并噻吖庚因衍生物(WO2008/064264)观察到的水平类似。对于化合物4得到类似的结果(数据未显示)。
实施例5：化合物1在大鼠中的长期缺血后心力衰竭模型中的作用
目的
本研究的目的在于测试化合物1减轻心功能障碍和减弱缺血-再灌注诱导的心力衰竭模型中心室重建的能力。
方法
通过缺血-再灌注(I/R)损伤在雄性wistar大鼠(224-240g，10-11周龄)中诱导慢性心力衰竭。对于I/R方案，闭合左前降支(LAD)冠状动脉1h。在再灌注后1周开始药物治疗(在饮用水中5mg/kg/d或10mg/kg/d)，并且维持3个月的研究期限。根据在治疗开始后1、2和3个月时的超声心动图并且根据与溶媒-处理和模拟-操作的动物相比3个月时的侵入性血流动力学评估化合物1的效能。还分析了心脏样本以评价肥大和胶原蛋白含量。在最终的研究日时从每只大鼠中采集血液以评价药物血浆浓度，如图3中所示。本研究设计如图3中所示。实验以双盲方式进行。
统计学方法
关于随时间测量的参数，通过2种方式ANOVAs与重复测量值分析模拟与溶媒的比较和药物治疗的比较。关于处死和形态计量法时的参数，通过t-检验分析模拟与溶媒的比较并且通过单向ANOVA、随后邓奈特检验分析药物治疗比较。
结果
与模拟-操作的动物相比溶媒-治疗的I/R动物显示左心室(LV)心脏收缩末期(LVESV)和心脏舒张末期(LV EDV)容积(图4A和B)增加、如根据射血分数(EF)减小测量的心脏功能下降(图4C)和间质胶原含量增加(图5D)。从1到3个月，与溶媒相比以5和10mg/kg/d施用的化合物1显著地增加EF，且LVESV和LVEDV降低(图4A-C)，并且间质胶原蛋白含量减少(图5D)。
侵入性血液动力学研究(在3个月时)显示在用化合物1以5和10mg/kg/d治疗的动物中与溶媒相比保护了LV dP/dt max和LV dP/dt min(图6B和C)，其中在治疗时LV心脏收缩压无统计学显著性改变(图6A)。
在治疗时未观察到对体重(Bw)、梗死面积或肥大(LV重量)的作用(图5A-C)。药物的血浆浓度如图7中所示。
结果显示低至5mg/kg/d浓度的化合物1对大鼠中慢性缺血后心力衰竭模型中的收缩和舒张心脏功能发挥有益作用。
化合物1与化合物A即WO 2007/024717中所述的结构相关的苯并噻吖庚因衍生物相比具有更显著性和令人意外的活性。正如图8中所示，在本研究结束时，以5mg/kg/d施用3个月的化合物A在与化合物1相比时难以改善慢性缺血后心力衰竭大鼠模型中的收缩和舒张心脏功能。因此，以5mg/kg/d的剂量在大鼠CHF模型中治疗3个月后观察到化合物1、但不是化合物A的有益作用。
化合物A
实施例6：化合物1对小鼠肌营养不良症模型(mdx)中肌肉功能的作用
目的
本研究的目的在于测试使用化合物1治疗是否改善肌营养不良蛋白-缺乏小鼠模型(mdx)中的肌肉功能。
方法
在研究开始时，使6周和约20克的C57BL/10ScSn-DMDmdx/J(缩写为mdx，n＝5/组)小鼠适应轮式笼6天，然后随机分入接受溶媒(H2O)或在随意饮用的饮用水中施用的目标剂量的5mg/kg/d、10mg/kg/d或50mg/kg/d(实际剂量分别为：7.9mg/kg/d；12.8mg/kg/d；和61.5mg/kg/d，根据每周测量的药物溶液消耗除以1重确定)的化合物1的钠盐(基于母体药物重量；钠盐在本实施例的下文中称作“化合物1”)4周治疗的组中。将年龄匹配的C57BL/6(缩写为WT，n＝4/组)小鼠随机分入接受溶媒(H2O)或目标剂量的50mg/kg/d(确切剂量：67.7mg/kg/d)化合物1的钠盐治疗的组中。
在前3周中测量轮上的自愿活动、体重和平均水消耗量。在治疗4周后，在本研究结束时测量特定的肌力。
