PT2653466E - Agentes para tratar patologias envolvendo a modulação de receptores de rianodina - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Agentes para tratar patologias envolvendo a modulação de receptores de rianodina"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A invenção presente diz respeito a derivados de 1,4-benzotiazepina e à sua utilização para tratar patologias e doenças associadas a receptores de rianodina (RyR) que regulam o funcionamento do canal de cálcio nas células. A invenção também descreve composições farmacêuticas que incluem estes compostos e as suas utilizações para tratar doenças e estados associados aos RyR, em especial patologias cardíacas, dos músculos esqueletais e do sistema nervoso central (SNC).

ESTADO DA TÉCNICA 0 retículo sarcoplásmico (SR) é uma estrutura nas células que funciona, entre outras, como um reservatório intracelular especializado de cálcio (Ca2+) . Os RyR são canais no SR, que se abrem e se fecham para regular a libertação de Ca2+ a partir do SR para o citoplasma

intracelular da célula. A libertação de Ca2+ para o citoplasma, a partir do SR, aumenta a concentração citoplásmica em Ca2+. A probabilidade de abertura dos RyR 2 refere-se à verosimilhança de um RyR se encontrar aberto num momento determinado, e portanto capaz de libertar Ca2+ para o citoplasma, a partir do SR.

Existem três tipos de RyR, que são todos fortemente homólogos: RyRl, RyR2, e RyR3. RyRl existe predominantemente no músculo esqueletal, bem como em outros tecidos, RyR2 existe predominantemente no coração bem como noutros tecidos, e RyR3 encontra-se no cérebro bem como noutros tecidos. 0 RyR é um tetrâmero. Parte do complexo RyR é formada por quatro polipéptidos de RyR associados a quatro proteínas de ligação FK506 (FKBP) (calstabinas), especificamente FKBP12 (calstabina 1) e FKBP12.6 (calstabina 2) . A calstabina 1 liga-se a RyRl e a RyR3 enquanto a calstabina 2 se liga a RyR2. As calstabinas ligam-se a RyR (uma molécula por cada subunidade de RyR) , estabilizam a função RyR, facilitam a passagem acoplada entre RyR vizinhas e evitam uma activação anormal (fuga de Ca2+) do canal por estabilizarem o estado fechado do canal. O Receptor de Rianodina 2 e as Doenças Cardíacas

No músculo cardíaco estriado, o principal canal de libertação de Ca2+ necessário para o acoplamento da excitação-contracção (EC) e para a contracção muscular é o RyR2. Durante o acoplamento EC, a despolarização da membrana da célula do músculo cardíaco durante a fase zero do potencial de acção activa canais cujo fecho depende da voltagem, para o Ca2+. 0 influxo de Ca2+ através dos canais 3 dependentes da voltagem abertos inicia por sua vez a libertação de Ca2+ do SR através de RyR2. Este processo é conhecido como a libertação de Ca2+ induzida por Ca2+. A libertação de Ca2+ induzida por Ca2+.mediada por RyR2 vai então activar as proteínas contrácteis na célula cardíaca, originando a contracção do músculo cardíaco. A fosforilação de RyR2 pela proteína quinase A (PKA) é uma parte importante da resposta de "luta ou foge" que aumenta o ganho do acoplamento EC cardíaco quando aumenta a quantidade de Ca2+ libertado em função de um determinado despoletante. Este caminho de sinalização proporciona um mecanismo no qual a activação do sistema nervoso simpático (SNS), em reacção a uma tensão, origina um aumento do caudal cardíaco de saída. Por fosforilação de RyR2 pela PKA origina-se uma dissociação parcial da calstabina 2 do canal, que por seu turno leva a um aumento da probabilidade de abertura, e a um aumento da libertação de Ca2+ do SR para o citoplasma intracelular. A insuficiência cardíaca (HF) é caracterizada por um estado hiperadrenérgico prolongado no qual os teores em catecolamina no soro estão cronicamente elevados. Uma consequência deste estado hiperadrenérgico crónico é uma hiperfosforilação persistente de RyR2 pela PKA, de tal modo que 3 a 4 das quatro Ser2808 em cada canal homotetramérico de RyR2 estão cronicamente fosforiladas (Marx SO, et al., Cell, 2000; 101(4): 365-376). Em especial, a hiperfosforilação crónica de RyR2 por PKA está associada a 4 um esvaziamento da subunidade de calstabina 2 de estabilização do complexo molecular do canal de RyR2. 0 esvaziamento da calstabina origina uma "fuga" diastólica de Ca2+ do SR a partir do complexo de RyR, o que contribui para uma deficiência da contractilidade (Marx et al., 2000) . Devido à activação da corrente despolarizante para dentro, esta "fuga" diastólica de Ca2+ do SR também está associada a arritmias cardíacas fatais (Lehnart et al., J. Clin. Invest. 2008; 118(6): 2230-2245). De facto, murganhos modificados de modo a não terem o local de fosforilação por PKA de RyR2 estão protegidos da progressão da HF a seguir a um enfarte do miocárdio (MI) (Wehrens XH et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2006; 103(3): 511-518). Além disto, a hiperf osf orilação crónica por PKA de RyR2 na HF está associada a uma remodelação do complexo macromolecular de RyR2 que inclui um esvaziamento das fosfatases (Marx et al., 2000) PP1 e PP2a (tornando a desfosforilação da Ser2808 ineficiente) e da fosfodiesterase de tipo 4 específica para cAMP (PDE4D3), do complexo de RyR2. O esvaziamento em PDE4D3 do complexo de RyR2 provoca um aumento prolongado dos teores locais em cAMP (Lehnart SE, et al., Cell 2005; 123(1) : 25-35) . Deste modo, a fuga diastólica de Ca2+ do SR contribui para a progressão da HF e para arritmias. Além disto, uma publicação recente demonstrou que em murganhos transgénicos knock-in com RyR2-S2808D+/+ (serina 2808 substituindo ácido aspártico), que mimetiza a hiperfosforilação constitutiva de RyR2 por PKA, existe um esvaziamento da calstabina 2 e um RyR2 com fugas. Os murganhos RyR2-S2808D+/+ desenvolvem cardiomiopatia 5 dependente da idade, demonstram uma oxidação e uma nitrosilação elevadas de RyR2, um menor conteúdo de Ca2+ armazenado no SR, e uma maior libertação de Ca2+ diastólica do SR. Após um enfarte do miocárdio, os murganhos RyR2-S2808D+/+ exibem maior mortalidade, quando comparados com WT da mesma prole. Por tratamento com S107, um derivado de 1,4-benzotiazepina que estabiliza as interacções entre RyR2 e a calstabina 2 (WO 2007/024.717), inibe a libertação diastólica de Ca2+ do SR mediada por RyR2 e diminui a progressão da HF tanto nos murganhos WT como nos RyR2- S2808D+/+ (Shan et al., J. Clin. Invest. 2010, 1 de

Dezembro; 120(12) : 4375-87) .

Além disto, o RyR2 contém cerca de 33 resíduos tiol livres o que o torna extremamente sensível ao estado redox celular. A oxidação da cisteína facilita a abertura do RyR e a libertação de Ca2+ do SR. Shan et al., 2010, demonstraram que a oxidação e a nitrosilação de RyR2 e a dissociação da subunidade estabilizadora calstabina 2 do RyR2 induz a libertação de Ca2+ do SR. A taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT) é uma patologia herdada em indivíduos com corações estruturalmente normais. Já têm sido ligadas à CPVT mais do que 50 mutações diferentes no RyR2. Os doentes com CPVT sofrem síncope e morte cardíaca súbita (SCD), desde s crianças até aos adultos, e a mortalidade atinge aos 35 anos de idade uns 50 %. Os indivíduos com CPVT têm arritmias ventriculares quando são 6 submetidos a exercício, mas não desenvolvem arritmias em repouso. As mutações do RyR2 associadas à CPVT originam canais RyR2 propensos a "fugas" devido à menor ligação da subunidade calstabina 2 (Lehnart et al., 2008). Os murganhos heterozigóticos quanto à mutação R2474S em RyR2 (murganhos RyR2-R2474S) exibem convulsões generalizadas espontâneas tónicas-clonais (que ocorrem na ausência de arritmias cardíacas), arritmias ventriculares induzidas pelo exercício, e SCD. Um tratamento com S107 aumenta a ligação da calstabina 2 ao canal mutante RyR2-R2474S, inibe as fugas do canal, evita arritmias cardíacas e aumenta o limiar das convulsões (Lehnart et al., 2008) . O Receptor 1 da Rianodina e as Doenças dos Músculos Esqueletais A contracção do músculo esquelético é activada pela libertação de Ca2+ do SR via RyRl. A despolarização da membrana transversa (T)-tubular activa o sensor da voltagem da dihidropiridina do receptor (Cavl.l) que por sua vez activa os canais RyRl por uma interacção directa proteína-proteína provocando a libertação de Ca2+m armazenado no SR. O Ca2+ liga-se à troponina C permitindo a formação de ligações cruzadas actina-miosina e o encurtamento dos sarcómeros.

Sob condições de tensão muscular prolongada (por exemplo, durante a corrida de uma maratona) ou numa doença tal como a insuficiência cardíaca, ambas as quais são 7 caracterizadas pela activação crónica do SNS, a função do músculo esqueletal é prejudicada, possivelmente devido a um 2 + acoplamento EC alterado. Em especial, a quantidade de Ca libertado do SR durante cada contracção muscular é diminuída, podem ocorrer acontecimentos aberrantes de libertação de Ca2+, e torna-se mais lenta a reabsorção do Ca2+ (Reiken, S, et al. 2003. J. Cell Biol. 160: 919-928) .

Estas observações sugerem que os efeitos nocivos da activação crónica do SNS sobre os músculos do esqueleto podem ser devidos, pelo menos parcialmente, a defeitos na sinalização do Ca2+. O complexo macromolecular de RyRl é constituído por um tetrâmero da subunidade com 560-kDa, RyRl, que forma um andaime para suporte de proteínas que regulam a função do canal, incluindo a PKA e a fosfodiesterase 4D3 (PDE4D3), a proteína fosfatase 1 (PP1) e a calstabina 1. Uma proteína A-quinase âncora (mAKAP) alveja a PKA e a PDE4D3 ao RyRl, enquanto a espinofilina alveja a PP1 ao canal (Marx et al., 2000; Brillantes et al., Cell, 1994, 77, 513-523; Bellinger et al. J. Clin. Invest. 2008, 118, 445-53). As subunidades catalíticas e reguladoras PKA, PP1, regulam a fosforilação mediada por PKA de RyRl na Ser2843 (Ser2844 no murganho) .

Foi demonstrado que a fosforilação mediada por PKA de RyRl na Ser2844 aumenta a sensibilidade do canal ao Ca2+ do citoplasma, diminui a afinidade de ligação da calstabina 1 a RyRl, e desestabiliza o estado fechado do canal (Reiken et al. , 2003; Marx, S.O. et al., Science, 1998, 281: 818- 821) . músculo

As concentrações em calstabina 1 no esqueletal estão descritas como sendo de cerca de 200 nM e também que a fosforilação por PKA de RyRl diminui a afinidade de ligação da calstabina 1 a RyRl de cerca de 100-200 nM a mais do que 600 nM. Deste modo, em condições fisiológicas, a diminuição da afinidade da ligação da calstabina 1 a RyRl, resultante da fosforilação por PKA de RyRl na Ser2843, é suficiente para diminuir substancialmente a quantidade de calstabina 1 presente no complexo de RyRl. Uma hiperfosforilação crónica de RyRl por PKA na Ser2843 (definida como uma fosforilação por PKA de 3 ou 4 dos 4 locais susceptíveis a PKA, Ser2843, presentes em cada homotetrâmero RyRl) resulta em canais "com fugas" (isto é, canais com propensão para se abrirem, em repouso), que contribuem para a disfunção do músculo esqueletal que está associada a estados hiperadrenérgicos persistentes tais como os que ocorrem nos indivíduos com insuficiência cardíaca (Reiken et al., 2003).

Além disto, a regulação da RyRl por modificações de após a tradução para além da fosforilação, tal como por nitrosilação dos grupos sulfidrilo livres nos resíduos de cisteína (nitrosilação em S), bem como a oxidação do canal, têm sido descritas como aumentando a actividade do canal RyRl. Demonstrou-se tanto para a nitrosilação em S como para a oxidação de RyRl, que elas diminuem a ligação da calstabina 1 a RyRl. Já foi descrito por Bellinger et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. 2008, 105(6): 2198-2002) que durante o exercício 9 extremo em murganhos e em seres humanos, a RyRl é progressivamente hiperfosforilada por PKA, é nitrosilada em S e é esvaziada de PDE4D3 e de calstabina 1, originando os canais "com fugas" que provocam diminuição da capacidade de exercício nos murganhos. Um tratamento com S107 evita o esvaziamento da calstabina 1 do complexo RyRl, melhora a geração de força e a capacidade de exercício, e diminui a actividade dependente de Ca2+ da protease calpaína e os teores em creatinina no plasma. A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma das principais doenças genéticas mortais da infância. A DMD está ligada ao cromossoma X, afectando 1 em 3.500 indivíduos nascidos do sexo masculino e origina tipicamente a morte aos ~30 anos de idade, por falha cardíaca ou respiratória. Mutações da distrofina associadas à DMD levam a uma perda completa da proteína distrofina, e desse impedem a ligação entre o citoesqueleto do subsarcolema e a matriz extracelular. Esta ligação é essencial para proteger e para estabilizar o músculo contra as lesões provenientes da contracção. Não existe hoje em dia cura para a DMD e a maior parte dos tratamentos medicinais são paliativos. As intervenções emergentes, nas Fases I/II dos ensaios clínicos, são o salto de exão, a inibição da miostatina, e a regulação em alta da utrofina. No entanto, existem problemas na libertação sistémica, na manutenção do salto de exão, e na regulação em alta da utrofina. Além disto, nos ensaios clínicos das Fases I/II, a inactivação da miostatina para aumentar a dimensão muscular não demonstrou 10 mais força nem melhor funcionamento muscular. A instabilidade do sarcolema devida a mutações na distrofina tem um efeito em cascata. Um efeito principal é o aumento da concentração de Ca2+ no citosol, que leva à activação das protéases dependentes de Ca2+ (calpaínas). Outro efeito é a inflamação e a actividade elevada de iNOS, que pode provocar oxidação/nitrosilação de proteínas, lípidos, e do ADN. A patologia muscular na DMD é progressiva e excede em muito a instabilidade do sarcolema. Deste modo a patologia é consistente com a instabilidade do sarcolema aumentando a susceptibilidade a mais lesões. Foi recentemente demonstrado que uma oxidação excessiva ou uma nitrosilação de RyRl pode impedir a interacção da calstabina 1 com o complexo RyRl, levando a fugas do RyRl e a fraqueza muscular num modelo em murganho da distrofia muscular (mdx) , e que o tratamento com S107 melhora os índices de função muscular neste modelo em murganho (Bellinger, A. et al. 2009, Nature Medicine, 15: 325-330). A diminuição de massa muscular e da força relacionadas com a idade (sarcopenia) contribui para a incapacidade e o aumento da mortalidade. Andersson, D. et al., (Cell Metab. 2011, 3 de Agosto; 14(2): 196-207) descreveram que a RyRl de murganhos idosos (24 meses) está oxidada, tem cisteínas nitrosiladas, e está esvaziada de calstabina 1, em comparação com a RyRl de murganhos adultos novos (3-6 meses). A remodelação deste canal complexo RyRl originou canais "com fugas" com uma maior probabilidade de abertura, levando a uma perda intracelular de cálcio no 11 músculo esqueletal. Tratando murganhos idosos com S107 estabilizou-se a ligação da calstabina 1 e RyRl, diminuiu-se a perda intracelular de cálcio, diminuiram-se as espécies reactivas de oxigénio (ROS), e aumentou-se a libertação tetânica de Ca2+, a força especifica dos músculos, e a capacidade de exercício.

