TW201345900A

TW201345900A - 用於治療與雷諾定（ｒｙａｎｏｄｉｎｅ）受體之調節相關疾病之藥劑

Info

Publication number: TW201345900A
Application number: TW102113668A
Authority: TW
Inventors: Jia-Ming Yan; Sandro Belvedere; Yael Webb; Marc Bertrand; Nicole Villeneuve
Original assignee: Servier Lab; Armgo Pharma Inc
Priority date: 2012-04-18
Filing date: 2013-04-17
Publication date: 2013-11-16
Also published as: CL2014002756A1; SA113340479B1; MD4489B1; WO2013156505A1; GT201400222A; MD20140119A2; NI201400123A; HRP20141113T8; JP5965542B2; MA37525B1; NZ701122A; AU2013248313A1; MX350890B; ZA201407499B; EA201401141A8; RS53711B1; US20140088171A1; ES2529890T3; ME01969B; IL235043A

Abstract

本發明係關於1,4-苯并噻氮呯衍生物及其治療與調控細胞中鈣通道功能之雷諾定受體(ryanodine receptor；RyR)相關病況、病症及疾病上之用途。本發明亦揭示含有該等化合物之醫藥組合物及其治療與RyR相關疾病及病況上之用途，特定言之是指心臟、肌肉骨骼及中樞神經系統(CNS)疾病。

Description

用於治療與雷諾定(RYANODINE)受體之調節相關疾病之藥劑

本發明係關於1,4-苯并噻氮呯衍生物及其治療與調控細胞中鈣通道功能之雷諾定受體(ryanodine receptor；RyR)相關病症及疾病上之用途。本發明亦揭示含有該等化合物之醫藥組合物及其治療與RyR相關疾病及病況上之用途，特定言之是指心臟、骨骼肌肉及中樞神經系統(CNS)疾病。

肌漿網(sarcoplasmic reticulum；SR)係一種在細胞中的結構，在諸多的功能中，其具有特化胞內鈣(Ca²⁺)儲庫之功能。RyR為SR中之通道，其會敞開及閉合以調控Ca²⁺自細胞SR釋放至胞內細胞質中。自SR將Ca²⁺釋放至細胞質中會增加細胞質的Ca²⁺濃度。RyR之敞開概率係指RyR在任何指定時刻敞開且因此可將Ca²⁺自SR釋放至細胞質中之可能性。

RyR有三種類型，其等均係高度同源：RyR1、RyR2、及RyR3。RyR1主要存在於骨骼肌以及其他組織中，RyR2主要存在於心臟以及其他組織中，而RyR3存在於腦以及其他組織中。RyR為四聚物。RyR複合體之部分係由4個RyR多肽結合4個FK506結合蛋白(FKBP)(穩鈣結合蛋白(calstabin))而形成，特定言之是FKBP12(穩鈣結合蛋白1)及FKBP12.6(穩鈣結合蛋白2)。穩鈣結合蛋白1會結合RyR1及RyR3，而穩鈣結合蛋白2會結合RyR2。該等穩鈣結合蛋白會結合RyR(每個RyR亞單位結合一個分子)、穩定RyR功能、幫助鄰近RyR間之偶聯門控及藉由穩定通道封閉狀態而避免該通道之異常活化(Ca²⁺洩漏)。

雷諾定受體2與心臟疾病

於心臟橫紋肌中，RyR2為興奮-收縮(excitation-contraction；EC)偶聯及肌肉收縮時所需要的主要Ca²⁺釋放通道。於EC偶聯期間，動作電位0期期間，心肌細胞膜之去極化會活化電壓門控Ca²⁺通道。繼而通過敞開電壓門控通道之Ca²⁺匯流會啟動經由RyR2從SR釋放出Ca²⁺。此過程稱為Ca²⁺誘導之Ca²⁺釋放。RyR2介導的Ca²⁺誘導之Ca²⁺釋放接著會活化心臟細胞中之收縮蛋白，從而導致心肌收縮。

RyR2藉蛋白激酶A(protein kinase A；PKA)之磷酸化係「戰或逃」反應的一重要部分，其會藉由增加針對特定觸發器之Ca²⁺釋放量而增加心臟EC偶聯量。此訊號傳導路徑提供交感神經系統(SNS)之活化之機轉，以回應於壓力而導致增加之心臟輸出。藉PKA磷酸化RyR2致使穩鈣結合蛋白2自該通道部分解離，其繼而導致增加敞開概率，及增加自SR至胞內細胞質中之Ca²⁺釋放。

心臟衰竭(heart failure；HF)之特徵係持續高腎上腺素能狀態，其中血清兒茶酚胺濃度長期地增加。由於此慢性高腎上腺素能狀態之一結果係RyR2之持續性PKA高磷酸化，以致每個同源四聚體RyR2通道中4個Ser2808之3-4者長期地處於磷酸化狀態(Marx SO等人，Cell,2000；101(4)：365-376)。特定言之，RyR2之長期性PKA高磷酸化與自RyR2通道高分子複合體之通道穩定亞單位穩鈣結合蛋白2之耗損具有相關性。穩鈣結合蛋白之耗損會導致RyR複合體之舒張性SR Ca²⁺「洩漏」，此造成收縮功能受損(Marx等人，2000)。由於內向去極化電流之活化之故，此舒張性SR Ca²⁺「洩漏」亦與致命性心臟節律不整具有相關性(Lehnart等人，J Clin Invest.2008；118(6)：2230- 2245)。的確，經以缺乏PKA磷酸化部位之RyR2改造的小鼠在心肌梗塞(MI)後可受到保護免遭受HF進展之折磨(Wehrens XH等人Proc Natl Acad Sci USA.2006；103(3)：511-518)。此外，HF期間，RyR2之長期性PKA高磷酸化與耗損來自RyR2複合體之包括磷酸酶(Marx等人2000)PP1及PP2a(減損Ser2808之去磷酸化)及cAMP特異性4型磷酸二酯酶(PDE4D3)的RyR2高分子複合體之再塑具有相關性。耗損來自該RyR2複合體之PDE4D3會導致局部cAMP濃度持續增加(Lehnart SE等人，Cell 2005；123(1)：25-35)。因此，舒張性SR Ca²⁺洩漏造成HF進展及心律不整結果。此外，最新報告已證實，模擬RyR2之組成型PKA高磷酸化的RyR2-S2808D+/+(天冬胺酸取代絲胺酸2808)敲入基因小鼠顯示具有穩鈣結合蛋白2的耗損及洩漏性RyR2。RyR2-S2808D+/+小鼠會發展出與老化相關的心肌病、展現上升的RyR2氧化及亞醯醯化作用、經減少的SR Ca²⁺儲庫量、及增加舒張性SR Ca²⁺洩漏。心肌梗塞之後，RyR2-S2808D+/+小鼠相較WT同窩小鼠具有增加的死亡率。S107(一種可穩定RyR2-穩鈣結合蛋白2相互作用之1,4-苯并噻氮呯衍生物(WO 2007/024717))之治療可抑制RyR2介導之舒張性SR Ca²⁺洩漏且可減緩WT及RyR2-S2808D+/+小鼠兩者中HF進展(Shan等人，JClin Invest.2010年12月1日；120(12)：4375-87)。

此外，RyR2包含約33個游離硫醇基，致使其對細胞氧化還原態極為敏感。半胱胺酸之氧化有利於RyR敞開及SRCa²⁺洩漏。Shan等人，2010證實RyR2之氧化及亞硝醯化作用及穩定亞單位穩鈣結合蛋白2自RyR2之解離會誘導SR Ca²⁺洩漏。

兒茶酚胺能性多形性室性心動過速(catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia；CPVT)為具有結構標準心臟之個體的遺傳性疾病。超過50個的特異RyR2突變體與CPVT有關。CPVT病患自幼兒至成年會經歷暈厥及心源性猝死(sudden cardiac death； SCD)，且到35歲死亡率高達50%。罹患CPVT之個體在進行運動時具有心室性心律不整，但在靜息下則不會發展心律不整。與CPVT相關之RyR2突變作用會產生出「滲漏」RyR2通道，這是因為穩鈣結合蛋白2亞單位之結合減低之故(Lehnart等人，2008)。RyR2中R2474S突變雜合子小鼠(RyR2-R2474S小鼠)會出現自發性廣泛性強直-陣攣發作(其在沒有心律不整時發生)、運動誘發之心室性心律不整及SCD。經以S107處理可增強穩鈣結合蛋白2至突變RyR2-R2474S通道之結合、抑制通道洩漏、防止心律不整及提高抽搐閾值(Lehnart等人，2008)。

雷諾定受體1與骨骼肌肉疾病

藉由RyR1之SR Ca²⁺釋放可活化骨骼肌收縮。橫(T)小管膜之去極化會活化二氫吡啶受體電壓感測器(Cav1.1)，繼而經直接蛋白-蛋白相互作用引起SR Ca²⁺儲庫釋放而活化RyR1通道。Ca²⁺結合至肌鈣蛋白C，致使肌動蛋白-肌球蛋白交叉橋接發生及肌小節縮短。

於長時間肌肉緊張狀態(例如，在跑馬拉松期間)或諸如心臟衰竭之疾病中，其二者均表徵為SNS之長期性活化、骨骼肌機能受損，可能歸因於經改變的EC偶聯。特定言之，在肌肉每次收縮中自SR之Ca²⁺釋放量會減少，異常性Ca²⁺釋放事件可能發生，且Ca²⁺再吸收減慢(Reiken,S等人2003.J.Cell Biol.160：919-928)。這些觀察現象推測，SNS之長期性活化對骨骼肌之有害效應可能(至少部分)是因為Ca²⁺訊號傳導缺陷的原因。

RyR1高分子複合體係由可形成用於調控通道功能之蛋白質支架的560-kDa RyR1亞單位四聚體所組成，包含PKA及磷酸二酯酶4D3(PDE4D3)、蛋白磷酸酶1(PP1)及穩鈣結合蛋白1。A-激酶錨定蛋白(mAKAP)會將PKA及PDE4D3靶向至RyR1，而樹突棘素(spinophilin)則將PP1靶向至通道(Marx等人2000；Brillantes等人，Cell，1994，77，513-523；Bellinger等人J.Clin.Invest.2008， 118，445-53)。PKA、PP1及PDE4D3之催化及調控亞單位會調控RyR1於Ser2843(小鼠中之Ser2844)處之PKA介導磷酸化。已顯示RyR1於Ser2844處之PKA介導磷酸化會增加通道對細胞質Ca²⁺之敏感性、降低針對RyR1之穩鈣結合蛋白1之結合親和力，及使通道的閉合狀態變得不穩定(Reiken等人，2003；Marx,S.O.等人，Science，1998，281：818-821)。報告稱，骨骼肌中之穩鈣結合蛋白1濃度為約200nM，及針對RyR1而言，RyR1之PKA磷酸化會減弱穩鈣結合蛋白1之結合親和力從約100-200 nM至大於600 nM。因此，於病理狀態下，降低針對RyR1之穩鈣結合蛋白1結合親和力，其起因於RyR1於Ser2843處之PKA磷酸化，係足以實質上降低存在於RyR1複合體中之穩鈣結合蛋白1含量。RyR1於Ser2843處之長期性PKA高磷酸化(定義為存在於每一RyR1同源四聚體中的4個PKA Ser2843部位之3或4者之PKA磷酸化)會產生出「滲漏」通道(亦即，通道在靜息狀態下容易敞開)，此造成與持續性高腎上腺素能狀態相關，諸如發生在罹患心臟衰竭之固體中之骨骼肌功能障礙(Reiken等人，2003)。

此外，已報導，除了藉由磷酸化之外，轉譯後修飾(諸如藉由游離硫氫基對半胱胺酸殘基之亞硝醯化(S-亞硝醯化))以及通道氧化調控RyR1可增加RyR1通道活性。已顯示，RyR1之S-亞硝醯化及氧化可減弱穩鈣結合蛋白1與RyR1之結合。

過去據Bellinger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.2008，105(6)：2198-2002)報導，在小鼠及人的極限運動中，RyR1會進行性地PKA-高磷酸化、S-亞硝醯化及耗損PDE4D3及穩鈣結合蛋白1，導致產生出會造成降低小鼠運動能力之「滲漏」通道。經以S107處理可防止耗損來自RyR1複合體之穩鈣結合蛋白1、改善力生成及運動能力，及減低Ca^2+-依賴中性蛋白酶calpain活性及血漿肌酸酐激酶濃度。

