ES2934319T3 - Métodos y composiciones para el tratamiento de la atrofia muscular, la debilidad muscular y/o la caquexia - Google Patents

Métodos y composiciones para el tratamiento de la atrofia muscular, la debilidad muscular y/o la caquexia Download PDF

Info

Publication number
ES2934319T3
ES2934319T3 ES14826845T ES14826845T ES2934319T3 ES 2934319 T3 ES2934319 T3 ES 2934319T3 ES 14826845 T ES14826845 T ES 14826845T ES 14826845 T ES14826845 T ES 14826845T ES 2934319 T3 ES2934319 T3 ES 2934319T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
stat3
muscle
mice
cachexia
dihydroxy
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES14826845T
Other languages
English (en)
Inventor
David Tweardy
Moses Kasembeli
Marvin Xu
Thomas Eckols
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baylor College of Medicine
Original Assignee
Baylor College of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baylor College of Medicine filed Critical Baylor College of Medicine
Application granted granted Critical
Publication of ES2934319T3 publication Critical patent/ES2934319T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D333/30—Hetero atoms other than halogen
    • C07D333/34—Sulfur atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/145—Amines having sulfur, e.g. thiurams (>N—C(S)—S—C(S)—N< and >N—C(S)—S—S—C(S)—N<), Sulfinylamines (—N=SO), Sulfonylamines (—N=SO2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/18—Sulfonamides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/357—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having two or more oxygen atoms in the same ring, e.g. crown ethers, guanadrel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/38—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom
    • A61K31/381—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom having five-membered rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/4035—Isoindoles, e.g. phthalimide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4196—1,2,4-Triazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/428—Thiazoles condensed with carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4406—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof only substituted in position 3, e.g. zimeldine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/45—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cycloheximide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4704—2-Quinolinones, e.g. carbostyril
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4709—Non-condensed quinolines and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/06—Anabolic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/01—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C311/02—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C311/08—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/01—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C311/10—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of a saturated carbon skeleton containing rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/01—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C311/12—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton containing rings
    • C07C311/13—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton containing rings the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/15—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C311/21—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/22—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C311/23—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound oxygen atoms having the sulfur atoms of the sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C311/24—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound oxygen atoms having the sulfur atoms of the sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/22—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C311/29—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound oxygen atoms having the sulfur atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/30—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/37—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups having the sulfur atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C311/38—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups having the sulfur atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring having sulfur atoms of sulfonamide groups and amino groups bound to carbon atoms of six-membered rings of the same carbon skeleton
    • C07C311/44—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups having the sulfur atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring having sulfur atoms of sulfonamide groups and amino groups bound to carbon atoms of six-membered rings of the same carbon skeleton having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/23—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/46—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton having at least one of the nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, further bound to other hetero atoms
    • C07C323/49—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton having at least one of the nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, further bound to other hetero atoms to sulfur atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C381/00—Compounds containing carbon and sulfur and having functional groups not covered by groups C07C301/00 - C07C337/00
    • C07C381/06—Compounds containing sulfur atoms only bound to two nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D213/70—Sulfur atoms
    • C07D213/71—Sulfur atoms to which a second hetero atom is attached
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/36—Sulfur atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings
    • C07D231/10—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D231/14—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D231/18—One oxygen or sulfur atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D319/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D319/10—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes
    • C07D319/14—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D319/16—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring
    • C07D319/18—Ethylenedioxybenzenes, not substituted on the hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/14—The ring being saturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2602/00—Systems containing two condensed rings
    • C07C2602/02—Systems containing two condensed rings the rings having only two atoms in common
    • C07C2602/04—One of the condensed rings being a six-membered aromatic ring
    • C07C2602/10—One of the condensed rings being a six-membered aromatic ring the other ring being six-membered, e.g. tetraline
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Heat Sensitive Colour Forming Recording (AREA)
  • Compression Or Coding Systems Of Tv Signals (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Las realizaciones de la invención incluyen métodos para tratar, prevenir y/o reducir el riesgo o la gravedad de una afección seleccionada del grupo que consiste en atrofia muscular, debilidad muscular, caquexia y una combinación de las mismas en un individuo que lo necesite. En algunas realizaciones, se emplean moléculas pequeñas particulares para el tratamiento, la prevención y/o la reducción del riesgo de atrofia muscular. En al menos casos particulares, las moléculas pequeñas son inhibidores de STAT3. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para el tratamiento de la atrofia muscular, la debilidad muscular y/o la caquexia
Declaración con respecto a la investigación o el desarrollo con fondos federales
La presente invención se realizó con apoyo gubernamental en virtud de las P50 CA058183, K08 HL085018-01A2, P50 CA097007, R21 CA149783 y R41 CA153658, otorgadas por los National Institutes of Health. El gobierno de Estados Unidos tiene determinados derechos sobre la invención.
Campo técnico
La presente invención se refiere en general al menos a los campos de la biología celular, la biología molecular y la medicina.
Antecedentes de la invención
La atrofia muscular es una complicación debilitante de afecciones catabólicas, incluyendo insuficiencia renal crónica (IRC), diabetes, cáncer o infecciones graves. Lamentablemente, existen pocas estrategias confiables que bloqueen la pérdida de proteína muscular iniciada por estas afecciones. Anteriormente, se encontró que la miostatina, un regulador negativo del crecimiento muscular, aumenta en los músculos de ratones con IRC y, cuando la miostatina se inhibe con un pepticuerpo de miostatina "humanizado", se bloqueaba la atrofia muscular inducida por IRC (Zhang et al., 2011a). Se llegó a una conclusión similar en estudios de modelos de caquexia por cáncer en ratones (Zhou et al., 2010). En los ratones con IRC, la inhibición de la miostatina redujo los niveles circulantes de IL-6 y TNFa, lo que sugiere un vínculo entre la inflamación y la atrofia muscular según se informó en estudios clínicos (Carrero et al., 2008; Hung et al., 2011). La evidencia de que la inflamación estimula la atrofia muscular incluye informes de que la infusión de TNFa, IL-6, IL-1p o IFN-y en roedores produce atrofia muscular, mientras que la neutralización de citocinas usando estrategias genéticas o farmacológicas atenúa la atrofia muscular (Cheung et al., 2010). Por ejemplo, se trataron roedores con una infusión constante de angiotensina II (Ang II) y se encontró que había atrofia muscular más niveles circulantes aumentados de IL-6 y expresión aumentada de SOCS3 con señalización de insulina/IGF-1 suprimida; la inactivación de IL-6 de los ratones suprimió la atrofia muscular inducida por Ang II (Zhang et al., 2009; Rui et al., 2004; Rui et al., 2002).
Las respuestas a IL-6 o IFNy implican la estimulación de las rutas de señalización intracelular, incluyendo la activación de las proteínas tirosina cinasas (JAK) Janus. Posteriormente, las JAK median la fosforilación de tirosina de los factores transductores de señales y activadores de la transcripción (STAT) seguida de su dimerización, translocación nuclear y activación de genes diana (Horvath, 2004). Entre los siete miembros de la familia Stat, Stat3 es el miembro principal que se activa por la familia de citocinas IL-6 (Hirano et al., 1997; Kishimoto et al., 1994). Recientemente, Bonetto et al. informaron de los resultados de un análisis en micromatriz de músculos de ratones con caquexia inducida por cáncer. Los componentes de 20 rutas de señalización se regularon por aumento, incluyendo IL-6, Stat3, JAK-STAT, SOCS3, el complemento y las rutas de coagulación. Por lo tanto, la vía de Stat3 podría estar vinculada con la pérdida de masa muscular, pero se desconoce la ruta desde Stat3 hasta la atrofia muscular.
Una posible diana de Stat3 activado es C/EBP8. Los factores de transcripción C/EBP (C/EBP-a, -p, -y, -8, -u> y -Z) se expresan en varios tejidos y actúan regulando los procesos inflamatorios y metabólicos (Ramji y Foka, 2002). C/EBP-p o -8 pueden estimular la señalización intracelular en hepatocitos o células inflamatorias (Poli, 1998; Akira et al., 1990; Alonzi et al., 1997) y en ratones que respondieron a un exceso de glucocorticoides, la expresión y la actividad de unión de C/EBP-p y -8 en el músculo aumentan (Penner et al., 2002; Yang et al., 2005).
Una realización que incluye C/EBP8 implica una expresión de miostatina aumentada porque el promotor de miostatina contiene sitios de reconocimiento para los receptores de glucocorticoides, factores de transcripción Forkhead, así como miembros de la familia de factores de transcripción C/EBP (Ma et al., 2003; Allen y Unterman, 2007). En la presente divulgación, se identifica una ruta de señalización intracelular en miotubos cultivados que cierra las brechas entre p-Stat3 y la miostatina y la pérdida de masa muscular. Para examinar si la ruta era funcional in vivo, se estudió el modo en que dos afecciones catabólicas, IRC o la diabetes aguda inducida por estreptozotocina afectaba al metabolismo muscular en un ratón con inactivación (KO) de Stat3 específica de músculo. También se sometió a prueba si un inhibidor micromolecular de la fosforilación de Stat3 corregiría la atrofia muscular. La interrupción de Stat3 mejoró el metabolismo muscular y la fuerza en ratones con IRC y se recopilaron evidencias de la ruta en biopsias musculares de pacientes con IRC.
La presente divulgación satisface una necesidad en la técnica de proporcionar compuestos y métodos novedosos para tratar y/o prevenir la atrofia muscular o caquexia en individuos.
Santos Silva et al. (The FASEB journal, vol. 27 n.° 1 Suplemento 793.4) analizan una nueva estrategia terapéutica para bloquear la caquexia por cáncer: centrarse en la inhibición de STAT3.
Mak et al. (J Cachexia Sarcopenia Muscle (2011) 2:9-25) analizan la atrofia en la insuficiencia renal crónica.
Sumario de la invención
En un aspecto, la presente invención proporciona una composición para su uso en un método de tratamiento de una afección seleccionada del grupo que consiste en debilidad muscular, atrofia muscular, caquexia, y una combinación de las mismas en un individuo que tiene atrofia muscular o caquexia o que está en riesgo de tener atrofia muscular o caquexia; en donde dicha afección es el resultado de insuficiencia renal crónica subyacente; en donde dicha composición se selecciona del grupo que consiste en N-(1',2-dihidroxM,2-binaftalen-4'-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(3,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(4,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(5,1-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(6,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(7,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(8,1-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, 4-bromo-N-(1,6'-dihidroxi-[2,2']binaftalenil-4-il)-bencensulfonamida y combinaciones de las mismas; en donde dicho método comprende la etapa de proporcionar al individuo una cantidad eficaz de una o más de dichas composiciones.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición seleccionada del grupo que consiste en N-(3,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(4,1-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(5,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(6,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(7,1-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, N-(8,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida y 4-bromo-N-(1,6'-dihidroxi-[2,2']binaftalenil-4-il)-bencensulfonamida.
Las realizaciones de la invención incluyen composiciones para su uso en el tratamiento de atrofia muscular (que puede producirse como debilitamiento, reducción y/o pérdida de músculo provocada por enfermedad, la edad o la falta de uso) y/o debilidad muscular y/o caquexia. La afección subyacente es el resultado de insuficiencia renal crónica subyacente y puede o no ser conocida. En realizaciones específicas, la atrofia muscular y/o la debilidad muscular pueden ser parte de la caquexia, y la caquexia también puede tratarse con composiciones de la invención.
Realizaciones de la invención incluyen composiciones para su uso en el tratamiento de debilidad muscular y/o atrofia muscular y/o caquexia en un individuo que tiene atrofia muscular o caquexia o que está en riesgo de tener atrofia muscular o caquexia, de modo que puede saberse que el individuo tiene debilidad muscular y/o atrofia muscular y/o caquexia, se sospecha que tiene debilidad muscular y/o atrofia muscular y/o caquexia, o está en riesgo de tener debilidad muscular y/o atrofia muscular y/o caquexia. Las composiciones incluyen moléculas pequeñas como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el individuo está recibiendo un tratamiento adicional para una afección subyacente que está relacionada con (y puede ser la causa directa o indirecta de) la debilidad muscular y/o la atrofia muscular y/o la caquexia y/o el individuo está recibiendo un tratamiento adicional para la debilidad muscular y/o la atrofia muscular y/o la propia caquexia.
En realizaciones de la invención, la composición es para su uso en un método en el que a un individuo se le administra más de una dosis de una o más composiciones descritas en el presente documento. La pauta posológica puede separarse en el tiempo por minutos, horas, días, meses o años.
Las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de un individuo que tiene al menos un síntoma de una afección seleccionada de atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas, o está en riesgo de tener una afección seleccionada de atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas al tener una afección subyacente, que puede tener una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas como parte de la afección subyacente o como un componente secundario de la afección subyacente, de modo que la afección subyacente es IRC.
La administración de la composición de la invención puede realizarse por cualquier vía adecuada, incluyendo sistémica o local, aunque en algunas realizaciones específicas, la vía de administración es oral, intravenosa, tópica, subcutánea, intraarterial, intraperitoneal, bucal, por aerosol, por inhalación, etc., por ejemplo.
En algunas realizaciones de la invención, las composiciones de la invención son útiles para tratar una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas y, en casos específicos, dicho tratamiento se produce inhibiendo la actividad de Stat3 y/o Stat1. En determinadas realizaciones, las composiciones inhiben Stat3, pero no inhiben Stat1. En realizaciones particulares, las composiciones no inhiben Stat3 o Stat1. En algunas realizaciones, los compuestos de la invención interactúan con el dominio SH2 de Stat3, inhiben competitivamente la unión de Stat3 recombinante a su ligando peptídico con pY inmovilizado y/o inhiben la fosforilación de la tirosina de Stat3 mediada por IL-6, por ejemplo. En realizaciones particulares, las composiciones de la invención cumplen los criterios de análisis de interacción (CIA): 1) puntuación de energía mínima global <-30; 2) formación de un puente salino y/o de una red de puentes de H dentro del sitio de unión al residuo pY de Stat3; y/o 3) formación de un puente de H con o bloqueo del acceso al hidrógeno de la amida del E638 de Stat3, por ejemplo. En algunas realizaciones, la composición o las composiciones interactúan con una cavidad de unión hidrófoba con el dominio SH2 de Stat3.
En una realización específica de la invención, hay una composición para su uso en un método de tratamiento de una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas en un individuo que tiene atrofia muscular o caquexia o que está en riesgo de tener atrofia muscular o caquexia, en donde dicha afección es el resultado de insuficiencia renal crónica subyacente; en donde dicha composición se selecciona del grupo que consiste en N-(1',2-dihidroxi-1,2'-binaftalen-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(3,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(4,1-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(5,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(6,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(7,1-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(8,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, 4-bromo-N-(1,6'-dihidroxi-[2,2'] binaftalenil-4-il)-bencensulfonamida y una mezcla de las mismas; en donde dicho método comprende la etapa de proporcionar al individuo una cantidad eficaz de una o más de dichas composiciones.
En realizaciones de la invención, hay una composición seleccionada del grupo que consiste en N-(3,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(4,1-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(5,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(6,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(7,1-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, N-(8,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida y 4-bromo-N-(1,6'-dihidroxi-[2,2']binaftalenil-4-il)-bencensulfonamida. La composición puede estar comprendida en una formulación farmacéutica. La composición puede estar compuesta de un vehículo. La composición puede estar compuesto de otra composición terapéutica, tal como una composición terapéutica para una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas. La composición puede estar comprendida en un disolvente adecuado. La composición puede estar comprendida en un disolvente y/o polietilenglicol (PEG). En realizaciones específicas, el disolvente es Labrasol® (glicéridos EP de caprilcaproil macrogol-8; glicéridos NF de caprilcaproil polioxilo-8; glicéridos caprílicos/cápricos de PEG-8 (FDA IIG de EE. UU.), agua, etanol, glicerina, propilenglicol, alcohol isopropílico, metanol, acetona, isopropanol, acetonitrilo, t-butanol, n-hexano, ciclohexano, etc. En realizaciones específicas, el PEG es PEG-200, PEG-300 o PEG-400. En casos particulares, la composición se formula en un 60 % de Labrasol® y un 40 % de PEG-400. La composición puede estar comprendida en un comprimido, cápsulas de gelatina blandas, etc.
Cada una de las figuras adjuntas se proporciona con fines ilustrativos y descriptivos únicamente y no pretende ser una definición de los límites de la presente invención.
Descripción de los dibujos
En la medida en que los dibujos se refieren a compuestos no definidos en las reivindicaciones, se proporcionan con fines de referencia.
La figura 1 muestra la inhibición de la unión de Stat3 al ligando fosfopeptídico inmovilizado por los compuestos. La unión de Stat3 recombinante (500 nM) a un chip sensor de BiaCore recubierto con un fosfododecapéptido basado en la secuencia de aminoácidos que rodea a Y1068 dentro del EGFR se midió al instante por RPS (unidades de respuesta) en ausencia (0 j M) o en presencia de concentraciones crecientes (de 0,1 a 1.000 j M) de Cpd3 (panel A) , Cpd30 (panel B), Cpdl88 (panel C), Cpd3-2 (panel D), Cpd3-7 (panel E) y Cpd30-12 (panel F). Los datos mostrados son representativos de 2 o más experimentos. Los niveles de unión en equilibrio obtenidos en ausencia o presencia de compuestos se normalizaron (respuesta obtenida en presencia del compuesto la respuesta obtenida en ausencia del compuesto x 100) y se representaron gráficamente frente al logaritmo de la concentración (nM) de los compuestos (panel G). Los puntos experimentales se ajustan a una curva de unión competitiva que usa una ecuación logística de cuatro parámetros (véanse los ejemplos de métodos para más detalles). Estas curvas se usaron para calcular la CI50 (tabla 1).
La figura 2 muestra la inhibición de la activación de Stat3 mediada por IL-6 por parte de los compuestos. Las células HepG2 se trataron previamente con DMSO solo o con DMSO que contenía Cpd3 (panel A), Cpd188 (panel B) , Cpd30 (panel C), Cpd3-2 (panel D), Cpd3-7 (panel E) o Cpd30-12 (panel F) a la concentración indicada durante 60 min. Las células se estimularon a continuación con IL-6 (30 ng/ml) durante 30 minutos. Los extractos de proteína de las células se separaron por SDS-PAGE, se transfirieron y se revelaron en serie con anticuerpos contra pStat3, Stat3 total y actina p. Las manchas de transferencia se desprendieron entre cada investigación de anticuerpos. Las intensidades de las bandas de inmunotransferencia se cuantificaron por densitometría. El valor de la intensidad de cada banda de pStat3 se dividió por cada valor correspondiente de la intensidad de la banda de Stat3 total, y los resultados se normalizaron al valor de control tratado con DMSO y se representaron gráficamente en función del logaritmo de la concentración del compuesto. Las curvas con mejor ajuste se generaron tomando como base un modelo logístico de 4 parámetros/un sitio de respuesta a la dosis/XLfit 4.2, IDBS. Cada panel es representativo de 3 o más experimentos.
La figura 3 proporciona fórmulas químicas y nombres de compuestos ilustrativos. Las fórmulas químicas y los nombres están indicados para Cpd3 (panel A), Cpd30 (panel B), Cpd188 (panel C), Cpd3-2 (panel D), Cpd3-7 (panel E) y Cpd30-12 (panel F).
La figura 4 muestra el efecto de los compuestos sobre la activación de Statl. Las células HepG2 se trataron previamente con DMSO solo o con DMSO que contenía cada uno de los compuestos a una concentración de 300 |jM durante 60 minutos. Las células se estimularon con IFN-y (30 ng/ml) durante 30 min. Los extractos de proteína de las células se separaron por SDS-PAGE y se inmunotransfirieron en serie con anticuerpos contra pStatl, Statl total y actina p. Las manchas de transferencia se desprendieron entre cada inmunotransferencia. Los resultados mostrados son representativos de 2 o más experimentos.