As publicações internacionais de patentes PCT WO 2005/094.457, WO 2006/101.496 e WO 2007/024.717 descrevem derivados de 1,4-benzotiazepina e a sua utilização no tratamento de patologias cardíacas, musculares esqueletais e cognitivas, entre outras. A publicação internacional de patente PCT WO 2008/060.332 diz respeito à utilização de derivados de 1,4-benzotiazepina para o tratamento da fadiga muscular em sujeitos que sofram de patologias tais como distrofia muscular, ou em sujeitos que sofram de fadiga muscular em resultado de exercício mantido, prolongado e/ou extenuante, ou de tensão crónica. A publicação internacional de patente PCT WO 2008/021.432 diz respeito à utilização de derivados de 1,4-benzotiazepina para o tratamento e/ou a prevenção de doenças, patologias e estados que afectam o sistema nervoso. A publicação internacional de patente PCT WO 2012/019.076 diz respeito à utilização de derivados de 1,4- 12 benzotiazepina para o tratamento e/ou a prevenção de lesões por isquémia e reperfusão cardíaca. Fauconnier et al., Proc. Nat1. Acad. Sei. USA, 2011, 108(32): 13258-63 reportam que fugas de RyR mediadas pela activação de caspase-8 levam a lesões no ventrículo esquerdo após enfarte do miocárdio e reperfusão, e que o tratamento com S107 inibia a perda de Ca2+ do SR, diminuía as arritmias ventriculares, a dimensão do enfarte, e a remodelação ventricular esquerda aos 15 dias após a reperfusão. A publicação internacional de patente PCT WO 2012/019.071 diz respeito à utilização de derivados de 1,4-benzotiazepina para o tratamento e/ou a prevenção de sarcopenia. A publicação internacional de patente PCT WO 2012/037.105 diz respeito à utilização de derivados de 1,4-benzotiazepina para o tratamento e/ou a prevenção de patologias e doenças induzidas por tensão.

Existe uma necessidade de se identificarem novos compostos eficazes para tratar patologias e doenças associadas aos RyR, incluindo patologias e doenças dos músculos esqueletais e cardíacas. Mais especificamente, continua a existir uma necessidade de se identificarem novos agentes que se possam utilizar para tratar patologias associadas a RyR através, por exemplo, da reparação das fugas nos canais RyR, e do aumento da ligação entre as calstabinas e os RyR fosforilados/oxidados/nitrosilados por 13 PKA, e os RyR mutantes que de outra forma tenham uma afinidade diminuida para, ou não se liguem a, calstabinas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO A invenção presente proporciona novos derivados de 1,4-benzotiazepina, e os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. Em algumas concretizações, os compostos da invenção presente são estabilizadores do receptor de rianodina (RyR) do canal de cálcio, por vezes referidos como "Rycal®". A invenção presente também proporciona métodos para utilizar estes compostos para tratar patologias e doenças associados aos RyR.

Os compostos da invenção presente são uma selecção dos derivados de 1,4-benzotiazepina descritos no WO 2007/024.717. O WO 2007/024.717 descreve compostos estruturalmente semelhantes, no entanto, tal como se descreve mais em pormenor neste documento, verificou-se que estes compostos são fortemente instáveis e portanto que a sua utilidade terapêutica como fármacos é limitada. O problema subjacente ao pedido presente é portanto proporcionar derivados alternativos de 1,4-benzotiazepina que sejam não só activos do ponto de vista farmacêutico -mas também que tenham propriedades favoráveis tais como uma elevada estabilidade metabólica, e sejam portanto adequados como fármacos no tratamento de doenças e estados associados a RyR, por exemplo patologias cardíacas, dos músculos esqueletais e do sistema nervoso central (SNC). Verificou- 14 se inesperadamente que os compostos com a fórmula (I) são estáveis, bem como farmacologicamente activos, proporcionando deste modo uma solução técnica para o problema subjacente à invenção presente.

Os compostos da invenção presente são representados pela estrutura com a fórmula (I):

(I) na qual R seja COOH; e os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.

Os compostos com a fórmula (I) podem estar presentes sob a forma de um sal com um ácido ou uma base aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. Estes sais são preferivelmente seleccionados de entre o conjunto constituído por sais de sódio, potássio, magnésio, hemifumarato, cloridrato e bromidrato, representando cada um deles uma concretização distinta da invenção presente. 15

Um sal preferido hoje em dia é o sal de sódio. Outro sal preferido hoje em dia é o sal hemifumarato.

Nalgumas concretizações especificas, selecciona-se o composto de entre o conjunto constituído por composto 1, composto 4 e composto 6, e os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. Descrevem-se adiante neste documento as estruturas destes compostos.

Numa concretização preferida, o composto é representado pela estrutura do composto (1):

ou os seus sais aceitável do ponto de vista farmacêutico. possibilidades uma

Em algumas concretizações, proporciona-se o composto 1 a título de composto de origem. Noutras concretizações, no entanto, proporciona-se o composto 1 sob a forma de um sal com um ácido ou com uma base aceitável do ponto de vista farmacêutico. Preferivelmente, selecciona-se esse sal de entre o conjunto constituído por sais de sódio, potássio, magnésio, hemifumarato, cloridrato e bromidrato, representando cada uma destas 16 concretização individual da invenção presente. Um sal preferido hoje em dia é o sal de sódio. Outro sal preferido hoje em dia é o sal hemifumarato. A invenção presente também proporciona métodos para a síntese dos compostos da invenção, e dos seus sais. A invenção presente também proporciona composições farmacêuticas contendo um ou mais dos compostos da invenção, e pelo menos um aditivo ou excipiente, por exemplo, cargas, diluentes, aglomerantes, desintegrantes, tampões, corantes, emulsionantes, agentes que melhoram o sabor, gelificantes, agentes de deslizamento, conservantes, solubilizantes, estabilizadores, agentes de suspensão, edulcorantes, agentes de tonicidade, agentes molhantes, emulsionantes, agentes dispersantes, agentes de inchamento, retardantes, lubrificantes, absorventes, e agentes de aumento da viscosidade. As composições podem ser apresentadas em formas de dosagem que sejam cápsulas, grânulos, pós, soluções, saquetas, suspensões, ou comprimidos. A invenção presente também proporciona métodos para tratar ou para evitar diversas patologias, doenças e estados associados a RyR, tais como patologias e doenças cardíacas, musculosesqueletais, cognitivas, do SNC e neuromusculares, que incluam a administração a um sujeito que necessite de um tal tratamento de uma quantidade de um composto com a fórmula (I) ou de um seu sal, eficaz para 17 evitar ou para tratar uma patologia ou uma doença associada a um RyR. A invenção presente também proporciona um método para evitar ou para tratar uma fuga num RyR (incluindo RyRl, RyR2 e RyR3) num sujeito, incluindo administrar-se ao sujeito uma quantidade de um composto com a fórmula (I) ou de um seu sal, eficaz para evitar ou para tratar uma fuga no RyR.

Além disto, a invenção presente proporciona um método de modular a ligação de RyR a calstabinas num sujeito, incluindo administrar-se ao sujeito uma quantidade de um composto com a fórmula (I) ou de um seu sal, eficaz para modular a quantidade de calstabina ligada ao RyR. A invenção também diz respeito à utilização de um composto com a fórmula (I) para o fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou a prevenção de patologias, doenças e estados associados a RyR, tais como patologias e doenças cardíacas, musculoesqueletais e cognitiva/do SNC. Noutra concretização, a invenção presente diz respeito à utilização de um composto com a fórmula (I) para o fabrico de um medicamento para evitar ou tratar uma fuga no RyR. Noutra concretização, a invenção presente diz respeito à utilização de um composto com a fórmula (I) para o fabrico de um medicamento para modular a quantidade de calstabinas ligadas a RyR.

Os métodos da invenção podem ser levados à prática num sistema in vitro (por exemplo, culturas de 18 células ou de tecidos) ou in vivo (por exemplo, num animal não humano ou num ser humano).

Em algumas concretizações, os compostos da invenção são proporcionados em combinação com terapia de salto de exão, por exemplo, oligonucleótidos de sentido reverso (AO), de modo a incrementar os saltos de exões num mARN com interesse, por exemplo, o gene DMD, tal como se descreve em mais pormenor neste documento. Outras características e vantagens da invenção presente tornar-se-ão aparentes a partir da descrição pormenorizada e das figuras que se seguem.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura IA

Imunotransferência com anticorpo para calstabina 2 mostrando a ligação da calstabina 2 a RyR fosforilado por PKA na ausência (-) ou na presença de composto 1 100 nM. (+): ligação da calstabina a RyR2 não fosforilado por PKA. Utiliza-se S36 (US 7.544.678), a titulo de um controlo positivo.

Figura 1B

Imunotransferência com anticorpo contra calstabina 2 mostrando a ligação da calstabina 19 2 a RyR2 fosforilado por PKA na ausência (-) ou na presença de composto 2, composto 3 ou composto 4, 100 nM,. (+): ligação da calstabina a RyR2 não fosforilado. Utiliza-se S36 como controlo positivo.

Figura 1C

Imunotransferência com anticorpo contra calstabina 1 mostrando a ligação da calstabina 1 a RyRl fosforilado por PKA na ausência (Neg) ou na presença das concentrações indicadas de composto 1 ou e composto 4. (Pos) : ligação da calstabina a RyR 1 não fosforilado. Utiliza-se S36 como controlo positivo.

Figura 2

Figura 2A: Imunotransferência com anticorpo contra calstabina 1 mostrando os teores em calstabina 1 nos complexos RyRl imunoprecipitados de lisados tibiais em murganhos a que se administrou veiculo (DMSO/PEG a 50:50), só isoproterenol (ISO) ou isoproterenol em conjunto com as concentrações indicadas de composto 1 em bombas osmóticas. Utiliza-se S36 como controlo a 3,6 mM. 20

Figura 2B: quantificaçao da % de calstabinal que se volta a ligar a RyRl.

Figura 3

Modelo de insuficiência cardíaca crónica no rato induzida por lesões devidas a isquémia-reperfusão (I/R). Para o protocolo de I/R, ocludiu-se a artéria coronária anterior descendente esquerda (LAD) durante 1 h.

Figura 4

Volumes do ventrículo esquerdo (LV) e fracção de ejecção (EF) em ratos tratados com composto 1 a 5 mg/kg/d (5 MK) ou a 10 mg/kg/d (10 MK) na água de beber, em relação a ratos tratados com veículo (H20) e a animais operados em falso. Induziu-se a insuficiência cardíaca crónica por lesões de isquémia-reperfusão (I/R). Ocludiu-se a artéria LAD durante 1 h; iniciou-se o tratamento 1 semana depois da reperfusão e continuou-se durante 3 meses. Obtiveram-se os parâmetros ecocardiográficos passados 1, 2 ou 3 meses do tratamento. Figura 4A: Volume

Diastólico Final do LV; Figura 4B: Volume Sistólico Final do LV; Figura 4C: EF. Figuras 4A e 4B: § P<0,001 em relação ao falso; * P<0,05 em relação ao veículo; t P<0,001 em 21 relação ao veículo. Figura 4C: § P<0,001 em relação ao falso, t P<0,001 em relação ao veículo.

Figura 5

As Figuras 5A-C representa a massa corporal (BW) (5A), o tamanho do enfarte (5B), e a massa do LV (5C), e a Figura 5D representa o conteúdo em colagénio em ratos tratados com composto 1 a 5 mg/kg/d (5 MK) e a 10 mg/kg/dia (10 MK) na água de beber, em relação aos tratados a veículo (H20) e aos operados em falso. Induziu-se a insuficiência cardíaca crónica por lesões de isguémia-reperfusão (I/R). Ocludiu-se a artéria LAD durante 1 h; iniciou-se o tratamento 1 semana depois da reperfusão e continuou-se durante 3 meses. Mediram-se os parâmetros passados 3 meses do tratamento.

Figuras 5A-C: não significativas. Figura 5D: ttt P<0,001 em relação ao falso; * P<0,05 em relação a veículo.

Figura 6

Hemodinâmica invasiva: Tensão sistólica do ventrículo esguerdo (LV SP) (6A), dP/dtmax (6B); e dP/dtmin (6C) em ratos tratados com composto 1 a 5 mg/kg/d (5 MK) ou a 10 mg/kg/dia 22 (10 MK) na água de beber, em relação a animais tratados com veiculo (H20) e a animais operados em falso. Induziu-se a insuficiência cardíaca crónica por lesões de isquémia-reperfusão (I/R) . Induziu-se a insuficiência cardíaca crónica por lesões de isquémia-reperfusão (I/R) . Ocludiu-se a artéria LAD durante 1 h; iniciou-se o tratamento 1 semana depois da reperfusão e continuou-se durante 3 meses. Figura 6A: não significativa. Figura 6B: § P<0,05 em relação a falso; * P<0,05 em relação a veículo. Figura 6C: t P<0,01 em relação a falso; * P<0,05 em relação a veículo.

Figura 7

Concentrações em composto 1 no plasma (μΜ) em função da altura do dia.

Figura 8 EF em ratos tratados com composto 1 ou com composto A a 5 mg/kg/d (5 MK) na água de beber, em relação a animais tratados com veículo (H20) e a animais operados em falso. Ocludiu-se a artéria LAD durante 1 h; iniciou-se o tratamento 1 semana depois da reperfusão e continuou-se durante 3 meses. Obtiveram-se os parâmetros electrocardiográficos passados 1, 2 23 ou 3 meses do tratamento. § P<0,001 em relação a falso; * P<0,05 em relação a veículo; t P<0,001 em relação a veículo.