将24hr期限内运动的距离(Km/天)分析为功能活动改善的指标(参见DMD_M.2.1.002SOP，在http：//www.treat-nmd.eu/上)。在本研究结束时，如下文进一步所述的，分离趾长伸肌(EDL)用于肌力分析。在本研究结束时通过眶后放血从每只小鼠中采集血液(黑暗周期结束后-约7AM)以评价药物血浆浓度。实验是双盲的。
力的测量
在本研究结束时，使用来自Aurora Scientific(Aurora，Ontario，Canada)的407A肌肉试验系统从用于等长力分析的后肢中剖离EDL肌肉。用6-0号缝合线扎紧每条筋腱，并且将腱与腱之间的EDL肌肉转入O2/CO2(95％/5％)起泡的蒂罗德溶液(以mM计：NaCl 121，KCl 5.0，CaCl21.8，MgCl2，NaH2PO4，NaHCO324和葡萄糖5.5)的Ragnoti浴中。使用所述缝合线，将1条筋腱与连接力传感器的不锈钢钩垂直扎紧。将另一条缝合的筋腱向下压入Aurora系统的移动臂。使用2个铂电极之间的电场刺激EDL肌肉收缩。在每次实验开始时，调整肌肉长度以得到最大力。通过使用递增刺激频率(5-250Hz，200ms，在阈上电压时)触发收缩测定力-频率相关性。在两次刺激之间，允许肌肉休息～3min。在力测量结束时，测量同时在Aurora系统中缝合的EDL肌肉的长度(L0)。然后从所述系统中取出EDL肌肉并且在切断末端筋腱和取消缝合后称重。然后将EDL肌肉冷冻在液氮中。通过用EDL肌肉重量除以EDL肌肉长度和1.056mg/m3的哺乳动物肌肉密度常数(Yamada，T.，等人Arthritis和rheumatism 60：3280-3289)计算EDL肌肉的横断面积(mm2)。为了测定EDL特定力(kN/m2)，用绝对强直性张力除以EDL肌肉横断面积。
统计学方法
为了确定统计学显著性，斯氏t-检验用于在两组之间比较。将全部采集的数据表示为平均值+/-SEM。
结果
测试化合物1改善mdx小鼠中自愿训练的能力。在使小鼠适应自动轮式笼的驯化后，用计算机24/7监测小鼠在自动轮上的活动。将采集的数据转换成3周内每天运动的距离。用10和50mg/kg/d(目标剂量)的化合物1治疗的Mdx小鼠与用单独的溶媒(H2O)治疗的mdx小鼠相比在轮上的运动距离明显地更长(从第1天至第19天P＜0.001)。所观察到的治疗作用在早至治疗开始后2-3天就可以观察到并且持续活动监测期的自始至终。使用50mg/kg/d化合物1治疗的WT小鼠未观察到化合物1对运动距离的作用(图9)。此外。正如根据在EDL肌肉中的体外力所测定的(图10)，化合物1治疗以肌肉mdx剂量依赖性增加了特定的力。在150Hz刺激频率下和高于50mg/kg/d-治疗的mdx小鼠中显示在特定肌力方面具有统计学显著性的增加(P＜0.05)。在WT小鼠中未观察到化合物1治疗对特定肌力的作用。
正如图11中所示，化合物1治疗不影响体重。未观察到对水消耗的剂量依赖性作用。化合物1的早晨血液暴露为(平均值±SEM)3.3±0.4μM，5mg/kg/d-施用的mdx小、鼠；10.7±0.9μM，10mg/kg/d-施用的mdx小鼠；52.8±1.7μM，50mg/kg/d-施用的mdx小鼠；和72.8±7.0μM，50mg/kg/d-施用的WT小鼠。这些结果共同显示与溶媒-治疗的对照组相比，在mdx小鼠杜兴肌营养不良(DMD)鼠模型中以10mg/kg/d和50mg/kg/d(目标剂量)的化合物1治疗在3周后改善了自愿轮训练并且在4周后改善了特定的肌力，由此证实本文请求保护的化合物1及其类似物在治疗肌营养不良症中的用途。
实施例7：代谢稳定性
将化合物1即本发明有代表性的RycalTM与WO 2007/024717中所述的结构相关的苯并噻吖庚因衍生物化合物B和化合物C比较代谢稳定性。
A.人肝微粒体中的代谢稳定性
方法：
化合物增溶：用DMSO制成储备溶液并且用包含1mg/ml BSA的水制成工作溶液。