裘馨型肌肉萎縮(Duchenne muscular dystrophy；DMD)為主要兒童期致死性遺傳性疾病之一。DMD係X染色體性聯遺傳，3,500個出生男嬰就有1個罹患，且通常在~30歲前會因呼吸或心臟衰竭而死亡。與DMD相關的肌縮蛋白之突變會導致肌縮蛋白完全耗失，因而破壞肌纖膜下細胞骨架與胞外基質間之聯結。此聯結是保護及穩定肌肉以抗收縮誘發性損傷所必需的。目前，無DMD之治癒方法且臨床上大多數治療係為緩解療法。出現在I/II期臨床試驗中的干預為外顯子跳躍、肌肉生長抑制素(myostatin)的抑制，及肌發育不全蛋白相關蛋白(utrophin)之上調。然而，全身性輸送傳遞、持續的外顯子跳躍，及肌發育不全蛋白相關蛋白上調存在有些問題。此外，於I/II期臨床試驗中，將肌肉抑制生長素失活以增加肌肉尺寸並未顯示具有經改善的肌肉強度或機能。因為肌縮蛋白突變作用所致之肌纖膜不穩定性具有一連串的效應。一個主要效應係增加的細胞溶質Ca²⁺濃度，此致使Ca^2+-依賴蛋白酶(calpain)活化。另一效應係發炎及增加的iNOS活性，此會導致蛋白質、脂質，及DNA之氧化/亞硝醯化。DMD肌肉病理係進行性的且遠遠超過肌纖膜之不穩定性。因此，該病理係與肌纖膜不穩定具有一致性，會增加易感性至進一步的損傷。最近證實，RyR1之過度氧化或亞硝醯化可破壞穩鈣結合蛋白1與RyR1複合體之相互作用，從而導致肌肉萎縮(mdx)之小鼠模型中之RyR1洩漏及肌肉無力，及經以S107處理可改善此小鼠模型中肌肉機能的指標(Bellinger,A.等人2009,Nature Medicine,15：325-330)。

與老化相關之肌肉質量及力之喪失(肌少症)會造成失能及增加死亡率。Andersson,D.等人(Cell Metab.2011年8月3日；14(2)：196-207)報導，相較於年齡更小(3-6月齡)成年小鼠之RyR1，老齡(24月齡)小鼠之RyR1係經氧化、半胱胺酸-亞硝醯化，且耗損掉穩鈣結合蛋白1。此RyR1通道複合體再塑會產生出「滲漏」通道，且敞開可能性會增加，從而導致骨骼肌中之胞內鈣洩漏。經以S107處理老齡小鼠可穩定穩鈣結合蛋白1與RyR1之結合、減少胞內鈣洩漏、減少反應性含氧物(reactive oxygen species；ROS)，且可增強強直性Ca²⁺釋放、肌專項力，及運動能力。

PCT國際專利公開案WO 2005/094457、WO 2006/101496及WO 2007/024717揭示1,4-苯并噻氮呯衍生物及其在諸多疾病中尤其在治療心臟、骨骼肌肉及認知病症上之用途。

PCT國際專利公開案WO 2008/060332係關於1,4-苯并噻氮呯衍生物在治療遭受諸如肌肉萎縮之病理折磨的個體、或遭受由於持續、長時間及/或劇烈運動、或長期性應力所致之肌肉疲勞折磨的個體之肌肉疲勞上之用途。

PCT國際專利公開案WO 2008/021432係關於1,4-苯并噻氮呯衍生物於治療及/或預防影響神經系統之疾病、病症及病況上之用途。

PCT國際專利公開案WO 2012/019076係關於1,4-苯并噻氮呯衍生物於治療及/或預防心臟缺血/再灌注損傷上之用途。Fauconnier等人，Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(32)：13258-63報導，經卡斯蛋白酶(caspase)-8活化所介導之RyR洩漏會導致心肌性缺血-再灌注後的左心室損傷，及經以S107處理於再灌注後15天可抑制SR Ca²⁺洩漏、降低心室節律不整、梗塞範圍，及左心室再塑。

PCT國際專利公開案WO 2012/019071係關於1,4-苯并噻氮呯衍生物於治療及/或預防肌少症上之用途。

PCT國際專利公開案WO 2012/037105係關於1,4-苯并噻氮呯衍生物於治療及/或預防壓力誘發性神經元病症及疾病上之用途。

有需要識別可有效用於治療包括骨骼肌肉及心臟病症及疾病之與RyR相關病症及疾病之新穎化合物。更特定言之，仍有需要識別可用以(例如)修復RyR通道滲漏、及增強穩鈣結合蛋白結合至PKA磷酸化/氧化/亞硝醯化RyR、及結合至以其他方式對穩鈣結合蛋白具有減低的親和力或不與其結合之突變體RyR來治療RyR相關疾病之新穎藥劑。

本發明提供新穎的1,4-苯并噻氮呯衍生物及其醫藥可接受鹽。於一些實施例中，本發明該等化合物為雷諾定受體(RyR)鈣通道穩定劑，有時稱之為「Rycals^TM」。本發明進而提供將該等化合物用於治療與RyR相關病症及疾病上之方法。

本發明化合物選自WO 2007/024717中陳述的1,4-苯并噻氮呯衍生物，WO 2007/024717闡述結構類似的化合物。然而，如本文之進一步論述，已發現該等化合物極不穩定，且因而其作為藥物之治療效用性受限。本申請案所根基的問題因而係提供替代性1,4-苯并噻氮呯衍生物，其不僅具有藥理學活性，而且具有諸如高代謝穩定性之有利特性，且因而可適用作為治療與RyR相關疾病及病況、例如心臟、骨骼肌肉及中樞神經系統(CNS)疾病之藥物。已出人意料地發現，式(I)化合物係穩定且又具藥理學活性，因而可提供針對本發明所根基問題的技術性解決辦法。

本發明化合物表示為結構式(I)：

及其醫藥可接受鹽其中：R為COOH。

式(I)化合物可呈與醫藥可接受酸或鹼之鹽形式存在。該等鹽較佳選自由鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、半富馬酸鹽、鹽酸鹽及氫溴酸鹽組成之群，且各種可能性均可以本發明個別實施例表示。目前較佳一種鹽為鈉鹽。另一種目前較佳鹽為半富馬酸鹽。

於一些具體實施例中，該化合物係選自由化合物1、化合物4及化合物6，及其醫藥可接受鹽組成之群。該等化合物之結構式述於下文中。

於一較佳實施例中，化合物表示為結構式(1)：

或其醫藥可接受鹽。

於一些實施例中，該化合物1係以母化合物提供。然而，於其他實施例中，化合物1係呈與醫藥可接受酸或鹼之鹽形式提供。較佳地，該鹽選自由鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、半富馬酸鹽、鹽酸鹽及氫溴酸鹽組成之群，且各種可能性均可以本發明個別實施例表示。目前較佳一種鹽為鈉鹽。另一種目前較佳鹽為半富馬酸鹽。

本發明亦提供用於合成本發明化合物及其鹽之方法。

本發明亦提供醫藥組合物，其等含有本發明組合物中之一或多者及至少一種添加劑或賦形劑，例如填料、稀釋劑、黏結劑、崩散劑、緩衝劑、著色劑、乳化劑、味道改善劑、膠凝劑、滑動劑、防腐劑、溶解劑、穩定劑、懸浮劑、甜味劑、滲透劑、潤濕劑、乳化劑、分散劑、膨潤劑、延遲劑、潤滑劑、吸收劑、及增黏劑。該等組合物可呈現為膠囊、顆粒、粉末、溶液、藥囊、懸浮液、或錠劑型。

本發明進而提供治療或預防與RyR相關之各種不同病症、疾病及病況、諸如心臟、肌肉骨骼功能、認知、CNS及神經肌肉病症及疾病之方法，該方法包括對有此治療需要的個體投與一含量之式(I)化合物或其鹽，可有效預防或治療與RyR相關之病症或疾病。本發明亦提供一種防止或處理個體中RyR(包括RyR1、RyR2及RyR3)洩漏之方法，該方法包括對該個體投與一含量之式(I)化合物或其鹽，可有效防止或處理RyR之洩漏。

此外，本發明提供一種調節個體中RyR與穩鈣結合蛋白之結合的方法，該方法包括對該個體投與一含量之式(I)化合物或其鹽，可有效調節RyR結合之穩鈣結合蛋白含量。

本發明進而有關於一種式(I)化合物於製造用於治療及/或預防與RyR相關病症、疾病及病況、諸如心臟、肌肉骨骼及認知/CNS病症及疾病的藥物上之用途。於另一實施例中，本發明係關於一種式(I)化合物於製造用於防止或處理RyR洩漏的藥物上之用途。於另一實施例中，本發明係關於一種式(I)化合物於製造用於調節RyR結合之穩鈣結合蛋白含量的藥物上之用途。

本發明該等方法可基於體外系統(例如，培養的細胞或組織)或體內(例如，非人的動物或人的體內)基礎上實施。

於一些實施例中，本發明化合物可併與結合外顯子跳躍療法提供，例如，如下文之進一步論述，反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide；AO)可用以促進所關注mRNA(例如DMD基因)之外顯子跳躍。本發明其他特徵及優點從下列具體陳述及圖式當可明瞭。

圖1A係以穩鈣結合蛋白2抗體之免疫轉漬顯示，在不存在(-)或存在100 nM化合物1下，穩鈣結合蛋白2與PKA磷酸化RyR2之結合。(+)：結合非PKA磷酸化RyR2之穩鈣結合蛋白。S36(US 7,544,678)係作為陽性對照。

圖1B係以穩鈣結合蛋白2抗體之免疫轉漬顯示，在不存在(-)或存在100 nM化合物2、化合物3或化合物4下，穩鈣結合蛋白2與PKA磷酸化RyR2之結合。(+)：結合非PKA磷酸化RyR2之穩鈣結合蛋白。S36係作為陽性對照。

圖1C係以穩鈣結合蛋白1抗體之免疫轉漬顯示，在不存在(Neg)或存在指定濃度之化合物1或化合物4下，穩鈣結合蛋白1與PKA磷酸化RyR1之結合。(Pos)：結合非PKA磷酸化RyR1之穩鈣結合蛋白。S36係作為陽性對照。

圖2 圖2A：係以穩鈣結合蛋白1抗體之免疫轉漬顯示，以滲透泵投與媒劑(50：50 DMSO/PEG)、僅投與異丙基腎上腺素(ISO)或與指定濃度之化合物1一起投與異丙基腎上腺素的小鼠脛骨溶胞產物中經免疫沉澱之RyR1複合體中穩鈣結合蛋白1濃度。S36係作為3.6 mM下之對照。圖2B：再結合RyR1之穩鈣結合蛋白1之量化(%)。

圖3 因缺血-再灌注(I/R)損傷所誘發之大鼠慢性心臟衰竭模型。就I/R方案而言，將左前下行(LAD)冠狀動脈阻塞1小時。

圖4 經以5 mg/kg/天(5MK)或10 mg/kg/天(10MK)之含於飲用水之化合物1處理的大鼠相對經媒劑(H₂O)處理且經過假手術的動物之左心室(LV)容積及噴血分數(EF)。慢性心臟衰竭係藉由缺血-再灌注(I/R)損傷誘發。將LAD動脈阻塞1小時；在再灌注後1週時開始治療且持續3個月。於治療1、2或3個月後獲得超音波心動圖參數。圖4A：LV舒張末期容積；圖4B：LV收縮末期容積；圖4C：EF。圖4A與4B：§ P<0.001相對假手術組；* P<0.05相對媒劑組；† P<0.001相對媒劑組。圖4C：§ P<0.001相對假手術組，† P<0.001相對媒劑組。

圖5 圖5A-C繪示體重(BW)(5A)、梗塞範圍(5B)、及LV重量(5C)，及圖5D繪示經以5 mg/kg/天(5MK)及10mg/kg/天(10MK)之含於飲用水中之化合物1處理之大鼠相對經媒劑(H₂O)處理且經過假手術的動物之膠原蛋白含量。慢性心臟衰竭係藉由缺血-再灌注(I/R)損傷誘發。將LAD動脈阻塞1小時；在再灌注後1週時開始治療且持續3個月。於治療3個月後測得參數。圖5A-C：不明顯。圖5D：††† P<0.001相對假手術組；* P<0.05相對媒劑組。

圖6 經以5 mg/kg/天(5MK)或10mg/kg/天(10MK)之含於飲用水中之化合物1處理的大鼠相對經媒劑(H₂O)處理且經過假手術的動物之創傷性血液動力學：左心室收縮壓(LV SP)(6A)、dP/dt最大(6B)；及dP/dt最小(6C)。慢性心臟衰竭係藉由缺血-再灌注(I/R)損傷誘發。將LAD動脈阻塞1小時；在再灌注後1週時開始治療且持續3個月。於治療3個月後測得血液動力學參數。圖6A：不明顯。圖6B：§ P<0.05相對假手術組；* P<0.05相對媒劑組。圖6C：† P<0.01相對假手術組；* P<0.05相對媒劑組。

圖7 化合物1血漿濃度(μM)相對時間(天)。

圖8 經以5mg/kg/天(5MK)之含於飲用水中之化合物1或化合物A治療的大鼠相對經媒劑(H₂O)處理且經過假手術的動物之EF。將LAD動脈阻塞1小時；在再灌注後1週時開始治療且持續3個月。於治療1、2或3個月後獲得超音波心動圖參數。§ P<0.001相對假手術組；* P<0.05相對媒劑組；† P<0.001相對媒劑組。

圖9 相較經媒劑(H₂O)處理的對照組，化合物1對mdx及WT小鼠之自發身體活動之效應。相較於媒劑對照組，以10及50 mg/kg/天(標靶劑量)之含於飲用水中方式給藥的mdx小鼠之第1-19天活動性而言，P<0.001。