Figura 9

Efeito do composto 1 sobre a actividade física espontânea de murganhos mdx e WT em comparação com a de controlos tratados com veículo (H20) . P<0,001 para a actividade nos dias 1-19 em murganhos mdx doseados com 10 e com 50 mg/kg/dia (dose alvo) administrados na água de beber, em comparação com controlo a veículo.

Figura 10

Relação específica força-frequência do músculo EDL, (A) murganhos mdx tratados com o composto 1 (a 5, 10 e a 50 mg/kg/d (dose alvo)) administrado na água de beber, em comparação com controlos tratados a veículo (H20) (n=5). p<0,05, para a dose de 50 mg/kg/d, a frequências de 150 Hz e acima. (B) murganhos WT, C57BL/6, tratados com composto 1 (a 50 mg/kg/d (dose alvo) administrado na água de beber, em comparação com animais tratados a veículo (H20) (n=4)

Figura 11

Massa corporal média (12A) e consumo médio de água (12B) de murganhos mdx e WT tratados com veiculo (H20) ou com composto 1 (a 50 mg/kg/d (dose alvo) administrado na água de beber.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Deve entender-se que a descrição pormenorizada e os exemplos específicos, embora indiquem diversas concretizações da invenção, são incluídos apenas a título ilustrativo.

Tal como se utilizam nesta descrição e nas reivindicações apensas, as formas singulares "um" "uma", "o" e "a" incluem referências ao plural a não ser quando o conteúdo indicar claramente o contrário. O termo "Rycal®" refere-se a estabilizadores do receptor de rianodina do canal de cálcio, representados pelos compostos com a Fórmula geral (I) ou a (IA), tal como proporcionados pela invenção, bem como os compostos especificamente designados por valores numéricos tal como os proporcionados pela invenção, e colectivamente referidos neste documento como "composto(s) da invenção".

Compostos 25

Em algumas concretizações, os compostos da invenção presente são representados pela estrutura com a fórmula(I):

na qual R é COOH e os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.

Em concretizações preferidas, R na Fórmula (I) está na posição 4 do anel fenilo (isto é, na posição 7 do anel de benzotiazepina). Cada possibilidade representa uma concretização em separado da invenção presente. Os compostos com a fórmula (I) podem estar presentes sob a forma de um sal com um ácido ou com uma base aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. Estes sais são preferivelmente seleccionados de entre o conjunto constituído por sais de sódio, de potássio, de magnésio, hemifumarato, cloridrato e bromidrato, representando cada uma destas possibilidades uma concretização distinta da invenção presente. Um sal 26 preferido hoje em dia é o sal de sódio. Outro sal preferido hoje em dia é o sal hemifumarato.

Em algumas concretizações preferidas, o composto da invenção é seleccionado de entre o conjunto constituído por composto 1, composto 4, composto 6, e os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. São adicionalmente descritos compostos de referência seleccionados de entre o conjunto constituído por composto 2, composto 3, composto 5, e os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.

Estes compostos são representados pelas seguintes estruturas:

(2) 27

Definições Químicas: 28 0 termo "alquilo", tal como se utiliza neste documento, refere-se ta um hidrocarnoneto linear ou ramificado, saturado, contendo entre 1 e 4 átomos de carbono ("alquilo C1-C4"). Incluem-se nos grupos alquilo representativos os grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo, e terc-butilo.

Os compostos da invenção presente podem existir sob uma sua forma tautomérica. Todas essas formas tautoméricas estão contempladas neste documento como fazendo parte da invenção presente.

Os compostos da invenção presente são, a seguir à sua preparação, preferivelmente isolados e purificados de modo a obter-se uma composição contendo uma quantidade ponderai maior ou a cerca de 90 % do composto, cerca de 95 % do composto, e ainda mais preferivelmente mais do que cerca de 99 % do composto (compostos "substancialmente puros"), que em seguida se utiliza ou se formula tal como se descreve neste documento. Estes compostos "substancialmente puros" da invenção presente também estão contemplados neste documento como fazendo parte da invenção presente.

Utilização Terapêutica A invenção presente proporciona compostos que são capazes de tratar estados, patologias e doenças associadas 29 a RyR. Mais especificamente, a invenção presente proporciona compostos que são capazes de reparar uma fuga nos canais RyR, que podem ser canais RyRl, RyR2 e/ou RyR3. Numa concretização, os compostos da invenção aumentam a associação e/ou inibem a dissociação de RyR e calstabina (por exemplo, RyRl a calstabina 1; RyR2 a calstabina 2; e RyR 3 a calstabina 1). "Estados, patologias e doenças associadas a RyR" significa patologias e doenças que podem ser tratadas e/ou evitadas modulando RyR e nas quais se incluem patologias e doenças cardíacas, fadiga muscular, patologias e doenças musculoesqueletais, patologias e doenças do SNC, disfunção cognitiva, patologias e doenças neuromusculares, melhoria da função cognitiva, patologias e doenças dos ossos, caquexia do cancro, hipertermia maligna, diabetes, morte cardíaca súbita, e síndrome de morte súbita de crianças.

Numa concretização, a invenção presente diz respeito à utilização de uma quantidade eficaz de composto com a fórmula (I), tal como descrito neste documento, ou de um seu sal, para o fabrico de um medicamento para tratar ou para evitar um estado seleccionado de entre o conjunto constituído por patologias e doenças cardíacas, fadiga muscular, patologias e doenças esqueletais, patologias e doenças do SNCN, patologias e doenças neuromusculares, disfunção cognitiva, patologias e doenças dos ossos, caquexia do cancro, hipertermia maligna, diabetes, morte cardíaca súbita, e síndrome de morte súbita de crianças, ou 30 para melhorar a função cognitiva. Um composto preferido hoje em dia é um composto com a fórmula (1).

Noutra concretização, a invenção presente diz respeito a um composto com a fórmula (I) tal como descrita neste documento, ou um seu sal, para utilização no fabrico de um medicamento para tratar ou para evitar um estado seleccionado de entre o conjunto constituído por de entre o conjunto constituído por patologias e doenças cardíacas, fadiga muscular, patologias e doenças esqueletais, patologias e doenças do SNCN, patologias e doenças neuromusculares, disfunção cognitiva, patologias e doenças dos ossos, caquexia do cancro, hipertermia maligna, diabetes, morte cardíaca súbita, e síndrome de morte súbita de crianças, ou para melhorar a função cognitiva. Um composto preferido hoje em dia é um composto com a fórmula (D ·

Também se descrevem métodos para tratar ou para evitar um estado seleccionado de entre o conjunto constituído por de entre o conjunto constituído por patologias e doenças cardíacas, fadiga muscular, patologias e doenças esqueletais, patologias e doenças do SNCN, patologias e doenças neuromusculares, disfunção cognitiva, patologias e doenças dos ossos, caquexia do cancro, hipertermia maligna, diabetes, morte cardíaca súbita, e síndrome de morte súbita de crianças, ou para melhorar a função cognitiva, método que inclua o passo de se administrar a um sujeito que dela necessite uma quantidade 31 eficaz do ponto de vista terapêutico de um composto com a fórmula (I) tal como descrita neste documento, ou de um seu sal, para levar a cabo o tratamento referido. Um composto preferido hoje em dia é um composto com a fórmula (1).

Numa concretização, o estado, patologia ou doença está associado a uma função anormal do RyRl. Noutra concretização, o estado, patologia ou doença está associado a uma função anormal do RyR2. Noutra concretização, o estado, patologia ou doença está associado a uma função anormal do RyR3. Cada uma destas possibilidades representa uma concretização distinta da invenção presente.

Incluem-se nas patologias e doenças cardíacas as patologias e doenças de pulsação irregular, as patologias e doenças e pulsação irregular induzida pelo exercício, a insuficiência cardíaca, a falha cardíaca congestiva, a falha cardíaca crónica, a falha cardíaca aguda, a falha cardíaca sistólica, a falha cardíaca diastólica, a falha cardíaca descompensada aguda, as lesões de isquémia/reperfusão (I/R) (incluindo as lesões de I/R após angioplastia coronária ou após trombólise durante o enfarte do miocárdio (MI)), a doença obstrutiva crónica pulmonar, e a tensão sanguínea elevada. As patologias e doenças de pulsação irregular incluem a arritmia atrial e ventricular, a fibrilação atrial e ventricular, a taquiarritmia atrial e ventricular, a taquicardia atrial e ventricular, a taquicardia catecolaminérgica polimórfica ventricular (CPVT), e as suas variantes induzidas pelo exercício. 32

Os compostos da invenção também são úteis para tratar a fadiga muscular, que pode ser devida a exercício prolongado ou a exercício de elevada intensidade, ou podem ser provocadas por doenças musculoesqueletais. Incluem-se nos exemplos de patologias e doenças musculares a fadiga muscular esqueletal, doenças do núcleo central, fadiga muscular esqueletal induzida pelo exercício, patologias da bexiga, incontinência, fadiga muscular associada à idade, sarcopenia, miopatias congenitais, miopatias e/ou atrofias do músculo esqueletal, caquexia do cancro, miopatia com núcleos e bastões, miopatias mitocondriais [por exemplo, síndrome de Kearns-Sayre, síndrome MELAS (miopatia mitocondrial, encefalopatia, acidose láctica, e apoplexia), e síndrome MERRF (epilepsia mioclónica e fibras vermelhas rasgadas)], miopatias endócrinas, doenças da armazenagem muscular do glicogénio [por exemplo, doença de Pompe, doença de Andersen, e doenças de Cori], mioglobinúrias [por exemplo, doença de McArdle, doença de Tarui, e doença de DiMauro], dermatomiosite, miosite ossificante, paralisia periódica familiar, polimiosite, miosite com corpos de inclusão, neuromiotonia, síndrome de homem duro (stiff-man) , hipertermia maligna, cãibras musculares habituais, tetania, miastenia grave, atrofia muscular espinal (SMA), atrofia muscular espinal e bulbar (SBMA, também designada atrofia muscular espinobulbar, atrofia bulbo-espinal, neuropatia bulboespinal ligada a X (XBSN), atrofia espinal de tipo 1 ligada a X (SMAX1), e doença de Kennedy (KD) ) , e distrofia muscular. As patologias musculares esqueletais 33 preferidas incluem fadiga muscular induzida pelo exercício, uma miopatia congénita, distrofia muscular, fadiga muscular relacionada com a idade, sarcopenia, doença nuclear central, caquexia do cancro, patologias da bexiga, e incontinência.

Incluem-se nos exemplos de Distrofia Muscular a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), a Distrofia Muscular Becker (BMD), a Distrofia Muscular (Limb Girdle) de membro Cintado (LGMD), a Distrofia Muscular Congénita (CMD), a Distrofia Muscular distai, a distrofia facio-escapulo-humeral, a Distrofia Muscular miotónica, a Distrofia Muscular de Emery-Dreifuss, e a Distrofia Muscular oculo-faríngica, sendo hoje em dia preferida a DMD. A distrofia muscular congénita, tal como se utiliza neste documento, refere-se à distrofia muscular que está presente no nascimento. A CMD é classificada com base em mutações genéticas: 1) genes codificando para proteínas estruturais da membrana de base ou da matriz extracelular das fibras do músculo esqueletal; 2) genes codificando para glicosiltransferases putativas ou demonstradas, que por sua vez afectam a glicosilação da distroglicana, uma proteína externa de membrana na membrana bas; e 3) outros. Incluem-se nos exemplos de CMD a CMD deficiente em Laminina-a2 (MDC1A) , as CMG de Ullrich (UCMD 1, 2 e 3) , a síndrome de Walker-Warburg (WWS), a doença Músculo-olho-cérebro (MEB), a CMD de Fukuyama (FCMD), a CMD com deficiência secundária em laminina 1 (MDC1B), a CMD com deficiência secundária em 34 laminina 2 (MDC1C), a CMD com atraso mental e paquigíria (MDC1D), e a espinha rígida com distrofia muscular de Tipo 1 (RSMD1). A disfunção cognitiva pode estar associada a, ou incluir, perda de memória, perda de memória dependente da idade, patologia de tensão pós-traumática (PTSD), patologia de défice de atenção com hiperactividade (ADHD), patologia de espectro do autismo (ASD), patologia de ansiedade generalizada (GAD) , patologia obsessiva compulsiva (OCD), esquizofrenia, patologia bipolar, ou depressão maior.

As patologias e doenças do SNC incluem a doença de Alzheimer (AD), neuropatia, convulsões, Doença de Parkinson (PD), e Doença de Huntington (HD).

Incluem-se nas patologias e doenças neuromusculares a ataxia espinocerebelar (SCA), e a esclerose lateral amiotrófica (ALS, doença de Lou Gehrig).

Em algumas concretizações, os compostos da invenção presente melhoram a função cognitiva, que pode ser seleccionada de entre a memória a curto termo, memória a longo termo, atenção, aprendizagem, e qualquer combinação destas.

Em algumas concretizações, os compostos da invenção presente são úteis no tratamento de caquexia do cancro, isto é, da fraqueza muscular que está associada ao 35 cancro em geral, e preferivelmente da fraqueza muscular no cancro metastático, tal como metástases ósseas. A fraqueza muscular e a atrofia muscular (caquexia) são sintomas paraneoplásicos habituais nos doentes com cancro. Estes estados provocam fadiga significativa e diminuem muito a qualidade de vida do doente. A especificação presente proporciona um método para tratar e para evitar a fraqueza muscular num doente com cancro, com base, parcialmente, em se ter observado que em determinados tipos de cancro, por exemplo, no cancro da próstata e no cancro da mama com metástases nos ossos, o RyRl está oxidado o que induz que ele tenha "fugas". Verificou-se além disto que a prevenção destas fugas por administração de compostos Rycal melhora a função muscular. Incluem-se nos exemplos de cancros o cancro da mama, o cancro da próstata, o cancro dos ossos, o cancro do pâncreas, o cancro do pulmão, o cancro do cólon, e o cancro gastrointestinal.

Terapia de salto ds Exão:

Em algumas concretizações, os compostos da invenção presente modulam (por exemplo, incrementam) as emendas no mARN por aumentarem os saltos de exão mediados em sentido reverso. Esta modulação das emendas é levada a cabo na presença de oligonucleótidos de sentido reverso (AO) que sejam específicos para sequências de emendas com interesse. Em algumas concretizações da invenção, o composto com a fórmula (I) ou (IA) e o AO podem actuar de modo sinergístico, em que o composto com a fórmula (I) ou 36 (IA) incrementa ο salto de exão mediado pelo AO. Deste modo, em algumas concretizações, a invenção presente diz respeito a uma concretização da composição farmacêutica para utilização no tratamento ou na prevenção de qualquer dos estados descritos neste documento que estejam associados a RyR com Fugas, incluindo também a utilização de um AO de sentido reverso que seja específico para uma sequência de emenda numa sequência de mARN, para aumentar o salto de exão no mARN de interesse.