La figura 5 proporciona comparaciones de las secuencias de los dominios SH2 de Stat3 y Statl, de las estructuras tridimensionales y de las energías de Van der Waals de la unión del compuesto. La alineación de secuencias de los dominios SH2 de Stat3 y Statl se muestra en el panel A. Los residuos que se unen al residuo pY están resaltados y señalados con una flecha de trazo continuo, el residuo (E638) que se une al residuo 3 está resaltado y señalado con una flecha de trazo discontinuo y el buclepc-pD y el bucleaB-ac, que comprenden el sitio de unión hidrófobo del que consisten, están resaltados y señalados con flechas de trazo discontinuo punteado y trazo discontinuo, respectivamente. El panel B muestra una superposición de un modelo de superficie de Van der Waals de tubo y niebla del dominio SH2 de Stat3 y un modelo de superficie de Van der Waals de tubo y niebla del SH2 de Statl. Los residuos del dominio SH2 de Stat3 que representan el buclepc-pD están resaltados y se muestran con círculos de trazo punteado, y los residuos que representan el bucleaB-ac están resaltados y se muestran con un círculo de trazo discontinuo punteado; los residuos de bucle correspondientes dentro del dominio SH2 de Statl se muestran en una niebla ligera que rodea los círculos. Esta superposición se muestra unida por Cpd3-7, ya que se uniría al dominio SH2 de Stat3. Se calculó la energía de Van der Waals de cada compuesto unido al dominio SH2 de Statl o al dominio SH2 de Stat3, normalizada al valor de Statl y representada en el panel C.
La figura 6 muestra un modelo informático de cada compuesto unido por el dominio SH2 de Stat3. Se muestran los resultados del acoplamiento por ordenador al dominio SH2 de Stat3 para Cpd3 (panel A), Cpd30 (panel B), Cpd188 (panel C), Cpd3-2 (panel D), Cpd3-7 (panel E) y Cpd30-12 (panel F). La imagen a la izquierda de cada panel muestra la unión del compuesto a un modelo de relleno espacial del dominio SH2 de Stat3. El sitio de unión al residuo pY está representado por un círculo de trazo discontinuo, el sitio de unión al residuo 3 está representado por un círculo de trazo continuo, el bucle buclepc-pD está representado por un círculo de trazo punteado y el bucle bucleaB-ac está representado por un círculo de trazo discontinuo punteado. Los residuos R609 y K591 cruciales para la unión a pY se muestran dentro de un círculo de trazo discontinuo, el residuo E638 que se une el residuo 3 se muestra dentro de un círculo de trazo continuo, y el sitio de unión hidrófobo que consiste en el buclepc-pD y en el bucleaB-ac se muestra dentro de un círculo de trazo discontinuo punteado y de un círculo de trazo punteado, respectivamente. La imagen en el lado derecho de cada panel es una vista más cercana de esta interacción con los puentes de hidrógeno indicados por líneas de trazo punteado. En la figura 6A, el resto de ácido benzoico cargado negativamente de cpd3 tiene interacciones electrostáticas con el sitio de unión al residuo pY con carga positiva que consiste principalmente en el grupo catión guanidinio de R609 y el grupo amonio básico de K591. El grupo ácido benzoico también forma una red de puentes de hidrógeno que consiste en dobles puentes de H entre el oxígeno carboxílico y el hidrógeno del amonio de R609 y el hidrógeno de la amida de E612. La formación de puentes de H también se produce entre el oxígeno del carbonilo del ácido benzoico y el hidrógeno hidroxílico de la cadena lateral de la serina 611. Dentro del sitio de unión al residuo 3, el átomo de oxígeno de la 1,4-benzodioxina forma un puente de hidrógeno con el hidrógeno de la amida de E638. Además, la 2,3-dihidro-1,4-benzodioxina de cpd3 interactúa con los bucles que forman el sitio de unión hidrófobo. En la figura 6B, el extremo carboxílico del resto de ácido benzoico de cpd30, que está cargado negativamente en condiciones fisiológicas, forma un puente salino con el grupo guanidinio de R609 dentro del sitio de unión al residuo pY. Dentro del sitio de unión al residuo 3, el oxígeno del grupo tiazolidino forma un puente de H con el hidrógeno de la amida de la cadena principal peptídica de E638. Además, el resto de tiazolidina se sumerge en el sitio de unión hidrófobo. En la figura 6c existe una interacción electrostática entre el resto (carboximetil) tio de cpd188 que porta una carga negativa y el sitio de unión al residuo pY, que consiste en R609 y K591, que porta carga positiva en condiciones fisiológicas. Existen puentes de H entre el oxígeno del hidroxilo del grupo (carboximetil) tio de cpd188 y el hidrógeno del guanidinio de R609, entre el oxígeno del hidroxilo del grupo (carboximetil) tio y el hidrógeno de la amida de la cadena principal de E612, y entre el oxígeno del carboxilo del grupo (carboximetil) tio de cpd188 y el hidrógeno del hidroxilo de S611. Dentro del sitio de unión al residuo 3, existe un puente de H entre el oxígeno del hidroxilo del grupo ácido benzoico de cpd188 y el hidrógeno de la amida de E638. Además, el grupo ácido benzoico se extiende e interactúa con el sitio de unión hidrófobo. En la figura 6D, el grupo ácido benzoico de cpd3-2 tiene interacciones electrostáticas significativas con la cavidad del sitio de unión al residuo pY, aportado principalmente por R609 y K591, y forma dos puentes de H; el oxígeno carboxílico del grupo ácido benzoico se une al hidrógeno del guanidinio de R609, y el oxígeno del carbonilo del grupo ácido benzoico se une al hidrógeno del carbonilo de S611. Dentro del sitio de unión al residuo 3, el oxígeno dentro del grupo 1,3-dihidro-2H-inden-2-ilideno forma un puente de H con el hidrógeno de la amida de la cadena principal de e638. Además, el grupo 1,3-dihidro-2H-inden-2-ilideno se sumerge en el sitio de unión hidrófobo. En la figura 6E, los puentes de H se forman entre el oxígeno del carbonilo del resto 4-benzoato de metilo de cpd 3-7 y el guanidinio de la cadena lateral de R609 y entre el oxígeno del metoxi y el hidrógeno del extremo de amonio de K591. El grupo (2-metoxi-2-oxoetil)-4,8-dimetil-2-oxo-2H-cromeno de cpd3-7 bloquea el acceso al hidrógeno de la amida de E638 dentro del sitio de unión al residuo 3. Además, este grupo se sumerge en el sitio de unión hidrófobo. En la figura 6F existen interacciones electrostáticas entre el grupo derivado del ácido benzoico de Cpd30-12 y R609 y 591 dentro del sitio de unión al residuo pY. Además, los puentes de H se forman entre el oxígeno del hidroxilo de Cpd30-12 y el hidrógeno del guanidinio de R609, entre el oxígeno del carboxilo de Cpd30-12 y el hidrógeno del hidroxilo de S611, y entre el grupo furilo de Cpd30-12 y el hidrógeno del amonio de K591. Los grupos 1,3-dietil-4,6-dioxo-2-tioxotetrahidro-5(2H)-pirimidinilideno bloquean el acceso al sitio de unión del residuo 3; sin embargo, se extiende hacia el surco entre el sitio de unión al residuo pY y el buclepo-pD, evitando el sitio de unión hidrófobo.
La figura 7 muestra la inhibición de la translocación de citoplásmica a nuclear de Stat3 evaluada por microscopia de fluorescencia confocal y de alto rendimiento. En el panel A, las células MEF/GFP-Stat3 cultivadas en cubreobjetos se trataron previamente con DMSO que contenía (fila cuatro) o no contenía (fila tres) Cpd3 (300 j M) durante 60 minutos antes de estimularse sin (fila uno) o con IL-6 (200 ng/ml) e IL-6sR (250 ng/ml) durante 30 minutos (filas dos, tres y cuatro). Los cubreobjetos se examinaron mediante microscopia de fluorescencia confocal usando filtros para detectar la GFP (columna uno), el DAPI (columna dos) o ambos (combinación; columna tres). En el panel B, las células MEF-GFP-Stat3 se cultivaron en placas de 96 pocillos con fondos de vidrio óptico y se trataron previamente con el compuesto indicado a las concentraciones indicadas por cuadruplicado durante 1 hora y a continuación se estimularon con IL-6 (200 ng/ml) e IL-6sR (250 ng/ml) durante 30 minutos. Se fijaron las células y se examinaron las placas mediante microscopia de alto rendimiento para determinar la intensidad de fluorescencia en el núcleo (FLIN) y se calculó el % de AFLINMáx como se describe en el ejemplo 1. Los datos mostrados son la media ± DE y son representativos de 2 o más estudios. Las curvas con mejor ajuste se generaron basándose en un modelo logístico de 4 parámetros/un sitio de respuesta a la dosis/XLfit 4.2, IDBS y se usaron para calcular la CI50 (tabla 1).
La figura 8 muestra la inhibición de la unión al ADN de Stat3 por parte de los compuestos. Los ensayos de cambio de movilidad electroforética se realizaron usando extractos de células enteras preparados a partir de células HepG2 sin y con estimulación con IL-6 (30 ng/ml) durante 30 minutos. La proteína (20 jg ) se incubó con oligonucleótido doble radiomarcado (hSIE) y DMSO sin o con los compuestos indicados (300 uM) durante 60 minutos a 37 °C y a continuación se separó por PAGE. El gel se secó y se autorradiografió; se muestra la porción del gel correspondiente a la banda de hSIE unido a Stat3. Los datos mostrados son representativos de 2 estudios.
La figura 9 muestra Cpd3, Cpd30 y Cpd188 y la hidrofobia o hidrofilia de la superficie de la molécula. Las flechas de trazo discontinuo señalan superficies hidrófilas y las flechas de trazo continuo señalan superficies hidrófobas.
La figura 10 ilustra el compuesto ilustrativo 3 (Cpd3). La imagen superior izquierda de la figura 11 muestra el Cpd3 acoplado a Stat3 y la interacción entre el Cpd3 y la superficie de la proteína, y derivados de Cpd3 que pueden encajar en la superficie de la proteína. Las estrellas representan átomos y grupos químicos que pueden remplazarse por otros átomos o grupos químicos para crear uno o más derivados funcionales. Las superficies hidrófobas/hidrófilas de Cpd3 también se muestran en la imagen superior derecha. Las flechas de trazo discontinuo señalan superficies hidrófilas y las flechas de trazo continuo señalan superficies hidrófobas. R1 y R2 podrían ser idénticos o diferentes y pueden comprender hidrógeno, carbono, azufre, nitrógeno, oxígeno, alcanos, alcanos cíclicos, derivados basados en alcanos, alquenos, alquenos cíclicos, derivados basados en alquenos, alquinos, derivados basados en alquinos, cetonas, derivados basados en cetonas, aldehídos, derivados basado en aldehídos, ácidos carboxílicos, derivados basados en ácidos carboxílicos, éteres, derivados basados en éteres, ésteres y derivados basados en ésteres, aminas, derivados basados en aminas, amidas, derivados basados en amidas, arenos monocíclicos o policíclicos, heteroarenos, derivados basados en arenos, derivados basados en heteroarenos, fenoles, derivados basados en fenoles, ácido benzoico o derivados basados en ácido benzoico.
La figura 11 ilustra el compuesto ilustrativo 30 (Cpd30). La imagen superior izquierda de la figura 12 muestra el Cpd30 acoplado a Stat3 y la interacción entre el Cpd30 y la superficie de la proteína, y derivados de Cpd30 que encajan en la superficie de la proteína. Las estrellas representan átomos y grupos químicos que pueden remplazarse por otros átomos o grupos químicos para crear uno o más derivados funcionales. Las superficies hidrófobas/hidrófilas de Cpd30 también se muestran en la imagen superior derecha. Las flechas de trazo discontinuo señalan superficies hidrófilas y las flechas de trazo continuo señalan superficies hidrófobas. La estructura bidimensional de Cpd30 se muestra en la imagen inferior, R1, R2 R3 y R4 podrían ser idénticos o diferentes y pueden comprender hidrógeno, carbono, azufre, nitrógeno, oxígeno, alcanos, alcanos cíclicos, derivados basados en alcanos, alquenos, alquenos cíclicos, derivados basados en alquenos, alquinos, derivados basados en alquinos, cetonas, derivados basados en cetonas, aldehídos, derivados basado en aldehídos, ácidos carboxílicos, derivados basados en ácidos carboxílicos, éteres, derivados basados en éteres, ésteres y derivados basados en ésteres, aminas, derivados basados en aminas, amidas, derivados basados en amidas, arenos monocíclicos o policíclicos, heteroarenos, derivados basados en arenos, derivados basados en heteroarenos, fenoles, derivados basados en fenoles, ácido benzoico, o derivados basados en ácido benzoico.
La figura 12 ilustra el compuesto ilustrativo 188 (Cpd188). La imagen superior izquierda de la figura 12 muestra el Cpd188 acoplado al dominio SH2 de Stat3 y la interacción entre el Cpd188 y la superficie de la proteína, y derivados de Cpd188 que encajan en la superficie de la proteína. Las estrellas representan átomos y grupos químicos que pueden remplazarse por otros átomos o grupos químicos para crear uno o más derivados funcionales. Las superficies hidrófobas/hidrófilas de Cpd188 también se muestran en la imagen izquierda en la parte inferior. Las flechas de trazo discontinuo señalan superficies hidrófilas y las flechas de trazo continuo señalan superficies hidrófobas. En la imagen inferior derecha se muestran, Ri y R2 podrían ser idénticos o diferentes y pueden comprender hidrógeno, carbono, azufre, nitrógeno, oxígeno, alcanos, alcanos cíclicos, derivados basados en alcanos, alquenos, alquenos cíclicos, derivados basados en alquenos, alquinos, derivados basados en alquinos, cetonas, derivados basados en cetonas, aldehídos, derivados basado en aldehídos, ácidos carboxílicos, derivados basados en ácidos carboxílicos, éteres, derivados basados en éteres, ésteres y derivados basados en ésteres, aminas, derivados basados en aminas, amidas, derivados basados en amidas, arenos monocíclicos o policíclicos, heteroarenos, derivados basados en arenos, derivados basados en heteroarenos, fenoles, derivados basados en fenoles, ácido benzoico o derivados basados en ácido benzoico.
La figura 13 ilustra diagramas esquemáticos de Stat1 y Stat3.
La figura 14 muestra que la CI50 de RPS de las sondas químicas de Stat3 de 2.a generación se correlaciona inversamente con la puntuación del farmacóforo tridimensional.
La figura 15 muestra la CI50 de RPS y la CE50 de la apoptosis en LMA de Cpd188 precursor y dos sondas químicas de Stat3 de tipo 188 de 2.a generación.
La figura 16 proporciona una ilustración de las relaciones estructura-actividad de 38 sondas de Stat3 de 2.a generación de tipo Cpd188.
La figura 17 muestra un esquema de modificación ilustrativo para el desarrollo de sondas de Stat3 de 3.a generación usando Cpd188-15 como armazón.
La figura 18 proporciona una ilustración de la superficie electrostática del dominio SH2 de Stat3 (área positiva en azul, neutra en blanco y negativa en rojo en una figura a color) y 20 orientaciones de acoplamiento de 5 (R = CH2PO32-), que muestra interacciones fuertes entre los grupos fosfonato (en morado y rojo) y K591/R609.
La figura 19 muestra que las citocinas inflamatorias y p-Stat3 están elevadas en los músculos de pacientes con IRC. A. Inmunotinción de secciones musculares para lL-6 y TNFa (color pardo) de biopsias de sujetos de control sanos de edad y sexo coincidentes (panel izquierdo) y pacientes con IRC (panel central). La cuantificación de la tinción se calcula como el porcentaje de fibras musculares inmunoteñidas (panel derecho; n = 3 sujetos de control; n = 4 pacientes con IRC; regla = 50 |jm). B. Inmunoelectrotransferencias representativas para p-Stat3 en sujetos de control y pacientes con IRC (panel superior) y la relación entre la intensidad de p-Stat3 y Stat3 total (panel inferior) (n = 6 sujetos de control; n = 6 pacientes con IRC). C. Las secciones de músculo de sujetos de control y pacientes con IRC se inmunotiñeron para p-Stat3 (panel superior). Los núcleos pardos son p-Stat3 positivos (flechas). Porcentaje de núcleos p-Stat3 positivos en un total de 550 núcleos (panel inferior; n = 4 sujetos de control; n = 6 pacientes con IRC). Los valores son la media ± EEM. *p <0,05 frente a sujetos de control.
La figura 20 muestra que la inactivación de Stat3 específica de músculo en ratones suprime la IRC o la atrofia muscular inducida por estreptozotocina. A. Densidad de p-Stat3 corregida por Stat3 total en lisados de músculos gastrocnemios (panel superior; n = 5 ratones/grupo; *p <0,05 frente a ratones control simulados). También se muestran inmunoelectrotransferencias representativas de p-Stat3 (panel inferior). B. Cambios en los pesos corporales de ratones Stat3 KO y Stat3flox/flox, de control durante 5 semanas después de la creación de IRC (n = 10 pares de ratones; *p <0,05 frente a Stat3flox/flox). C y D. Promedio de pesos de los músculos gastrocnemio y tibial anterior (TA) de fibras mixtas (n = 10 ratones/grupo). E y F. Se aislaron músculos EDL de ratones de simulación o con IRC y Stat3flox/flox o Stat3 KO. Se midieron las tasas de síntesis de proteínas (E) y degradación de proteínas (F) (n = 20 músculos EDL de 10 ratones/grupo). G. La fuerza muscular de cada ratón usado en la figura 2B se midió durante cuatro días consecutivos. Se muestra el promedio de fuerza muscular (en Newtons) (n = 10 ratones/grupo). H. Inmunoelectrotransferencias representativas de p-Stat3 en lisados de músculos gastrocnemios de ratones con diabetes aguda (STZ) y de control. El gráfico de barras muestra las densidades de p-Stat3 corregidas para GAPDH (n = 10 ratones/grupo; *p <0,05 frente a ratones CTRL). I y J. Promedio de pesos de los músculos tibial anterior (TA) y gastrocnemio de fibras mixtas de ambas patas (n = 10 ratones/grupo; *p <0,05 frente a Stat3flox/flox de control). Los valores son la media ± EEM.
La figura 21 proporciona un inhibidor micromolecular de la activación de Stat3, C188-9, que bloquea el atrofia muscular inducida por IRC. A. Los ratones de simulación o con IRC se trataron con C188-9 o d 5w (diluyente) durante 14 días. Se muestran inmunoelectrotransferencias representativas de p-Stat3, Stat3 y GAPDH de lisados de músculos gastrocnemios (n = 8 ratones/grupo). B. Diferencias en los pesos corporales de ratones de simulación o con IRC alimentados en paralelo tratados con C188-9 o D5W al inicio del estudio y después de 7 o 14 días de tratamiento (*p <0,05 frente a simulado D5W). C y D. Promedios de pesos de los músculos gastrocnemio y tibial anterior (TA) de fibras mixtas de ambas patas (n = 7 ratones/grupo). E. Las criosecciones de los músculos TA se inmunotiñeron con antilaminina para identificar la membrana basal del músculo. Se midieron las áreas de miofibras y se calculó la distribución del tamaño de las miofibras a partir de las áreas de ~500 miofibras evaluadas por un observador desconocedor del grupo de tratamiento (n = 4 pares de ratones). F. La fuerza muscular de cada ratón estudiado en la figura 3C se midió en cuatro días consecutivos (procedimientos experimentales; n = 7 ratones/grupo). G y H. A las 2 semanas de tratamiento con C188-9 o D5W, se midió la síntesis (G) y la degradación (H) de proteínas (n = 8 pares de ratones; *p <0,05 frente a D5W). Los valores son la media ± EEM.