圖10 EDL肌肉之專項力-頻率關係。(A)經以含於飲用水中方式投與化合物1(5、10及50 mg/kg/天(標靶劑量))處理的mdx小鼠相較於經媒劑(H₂O)處理的對照組(n=5)。在150 Hz及以上之頻率，就50 mg/kg/天劑量而言，p<0.05。(B)經以含於飲用水中方式投與化合物 1(50 mg/kg/天(標靶劑量)處理的WT、C57BL/6小鼠相較於經媒劑(H₂O)處理的對照組(n=4)

圖11經以含於飲用水中方式投與媒劑(H₂O)或化合物1(50 mg/kg/天(標靶劑量)處理的mdx及WT小鼠之平均體重(11A)及平均水消耗量(11B)。

應明瞭具體陳述及具體實例同時指明本發明之不同實施例僅以例示方式給出，因為熟習此項技藝者自此具體陳述當可明瞭屬於本發明精神及範疇之各種不同變化及修改。

如本文及附錄之請求項中所用，除非本文清除地另作指明，否則單數形式「一個」、「一種」、及「該」包涵參考物複數形式。本文中提及的所有公開案、專利申請案、專利案、及其他參考文獻之全部內容係以引用的方式併入。

術語「Rycals^TM」係指雷諾定受體鈣通道穩定劑，表示為如本發明所提供通式(I)或(IA)化合物、以及如本發明以數值表示之特定化合物及本文中統稱為「本發明之一或多種化合物」之特定化合物。

化合物

於一些實施例中，本發明化合物表示為式(IA)之結構式：

及其醫藥可接受鹽，其中R為COOH或其生物電子等排體(bioisostere)、COOR¹或CN；且R¹為C₁-C₄烷基。

於一些較佳實施例中，式(IA)中之R為羧酸(COOH)。於其他較佳實施例中，式(IA)中之R為羧酸生物電子等排體，例如四唑。或者，該羧酸生物電子等排體可為酸性雜環，諸如1,2,4-噁二唑-5(4H)-酮、1,2,4-噻二唑-5(4H)-酮、1,2,4-噁二唑-5(4H)-硫酮、1,3,4-噁二唑-2(3H)-硫酮、4-甲基-1H-1,2,4-三唑-5(4H)-硫酮、5-氟乳清酸、及類似者。額外之羧酸生物電子等排體描述在(例如)Hamada,Y.等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.2006；16：4354-4359；Herr,R.J.等人，Bioorg.Med.Chem.2002；10：3379-3393；Olesen,P.H.,Curr.Opin.Drug Discov.Devel.2001；4：471；Patani.G.A.等人，J.Chem.Rev.1996；96：3147；Kimura,T.等人Bioorg.Med.Chem.Lett.2006；16：2380-2386；及Kohara,Y.等人Bioorg.Med.Chem.Lett.1995；5(17)：1903-1908中。前述每一參考文獻之內容以引用的方式併入本文中。

於一較佳實施例中，本發明化合物係以結構式(IA)(其中R為COOH)及其醫藥可接受鹽表示(亦即，式(I)化合物)。

於其他較佳實施例中，式(IA)中之R在苯環的位置4(亦即，苯并噻氮呯環的位置7)。各種可能性均可以本發明個別實施例表示。式(IA)或(I)化合物可呈現與醫藥可接受酸或鹼之鹽形式。該等鹽較佳選自由鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、半富馬酸鹽、鹽酸鹽及氫溴酸鹽組成之群，且各種可能性均可以本發明個別實施例表示。目前較佳一種鹽為鈉鹽。另一種目前較佳鹽為半富馬酸鹽。

於一些具體實施例中，該化合物選自由以下組成之群：化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11、及化合物12，及其醫藥可接受鹽。該等化合物以下列結構式表示：

化學定義：

本文所用術語「烷基」係指具有1至4個碳原子(「C₁-C₄烷基」)之直鏈或支鏈飽和烴。代表性烷基包括(但不限於)甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、第二丁基、及第三丁基。該烷基可為未經取代、或經一或多個選自鹵素、鹵烷基、羥基、烷氧基、鹵代烷氧基、環烷基、芳基、雜環基、雜芳基、醯胺基、烷醯胺基、二烷基醯胺基、硝基、胺基、氰基、N₃、側氧基、烷胺基、二烷胺基、羧基、硫基、硫代烷基及硫代芳基之基團取代。

本發明化合物可呈其互變異構形式存在。所有該等互變異構形式作為本發明之一部分涵蓋於本文中。

本發明化合物之所有立體異構體(例如，彼等可能因為不同取代基上的不對稱碳而存在者)，包括鏡像異構形式及非對映異構形式，涵蓋於本發明範疇中。本發明化合物之個別立體異構體可(例如)實質上不含其他異構體(例如，呈具有某一特定活性之純化或實質上純化光學異構體)，或可經混合呈(例如)外消旋異構體、或呈富含一立體異構體之混合物。本發明對掌性中心可具有如IUPAC 1974 Recommendations定義之S或R組態。該等外消旋形式可依物理方法諸如(例如)分級結晶、非對映異構衍生物之分離或結晶、或藉由對掌性色譜柱層析法分離進行解析。該等個別光學異構體可自外消旋異構體依包括(但不限於)習知方法諸如(例如)與光學活性酸或鹼形成鹽接著結晶之任一適宜方法獲得。

本發明該等化合物於其製備之後，較佳經分離並純化以獲得含一含量(以重量計)之等於或大於約90%化合物、約95%化合物、及又更佳大於約99%化合物(「實質上純化」化合物)之組合物，其接著係如本文所述予以使用或調配。本發明之該等「實質上純化」化合物亦作為本發明之一部分包涵於本文中。

治療用途

本發明提供可治療與RyR相關病況、病症及疾病之化合物。更特定言之，本發明提供可修復RyR通道(可為RyR1、RyR2及/或RyR3通道)滲漏之化合物。於一個實施例中，本發明化合物促進締合及/或抑制RyR與穩鈣結合蛋白(例如，RyR1與穩鈣結合蛋白1；RyR2與穩鈣結合蛋白2；及RyR3與穩鈣結合蛋白1)之解離。「與RyR相關之病況、病症及疾病」意指可經調節RyR來治療及/或預防之病症及疾病且包括(但不限於)心臟病症及疾病、肌肉疲勞、肌肉骨骼病症及疾病、CNS病症及疾病、認知障礙、神經肌肉疾病及病症、認知功能改善、骨骼病症及疾病、癌症惡病質、惡性發熱、糖尿病、心源性猝死、及嬰兒猝死綜合症。

因此，於一個實施例中，本發明係關於一種治療或預防選自由以下組成之群之病況、或用於改善認知功能的方法：心臟病症及疾病、肌肉疲勞、肌肉骨骼病症及疾病、CNS病症及疾病、認知障礙、神經肌肉疾病及病症、骨骼病症及疾病、癌症惡病質、惡性發熱、糖尿病、心源性猝死、及嬰兒猝死綜合症，該方法包括對有此需要的個體投與治療有效量之如本文所述式(I)或(IA)化合物或其鹽以實施該治療之步驟。目前較佳一種化合物為式(1)化合物。

於另一實施例中，本發明係關於某一有效量之如本文所述式(I)或(IA)化合物或其鹽，於製造用於治療或預防選自由以下組成之群之病況、或用於改善認知功能的藥物上之用途：心臟病症及疾病、肌肉疲勞、骨骼肌肉病症及疾病、CNS病症及疾病、神經肌肉疾病及病症、認知障礙、骨骼病症及疾病、癌症惡病質、惡性發熱、糖尿病、心源性猝死、及嬰兒猝死綜合症。目前較佳一種化合物為式(1)化合物。

於另一實施例中，本發明係關於一種如本文所述式(I)或(IA)化合物或其鹽，其係用於製造用於治療或預防選自由以下組成之群之病況的藥物：心臟病症及疾病、肌肉疲勞、骨骼肌肉病症及疾病、CNS病症及疾病、認知障礙、神經肌肉疾病及病症、骨骼病症及疾病、癌症惡病質、惡性發熱、糖尿病、心源性猝死、及嬰兒猝死綜合症，或用於改善認知功能。目前較佳一種化合物為式(1)化合物。

於一個實施例中，該病況、病症或疾病係與RyR1之異常性功能相關。於另一實施例中，該病況、病症或疾病係與RyR2之異常性功能相關。於另一實施例中，該病況、病症或疾病係與RyR3之異常性功能相關。各種可能性均可以本發明個別實施例表示。

心臟病症及疾病包括(但不限於)不規則心跳病症及疾病、運動誘發的不規則心跳病症及疾病、心臟衰竭、充血性心臟衰竭、慢性心臟衰竭、急性心臟衰竭、收縮性心臟衰竭、舒張性心臟衰竭、急性失償型心臟衰竭、心臟缺血/再灌注(I/R)損傷(包括心肌梗塞(MI)期間之管狀動脈成形術或血栓溶解術後之I/R損傷)、慢性阻塞性肺病、及高血壓。不規則心跳病症及疾病包括(但不限於)心房及心室節律不整、心房及心室纖維性顫動、心房及心室頻脈心律不整、心房及心室性心跳過速、兒茶酚胺能性多形性室性心動過速(CPVT)、及其運動誘發的變化。

本發明化合物亦適用於治療肌肉疲勞，其可能係因長時間運動或高強度運動所致，或可能因肌肉骨骼疾病引起。肌肉病症及疾病之實例包括(但不限於)骨骼肌肉疲勞、中央軸空病、運動誘發的骨骼肌肉疲勞、膀胱病症、尿失禁、與老化相關之肌肉疲勞、肌少症、先天性肌肉病變、骨骼肌肉肌肉病變及/或萎縮、癌症惡病質、核及桿狀體之肌肉病變、粒線體肌病[例如，卡斯恩-賽爾(Kearns-Sayre)症候群、MELAS(粒線體肌病、腦病變、乳酸酸中毒、及中風)症候群、及MERRF(肌陣攣型癲癇伴破碎紅纖維)症候群]、內分泌性肌病、肌肉肝醣儲積病[例如，龐貝氏症(Pompe's disease)、安德森氏病(Andersen's disease)、及柯裏氏病(Cori's diseases)]、肌紅蛋白尿性[例如，麥克阿德爾氏病(McArdle's disease)、塔瑞氏病(Tarui disease)、及DiMauro病]、皮肌炎、骨化性肌炎、家族性週期性麻痹、多發性肌炎、包涵體肌炎、神經性肌強直、僵人綜合症(stiff-man syndrome)、惡性發熱、常見肌肉抽筋、痙攣、重度肌無力症、脊髓性肌肉萎縮症(SMA)、脊髓及延髓肌肉萎縮症(SBMA(亦稱為脊髓延髓性肌肉萎縮症)、延髓-脊髓性萎縮症、X染色體性聯的延髓脊神經病變(XBSN)、X染色體性聯的脊髓性肌肉萎縮症1型(SMAX1)、及肯尼迪病(Kennedy's disease)(KD))、及肌肉萎縮。較佳之骨骼肌肉病症包括(但不限於)運動誘導的骨骼肌肉疲勞、先天性肌肉病變、肌肉萎縮、與老化相關之肌肉疲勞、肌少症、中央軸空病、癌症惡病質、膀胱病症、及尿失禁。

肌肉萎縮之實例包括(但不限於)裘馨型肌肉萎縮(DMD)、貝克型肌肉萎縮(BMD)、肢帶型肌肉萎縮(LGMD)、先天性肌肉萎縮(CMD)、遠端型肌肉萎縮、顏面肩胛肱骨型萎縮、肌強直性肌肉萎縮、Emery-Dreifuss型肌肉萎縮、及眼咽型肌肉萎縮，且DMD係目前較佳。

本文中使用之先天性肌肉萎縮係指在出生時存在之肌肉萎縮。CMD係基於遺傳突變加以分類：1)編碼骨骼肌肉纖維基膜或胞外基質之結構蛋白之基因；2)編碼推定或證實的醣基轉移酶、繼而影響肌發育不全蛋白聚酶(dystroglycan)(為基膜之外膜蛋白)之醣基化之基因；及3)其他。CMD實例包括(但不限於)層黏連蛋白(Laminin)-α2-缺陷CMD(MDC1A)、Ullrich CMG(UCMD 1、2及3)、沃克-沃爾伯格綜合症(Walker-Warburg syndrome)(WWS)、肌-眼-腦病(MEB)、福山型(Fukuyama)CMD(FCMD)、CMD加繼發性層黏連蛋白缺陷1(MDC1B)、CMD加繼發性層黏連蛋白缺陷2(MDC1C)、CMD合併智力發育遲緩及腦回肥厚(pachygyria)(MDC1D)、及強直性脊柱合併肌肉萎縮1型(RSMD1)。

認知障礙可能相關於或包括(但不限於)失憶症、老化相關失憶症、創傷後壓力症(PTSD)、注意力缺陷過動症(ADHD)、自閉症系列障礙(ASD)、廣泛性焦慮症(GAD)、強迫症(OCD)、精神分裂症、躁鬱症、或重度憂鬱症。