Uma concretização especifica para aumento do salto de exão pelos compostos da invenção presente diz respeito à Distrofia Muscular de Duchenne (DMD). A DMD é uma doença mortal recessiva ligada a X caracterizada por fraqueza muscular progressiva ao longo da vida do doente. A DMD é provocada sobretudo por múltiplas remoções de exões fora do quadro no gene DMD, provocando uma ablação da produção da proteína distrofina. A perda da expressão da distrofina por si só não explica a patofisiologia da DMD. 0 desmantelamento do complexo distrofina-glicoproteína (DGC) também origina tensão oxidativa, sobrecarga mitocondrial em Ca2+ e apoptose, aumento do influxo de Ca2+ para o músculo, e sinalização patológica do Ca2+. Não existem terapias para a cura da DMD, e o único tratamento farmacológico demonstrado são corticosteróides, que podem prolongar a ambulação, mas têm efeitos colaterais substanciais. 0 salto de exão mediado por oligonucleótidos de sentido reverso é uma via terapêutica prometedora, alvejando restaurar o quadro de leitura de DM e permitindo a expressão de um 37 complexo intacto de distrofina com glicoproteína. Até à data, têm sido produzidos em seres humanos teores pequenos em proteína distrofina por este método. Kendall et al., (Sei. Transi. Med., 2012, 4(164), pág. 164-160) reportam que determinadas moléculas pequenas tais como o Dantroleno e outros moduladores de RyR, potenciam o salto de exão conduzido por oligómeros de sentido reverso de modo a aumentar o salto de exão e restaurar o quadro de leitura do mARN, a proteína distrofina do sarcolema, e o complexo de distrofina com glicoproteína no músculo esqueletal de murganhos mdx, um modelo murino de DMD.

Deste modo, numa concretização, a invenção presente diz respeito à utilização de um composto com a fórmula (I) consoante a invenção presente, em combinação com um oligonucleótido de sentido reverso (AO) que seja específico para uma emenda de sequência de um ou mais exões do gene DMD, por exemplo os exões 23, 45, 44, 50, 51, 52 e/ou 53 do gene DMD, para o fabrico de um medicamento pra tratar DMD. Os AO preferidos incluem os AO que alvejam os exões de DMD 23, 50 e/ou 51, do gene DMD, tais como os AO 2'-O-metil(2'OMe)fosforotioato ou fosforodiamidato-morfolino (PMO). Incluem-se nos exemplos de tais AO, Pro051/GSK2402968, AVI4658/Eteplirsen, e PMO E23 morfolino (5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3'). O termo uma "quantidade eficaz", "quantidade suficiente" ou "quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico" de um agente, tal como se utilizam neste 38 documento a título intercambiável, é a quantidade suficiente para proporcionar resultados benéficos ou pretendidos, incluindo resultados clínicos e, como tal, uma "quantidade eficaz" ou as suas variantes depende do contexto em que se estiver a aplicar. A resposta em algumas concretizações é de tipo preventivo, noutras de tipo terapêutico, e noutras uma combinação de ambos. 0 termo "quantidade eficaz" também inclui a quantidade de um composto da invenção, que seja "eficaz do ponto de vista terapêutico" e que evite ou atenue substancialmente efeitos colaterais indesejáveis.

Tal como se utiliza neste documento e se entende bem na técnica, "tratamento" é uma metodologia para se obterem resultados beneficiais ou pretendidos, incluindo resultados medicinais. Os resultados beneficiais ou resultados medicinais pretendidos podem incluir o alívio ou a melhoria de um ou mais sintomas ou estados, a diminuição da extensão de uma doença, um estado de doença estabilizado (isto é, não piorando) , evitar que uma doença se espalhe, atrasar ou travar a progressão de uma doença, melhorar ou cuidar paliativamente o estado de doença e a remissão (parcial ou total) , quer seja detectável, quer não detectável. "Tratamento" também pode significar prolongar-se a sobrevivência, em comparação com a sobrevivência esperada na ausência de um tratamento.

Composições farmacêuticas 39

Os compostos da invenção são formulados em composições farmacêuticas para administração a sujeitos humanos sob uma forma biologicamente compatível adequada para administração in vivo. De acordo com outro aspecto, a invenção presente proporciona uma composição farmacêutica incluindo compostos da invenção misturados com um diluente e/ou veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico. 0 veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico é preferivelmente "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da composição e não ser nocivo ao seu destinatário.

Pode administrar-se o composto por si só, mas ele é preferivelmente administrado com um ou mais veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. 0 veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico empregue neste documento pode ser seleccionado de entre diversos materiais orgânicos ou inorgânicos que são utilizados como materiais para formulações farmacêuticas e que são incorporados a título de um ou mais de entre cargas, diluentes, aglomerantes, desintegrantes, tampões, corantes, emulsionantes, agentes que melhorem o sabor, gelificantes, deslizantes, conservantes, solubilizadores, estabilizadores, agentes de suspensão, edulcorantes, agentes de tonicidade, agentes molhantes, emulsionantes, agentes de dispersão, agentes de inchaço, retardantes, lubrificantes, absorventes, e agentes de aumento da viscosidade. 40

Os compostos da invenção presente são administrados a um sujeito animal ou humano por processos conhecidos incluindo, sem limitação, administração oral, sublingual, bucal, parentérica (endovenosa, intramuscular ou subcutânea), transdérmica, percutânea ou transcutânea, intranasal, intra-vaginal, rectal, ocular, e respiratória (via inalação). Os compostos da invenção também podem ser administrados ao sujeito através de uma entrega nos músculos do sujeito, incluindo, mas não se limitando a, os músculos cardíacos ou esgueletais do sujeito. Numa concretização, o composto é administrado ao sujeito recorrendo a uma entrega alvejada às células do músculo cardíaco por intermédio de um cateter inserido no coração do sujeito. Noutras concretizações, os compostos podem ser administrados directamente no SNC, por exemplo por injecção intralombar ou por infusão intraventricular dos compostos directamente no fluido cérebroespinal (CSF), ou por administração intraventricular, intratecal ou intersticial. Prefere-se hoje em dia a administração oral.

Incluem-se em particular nas composições farmacêuticas sólidas consoante a invenção para administração oral, os comprimidos ou drageias, comprimidos sublinguais, saguetas, cápsulas incluindo cápsulas em gelatina, pós, e grânulos, e nas líguidas destinadas a administração oral, nasal, bucal ou ocular, em especial emulsões, soluções, suspensões, gotas, xaropes e aerossóis. Os compostos também podem ser administrados sob a forma de uma suspensão ou solução na água de beber ou com alimentos. 41

Incluem-se nos exemplos de veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, mas não se limitam a, derivados de celulose incluindo carboximetilcelulose, metilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, etilcelulose e celulose microcristalina; açúcares tais como manitol, sacarose, ou lactose; glicerina, goma-arábica, estearato de magnésio, estearilfumarato de sódio, soro salino, alginato de sódio, amido, talco e água, entre outros. intramuscular

Incluem-se nas composições farmacêuticas consoante a invenção destinadas a injecções parentéricas, em particular soluções estéreis, que podem ser aquosas ou não aquosas, dispersões, suspensões ou emulsões e também pós estéreis para a reconstituição de soluções ou dispersões injectáveis. Os compostos da invenção podem ser combinados com uma solução aquosa estéril que seja isotónica com o sangue do sujeito. Prepara-se uma tal formulação dissolvendo um ingrediente activo sólido em água contendo substâncias fisiologicamente compatíveis, tais como cloreto de sódio, glicina e outros semelhantes, e tendo um pH tamponizado compatível com as condições fisiológicas, de modo a produzir uma solução aquosa, e depois tornando essa solução estéril. Apresenta-se a formulação em contentores de unidade de dose ou de múltiplas unidades de dose, tais como ampolas seladas ou frascos. A formulação é entregue por qualquer modo de injecção, incluindo epifascial, intracapsular, intracranial, intracutânea, intratecal, 42 intraorbital, intraperitoneal, intraespinal, intraesternal, intravascular, endovenosa, parenquimatosa, subcutânea, ou sublingual, ou por intermédio de um cateter até ao coração do sujeito.

As composições farmacêuticas para administração rectal ou vaginal são preferivelmente supositórios, e as destinadas a administração percutânea ou transcutânea incluem em particular pós, aerossóis, cremes, unguentos, geles e pachos.

Para aplicação transdérmica, os compostos da invenção são combinados com incrementadores da penetração através da pele, tais como propilenoglicol, polietilenoglicol, isopropanol, etanol, ácido oleico, N-metilpirrolidona e outros semelhantes, que aumentam a permeabilidade da pele aos compostos da invenção e permitem que os compostos penetrem através da pele e até à circulação sanguínea. As composições composto/incrementador também podem ser combinadas com mais uma substância polimérica, tal como etilcelulose, hidroxipropilcelulose, etileno/acetato de vinilo, polivinilpirrolidona, e outras semelhantes, para se obter a composição sob a forma de um gel, que se dissolve num solvente, se evapora até à viscosidade pretendida, e então se aplica sobre material de suporte para se obter um penso.

Preparam-se as formulações farmacêuticas da invenção presente por métodos que são bem conhecidos na 43 técnica farmacêutica, incluindo métodos de granulação em húmido ou a seco, ou por compressão directa. A escolha do veiculo é determinada pela solubilidade e pela natureza química dos compostos, pela via seleccionada para a administração e pela prática farmacêutica habitual.

As composições farmacêuticas mencionadas acima ilustram a invenção.

De acordo com os métodos da invenção presente, qualquer destes compostos pode ser administrado ao sujeito (ou ser levado ao contacto com as células do sujeito) numa quantidade eficaz para limitar ou evitar uma diminuição do teor em calstabina ligada a RyR no sujeito, em especial nas células do sujeito. Um indivíduo especializado pode determinar facilmente esta quantidade, baseado em processos já conhecidos, incluindo a análise de curvas de titulação estabelecidas in vivo e métodos e ensaios descritos neste documento. Uma quantidade adequada dos compostos da invenção eficaz para limitar ou evitar uma diminuição do teor em calstabina ligada a RyR no sujeito, pode ser de entre cerca de 0,01 mg/kg/dia e cerca de 100 mg/kg/dia (por exemplo, 1, 2, 5, 10, 20, 25, 50 ou 100 mg/kg/dia), e/ou é uma quantidade suficiente para se conseguirem teores no plasma de entre cerca de 300 ng/mL e cerca de 5.000 ng/mL. Em alternativa, a quantidade de compostos da invenção pode ser de entre cerca de 1 mg/kg/dia e cerca de 50 mg/kg/dia. Em alternativa, a quantidade de compostos da invenção pode ser de entre cerca de 10 mg/kg/dia e cerca de 20 mg/kg/dia. 44

Também se incluem quantidades de entre cerca de 0,01 mg/kg/dia ou 0,05 mg/kg/dia e cerca de 5 mg/kg/dia ou cerca de 10 mg/kg/dia, que se podem administrar. Métodos de Síntese A invenção presente proporciona, em mais um seu aspecto, processos para a preparação de um composto da invenção, e dos seus sais. Mais especificamente, a invenção presente proporciona processos para a preparação de compostos com a fórmula (I), por exemplo, composto 1, composto 2, composto 3, composto 4, composto 5, composto 6, ou dos seus sais. As diversas vias sintéticas até aos compostos são descritas nos exemplos. A via geral de síntese (ROS) está apresentada no Esquema 1 adiante:

No Esquema 1, Ra é COOR1 ou CN; R1 é um alquilo Ci-C4, e L é um grupo de saída, que é, a título de exemplo, um halogéneo, um sulfonato (0S02R' em que R' seja alquilo ou arilo, por exemplo, OMs (mesilato) , OTs (tosilato)) , e outros semelhantes. Faz-se reagir a amina usada como 45 matéria-prima com o agente alquilante (derivado benzilico ilustrado acima), preferivelmente na presença de uma base, para se obter o produto pretendido ou um seu precursor (R=Ra) . Pode além disto fazer-se reagir o referido precursor para se transformar o grupo Ra no grupo COOH tal como se exemplifica adiante na secção experimental deste documento, ou por qualquer outro método conhecido dos indivíduos com conhecimentos da técnica. Por exemplo, pode transformar-se um éster precursor (Ra=COOR1 em que R1 seja um alquilo C1-C4) , no ácido carboxílico correspondente (R = COOH) por hidrólise em condições ácidas ou básicas de acordo com métodos conhecidos. Em alternativa, pode transformar-se um nitrilo precursor (Ra = CN) num tetrazole (um isóstero de um ácido carboxílico) por reacção com amida de sódio em condições adequadas, ou num ácido carboxílico (R = COOH) por hidrólise.

Pode preparar-se a amina usada como matéria-prima seguindo os métodos descritos no WO 2009/111.463 ou no WO 2007/024.717, ou por qualquer outro método conhecido dos indivíduos com conhecimentos da técnica. A natureza da base não é especialmente limitativa. Incluem-se nas bases preferidas os hidretos (por exemplo, hidreto de sódio ou de potássio) e a N,N-di-isopropiletilamina. Outras bases adequadas incluem uma base orgânica tal como uma amina terciária, seleccionada de entre o conjunto constituído por aminas acíclicas (por exemplo, trimetilamina, trietilamina, dimetilfenilamina, di-isopropiletilamina e tributilamina), aminas cíclicas (por exemplo, N-metilmorfolina) e aminas 46 aromáticas (dimetilanilina, dimetilaminopiridina e piridina).

Pode levar-se a cabo a reacção na presença ou na ausência de um solvente. A natureza do solvente, quando for utilizado, não é especialmente limitativa, incluindo-se nos exemplos solventes tais como um éster (por exemplo, acetato de etilo), um éter (por exemplo, THF) , um solvente clorado (por exemplo, diclorometano ou clorofórmio), dimetilformamida (DMF), e outros solventes tais como acetonitrilo ou tolueno, ou misturas destes solventes uns com os outros ou com água.

Podem preparar-se sais dos compostos com a fórmula (I) em que R=COOH fazendo reagir a molécula de origem com uma base adequada, por exemplo, NaOH ou KOH, para se obter o sal de metal alcalino correspondente, por exemplo, o sal de sódio ou de potássio. Em alternativa, podem transformar-se directamente os ésteres (R=COOR1) em sais, por reacções com bases adequadas.

Também se podem preparar os sais dos compostos com a fórmula (I) fazendo reagir a molécula de origem com um ácido adequado, por exemplo, HC1, ácido fumárico, ou ácido para-toluenossulfónico, para se obterem os sais correspondentes, por exemplo o cloridrato, o tosilato ou o hemifumarato.