La figura 22 muestra que la activación de Stat3 en miotubos C2C12 aumenta la expresión de C/EBP8 y miostatina. A. Inmunoelectrotransferencias representativas de miotubos C2C12 tratados con IL-6 (100 ng/ml) durante diferentes tiempos (panel izquierdo). Factores de cambio en las densidades de proteínas corregidas para GAPDH en diferentes momentos, calculados a partir de valores en el momento cero (panel derecho), n = 3 repeticiones; *p <0,05 frente al tiempo cero. B. Los miotubos C2C12 se infectaron con un lentivirus que expresaba Stat3 activo de manera constitutiva (Stat3C-GFP). Se muestra una inmunoelectrotransferencia representativa para las proteínas indicadas. C. Los miotubos C2C12 se trataron con o sin C188-9 durante 2 h antes de añadir IL-6 (100 ng/ml) durante 24 h. Se muestra una inmunoelectrotransferencia representativa para las proteínas indicadas. D. Los mioblastos C2C12 se cotransfectaron con un plásmido que expresaba luciferasa dirigida por el promotor C/EBPS, luciferasa de Renilla más un lentivirus que expresaba Stat3C-GFP y se trataron con o sin IL-6. Se midió la actividad de luciferasa doble (n = 3 repeticiones; *p <0,05 frente al control de GFP respectivo). E. Los mioblastos C2C12 se transfectaron con ARNip de control o ARNip de C/EBPS y, después de la diferenciación en miotubos, se trataron con o sin IL-6. Se muestran inmunoelectrotransferencias representativas de Stat3, C/EBPS y miostatina. F. Los mioblastos C2C12 se cotransfectaron con un plásmido que expresaba la luciferasa dirigida por el promotor de miostatina más plásmidos (ADNc3 de control, Stat3C, C/e Bp S, ARNip de C/EBPS o ARNip de Stat3C más C/EBPS) y se trataron con o sin IL6. Se midió la actividad de luciferasa (n = 3 repeticiones; *p <0,05 frente a CTRL de ADNc3). G. Se transfectaron mioblastos C2C12 con lentivirus que expresaba un ARNip para miostatina. Se seleccionaron mioblastos que mostraban supresión de miostatina y a continuación se diferenciaron tras haberlos transfectado con plásmidos que expresaban Stat3C, C/EBPS o Stat3C más C/EBPS. En estas células, se midió la degradación de proteínas (panel superior; n = 6 repeticiones, #p <0,05 frente a GFP de control, *p <0,05 frente a CTRL de ARNip). Las inmunoelectrotransferencias de proteínas expresadas en respuesta a transfecciones se muestran en la figura 32.
La figura 23 muestra que la activación de Stat3 en músculos de ratón aumenta la expresión de C/EBPS y miostatina. A. Inmunoelectrotransferencias representativas de las proteínas indicadas de lisados de músculos gastrocnemios de ratones de control (Stat3flox/flox) o de simulación Stat3 KO o con IRC. B y C. ARNm de miostatina (B) y C/EBPS en músculos de ratones de simulación o con IRC analizados mediante r T-PCR (n = 4 ratones/grupo; *p <0,05 frente a simulación Stat3flox/flox). D. Inmunoelectrotransferencias representativas de las proteínas indicadas en lisados de músculos gastrocnemios de ratones de control STZ frente a WT (n = 5 pares). E. Los ratones de simulación o con IRC se trataron con C188-9 o D5W (diluyente) durante 14 días. Se muestran inmunoelectrotransferencias representativas de las proteínas indicadas de lisados de músculos gastrocnemios (n = 8 ratones/grupo). F y G. Niveles de ARNm de miostatina (F) y C/EBPS (G) analizados por RT-PCR y corregidos para GAPDH (n = 3 ratones/grupo: ratones de tipo silvestre sin IRC; ratones de simulación tratados con C188-9 o D5W; ratones con IRC tratados con C188-9 o D5W; *p <0,05 frente a WT sin IRC). Los valores son la media ± EEM. Figura 6. C/EBPS y miostatina median la atrofia muscular inducida por IRC o Stat3. A. Pesos corporales de ratones de tipo salvaje u con homo- o heteroinactivación de C/EBPS después de la creación de IRC. Los valores se expresan como porcentaje del peso corporal basal (media ± EEM; n = 9 para ratones WT; n = 11 para C/EBPS-/-; n = 11 para ratones C/e BP8+/-; *p <0,05 frente a WT IRC). B. La supervivencia se calculó como el porcentaje de ratones que sobrevivieron a las 3 semanas después de IRC o después de la cirugía simulada (n = 20 para WT; n = 25 para C/EBPS-/-; n = 21 para C/EBP8+/-; *p <0,05 frente a C/Eb PS-/- IRC). C. Promedios de los pesos de músculos de fibra roja (sóleo) o fibra blanca (EDL) de ambas patas (media ± EEM; n = 10 ratones/grupo; *p <0,05 frente a WT IRC). D. Inmunoelectrotransferencias representativas de p-Stat3 y miostatina de músculos de ratones con IRC o con operación simulada de los siguientes grupos: C/EBPS-/-, C/EBP8+/- o control (WT). E. Criosecciones de músculos gastrocnemios de ratones que se transfectaron con lentivirus que expresaban Stat3C-GPF o GFP y se trataron con inhibidor antimiostatina o PBS. Las secciones se inmunotiñeron con p-Smad2/3 (rojo, panel inferior). En el panel superior, la imagen superpuesta muestra miofibras GFP positivas (verde) que expresaban p-Smad2/3. F. Se midieron las áreas GFP positivas en las miofibras y se muestran los tamaños medios de las miofibras de cada grupo (panel izquierdo). Se calculó el porcentaje de núcleos p-Smad2/3 positivos con respecto al total de núcleos (panel derecho; media ± EEM, *p <0,05 frente a GFP/PBS).
La figura 25 muestra las evidencias de una ruta de p-Stat3, C/EBPS y miostatina en músculos de pacientes con IRC A. Inmunoelectrotransferencias representativas de p-Akt de biopsias musculares de controles sanos o pacientes con IRC. El gráfico de barras muestra las densidades de p-Akt corregidas para GAPDH (panel inferior; n = 4 pacientes con IRC y 3 sujetos sanos). B. Los niveles de ARNm de C/EBPS o miostatina se analizaron por RT-PCR de biopsias musculares de controles sanos o pacientes con IRC (n = 5 sujetos de control y 9 pacientes con IRC). C. Inmunoelectrotransferencias representativas de las proteínas indicadas de biopsias musculares de controles sanos o pacientes con IRC. D. Las densidades de las bandas se cuantificaron después de la corrección para GAPDH (n = 3 pares para CEBPS; n = 8 pares para miostatina). Los valores son la media ± EEM. *p <0,05 frente a controles sanos.
Figura 26: Los músculos de pacientes con IRC presentaban niveles elevados de ARNm de TNFa. Se usó RT-PCR para evaluar los niveles de ARNm de TNFa corregidos para GAPDH. El gráfico de barras (media ± EEM) ilustra la diferencia encontrada en muestras de 9 pacientes con IRC y 5 controles sanos (*, p <0,05 frente a sujetos sanos).
La figura 27 muestra los cambios de peso corporal en ratones con inactivación de Stat3 en músculo. Cambios en los pesos corporales de ratones de control Stat3 KO y Stat3flox/flox medidos de 3 a 8 semanas después del nacimiento. No hubo diferencias significativas en los pesos corporales de los ratones Stat3 KO frente a Stat3flox/flox sin IRC (n = 6 control; n = 9 Stat3).
La figura 28 proporciona niveles séricos de IL-6 de ratones STZ que se evaluaron mediante ELISA (n = 4 ratones/grupo).
La figura 29 muestra los cambios en los pesos corporales de ratones Stat3 KO o Stat3flox/flox con diabetes aguda. Durante 9 días después de la inyección de estreptozotocina, se mostraron los cambios del peso corporal diario (n = 10 ratones/grupo; *p <0,05 frente a Stat3flox/flox sin STZ; #p <0,05 frente a Stat3 KO St Z).
La figura 30 muestra que la activación de Stat3 en miotubos C2C12 aumenta la expresión de ARNm de C/EBP8. Los miotubos C2C12 se trataron con IL-6 (100 ng/ml) durante tiempos diferentes. Se usó RT-PCR para evaluar los niveles de ARNm de C/EBPS. Los gráficos de barras muestran los cambios en los ARNm de C/EBP después de la corrección para el ARNm de GAPDH. n = 3 repeticiones; *p <0,05 frente al tiempo cero.
La figura 31 proporciona activación de Stat3 en miotubos C2C12, que aumenta la expresión del ARNm de miostatina. Los miotubos C2C12 se trataron con IL-6 (100 ng/ml) durante diferentes tiempos. Se usó RT-PCR para evaluar los niveles de ARNm de miostatina. Los gráficos de barras muestran los cambios en los ARNm de miostatina después de la corrección para el ARNm de GAPDH. N = 3 repeticiones; *p <0,05 frente al tiempo cero.
La figura 32 muestra que la expresión de ARNm de miostatina y C/EBPS inducida por IL-6 requiere la activación de Stat3. Los miotubos C2C12 se trataron con o sin C188-9 durante 1 o 24 h y se usaron RT-PCR para evaluar los niveles de ARNm. Los gráficos de barras (media ± EEM) ilustran los niveles de ARNm corregidos para GAPDH de miostatina (parte superior) y C/EBPS (para inferior). N = 3 experimentos independientes; *, p <0,05 frente a los resultados sin C188-9.
La figura 33 muestra que C-188-9 suprime la pérdida de miotubos inducida por IL-6. Los miotubos C2C12 se trataron con C188-9, un inhibidor de Stat3, durante 2 h antes de añadir IL-6 (100 ng/ml) durante 24 h. Se midieron los tamaños de los miotubos (media ± EEM; N = 3 experimentos independientes; *, p <0,05 frente a miotubos sin tratar).
La figura 34 muestra los niveles de proteína que se midieron en células C2C12 con atenuación de miostatina y sobreexpresión de Stat3C o C/EBPS. Se transfectaron mioblastos C2C12 con lentivirus que expresaba un ARNip para miostatina. Se seleccionaron mioblastos que mostraban supresión de miostatina y a continuación se diferenciaron tras haberlos transfectado con plásmidos que expresaban Stat3C, C/EBPS o Stat3C más C/EBPS. Se mostraron inmunoelectrotransferencias de proteínas expresadas en respuesta a las transfecciones.
La figura 35 muestra que la inhibición de miostatina bloqueó p-Smad2/3 inducido por Stat3C. Los lisados musculares de músculos transfectados con lentivirus que expresaba GFP o Stat3C y ratones tratados con pepticuerpo antimiostatina o PBS se sometieron a inmunoelectrotransferencia para mostrar los niveles de p-stat3 y p-Smad2/3.
La figura 36 muestra que los medios acondicionados de células cancerosas C26 o LLC activan p-Stat3 en células C2C12, un modelo de músculo esquelético. Miotubos C2C12. A. Inmunoelectrotransferencias representativas de p-Stat3 y Stat3 en miotubos C2C12 que se expusieron durante diferentes tiempos a medios acondicionados de células de cáncer de colon C26. B. Los miotubos C2C12 se trataron previamente con el inhibidor de Stat3, C188-9, durante 2 horas antes de exponerlos a medios acondicionados de células cancerosas C26 o LLC. Se muestran inmunoelectrotransferencias representativas para p-Stat3 o Stat3. C. Los miotubos C2C12 se trataron con C188-9 más medios acondicionados de células C26 durante diferentes tiempos. Se muestran inmunoelectrotransferencias representativas para C/EBPS y miostatina. D. Los promedios de los tamaños de los miotubos C2C12 se evaluaron después de incubación con medios acondicionados de células C26 con o sin C188-9 durante 72 horas (media ± EEM; p <0,05).
La figura 37 muestra que la inactivación de Stat3 específica de músculo en ratones suprime la pérdida de masa muscular inducida por LLC. A ratones con inactivación de Stat3 específica del músculo o ratones de control, Stat3flox/flox (10 ratones en cada grupo) se les inyectó LLC 18 días antes. A. Los cambios en el peso corporal se expresan como un porcentaje del peso corporal medido antes de inyectar LLC. B. Pesos de los tumores medidos cuando se sacrificaron los ratones. C. Pesos de diferentes músculos (TA, tibial anterior; Gast, gastrocnemio; y EDL, extensor digitorum longus - extensor largo de los dedos) medido a los 18 días después de inyectar LLC. D. Inmunoelectrotransferencias representativas de Stat3, C/EBPS y miostatina de músculos de ratones con inactivación específica de músculo de Stat3 o ratones Stat3flox/flox. Se compararon ratones con y sin tumor y se cuantificaron las densidades de las transferencias (panel inferior). E. Se midió la fuerza de agarre muscular (n = 5 ratones en cada grupo) (media ± EEM).
La figura 38 muestra que la eliminación de C/EBP8 en ratones suprime la caquexia inducida por LLC. A los ratones con inactivación de C/EBPS y de control se les inyectó LLC y 18 días después, se midió: A. peso corporal; B. pesos de diferentes tipos de músculos según el tipo de fibra; C. tasas medidas de degradación de proteínas musculares; D. fuerza de agarre muscular; E. inmunoelectrotransferencias representativas de miostatina en músculos de ratones C/EBPS o de control tratados con o sin LLC (panel superior). El factor de aumento en miostatina frente a los resultados en ratones de control se muestra en el panel inferior. Los resultados se expresan como la media ± EEM.
La figura 39 proporciona que el bloqueo de la activación de Stat3 con C188-9, un inhibidor de Stat3, suprime la caquexia por cáncer. Se trataron ratones CD2F1 que portaban tumor C26 durante 5 días con C188-9 dos veces al día durante 14 días. Los resultados de estos ratones se compararon con los de ratones CD2F1 que portaban el tumor y se trataron con el diluyente, dextrosa al 5 % en agua (D5W). Los ratones CD2F1 sin tumores c 26 sirvieron como ratones de control. Había 12 ratones en cada grupo. A. Se cuantificaron (panel inferior) inmunoelectrotransferencias representativas de diferentes proteínas (panel superior). Los resultados mostrados son: B. pesos corporales; C. pesos musculares; D. la distribución de los tamaños de las miofibras en los 3 grupos de ratones; E. fuerza de agarre muscular; y F y G son tasas medidas de síntesis y degradación de proteínas. Los resultados son la media ± EEM.
La figura 40 muestra que p-Stat3 estimula la transcripción de caspasa-3, que participa en el desarrollo de la caquexia por cáncer. A. Las inmunoelectrotransferencias representativas revela niveles aumentados de procaspasa-3 y caspasa-3 en músculos de ratones portadores de C26 o LLC. B. Inmunoelectrotransferencias representativas que muestran una actividad de caspasa-3 aumentada medida como la escisión de la actina para producir el fragmento de actina de 14 kDa, característica de las afecciones catabólicas. C. Se trataron miotubos C2C12 durante 24 horas con medios acondicionados de células C26. Un ensayo ChiP muestra que p-Stat3 se une al promotor de caspasa-3. D. Los miotubos C2C12 se infectaron con un adenovirus que expresaba GFP o Stat3. Después de 24 horas, las células que expresaban Stat3C se estimularon mediante IL-6. Los resultados de un ensayo ChiP usando anti-p-Stat3 o anti-Stat-3 revelaron la unión de Stat3 al promotor de caspasa-3. E. Las células C2C12 se transfectaron con diferentes segmentos de una construcción de promotor de caspasa-3-luciferasa más un plásmido que expresa Stat3 activo de forma constitutiva. Posteriormente, las células se trataron con o sin IL-6 durante 6 h y la actividad de luciferasa se usó para evaluar la actividad del promotor de caspasa-3. Los resultados son la media ± EEM.
La figura 41 muestra que la activación de Stat3 induce el sistema de ubiquitina-proteasoma en la caquexia inducida por cáncer. A. Los miotubos C2C12 se trataron con medios acondicionados de células C26 con o sin C188-9 durante 72 horas. A. Inmunoelectrotransferencia representativa que muestra una disminución en la cadena pesada de miosina está bloqueada por C188-9. B. Los miotubos C2C12 se trataron con medios acondicionados de células C26 con o sin C188-9 durante 24 horas. Se muestran los niveles de ARNm de MAFbx/atrogina-1 y MuRF-1. C y D. Los ratones CD2F1 que portaban tumores C26 se trataron con C188-9 durante 2 semanas. Inmunoelectrotransferencias representativas de lisados de músculos gastrocnemios muestran que C188-9 suprime la proteína MAFbx/atrogina-1 y los ARNm en ratones que portan tumores C26. E. Tumores LLC en ratones con inactivación específica de músculo de Stat3 o Stat3flox/flox y después de 14 días, una inmunoelectrotransferencia representativa del músculo muestra el nivel de proteína de MAFbx/atrogina-1. Los resultados son la media ± EEM.
La figura 42 ilustra una figura de sumario que muestra la manera en que el cáncer que activa p-Stat3 en el músculo puede estimular la pérdida de masa muscular. La activación de Stat3 estimula la expresión de C/EBPS, que aumenta la miostatina y MAFbx/atrogina-1 y MuRF-1 para aumentar la atrofia muscular por parte del UPS. La activación de Stat3 también aumenta la expresión y actividad de caspasa-3 para coordinar la proteólisis muscular con el UPS.
Descripción detallada de la invención
Debe comprenderse que la siguiente descripción detallada y los ejemplos específicos, a la vez que indican realizaciones específicas de la invención, se proporcionan solamente a modo de ilustración.
En algunas realizaciones, hay una composición para su uso en un método de tratamiento, de una condición seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas en un individuo como se define en el presente documento, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de uno o más compuestos particulares como se definen en el presente documento. En algunas realizaciones, el compuesto o compuestos son un inhibidor de STAT3. En determinadas realizaciones, el compuesto o compuestos no son inhibidores de STAT3. En casos particulares, el compuesto o compuestos son un inhibidor de STAT1, pero en casos particulares no son un inhibidor de STAT1. En determinados aspectos, existen algunos compuestos que son inhibidores tanto de STAT3 como de STAT1 o bien no son inhibidores de STAT3 ni de STAT1.
En determinadas realizaciones de la invención, hay un compuesto para su uso en el tratamiento de una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas, en un individuo que tiene atrofia muscular o caquexia o que está en riesgo de tener atrofia muscular o caquexia, en donde dicha afección es el resultado de insuficiencia renal crónica subyacente; en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en N-(1',2-dihidroxi-1,2'-binaftalen-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(3,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(4,1-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(5,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(6,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(7,1-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(8,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, 4-bromo-N-(1,6'-dihidroxi-[2,2']binaftalenil-4-il)-bencensulfonamida o una combinación de las mismas.
En una realización específica de la invención, la composición es para su uso mediante administración in vivo en un mamífero. En otra realización, el mamífero es un ser humano. En otra realización específica, se sabe que el ser humano tiene una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas, se sospecha que tiene una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas, o está en riesgo de desarrollar una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas. En otra realización, se sabe que el humano tiene una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas y está recibiendo un tratamiento adicional para una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas y/o una afección subyacente relacionada con una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas. Una o más composiciones de la divulgación tratan, previenen y/o reducen el riesgo de pérdida de peso corporal y/o pérdida de peso muscular, en realizaciones particulares.
I. Definiciones
Como se usa en la memoria descriptiva del presente documento, "un" o "uno/a" puede significar uno/a o más. Como se usa en la reivindicación o en las reivindicaciones del presente documento, cuando se usan junto con la expresión "que comprende", las palabras "un" o "uno/a" pueden significar uno/a o más de uno/a. Como se usa en el presente documento, "otro/a" puede significar al menos un/a segundo/a o más. Aún más, las expresiones "que tiene/n", "que incluye/n", "que contiene/n" y "que comprende/n" se usan indistintamente y un experto en la materia es consciente de que estas expresiones son expresiones abiertas. Algunas realizaciones de la invención pueden consistir en o consisten esencialmente en uno o más elementos, etapas del método y/o métodos de la invención. Se contempla que cualquier método o composición que se describa en el presente documento puede implementarse con respecto a cualquier otro método o composición que se describa en el presente documento.
El término "inhibidor", como se usa en el presente documento, se refiere a una o más moléculas que interfieren al menos en parte con la actividad de Stat3 para realizar una o más actividades, incluyendo la capacidad de Stat3 de unirse a una molécula y/o la capacidad de fosforilarse.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, significa aquella cantidad de un compuesto, material o composición que comprende un compuesto de la presente invención que es eficaz para producir algún efecto terapéutico deseado, por ejemplo, tratar (es decir, prevenir y/o mejorar) el cáncer en un sujeto, o inhibir las interacciones proteína-proteína mediadas por un dominio SH2 en un sujeto, con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. En una realización, la cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para reducir o eliminar al menos un síntoma. Un experto en la materia reconoce que una cantidad puede considerarse terapéuticamente eficaz incluso si el cáncer no se erradica totalmente, pero se mejora parcialmente. Por ejemplo, la diseminación del cáncer puede detenerse o reducirse, un efecto secundario del cáncer puede reducirse parcialmente o eliminarse completamente, la esperanza de vida del sujeto puede aumentarse, el sujeto puede experimentar menos dolor, y así sucesivamente.
En el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance del criterio médico reconocido, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin producir demasiada toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.
La expresión "en riesgo de tener atrofia muscular", como se usa en el presente documento, se refiere a una persona que está en riesgo de tener menos de su nivel normal de fuerza o muy poco músculo o que ha perdido músculo, tal como un individuo que tiene una afección médica subyacente con dicho síntoma o es anciano.