CNS病症及疾病包括(但不限於)阿茲海默氏症(AD)、神經病變、抽搐、帕金森氏症(PD)、及亨丁頓氏症(HD)。

神經肌肉病症及疾病包括(但不限於)脊髓小腦共濟失調(SCA)、及肌萎縮性側索硬化症(ALS，魯蓋瑞氏症(Lou Gehrig's disease))。

於一些實施例中，本發明化合物係改善可能選自短期記憶、長期記憶、注意力、學習、及其任何組合之認知障礙。

於一些實施例中，本發明化合物適用於治療癌症惡病質，亦即，一般與癌症相關之肌肉無力，及較佳係轉移性癌症(諸如骨轉移)相關之肌肉無力。肌肉無力及肌肉萎縮(惡病質)係癌症病患中常見的副腫瘤性症候群。該等病況會引起顯著疲勞及顯著降低病患的生活品質。本發明提供一種用於治療及預防癌症病患肌無力之方法部分地是基於以下發現：於特定類型癌症(例如前列腺及乳腺癌合併骨轉移)中，RyR1經氧化後導致其變成「滲漏」。更已發現，藉由投與Rycal化合物可防止該滲漏改善肌肉機能。癌症實例包括(但不限於)乳腺癌、前列腺癌、骨癌、胰腺癌、肺癌、結腸癌、及胃腸癌。

外顯子跳躍療法：

於一些實施例中，本發明化合物可藉由促進反義體介導的外顯子跳躍調節(例如，促進)mRNA接合。此接合之調節係於對所關注接合序列具特異性之反義寡核苷酸(AO)存在下達成的。於本發明一些實施例中，式(I)或(IA)化合物及AO可協同作用，其中該式(I)或(IA)化合物可促進AO介導的外顯子跳躍。因此，於一些實施例中，本發明係關於一種醫藥組合物，其係用於治療或預防任何如本文所述與滲漏RyR相關的病況，進一步包括針對mRNA序列中接合序列具特異性之反義AO在促進所關注mRNA中外顯子跳躍上之用途。

藉本發明化合物促進外顯子跳躍之一個特定實施例係有關於裘馨型肌肉萎縮(DMD)。DMD表徵係病患終身罹患進行性肌肉無力之致死性X染色體性聯隱性疾病。DMD主要係藉由會造成肌縮蛋白生成減弱之DMD基因中讀碼框失序之多外顯子缺失之突變作用所引起的。僅有肌縮蛋白表現損失無法解釋DMD病理生理。肌縮蛋白-醣蛋白複合體(DGC)之破壞亦會導致氧化壓力、粒線體Ca²⁺過載及細胞凋亡、增加至肌肉中之Ca²⁺匯流量及病理學Ca²⁺訊號傳導。就DMD而言並沒有治癒性療法，且經證實的唯一藥理學療法係腎上腺皮質類固醇，雖可延長步行，然具有實質上的副作用。反義寡核苷酸介導的外顯子跳躍係一種旨在復原DMD讀碼框且容許完整肌縮蛋白醣蛋白複合體之表現之有效治療方法。迄今，已藉此方法於人體中產生出低含量之肌縮蛋白。Kendall等人(Sci Transl Med,2012,4(164)，頁數164ra160)報導諸如丹曲林(Dantrolene)及其他RyR調節劑之某些小分子可增強反義寡聚物導引的外顯子跳躍，以增加外顯子跳躍來復原mdx小鼠(患有DMD之小鼠模型)之骨骼肌中的mRNA讀碼框、肌纖膜肌縮蛋白及肌縮蛋白醣蛋白複合體。

因此，於一個實施例中，本發明係關於一種對有此需要的固體投與根據本發明式(I)或(IA)化合物併與組合對DMD基因一或多個外顯子(例如，DMD基因之外顯子23、45、44、50、51、52及/或53)的接合序列具特異性之反義寡核苷酸(AO)來治療DMD之方法。較佳之AO包括(但不限於)靶向DMD基因之DMD外顯子23、50及/或51之AO，諸如2'-O-甲基(2'OMe)硫代磷酸酯或磷二醯胺酸嗎啉酯(PMO)AO。該等AO之實例包括(但不限於)Pro051/GSK2402968、AVI4658/Eteplirsen、及PMO E23嗎啉基(5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3')。

術語本文所用藥劑「有效量」、「足量」或「治療有效量」可互換地，其係指足以達成有益或所期望結果(包括臨床結果)的用量且因而「有效量」或其變化項取決於其之施用相關的內容。在一些實施例中係預防性的反應，在其他實施例中係治療性，及於其他實施例中係其組合。術語「有效量」亦包涵本發明化合物的用量，其係「治療有效」且可避免或實質上減少所不期望的副作用。

如本文所用及如在相關技藝所充分明瞭，「治療」係一種可達成有益或所期望結果(包括臨床結果)之方法。有益或所期望臨床結果可包括(但不限於)無論可偵測到還是不可偵測到的一或多種症狀或病況之緩解或改善、疾病程度之減輕、穩定(亦即，非惡化)的疾病狀態、疾病擴散之防止、疾病進展之延遲或減慢、疾病狀態之改善或減輕及緩解(無論部分還是總體)。「治療」亦可意指相較於若非接受治療之預期存活期，延長生存期。

醫藥組合物

本發明化合物係經調配呈醫藥組合物而用於針對人個體以適於體內投與之生物相容形式投藥。根據另一態樣，本發明提供一種含有呈與醫藥可接受稀釋劑及/或載劑之混合物之本發明化合物的醫藥組合物。該醫藥可接受載劑較佳係與該組合物之其他成分相容，在意義上是「可接受」且對其接受者不會造成傷害。

該化合物可單獨地投與，然較佳係與一或多種醫藥可接受載劑一起投與。用於本文中之醫藥可接受載劑可選自作為原料用於醫藥調配物之多種有機或無機原料且其等係呈填料、稀釋劑、黏結劑、崩散劑、緩衝劑、著色劑、乳化劑、味道改善劑、膠凝劑、滑動劑、防腐劑、溶解劑、穩定劑、懸浮劑、甜味劑、滲透劑、潤濕劑、分散劑、膨潤劑、延遲劑、潤滑劑、吸收劑、及增黏劑中之任何一或多者併入。

本發明化合物係依包括(但不限於)經口、經舌下、經頰內、非經腸式(靜脈內、肌肉內或皮下)、經皮、經皮或經皮性、經鼻內、經陰道內、經直腸、經眼、及經呼吸道(經吸入投與)之已知程序投與給人或動物個體。本發明化合物亦可藉由傳遞至包括(但不限於)個體心臟或骨骼肌肉之個體肌肉來投與給個體。於一個實施例中，該化合物係經由插入個體心臟中之導管靶向傳遞至心肌細胞來投與給個體。於其他實施例中，化合物可(例如)藉由直接以腰內注射或室內輸注方式將該等化合物投與腦脊髓液(CSF)中、或藉由室內、鞘內或間質內投藥方式直接投與至CNS中。目前較佳的是口服。

根據本發明適於固體口服之醫藥組合物尤其包括錠劑或糖衣丸 (dragées)、舌下錠劑、藥囊、包括明膠膠囊之膠囊、粉末、及顆粒，及彼等適於液體口服、經鼻、經頰內或經眼投與者尤其包括乳液、溶液、懸浮液、滴劑、糖漿及氣霧劑。該等化合物亦可呈懸浮液或溶液藉飲用水或與食物一起投與。可接受醫藥載劑之實例包括(但不限於)纖維素衍生物，包括羧甲基纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素及微晶纖維素；糖類，諸如甘露醇、蔗糖、或乳糖；尤其地，甘油、阿拉伯膠、硬脂酸鎂、硬脂富馬酸鈉、生理鹽水、藻酸鈉、澱粉、滑石及水。

適於非經腸式注射之根據本發明醫藥組合物尤其包括可為水性或非水性分散液、懸浮液或乳液之無菌溶液以及適於可注射溶液或分散液之復水之無菌粉末。本發明化合物可與與個體血液等滲之無菌水溶液組合地投與。製造此種調配物係藉由使固體活性成分溶解於含有諸如氯化鈉、甘胺酸及類似之生理相容物質、且具有與生理條件相容之緩衝pH的水中，以製得水溶液，然後，將該溶液無菌化。該調配物存在於單位或多劑量容器(諸如封口型安瓿或小瓶)中。該調配物係藉由包括(但不限於)筋膜上注射、囊內注射、顱內注射、皮內注射、鞘內注射、肌肉內注射、眼窩內注射、腹膜內注射、脊柱內注射、胸骨內注射、血管內注射、靜脈內注射、主質內注射、皮下注射、或經舌下投與或將導管插至個體心臟中方式之任何注射模式傳遞。

適於經直腸或經陰道投與之該等醫藥組合物較佳為栓劑，及彼等適於經皮或經皮性投與者尤其包括粉末、氣霧劑、霜劑、軟膏、凝膠及貼布。

就經皮投與而言，本發明化合物係與皮膚滲透促進劑諸如丙二醇、聚乙二醇、異丙醇、乙醇、油酸、N-甲基吡咯啶酮及類似者組合，該等皮膚滲透促進劑增加皮膚對本發明化合物之通透性且容許該等化合物滲透通過皮膚至血液中。該等化合物/促進劑組合物亦可進一步與諸如乙基纖維素、羥丙基纖維素、乙酸乙酯/乙烯酯、聚乙烯吡咯啶酮、及類似者之聚合物質組合，以提供呈凝膠形式之組合物，將其溶解於溶劑中，蒸發至所期望黏度及接著施覆至背襯材料以提供貼布。

製造本發明醫藥調配物係藉由為醫藥技藝所熟知的方法，包括(但不限於)溼式及乾燥造粒法、或藉由直接壓製。對載劑之選擇取決於化合物的溶解度及化學性質、選擇的投藥途徑及標準醫藥實務。

以上提及的該等醫藥組合物係說明本發明但不以任何方式限制本發明。

根據本發明方法，該等化合物中之任一者係以可有效限制或防止個體(特定言之個體的細胞)中RyR結合穩鈣結合蛋白濃度增加的量投與給個體(或與個體的細胞接觸)。熟習此項技藝者可根據包括所確立體內滴定曲線分析及本文所揭示方法及分析之已知程序輕易地確定該量。可有效限制或防止個體中RyR結合穩鈣結合蛋白濃度增加之本發明化合物的適宜量之範圍約0.01 mg/kg/天至約100 mg/kg/天(例如，1、2、5、10、20、25、50或100 mg/kg/天)，及/或為足以達成範圍約300 ng/ml至約5,000 ng/ml之血漿濃度的用量。或者，本發明化合物的用量範圍在約1 mg/kg/天至約50 mg/kg/天。或者，本發明化合物的用量範圍在約10 mg/kg/天至約20 mg/kg/天。亦包括可投與約0.01 mg/kg/天或0.05 mg/kg/天至約5 mg/kg/天或約10 mg/kg/天用量。

合成方法

本發明於另一態樣中係提供製造本發明化合物及其鹽之方法。更特定言之，本發明提供製造式(I)或(IA)化合物(例如化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11、及化合物12)或其鹽之方法。以實例方式論述該等化合物之不同合成途徑。下列反應圖1係描述一般合成途徑(ROS)：

反應圖1中，R^a為COOR¹或CN；R¹為C₁-C₄烷基，及L為離去基團，其例如為：鹵素、磺酸酯基(OSO₂R'，其中R'為烷基或芳基，例如，OM(甲磺酸酯基)、OT(甲苯磺酸酯基))及類似者。胺起始物質較佳係在鹼存在下與烷基化試劑(以上顯示之苄基衍生物)反應，以生成所期望產物或其前驅體(R=R^a)。若須要，該前驅體可如下文實驗部分中所舉例、或依熟習此項技藝者悉知的任何其他方法進一步反應，將基團R^a轉化為基團R。例如，酯前驅體(R^a=COOR¹，其中R¹為C₁-C₄烷基)可依已知方法經酸性或鹼性條件下水解而轉化為對應之羧酸(R=COOH)。或者，腈前驅體(R^a=CN)可經適宜條件下與疊氮化鈉反應而轉化為四唑(羧酸電子等排體)，或經水解而轉化為羧酸(R=COOH)。

胺起始物質可依WO 2009/111463或WO 2007/024717中所述的方法、或熟習此項技藝者熟知的任何其他方法製得。所有前述參考文獻之內容以引用的方式併入本文中。鹼性質無特定限制性。較佳之鹼包括(但不限於)氫化物(例如，鈉或鉀氫化物)及N,N-二異丙基乙胺。其他適宜之鹼包括(但不限於)有機鹼，諸如三級胺，其選自由非環狀胺(例如，三甲胺、三乙胺、二甲基苯基胺、二異丙基乙胺及三丁胺)、環狀胺(例如，N-甲基嗎啉)及芳族胺(二甲基苯胺、二甲胺基吡啶及吡啶)組成之群。

該反應可於存在或不存在溶劑下進行。當使用溶劑時，溶劑性質無特定限制性，及實例包括諸如酯(例如，乙酸乙酯)、醚(例如，THF)、氯化溶劑(例如，二氯甲烷或氯仿)、二甲基甲醯胺(DMF)之溶劑，及其他溶劑，諸如乙腈或甲苯，或該等溶劑與其他各者或水之混合物。