EXEMPLOS 47

Proporcionam-se os exemplos que se seguem a título de ilustrações de algumas concretizações preferidas de acordo com a invenção. EXEMPLO 1: Síntese

Instrumentos: RMN: Bruker AVANCE III 400 ou Varian Mercury 300 LC/MS: Waters Delta 600 equipada com um Auto amostrador 717Plus, um Detector 2996 de Conjunto de Foto díodos, e um Detector de Massas 3100, ou Shimadzu 210

Processo Geral para a alquilação de 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidrobenzo[f][1,4]tiazepina ("Amina").

-NH

Amina

H3OQ

Dissolve-se amina (estrutura representada acima) (1 mmol) em 3 mL de diclorometano. Adiciona-se à solução reagente de alquilação (1 mmol), e em seguida N,N-di-isopropiletilamina (0,34 mL, 2 mmol). Agita-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Coloca-se directamente a solução sobre a coluna e elui-se com hexano/EtOAc (a 2:1, em volume). 48

3-((7-metoxi-2,3-dihidrobenzo[f] 4 (5H)-il)metil)benzoato de metilo: RMN

[1,4]tiazepin-de 2Η (300 MHz, (dd, J =8,4 Hz, r 09 (s, 2H) , 3,90 (m, 2H), 2,72 (m,

COOCHa Composto 3 CDC1 3): 7,96 (m, 2H) , 7, 46 (m, 3H) , 6,70 3, 0 Hz, 1H), 6,50 (d, J = 2 ,7 Hz, 1H), 4 (s, 3H), 3,72 (s, 3H) , 3, , 57 (s, 2H) , 3,35 2H). MS: 344(M+l). 4-((7-metoxy-2,3-dihidrobenzo[f] 4 (5H)-il)metil)benzoato de metilo: RMN CDC13) : 7,99 (d, J= 8,4 Hz, 2H) , 7,46 (d, 7,37 (d, J= 8,7 Hz, 2H) , 6,70 (dd, J =8,4 6,50 (d, J = 2,7 Hz, 1H) , 4,09 (s, 2H) , 3 (s, 3H) , 3,57 (s, 2H) , 3,35 (m, 2H) , 2 344(M+l).

[1,4]tiazepin-de ΤΗ (300 MHz, J= 8,4 Hz, 1H), Hz, 3,0 Hz, 1H), ,90 (s, 3H) , 3,72 , 72 (m, 2H) . MS:

Composto 5 49 2-((7-metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][l,4]tiazepin-4(5H)-il)metil)benzoato de metilo: Transformou-se o composto no sal cloridrato com HC1 2 M em éter. RMN de (300 MHz, DMSO-de) : 10,33 (lg, 1H) , 8,08 (d, J= 7,5Hz, 1H) , 7, 80-7, 65 (m, 3H) , 7,51 (d, J=8,lHz, 1H) , 7,14 (s, 1H) , 6,99 (dd, J= 8,4, 2,1Hz, 1H) , 4, 90-4,40 (m lg, 4H) , 3,88 (s, 3H), 3,78 (s, 3H), 3,40 (m, 2H), 3,26 (m, 1H), 3,11 (m, 1H). MS: 344 (M+l).

Hidrólise do éster metilico (processo geral)

Dissolveu-se éster metilico (3 mmol) em 30 mL de THF/metanol/NaOH 1 M (a 1:1:1, em volume). Agitou-se a mistura durante 8 horas e uma CCF mostrava que o éster tinha desaparecido por completo. Adicionou-se 1 mL de HC1 concentrado para ajustar a um pH ácido. Removeu-se o solvente orgânico e separou-se o sólido contido por filtração. Secou-se o sólido ao ar.

Ácido 3-((7-metoxi-2,3- dihidrobenzo[f] [1,4 ] tiazepin-4(5H)-yl)metil)benzóico : Foi obtido por extracção utilizando EtOAc como solvente. RMN de XH (300 MHz, CDC13) 8,10 (s, 1H) , 8,04 (d, J= 8,4 Hz, 1H) , 7,80 (lg, 1H) , 7,46 (m, 2H) , 6,80 (m, 2H) , 4,40 (s, 2H) , 50 3,90 (s, 2H) , 3,76 (s, 3H) , 3,42 (s, 2H) , 2,86 (s, 2H) . MS: 330 (M+l), 328 (M-l). 50

COOH Composto 1

Acido 4-((7-metoxi-2,3-dihidrobenzo[f] [ 1,4]tiazepin-4(5H)-il)metil)benzóico: Foi obtido por extracção utilizando EtOAc como solvente. RMN de (300 MHz, CDC13 ): 8,02 (d, J= 8,4 Hz, 2H) , 7,46 (d , J= 8,4 Hz, 1H) , 7,42 (d, J= 8,7 Hz, 2H), 6,70 (dd, J =8,4 Hz, 3, 0 Hz, 1H) , 6,50 (d, J = = 3,0 Hz, 1H), 4,11 (s, 2H), 3,72 (s, 3H) , 3, 62 (s, 2H), 3, 35 (m, 2H) , 2,76 (m, 2H) . MS: 330 (M+l), 328 (M-l).

Composto 1, sal sódico:

Preparou-se o sal sódico do composto 1 a partir da molécula de origem utilizando 1 equivalente de NaOH em EtOH (p.f. do sal: > 290°C) . RMN de 1 (DMSO-D6, 600 MHz) , δ (ppm) : 7,77 (2H, m) , 7,41 (1H, d), 7,13 (2H, m) , 6,75 (1H, dd), 6, 63 (1H, d) , 4,00 (2H, s), 3,70 (3H, s), 3,49 (2H, s) , 3,18 1 (2H, m) , 2, 70 (2H, m) .

Composto 1, sal hemifumarato: 51

Introduziram-se 1,6 g do composto 1 (forma neutra) e 265 mg de ácido fumárico num balão de fundo redondo. Adicionaram-se 10 mL de acetona e 2 mL de água, e aqueceu-se a mistura reaccional ao refluxo. Observou-se que se dissolvia em parte (sem ocorrer uma clarificação completa) e em seguida ocorria uma precipitação. Aqueceu-se a mistura reaccional ao refluxo de um dia para o outro. Depois de arrefecer, isolou-se o sólido residual por filtração, lavou-se com 3 mL de acetona e secou-se em vazio (40°C/10 mbar) durante 4 horas. RMN de ΧΗ (DMSO-D6, 600 MHz) , δ (ppm) : 12,97 (2H, s lg) , 7,90 (2H, m) , 7,43 (1H, d), 7,40 (2H, m) , 6,77 (1H, dd) , 6,64 (1H, d), 6,62 (1H, s) , 4,03 (2H, s) , 3,70 (3H, s) , 3,58 (2H, s), 3,20 (2H, m) , 2,72 (2H, m) .

Ácido 2-( (7-metoxi-2,3- dihidrobenzo[f][l,4]tiazepin-4(5H)-il)metil)benzóico: Transformou-se o composto no seu sal cloridrato com HC1 2 M em éter. RMN de ΧΗ (300 MHz, DMSO-d6) : 10,10 (lg, 1H) , 8,08 (d, J= 7,5Hz, 1H) , 7,66-7,51 (m, 4H) , 7,17 (d, J= 2,1Hz, 1H) , 6,99 (dd, J= 8,4, 2,1Hz, 1H) , 4, 80-4,40 (m lg, 4H) , 3,78 (s, 3H), 3,46 (m, 2H), 3,13 (m, 2H). MS: 330(M+l), 328 (M-l) . Síntese de 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidrobenzo[f][1,4]tiazepina ("Amina").

1,5 eq. de K2C03; 1,0 eq. de DIGA, THF, refluxo de um dia para o outro

NaHC03, água, DCM, temperatura ambiente

10 eq. de (HCHO)n HBr a 33 % em Ácido Acético

0,4 eq. de PTSA

HBr 4 3 2-(4-Metoxifeniltio)etanamina (1)

Misturaram-se 4-metoxtiofenol (50 g, 0,357 mol) , monocloridrato de 2-cloroetilamina (39,8 g, 0,343 mol.), K2C03 (78, 8 g, 0,57 mol) e di-isopropiletilamina (32 mL, 0,178 mol) em 200 mL de THF. Desgaseif icou-se a mistura durante 5 minutos sob pressão reduzida e aqueceu-se ao refluxo sob árgon de um dia para o outro. Removeu-se o solvente e adicionou-se água (300 mL) ao reactor. Extraiu-se a mistura com diclorometano (3 x 200 mL). Separaram-se as fases orgânicas, removeu-se o diclorometano e adicionaram-se 50 mL de HCI concentrado, e em seguida 200 mL de água. Extraiu-se a solução com EtOAc/hexano a 1:1 (3 x 200 mL) . Ajustou-se o pH da fase aquosa a 10 com NaOH 2 M, e extraiu-se com diclorometano (3 x 200 mL). Secou-se o conjunto das fases orgânicas sobre sulfato de sódio anidro. Por remoção do solvente obtiveram-se 61 g do composto pretendido sob a forma de um líquido incolor, com um 53 rendimento de 97 %. RMN de ΤΗ (300 MHz, CDCI3) : 7,35(d, J = 8,7 Hz, 2H) , 6,81 (d, J= 8,7 Hz, 2H) , 3,77 (s, 3H) , 2,88- 2,80 (m, 4H), 1,44 (s, 2H) . 2-(4-Metoxifeniltio)etilcarbamato de benzilo (2)

Primeiro método

Adicionou-se gota a gota a 02C, ao reactor contendo composto 1 (8,0 g, 43,7 mmol), bicarbonato de sódio (12,1 g, 144 mmol), água (100 mL) e diclorometano (200 mL), cloroformato de benzilo (8,2 g, 48,1 mmol, diluído em 100 mL de diclorometano). Terminada a adição, agitou-se a mistura durante 5 h à temperatura ambiente. Separou-se a fase orgânica e extraiu-se a fase aquosa com 100 mL de diclorometano. Secou-se o conjunto das fases orgânicas sobre sulfato de sódio. Removeu-se o solvente e triturou-se o sólido resultante com 200 mL de THF/hexano (a 1:10). Separou-se o sólido e secou-se obtendo-se o produto pretendido (12,9 g) com o rendimento de 93 %. Método alternativo

Adicionou-se ao composto 1 (10 g, 54,6 mmol) e trietilamina (15 mL, 106 mmol) em 200 mL de diclorometano, cloroformato de benzilo (7,24 mL, 51,5 mmol, diluído em 100 mL de diclorometano), gota a gota a 0°C. Terminada a adição, agitou-se a solução durante uma hora à temperatura ambiente. Separou-se o sólido por filtração. Extraiu-se a 54 solução com 100 mL de HC1 0,1 M HC1 e com 100 mL de solução saturada de carbonato de sódio, e secou-se sobre sulfato de sódio anidro. Por remoção do solvente obteve-se um sólido branco que se agitou em 200 mL de THF/hexano (a 1:20) durante três horas. Separou-se o sólido por filtração para se obterem 14,2 g do composto pretendido, com um rendimento de 87 %. RMN de 1h (300 MHz, CDC13) : 7,35(m, 7H) , 6,83 (d, J= 8,7 Hz, 2H) , 5,07 (m, 3H) , 3,77 (s, 3H) , 3,10 (q, J = 6,3 Hz, 2H) , 2,92 (t, J= 6,3 Hz, 2H) . 7-Metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepina-4(5H)-carboxilato de benzilo (3)

Agitou-se uma mistura do composto 2 (7,3 g, 23 mmol), paraformaldeido (6,9 g 0,23 mol) e ácido p-toluenossulfónico (1,45 g, 7,6 mmol) em 250 mL de tolueno a 70°C de um dia para o outro. Arrefeceu-se até à temperatura ambiente, separou-se o sólido por filtração. Extraiu-se a solução com solução saturada de carbonato de sódio (100 mL) , e secou-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio anidro. Obteve-se o produto pretendido (7,4 g) sob a forma de um liquido, depois de se remover o solvente, num rendimento de 97 %. RMN de ΤΗ (300 MHz, CDC13) : 7,44 (d, J= 8,1 Hz, 0,77H) , 7,32 (m, 5,60H), 7,07 (d, J= 2,7 Hz, 0,33H), 6,68 55 (m, 1,30H), 5,04 (s, 2H) , 4,59 (s, 2H) , 3,96 (lg, 1,80H), 3,80 (ss, 1,23 H) , 3,55 (s, 1,97H), 2,76 (m, 2H) . 7-metoxi-2,3,4,5-(sal com 4 HBr)

Bromidrato de tetrahidrobenzo[f][1,4]tiazepina (Amina)

Primeiro método

Adicionou-se uma solução de HBr (a 33 % em ácido acético, 10 mL) ao composto 3 (4,2 g, 12,8 mmol). Terminada a adição, começou a desenvolver-se dióxido de carbono e formou-se um sólido branco. Deixou-se a mistura em repouso à temperatura ambiente durante mais 2 horas. Adicionou-se éter dietilico (150 mL) à mistura, e agitou-se durante 30 minutos. Separou-se o sólido por filtração e lavou-se com éter dietilico. Secou-se o sólido em vazio para se obterem 3,40 g do composto pretendido com o rendimento de 91,8 %. RMN de λΕ (300 MHz, DMSO-d6) : 9,02 (lg, 2H) , 7,52 (d, J= 8,1 Hz, 1H) , 7,27 (d, J= 3,3 Hz, 1H) , 6,92 (dd, J= 8,4, 2,7 Hz, 1H) , 4,41 (s, 2H) , 3,77 (s, 3H) , 3,53 (m, 2H) , 2, 96 (m, 2H) . Método alternativo (base livre 4a)

Misturou-se composto 3 (10 g, 30 mmol) com 50 mL de HC1 concentrado, 50 mL de água e 30 mL de dioxano. Agitou-se a mistura a 100°C de um dia para o outro. Depois de se arrefecer até à temperatura ambiente, removeu-se a 56 maior parte do solvente e HC1 sob pressão reduzida. Adicionou-se água (100 mL) à solução e separou-se o sólido por filtração. Extraiu-se a solução aquosa com EtOAc/hexano (a 1:1, 3 x 100 mL) e basificou-se adicionando-lhe 15 g de NaOH. Extraiu-se a mistura com diclorometano (3 x 150 mL). Secou-se o conjunto das fases orgânicas sobre sulfato de sódio anidro. Por remoção do solvente obteve-se um liquido que solidificava quando em repouso à temperatura ambiente proporcionando 6,2 g do composto pretendido. RMN de XH (300 MHz, CDC13) : 7, 42 (d, J= 1—1 00 Hz 1H) , 6,78 (d, J= 2, 7 Hz, H) , 6, ,68 (dd, J= 2, 7, 8,1 Hz, 1H) 4,08 (s, 2H), 3, 96 dg, 1 ,80) , 3,76 (s, 3 H) , 3,38 (m, 2H) 2, 68 (m, 2H).