代谢生物利用度预测：代谢生物利用度预测(MF％)基于使用推定总吸收的肝微粒体的体外代谢稳定性测定。简言之，在NADPH(1mM)的存在下，在0、5、15、30和60min温育后，在与大鼠和人肝微粒体(0.33mg蛋白质n/ml)一起温育(10-7M)后，通过LC-MS-MS对未改变的药物进行定量。使用甲醇(v/v)终止酶反应，通过离心沉淀蛋白质。表示为ml/min/g蛋白质的体外固有清除率(Clint_mic)是未改变药物剩余浓度与温育时间关系的斜率(LN线性化后)。然后使用0.045mg prot/kg肝和大鼠的11g和人的1.2kg肝重将体外Clint放大至体内全身(体内Clint)。然后使用良好搅动的模型(Hep Cl＝体内Clint＊HBF/(体内Clint+HBF)将体内Clint转化成肝清除率(HepCl)，其中将HBF(肝血流)取为大鼠22ml/min和人1500ml/min。然后使用方程(MF％＝1-HepCl/HBF)根据提取比例中推定MF％。结果如表1中所示：
表1：人微粒体中的稳定性
.a.Clint_mic：以ml/min/g蛋白质计的体外固有清除率
b.MF％：以％计的代谢生物利用度
B.大鼠和人肝细胞中的代谢稳定性
化合物增溶：用DMSO制成储备溶液并且用包含1/10大鼠血浆或1/4人血浆的William培养基制成工作溶液。
代谢稳定性测定：将化合物10-7M与分离的肝细胞(6E+5细胞/ml，大鼠肝细胞；和4E+5细胞/ml，人肝细胞)在37℃在来自用Wiliams培养基(1/10稀释，大鼠；和1/4稀释，人)稀释的相同种类的血浆中温育。在在0、10、20、30、60和120min的采样时间进行，并且用甲醇(v/v)终止酶反应。通过离心沉淀蛋白质，并且通过LC/MS/MS分析上清液。使用人的4E+5细胞/ml的0.134mg蛋白质/ml与大鼠的6E+5细胞/ml的0.201mg蛋白质/ml之比对肝微粒体计算表示为ml/min/g蛋白质的Clint。在本测定中通过LC/MS/MS检测每一样品中存在的参比药物和潜在的代谢物。结果如表2中所示：
表2：大鼠和人肝细胞中的稳定性
.a.Clint_mic：以ml/min/g蛋白质计的体外固有清除率
b.MF％：以％计的代谢生物利用度
c.Q：细胞数量/ml
C.小鼠和大鼠微粒体中的代谢稳定性
材料和方法
稀释缓冲液：包含5mM EDTA的pH 7.4中的0.1M Tris HCl缓冲液。
NADPH辅因子溶液：向包含2.79mL稀释缓冲液的50mL falcon试管内加入0.429mLNADPH-再生溶液A和0.079mL NADPH-再生溶液B。
微粒体制备：(1.5mg/mL溶液)在37℃将包含3.32mL稀释缓冲液的50mL falcon试管温热15min.(至少10min.)。将0.178mL微粒体(24.6mg/mL)加入到预温热的稀释缓冲液中。该微粒体制备物的蛋白质浓度为1.25mg/mL。
样品(测试化合物)-原始和中间储备溶液：制备测试化合物在甲醇中的1mg/mL(0.5mg/mL用于化合物1)溶液。使用稀释缓冲液由原始储备溶液制备100μM测试化合物的中间溶液。通过用稀释缓冲液稀释100μM中间溶液制备5μM溶液。
实验：
(本实验在1.5mL eppendorf微型离心管中进行)
0分钟温育。方法：
a.加入100μL预温热的微粒体。
b.加入50μL5μM测试化合物溶液。
c.加入500μL冷终止溶液(冰冷甲醇)。
d.加入100μL NADPH辅因子溶液至eppendorf中。
a.涡旋混合eppendorf。
“t”分钟温育
b.加入100μL NADPH辅因子溶液至eppendorf中。
c.加入50μL5μM测试化合物溶液。
d.加入100μL预温热的微粒体。
e.在37℃300rpm在热混合器上温育eppendorf‘t’min。