製造式(I)(其中R=COOH)化合物之鹽可藉由使母體分子與適宜鹼(例如，NaOH或KOH)反應，以生成對應之鹼金屬鹽，例如，鈉鹽或鉀鹽。或者，酯(R=COOR¹)可藉由與適宜鹼反應直接轉化為鹽。

製造式(I)化合物之鹽亦可藉由使母體分子與適宜酸(例如，HCl、富馬酸或對甲苯磺酸)反應，以生成對應之鹽，例如，鹽酸鹽、甲苯磺酸鹽或半富馬酸鹽。

實例

以下實例提供作為根據本發明一些較佳實施例的示例。

實例1：合成

儀器：

NMR：Bruker AVANCE III 400或Varian Mercury 300

LC/MS：Waters Delta 600，其配備自動取樣器717+(Autosampler 717Plus)、光電二極管陣列檢測器2996(Photo Diode Array Detector 2996)、及質量檢測器3100(Mass Detector 3100)(或Shimadzu 210)

將7-甲氧基-2,3,4,5-四氫苯并[f][1,4]噻氮呯(「胺」)進行烷基化之一般程序

將胺(以上顯示之結構式)(1 mmol)溶解於3 ml二氯甲烷中。將烷基化試劑(1 mmol)添加至該溶液中，接著添加N,N-二異丙基乙胺(0.34 ml,2 mmol)。室溫下隔夜攪拌該混合物。將該溶液直接加載至管柱上，且利用己烷/EtOAc(2：1，體積比)洗脫。

3-((7-甲氧基-2,3-二氫苯并[f][1,4]噻氮呯-4(5H)-基)甲基)苯甲酸甲酯：¹HNMR(300 MHz,CDCl₃)：7.96(m,2H),7.46(m,3H),6.70(dd,J=8.4 Hz,3.0 Hz,1H),6.50(d,J=2.7 Hz,1H),4.09(s,2H),3.90(s,3H),3.72(s,3H),3.57(s,2H),3.35(m,2H),2.72(m,2H)。MS：344(M+1)

4-((7-甲氧基-2,3-二氫苯并[f][1,4]噻氮呯-4(5H)-基)甲基)苯甲酸甲酯：¹HNMR(300 MHz,CDCl₃)：7.99(d,J=8.4 Hz,2H),7.46(d,J=8.4 Hz,1H),7.37(d,J=8.7 Hz,2H),6.70(dd,J=8.4 Hz,3.0 Hz,1H),6.50(d,J=2.7 Hz,1H),4.09(s,2H),3.90(s,3H),3.72(s,3H),3.57(s,2H),3.35(m,2H),2.72(m,2H)。MS：344(M+1)

2-((7-甲氧基-2,3-二氫苯并[f][1,4]噻氮呯-4(5H)-基)甲基)苯甲酸甲酯：該化合物經與含於醚中之2M HCl反應而轉化為鹽酸鹽。¹HNMR(300 MHz,DMSO-d₆)：10.33(br,1H),8.08(d,J=7.5Hz,1H),7.80-7.65(m,3H),7.51(d,J=8.1Hz,1H),7.14(s,1H),6.99(dd,J=8.4,2.1Hz,1H),4.90-4.40(m,br,4H),3.88(s,3H),3.78(s,3H),3.40(m,2H),3.26(m,1H),3.11(m,1H)。MS：344(M+1)

2-((7-甲氧基-2,3-二氫苯并[f][1,4]噻氮呯-4(5H)-基)甲基)苄腈：¹HNMR(300 MHz,CDCl3)：7.67-7.26(m,5H),6.73(d,J=2.7 Hz,1H),6.74(dd,J=2.7,8.4 Hz,1H),4.14(s,2H),3.78(s,3H),3.70(s,2H),3.36(m,2H),2.76(m,2H)。MS：311(M+1)

3-((7-甲氧基-2,3-二氫苯并[f][1,4]噻氮呯-4(5H)-基)甲基)苄腈：¹HNMR(300 MHz,CDCl3)：7.64-7.42(m,5H),6.74(dd,J=2.7,8.4 Hz,1H),6.48(d,J=2.7 Hz,1H),4.08(s,2H),3.75(s,3H),3.57(s,2H),3.36(m,2H),2.76(m,2H)。MS：311(M+1)

4-((7-甲氧基-2，3-二氫苯并[f][1,4]噻氮呯-4(5H)-基)甲基)苄腈：¹HNMR(300 MHz,CDCl3)：7.64(d,J=7.2Hz,2H),7.42(m,3H),6.74(dd,J=2.7,8.4 Hz,1H),6.48(d,J=2.7 Hz,1H),4.08(s,2H),3.75(s,3H),3.58(s,2H),3.36(m,2H),2.76(m,2H)。MS：311(M+1)

酯水解(一般程序)

將甲基酯(3 mmol)溶解於30 ml THF/甲醇/1 M NaOH(1：1：1，v/v)中。攪拌該混合物8小時，且TLC顯示酯完全消失。添加1 ml濃HCl以調整至酸性pH。移除有機溶劑，及藉由過濾收集所形成的固體。於空氣中乾燥該固體。

3-((7-甲氧基-2,3-二氫苯并[f][1,4]噻氮呯-4(5H)-基)甲基)苯甲酸：該化合物係以作為溶劑之EtOAc萃取獲得。¹HNMR(300 MHz,CDCl₃)：8.10(s,1H),8.04(d,J=8.4 Hz,1H),7.80(br,1H),7.46(m,2H),6.80(m,2H),4.40(s,2H),3.90(s,2H),3.76(s,3H),3.42(s,2H),2.86(s,2H).MS：330(M+1),328(M-1)。

4-((7-甲氧基-2,3-二氫苯并[f][1,4]噻氮呯-4(5H)-基)甲基)苯甲酸：該化合物係以作為溶劑之EtOAc萃取獲得。¹HNMR(300 MHz,CDCl₃)：8.02(d,J=8.4 Hz,2H),7.46(d,J=8.4 Hz,1H),7.42(d,J=8.7 Hz,2H),6.70(dd,J=8.4 Hz,3.0 Hz,1H),6.50(d,J=3.0 Hz,1H),4.11 (s,2H),3.72(s,3H),3.62(s,2H),3.35(m,2H),2.76(m,2H).MS：330(M+1),328(M-1)。

化合物1，鈉鹽：

化合物1之鈉鹽係從母體分子使用1當量的含於EtOH中之NaOH製得(鹽m.p.：>290℃)。

¹HNMR(DMSO-D6,600MHz),δ(ppm)：7.77(2H,m),7.41(1H,d),7.13(2H,m),6.75(1H,dd),6.63(1H,d),4.00(2H,s),3.70(3H,s),3.49(2H,s),3.18(2H,m),2.70(2H,m)。

化合物1，半富馬酸鹽：

將1.6 g化合物1(中性形式)與265 mg富馬酸加入一圓底燒瓶中。於添加18 mL丙酮及2 mL水後，使反應混合物回流。觀察到部分溶解(但不完全澄清)，接著產生沉澱。然後使該反應混合物回流過夜。於冷卻後，藉由過濾分離殘餘固體，利用3 mL丙酮洗滌，及於真空下乾燥(40℃/10毫巴)達4小時。

¹HNMR(DMSO-D6,600MHz),δ(ppm)：12.97(2H,bs),7.90(2H,m),7.43(1H,d),7.40(2H,m),6.77(1H,dd),6.64(1H,d),6.62(1H,s),4.03(2H,s),3.70(3H,s),3.58(2H,s),3.20(2H,m),2.72(2H,m)。

2-((7-甲氧基-2,3-二氫苯并[f][1,4]噻氮呯-4(5H)-基)甲基)苯甲酸：該化合物藉含於醚中之2M HCl轉化為鹽酸鹽。¹HNMR(300 MHz,DMSO-d₆)：10.10(br,1H),8.08(d,J=7.5Hz,1H),7.66-7.51(m,4H),7.17(d,J=2.1Hz,1H),6.99(dd,J=8.4,2.1Hz,1H),4.80-4.40(m,br,4H),3.78(s,3H),3.46(m,2H),3.13(m,2H).MS：330(M+1),328(M- 1)。

四唑之合成法(一般程序)

腈前驅體(3.22 mmol)、疊氮化鈉(830 mg,12.9 mmol)及三乙胺鹽酸鹽(1.72 g,12.9 mmol)係含於40 ml無水DMF中，於100℃下攪拌5天。於高度真空下移除該DMF，且將殘餘物與水混合。以二氯甲烷(3×100 ml)萃取水溶液。藉由管柱層析(EtOAc/甲醇)純化純化合物。

4-(2-(1H-四唑-5-基)苄基)-7-甲氧基-2,3,4,5-四氫苯并[f][1,4]噻氮呯：¹HNMR(300 MHz,CDCl3與一滴CD3OD)：8.30(d,J=8.7Hz,1H),7.53(m,2H).7.14(t,J=7.8Hz,1H),7.20(d,J=7.5Hz,1H),6.84(dd,J=2.7,8.4 Hz,1H),6.69(d,J=2.7 Hz,1H),4.46(s,2H),3.80(s,2H),3.75(s,2H),3.43(m,2H),2.96(m,2H)。MS：354(M+1),352(M-1)

4-(3-(1H-四唑-5-基)苄基)-7-甲氧基-2,3,4,5-四氫苯并[f][1,4]噻氮呯：¹HNMR(300 MHz,CDCl₃)：8.16(s,1H),7.90(d,J=7.5Hz,1H),7.40(d,J=8.4Hz,1H),7.20(m,2H),6.74(dd,J=2.7,8.4 Hz,1H),6.58(d,J=2.7 Hz,1H),4.18(s,2H),3.75(s,5H),3.36(m,2H),2.76(m,2H)。MS：354(M+1),352(M-1)

4-(4-(1H-四唑-5-基)苄基)-7-甲氧基-2,3,4,5-四氫苯并[f][1,4]噻氮呯：¹HNMR(300 MHz,CDCl3與一滴CD3OD)：7.99(d,J=7.2Hz,2H),7.42(m,3H),6.74(dd,J=2.7,8.4 Hz,1H),6.53(d,J=2.7 Hz,1H),4.10(s,2H),3.71(s,3H),3.58(s,2H),3.36(m,2H),2.76(m,2H)。MS：354(M+1),352(M-1)

7-甲氧基-2,3,4,5-四氫苯并[f][1,4]噻氮呯(「胺」)之合成

2-(4-甲氧基苯基硫基)乙胺(1)

於200 mL THF中混合4-甲氧基硫酚(50 g,0.357 mol)、2-氯乙胺單鹽酸鹽(39.8 g,0.343 mol)、K₂CO₃(78.8 g,0.57 mol)及二異丙基乙胺(32 mL,0.178 mol)。混合物於減壓下脫氣5分鐘，及於氬氣下回流過夜。移除溶劑並添加水(300 mL)至該燒瓶。以二氯甲烷(3×200 mL)萃取該混合物。收集有機相，移除二氯甲烷並添加50 mL濃HCl，接著添加200 mL水。以1：1 EtOAc/己烷(3×200 mL)萃取溶液。以2 M NaOH將水層調整至pH 10，然後利用二氯甲烷(3×200 mL)萃取。已合併之有機溶液經過無水硫酸鈉乾燥。溶劑移除後可提供無色液體之61 g目標化合物，產率為97%。

¹H-NMR(300 MHz,CDCl₃)：7.35(d,J=8.7 Hz,2H),6.81(d,J=8.7 Hz,2H),3.77(s,3H),2.88-2.80(m,4H),1.44(s,2H)。

2-(4-甲氧基苯基硫基)乙基胺基甲酸苄酯(2)

第一方法

於0℃下，逐滴地將氯甲酸苄酯(8.2 g,48.1 mmol，經100 mL二氯甲烷稀釋)添加至含有化合物1(8.0 g,43.7 mmol)、碳酸氫鈉(12.1 g,144 mmol)、水(100 mL)及二氯甲烷(200 mL)之燒瓶中。添加之後，室溫下攪拌混合物5小時。收集有機層，且以100 mL二氯甲烷萃取水溶液。已合併之有機溶液經過硫酸鈉乾燥。移除溶劑並藉200 mL THF/己烷(1：10)濕磨所得固體。收集固體並乾燥而留下目標產物(12.9 g)，產率為93%。

替代方法

於0℃下，逐滴地將氯甲酸苄酯(7.24 mL,51.5 mmol，經100 mL二氯甲烷稀釋)添加至含化合物1(10 g,54.6 mmol)與三乙胺(15 mL,106 mmol)之200 mL二氯甲烷溶液中。添加之後，室溫下攪拌該溶液1小時。藉由過濾移除固體。以100 mL 0.1 M HCl及100 mL飽和碳酸鈉萃取該溶液，接著經過無水硫酸鈉乾燥。溶劑移除可提供白色固體，其於200 mL THF/己烷(1：20)中攪拌3小時。藉由過濾收集固體，可提供14.2 g目標化合物(產率87%)。

¹H-NMR(300 MHz,CDCl₃)：7.35(m,7H),6.83(d,J=8.7 Hz,2H),5.07(m,3H),3.77(s,3H),3.10(q,J=6.3 Hz,2H),2.92(t,J=6.3 Hz,2H)。

7-甲氧基-2,3-二氫苯并[f][1,4]噻氮呯-4(5H)-羧酸苄酯(3)