La expresión "en riesgo de tener caquexia" se usa en el presente documento para referirse a los individuos que tienen posibilidades de tener caquexia debido a factores pasados, presentes o futuros. En realizaciones particulares, un individuo en riesgo de tener caquexia es aquel que tiene una afección subyacente que se sabe que provoca o está asociada con caquexia como al menos un síntoma. La afección puede ser crónica o no. En algunas realizaciones, una afección médica subyacente que se sabe que tiene caquexia como al menos un síntoma, incluye al menos insuficiencia renal, cáncer, SIDA, infección por VIH, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (incluyendo enfisema), esclerosis múltiple, insuficiencia cardíaca congestiva, tuberculosis, polineuropatía amiloidótica familiar, acrodinia, deficiencia hormonal, acidosis metabólica, enfermedad infecciosa, pancreatitis crónica, trastorno autoinmunitario, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, desequilibrio electrolítico, enfermedad de Addison, septicemia, quemaduras, traumatismo, fiebre, fractura de huesos largos, hipertiroidismo, tratamiento prolongado con esteroides, cirugía, trasplante de médula ósea, neumonía atípica, brucelosis, endocarditis, hepatitis B, absceso pulmonar, mastocitosis, síndrome paraneoplásico, poliarteritis nodosa, sarcoidosis, lupus eritematoso sistémico, miositis, polimiositis, dermatomiositis, enfermedades reumatológicas, enfermedad autoinmunitaria, vasculpatía del tejido conjuntivo, leishmaniasis visceral, reposo prolongado en cama y/o adicción a las drogas, tales como anfetaminas, opiáceos o barbitúricos.
Como se usa en el presente documento, la "afinidad de unión" se refiere a la fuerza de una interacción entre dos entidades, tal como una interacción proteína-proteína. La afinidad de unión a veces se denomina Ka, o constante de asociación, que describe la probabilidad de que las dos entidades separadas estén en el estado unido. En general, la constante de asociación se determina mediante una variedad de métodos en los que dos entidades separadas se mezclan entre sí, la porción no unida se separa de la porción unida y se miden las concentraciones de las no unidas y las unidas. Un experto en la materia se da cuenta de que existe una variedad de métodos para medir constantes de asociación. Por ejemplo, las porciones no unidas y unidas pueden separarse entre sí mediante adsorción, precipitación, filtración en gel, diálisis o centrifugación, por ejemplo. La medición de las concentraciones de las porciones unidas y no unidas puede conseguirse, por ejemplo, midiendo la radiactividad o la fluorescencia, por ejemplo. La Ka también puede deducirse indirectamente a través de la determinación de la Ki o constante de inhibición. La determinación de la Ki puede realizarse de varias formas, por ejemplo, midiendo la Ka de la unión de STAT3 a su ligando fosfopeptídico dentro del EGFR en la posición Y1068, y midiendo la concentración de una molécula que reduce la unión de STAT3 en un 50 %. En determinadas realizaciones de la invención, la afinidad de unión de un inhibidor de Stat3 por el dominio SH2 de Stat3 es similar a, o mayor que, la afinidad de los compuestos enumerados en el presente documento.
El término "dominio", como se usa en el presente documento, se refiere a una subsección de un polipéptido que posee una característica estructural y/o funcional única; normalmente, esta característica es similar en diversos polipéptidos. La subsección comprende normalmente aminoácidos contiguos, aunque también puede comprender aminoácidos que actúan en conjunto o que están muy cerca debido al plegamiento u otras configuraciones. Un ejemplo de un dominio de proteína es el dominio de homología a Src 2 (SH2) de Stat3. La expresión "dominio SH2" está reconocida en la técnica y, como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio de proteína implicado en interacciones proteína-proteína, tal como un dominio dentro de la tirosina cinasa Src que regula la actividad cinasa. La invención contempla la modulación de la actividad, tal como la actividad que depende de las interacciones proteína-proteína, mediada por dominios SH2 de proteínas (por ejemplo, tirosina cinasas tales como Src) o proteínas implicadas en la transmisión de una señal de tirosina cinasa en organismos que incluyen mamíferos, tales como seres humanos.
Como se usa en el presente documento, un "mamífero" es un sujeto apropiado para el método de la presente invención. Un mamífero puede ser cualquier miembro de la clase superior de vertebrados Mammalia, que incluye a los seres humanos; caracterizados por recién nacidos vivos, vello corporal y glándulas mamarias en la hembra que segregan leche para alimentar a las crías. Adicionalmente, los mamíferos se caracterizan por su capacidad para mantener una temperatura corporal constante a pesar de las condiciones climáticas cambiantes. Algunos ejemplos de mamíferos son los seres humanos, gatos, perros, vacas, ratones, ratas y chimpancés. Los mamíferos pueden denominarse "pacientes" o "sujetos" o "individuos".
II. Realizaciones generales
Las realizaciones generales incluyen una o más composiciones para su uso en un método de tratamiento de una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas. La debilidad muscular y/o la atrofia muscular y/o la caquexia son el resultado de una insuficiencia renal crónica subyacente. La insuficiencia renal crónica subyacente puede ser una afección catabólica.
En algunos casos, se sospecha que un individuo tiene una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas; dicha sospecha puede deberse a que el individuo tiene pérdida muscular y/o de peso involuntaria. En determinados aspectos, dicha sospecha puede deberse a que el individuo tiene ha perdido músculo. En algunos casos, un individuo puede tener al menos un síntoma de una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas, pero también puede tener otros síntomas.
En determinados casos, un individuo está en riesgo de tener una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas. En dichos casos, el individuo tiene una afección médica que puede estar asociada con atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia y no ha tenido suficiente progresión de la afección médica para manifestar atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia o aún no ha tenido un síntoma detectable de atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia.
En algunas realizaciones, se sabe que el individuo tiene una afección subyacente que a menudo tiene atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia como al menos un síntoma, y que ese individuo puede haber mostrado o no signos de tener atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia. En los casos en los que un individuo tiene una afección subyacente que a menudo tiene atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia como al menos un síntoma, al individuo se le puede proporcionar una cantidad eficaz de una o más composiciones de la invención antes y/o después de la aparición de atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia. Cuando al individuo se le proporciona una o más composiciones antes de la aparición de atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia, el inicio de la atrofia muscular y/o la debilidad muscular y/o la caquexia puede retardarse o inhibirse por completo y/o la gravedad de la atrofia muscular y/o la debilidad muscular y/o la caquexia puede reducirse, en comparación con la afección del individuo sin haber recibido la composición o las composiciones, por ejemplo.
En realizaciones particulares, a un individuo se le ha diagnosticado una afección subyacente que se sabe que tiene atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia como al menos un síntoma, y los métodos de la invención pueden incluir etapas de diagnóstico de la debilidad muscular y/o atrofia muscular y/o caquexia y/o la afección subyacente del individuo. Un individuo puede someterse a prueba de atrofia muscular por medios convencionales en la técnica.
III. Atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia
Realizaciones de la invención se refieren a composiciones para su uso en el tratamiento de una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular, caquexia y cualquier combinación de las mismas.
Las realizaciones de atrofia muscular y/o debilidad muscular pueden surgir en el contexto del individuo que también tiene caquexia, o el individuo puede no tener también caquexia. La composición para el uso de la presente invención es para su uso en el tratamiento de atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia, que es el resultado de una insuficiencia renal crónica subyacente. La atrofia muscular y/o la debilidad muscular pueden manifestarse antes o después de la detección de otros síntomas de la afección médica subyacente. La atrofia muscular puede prevenirse o revertirse por completo o puede haber un retardo en el inicio y/o la gravedad tras el uso de una o más composiciones de la invención.
La atrofia muscular y/o la debilidad muscular pueden evaluarse de diversas maneras, incluyendo exploración física; pruebas de estar sentado y de pie; pruebas de marcha; medición del índice de masa corporal; pruebas de reflejos; análisis de sangre para enzimas musculares; exploración por TC; medición del nitrógeno corporal total; biopsia muscular; y/o electromiograma, por ejemplo.
La caquexia, que también puede denominarse síndrome consuntivo, se produce cuando hay una pérdida de masa corporal que no puede revertirse mediante la alimentación. Ejemplos de síntomas de caquexia incluyen pérdida de peso, atrofia muscular, cansancio, debilidad y/o considerable pérdida de apetito en un individuo que no busca perder peso activamente. En aspectos particulares, la caquexia es el resultado de una patología idiopática, dado que incluso si el individuo afectado consume más calorías, hay pérdida de masa corporal. En casos específicos, la reducción del músculo esquelético es un factor pronóstico.
En realizaciones de la invención, es posible que se sepa que el individuo tiene la afección médica asociada con la atrofia muscular y/o la debilidad muscular y/o la caquexia (es decir, insuficiencia renal crónica), aunque en algunos casos no se sabe que el individuo tenga la afección médica (es decir, insuficiencia renal crónica). En casos particulares, una persona tiene atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia como síntoma de una afección médica subyacente (es decir, insuficiencia renal crónica) conocida o desconocida. Un individuo puede presentar atrofia muscular, debilidad muscular y/o caquexia como primer síntoma y el médico puede buscar una afección subyacente. Un individuo puede presentar la afección médica subyacente y el médico puede controlar al individuo para detectar el inicio de atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia o puede reconocer uno o más síntomas de atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia.
En realizaciones de la invención, una o más de las composiciones se proporcionan a un individuo con una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas, además de otro agente para el tratamiento de atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia. Ejemplos de tratamiento de la caquexia incluyen esteroides anabólicos; fármacos que imitan la progesterona; BMS-945429 (también conocido como ALD518); enobosarm; propranolol y etodolaco; ácidos grasos omega-3; marihuana medicinal, IGF-1; complementos nutricionales y/o ejercicio.
En algunas realizaciones, el individuo tiene un caso grave de caquexia, tal como cuando el individuo afectado está tan débil físicamente que el individuo está en un estado de inmovilidad como resultado de la pérdida de apetito, astenia y/o anemia, por ejemplo.
IV. Composiciones
Las realizaciones de la invención abarcan composiciones para su uso en el tratamiento de una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas.
En realizaciones particulares, hay composiciones seleccionadas del grupo que consiste en N-(3,1'-dihidroxi
[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(4,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(5,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(6,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(7,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, N-(8,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida y 4-bromo-N-(1,6'-dihidroxi-[2,2']binaftalenil-4-il)-bencensulfonamida.
En una realización específica de la invención, hay un compuesto para su uso en un método de tratamiento de una afección seleccionada de debilidad muscular, atrofia muscular y caquexia o cualquier combinación de las mismas en un individuo que tiene atrofia muscular o caquexia o que está en riesgo de tener atrofia muscular o caquexia; en donde dicha afección es el resultado de una insuficiencia renal crónica subyacente; en donde la composición se selecciona del grupo que consiste en N-(1',2-dihidroxi-1,2'-binaftalen-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(3,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(4,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(5,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(6,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(7,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(8,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, 4-bromo-N-(1,6'-dihidroxi-[2,2']binaftalenil-4-il)-bencensulfonamida, y combinaciones de las mismas; en donde dicho método comprende la etapa de proporcionar al individuo una cantidad eficaz de uno o más de dichos compuestos.
Las composiciones de la presente invención pueden obtenerse por cualquier medio adecuado.
V. Realizaciones para acción dirigida a Stat3
Las proteínas STAT, de las que existen siete (1,2, 3, 4, 5A, 5B y 6), transmiten señales de hormonas peptídicas desde la superficie celular al núcleo. La información estructural detallada de las proteínas STAT actualmente está limitada a Stat1 y Stat3. Stat1 fue la primera proteína STAT que se descubrió (Fu et al., 1992) y es necesaria para la señalización mediante los IFN de tipo I y II (Meraz et al., 1996; Wiederkehr-Adam et al., 2003; Durbin et al., 1996; Haan et al., 1999). Los estudios en ratones deficientes en Stat1 (Meraz et al., 1996; Durbin et al., 1996; Ryan et al., 1998) respaldan una función para Stat1 en la inmunidad innata, especialmente contra patógenos víricos. Además, Stat1 es un potente inhibidor del crecimiento y un promotor de la apoptosis (Bromberg y Darnell, 2000). Además, debido a que los tumores de animales sin mutaciones tratados con un carcinógeno crecen más rápidamente cuando se trasplantan en animales deficientes en Stat1 que en un hospedador sin mutaciones, Stat1 contribuye a la vigilancia del tumor (Kaplan et al., 1998).
Stat3 se denominó originalmente factor de respuesta de fase aguda (APRF) porque se identificó por primera vez como un factor de transcripción que se unía a elementos de respuesta a IL-6 dentro de la región potenciadora-promotora de diversos genes de proteínas de fase aguda (Akira, 1997). Además de los receptores para la familia de las citocinas IL-6, otras rutas de señalización están vinculadas a la activación de Stat3, que incluyen receptores para otros receptores de citocinas de tipo I y tipo II, tirosina cinasas receptoras, receptores acoplados a proteínas G y cinasas Src (Schindler y Darnell, 1995; Turkson et al., 1998). La alteración dirigida del gen Stat3 de ratón da lugar a una mortalidad embrionaria a los 6,5 a 7,5 días (Takeda et al., 1997), lo que indica que Stat3 es esencial para el desarrollo embrionario temprano, posiblemente la gastrulación o la función del endodermo visceral (Akira, 2000). La eliminación específica de tejido de Stat3 usando la tecnología Cre-lox ha revelado una apoptosis disminuida de las células epiteliales mamarias, que da como resultado una involución mamaria retardada durante el destete (Chapman et al., 1999). Hallazgos recientes indican que el cambio de la proteína STAT predominante activada por un receptor dado puede producirse cuando se elimina genéticamente una proteína STAT posterior de ese receptor (Costa-Pereira et al., 2002; Qing y Stark, 2004). Estos hallazgos sugieren la posibilidad de que el efecto de la eliminación de Stat3 en el tejido mamario pueda estar mediado indirectamente por una activación aumentada de otras proteínas STAT, especialmente Stat5.
Isoformas de Stat1 y Stat3. Se han identificado dos isoformas de Stat1 y Stat3: a (p91 y p92, respectivamente) y p (p84 y p83, respectivamente) (Schindler et al., 1992; Schaefer et al., 1995; Caldenhoven et al., 1996; Chakraborty et al., 1996) - que surgen debido al empalme de ARNm alternativo (figura 13). A diferencia de Stat1p (712 aa), en la que la transactivación en el extremo carboxílico simplemente se elimina, los 55 residuos aminoacídicos de Stat3a se remplazan en Stat3 p por 7 residuos aminoacídicos únicos en su extremo carboxílico. A diferencia de Stat1 p, Stat3 p no es simplemente un negativo dominante de Stat3a (Maritano et al., 2004) y regula las dianas génicas de una manera distinta a la de Stat3 p (Maritano et al., 2004; Yoo et al., 2002). Se ha demostrado que Stat3a interviene en la transformación en modelos celulares y muchos cánceres humanos, incluyendo cáncer de mama. Se demostró que Stat3a se activa constitutivamente en fibroblastos transformados por oncoproteínas tales como v-Src (Yu et al., 1995; García y Jove, 1998) y que es esencial para la transformación mediada por v-Src (Turkson et al., 1998; Costa-Pereira et al., 2002). A diferencia de Stat3a, Stat3p antagonizó la transformación de v-Src mediada por Stat3a (Turkson et al., 1998). La sobreexpresión de una forma activa de forma constitutiva de Stat3a en fibroblastos de rata o ratón inmortalizados indujo su transformación y les confirió la capacidad de formar tumores en ratones atímicos (Bromberg et al., 1999). Se ha demostrado que Stat3 está activada de forma constitutiva en una variedad de tumores hemáticos y sólidos, incluyendo cáncer de mama (Dong et al., 2003; Redell y Tweardy, 2003) como resultado de la producción autocrina del factor de crecimiento o la desregulación de proteínas tirosina cinasas. En prácticamente todos los casos, la isoforma que muestra actividad aumentada es Stat3a.
Acción dirigida a Stat3a evitando Stat1. Dados sus múltiples funciones que intervienen en la oncogénesis, Stat3 ha llamado recientemente la atención como una posible diana para el tratamiento contra el cáncer (Bromberg, 2002; Turkson, 2004). Si bien se han empleado con éxito varios métodos de inhibición de Stat3 y se ha establecido una prueba preliminar de que la acción dirigida a Stat3 es potencialmente beneficiosa en una variedad de sistemas tumorales, incluyendo cáncer de mama en el que Stat3 está activada de forma constitutiva (Epling-Burnette et al., 2001; Yoshikawa et al., 2001; Li y Shaw, 2002; Catlett-Falcone et al., 1999; Mora et al., 2002; Grandis et al., 2000; Leong et al., 2003; Jing et al., 2003; Jing et al., 2004; Turkson et al., 2001; Ren et al., 2003; Shao et al., 2003; Turkson et al., 2004; Uddin et al., 2005); todos tienen posibles limitaciones para su traslado al uso clínico para tratamiento contra el cáncer relacionadas con problemas relativos a la administración, la especificidad o la toxicidad.
Varios grupos han seguido estrategias específicas que se dirigen a Stat3 mediante la identificación de inhibidores del reclutamiento y/o dimerización de Stat3 (Turkson et al., 2001; Ren et al., 2003; Shao et al., 2003; Uddin et al., 2005; Song et al., 2005; Schust et al., 2006). Como se resumen a continuación, esta estrategia tiene capacidad de conseguir una especificidad basada en la observación de que el motivo peptídico pY preferido de cada proteína STAT es distinto. Cuando se combina con un planteamiento de molécula pequeña, esta estrategia tiene la capacidad de superar los problemas de administración y toxicidad.
Acción dirigida a Stat3a evitando Stat3P. Algunas de las características bioquímicas distintas de Stat3p frente a Stat3a, especialmente la activación constitutiva y un aumento de 10 a 20 veces en la afinidad de unión al ADN, se han atribuido a la ausencia del dominio de transactivación en el extremo carboxílico (TAD) que da como resultado una estabilidad aumentada del dímero de Stat3p (Park et al., 1996; Park et al., 2000). La estabilidad aumentada del dímero probablemente sea el resultado de una mayor afinidad de unión del dominio SH2 a los motivos peptídicos pY en el contexto de Stat3p en comparación con Stat3a debido a un impedimento estérico reducido conferido por la eliminación del TAD. Estas características bioquímicas diferenciales entre Stat3a y Stat3p se explotan para desarrollar un compuesto químico que se dirige selectivamente a Stat3a, en algunas realizaciones. Esta selectividad potencia el efecto antitumoral de dichos compuestos, en determinados casos, porque evitarían Stat3 p, que funciona antagonizando las funciones oncogénicas de Stat3a.
Los tratamiento específicos dirigidos a la señalización de Stat3 pueden ser útiles para el tratamiento de la caquexia.
VI. Politerapia
Es un aspecto de esta invención que una composición como se divulga en el presente documento se usa en combinación con otro agente o método de tratamiento, tal como otro tratamiento de atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia y/o un tratamiento para una afección subyacente. La composición o composiciones (que pueden ser un inhibidor de Stat3 o no) pueden preceder o seguir al tratamiento con otro agente en intervalos que varían de minutos a semanas, por ejemplo. En realizaciones en las que el otro agente y la composición de la invención se aplican por separado a un individuo con caquexia, tal como en el momento de la administración a un individuo sospechoso de tener caquexia, que se sabe que tiene caquexia o en riesgo de tener caquexia, en general uno se aseguraría de que no pasara un periodo de tiempo significativo entre el momento de cada administración, de manera que el agente y la composición todavía pudieran ejercer un efecto combinado ventajoso en el individuo.