f.从热混合器上取出eppendorf。
g.加入500μL冷终止溶液(冰冷甲醇)。
h.涡旋混合eppendorf。
在4℃将‘0’和‘t’分钟温育样品以15,000rcf离心15min。除去500μL上清液，对其进行LC/MS分析(SIM-选择性离子监测)
将结果表示为％剩余测试化合物＝(‘t’min样品的MS面积响应/‘0’min样品的MS面积响应)＊100。MS面积用作重复注射的平均值。
对于每一测试化合物，时间点＝0、15、30和60min。
阳性对照：
2μM丙米嗪-5min.和2μM丙米嗪-15min.温育用作大鼠和小鼠肝微粒体稳定性实验的阳性对照。
结果如表3中所示：
表3：小鼠和大鼠微粒体中的稳定性
令人惊奇地，正如表1-3中所观察到的，化合物1与WO 2007/024717中公开的结构类似物化合物B和C(已经发现两者在测试系统中具有的体外代谢稳定性差，使得这些化合物不适合于作为药物候选物研发)相比在小鼠、大鼠和人微粒体和大鼠和人肝细胞中显著地稳定。令人惊奇和出人意料地，用COOH部分替代现有技术化合物中的H或OH部分产生了化合物1，其在所有测试系统中均展示出高度的代谢稳定性。化合物1与其结构类似物相比的代谢稳定性增加确实是令人惊奇的，且证明了该化合物超过本领域中已知化合物的令人意外的有益性。
将本文引述的全部出版物、参考文献、专利和专利申请完整地引入本文作为参考，就如同将每篇申请、专利或专利申请各自特别地和分别地完整地引入参考一样。
上述具体实施方案的描述由此完整地揭示出了本发明的一般性质，通过应用目前的知识，在不进行过度实验和不脱离一般概念的情况下易于改变和/或调整应用这种具体的实施方案，由此这种调整和改变应和预期包含在所公开的实施方案的含义和范围内。应理解本文使用的措词或术语的目的在于示例而非限定。实现各种所公开的功能的方式、材料和步骤可以在不脱离本发明的情况下采用不同的可替代形式。

Claims (33)

1.结构式(I)表示的化合物：
其中
R是COOH；
及其药学可接受的盐。
2.根据权利要求1的结构式(I)表示的化合物及其药学可接受的盐，其中所述盐为与药学可接受的酸或碱的盐的形式。
3.根据权利要求2的结构式(I)表示的化合物及其药学可接受的盐，其中所述盐选自钠盐、钾盐、镁盐、半富马酸盐、盐酸盐和氢溴酸盐。
4.根据权利要求3的结构式(I)表示的化合物及其药学可接受的盐，其中所述盐是钠盐或半富马酸盐。
5.根据权利要求1的化合物，其选自：
6.根据权利要求1的化合物或其药学可接受的盐，其中所述的化合物由结构式(1)表示：
7.根据权利要求6的结构式(I)表示的化合物及其药学可接受的盐，其中所述盐为与药学可接受的酸或碱的盐的形式。
8.根据权利要求7的结构式(I)表示的化合物及其药学可接受的盐，其中所述盐选自钠盐、钾盐、镁盐、半富马酸盐、盐酸盐和氢溴酸盐。
9.根据权利要求8的结构式(I)表示的化合物及其药学可接受的盐，其中所述盐是钠盐。
10.根据权利要求8的结构式(I)表示的化合物及其药学可接受的盐，其中所述盐是半富马酸盐。
11.根据权利要求1-10任一项的化合物或其盐用于制备治疗或预防选自心脏障碍和疾病、肌疲劳、肌肉骨骼障碍和疾病、CNS障碍和疾病、认知功能障碍、神经肌肉障碍和疾病、骨障碍和疾病、癌症恶病质、恶性体温过高、糖尿病、心脏型猝死和婴儿猝死综合征的病症或用于改善认知功能的药物的用途。
12.药物组合物，其包含根据权利要求1-10任一项的化合物和一种或多种药学可接受的赋形剂或载体。
13.根据权利要求12的药物组合物用于制备治疗或预防选自心脏障碍和疾病、肌疲劳、肌肉骨骼障碍和疾病、CNS障碍和疾病、认知功能障碍、神经肌肉障碍和疾病、骨障碍和疾病、癌症恶病质、恶性体温过高、糖尿病、心脏型猝死和婴儿猝死综合征的病症或用于改善认知功能的药物的用途。