於70℃下，隔夜攪拌含於250 mL甲苯中之化合物2(7.3 g,23 mmol)、多聚甲醛(6.9 g,0.23 mol)及對甲苯磺酸(1.45 g,7.6 mmol)之混合物。冷卻至室溫之後，過濾除去固體。以飽和碳酸鈉(100 mL)萃取溶液，且有機層經過無水硫酸鈉乾燥。移除溶劑後獲得液體狀之目標產物(7.4 g)，產率為97%。

¹H-NMR(300 MHz,CDCl₃)：7.44(d,J=8.1 Hz,0.77H),7.32(m,5.60H),7.07(d,J=2.7 Hz,0.33H),6.68(m,1.30H),5.04(s,2H),4.59(ss,2H),3.96(br,1.80),3.80(ss,1.23H),3.55(s,1.97H),2.76(m,2H)。

7-甲氧基-2,3,4,5-四氫苯并[f][1,4]噻氮呯氫溴酸鹽(胺)(4 HBr鹽)

第一方法

將HBr溶液(33%含於乙酸中，10 mL)添加至化合物3(4.2 g,12.8 mmol)中。添加之後，二氧化碳開始生成且形成白色固體。另於室溫下讓該混合物靜置2小時。將二乙醚(150 mL)添加至該混合物中，且使其攪拌30分鐘。藉由過濾收集固體，並以二乙醚洗滌。於真空下乾燥該固體，可提供3.40 g目標化合物，產率為91.8%。

¹H-NMR(300 MHz,DMSO-d₆)：9.02(br,2H),7.52(d,J=8.1 Hz,1H),7.27(d,J=3.3 Hz,1H),6.92(dd,J=8.4,2.7 Hz,1H),4.41(s,2H),3.77(s,3H),3.53(m,2H),2.96(m,2H)。

替代方法(游離鹼4a)

將化合物3(10 g,30 mmol)與50 mL濃HCl、50 mL水及30 mL二噁烷混合。於100℃下，隔夜攪拌該混合物。冷卻至室溫後，於減壓下移除大部分溶劑及HCl。將水(100 mL)添加至該溶液中並過濾除去固體。以EtOAc/己烷(1：1，3×100 mL)萃取水溶液，且添加15 g NaOH進行鹼化。以二氯甲烷(3×150 mL)萃取該混合物。已合併之溶液經過無水硫酸鈉乾燥。溶劑移除可提供液體，該液體於室溫下靜置之後進行固化會產生6.2 g目標化合物。

¹H-NMR(300 MHz,CDCl₃)：7.42(d,J=8.1 Hz,1H),6.78(d,J=2.7 Hz,H),6.68(dd,J=2.7,8.1 Hz,1H),4.08(s,2H),3.96(br,1.80),3.76 (s,3H),3.38(m,2H),2.68(m,2H)。

實例2：穩鈣結合蛋白2與PKA-磷酸化RyR2之結合

如先前所述(Marx等人，2000；Kaftan等人，Circ.Res.,1996,78：990-97)製造心臟SR膜。室溫下，利用抗穩鈣結合蛋白抗體(1：1,000)(Jayaraman等人，J.Biol.Chem.,1992,267：9474-77)，如所述進行微粒體(50μg)之免疫轉漬分析達1小時(Reiken等人，Circulation,107：2459-66,2003)。與HRP標記的抗兔IgG(1：5,000稀釋；Transduction Laboratories，Lexington，Ky.)培養後，利用ECL(Amersham Pharmacia，Piscataway，N.J.)顯影該轉漬，並於x光片上偵測，或暴露至經紅外染料標記的第二抗體，並於購自Li-Cor Biosciences之設備(型號Odyssey)上進行觀測。除非另作規定，否則化合物係以100 nM濃度進行測試。下文呈現一代表性穩鈣結合蛋白2結合試驗。

A. 心臟肌漿網(CSR)之PKA磷酸化

將反應混合物置於1.5 ml微量離心管中。添加200 μg心臟SR至激酶緩衝劑、PKA及ATP之反應混合物，達到100 μl之最終體積(下方之反應混合物)。最後添加ATP以引發反應。

反應混合物：

20 μl=試樣(心臟SR，2或10 μg/μl)

10 μl=10×激酶緩衝劑(80 mM MgCl₂、100 mM EGTA、500 mM Tris/PIPES)，pH=7.0

20 μl=PKA(2單位/ul)(Sigma# P2645)

10 μl=10×ATP(1.0 mM)(Sigma A 9187)

40 μl=蒸餾H₂O

1.於30℃下培養該等微量管達30分鐘。

2.接著將反應混合物轉移至0.5ml厚壁玻璃管。

3.將含有反應混合物之該等玻璃管以50,000×g，使用S120AT3轉子之Sorvall離心機RCM120EX中離心10分鐘。以50,000×g離心10分鐘足以分離出微粒體。

4.以結合緩衝劑(10 mM咪唑，300 mM蔗糖，pH=7.4)洗滌所得集結粒4次。每次均添加100 μl 1×結合緩衝劑至該微量管以洗滌該集結粒。利用微量吸移管進行上下沖洗將該集結粒進行再懸浮。於最後一次離心後，添加50 μl結合緩衝劑，並將所有微量管的集結粒組併在一起。於-20℃下儲存反應物。

5.藉由以6%聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)分離出約10 μg CSR及分析全RyR(5029 Ab，1：3000稀釋或單株Ab，購自Affinity Bioreagents，Cat # MA3-916，1：2000稀釋)及PKA磷酸化RyR2(P2809 Ab，1：10000稀釋)二者的免疫轉漬來證實磷酸化。

6.可於-80℃下儲存等分試樣。

B. 穩鈣結合蛋白再結合試驗

1.PKA磷酸化CSR(約20 μg)係與含或不含化合物之100 μl結合緩衝劑(如上所述)中之250 nM穩鈣結合蛋白2培養。

2.將反應物置於0.5 ml厚壁玻璃管(Hitachi Centrifuge ware，目錄編號B4105)中。

3.穩鈣結合蛋白2係作為最後試劑添加於該反應混合物。於室溫下進行反應達30分鐘。

4.於反應之後，該等試管於100,000 g下離心10分鐘。(具有S120AT3轉子之Sorvall RCM120EX離心機)。

5.以4℃之1×結合緩衝劑洗滌所得集結粒4次。於每次洗滌之後，於4℃下以50,000 g離心該等試管10分鐘。

6.於最後一次洗滌後，棄置上清液。

7.添加20 μl試樣緩衝劑(2×)[述於下文中之6×試樣緩衝劑]，及利用微量吸移管及/或藉由短暫渦轉將該集結粒再懸浮。將該懸浮液轉移至1.5ml微量離心管。

8.於90℃下，將該等微量管加熱4分鐘。

9.使用15% SDS/PAGE分離蛋白質。

10.藉抗FKBP(Jayaraman等人，J.Biol.Chem.1992；267：9474-77，1：2000)一級抗體及適宜之二級抗體來偵測穩鈣結合蛋白2之結合。

6×試樣緩衝劑

7.0 ml 4×Tris-HCl/SDS，pH6.8

3.0 ml甘油(30%最終濃度)

1.0 g SDS(10%最終濃度)

0.93 g DTT(0.6 M最終濃度)

1 mg溴苯酚藍(0.001%最終濃度)

添加蒸餾水至10 ml最終體積。

於-70℃下，分裝成1 ml等分試樣儲存。

結果：

圖1A繪示利用穩鈣結合蛋白2抗體之免疫轉漬，顯示不存在(-)或存在100 nM化合物1下，穩鈣結合蛋白2與PKA磷酸化RyR2之結合。(+)：結合至非PKA磷酸化RyR2之穩鈣結合蛋白。S36(為述於US 7,544,678中之苯并噻氮呯)係用作為對照組。如所示，化合物1於100 nM濃度下可防止穩鈣結合蛋白2自PKA磷酸化RyR2解離及/或促使穩鈣結合蛋白2(再)結合至PKA磷酸化RyR。

如圖1B中所示，在前述穩鈣結合蛋白2再結合試驗中進行測試時，亦發現以下代表性化合物可防止穩鈣結合蛋白2自PKA磷酸化RyR2解離，及/或促使穩鈣結合蛋白2(再)結合至PKA磷酸化RyR2(100 nM：化合物2、化合物3及化合物4)。

實例3：穩鈣結合蛋白1至PKA磷酸化RyR1之結合

以類似實例2之方式及如US專利申請公開案第2004/0224368號(該案內容係以引用的方式併入本文中)進一步所論述自骨骼肌肉製備SR膜。微粒體(50μg)之免疫轉漬如所闡述係利用抗穩鈣結合蛋白1抗體(Zymed)(1：1,000)進行。如實例2中所述顯影並量化該等轉漬。

圖1C繪示利用穩鈣結合蛋白抗體之免疫轉漬，顯示在不存在(Neg)或存在指定濃度之化合物1或化合物4下，穩鈣結合蛋白1會結合至PKA磷酸化RyR1。(Pos)：結合至非PKA磷酸化RyR1之穩鈣結合蛋白。S36係使用作為對照組。如所示，化合物1及化合物4係以劑量依賴方式防止穩鈣結合蛋白1自PKA磷酸化RyR1解離及/或促使穩鈣結合蛋白1(再)結合至PKA磷酸化RyR1，估算得EC50分別為約100 nM及150 nM。

實例4：在經異丙基腎上腺素處理小鼠中再結合至RyR1之穩鈣結合蛋白1

異丙基腎上腺素(為β腎上腺素能受體促效劑)會過度刺激β腎上腺素能受體而誘發小鼠心臟衰竭。與此同時引起的係PKA活化、RyR2於SR上磷酸化、及穩鈣結合蛋白2(FKBP12.6)對RyR2的相互作用減弱。在骨骼肌肉中會發生類似連串事件，其中RyR1被磷酸化，致使穩鈣結合蛋白1(FKBP12)至RyR1之結合減弱。

如國際公開案第WO2008/064264號(其內容以引用的方式併入本文中)中詳細論述，對野生型小鼠之長期性異丙基腎上腺素處理提供作為引起可輕易量化之RyR生物化學變化之快速且可靠的方法。該等變化包括增加的RyR磷酸化及同時減弱的穩鈣結合蛋白之結合。

動物及試劑

根據已核可的方案飼養並研究C57Bl/6小鼠。合成性β-腎上腺素能促效劑、異丙基腎上腺素(ISO)係獲自Sigma(I65627)且製成為100 mg/ml儲液(含於水中)。藉由添加蔗糖(1 mM)、二硫蘇糖醇(320 mM)、及1蛋白酶抑制劑錠劑(10×)至10 ml儲備溶液(10 mM HEPES、1 mM EDTA、20 mM NaF、2 mM Na₃VO₄)中製得裂解緩衝劑。

滲透泵準備及手術移植

通過皮下植入滲透輸注泵(Alzet微型滲透泵，型號2001，Durect Corporation，Cupertino，CA)，連續給小鼠輸注10 mg/ml異丙基腎上腺素(1 μl/hr)歷時5天。

就藥物裝載而言，豎直固定住滲透泵並由含過量藥物溶液(~250-300 μl)之1 ml針筒(附接至套管)將200 μl藥物溶液注入該泵中。向下慢慢注射該藥物溶液，同時慢慢提升該針筒，直至該泵裝填過量。排出流體溢流超過該泵時即確定該泵恰當地裝填。

依下述步驟以經皮下方式植入經裝載之滲透泵。在O₂下，以0.6 L/min速度投與1.5-2%異氟烷來麻醉小鼠接受者，且接著量測並記錄其體重。然後將小鼠以胸部朝下方式置於苯乙烯發泡體上，其臉部在鼻錐體中。毛皮被夾在後頸上，在耳後方延伸至頭頂。用70%酒精輕輕擦試該區域，然後於頭頸項/頸上進行中線小切口。用酒精擦洗縫合固定架，插入至該切口中，然後打開以使皮膚與皮下組織分開。為了容納該泵，此開口往後延伸至後軀。將經裝載之泵插入至該開口，且其釋離部位定位在遠離切口處，且容許置於具有最小張力之皮膚下方。藉由5.0尼龍線縫合封閉該切口，需要約5-6次縫合，然後用70%酒精輕輕擦拭該區域。於手術之後，將小鼠置於個別籠子中，以便將交感神經系統之損傷及可能激活減至最低。

骨骼肌肉分離

小鼠骨骼肌肉組織之分離如下。藉由切開踝處皮膚暴露腿部肌肉並向上拉起。以臺氏緩衝劑(Tyrode's buffer)(10 mM HEPES、140 mM NaCl、2.68 mM KCl、0.42 mM Na₂HPO₄、1.7 mM MgCl₂、11.9 mM NaHCO₃、5 mM葡萄糖、1.8 mM CaCl₂，藉由添加20 mg CaCl₂至由不含CaCl₂之10×溶液製成的100 ml 1×緩衝劑中製得)維持該組織呈潮濕狀態。接下來肌肉經分離並以液氮方式冷藏。分離趾長伸肌(EDL)係藉由在外側肌腱與由EDL及脛側肌腱形成之X之間插入剪刀、朝膝向上剪切；切開腓骨肌以暴露腓腸肌的扇形肌腱；在該X及該肌肉下方插入鑷子以疏鬆EDL肌腱；切開該EDL肌腱並拉起該肌肉；且最後進行切開來疏鬆該EDL。藉由自腓腸肌上部移去腓骨肌分離比目魚肌；藉由切開並拉起阿基裏氏肌腱(Achilles tendon)使該比目魚肌暴露在腓腸肌底側上；切開在膝後方肌肉上部處之比目魚肌；最後拉起該比目魚肌並自腓腸肌將其切下。分離脛骨係藉由自踝正面切開脛骨肌腱，向上拉起該肌腱，然後自該脛骨將其切下。藉由切開膝正上方的肌肉並移去肌束自兩腿分離出股肌(大腿肌肉)。以液氮方式冷藏該等樣本。