Por ejemplo, en dichos casos, se contempla que se pueda poner en contacto la célula, el tejido o el organismo con una, dos, tres, cuatro o más modalidades sustancialmente de forma simultánea (es decir, en menos de aproximadamente un minuto) con la composición de la invención. En otros aspectos, uno o más agentes pueden administrarse en aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 25 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 27 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 29 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 31 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 33 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 37 horas, aproximadamente 38 horas, aproximadamente 39 horas, aproximadamente 40 horas, aproximadamente 41 horas, aproximadamente 42 horas, aproximadamente 43 horas, aproximadamente 44 horas, aproximadamente 45 horas, aproximadamente 46 horas, aproximadamente 47 horas, hasta aproximadamente 48 horas o más antes y/o después de administrar la composición de la invención. En otras determinadas realizaciones, un agente puede administrarse en aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 8 días, aproximadamente 9 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 13 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 15 días, aproximadamente 16 días, aproximadamente 17 días, aproximadamente 18 días, aproximadamente 19 días, aproximadamente 20, hasta aproximadamente 21 días antes y/o después de administrar la composición de la invención, por ejemplo. En algunas situaciones, puede ser deseable prolongar el periodo de tiempo para el tratamiento de manera significativa, tal como cuando varias semanas (por ejemplo, aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7 o aproximadamente 8 semanas o más) transcurren entre las respectivas administraciones. En algunas situaciones, puede ser deseable prolongar el periodo de tiempo para el tratamiento de manera significativa, tal como cuando varios meses (por ejemplo, aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7 o aproximadamente 8 semanas o más) transcurren entre las respectivas administraciones.
Pueden emplearse diversas combinaciones, la composición de la invención es "A" y el agente secundario, que puede ser cualquier otro agente terapéutico contra el cáncer, es B":
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
La administración de las composiciones terapéuticas de la presente invención a un paciente seguirá protocolos generales para la administración de fármacos, teniendo en cuenta la toxicidad. Se espera que los ciclos de tratamiento se repitan según sea necesario.
VII. Composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz de una composición, como se divulga en el presente documento, disuelta o dispersada en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéutica" o "farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica o negativa distinta cuando se administran a un animal, tales como, por ejemplo, un ser humano, según sea adecuado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos un inhibidor de Stat3 de la invención y, en algunos casos, un principio activo adicional, será conocida por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación, como se ejemplifica en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a Ed. Mack Printing Company, 1990. Por otra parte, para la administración a un animal (por ejemplo, un ser humano), se entenderá que las preparaciones deben cumplir con las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza según las exigencias de la Oficina de normas biológicas de la FDA.
Como se usa en el presente documento, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos de disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizantes de fármacos, geles, aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, colorantes, materiales similares y combinaciones de los mismos, como sabría un experto en la materia (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a Ed. Mack Printing Company, 1990, págs. 1289-1329). Excepto en la medida en que cualquier excipiente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.
La composición o composiciones pueden comprender diferentes tipos de vehículos dependiendo de si se van a administrar en forma sólida, líquida o de aerosol, y de si tienen que ser estériles para dichas vías de administración tales como inyección. La presente invención puede administraron por vía intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, por inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada que riega directamente las células diana, mediante un catéter, mediante un lavado, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas), como un aerosol o por otro método o cualquier combinación de los anteriores, como sabría un experto en la materia (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a Ed. Mack Printing Company, 1990).
La cantidad de dosis real de una composición de la presente invención administrada a un individuo puede determinarse por factores físicos y fisiológicos tales como el peso corporal, la gravedad de la afección, el tipo de enfermedad que hay que tratar, las intervenciones terapéuticas previas o simultáneas y la vía de administración. El médico responsable de la administración, en todo caso, determinará la concentración del principio o principios activos y la dosis o las dosis adecuadas para el sujeto individual.
En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, al menos aproximadamente un 0,1 % de una composición. En otras realizaciones, el compuesto activo puede comprender entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 75 % del peso de la unidad, o entre aproximadamente un 25 % y aproximadamente un 60 %, por ejemplo, y cualquier intervalo que se puede derivar de los mismos. En otros ejemplos no limitantes, una dosis también puede comprender de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal, 0,5 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 750 mg/kg de peso corporal, a aproximadamente 1.000 mg/kg de peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo que se pueda derivar de los mismos. En ejemplos no limitantes de un intervalo que se puede derivar de las cifras indicadas en el presente documento, puede administrarse un intervalo de aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, etc., basándose en los números descritos anteriormente. En determinadas realizaciones de la invención, se contemplan diversos mecanismos de dosificación. Por ejemplo, la composición puede administrarse una o más veces al día, una o más veces a la semana o una o más veces al mes, etc.
En cualquier caso, la composición puede comprender diversos antioxidantes para retardar la oxidación de uno o más componentes. Adicionalmente, la prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante conservantes tales como diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, incluyendo, pero sin limitación, parabenos (por ejemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tiomersal o combinaciones de los mismos.
La composición puede formularse en una forma de base libre, neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales formadas con los grupos carboxilo libres derivados de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, hidróxidos de calcio o férricos; o bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína.
En realizaciones donde la composición está en forma líquida, un vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que comprende, pero sin limitación, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido, etc.), lípidos (por ejemplo, triglicéridos, aceites vegetales, liposomas) y combinaciones de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, usando un recubrimiento, tal como lecitina; mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido por dispersión en vehículos tales como, por ejemplo, poliol líquido o lípidos; mediante el uso de tensioactivos tales como, por ejemplo, hidroxipropilcelulosa; o combinaciones de los mismos dichos métodos. En muchos casos, se preferirá incluir agentes isotónicos, tales como, por ejemplo, glúcidos, cloruro de sodio o combinaciones de los mismos.
Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando la presente invención en la cantidad necesaria del disolvente apropiado con diversas cantidades de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los otros ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, suspensiones o emulsiones, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío o liofilización que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de un medio líquido previamente esterilizado por filtración del mismo. El medio líquido debe estar tamponado de manera adecuada si fuera necesario, y el diluyente líquido se hará previamente isotónico antes de la inyección con suficiente solución salina o glucosa. También se contempla la preparación de composiciones muy concentradas para inyección directa, donde se prevé el uso de DMSO como disolvente para dar lugar a una penetración extremadamente rápida, lo que administra altas concentraciones de los agentes activos en un área pequeña.
La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas debe mantenerse al mínimo en un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína.
En realizaciones particulares, puede lograrse la absorción prolongada de una composición inyectable mediante el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.
VIII. Kits
Cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento puede estar comprendida en un kit y están alojadas en un recipiente adecuado. Los kits comprenderán, por tanto, en un medio de recipiente adecuado, una o más composiciones y, en algunos casos, un agente adicional de la presente invención. En algunos casos, existen uno o más agentes distintos a los de la composición de la divulgación que se incluyen en el kit, tales como uno o más agentes distintos para el tratamiento de atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia y/o uno o más agentes para el tratamiento de una afección subyacente asociada con atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia. En realizaciones particulares, existe un aparato o cualquier tipo de medio para el diagnóstico de atrofia muscular y/o debilidad muscular y/o caquexia.
Los componentes de los kits pueden envasarse en medios acuosos o en forma liofilizada. El medio de recipiente de los kits en general incluirá al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, frasco, jeringuilla u otro medio de recipiente, en el que pueda colocarse un componente y, preferentemente, dividirse en alícuotas adecuadamente. Cuando existe más de un componente en el kit, el kit también contendrá en general un segundo, tercer u otro recipiente adicional en el que pueden colocarse los componentes adicionales por separado. Sin embargo, en un vial pueden estar comprendidas diversas combinaciones de componentes. Los kits de la presente invención también incluirán normalmente un medio para contener la composición, un agente adicional y cualquier otro recipiente de reactivos en aislamiento hermético para su venta comercial. Dichos recipientes pueden incluir recipientes de plástico moldeados por inyección o por soplado en los que se conserven los viales deseados.
Las composiciones también pueden formularse en una composición inyectable. En cuyo caso, el propio medio de recipiente puede ser una jeringa, una pipeta y/u otro aparato similar, desde el que puede aplicarse la formulación a una zona infectada del cuerpo, inyectarse en un animal y/o incluso aplicarse a y/o mezclarse con los otros componentes del kit. Sin embargo, los componentes del kit pueden proporcionarse como un polvo o polvos secos. Cuando los reactivos y/o los componentes se proporcionan como un polvo seco, el polvo puede reconstituirse mediante la adición de un disolvente adecuado. Se prevé que el disolvente también pueda proporcionarse en otro medio de recipiente.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la materia apreciarán que, en la medida en que los siguientes ejemplos se refieren a materia objeto no definida en las reivindicaciones, se proporcionan con fines de referencia.
EJEMPLO 1
MATERIALES Y MÉTODOS ILUSTRATIVOS
Cribado virtual de ligandos. Los autores de la invención aislaron la estructura tridimensional del dominio SH2 de Stat3 de la estructura del fragmento central de los homodímeros de Stat3 fosforilados unidos al ADN (Becker et al., 1998) depositada en el banco de datos RCSB Protein Data Bank (PDB) (código del PDB 1BG1) y convertida en un sistema compatible con Mecánica de Coordinación Interna (ICM) mediante la adición de átomos de hidrógeno, modificando aminoácidos inusuales, haciendo ajustes de carga y realizando etapas de limpieza adicionales. Además, los autores de la invención recuperaron las coordenadas del dominio SH2 de Stat1 del banco de datos PDB (código del PDB 1BF5) para usarlas en el análisis de selectividad por ordenador (Chen et al., 1998). Las bases de datos de sustancias químicas comerciales (Chembridge, Asinex, ChemDiv, Enamine, Keyorganics y Life Chemicals) se eligieron como fuentes de compuestos para el cribado informático. La selección fue el hidrógeno de la amida de E638 dentro del sitio que se une al residuo 3 (Q, C o T) dentro del ligando peptídico con pY (Shao et al., 2006) como punto central de la cavidad de unión, que consistía en un cubo con unas dimensiones de 16,0 x 16,9 x 13,7 ángstroms. Además del sitio de unión 3, este cubo contenía el sitio de unión al residuo pY que consistía principalmente en R609 y K591 (Shao et al., 2006) y un sitio de unión hidrófobo que consistía en el buclepC-pD y el bucleaB-aC. La alineación de secuencias y la superposición de las estructuras de Stat3 y Stat1 revelaron diferencias sustanciales en la secuencia de estos bucles; la ausencia de su superposición indicó que esta región podría servir como filtro de selectividad (Cohen et al., 2005). Se realizó un cálculo de acoplamiento flexible (Totrov y Abagyan, 1997) para determinar la puntuación de la energía mínima global y, de ese modo, predecir la conformación óptima del compuesto dentro de la cavidad. Se seleccionó un compuesto para adquisición y pruebas bioquímicas tomando como base el cumplimiento de los criterios del análisis de interacción (CIA): 1) puntuación de la energía mínima global <-30, 2) formación de un puente salino y/o de una red de puentes de H dentro del sitio de unión al residuo pY y 3) formación de un puente de H con o bloqueando el acceso al hidrógeno de la amida de E638. La mayor parte de, aunque no todos, los compuestos interactuaron también con el sitio de unión hidrófobo.
Ensayo de unión de SH2 de Stat3/péptido pY. Los ensayos de unión de Stat3 se realizaron a 25 °C con un biosensor BIAcore 3000 usando tampón Tris 20 mM pH 8 que contenía mercaptoetanol 2 mM y DMSO al 5 % como tampón de migración (Kim et al. 2005). Los dodecapéptidos derivados de EGFR biotinilados fosforilados y no fosforilados de control basados en la secuencia que rodea a Y1068 (Shao et al., 2004) se inmovilizaron en un chip sensor recubierto con estreptavidina (BIAcore Inc., Piscataway NJ). La unión de Stat3 se realizó en tampón Tris 20 mM pH 8 que contenía p-mercaptoetanol 2 mM a un caudal de 10 ul/min durante 1-2 minutos. Se mezclaron previamente partes alícuotas de Stat3 a 500 nM con compuesto para lograr una concentración final de 1-1.000 uM y se incubaron a 4 °C antes de inyectarlas en el chip sensor. El chip se regeneró inyectando 10 ul de glicina 100 mM a pH 1,5 después de cada inyección de muestra. Se procesó un control (Stat3 con DMSO, pero sin compuesto) al principio y al final de cada ciclo (40 inyecciones de muestra) para garantizar que la integridad del chip sensor se mantuviera durante todo el ciclo. El promedio de los dos controles se normalizó al 100 % y se usó para evaluar el efecto de cada compuesto sobre la unión de Stat3. Las respuestas se normalizaron dividiendo el valor a los 2 minutos por la respuesta obtenida en ausencia de compuestos a los 2 minutos y multiplicando por 100. Los valores de CI50 se determinaron representando gráficamente el % de respuesta máxima en función del logaritmo de la concentración del compuesto y ajustando los puntos experimentales a un modelo de unión competitiva usando una ecuación logística de cuatro parámetros: R = Ralto -(Ralto -Rbajo)/ (1 conc/A1)A2, donde R = porcentaje de respuesta a la concentración de inhibidor, Ralto = porcentaje de respuesta sin compuesto, Rbajo= porcentaje de respuesta a la concentración de compuesto más alta, A2 = parámetro de ajuste (pendiente) y A1 = CI50 (programa informático BIAevaluation versión 4.1).
Ensayo de inmunotransferencia. Se cultivó la línea celular de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) en placas de 6 pocillos en condiciones normales. Las células se trataron previamente con compuestos (0, 1, 3, 10, 30, 100 y 300 uM) durante 1 hora y a continuación se estimularon en condiciones óptimas con interferón gamma (IFN-y; 30 ng/ml durante 30 min) para activar Stat1, o interleucina-6 (IL-6; 30 ng/ml durante 30 min) para activar Stat3 (30-31). A continuación se recuperaron los cultivos y se extrajeron las proteínas usando tampón de alta salinidad, como se describe (Shao et al., 2006). En resumen, los extractos se mezclaron con tampón de muestra de laurilsulfato de sodio (SDS) 2X (125 mmol/l de Tris-HCl a pH 6,8; SDS al 4 %; glicerol al 20 %; 2-mercaptoetanol al 10 %) en una relación 1:1 y se calentaron durante 5 minutos a 100 °C. Las proteínas (20 |jg) se separaron por SDS-PAGE al 7,5 % y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Waltham, MA) y se inmunotransfirieron. Se incluyeron marcadores de peso molecular prefijados (Biorad, Hercules, CA) en cada gel. Las membranas se investigaron en serie con anticuerpos contra pY701 de Stat1 o pY705 de Stat3 seguido de anticuerpos contra Stat1 o Stat3 (Transduction labs, Lexington, KY) y después un anticuerpo contra actina p (Abcam, Cambridge, MA). Las membranas se desprendieron entre cada investigación con anticuerpos usando tampón de desprendimiento de inmunoelectrotransferencia Restore™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) según las instrucciones del fabricante. Se usó anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante como anticuerpo secundario (Invitrogen Carlsbad, CA) y las membranas se revelaron con un sistema de detección de quimioluminiscencia potenciada (ECL) (Amersham Life Sciences Inc.; Arlington Heights, IL.).
Cribado de similitud. Tres compuestos identificados en el cribado de ligando virtual inicial (VLS), Cpd3, Cpd30 y Cpd188, inhibieron la unión de SH2 de Stat3/péptido pY y la fosforilación de Stat3 mediada por IL-6, y se eligieron como moléculas de referencia para el cribado de similitud. Se envió una consulta de similitud de huella molecular para cada compuesto de referencia a Molcart/ICM (distancia máxima, 0,4). Se calculó la similitud entre cada molécula de referencia y cada molécula de la base de datos, y los resultados de similitud se clasificaron en orden decreciente de puntuación de similitud de ICM (Eckert y Bajorath, 2007). Las bases de datos consultadas incluyeron ChemBridge, LifeChemicals, Enamine, ChemDiv, Asinex, AcbBlocks, KeyOrganics y PubChem para un total de 2,47 millones de compuestos. Todos los compuestos identificados se acoplaron informáticamente a la cavidad de unión del dominio SH2 de Stat3. Los compuestos que cumplían los criterios CIA se adquirieron y se analizaron como se describe para los compuestos identificados en el cribado principal.
Ensayo del cambio en la movilidad electroforética (EMSA): el EMSA se realizó usando el oligonucleótido bicatenario radiomarcado hSIE como sonda como se describe (Tweardy et al., 1995). En resumen, se prepararon extractos con alto contenido de sal a partir de células HepG2 incubadas sin o con IL-6 (30 ng/ml) durante 30 minutos. La concentración de proteína se determinó mediante el ensayo de Bradford y se incubaron 20 ug de extracto con compuesto (300 uM) durante 60 minutos a 37 °C. La sonda hSIE unida y no unida se separó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (4,5 %). Los geles se secaron y se autorradiografiaron.
Modelado molecular. Todas las configuraciones tridimensionales del dominio SH2 de Stat3 en complejo con compuestos se determinaron mediante una optimización de la energía global que implica múltiples etapas: 1) la ubicación de las moléculas orgánicas se ajustó como un todo en una amplitud de 2 A mediante traslaciones y rotaciones aleatorias seudobrownianas alrededor del centro de gravedad molecular, 2) las variables internas de las moléculas orgánicas se cambiaron al azar. 3) los grupos acoplados dentro de los ángulos de torsión de la cadena lateral del dominio SH2 de Stat3 se muestrearon con variaciones grandes de la probabilidad sesgadas mientras se fijaban las otras variables de la proteína, 4) las minimizaciones de la energía local se realizaron usando el Programa de Energía de Conformación Empírica para Péptidos de tipo 3 (ECEPP3) en vacío (Nemethy et al., 1992) con una constante dieléctrica dependiente de la distancia £ = 4r, la energía del disolvente basada en la superficie y las contribuciones entrópicas de las cadenas laterales de la proteína evaluadas añadidas, y 5) las conformaciones del complejo, que se determinaron según los criterios de Metrópolis, se seleccionaron para el siguiente ciclo de cribado de la conformación. La configuración tridimensional inicial del dominio SH2 de Stat1 en un complejo con cada compuesto se predijo y se generó mediante superposición, dentro del modelo informático, de las características tridimensionales de Sh 2 de Stat1 sobre la configuración tridimensional del dominio SH2 de Stat3 en un complejo con cada compuesto. El modelo informático final de SH2 de Stat1 en un complejo con cada compuesto se determinó por minimización local usando mecánica molecular basada en el Campo de Fuerzas de Coordenadas Internas (ICFf ) (Totrov y Abagyan, 1997). Los autores de la invención calcularon la energía de Van der Waals del complejo de Stat1 o 3-SH2 unido a cada compuesto usando el potencial de Lennard-Jones con el campo de fuerza ECEPP/3 (Nemethy et al., 1992).
Microscopia de fluorescencia confocal y de alto rendimiento. La microscopia de fluorescencia confocal y de alto rendimiento (HTFM) de las células MEF/GFP-Stat3a se realizó como se describe (Huang et al., 2007). En resumen, para la microscopia de fluorescencia confocal, las células se cultivaron en placas de 6 pocillos que contenían un cubreobjetos. Para la HTFM, las células se sembraron en placas CC3 de 96 pocillos a una densidad de 5.000 células/pocillo usando un sistema de siembra en placa automático. Las células se cultivaron en condiciones normales hasta un 85-90 % de confluencia. Las células se trataron previamente con compuesto durante 1 hora a 37 °C y a continuación se estimularon con IL-6 (200 ng/ml) e IL-6sR (250 ng/ml) durante 30 minutos. Las células se fijaron con formaldehído al 4 % en tampón PEM (PIPES potásico 80 mM, pH 6,8, EGTA 5 mM pH 7,0, MgCh 2 mM) durante 30 minutos a 4 °C, se inactivaron en 1 mg/ml de NaBH4 (Sigma) en tampón PEM y se tiñeron con contraste durante 1 minuto en 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Sigma; 1 mg/ml) en tampón PEM. Los cubreobjetos se examinaron por microscopia de fluorescencia confocal. Las placas se analizaron mediante HTFM automatizada usando la plataforma Cell Lab IC Image Cytometer (IC100) y el programa informático de análisis Cytoshop versión 2.1 (Beckman Coulter). La translocación nuclear se cuantifica usando la fracción localizada en la medición del núcleo (FLIN) (Sharp et al., 2006).
EJEMPLO 2
IDENTIFICACIÓN POR VLS DE COMPUESTOS QUE BLOQUEABAN LA UNIÓN DE STAT3 A SU LIGANDO FOSFOPEPTÍDICO E INHIBÍAN LA FOSFORILACIÓN DE STAT3 MEDIADA POR IL-6
Se usó el protocolo de VLS para evaluar un total de 920.000 compuestos medicamentosos. De estos, 142 compuestos cumplieron los criterios CIA. Estos compuestos se adquirieron y analizaron para determinar su capacidad de bloquear la unión de Stat3 a su ligando fosfopeptídico en un ensayo de unión basado en resonancia de plasmón superficial (RPS) y para inhibir la fosforilación de Stat3 mediada por IL-6. Los experimentos de competencia por RPS mostraron que, de los 142 compuestos analizados, 3 compuestos, Cpd3, Cpd30 y Cpd188, podían competir directamente con el péptido pY por la unión a Stat3 con valores de CI50 de 447, 30 y 20 pM, respectivamente (figuras 1 y 3; tabla 4).
m
Figure imgf000020_0001
1Los datos presentados son la media o la media ± DE; ND = no determinado.