EXEMPLO 2: Ligação da calstabina 2 a RyR2 fosforilado por PKA

Prepararam-se membranas SR cardíacas tal como previamente descrito (Marx et ai., 2000; Kaftan et ai., Circ. Res., 1996, 78: 990-97). Fazendo a imunotransferência de microssomas (50 pg) tal como se descreveu, com anticorpo anti-calstabina (a 1:1.000) (Jayaraman et ai., J. Biol. Chem., 1992, 267: 9474-77) durante 1 h à temperatura ambiente (Reiken et ai., Circulation, 107: 2459-66, 2003). Depois de uma incubação com IG anti-coelho marcado com HRP (diluição a 1:5.000; Transduction Laboratories, Lexington, Ky.), desenvolvendo-se as manchas utilizando ECL (Amersham Pharmacia, Piscataway, N.J.) e detectando-se numa película 57 de raios-X, ou expondo-se a anticorpos secundários marcados com corante infravermelho e visualizando-se num equipamento da Li-Cor Biosciences (modelo Odyssey). A não ser aonde se afirmara algo em contrário, testaram-se os compostos a uma concentração de 100 nM. Apresenta-se adiante um ensaio de ligação representativo a calstabina 2.

A. Fosforilação do retículo sarcoplásmico cardíaco (CSR) por PKA

Montou-se a mistura reaccional num tubo de microcentrifugação de 1,5 mL. Adicionaram-se 200 pg de SR cardíaco a uma mistura reaccional de tampão quinase, PKA e ATP com um volume final de 100 pL (mistura reaccional adiante). Adicionou-se por último o ATP para iniciar a reacção.

Mistura reaccional: pL = Amostra (SR cardíaco, 2 ou 10 pg/pL) 10 pL = Tampão quinase 10 x (80 mM em MgCl2, 100 mM em EGTA, 500 mM em Tris/PIPES), pH=7,0 20 pL = PKA (2 unidades/ pL) (Sigma N1 2 P2645) 10 pL = 10 x ATP (1,0 mM) (Sigma A 9187) 40 pL = H20 destilada 1

Incubaram-se os tubos a 30 °C durante 30 2 minutos. 58 2. Transferiu-se então a mistura reaccional para tubos em vidro de 0,5 mL com parede grossa. 3. Centrifugaram-se os tubos em vidro contendo a mistura reaccional durante 10 minutos a 50.000 x g numa Centrífuga Sorvall RCM120EX utilizando um rotor S120AT3. Uma centrifugação a 50.000 x g durante 10 minutos é suficiente para isolar os microssomas. 4. Lavou-se a pastilha resultante 4 vezes com tampão de ligação (10 mM em Imidazol, 300 mM em Sacarose, pH =7,4). Adicionaram-se de cada vez 100 pL de tampão de ligação 1 x ao tubo para se lavar a pastilha. Voltou a suspender-se a pastilha utilizando a ponta da pipeta para proporcionar movimentos de subida e descida. Depois da última centrifugação adicionou-se 50 pL de tampão de ligação e juntaram-se as pastilhas de todos os tubos. Armazenou-se a mistura reaccional a -20°C. 5. Confirmou-se a fosforilação separando cerca de 10 pg de CSR por electroforese sobre gel de Poliacilamida a 6 % (PAGE) e analisando nas imunotransferências tanto o RyR total (Anticorpo 5029, diluição a 1:3.000 ou Anticorpo Monoclonal da Affinity Bioreagents, N2 de Cat2 MA3-916, diluído a 1:2.000) e RyR2 fosforilado por PKA (Anticorpo P2809, diluído a 1:10.000). 6. Podem armazenar-se as alíquotas a -802C. B. Ensaio de Ligação de Novo de Calstabina 1. Incubou-se CSR fosforilado por PKA (cerca de 20 pg) com Calstabina 2 250 nM em 100 pL de tampão de ligação (tal como descrito acima) com ou sem compostos. 2. Preparou-se a mistura reaccional em tubo de vidro de 0,5 mL com parede espessa (material Hitachi para Centrífuga, N2 de Catálogo B4105) . 3. Adicionou-se calstabina 2 a título de último reagente à mistura reaccional. Levou-se a cabo a reacção à temperatura ambiente durante 30 minutos. 4. Terminada a reacção, centrifugaram-se os tubos durante 10 minutos a 100.000 g. (Centrífuga Sorvall RCM120EX com rotor S120AT3). 60 5. Lavou-se a pastilha resultante 4 vezes em tampão de ligação 1 x a 4°C. Depois de cada lavagem centrifugaram-se os tubos a 50.000 g durante 10 minutos a 4°C. 6. Depois da lavagem final, descartou-se o sobrenadante. 7. Adicionaram-se 20 pL de tampão da amostra (2 x) [descreve-se adiante o tampão de amostra 6 x] e voltou a suspender-se a pastilha com a ponta de uma pipeta e/ou agitando durante instantes num vortex. Transferiu-se a suspensão para um tubo de microcentrifugação de 1,5 mL. 8. Aqueceram-se os tubos a 90 °C durante 4 minutos. 9. Separaram-se as proteínas utilizando SDS a 15 %/PAGE. 10. Detectou-se a ligação a calstabina 2 com o anticorpo primário anti-FKBP (Jayaraman et al., J. Biol. Chem. 1992; 267: 9474-77, a 1:2.000) e um anticorpo secundário apropriado.

Tampao de Amostra 6 x 61 7.0 mL de 4 x Tris-HCl/SDS, a pH 6,8 3.0 mL de glicerol (30 % de concentração final) 1.0 g de SDS (10 % de concentração final) 0,93 g de DTT (0,6 M final) 1 mg de azul de bromofenol (0,001 % de concentração final) Água destilada até 10 mL de volume final. Armazenagem em aliquotas de 1 mL a -70°C.

Resultados: A Figura IA mostra uma imunotransferência com anticorpo para calstabina 2, mostrando a ligação entre calstabina 2 e RyR2 fosforilado por PKA na ausência (-) ou na presença de composto 1 100 nM. ( + ) : ligação de calstabina a RyR2 não fosforilado por PKA. A S36, uma benzotiazepina descrita na US 7.544.678, é utilizada a titulo de controlo. Tal como se mostra, o composto 1, a uma concentração de 100 nM, evitava a dissociação da calstabina 2 ligada a RyR2 fosforilada por PKA e/ou aumentava a ligação ou nova ligação entre a calstabina 2 e o RyR fosforilado por PKA.

Tal como se ilustra na Figura 1B, verificou-se que também os seguintes compostos representativos evitavam a dissociação da calstabina 2 do RyR2 fosforilado por PKA, e/ou aumentam a ligação ou a nova ligação entre calstabina 2 e RyR2 fosforilado por PKA quando testados no ensaio de 62 nova e ligação de calstabina 2 mencionado acima, a 100 nM: composto 2, composto 3 e composto 4.

EXEMPLO 3: Ligação da calstabina 1 a RyRl fosforilado por PKA

Prepararam-se membranas SR de músculo esqueletal de um modo semelhante ao utilizado no Exemplo 2, e tal como se descreve também na publicação de pedido de patente US N2 . 2004/0 224.368, cujo conteúdo se considera incorporado neste documento por citação. Levou-se a cabo a imunotransferência dos microssomas (50 pg) tal como descrito, com anticorpo anti-calstabina 1 (Zymed) (a 1:1.000). Desenvolveram-se as manchas e quantificaram-se tal como se descreveu no Exemplo 2. A Figura 1C representa uma imunotransferência com anticorpo para calstabina 1 mostrando a ligação da calstabina 1 a RyRl fosforilado por PKA na ausência (Neg) ou na presença das concentrações indicadas de composto 1 ou de composto 4. (Pos) : ligação da calstabina a RyRl não fosforilado por PKA. Utiliza-se S36 como controlo. Tal como se ilustra, o composto 1 e o composto 4 evitaram a dissociação da calstabina 1 do RyRl fosforilado por PKA e/ou aumentava a ligação ou a nova ligação da calstabina 1 a RyRl fosforilado por PKA de um modo dependente da dose, com um EC50 estimado de cerca de 100 nM e 150 nM, respectivamente. 63 EXEMPLO 4: Nova Ligação da Calstabina 1 a RyRl em Murganhos Tratados com Isoproterenol 0 isoproterenol, um agonista de receptores beta adrenérgicos, induz insuficiência cardíaca em murganhos por estimulação excessiva do receptor beta adrenérgico. Em simultâneo com isto, ocorrem a activação da PKA, a fosforilação do RyR2 no SR, e a diminuição da interacção da calstabina 2 (FKBP12.6) com o RyR2 . Uma cascata de acontecimentos semelhante ocorre no músculo esqueletal, na qual RyRl é fosforilado, levando a uma menor ligaçao da calstabina 1 (FKBP12) a RyRl.

Tal como se descreve em pormenor na publicação de pedido internacional N2 WO 2008/064.264, cujo conteúdo se incorpora neste documento por citação, um tratamento crónico com isoproterenol num murganho de tipo selvagem proporciona um método rápida e de confiança para induzir alterações na bioquímica de RyR que poderiam ser facilmente quantificadas. Estas alterações incluem um aumento da fosforilação de RyR e a concomitante menor ligação a calstabina.

Animais e Reagentes

Mantiveram-se murganhos C57B1/6 e estudaram-se seguindo protocolos aprovados. Obteve-se o agonista beta-adrenérgico sintético isoproterenol (ISO) junto da Sigma (165627), e preparou-se sob a forma de uma solução de 64 reserva a 100 mg/mL em água. Preparou-se o tampão de lise adicionando sacarose (1 mM) , ditiotreitol (320 mM) , e 1 comprimido de inibidor de protease (10X) a 10 mL de solução de reserva (HEPES 10 mM, EDTA 1 mM, NaF 20 mM, Na3V04 2 mM) .

Preparação e Implantação Cirúrgica da Bomba

Osmótica

Infundiu-se continuamente em murganhos durante cinco dias isoproterenol a 10 mg/mL (1 pL/h), por intermédio de uma bomba de infusão osmótica implantada de modo subcutâneo (bomba Alzet MiniOsmotic pump, Modelo 2001, Durect Corporation, Cupertino, CA).

Para se carregar com fármaco, manteve-se a bomba osmótica vertical e injectaram-se 200 pL de solução do fármaco na bomba através de uma seringa de 1 mL (ligada a uma cânula) que continha um excesso de solução do fármaco (~ 250-300 pL) . Injectou-se lentamente a solução do fármaco para baixo, enquanto se levantava lentamente a bomba, até a bomba estar completamente cheia e derramar. A saida de fluido em excesso quando se rolhava a bomba confirmava que a bomba estava correctamente cheia.

Implantaram-se as bombas osmóticas carregadas de modo subcutâneo recorrendo aos passos seguintes. O murganho destinatário era anestesiado com 1,5-2 % de isoflurano em 02 administrado a 0,6 L/minuto, e media-se e registava-se 65 então a sua massa corporal. Colocava-se então o murganho de peito para baixo sobre esferovite, a sua face no cone do nariz. Rapava-se o pelo da parte de trás do pescoço, desde atrás das orelhas até ao topo da cabeça. Limpava-se suavemente a área com um material embebido em álcool a 7 0 %, e fazia-se uma pequena incisão ao longo da linha média da nuca da cabeça/pescoço. Limpou-se com álcool uma sutura, e inseriu-se no corte, abrindo-se para libertar a pele do tecido subjacente. Para acomodar a bomba, prolongou-se esta abertura até às patas traseiras. Inseriu-se a bomba carregada pela abertura, com o seu ponto de libertação posicionado longe da incisão, e deixou-se adaptar debaixo da pele com uma tensão mínima. Fechou-se a incisão com sutura 5,0 em nylon, necessitando de cerca de 5-6 pontos, e esfregou-se suavemente a área com um material com álcool a 70 %. Depois da cirurgia, colocaram-se os animais em jaulas individuais para minimizar as lesões e a possível activação do sistema nervoso simpático.

Isolamento do Músculo Esqueletal

Isolou-se tecido muscular esqueletal como se segue. Expuseram-se os músculos das pernas cortando a pele no tornozelo e puxando para cima. Manteve-se o tecido humedecido com tampão de Tyrode (HEPES 10 mM, 140 mM em NaCl, 2,68 mM em KC1, 0,42 mM em Na2HP04, 1,7 mM em MgCl2, 11,9 mM em NaHC03, 5 mM em glucose, 1,8 mM em CaCl2, preparado adicionando 20 mg de CaCl2 a 100 mL de tampão 1 X preparado a partir de uma solução 10 X sem CaCl2) . 66

Isolaram-se os músculos seguintes e congelaram-se em azoto líquido. Isolou-se o extensor digitorum longus (EDL) inserindo tesouras entre o tendão lateral e ο X formado pelos tendões do EDL e do Tibialis, cortando para cima em direcção ao joelho; cortando o músculo fibularis para expor o tendão em forma de leque do gastrocnemius; inserindo fórceps sob ο X e sob o músculo para soltar o tendão EDL; cortando o tendão EDL e puxando o músculo para cima; e finalmente cortando o EDL para o soltar. Isolou-se o soleus removendo o músculo fibularis do topo do gastrocnemius; expondo o soleus na parte inferior do gastrocnemius cortando e levantando o tendão de Aquiles; cortando o soleus no topo do músculo por trás do joelho; e por último puxando o soleus e cortando-o para o soltar do músculo gastrocnemius. Isolou-se o tibialis cortando o tendão do tibialis a partir da parte dianteira do tornozelo, puxando o tendão para cima, e cortando-o para o separar da tíbia. Isolou-se o vastus (músculo da coxa) de ambas as pernas, cortando este músculo logo acima do joelho e removendo o feixe muscular. Congelaram-se as amostras em azoto líquido.

Imunoprecipitação de RyRl a Partir de Lisados de

Tecidos incubando anti-RyRl (5 0 mM em NaF, 1,0 com 0,5

Imunoprecipitou-se RyRl a partir de amostras 200-500 pg de homogenado com 2 pL de anticorpo (Zymed) em 0,5 mL de um tampão RIPA modificado Tris-HCl (pH 7,4), com 0,9 % de NaCl, 5,0 mM em mM em NasVCg, com 0,5 % de Triton-X100, e 67 inibidores de protease), a 4°C durante 1,5 h. Incubaram-se então as amostras com pérolas de sefarose Protein A (Amersham Pharmacia Biotech, Piscatawy, NJ) a 4°C durante 1 hora, e em seguida lavaram-se as pérolas três vezes com RIPA gelado. Aqueceram-se as amostras a 95°C e fraccionaram-se por dimensões usando SDS-PAGE (15 % de SDS-PAGE para a calstabina). Desenvolveram-se as imunotransferências utilizando um anticorpo anti-FKBP (FKBP12/12.6, Jayaraman et al., J. Biol. Chem. 1992; 267: 9474-77) aa uma diluição de 1:2.000. Diluíram-se os anticorpos em 5 % de leite TBS-T (20 mM em Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 M de NaCl, 0,05 % de Tween® 20, 0,5 % e Triton X-100) .