自組織溶胞產物之RyR1免疫沉澱

4℃下，將200-500 μg樣本均質液與含於0.5 ml改質RIPA緩衝劑(50 mM Tris-HCl(pH 7.4)、0.9% NaCl、5.0 mM NaF、1.0 mM Na3VO₄、0.5% Triton-X100、及蛋白酶抑制劑)中之2 μl抗RyR1抗體(Zymed)培養1.5小時，以自樣本中免疫沉澱出RyR1。接著於4℃下，用蛋白A瓊脂糖凝膠(sepharose)珠(Amersham Pharmacia Biotech，Piscatawy，NJ)培養該等樣本歷時1小時，於此之後，用冰冷RIPA洗滌該等珠3次。將該等樣本加熱至95℃，接著藉由SDS-PAGE(就穩鈣結合蛋白而言，15% SDS-PAGE)進行大小分級。於1：2,000稀釋下利用抗FKBP抗體(FKBP12/12.6，Jayaraman等人，J.Biol.Chem.1992；267：9474-77)顯影免疫轉漬。該等抗體係於5%乳或TBS-T(20 mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.5 M NaCl、0.05% Tween® 20、0.5% Triton X-100)中稀釋。

結果

如上述將含或不含測試化合物之含有異丙基腎上腺素的滲透泵植入小鼠中。小鼠係以滲透方式灌注唯一媒劑(DMSO/PEG)、唯一異丙基腎上腺素(ISO)(0.5 mg/kg/hr)、或異丙基腎上腺素(0.5 mg/kg/小時)與指定濃度之化合物1之組合歷時5天。在第6天，將各小鼠殺死，接著分離骨骼肌肉組織並用以分析RyR1免疫沉澱物中穩鈣結合蛋白1之結合。

化合物1對在經異丙基腎上腺素處理之小鼠分離的骨骼肌肉中促使穩鈣結合蛋白1結合至RyR1之效應繪示在圖2A(免疫轉漬)與2B(圖形量化)中。如所顯示，化合物1使得骨骼肌肉膜中結合至RyR1之穩鈣結合蛋白1含量增加至與藉由投與3.6 mM S36(另一苯并噻氮呯衍生物，經使用作為陽性對照組(WO2008/064264))所觀測到含量類似的含量。就化合物4而言，獲得類似結果(數據未顯示)。

實例5：化合物1於大鼠慢性缺血後心臟衰竭模型中之效應

目標

此研究目標係測試化合物1在缺血-再灌注誘發性心臟衰竭模型中減輕心臟功能障礙及減緩心室再塑之能力。

方法學

藉由缺血-再灌注(I/R)損傷技術，誘發雄性wistar大鼠(224-240 g，10-11週齡)產生慢性心臟衰竭。就I/R方案而言，將左前下行(left anterior descending；LAD)冠狀動脈阻塞1小時。再灌注後1週時開始藥物處理(5 mg/kg/天或10 mg/kg/天，含於飲用水中)且維持3個月研究期。相較於媒劑處理及進行假手術的動物，在治療開始後的第1、第2及第3個月藉由超聲心動圖、及在第3個月藉由侵入性血液動力學評估化合物1之藥效。亦分析心臟試樣來評估過度生長及膠原蛋白含量。在研究的最後一天，採集各大鼠血液以評估藥物血漿濃度，如圖3中所示。該研究設計繪示於圖3中。實驗以盲目方式進行。

統計方法

根據隨著時間所測得的參數，藉由運用重複測量之2因子ANOVA分析假手術組對媒劑組之比對及藥物處理之比對。基於犧牲及形態測量學下測得的參數，藉由t-試驗分析假手術組對媒劑組之比對及藉由1因子ANOVA及其後鄧恩(Dunnett)測試進行藥物處理之比對。

結果

媒劑處理的I/R動物相較於假手術的動物顯示，會增加左心室(LV)收縮末期(LV ESV)及舒張末期(LV EDV)容量(圖4A及B)、依減小的噴血分數(EF)(圖4C)所測得會降低心臟功能及會增加間質膠原蛋白含量(圖5D)。相較於媒劑，以5及10 mg/kg/天投與化合物1會顯著增加1至3月之EF及減低LVESV及LVEDV(圖4A-C)，以及減小間質膠原蛋白含量(圖5D)。

創傷性血液動力學研究(3個月時)顯示，以5及10 mg/kg/天化合物1處理之動物相較於媒劑組之LV dP/dt最大及LV dP/dt最小之保存率(圖6B與C)，當處理時之LV收縮壓在統計上無明顯變化(圖6A)。

於處理時未觀察到對體重(BW)、梗塞範圍或過度生長(LV體重)之效應(圖5A-C)。藥物血漿濃度繪示在圖7中。

該等結果顯示，如5 mg/kg/天般低濃度之化合物1對大鼠慢性缺血後心臟衰竭模型中之心臟收縮及舒張功能均可產生有益效果。

化合物1相較於化合物A(述於WO 2007/024717中之結構相關苯并噻氮呯衍生物)明顯且驚人地更具活性。如圖8中所顯示，在研究結束時相較於慢性缺血後心臟衰竭大鼠模型中之化合物1而言，化合物A於5 mg/kg/天濃度下投與3個月無法改善心臟收縮及舒張功能。因此，在大鼠CHF模型中以5 mg/kg/天劑量處理3個月觀察到化合物1但非化合物A之有益效果。

實例6：化合物1對小鼠肌肉萎縮模型(mdx)中肌肉機能之效應

目標

此研究目標係測試經以化合物1處理是否能改善肌縮蛋白缺陷小鼠模型(mdx)中之肌肉機能。

方法學

研究初始時，C57BL/10ScSn-DMD ^mdx/J(縮寫為mdx，n=5隻/組別)為6週齡且約20公克，小鼠在隨機分為接受媒劑(H₂O)或以隨意含於飲用水中方式投與之標靶劑量5 mg/kg/天、10 mg/kg/天、或50 mg/kg/天(實際劑量：7.9 mg/kg/天；12.8 mg/kg/天；及61.5 mg/kg/天，分別地，自每週所測得藥物溶液消耗量除以體重測得)之化合物1鈉鹽(以原型藥物的重量計；該鈉鹽在此實例後文中稱為「化合物1」)處理4週的組別之前，先熟悉轉輪籠歷時6天。將年齡相匹配之C57BL/6(縮寫為WT，n=4隻/組別)小鼠隨機分為接受媒劑(H₂O)或標靶劑量50 mg/kg/天(實際劑量：67.7 mg/kg/天)之化合物1鈉鹽處理的組別。

在前3週內測定自願轉輪活動、體重、及平均水消耗量。在處理4週後，於研究結束時，量測專項肌肉力。

24小時期間所運動的距離(Km/天)經分析作為改善的功能性活動的指標(參見，http://www.treat-nmd.eu/下之DMD_M.2.1.002 SOP)。在研究結束時，分離趾長伸肌(extensor digitorum lomgus；EDL)用於如下文進一步論述的肌肉力分析。在研究結束時(於黑暗週期結束時-約早上7時)，藉由眼窩採血技術採集各小鼠血液以評估藥物血漿濃度。實驗係盲目試驗。

力的測量

於研究結束時，自後肢切下EDL肌肉，利用購自Aurora Scientific(Aurora，Ontario，Canada)之407A肌肉測試系統進行等長力分析。將6-0縫合線繫至各肌腱，且總體EDL肌肉(肌腱對肌腱)被傳送至經O₂/CO₂(95%/5%)鼓泡之臺式溶液(單位為mM：NaCl 121、KCl 5.0、CaCl₂ 1.8、MgCl₂、NaH₂PO₄、NaHCO₃ 24、及葡萄糖5.5)Ragnoti浴中。利用該等縫合線，一肌腱垂直繫至與力傳感器連接的不鏽鋼勾子。另一縫合之肌腱在下方夾鉗至Aurora系統之移動臂中。利用兩鉑電極間的電場刺激EDL肌肉而收縮。在各實驗開始時，調整肌肉長度以產生出最大力。利用增量的刺激頻率(5-250 Hz維持200 ms，於超閾限電壓下)觸發收縮來確定出力-頻率關係。在該等刺激之間，讓肌肉靜息~3分鐘。在力測量結束時，測得經縫合於Aurora系統中之肌腱除外EDL肌肉之長度(L_o)。接著自該系統移去EDL肌肉且在截割末端肌腱之後稱重並縫合。EDL肌肉接著以液氮方式冷藏。EDL肌肉重量除以EDL肌肉長度與哺乳動物肌肉密度常數1.056 mg/m³可算得EDL肌肉的橫截面積(mm²)(Yamada,T.等人之Arthritis and rheumatism 60：3280-3289)。為測定EDL專項力(kN/m²)，將絕對強直力除以EDL肌肉橫截面積。

統計方法

為了確定統計顯著性，利用student's t-試驗來進行兩組別間的比較。所有蒐集的數據均表示為平均值+/-平均值標準誤差(SEM)。

結果

測試化合物1增進mdx小鼠自願運動的能力。在使小鼠熟悉自發轉輪籠之後，藉由電腦24/7監測小鼠於自發轉輪上之活動性。3週內將蒐集的數據轉錄為每天所運動的距離。經10及50 mg/kg/天(標靶劑量)化合物1處理之mdx小鼠相較經唯一媒劑(H₂O)處理之mdx小鼠於轉輪上運動明顯具有較長的距離(P<0.001，自第1天至第19天)。早在處理開始後的第2-3天即觀察到處理效果，且維持於整個活動性監測期間。以經50 mg/kg/天化合物1處理之WT小鼠而言，未觀察到化合物1對運動距離的效應(圖9)。此外，如於EDL肌肉中所測之體外力測量值(圖10)，化合物1處理會以劑量依賴性方式增加mdx肌肉之專項力。經150 Hz之刺激頻率及高於50 mg/kg/天下處理之mdx小鼠顯示出專項肌肉力之統計會顯著性增加(P<0.05)。在WT小鼠中未觀察到化合物1處理對專項肌肉力之效應。

如圖11所顯示，化合物1處理不會影響體重。未觀察到水消耗量之劑量依賴性效應。針對於經5 mg/kg/天給藥之mdx小鼠而言，化合物1之清晨血液暴露量為(平均值±平均標準偏差)3.3±0.4μM，針對於經10 mg/kg/天給藥之mdx小鼠而言為10.7±0.9μM，針對於經50 mg/kg/天給藥之mdx小鼠而言為52.8±1.7μM及針對於經50 mg/kg/天給藥之WT小鼠而言為72.8±7.0μM。總之，該等結果顯示相較於經媒劑處理之對照組，於mdx小鼠(裘馨型肌肉萎縮(DMD)之鼠科模型)中，化合物1於10 mg/kg/天及50 mg/kg/天(標靶劑量)下之處理在3週後會增進自願轉輪運動及4週後增加專項肌肉力，因而證實本文所主張的化合物1及其類似物於治療肌肉萎縮上之效用性。

實例7：代謝穩定性

將根據本發明代表性Rycal^TM之化合物1及述於WO 2007/024717中之結構相關性苯并噻氮呯衍生物的化合物B及化合物C之代謝穩定性作比較。

A. 人肝微粒體中之代謝穩定性

方法：

化合物溶解度：於DMSO中製得儲備溶液，及於含1 mg/ml BSA之水中製得工作溶液。

代謝生物可利用率之預測：代謝生物可利用率預測值(MF%)係以假定全吸收之肝微粒體之體外代謝穩定性量度為基礎。簡言之，完整藥物係於NADPH(1mM)存在下，以大鼠及人肝微粒體(0.33 mg蛋白質/ml)培養(10^-7M)培養0、5、15、30及60分鐘之後，藉由LC-MS-MS量化。以甲醇(v/v)終止酵素反應且藉由離心沉澱蛋白質。以ml/分鐘/1 g蛋白質表示之體外內在清除率(Clint_小鼠)係完整藥物殘餘濃度對培養時間之斜率(於LN線性化之後)。接著，利用0.045 mg蛋白質/1 kg肝臟及就大鼠而言肝臟重量為11 g及就人而言為1.2 kg，將體外Clint擴大規模至體內全身(體內Clint)。體內Clint接著係利用充分攪拌的模型(HepCl=體內Clint*HBF/(體內Clint+HBF)變換為肝清除率(HepCl)，其中就大鼠而言測得HBF(肝血流量)為22 ml/min及就人而言為1500 ml/分鐘。然後利用隨後的公式(MF%=1-HepCl/HBF)自攝取率推導出MF%。該等結果示於表1中：