Además, cada compuesto inhibió la fosforilación de Stat3 mediada por IL-6 con valores de CI50 de 91, 18 y 73 pM, respectivamente (figura 2; tabla 4).
El cribado de similitud con Cpd3, Cpd30 y Cpd188 identificó 4.302 compuestos adicionales. Se realizó un cribado de VLS con cada uno de estos compuestos, que identificó 41 compuestos que cumplían los criterios CIA; estos se adquirieron y se analizaron. Los experimentos de competencia por RPS mostraron que, de estos 41 compuestos, 3 compuestos, Cpd3-2, Cpd3-7 y Cpd30-12, podían competir directamente con el péptido pY por la unión a Stat3 con valores de CI50 de 256, 137 y 114 pM, respectivamente (figuras 1 y 3; tabla 4). Además, cada compuesto inhibió la fosforilación de Stat3 mediada por IL-6 con valores de CI50 de 144, 63 y 60 pM, respectivamente (figura 2; tabla 4).
EJEMPLO 3
LA INHIBICIÓN MEDIADA POR COMPUESTO DE LA FOSFORILACIÓN ESTIMULADA POR LIGANDO DE STAT3 ES ESPECÍFICA PARA STAT3 CON RESPECTO A STAT1
Mientras que Stat3 interviene en la oncogénesis, en parte, a través de la inhibición de la apoptosis, Stat1 es antioncogénica; media en los efectos apoptóticos de los interferones e interviene a la vigilancia del tumor (Kaplan et al., 1998; Ramana et al., 2000). Como consecuencia, los compuestos que se dirigen a Stat3 evitando Stat1, dejando sus funciones antioncogénicas sin oposición, pueden dar como resultado un efecto antitumoral sinérgico. Para evaluar la selectividad de los compuestos por Stat3 con respecto a Stat1, se incubaron células HepG2 con Cpd3, Cpd30, Cpd188, Cpd3-2, Cpd3-7 y Cpd30-12 (300 pM) durante 1 hora a 37 °C antes de la estimulación con IFN-y (figura 4). Solo el tratamiento con Cpd30-12 bloqueó la fosforilación de Stat1, mientras que cada uno de los otros cinco compuestos, Cpd3, Cpd30, Cpd188, Cpd3-2 y Cpd3-7, no lo hicieron. Por tanto, cinco de los seis compuestos ilustrativos identificados fueron selectivos e inhibieron la fosforilación estimulada por ligando de Stat3, pero no de Stat1.
EJEMPLO 4
ANÁLISIS DE SECUENCIA Y MODELADO MOLECULAR DE LA INTERACCIÓN DE CADA COMPUESTO CON EL DOMINIO SH2 DE STAT3 FRENTE A STAT1
Para comprender a nivel molecular la base de la selectividad de los Cpd 3, 30, 188, 3-2 y 3-7 y la ausencia de selectividad en el caso de Cpd 30-12, se compararon las secuencias de aminoácidos y las estructuras disponibles del dominio SH2 de Stat1 y Stat3 y también se examinó la manera en que interactuaba cada compuesto con ambos. La alineación de secuencias reveló identidad en los residuos dentro de Stat3 y de Stat1 correspondientes al sitio de unión para el residuo pY y el residuo 3 (figura 5A). Además, la superposición de las estructuras de SH2 de Stat3 y Stat1 reveló que los bucles que contenían estos sitios de unión estaban superpuestos (figura 5B). Por el contrario, la alineación de secuencias reveló diferencias sustanciales en la secuencia de las regiones del dominio SH2 correspondientes a los bucles que forman el sitio de unión hidrófobo (figura 5A). Además, la revisión de la superposición de los dominios SH2 de Stat3 y Stat1 reveló que, a diferencia de la estrecha yuxtaposición de los dos bucles de Stat3 que forman el sitio de unión hidrófobo, los dos bucles correspondientes de Stat1 no están estrechamente yuxtapuestos para formar una cavidad (figura 5B).
La revisión de los modelos informáticos de Cpd3, Cpd30, Cpd188, Cpd3-2 y Cpd3-7 en un complejo con el dominio SH2 de Stat3 reveló que cada uno tiene interacciones significativas con la cavidad de unión del dominio SH2 de Stat3 en los tres sitios de unión, el sitio de unión al residuo pY, el sitio de unión al residuo 3 y el sitio de unión hidrófobo (figura 6A, B, C, D y E). Por el contrario, Cpd30-12 interactúa con el sitio de unión al residuo pY y bloquea el acceso al sitio de unión al residuo 3, pero no interactúa ni bloquea el acceso al sitio de unión hidrófobo (figura 6F). Además, las energías de Van der Waals de los 5 compuestos selectivos eran mucho más favorables para su interacción con los bucles de Stat3 que forman el sitio de unión hidrófobo que con los bucles correspondientes de Stat1 (figura 5C). Por tanto, el modelado por ordenador indicó que la actividad de los compuestos contra Stat3 deriva de su capacidad de interactuar con los sitios de unión para los residuos pY y 3 dentro de la cavidad de unión, mientras que la selectividad por Stat3 con respecto a Stat1 deriva de la capacidad de los compuestos de interactuar con el sitio de unión hidrófobo dentro de la cavidad de unión de SH2 de Stat3, lo que sirvió como filtro de selectividad.
EJEMPLO 5
INHIBICIÓN DE LA TRANSLOCACIÓN NUCLEAR DE STAT3 FOSFORILADO POR PARTE DE CPD3, CPD30, CPD188, CPD3-2 Y CPD3-7 EVALUADA POR HTFM
Después de su fosforilación en Y705, Stat3 experimenta un cambio en la conformación desde la dimerización entre las cabezas mediada a través de su dominio de oligomerización aminoterminal hasta la dimerización entre colas mediada por interacciones recíprocas de SH2/ligando peptídico con pY705. Este cambio conformacional está seguido por una acumulación nuclear. Se esperaría que los compuestos que se dirigen a las interacciones de SH2/ligando peptídico con pY de Stat3 inhibieran la acumulación nuclear de Stat3. Para determinar si este era el caso con los compuestos del presente documento, se empleó un ensayo de translocación nuclear (figura 7) usando células de fibroblastos embrionarios murinos (MEF) que son deficientes en Stat3 endógeno, pero expresan de forma constitutiva Stat3a marcado con GFP a niveles endógenos, MEF/GFP-Stat3 a (Huang et al., 2007). La incubación previa de células MEF/GFP-Stat3 a con Cpd3, Cpd30, Cpd188, Cpd3-2 y Cpd3-7, pero no con Cpd30-12, bloqueó la translocación nuclear mediada por ligando de GFP-Stat3 a con valores de CI50 de 131, 77, 39, l5o y 20 pM (figura 7 y tabla 4).
EJEMPLO 6
DESESTABILIZACIÓN DE COMPLEJOS DE STAT3-ADN POR PARTE DE CPD3 Y CPD3-7
Una vez en el núcleo, los dímeros de Stat3 se unen a elementos de ADN específicos para activar y, en algunos casos, reprimir la transcripción génica. Los dodecapéptidos con tirosina fosforilada basados en motivos dentro de los receptores que reclutan Stat3 han demostrado previamente que desestabilizan Stat3 (Chakraborty et al., 1999; Shao et al., 2003). Se podría esperar que los compuestos que se unen al sitio de unión a fosfopéptidos de Stat3 hagan lo mismo. Para determinar si este era el caso de cualquiera de los compuestos identificados, se incubaron extractos de células HepG2 estimuladas con IL-6 en reacciones de unión que contenían hSIE radiomarcado (figura 8) y cada uno de los cinco compuestos selectivos (300 pM). La incubación con Cpd3 o Cpd3-7 redujo la cantidad de hSIE desplazada a la mitad o más. Los otros compuestos no tuvieron un efecto detectable sobre la intensidad de la banda de Stat3:hSIE. Por tanto, 2 de los 5 compuestos selectivos desestabilizaron los complejos de Stat3:hSIE.
EJEMPLO 7
ESTRATEGIA ILUSTRATIVA DE INHIBIDORES DE STAT3 PARA CÉLULAS MADRE CANCEROSAS
En el campo del desarrollo de sondas de Stat3, los autores de la invención se han centrado en sondas de Stat3 micromoleculares (Xu et al., 2009) y son útiles varias características del programa de moléculas pequeñas, incluyendo: 1) un modo de acción claramente definido de estas sondas: se dirigen al dominio de homología a Src (SH) 2 de Stat3 que está implicado en 2 etapas en la ruta de activación de Stat3; 2) su especificidad de acción; y 3) la posibilidad de usar sondas de guía identificadas hasta ahora para identificar sondas con una actividad mayor en 2 a 3 unidades logarítmicas tomando como base los análisis de la SAR recientes e ilustrativos y las consideraciones de química de la medicina que se presentan a continuación.
En realizaciones específicas, la afinidad de los compuestos se mejora al obtener una mayor afinidad en la escala logarítmica al pasar de sondas de 1.a generación a 2.a generación usando un análisis tridimensional de farmacóforos. Además, la selectividad se mejora a través de realizaciones de modelado, en particular a través de la identificación de un dominio de unión hidrófobo distinto en la cavidad de unión a fosfopéptidos de SH2 de Stat3 con respecto a SH2 de Stat1 (Xu et al., 2009).
Identificación de sondas químicas de Stat3 de 1.a generación. Para desarrollar sondas químicas que se dirijan selectivamente a Stat3, los autores de la invención cribaron casi 920.000 compuestos pequeños medicamentosos acoplando cada uno en la cavidad de unión a péptidos del dominio SH2 de Stat3, que consiste en tres sitios: el sitio de unión al residuo pY, el sitio de unión al residuo 3 y un sitio de unión hidrófobo, lo que sirvió como filtro de selectividad (Xu et al., 2009). Tres compuestos (Cpd3, Cpd30 y Cpd188) cumplieron los criterios de análisis de interacción, inhibieron competitivamente la unión de Stat3 recombinante a su ligando peptídico con pY inmovilizado e inhibieron la fosforilación de la tirosina de Stat3 mediada por IL-6. Estos compuestos se usaron en un cribado de similitud de 2,47 millones de compuestos, que identificó 3 compuestos más (Cpd3-2, Cpd3-7 y Cpd30-12) con actividades similares. Los análisis de los 6 compuestos activos para evaluar la capacidad de inhibir la fosforilación de Statl mediada por IFN-y revelaron que todos, excepto Cpd30-12, eran selectivos para Stat3. El modelado molecular de los dominios SH2 de Stat3 y Statl unidos al compuesto reveló que la interacción del compuesto con el sitio de unión hidrófobo era la base de la selectividad. Los 5 compuestos selectivos inhibieron la translocación de nuclear a citoplásmica de Stat3, mientras que 3 de los 5 compuestos (Cpd3, Cpd30 y Cpd188) indujeron la apoptosis preferentemente de líneas celulares de cáncer de mama ilustrativas con una activación constitutiva de Stat3.
Identificación de sondas químicas de Stat3 de 2.a generación. El cribado de similitud descrito anteriormente no produjo ningún resultado usando Cpd188, el más activo de los 3 compuestos de partida, como compuesto de consulta. Como consecuencia, los autores de la invención repitieron el cribado de similitud bidimensional usando el armazón de Cpd188 como estructura de consulta y la colección de Life Chemicals, lo que produjo 207 resultados. Se realizó un análisis tridimensional de farmacóforos con estos 207 compuestos usando Ligand Scout y se adquirieron los 39 compuestos con mejor puntuación y se ensayaron mediante RPS para evaluar la inhibición de la unión de Stat3 a su ligando fosfopeptídico. Todos excepto seis de estos 39 compuestos tienen unas CI50 medibles por RPS, teniendo 19 de ellos valores de CI50 iguales o menores a los del compuesto precursor, y teniendo 2 de ellos (Cpd188-9 y Cpd188-15) valores de CI50 una unidad logarítmica menor. El análisis de estos l9 compuestos ha revelado una correlación estadísticamente significativa entre las puntuaciones de farmacóforos tridimensionales y las CI50 por RPS, así como la puntuación de farmacóforos tridimensionales y las CI50 para la inhibición de la translocación de citoplásmica a nuclear mediada por ligando. Además, tanto Cpd188-9 como Cpd188-15 mostraron una actividad mayor en una unidad logarítmica en la inducción de la apoptosis de la línea celular leucémica humana que el Cpd188 precursor (figura 15). Además, Cpd188-38 mostró una actividad 2 unidades logarítmicas mayor que el Cpd188 precursor en la inhibición de la translocación de citoplásmica a nuclear en el ensayo de HTFM, mientras que Cpd188-15 mostró una actividad 1 unidad logarítmica mayor que el Cpd188 precursor en la disminución de MSFE (tabla 5). Además, varios de los compuestos similares a 188 de segunda generación representan una mejora sustancial con respecto a Cpd188 desde un punto de vista de química de la medicina, metabolismo y biodisponibilidad. En particular, Cpd188-9 carecía de ambos grupos carboxilo, lo que en casos particulares mejora la permeabilidad celular y/o el grupo tioéter, que está sujeto a oxidación. R2 = 0,2 P = 0,013 (j M)
T l : m ri rmin m imil r 1 2. n r i n
Figure imgf000022_0001
*media ± DE
** Xu et al. PLoS ONE
*** Células SUM159PT y HS578T en placa (6 pocillos por ensayo) sin o con compuesto a 1,10 o 100 j M, incubadas 3 d; esferas contadas el día 3.
Análisis de la relación estructura-actividad (SAR) de las sondas de Stat3 de 2.a generación. La totalidad de los 39 compuestos de segunda generación descritos anteriormente, más el propio Cpd188, son derivados de N-naft-1-ilbencensulfamida. Tras un cuidadoso análisis de sus relaciones estructura-actividad (SAR), los autores de la invención descubrieron que la mayoría de estos compuestos similares a Cpd188 (38 de 40: los 2 restantes son débiles y se describirán a continuación en EXP ID) pueden dividirse en tres grupos estructurales en una tendencia general de disminución de la actividad, como se muestra en la figura 16. Cinco compuestos del grupo III son en realidad los precursores de los compuestos de los grupos I y II. La adición de una variedad de grupos (el grupo -R resaltado en rojo en la estructura general del grupo I en la figura 16), tal como un grupo triazol-3-il-mercapto (188-15) o cloro (188­ 10), a la posición 3 del anillo de naftilamina dio lugar a los compuestos del grupo I, que son la serie más potente de sondas de Stat3. En una realización específica, este es el factor contribuyente más importante a la actividad inhibidora: en los compuestos del grupo I se encuentra un total de ocho sustituyentes en 3, que potencian invariablemente la actividad en varios órdenes de magnitud.
La mayoría de las sondas de Stat3 del grupo II contienen un anillo de 5 miembros que combina los grupos 3-R y 4-OR2, tal como un furano (188-11). Sin embargo, los compuestos de este grupo son, en promedio, ~5 veces menos activos que los compuestos del grupo I, lo que indica que, en determinados aspectos, el átomo de H del grupo 4-hidroxi (resaltado en azul en la estructura general del grupo I en la figura 16) es importante, por ejemplo, está implicado en un puente de H favorable con la proteína. La falta de capacidad para formar el puente de H se atribuye a las actividades más débiles de las sondas del grupo II, en casos particulares. Estas consideraciones subyacen a una estrategia de química de la medicina que se presenta a continuación.
EJEMPLO 8
QUÍMICA DE LA MEDICINA PARA LA SÍNTESIS DE SONDAS DE SULFAMIDA DE STAT3 SIMILARES A 188 DE 3.a GENERACIÓN
La estructura cristalina de Stat3 muestra que el dominio SH2 tiene una gran área de unión ampliamente dispersa y en general poco profunda con varios valles y colinas que reconocen el ligando del péptido pY (figura 18). El modelado molecular basado en la estructura (acoplamiento) fue útil para identificar la contribución de la superficie de unión hidrófoba del dominio SH2 de Stat3 como filtro de selectividad (Xu et al., 2009). Sin embargo, diferentes programas de acoplamiento dieron distintas orientaciones de unión para la misma sonda sobre la superficie de unión, con afinidades de unión pronosticadas similares. Los autores de la invención, por lo tanto, en realizaciones particulares, tomando como base los resultados iniciales de la SAR descritos anteriormente, usan la química tradicional de la medicina para llevar a cabo además un estudio ilustrativo integral de la relación estructura-actividad, para optimizar la actividad, así como la selectividad, de esta novedosa clase de sondas de sulfamida de Stat3. El compuesto 188-15 sirve de armazón para preparar los compuestos de nueva generación, como se muestra esquemáticamente (figura 16).
Además, la química para preparar estos compuestos es sencilla con un buen rendimiento, lo que implica la reacción de un cloruro de sulfonilo con una anilina/amina, que puede obtenerse comercialmente o sintetizarse fácilmente.
Para las modificaciones propuestas que se describen a continuación, se puede consultar la figura 17. EXP IA. Modificación 1. Dado que casi todas las sondas de 2.a generación contienen un grupo fenilsulfonilo, la primera etapa hacia la optimización de la actividad se centra en sintetizar una serie de compuestos que tengan un grupo (por ejemplo, bicíclico o tricíclico) más grande o un alquilsulfonilo. La ruta sintética general se muestra a continuación:
Existen aproximadamente 4.300 cloruros de sulfonilo disponibles en el mercado, entre los que 25, tales como los mostrados anteriormente, se seleccionan para preparar sondas. La anilina 2, que es el componente de amina del compuesto 188-10 (figura 16), una de las sondas más activas, se prepara fácilmente en una reacción simple de dos etapas a partir del nitrocompuesto 1. En primer lugar, pueden prepararse 25 compuestos (por ejemplo) y someter a prueba sus actividades en ensayos de RPS in vitro de rendimiento rápido y de HTFM in vivo. Tomando como base los resultados del estudio de la relación estructura-actividad, pueden diseñarse y sintetizarse más compuestos y analizarse de forma iterativa hasta la optimización de esta modificación.
EXP IB. Modificación 2. A continuación, puede modificarse el sustituyente 3 del anillo de naftilamina, tomando como base la estructura del compuesto 188-15, por ejemplo. Estudios previos de la SAR demostraron que este sustituyente es útil para la actividad de esta clase de sondas, en determinadas realizaciones. Sin embargo, un total de 8 grupos en esta posición con una gran diferencia de tamaño, desde un solo átomo de Cl hasta un grupo benzotiazol-2-ilmercapto bicíclico grande, mostraron actividades similares. Este rasgo característico indica que, en determinadas realizaciones, las modificaciones en esta posición deben centrarse más en otras propiedades, tales como las interacciones electrostáticas con la proteína, como se ejemplifica a continuación. Además, muchos de estos grupos son tioéteres, que pueden estar sujetos a oxidación/degradación in vivo y dar lugar a un perfil farmacocinético desfavorable, en aspectos particulares. El átomo central -S- se cambia a isósteros metabólicamente más estables, tales como -CH2-, -n H- y -O-, en determinados casos. En determinados aspectos, pueden sintetizarse los siguientes compuestos para optimizar el sustituyente en la posición 3:
La síntesis también se inicia desde 1, en determinados casos. La halogenación regioselectiva y la formilación en la posición 3 da lugar a dos compuestos, es decir, compuesto 3 con bromo o yodo y aldehído 4, que son compuestos de partida versátiles, comunes para introducir una amplia gama de sustituyentes en esta posición (por ejemplo, los enumerados anteriormente).