Resultados

Implantaram-se bombas osmóticas contendo isoproterenol com ou sem composto em teste em murganhos, tal como se descreveu acima. Os murganhos sofreram a perfusão osmótica durante cinco dias, quer apenas com veículo (DMSO/PEG), quer apenas com isoproterenol (ISO) (a 0,5 mg/kg/h), quer ainda com uma combinação de isoproterenol (a 0,5 mg/kg/h) e composto 1, às concentrações indicadas. No dia 6, sacrificaram-se os diversos murganhos, isolou-se o seu tecido muscular esqueletal e utilizou-se para se analisar a ligação entre calstabina 1 e os imunoprecipitados de RyRl. 68 0 efeito do composto 1 no aumento da ligação de calstabina 1 a RyRl no músculo esqueletal isolado dos murganhos tratados com isoproterenol está representado nas Figuras 2A (imunotransferência) e 2B (quantificação gráfica) . Tal como ilustrado, o composto 1 aumentava os teores em calstabina 1 ligada a RyRl nas membranas do músculo esqueletal até a um teor semelhante ao observado por administração de S36 3,6 mM, outro derivado de benzotiazepina que se utilizou a titulo de controlo positivo (WO 2008/064.264). Obtiveram-se resultados semelhantes para o composto 4 (dados não apresentados). EXEMPLO 5: Efeito do Composto 1 num modelo de insuficiência cardíaca crónica pós-isquémica no rato

Objectivo O objectivo deste estudo foi o de testar a capacidade do composto 1 para diminuir a disfunção cardíaca e atenuar a remodelação ventricular num modelo de insuficiência cardíaca induzida por isquémia-reperfusão.

Metodologia

Induziu-se insuficiência cardíaca crónica em ratos wistar do sexo masculino (224-240 g, 10-11 semanas de idade) por lesões de isquémia-reperfusão (I/R). Para o protocolo de I/R, ocludiu-se a artéria coronária esquerda anterior descendente (LAD) durante 1 h. Iniciou-se o 69 tratamento com fármaco (a 5 mg/kg/d ou a 10 mg/kg/d na água de beber) 1 semana após a reperfusão, e manteve-se durante um período de estudo de 3 meses. Avaliou-se a eficácia do composto 1 por ecocardiografia um, dois e três meses depois de iniciado o tratamento, e por hemodinâmica invasiva aos 3 meses, em comparação com animais tratados com veículos e operados em falso. Analisaram-se também amostras cardíacas para avaliar a hipertrofia e a quantidade de colagénio. Recolheu-se sangue dos diversos ratos no dia final do estudo para avaliar as concentrações em fármaco do sangue, tal como se ilustra na Figura 3. A concepção do estudo está ilustrada na Figura 3. Levaram-se a cabo as experiências de um modo cego Métodos Estatísticos

Relativamente aos parâmetros que se foram determinando ao longo do tempo, analisaram-se as comparações entre os dados dos operados em Falso em relação aos tratados com Veículo e com os tratamentos com fármaco por ANOVA em 2 sentidos com medições repetidas. Relativamente aos parâmetros medidos no sacrifício e na morfometria, analisaram-se as comparações entre os operados em Falso e os tratados a Veículo pelo teste t e as comparações entre os tratamentos com fármaco por ANOVA com 1 sentido seguido pelo teste de Dunnett.

Resultados 70

Os animais I/R tratados com Veiculo, em comparação com os animais operados em falso, denotavam aumentos dos volumes do ventrículo esquerdo (LV), bem como no final da sístole (LV ESV) e no final da diástole (LV EDV) (Figuras 4A e 4B) , uma função cardíaca deprimida tal como determinada ou uma menor Fracção de Ejecção (EF) (Figura 4C) e um aumento do conteúdo em colagénio intersticial (Figura 5D) . O composto 1, administrado a 5 e a 10 mg/kg/d, aumentava significativamente a EF, e também diminuía tanto o LVESV como o LVEDV, em comparação com o veículo, durante entre um mês e três meses (Figuras 4A-C), e diminuía também o conteúdo em colagénio intersticial (Figura 5D). O estudo hemodinâmico invasivo (aos 3 meses) denotava uma manutenção dos valores de LV dP/dt max e de LV dP/dt min nos animais tratados com composto 1 a 5 e a 10 mg/kg/d, em comparação com veículo (Figuras 6B e 6C) , sem alteração estatisticamente significativa na tensão sistólica no LV aquando do tratamento (Figura 6A). Não se verificaram efeitos sobre a massa corporal (BW) , dimensão do enfarte ou hipertrofia (massa do LV) aquando do tratamento (Figuras 5A-C). Representam-se as concentrações de fármaco no plasma na Figura 7.

Os resultados mostram que o composto 1, a concentrações tão pequenas como 5 mg/kg/d, exerce um efeito beneficiai sobre tanto a função cardíaca sistólica como a 71 diastólica num modelo de insuficiência cardíaca pós-isquémica no rato. 0 composto 1 era significativamente e surpreendentemente mais activo em comparação com o composto A, um derivado de benzotiazepina com ele relacionado do ponto de vista estrutural, descrito no WO 2007/024.717. Tal como se ilustra na Figura 8, o composto A, administrado a uma concentração de 5 mg/kg/d durante 3 meses, não conseguiu melhorar a função cardíaca sistólica nem a diastólica, em comparação com o composto 1, no modelo de insuficiência cardíaca pós-isquémica no rato, no final do estudo. Deste modo, os efeitos beneficiais do composto 1, mas não do composto A, foram observados a uma dose de 5 mg/kg/d passados 3 meses de tratamento no modelo de CHF em rato.

EXEMPLO 6: Efeito do Composto 1 na função muscular num modelo de distrofia muscular no murganho (mdx)

Objectivo 72 0 objectivo deste estudo foi o de testar se o tratamento com o composto 1 melhora a função do músculo num modelo de deficiência em distrofina no murganho (mdx).

Metodologia

Aclimataram-se murganhos C57BL/10ScSn-DMDmdx/J (abreviado como mdx, com n=5 por grupo), de 6 semanas e com cerda de 20 gramas no início do estudo, a jaulas com rodas durante seis dias, antes de se repartirem aleatoriamente por grupos que recebiam tratamento quer com veículo (H2O), quer com doses-alvo de 5 mg/kg/d, 10 mg/kg/d, ou 50 mg/kg/d (doses actuais: 7,9 mg/kg/d; 12,8 mg/kg/d; e 61,5 mg/kg/d, respectivamente, determinadas a partir do consumo semanal da solução do fármaco, tal como medido semanalmente, dividido pela massa corporal) do sal sódico do composto 1 (com base na massa do fármaco de origem; o sal sódico é referido adiante neste documento e neste Exemplo como "composto 1") e é administrado na água de beber ad libitum durante 4 semanas. Os murganhos C57BL/6 da mesma idade (abreviados como WT, a n=4 por grupo), foram repartidos aleatoriamente em grupos que receberam tratamento quer com veículo (H20) , quer com uma dose-alvo de 50 mg/kg/d (dose actual: 67,7 mg/kg/d) do sal sódico do composto 1.

Mediram-se a actividade voluntária na roda, a massa corporal, e o consumo médio de água durante as primeiras 3 semanas. Mediu-se a força muscular específica passadas 4 semanas do tratamento, no fim do estudo. 73

Analisou-se a distância percorrida (km/dia) durante um período de 24 h, como um índice de uma actividade funcional melhorada (veja-se, DMD_M.2.1.002 SOP em http://www.treat-nmd.eu/). Na conclusão do estudo, isolou-se o músculo extensor digitorum longus (EDL) para análise da força muscular tal como se descreve mais em pormenor adiante neste documento. Recolheu-se sangue dos diversos murganhos por sangrias retro-orbitais no final do estudo (no final da fase de escuridão do ciclo - por volta das 7 da manhã) para avaliar as concentrações me fármaco no plasma. As experiências eram cegas.

Medições da força

No final do estudo, dissectou-se o músculo EDL das patas traseiras para análise da força isométrica utilizando o Sistema de Teste Muscular 407A da Aurora Scientific (Aurora, Ontário, Canadá). Atou-se uma sutura 6-0 a cada tendão e transferiu-se o músculo EDL inteiro, tendão a tendão, para um banho Ragnoti de solução Tyrode (em mM: NaCl 121, KC1 5.0, CaCl2 1,8, MgCl2, NaH2P04, NaHC03 24, e glucose 5,5), borbulhado com 02/C02 (a 95 %/5 %) .

Utilizando as suturas, atou-se verticalmente um tendão a um gancho em aço inoxidável ligado a um transdutor de força. Agrafou-se o outro tendão suturado a um braço móvel do sistema Aurora. Estimulou-se o músculo EDL para contrair utilizando um campo eléctrico entre dois eléctrodos de platina. No início de cada experiência, ajustou-se o comprimento do músculo para se conseguir a força máxima. Determinaram-se as relações força-frequência despoletando a contracção utilizando frequências de estimulação crescentes (5-250 Hz durante 200 ms a uma voltagem superior à liminar). Entre estimulações deixou-se o músculo repousar ~3 minutos. No final da medição da força, mediu-se o comprimento (L0) do músculo EDL enquanto suturado no sistema Aurora, excluindo os tendões. Removeu -se então o músculo EDL do sistema e pesou-se depois de se desagrafarem os tendões e as suturas das extremidades. Congelou-se então o músculo EDL em azoto liquido. Calculou-se a área transversal (em mm2) do músculo EDL dividindo a massa do músculo EDL pelo comprimento do músculo EDL e recorrendo à constante para a densidade do músculo de mamífero de 1,056 mg/m3 (Yamada, T., et al. Arthritis and rheumatism 60: 3280-3289). Para se determinar a força específica do EDL (kN/m2) , dividiu-se a força tetânica absoluta pela área da secção transversal do músculo EDL. Métodos Estatísticos

Para se determinar a significância estatística, utilizou-se o teste t de Student para a comparação entre dois grupos. Exprimiram-se todos os dados utilizados como média +/- EPM.

Resultados 75

Testou-se a capacidade do composto 1 para melhorar o exercício voluntário em murganhos mdx. Depois de se aclimatarem os murganhos à jaula com a roda voluntária, monitorizou-se a actividade dos murganhos nas rodas voluntárias por computador a 24/7. Transcreveram-se os dados apurados como distâncias percorridas durante um dia, ao longo de 3 semanas. Os murganhos mdx tratados com 10 e com 50 mg/kg/d (doses alvo) do composto 1 percorriam distâncias significativamente mais longas na roda, em comparação com os murganhos mdx tratados apenas com veículo (H20) (P< 0,001 entre o dia 1 e o dia 19). Observava-se o efeito de tratamento logo a partir de 2-3 dias após o início do tratamento, e ele continuava durante todo o período de monitorização da actividade. Não se verificou nenhum efeito do composto 1 sobre a distância percorrida com murganhos WT tratados com 50 mg/kg/d de composto 1 (Figura 9). Além disto, tal como se determinou por medições da força in vitro do músculo EDL (Figura 10), o tratamento com composto 1 aumentava a força específica no músculo mdx de um modo dependente da dose. Às frequências de estimulação de 150 Hz e acima, os murganhos mdx tratados a 50 mg/kg/d denotavam um aumento estatisticamente significativo na força específica do músculo (P<0,05). Não se observou nenhum efeito do tratamento com composto 1 sobre a força específica do músculo nos murganhos WT.

Tal como se ilustra na Figura 11, o tratamento com o composto 1 não afectou a massa corporal. Não se observaram efeitos dependentes da dose sobre o consumo da 76 água. A exposição ao composto 1 no sangue matinal era (média ± EPM) 3,3 ± 0,4 μΜ para os murganhos mdx doseados a 5 mg/kg/d, 10,7 ± 0.9 μΜ para os murganhos mdx doseados a 10 mg/kg/d, 52,8 ± 1,7 μΜ para os murganhos mdx doseados a 50 mg/kg/d e 72,8 ±7,0 μΜ para os murganhos WT doseados a 50 mg/kg/d. Tomados em conjunto, os resultados mostram que, em comparação com os controlos tratados com veiculo, o tratamento com composto 1 a 10 mg/kg/d e a 50 mg/kg/d (doses alvo) melhorava o exercício voluntário na roda ao fim de 3 semanas e a força específica do músculo ao fim de 4 semanas nos murganhos mdx, um modelo murino da Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), demonstrando portanto a utilidade do composto 1 e dos seus análogos tal como se reivindica neste documento, no tratamento da distrofia muscular. EXEMPLO 7: Estabilidade Metabólica A estabilidade metabólica do composto 1, um Rical representativo consoante a invenção presente, foi comparada com a de um composto B e de um composto C, derivados de benzotiazepina estruturalmente relacionados descritos no WO 2007/024,717. A. Estabilidade Metabólica em microssomas hepáticos humanos Métodos: 77

Solubilização do composto: Prepararam-se soluções de reserva em DMSO, e soluções de trabalho em água contendo 1 mg/mL de BSA.

Precisão da biodisponibilidade metabólica: As previsões da biodisponibilidade metabólica (MF %) foram baseadas nas medições da estabilidade metabólica in vitro com microssomas hepáticos assumindo absorção total. Em suma, quantificaram-se os fármacos não alterados por LC-MS-MS após incubação (10-7M) com microssomas hepáticos de rato e humanos (0,33 mg de proteína/mL) passados 0, 5, 15, 30 e 60 minutos de incubação na presença de NADPH (1 mM). Parou-se a reacção enzimática com metanol (em volume) e precipitaram-se as proteínas por centrifugação. As velocidades intrínsecas de remoção in vitro (Clint_mic) expressas em mL/minuto/g de proteína eram os coeficientes angulares (após liearização do LN) das concentrações remanescentes de fármaco inalterado em relação aos períodos de incubação. Os valores de Clint in vitro foram então submetidos a um aumento de escala a valores válidos para o corpo inteiro in vivo (vivoClint) utilizando 0,045 mg prot/kg de fígado, e massas de fígado de 11 g para o rato e de 1,2 kg para o Homem. Transformaram-se então os valores de Clint in vivo em eliminações hepáticas (HepCl) utilizando o modelo bem agitado (HepCl=vivoClint*HBF/(vivoClint + HBF), em que HBF (caudal sanguíneo hepático), sendo 22 mL/minuto para o rato e 1.500 mL/minuto para o Homem. Deduziram-se então as MF % da razão 78 de extracção usando a seguinte equação (MF %=l-HepCl/HBF). Apresentam-se os resultados na Tabela 1:

Tabela 1: Estabilidade em microssomas humanos

B. Estabilidade metabólica em hepatócitos hepáticos de rato e humanos

Solubilização do composto: Prepararam-se soluções de reserva em DMSO, e soluções de trabalho em meio de William contendo plasma de rato a 1/10 ou plasma humano a 1/4.