B.大鼠及人肝臟肝細胞中之代謝穩定性

化合物溶解度：於DMSO中製得儲備溶液，及於含1/10大鼠血漿或1/4人血漿之William培養基中製得工作溶液。

代謝穩定性測定：化合物以10^-7 M於37℃下與分離肝細胞(針對大鼠肝細胞而言，6E+5個細胞/ml，及針對人肝細胞而言，4E+5個細胞/ml)一起培養於自相同物種之經Wiliam氏培養基稀釋(針對大鼠而言，1/10稀釋及針對人而言，¼稀釋)之血漿中。取樣時間在第0、10、20、30、60及120分鐘時進行且利用甲醇(v/v)終止酵素反應。藉由離心沉澱蛋白質且藉由LC/MS/MS分析上清液。以ml/分鐘/g蛋白質表示之Clint針對肝微粒體而言，針對於人4E+5個細胞/ml係用0.134 mg蛋白質/ml，而針對於大鼠6E+5個細胞/ml係用0.201 mg蛋白質/ml之比率算得。於各樣本之分析期間藉由LC/MS/MS校驗參照藥物及可能代謝產物之存在。該等結果示於表2中：

C.小鼠及大鼠微粒體中之代謝穩定性

材料及方法

稀釋緩衝液：0.1M Tris HCl緩衝劑，pH 7.4，含有5 mM EDTA。

NADPH輔因子溶液：將0.429 mL NADPH-再生溶液A及0.079 mL NADPH-再生溶液B添加至含有2.79 mL稀釋緩衝液之50 mL falcon管中。

微粒體製劑：(1.5 mg/mL溶液)於37℃下，將含有3.32 mL稀釋緩衝液之50 mL falcon管預熱15分鐘(至少10分鐘)。將0.178 mL微粒體(24.6 mg/mL)添加至該經預熱之稀釋緩衝液。該微粒體製劑之蛋白質濃度為1.25 mg/mL。

試樣(測試化合物)-初始及中間儲備溶液：製得測試化合物於甲醇中之1 mg/mL(就化合物1而言使用0.5 mg/mL)溶液。自初始儲備溶液之測試化合物之100 μM中間溶液係使用該稀釋緩衝液製得。使用稀釋緩衝液稀釋該100 μM中間溶液製得5 μM溶液。

實驗：

(該等實驗係在1.5 mL微量型微量離心管中進行)

0分鐘時的培養。程序：

a.添加100 μL之經預熱微粒體

b.添加50 μL之測試化合物之5 μM溶液。

c.添加500 μL之冷終止溶液(冰冷甲醇)

d.添加100 μL之NADPH輔因子溶液至該微量離心管。

a.將該微量離心管漩渦混合。

「t」分鐘時的培養

b.添加100 μL之NADPH輔因子溶液至該微量離心管。

c.添加50 μL之測試化合物之5 μM溶液。

d.添加100 μL之經預熱的微粒體

e.於37℃ 300 rpm下在恒溫混勻器(thermomixer)上培養該微量離心「t」分鐘。

f.自恒溫混勻器移去該微量離心管

g.添加500 μL冷終止溶液(冰冷甲醇)

h.將該微量離心管漩渦混合。

經「0」及「t」分鐘培養之兩者樣本於15,000 rcf在4℃下離心15 分鐘。移去500 μL上清液並使其經歷LC/MS分析(SIM-選擇性離子監測)。

結果表示成測試化合物殘餘%=(「t」分鐘時樣本之MS面積相應值(MS Area response)/「0」分鐘時樣本之MS面積相應值) * 100。所用的MS面積雙重複注射之平均值。

各測試化合物之時間點=0、15、30及60分鐘

陽性對照組：

2 μM丙咪嗪(Imipramine)-5分鐘及2 μM丙咪嗪-15分鐘培養係作為用於大鼠及小鼠肝微粒體穩定性實驗之陽性對照組。

該等結果示於表3中：

驚人地，根據表1-3可見，化合物1於小鼠、大鼠及人微粒體、及大鼠及人肝細胞中相較揭示於WO 2007/024717中之結構類似的化合物B及C而言明顯更為穩定，已發現此兩種化合物於測試系統中咸具有不良的體外代謝穩定性，使得該等化合物不適於作為藥物候選之開發。驚人且出人意料地，先前技術化合物中以COOH部分置換H或OH部分而成為化合物1，其在所有測試系統中均展現出高代謝穩定性。化合物1相較其結構類似物而言增加的代謝穩定性的確驚人，且證實該化合物優於相關技藝中所熟知化合物之意外效益。

本文中引用的所有公開案、參考文獻、專利案及專利申請案全文在如假若明確且分別指明各個別的申請案、專利案或專利申請案全文以引用的方式併入之該相同程度上以引用方式併入。

具體實施例之前述說明將如此全面地呈現本發明之一般本質，以致他人可在不需過度實驗且不脫離一般概念下應用現有知識簡單地改動及/或修改該等具體實施例之不同申請案，且因此，該等修改及改動應該並意圖在所揭示實施例等效物的含義及範圍內理解。咸應明瞭用於本文中的行語(phraseology)或術語(terminology)係為達說明之目的而非限制。用於實施各種不同所揭示功能之該等方法、材料、及步驟可在不脫離本發明下採用多種替代形式。

Claims

一種結構式(I)表示之化合物：及其醫藥可接受鹽，其中R為COOH。
如請求項1之化合物，其係呈與醫藥可接受酸或鹼之鹽形式。
如請求項2之化合物，其中該鹽係選自由鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、半富馬酸鹽、鹽酸鹽及氫溴酸鹽組成之群，較佳地，其中該鹽為鈉鹽或半富馬酸鹽。
如請求項1之化合物，其係選自由以下組成之群：
如請求項1之化合物或其醫藥可接受鹽，該化合物由結構式(1)表示：
如請求項5之化合物，其係呈與醫藥可接受酸或鹼之鹽形式。
如請求項6之化合物，其中該鹽係選自由鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、半富馬酸鹽、鹽酸鹽及氫溴酸鹽組成之群。
如請求項7之化合物，其中該鹽為鈉鹽。
如請求項7之化合物，其中該鹽為半富馬酸鹽。
一種醫藥組合物，其包括併與一或多種醫藥可接受賦形劑或載劑組合之如請求項1至9中任一項之化合物。
如請求項10之醫藥組合物，其係用於治療或預防選自由以下組成之群之病況：心臟病症及疾病、肌肉疲勞、肌肉骨骼病症及疾病、CNS病症及疾病、認知障礙、神經肌肉病症及疾病、骨骼病症及疾病、癌症惡病質、惡性發熱、糖尿病、心源性猝死、及嬰兒猝死綜合症，或用於改善認知功能。
一種方法，其治療或預防選自由以下組成之群之病況：心臟病症及疾病、肌肉疲勞、肌肉骨骼病症及疾病、CNS病症及疾病、認知障礙、神經肌肉病症及疾病、骨骼病症及疾病、癌症惡病質、惡性發熱、糖尿病、心源性猝死、及嬰兒猝死綜合症，或用於改善認知功能，該方法包括對有此需要的個體投與治療有效量之如請求項1至9中任一項之化合物、或根據請求項10之醫藥組合物來實施該治療之步驟。
如請求項10之用於治療或預防如請求項11之病況之醫藥組合物、或如請求項12之方法，其中該病況與雷諾定受體1(ryanodine receptor；RyR1)、雷諾定受體型2(RyR2)、雷諾定受體型3(RyR3)、或其組合之異常功能具有相關性。
如請求項10之用於治療或預防如請求項11之病況之醫藥組合物、或如請求項12之方法，其中該等心臟病症及疾病係選自由以下組成之群：不規則心跳病症及疾病，諸如選自由心房及心室節律不整、心房及心室纖維性顫動、心房及心室頻脈心律不整、心房及心室性心跳過速、兒茶酚胺能性多形性室性心動過速(CPVT)、及其運動誘發的變化組成之群之不規則心跳病症及疾病；運動誘發的不規則心跳病症及疾病；心臟衰竭；充血性心臟衰竭；慢性心臟衰竭；急性心臟衰竭；收縮性心臟衰竭；舒張性心臟衰竭；急性失償型心臟衰竭；心臟缺血/再灌注(I/R)損傷；慢性阻塞性肺病；於治療心肌梗塞(MI)之冠狀動脈血管成形術或血栓溶解術之後之I/R損傷；及高血壓。
如請求項10之用於如請求項11之治療或預防之醫藥組合物、或如請求項12之方法，其中該肌肉疲勞係因骨骼肌肉疾病、病症或病況所致。
如請求項10之用於如請求項11之治療或預防之醫藥組合物、或如請求項12之方法，其中該肌肉骨骼病症、疾病或病況係選自由以下組成之群：運動誘導的骨骼肌肉疲勞；因長時間運動或高強度運動所致之運動誘導的肌肉疲勞；先天性肌肉病變；肌肉萎縮，諸如裘馨型(Duchenne)肌肉萎縮(DMD)、貝克型(Becker)肌肉萎縮(BMD)、肢-帶型肌肉萎縮(LGMD)、顏面肩胛肱骨型萎縮、肌強直性肌肉萎縮、先天性肌肉萎縮(CMD)、遠端型肌肉萎縮、Emery-Dreifuss型肌肉萎縮、及眼咽型肌肉萎縮；脊髓型肌肉萎縮症(SMA)、脊髓及延髓型肌肉萎縮症(SBMA)、與老化相關之肌肉疲勞；肌少症、中央軸空病；癌症惡病質；膀胱病症；及尿失禁。
如請求項10之用於如請求項11之治療或預防之醫藥組合物、或如請求項12之方法，其中該等CNS病症及疾病係選自由阿茲海默氏症(Alzheimer's Disease；AD)、神經病變、癲癇發作、帕金森氏症(Parkinson’s Disease；PD)、及亨丁頓氏症(Huntington’s Disease；HD)組成之群；及該等神經肌肉病症及疾病係選自由脊髓小腦共濟失調(SCA)、及肌萎縮性側索硬化症(ALS，魯蓋瑞氏症(Lou Gehrig's disease))組成之群。
如請求項10之用於如請求項11之治療或預防之醫藥組合物、或如請求項12之方法，其中該認知障礙係與壓力相關或與老化相關，或其中待改善之該認知功能為短期記憶、長期記憶、注意力或學習，或其中該認知障礙係與選自由以下組成之群之疾病或病症相關：阿茲海默氏症(AD)、注意力缺乏過動症(ADHD)、自閉症系列障礙(ASD)、廣泛性焦慮症(GAD)、強迫症(OCD)、帕金森氏症(PD)、創傷後壓力症(PTSD)、精神分裂症、躁鬱症、及重度憂鬱症。
如請求項10之用於如請求項11之治療或預防之醫藥組合物、或如請求項12之方法，其中該病況較佳係因具有骨轉移之癌症所致之癌症惡病質。
如請求項10之用於如請求項11之治療或預防之醫藥組合物、或如請求項12之方法，其中該化合物係使用足以恢復或促進穩鈣結合蛋白2(calstabin 2)結合至RyR2之劑量。
如請求項10之用於如請求項11之治療或預防之醫藥組合物、或如請求項12之方法，其中該化合物係使用足以恢復或促進穩鈣結合蛋白1結合至RyR1之劑量。
如請求項10之用於如請求項11之治療或預防之醫藥組合物、或如請求項12之方法，其中該化合物係使用足以在通過RyR通道時減低Ca²⁺洩漏之劑量。
如請求項1至9中任一項之化合物或其鹽，其係用於治療或預防選自由以下組成之群之病況：心臟病症及疾病、肌肉疲勞、肌肉骨骼病症及疾病、CNS病症及疾病、認知障礙、神經肌肉疾病及病症、骨骼病症及疾病、癌症惡病質、惡性發熱、糖尿病、心源性猝死、及嬰兒猝死綜合症，或用於改善認知功能。
如請求項10之用於如請求項11之治療或預防之醫藥組合物、或如請求項12之方法，其進一步包括使用對所關注mRNA中之接合序列具特異性之反義寡核苷酸(AO)，來促進該所關注mRNA中之外顯子跳躍。
如請求項24之醫藥組合物，其係用於治療裘馨型肌肉萎縮(DMD)，其中該反義寡核苷酸(AO)對DMD基因之至少一個外顯子之接合序列、較佳DMD基因之外顯子23、45、44、50、51、52及/或53之接合序列具特異性。
一種治療患有裘馨型肌肉萎縮(DMD)之個體之方法，該方法包括對該個體併與對DMD基因至少一個外顯子之接合序列、較佳 DMD基因之外顯子23、45、44、50、51、52及/或53之接合序列具特異性之反義寡核苷酸(AO)組合投與如請求項1至9中任一項之化合物或如請求項10之醫藥組合物之步驟。
一種製備如請求項1至9中任一項之化合物的方法，該方法包括步驟：使下式之化合物與下式之化合物反應其中R^a為COOR¹或CN；R¹為C₁-C₄烷基，及L為離去基團，以提供下式之化合物：；且基團R^a轉化為基團R以提供式(I)之化合物。