Por otra parte, la estructura cristalina del dominio SH2 de Stat3 también proporciona una prueba importante de que más compuestos con diferentes propiedades electrostáticas son útiles para la caracterización. La superficie molecular electrostática de la proteína muestra dos rasgos característicos distintos, como se muestra en la figura 18. La primera es la superficie de Glu638 cargada negativamente que sobresale en el centro. A continuación, es de particular interés un área cargada positivamente, compuesta por la Arg609 y la Lys591, ubicadas en el borde del dominio, que es en realidad el sitio de unión a pY (tirosina fosforilada) del receptor. Los autores de la invención también descubrieron que la introducción de un grupo con carga negativa dirigido al sitio de unión a pY da lugar a sondas particularmente activas, en determinadas realizaciones. Por ejemplo, el estudio de acoplamiento del compuesto 5 con 3-fosfometilo (R = CH2PO32-) mostró que todos los grupos fosfonato de las 20 orientaciones de acoplamiento están estrechamente agrupados entre sí y ubicados en el sitio de unión a pY, lo que indica fuertes interacciones electrostáticas y de puente de H con los residuos Arg609 y Lys591 (figura 18).
EXP IC. Modificaciones 3 y 4. En conjunto, las modificaciones 3 y 4 prueban los efectos de cambiar los sustituyentes en las posiciones 4, 5 y 6. El -OH en la posición 4 puede ser superior a -OR, en determinados aspectos. Puede analizarse si el átomo de H del -OH es responsable de una mejor actividad sintetizando los compuestos 6 (acilados o alquilados en la posición 5), como se muestra esquemáticamente a continuación. Además, también pueden prepararse los compuestos 7 con deshidroxi, partiendo de 3-bromonaftil-1-amina.
Con respecto a los métodos sintéticos generales para modificar las posiciones 5 y 6, en primer lugar puede sintetizarse aproximadamente una docena de estos compuestos en esta categoría y, si surgen compuestos muy activos, pueden prepararse más compuestos para optimizar la actividad para estas dos posiciones.
EXP ID. Modificación 5. Aquí se muestran los únicos dos compuestos no incluidos en el análisis de SAR (debido a un sustituyente diferente en la posición 4), así como sus actividades inhibidoras contra Stat3:
A pesar de la débil actividad, es favorable enmascarar el H polar de la sulfamida para el segundo compuesto, en determinados aspectos, lo que proporciona una ruta fácil para preparar sondas más potentes. Por lo tanto, puede usarse el siguiente método para preparar una serie de N-acil o N-alquil sulfamidas 5:
EJEMPLO 9
IDENTIFICACIÓN DE SONDAS QUÍMICAS SELECTIVAS DE STAT3 A PARTIR DE COMPUESTOS DE SULFAMIDA SINTETIZADOS EN EL EJEMPLO 11
Se analiza la capacidad de cada compuesto de sulfamida novedoso de inhibir la unión de Stat3 a su ligando fosfopeptídico por RPS, y la capacidad de bloquear la translocación de citoplásmica a nuclear estimulada por IL-6 en el ensayo de HTFM. Las sondas con actividad en estos ensayos equivalentes o mayores que los compuestos de 2.a generación más activos se someten a prueba para determinar la inhibición de la fosforilación de Stat3 estimulada por IL-6 y la falta de capacidad de inhibir la fosforilación de Statl estimulada por IFN-y como se describe a continuación.
EXP IIA. Ensayo por RPS de inhibición de la unión de Stat3/péptido pY. Los ensayos de unión de Stat3 al péptido pY se realizan a 25 °C usando un biosensor BIAcore 3000, como se describe (Xu et al., 2009). En resumen, los dodecapéptidos derivados de EGFR biotinilados fosforilados y no fosforilados de control basados en la secuencia que rodea a Y1068 se inmovilizan en un chip sensor recubierto con estreptavidina (BIAcore Inc., Piscataway NJ). La unión de Stat3 se realiza en tampón Tris 20 mM pH 8 que contiene p-mercaptoetanol 2 mM a un caudal de 10 ul/min durante 1-2 minutos. Se mezclan previamente partes alícuotas de Stat3 a 500 nM con compuesto para lograr una concentración final de 1-1.000 uM y se incuban a 4 °C antes de inyectarlas en el chip sensor. El chip se regenera inyectando 10 ul de glicina 100 mM a pH 1,5 después de cada inyección de muestra. Se procesa un control (Stat3 con DMSO, pero sin compuesto) al principio y al final de cada ciclo (40 inyecciones de muestra) para garantizar que la integridad del chip sensor se mantenga durante todo el ciclo. El promedio de los dos controles se normaliza al 100 % y se usa para evaluar el efecto de cada compuesto sobre la unión de Stat3. Las respuestas se normalizan dividiendo el valor a los 2 minutos por la respuesta obtenida en ausencia de compuestos a los 2 minutos y multiplicando por 100. Los valores de CI50 se determinan representando gráficamente el % de respuesta máxima en función del logaritmo de la concentración del compuesto y ajustando los puntos experimentales a un modelo de unión competitiva usando una ecuación logística de cuatro parámetros: R = Ralto -(Ralto -Rbajo)/ (1 conc/A1)A2, donde R = porcentaje de respuesta a la concentración de inhibidor, Ralto = porcentaje de respuesta sin compuesto, Rbajo= porcentaje de respuesta a la concentración de compuesto más alta, A2 = parámetro de ajuste (pendiente) y A1 = CI50 (programa informático BIAevaluation versión 4.1).
EXP IIB. Microscopia de fluorescencia de alto rendimiento (HTFM), ensayos de inhibición de la translocación de citoplasma a núcleo. La HTFM de las células MEF/GFP-Stat3a se realiza para evaluar la capacidad de las sondas de inhibir la translocación de citoplásmica a nuclear de GFP-Stat3, como se describe (Xu et al., 2009), usando el sistema robótico disponible como parte del John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics en la Facultad de Medicina de la Universidad de Texas-Houston. En resumen, las células se siembran en placas CC3 de 96 pocillos a una densidad de 5.000 células/pocillo y se cultivan en condiciones normales hasta un 85-90 % de confluencia. Las células se tratan previamente con compuesto durante 1 hora a 37 °C y después se estimulan con IL-6 (100 ng/ml) e IL-6sR (150 ng/ml) durante 30 minutos. Las células se fijan con formaldehído al 4 % en tampón PEM (PIPES potásico 80 mM, pH 6,8, EGTA 5 mM pH 7,0, MgCh 2 mM) durante 30 minutos a 4 °C, se inactivan en 1 mg/ml de NaBH4 (Sigma) en tampón PEM y se tiñen con contraste durante 1 minuto en 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Sigma; 1 mg/ml) en tampón PEM. Las placas se analizan mediante HTFM automatizada usando la plataforma Cell Lab IC Image Cytometer (IC100) y el programa informático de análisis Cytoshop versión 2.1 (Beckman Coulter).
La translocación nuclear se cuantifica usando la fracción localizada en la medición del núcleo (FLIN). Los valores de la FLIN se normalizan restando la FLIN para las células no estimuladas y dividiendo, a continuación, esta diferencia por la diferencia máxima (delta, A) en la FLIN (la FLIN en células estimuladas con IL-6/sIL-6R en ausencia de compuesto menos la FLIN de células no estimuladas). Esta relación se multiplica por 100 para obtener el porcentaje de diferencia máxima en la FLIN y se representa gráficamente en función del logaritmo de la concentración de compuesto. Se determinan la curva con mejor ajuste y el valor de CI50 usando el modelo logístico de 4 parámetros/respuesta a la dosis/XLfit 4.2, programa informático IDBS.
EXP IIC. Ensayos de inhibición de pStat3 y pStatl mediada por ligando. Las sondas de Stat3 recién sintetizadas con una actividad equivalente a o mayor que la del compuesto precursor 188 en los ensayos de RPS y HTFM se ensayarán para evaluar la capacidad de inhibir selectivamente la fosforilación mediada por ligando de Stat3, como se describe (Xu et al., 2009). En resumen, las células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) se cultivan en placas de 6 pocillos y se tratan previamente con compuestos (0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 j M) durante 1 hora y a continuación se estimulan en condiciones óptimas con interleucina-6 (IL-6; 30 ng/ml durante 30 min) para activar Stat3, o interferón gamma (IFN-y; 30 ng/ml durante 30 min) para activar Stat1. Las células se recuperan y las proteínas se extraen usando un tampón de alta salinidad, se mezclan con tampón de muestra de laurilsulfato de sodio (SDS) 2X (125 mmol/l de Tris-HCl a pH 6,8; SDS al 4 %; glicerol al 20 %; 2-mercaptoetanol al 10 %) en una relación 1:1 y a continuación se calientan durante 5 minutos a 100 °C. Las proteínas (20 jg ) se separan por SDS-PAGE al 7,5 % y se transfieren a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Waltham, MA) y se inmunotransfieren. Las membranas se investigan en serie con anticuerpos contra pY701 de Stat1 o pY705 de Stat3, seguido de anticuerpos contra Stat1 o la Stat3 (Transduction labs, Lexington, KY) y después un anticuerpo contra actina p (Abcam, Cambridge, MA). Las membranas se desprenden entre cada investigación con anticuerpos usando tampón de desprendimiento de inmunoelectrotransferencia Restore™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) según las instrucciones del fabricante. Se usa anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante como anticuerpo secundario (Invitrogen Carlsbad, CA) y las membranas se revelan con un sistema de detección de quimioluminiscencia potenciada (ECL) (Amersham Life Sciences Inc.; Arlington Heights, IL.). Las intensidades de las bandas se cuantifican por densitometría. El valor de cada banda de pStat3 se divide por su correspondiente intensidad de banda de Stat3 total; los resultados se normalizan al valor de control tratado con DMSO. Este valor se representó gráficamente en función del logaritmo de la concentración de compuesto. La curva con mejor ajuste se determina usando el modelo logístico de 4 parámetros/respuesta a la dosis/XLfit 4.2, programa informático IDBS, y se usó para calcular el valor de CI50.
EXP IID. Modelado molecular de las interacciones de sonda-Stat3. Los resultados del modelado de la unión de la sonda de primera generación a los dominios SH2 de Stat3 con respecto a Stat1 sugirieron que la base de la selectividad experimental de las sondas por Stat3 con respecto a Stat1 se basaba en la capacidad de las sondas de tener una mayor interacción con el sitio de unión hidrófobo dentro de la cavidad de unión al péptido pY de Stat3 en comparación con Stat1. Por tanto, el sitio de unión hidrófobo sirvió como filtro de selectividad. Para someter a prueba si este sigue siendo el caso de las sondas de 3.a generación recién sintetizadas, pueden usarse 2 programas de acoplamiento complementarios GLIDE (Schrodinger) e ICM (MolSoft) para determinar la configuración de acoplamiento de energía más baja de cada sonda dentro del dominio de unión al péptido pY del dominio SH2 de Stat3 y Stat1. Pueden revisarse los modelos informáticos de cada sonda en un complejo con el dominio SH2 de Stat3 con respecto a Stat1 y, en particular, comparar las energías de Van der Waals y determinar si son equivalentes para su interacción con el dominio SH2 de Stat3 con respecto al dominio SH2 de Stat1. Fue este cálculo el que determinó la selectividad de las sondas de 1.a generación para Stat3 frente a Stat1. En particular, los cálculos de las energías de Van der Waals implicaban residuos que forman el sitio de unión hidrófobo (W623, Q635, V637, Y640 e Y657) como cruciales para esta selectividad.
En realizaciones específicas de la invención, hay una identificación de las sondas con una actividad de una unidad logarítmica o mayor que las sondas de 2.a generación en ensayos de SPR, HTFM y pStat3. Además, en determinados aspectos, algunas de las sondas de 3.a generación más activas que surgen de este análisis son selectivas para Stat3 con respecto a Stat1, tomando como base su mayor interacción con el sitio de unión hidrófobo dentro de la cavidad de unión al péptido pY de SH2 de Stat3 con respecto a Stat1.
EJEMPLO 11
LA ACTIVACIÓN STAT3 INICIA UNA RUTA DE C/EBP5 A MIOSTATINA QUE ESTIMULA LA PÉRDIDA DE MASA MUSCULAR
Como se aborda en el presente documento, las afecciones catabólicas como la insuficiencia renal crónica (IRC), provocan pérdida de masa muscular por mecanismos poco claros. En biopsias musculares de pacientes con IRC, se encontró Stat3 activado (p-Stat3) y se consideró que p-Stat3 inicia la atrofia muscular. Se generaron ratones con inactivación (KO) específica de músculo que evita la activación de Stat3. En estos ratones, las pérdidas de peso corporal y muscular se suprimieron en modelos de IRC o diabetes aguda. Una molécula pequeña que inhibe la activación de Stat3, produjo respuestas similares que sugieren potencial para estrategias de transferencia. Usando ratones con inactivación de C/EBP5 y miotubos C2C12 con atenuación de C/EBP5 o miostatina, se determinó que p Stat3 inicia la atrofia muscular mediante C/EBP8, estimulando la miostatina, un regulador negativo del crecimiento muscular. La inactivación de C/EBPS también mejoró la supervivencia de los ratones con IRC. Se verificó que p-Stat3, C/EBPS y la miostatina aumentaron en los músculos de pacientes con IRC. La ruta de p-Stat3 a C/EBPS a miostatina y la atrofia muscular proporciona una ruta para dianas terapéuticas que previenen la atrofia muscular.
Las biopsias musculares de pacientes con IRC revelan inflamación y activación de Stat3
Para abordar los mecanismos subyacentes a la atrofia muscular, se estudiaron 18 pacientes con IRC que tenían programada una inserción de catéter de diálisis peritoneal y un grupo de control de 16 sujetos sanos de la misma edad y sexo. Todos los sujetos llevaban un estilo de vida sedentario. En los 18 pacientes con IRC, el BUN y la creatinina sérica aumentaron 4 y ~8 veces respectivamente sobre los sujetos de control (tabla 12).
Tabla 12: Características clínicas de pacientes con insuficiencia renal crónica (IRC) y controles Controles Pacientes con IRC Valor de p
Número de sujetos 16 18
Edad (años) 63 (46-77) 67 (36-79) 0,15
Diabetes 0/16 4/18
Hipertensión 0/16 17/18
Aterosclerosis 0/16 14/18
Seco(H:M) 13:3 11:7
IMC (kg/m2) 25,4 ± 0,5 27,4 ± 1,2 0,07
BUN (mg/dl) 20,6 ± 1,3 89,8 ±4,6 <0,05
SCr (mg/dl) 0,96 ± 0,04 7,6 ± 1,8 <0,05
eGFR (ml/min/1,73 m2) 76,7 ± 3,7 9,1 ± 0,8 <0,05
CSA (0,1 m2) 1873 (1100-3389) 1003 (717-1601) <0,003
CRP (mg/dl) 3,21 ± 0,22 10,46 ± 2,98 <0,05
Fibrinógeno (mg/dl) 291,7 ± 31,7 579 ± 37,5 <0,005
Todos los pacientes con IRC experimentaron pérdida de peso involuntaria en los 3 meses anteriores a la obtención de las biopsias musculares. En pacientes con IRC, la ingesta media estimada de proteínas y calorías fue de 0,9 g/kg y 28 kcal/kg respectivamente, en comparación con ~1 g/kg y 30-32 kcal/kg respectivamente, en sujetos sanos de control (a partir de diarios de dieta). Aunque estas ingestas de proteínas y calorías superan la cantidad diaria recomendada (CDR), 13 de los 18 pacientes estaban desnutridos, lo que significa un nivel de evaluación global subjetivo de >2, y la seroalbúmina era baja en 11 pacientes (<3,8 g/100 ml) (Fouque et al., 2008). A pesar de que el índice de masa corporal era bajo (<23 kg/m2) en solo 4 sujetos, todos los pacientes tenían evidencia de pérdidas de proteínas: hubo una marcada reducción en el área de sección transversal (CSA) de las fibras musculares (mediana de pacientes con IRC = 1003 pm2, intervalo 717-1601; mediana de los controles = 1873 pm2, intervalo 1100-3389; p <0,003 Mann-Whitney). Se calculó la masa libre de grasa (MLG) del espesor del pliegue cutáneo (Avesani et al., 2004). Durante 3 meses, la MLG en pacientes con IRC disminuyó de 45,9 ± 2 a 44,1 ± 2 kg (p <0,05). En cuanto a los fármacos que pueden influir en el metabolismo muscular, ningún paciente estaba recibiendo esteroides, pero 14 pacientes se trataron con estatinas; estos pacientes no tenían signos de miopatía. Las características de los pacientes con IRC y los sujetos de control se muestran en la tabla 12. Todos los pacientes se trataron con diuréticos (furosemida) a diferentes dosis, lisinopril o doxazosina (17 pacientes), inhibidores de la bomba de protones (14 pacientes), inhibidores de la agregación plaquetaria (14 pacientes), tratamiento con insulina (4 pacientes), tratamiento con anticoagulantes orales (1 paciente) y eritropoyetina (10 pacientes). La diabetes estaba bien controlada con valores de hemoglobina A1c <6,5 % y niveles de glucosa en plasma en ayunas <110 mg/dl. Hubo niveles elevados de marcadores inflamatorios en pacientes con IRC, incluyendo la proteína C-reactiva circulante (control; 3,21 ± 0,22 frente a IRC; 10,46 ± 2,98 mg/dl; p <0,05) y fibrinógeno (control; 291 ± 31,7 frente a IRC; 579 ± 37,5 mg/dl; p = 0,005) (tabla 12). También hubo niveles aumentados de IL-6 y TNFa en las biopsias musculares en comparación con los resultados de los sujetos de control (figura 19A). Para finalizar, el ARNm de TNFa aumentó (figura 26) y, como se indica previamente, también lo hizo el ARNm de IL-6 (Verzola et al., 2011).
La proteína Stat3 activada aumentó significativamente en los músculos de pacientes con IRC frente a sujetos sanos (figura 19B). p-Stat3 estaba localizada principalmente en núcleos de biopsias ya que ~40 % de los núcleos en biopsias musculares de pacientes con IRC fueron positivos para p-Stat3 frente a ~20 % en sujetos sanos (figura 19C). Por tanto, aumentos significativos en las expresiones de citocinas inflamatorias, IL-6 y TNFa, se asociaron con la activación de Stat3 en músculos de pacientes con IRC que expresaron evidencia de atrofia muscular.
La inactivación de Stat3 específica de músculo suprime la pérdida de músculo a pesar de la IRC o la diabetes de tipo 1
En los músculos gastrocnemios de ratones con IRC, el nivel de p-Stat3 estaba aumentado en comparación con los resultados en los músculos de ratones de control con operación simulada alimentados en paralelo (figura 20A). Para explorar si la activación de Stat3 desencadena la atrofia muscular in vivo, se estudiaron ratones con eliminación específica del músculo del sitio de fosforilación de tirosina de Stat3 (Stat3 KO), en comparación con los resultados en ratones Stat3flox/flox de control (Takeda et al., 1998). Los ratones con inactivación de Stat3 específica de músculo no diferían de los ratones de control en términos de desarrollo, ingesta de alimentos y peso corporal (figura 27). Pero con la IRC, los pesos corporales de los ratones con inactivación de Stat3 aumentaron frente a los resultados en ratones Stat3flox/flox con IRC alimentados en paralelo (figura 20B). El aumento de peso se debió en parte a la masa muscular aumentada: después de 5 semanas de IRC, los pesos de los músculos gastrocnemio y tibial anterior fueron significativamente mayores que los músculos de los ratones Stat3flox/flox (figura 20C, D). Para determinar la causa de que se redujera la pérdida de masa muscular en ratones Stat3 KO con IRC, se midieron las tasas de síntesis y degradación de proteínas musculares y hubo una mejora significativa en ambos índices de metabolismo de proteínas en ratones Stat3 KO con IRC (figura 20e , F). Asimismo, hubo un aumento en la fuerza de agarre de los ratones Stat3 KO frente a los ratones Stat3flox/flox (figura 20g ).
La atrofia muscular en varias afecciones catabólicas se caracteriza como un aumento de las citocinas inflamatorias circulantes, alteración de la señalización de insulina/IGF-1 y un aumento en la degradación de proteínas musculares mediante el sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) (Zhang et al., 2011; Lecker et al., 2004). Para determinar si los resultados presentes en ratones con IRC se producen en otro modelo de atrofia muscular, se estudiaron ratones con diabetes aguda tratados con estreptozotocina (Price et al., 1996). Hubo un aumento en p-Stat3 más altos niveles circulantes y musculares de IL-6 en ratones con diabetes aguda (figura 20H, figura 28). El ARNm de IL-6 en los músculos de los ratones tratados con STZ se duplicó con respecto a los ratones de control. Los ratones Stat3 KO expresaron una disminución más lenta en el peso corporal frente a los resultados en diabetes aguda, ratones Stat3flox/flox (figura 29). La pérdida más lenta de peso corporal en ratones Stat3 KO con diabetes aguda se asoció con una mayor masa de los músculos gastrocnemio y tibial anterior frente a los resultados en ratones Stat3flox/flox (figura 20I, J). En ausencia de catabolismo inducido por IRC o diabetes, la inactivación de Stat3 específica de músculo no afectó significativamente el peso corporal, la masa muscular, el metabolismo de las proteínas o la fuerza de agarre en comparación con los resultados en ratones Stat3flox/flox (figura 20). Por tanto, p-Stat3 puede desencadenar atrofia muscular en determinadas afecciones catabólicas.