14.根据权利要求13的用途，其中所述病症与兰诺定受体1(RyR1)、兰诺定受体类型(RyR2)、兰诺定受体3型(RyR3)或其组合的功能异常相关。
15.根据权利要求13的用途，其中所述心脏障碍和疾病选自不规则心跳障碍和疾病；心力衰竭；心肌缺血/再灌注(I/R)损伤；慢性阻塞性肺疾病；冠状动脉血管成形术后I/R损伤或治疗心肌梗死的溶栓后(MI)；和高血压。
16.根据权利要求15的用途，其中不规则心跳障碍和疾病是锻炼诱发的不规则心跳障碍和疾病。
17.根据权利要求15的用途，其中心力衰竭选自充血性心力衰竭；慢性心力衰竭；急性心力衰竭；收缩性心力衰竭；舒张性心力衰竭；急性代偿性心力衰竭。
18.根据权利要求15的用途，其中不规则心跳障碍和疾病选自房性和室性心律失常、房性和心室颤动、儿茶酚胺依赖性室性心动过速(CPVT)和锻炼诱发的其变化形式的不规则心跳障碍和疾病。
19.根据权利要求18的用途，其中房性和室性心律失常选自房性和室性快速型心律失常和房性和室性心动过速。
20.根据权利要求13的用途，其中所述肌疲劳归因于骨骼肌疾病、障碍或病症。
21.根据权利要求13的用途，其中所述肌肉骨骼障碍和疾病选自锻炼诱发的骨骼肌疲劳；归因于延长锻炼或高强度锻炼的锻炼诱发的肌疲劳；先天性肌病；肌营养不良症；脊髓性肌萎缩(SMA)、脊柱和延髓肌萎缩(SBMA)、与年龄相关的肌疲劳；少肌症、中央核疾病；癌症恶病质；膀胱障碍；和失禁。
22.根据权利要求21的用途，其中肌营养不良症选自杜兴肌营养不良(DMD)、贝克肌营养不良(BMD)、角膜缘带肌营养不良(LGMD)、面肩肱型营养不良、肌强直性肌营养不良、先天性肌营养不良症(CMD)、远侧肌营养不良、埃-德二氏肌营养不良和眼咽肌营养不良。
23.根据权利要求13的用途，其中所述CNS障碍和疾病选自阿尔茨海默病(AD)、神经病、癫痫症、帕金森病(PD)和亨廷顿病(HD)；且所述神经肌肉障碍和疾病选自脊髓小脑性共济失调(SCA)和肌萎缩侧索硬化(ALS，Lou Gehrig病)。
24.根据权利要求13的用途，其中所述认知功能障碍与应激相关或与年龄相关，或其中所改善的认知功能是短期记忆、长期记忆、注意或学习，或其中所述认知功能障碍与疾病或障碍相关，所述疾病或障碍选自阿尔茨海默病(AD)、注意力缺陷伴多动障碍(ADHD)、孤独症谱系障碍(ASD)、一般焦虑症(GAD)、强迫性障碍(OCD)、帕金森病(PD)、创伤后精神紧张性障碍(PTSD)、精神分裂症、双相情感障碍和严重抑郁。
25.根据权利要求13的用途，其中所述病症是癌症恶病质。
26.根据权利要求25的用途，其中癌症恶病质归因于具有骨转移的癌症。
27.根据权利要求13的用途，其中以足以恢复或增强钙通道稳定蛋白2结合RyR2的剂量使用所述化合物。
28.根据权利要求13的用途，其中以足以恢复或增强钙通道稳定蛋白1结合RyR1的剂量使用所述化合物。
29.根据权利要求13的用途，其中以足以减少Ca2+通过RyR通道渗漏的剂量使用所述化合物。
30.根据权利要求13的用途，还包含应用对所关注的mRNA中的剪接序列具有特异性的反义寡核苷酸(AO)，其用于增强所述所关注的mRNA中的外显子跳跃。
31.根据权利要求30的用途，其用于治疗杜兴肌营养不良(DMD)，其中所述反义寡核苷酸(AO)对DMD基因的至少一个外显子的剪接序列具有特异性。
32.根据权利要求31的用途，其中所述反义寡核苷酸(AO)对DMD基因的外显子23、45、44、50、51、52和/或53的剪接序列具有特异性。
33.根据权利要求1-10任一项的化合物的制备方法，包含下列步骤：使下式的化合物
与下式的化合物反应，
其中Ra是COOR1或CN；R1是C1-C4烷基，且L是离去基，得到下式的化合物：
和
将基团Ra转化成基团R，得到式(I)化合物。
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