Determinação da estabilidade metabólica: Incubaram-se os compostos a 10“7 M com hepatócitos isolados (6E+5 células/mL para os hepatócitos de rato e 4E+5 79 células/mL para os hepatócitos humanos) a 37°C em plasma da própria espécie diluído em meio de Williams (diluição a 1/10 para os de rato e diluição a Vi para humanos) . As alturas das amostragens foram aos 0, 10, 20, 30, 60 e 120 minutos e parou-se a reacção enzimática com metanol (em volume). Precipitaram-se as proteínas por centrifugação e analisaram-se os sobrenadantes por LC/MS/MS. Exprimiram-se os valores de Clint em mL/minuto/g de proteína, calculados tal como para os microssomas hepáticos, utilizando uma razão de 0,134 mg de proteína/mL para 4E+5 células/mL para os humanos e de 0,201 mg de proteína/mL para 6E + 5 células /mL para o rato. A presença do fármaco de referência e do metabolito potencial foi verificada por LC/MS/MS durante os ensaios de todas as amostras. Apresentam-se os resultados na Tabela 2: 80

Tabela 2: Estabilidade em hepatócitos de rato e humanos

Composto f Hepatócitos de rato Hepatócitos human os Clint MF Q Clint MF Q j (mL/min/gprot) j rato % j células/mL (mL/min/gprot) j humano % células/mL B j1334 |3 6.00E+05 693 3 4.00E+05 1 I5 90 6,00E+05 o |ioo 4.00E+05 C 12610 2 6,00E+05 100 j16 4.00E+05 a. Clint_mic: eliminação intrínseca in vitro em mL/min/g de proteína b. MF %: biodisponibilidade metabólica em %

c. Q: quantidade de células por mL C. estabilidade metabólica em microssomas de murganho e de rato

Materiais e Métodos tampão de Diluição: Tampão 0,1 M de Tris HC1 a pH 7,4 contendo EDTA 5 mM.

Solução de cofactor NADPH: Adicionam-se a um tubo falcon de 50 mL contendo 2,79 mL de tampão de diluição, 0,429 mL de solução regenerante de NADPH, A, e 0,079 mL de solução regenerante de NADPH, B.

Preparação de Microssomas: (solução a 1,5 mg/mL) Aquece-se um tubo falcon de 50 mL contendo 3,32 mL de tampão de diluição a 37°C durante 15 minutos, (pelo menos 10 minutos), e adicionam-se 81 ao tampão de diluição previamente aquecido 0,178 mL de microssoma (a 24, 6 mg/mL) . A concentração proteica desta preparação de microssomas era de 1,25 mg/mL.

Amostra (Composto em Teste) - Soluções de Reserva Original e Intermediária: Preparou-se uma solução a 1 mg/mL (0,5 mg/mL para o composto 1) do composto em teste em metanol. Preparou-se uma solução intermediária 100 μΜ do composto em teste a partir da solução de reserva original utilizando o tampão de diluição. Preparou-se uma solução 5 μΜ diluindo a solução intermediária 100 μΜ com tampão de diluição.

Experiência: (Levaram-se a cabo as experiências em tubos de microcentrifugação Eppendorf de 1,5 mL)

Incubação aos 0 minutos. Processo: a. Adicionam-se 100 pL dos microssomas previamente aquecidos b. Adicionam-se 50 pL de solução 5 μΜ do composto em teste. c. Adicionam-se 500 pL de solução para oarar a frio (Metanol gelado) d. Adicionam-se 100 pL de solução de NADPH cofactor ao eppendorf. 82 a. Mistura-se o conteúdo do Eppendorf num Vortex. incubação aos "t" minutos

b. Adicionam-se 100 pL da solução do NADPH cofactor ao Eppendorf. c. Adicionam-se 50 pL da solução 5 pM do composto em teste. d. Adicionam-se 100 pL dos microssomas previamente aquecidos e. Incuba-se o Eppendorf a 37°C sob 300 rpm durante 't' minutos num misturador térmico. f. Remove-se o Eppendorf do misturador térmico g. Adicionam-se 500 pL de solução para parar fria (Metanol gelado) h. Mistura-se o conteúdo do Eppendorf num vortex.

Centrifugaram-se as amostras incubadas tanto aos '0' como aos ' t' minutos a 15.000 rcf a 4°C durante 15 minutos. Removeram-se 500 pL da solução de sobrenadante e submeteu-se a uma análise por LC/MS (SIM - Monitorização Selectiva de Ião)

Exprimem-se os resultados em % remanescente do composto em teste = (Área da resposta MS da amostra dos 't' minutos / Área da resposta MS da amostra dos '0' minutos) * 100. A área de MS utilizada é uma média de injecções em duplicado. 83 83 os de e

Pontos ao longo do tempo = 0, 15, 30 e 60 minut para cada composto em teste

Controlo Positivo:

Imipramina 2 μΜ - 5 minutos, e Imipramina 2 μΜ 15 minutos foram as incubações utilizadas a título controlo positivo para os microssomas de fígado de rato de murganho nas experiências de estabilidade.

Apresentam-se os resultados na Tabela 3: 84

Tabela 3: Estabilidade em microssomas de murganho e de rato | Composto (1) | Composto (B) j Composto (C) j

Estabilidade Metabólica in vitro | \ | Microssomas de ! Rato (% remanescente) | 15 minutos \ 54% | 1 % l o % | 30 minutos j 17% | 0% | o% | 1 h | 2% | 0% I o% i Microssomas de murganho (% remanescente) 15 minutos j 99% | 0% ! o% ! 30 minutos j 98% | 0% | 0% | 1 h | 82% | 0% | 0% |

Surpreendentemente, tal como se pode ver nas Tabelas 1-3, o composto 1 era significativamente mais estável em microssomas de murganho, rato e humanos, e em hepatócitos de rato e humanos, em comparação com os análogos estruturais, compostos B e C, descritos no WO 2007/024.717, que ambos demonstraram possuir uma pequena estabilidade metabólica in vitro nos sistemas testados, o que faz com que estes compostos não sejam adequados para desenvolvimento na qualidade de candidatos a fármacos. De uma forma surpreendente e inesperada, a substituição das espécies H ou OH dos compostos do estado da técnica por uma espécie COOH originava o composto 1, que apresentava uma elevada estabilidade metabólica em todos os sistemas testados. A maior estabilidade metabólica do Composto 1 em comparação com a dos seus análogos estruturais foi de facto surpreendente e substancia os benefícios inesperados deste composto em relação aos compostos conhecidos na técnica.

Lisboa, 24 de Novembro de 2014.

Claims (15)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto representado pela estrutura da fórmula (I):

(l) na qual, R seja COOH; e os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. 2. 0 composto consoante a reivindicação 1, sob a forma de um sal com um ácido ou com uma base aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. 3. 0 composto consoante a reivindicação 2, cujo sal seja seleccionado de entre o conjunto constituído por sal de sódio, potássio, magnésio, hemifumarato, cloridrato e bromidrato. 4. 0 composto consoante a reivindicação 1, que seja seleccionado de entre o conjunto constituído por: 2

(1) OH

5. 0 composto consoante a reivindicação 1, que seja representado pela estrutura da fórmula (1): 3

(1) ou os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. 6. 0 composto consoante a reivindicação 5, sob a forma de um sal com um ácido ou com uma base aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. 7. 0 composto consoante a reivindicação 6, cujo sal seja seleccionado de entre o conjunto constituído por sal de sódio, potássio, magnésio, hemifumarato, cloridrato e bromidrato. 8. 0 composto consoante a reivindicação 7, cujo sal seja o sal de sódio. 9. 0 composto consoante a reivindicação 7, cujo sal seja o sal hemifumarato. veículos

10. Uma composição farmacêutica incluindo um composto consoante qualquer uma das reivindicações 1-9, em combinação com um ou mais excipientes ou aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. 4

11. Uma composição farmacêutica consoante a reivindicação 10, para utilização no tratamento ou na prevenção de um estado seleccionado de entre o conjunto constituído por patologias e doenças cardíacas, fadiga muscular, patologias e doenças musculoesqueletais, patologias e doenças do SNC, disfunção cognitiva, patologias e doenças neuromusculares, patologias e doenças dos ossos, caquexia do cancro, hipertermia maligna, diabetes, morte súbita cardíaca, e síndrome de morte súbita de crianças, ou para melhorar a função cognitiva.

12 . Uma composição farmacêutica consoante a reivindicação O \—1 para utilização no tratamento ou na prevenção de patologias e doenças cardíacas consoante a reivindicação 11, em que as patologias e doenças cardíacas sejam seleccionadas de entre o conjunto constituído por patologias e doenças de pulsação irregular tais como patologias e doenças de pulsação irregular seleccionadas de entre o conjunto constituído por arritmia atrial e ventricular, fibrilação atrial e ventricular, taquiarritmia atrial e ventricular, taquicardia atrial e ventricular, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT), e as suas variantes induzidas pelo exercício; patologias e doenças de pulsação irregular induzidas pelo exercício; insuficiência cardíaca; insuficiência cardíaca congestiva; insuficiência cardíaca crónica; insuficiência cardíaca aguda; insuficiência cardíaca sistólica; insuficiência cardíaca diastólica; insuficiência cardíaca 5 aguda descompensada; lesão de isquémia/reperfusão cardíaca (I/R); doença obstrutiva pulmonar crónica; lesões I/R após angioplastia coronária ou após trombólise, para o tratamento do enfarte do miocárdio (MI); e tensão sanguínea elevada.

13. Uma composição farmacêutica consoante a reivindicação 10, para utilização no tratamento ou na prevenção consoante a reivindicação 11, em que a fadiga muscular seja devida a uma doença, uma patologia ou um estado dos músculos esqueletais.

14. Uma composição farmacêutica consoante a reivindicação 10 para utilização no tratamento ou na prevenção consoante a reivindicação 11, em que a patologia, doença ou estado musculoesqueletal seja seleccionado de entre o conjunto constituído fadiga muscular induzida pelo exercício; fadiga muscular induzida pelo exercício que seja devida a exercício prolongado ou a exercício de elevada intensidade; uma miopatia congénita; distrofia muscular tal como Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), Distrofia Muscular de Becker (BMD), Distrofia Muscular de Membro-Cinta (Limb-Girdle) (LGMD), distrofia facio-escapulo-humeral, distrofia muscular miotónica, distrofia muscular congénita (CMD), distrofia muscular distai, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, e distrofia muscular oculo-faríngica; atrofia muscular espinal (SMA), atrofia muscular espinal e bulbar (SBMA), fadiga muscular relacionada com a 6 idade; sarcopenia, doença nuclear central; caquexia do cancro; patologias da bexiga; e incontinência.

15. Uma composição farmacêutica consoante a reivindicação 10 para utilização no tratamento ou na prevenção consoante a reivindicação 11, em que as patologias e doenças do SNC sejam seleccionadas de entre o conjunto constituído por Doença de Alzheimer (AD) , neuropatia, convulsões, Doença de Parkinson (PD), e Doença de Huntington (HD); e as patologias e doenças neuromusculares são seleccionadas de entre o conjunto constituído por ataxia espinocerebelar (SCA), e esclerose lateral amiotrófica (ALS, doença de Lou Gehrig).

16. Uma composição farmacêutica consoante a reivindicação 10 para utilização no tratamento ou na prevenção consoante a reivindicação 11, na qual a disfunção cognitiva seja relacionada com a tensão ou relacionada com a idade, ou em que a função cognitiva a melhorar seja a memória de curto termo, a memória de longo termo, a atenção ou a aprendizagem, ou em que a disfunção cognitiva esteja associada a uma doença ou patologia seleccionada de entre o conjunto constituído por doença de Alzheimer (AD) , patologia de défice de atenção e hiperactividade (ADHD), patologia com espectro de autismo (ASD), patologia de ansiedade generalizada (GAD), patologia obsessiva compulsiva (OCD) , Doença de Parkinson (PD), patologia pós-traumática (PTSD), Esquizofrenia, patologia bipolar, e depressão maior. 7

17. Uma composição farmacêutica consoante a reivindicação 10, para utilização no tratamento ou na prevenção consoante a reivindicação 11, em que o estado seja a caquexia do cancro.

18. A composição farmacêutica consoante a reivindicação 17, em que a caquexia do cancro seja devida a um cancro com metástases ósseas.

19. Um composto consoante qualquer uma das reivindicações 1-9, ou um seu sal, para utilização no tratamento ou na prevenção de um estado seleccionado de entre o conjunto constituído por patologias e doenças cardíacas, fadiga muscular, patologias e doenças musculoesqueletais, patologias e doenças do SNC, disfunção cognitiva, patologias e doenças neuromusculares, patologias e doenças ósseas, caquexia do cancro, hipertermia maligna, diabetes, morte súbita cardíaca, e síndrome de morte súbita de crianças, ou para melhorar a função cognitiva.

20. Uma composição farmacêutica consoante a reivindicação 10, em combinação com um oligonucleótido de sentido reverso (AO) que seja específico para uma sequência de emenda num mARN de interesse, para aumentar o salto de exão no referido mARN com interesse, para utilização no tratamento ou na prevenção consoante a reivindicação 11. 8

21. Uma composição farmacêutica consoante a reivindicação 20, para utilização no tratamento da Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), em que o oligonucleótido de sentido reverso (AO) seja especifico para uma sequência de emenda de pelo menos um exão do gene DMD.

22. A composição farmacêutica consoante a reivindicação 21, na qual o oligonucleótido de sentido reverso seja especifico para uma sequência de emenda do exão 23, 45, 44, 50, 51, 52 e/ou 53 do gene DMD.

23. Um processo para a preparação e um composto consoante qualquer uma das reivindicações 1-9, incluindo o passo de se fazer reagir um composto com a fórmula

com um composto com a fórmula

em que Ra seja COOR1 ou CN; R1 seja alquilo C1-C4, e L seja um grupo de saida, para proporcionar um composto com a fórmula: h3co

-Ra e se transformar o grupo Ra no grupo R de tal modo que se obtenha um composto com a fórmula (I). Lisboa, 24 de Novembro de 2014.