La inhibición de la activación de Stat3 bloquea la atrofia muscular inducida por IRC
Para determinar si se podría desarrollar una estrategia de transferencia para interferir con la atrofia muscular cuando se activa Stat3, se evaluó C188-9, un inhibidor micromolecular de la fosforilación de Stat3. C188-9 tiene una potencia en el intervalo micromolar bajo y puede administrarse durante periodos prolongados (Xu et al., 2009; Redell et al., 2011). Después de 2 semanas de IRC, los ratones se emparejaron por su BUN y peso corporal y se les inyectó C188-9 o el diluyente, dextrosa al 5 % en agua (D5W). El tratamiento con C188-9 disminuyó el nivel de p-Stat3 en el músculo sin afectar al nivel de Stat3 (figura 21A). De acuerdo con los resultados de los ratones Stat3 KO con IRC, los pesos corporales de los ratones con IRC tratados con el inhibidor de Stat3 fueron significativamente mayores que los pesos de los ratones de control con IRC (figura 21B). Después de 14 días de C188-9, se encontró que el aumento en el peso corporal incluía más músculo a medida que los pesos de los músculos gastrocnemio y tibial anterior eran mayores (figura 21C, D). El aumento de la masa muscular se confirmó mediante un análisis de la distribución del tamaño de las miofibras en los músculos de los ratones con IRC tratados con C188-9 (figura 21E). Esta mejora en la masa muscular estuvo acompañada por una fuerza de agarre mejorada en ratones con IRC tratados con C188-9 (figura 21F). De acuerdo con los resultados de los ratones Stat3 KO, el bloqueo de Stat3 con C188-9 en ratones sin mutaciones de control no afectó significativamente a su ingesta de alimentos, peso corporal, masa muscular o fuerza de agarre (figura 21B-D, F). El mecanismo subyacente al aumento del peso muscular inducido por C188-9 incluía una síntesis de proteínas musculares mejorada y una degradación de proteínas disminuida (figura 21G, H). La inhibición de la activación de Stat3 suprime la pérdida de masa muscular y fuerza inducida por IRC.
En miotubos C2C12, la activación de Stat3 aumenta la expresión de C/EBP8 y miostatina
Se evaluó la ruta de señalización desde Stat3 activado hasta la atrofia muscular. Se estudió la miostatina porque su expresión aumenta en los músculos de ratones con IRC y la inhibición de la miostatina supera la disminución en la síntesis de proteínas y el aumento en la degradación de proteínas estimuladas por IRC (Zhang et al., 2011). Para determinar la manera en que la IRC da lugar a la expresión de miostatina, se evaluó C/EBPS porque el promotor de miostatina tiene varios sitios de reconocimiento de C/EBP (Ma et al., 2001) y Stat3 puede regular C/EBPs al menos en células epiteliales (Zhang et al., 2007). En primer lugar, miotubos C2C12 se trataron con IL-6 para activar Stat3. Después de 3 h, hubo un aumento en la proteína C/EBPS en los miotubos que respondían a Stat3 activado. Después de 24 h, la proteína miostatina aumentó y los cambios en los ARNm fueron coherentes con los resultados de la inmunoelectrotransferencia (figura 22A, figura 30-31). Estos resultados muestran que p-Stat3, C/EBPS y la miostatina se activaron secuencialmente.
A continuación, los miotubos C2C12 se infectaron con un lentivirus que expresa Stat3-GFP activo de forma constitutiva (Stat3C-GFP). El mayor nivel de expresión de p-Stat3 dio como resultado un aumento en C/EBPS y miostatina además de una disminución en p-Akt y la cadena pesada de miosina (MHC) frente a los resultados de miotubos que expresan GFP solo (figura 22B). Se descubrió otra evidencia de que la activación de Stat3 estimula la expresión de miostatina cuando se usó el inhibidor de Stat3 (C188-9) para bloquear p-Stat3 en miotubos C2C12. Después de 24 h de exposición a IL-6, hubo un aumento en p-Stat3, C/EBP8 y la miostatina y C188-9 bloqueó estas respuestas. El inhibidor también aumentó p-Akt (figura 22C) y suprimió los ARNm de C/EBPS y miostatina en miotubos C2C12 tratados con IL-6 (figura 32). De manera destacable, C188-9 no solo suprimió p-Stat3, sino que también evitó la disminución del tamaño de los miotubos inducida por la exposición a IL-6 (figura 33).
Para evaluar si Stat3 afecta a la expresión de C/EBPS, los mioblastos C2C12 se cotransfectaron con un plásmido que expresaba una luciferasa dirigida por el promotor de C/EBPS más un lentivirus que expresaba Stat3C-GFP activo de manera constitutiva. La sobreexpresión de Stat3C aumentó la actividad del promotor de C/EBPS en comparación con la del control de lentivirus que expresa GFP; además de la actividad promotora de C/EBPS estimulada por IL-6 en mioblastos (figura 22D).
Para identificar si p-Stat3 actúa a través de C/EBPS para estimular la miostatina, se atenuó C/EBPS usando ARNip. En este caso, el aumento inducido por IL-6 en la expresión de miostatina se bloqueó cuando se suprimió C/EBPS, aunque se aumentó p-Stat3 (figura 22E). A continuación, los mioblastos C2C12 se cotransfectaron con un plásmido que expresaba luciferasa dirigida por el promotor de miostatina más uno de los siguientes: 1) un plásmido que expresaba Stat3C; 2) un plásmido que expresaba C/EBPS; 3) oligonucleótido de ARNip de C/EBPS; o 4) un plásmido que expresaba Stat3C y el ARNip de C/EBPS. Stat3C activo de manera constitutiva aumentó moderadamente la actividad del promotor de miostatina, mientras que la transfección con C/EBPS en solitario aumentó significativamente la actividad del promotor de miostatina. La atenuación de C/EBPS bloqueó la actividad del promotor de miostatina, que se estimuló por IL6 o Stat3C (figura 22F).
Los mioblastos C2C12 también se transfectaron con un lentivirus que expresaba ARNip de miostatina; disminuyó la expresión de miostatina y redujo la degradación de proteínas incluso en células que expresaban Stat3C o C/EBPS (figura 22G, figura 34). Por tanto, la ruta de Stat3 a C/EBPS a miostatina proporciona un mecanismo que provoca la pérdida de masa muscular.
La atrofia muscular inducida por IRC in vivo está mediada por una ruta de p-Stat3 a C/EBP5 a miostatina
En músculos de ratones con IRC o diabetes aguda, hubo aumentos en la expresión de p-Stat3, C/EBPS y miostatina (figura 23A, D). Las proteínas C/EBPS y miostatina en los músculos de ratones Stat3 KO con IRC estuvieron significativamente por debajo de las respuestas en músculos de ratones Stat3flox/flox con IRC. La expresión de p-Smad2/3, la señal posterior de miostatina, también aumentó en los músculos de los ratones con IRC de acuerdo con los informes de que p-Smad2/3 media la atrofia muscular inducida por miostatina (Trendelenburg et al., 2009). El aumento de p-Smad2/3 en el músculo de ratones con IRC disminuyó abruptamente en los músculos de ratones Stat3 KO con IRC. Esto sugiere que, en la IRC, la activación de Stat3 da como resultado la expresión de la miostatina y la activación de su ruta de señalización posterior (figura 23A). Se encontraron resultados similares cuando se examinaron los ARNm de C/EBPS y miostatina en los músculos de los ratones Stat3 KO con IRC; los niveles en ratones Stat3 KO con IRC estaban por debajo de los ratones Stat3flox/flox de control con IRC (figura 23B, C). Stat3 activado en los músculos de los ratones con IRC no se bloqueó completamente por la inactivación de Stat3 específica de músculo en comparación con p-Stat3 en los músculos de los ratones sin iRc . Posiblemente, el resto de p-Stat3 en los lisados musculares de ratones Stat3 KO podría reflejar p-Stat3 en los glóbulos sanguíneos, los vasos sanguíneos o el intersticio, ya que los resultados se obtuvieron a partir de inmunoelectrotransferencias de lisados de músculo gastrocnemio.
Cuando se trataron los ratones con IRC usando el inhibidor de Stat3, ambas proteínas C/EBPS y miostatina disminuyeron y se bloqueó la fosforilación de p-Smad2/3 inducida por IRC. En este caso, la fosforilación de Akt fue mayor (figura 23E). De manera destacable, C188-9 suprimió las expresiones de ARNm estimuladas por IRC de C/EBPS y miostatina (figura 23F, G). En ratones de control sin IRC, la inactivación de Stat3 específica de músculo o el tratamiento con C188-9 no cambió los ARNm de C/EBPS o miostatina o sus proteínas en el músculo.
Para demostrar una vinculación de Stat3 a C/EBPS a miostatina in vivo, se estudiaron ratones deficientes en C/EBPS que tienen un desarrollo embrionario normal, son fértiles y no presentan defectos evidentes de desarrollo o fisiológicos (Sterneck et al., 1998). Se creó IRC en ratones heterocigóticos y homocigóticos para inactivación de C/EBPS y ratones sin mutaciones y se alimentó a los diferentes grupos con la misma cantidad de pienso que consumieron los ratones sin mutaciones con IRC. En ratones homocigóticos para inactivación de C/EBPS con IRC, se evitó la pérdida de peso corporal y muscular. También hubo una mejora en la supervivencia en ratones homocigóticos para inactivación de C/EBPS con IRC alimentados en paralelo (figura 24A-C). A pesar del aumento de p-Stat3 en los músculos de ratones homocigóticos y heterocigóticos para inactivación de C/EBPS o ratones sin mutaciones con IRC, no hubo aumento en la expresión de miostatina en ratones homocigóticos para inactivación de C/EBPS (figura 24D). El grado de supervivencia y la expresión de miostatina en los músculos de los ratones heterocigóticos para inactivación de C/EBPS fueron intermedios entre los homocigóticos para inactivación y los ratones sin mutaciones.
Para examinar si la atrofia muscular inducida por Stat3 in vivo está mediada por la miostatina, se inyectó un lentivirus que expresaba Stat3-GFP activo de manera constitutiva (Stat3C-GFP) en la pata trasera derecha de ratones recién nacidos. La inyección se repitió 2 semanas después. Al mismo tiempo, se inyectó lentivirus que expresaba GFP en la pata trasera izquierda (control). Dos semanas después, a un grupo de ratones se le inyectó pepticuerpo antimiostatina durante dos semanas; al otro grupo se le inyectó PBS. La sobreexpresión de Stat3C indujo una reducción significativa en el tamaño de las miofibras en comparación con los resultados en la pata trasera contralateral tratada con GFP. De manera destacable, la inhibición de la miostatina eliminó estas respuestas. A continuación, se inmunotiñeron secciones transversales de músculo con p-Smad2/3 y se encontró que había altos niveles de p-Smad2/3 en las miofibras que sobreexpresaban Stat3C-GFP. Similar a los resultados en ratones con IRC con inactivación de Stat3 específica de músculo o después del tratamiento con el inhibidor de Stat3, el aumento de p-Smad2/3 se bloqueó por el pepticuerpo antimiostatina (figura 24E, F, figura 35), coherente con una vía catabólica de p-Stat3 a C/EBP5 a la pérdida de proteína muscular inducida por miostatina.
En pacientes con IRC, hay evidencia de la ruta de p-Stat3, C/EBP5 a miostatina en el músculo
Las biopsias musculares de pacientes con IRC avanzada tenían tamaños de miofibras y niveles de p-Akt significativamente disminuidos (tabla 12, figura 25A). Había, sin embargo, niveles aumentados de ARNm y proteína de p-Stat3, C/EBP5 y miostatina en músculos de pacientes con IRC (figura 25B-D).
Muchas afecciones catabólicas, incluyendo IRC, diabetes, cáncer y las infecciones graves se complican con el atrofia muscular progresiva, que disminuye la calidad de vida y aumenta el riesgo de morbilidad y mortalidad. Las complicaciones de la iRc (exceso de angiotensina II, glucocorticoides, acidosis y alteración de la señalización de insulina/IGF-1) estimulan la degradación de proteínas y la pérdida de masa muscular. La IRC también aumenta los marcadores inflamatorios, incluyendo IL-6, t NF-gí y CRP y otros, que pueden activar p-Stat3 (Zhang et al., 2009; May et al., 1987; Hu et al., 2009; Zhang et al., 2011). Aun así, los mecanismos moleculares que provocan la pérdida de masa muscular son poco conocidos, lo que dificulta el desarrollo de fármacos u otras estrategias de tratamiento. En los presentes estudios, se identifica que Stat3 activado desencadena una ruta de p-Stat3 a miostatina que provoca el atrofia muscular progresiva inducida por IRC o diabetes aguda.
La evidencia de la vía dependiente de p-Stat3 que inicia la pérdida de masa muscular se obtuvo en cinco modelos experimentales: miotubos C2C12 cultivados; ratones con inactivación de p-Stat3 específica de músculo; ratones tratados con una pequeña molécula que inhibe la activación de Stat3; ratones con inactivación de C/EBP5; y biopsias musculares de pacientes con IRC. Los resultados muestran que la IRC activa Stat3, lo que da lugar a una expresión aumentada de C/EBP5 y a la regulación transcripcional de la expresión de miostatina. Cuando esta ruta se activa, hay una disminución en p-Akt que se demuestra que activará la caspasa-3 y el sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) para degradar la proteína muscular (Zhang et al., 2011; Du et al., 2004; Wang et al., 2010). Los resultados demuestran que: 1) la IRC o la diabetes aguda activa Stat3 en el músculo provocando pérdida de masa muscular; 2) la inactivación dirigida de Stat3 en el músculo o la inhibición farmacológica de Stat3 suprime la atrofia muscular inducida por IRC o diabetes aguda. Esto da lugar a un aumento en la síntesis de proteínas musculares y a una disminución en la degradación de proteínas con mejora en la masa muscular y la fuerza de agarre; 3) C/EBP5 es un mediador de la ruta de p-Stat3 a miostatina porque su inactivación inhibe la expresión de miostatina y suprime la atrofia muscular. Además, la inactivación de C/EBP5 se asoció con una mejora en la supervivencia. En biopsias musculares de pacientes con IRC, hay cambios similares en los niveles de los mismos mediadores, lo que sugiere que los resultados podrían formar la base para desarrollar estrategias de transferencia para suprimir la atrofia muscular en IRC.
En la actualidad, no hay fármacos clínicamente disponibles que se dirijan directamente a Stat3. Se inician programas de desarrollo de fármacos micromoleculares que se dirigen a la superficie de contacto del homodímero de Stat3 o al dominio SH2 de Stat3; lo último es necesario para la unión de Stat3 a los ligandos de fosfotirosilpeptídicos ubicados dentro de los complejos de receptores activados y dentro del propio homodímero de Stat3. Se identificaron tres compuestos candidatos (C3, C30 y C188); incluyendo, algunos compuestos individuales identificados, static (Schust et al., 2006), STA-21 (Song et al., 2005), S31-201 (Siddiquee et al., 2007) o LLL12 (Lin et al., 2010). Con respecto a LLL12, no se presentó la evidencia de la inhibición directa de Stat3 frente a una cinasa anterior. Por el contrario, C188-9, no inhibe las cinasas JAK o Src anteriores (Redell et al., 2011). Con respecto a la potencia, ni los compuestos precursores identificados por otros ni los derivados de los mismos son tan potentes como C188-9 (Bhasin et al., 2008; Zhang et al., 2010). Además, los compuestos identificados por otros que se han sometido a prueba en ratones no se toleran tan bien como C188-9 (Lin et al., 2009; Zhang et al., 2010); esos compuestos tienen una dosis máxima tolerada de 5 mg/kg cada 2 o 3 días en comparación con 100 mg/kg/día durante 14 días para C188-9 (Tweardy et al., datos no publicados). Por tanto, C188-9 es prometedor como prototipo molecular para el desarrollo de un fármaco que pudiera administrarse de forma segura a los pacientes.
¿Cómo influye C188-9 en la consunción de proteínas musculares? Una posibilidad es que la inyección de IL-6 en roedores active Stat3 y estimule la proteólisis muscular (Goodman, 1994). De hecho, hubo un aumento de IL-6 en los músculos de los pacientes con IRC y en ratones con diabetes aguda inducida por STZ. Esto último es coherente con los informes de pacientes con diabetes de tipo 1 (Mysliwiec et al., 2006; Mysliwiec et al., 2008; Shelbaya et al., 2012). El posible origen de IL-6 en la diabetes de tipo 1 incluye leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica y/o linfocitos T Th17 (Bradshaw et al., 2009; Foss-Freitas et al., 2006; Ryba-Stanislawowska et al., 2013). Sin embargo, otros encuentran que la IL-6 no estimula la pérdida muscular en ausencia de otra enfermedad tal como el cáncer (Baltgalvis et al., 2008). Por tanto, no está clara la manera en que las citocinas provocan la proteólisis muscular. En realizaciones específicas, el aumento de IL-6 estimulado por IRC (Kimmel et al., 1998) y posiblemente otras citocinas, activa p-Stat3, lo que desencadena la atrofia muscular. De hecho, cuando se eliminó Stat3 del músculo o cuando se estudió el inhibidor de Stat3, C188-9, se inhibió la atrofia muscular inducida por IRC. ¿Cómo podría p-Stat3 estimular la atrofia muscular? p-Stat3 regula por aumento C/EBP8 y aumenta la transcripción de miostatina, un potente regulador negativo de la masa muscular. Otros han implicado a C/EBPS en la patogenia de los trastornos catabólicos. Por ejemplo, basándose en análisis de micromatrices, hubo una regulación por aumento de múltiples genes, incluyendo C/EBPS, en músculos de ratones con caquexia por cáncer o en biopsias musculares de pacientes en hemodiálisis (Bonetto et al., 2011; Gutiérrez et al., 2008). Además, hay informes de que p-Stat3 estimula la expresión de C/EBPS en el cáncer, los inmunocitos o los hepatocitos. Esto es relevante porque el promotor de C/EBPS contiene un sitio de unión a Stat3, lo que lo convierte en un probable participante en la ruta (Zhang et al., 2007; Sanford y DeWille, 2005). De hecho, la exposición de miotubos C2C12 a IL-6 estimula p-Stat3 y aumenta secuencialmente la expresión de C/EBPS. Asimismo, la expresión de Stat3 activo de manera constitutiva en miotubos aumentó la actividad del promotor de C/EBPS y la expresión de la proteína C/EBPS. A la inversa, la inhibición de Stat3 en miotubos C2C12 o en ratones con IRC suprimió la expresión de C/EBPS. Una probable diana de C/EBPS es la miostatina. Por ejemplo, cuando el se expresaba el ARNip de C/EBPS en miotubos, se bloqueaba el aumento de miostatina estimulado por IL-6. Además, la inactivación de C/EBP8 en ratones con IRC evitó la pérdida de masa muscular y la expresión de miostatina. Las conclusiones de estos resultados son coherentes con los informes de que la miostatina se expresa en una amplia variedad de afecciones catabólicas asociadas con la atrofia muscular, incluyendo el cáncer, IRN, diabetes o ingravidez (vuelo espacial) (Zhou et al., 2010; Zhang et al., 2011; Feldman et al., 2006; Lalani et al., 2000). En ratones con IRC, la activación de Stat3 da lugar a la expresión de miostatina y sus señales posteriores, p-Smad2/3, más degradación acelerada de proteínas. La sobreexpresión de Stat3C en el músculo de ratones provoca tamaños disminuidos de las miofibras y la atenuación de la miostatina resuelve el fenotipo de activación de Stat3: se aumentan los tamaños de las miofibras y se reducen los niveles de p-Smad2/3. Por otra parte, la inhibición de la miostatina suprime la atrofia muscular provocada por IRC (Zhang et al., 2011). Para finalizar, Zhou et al., informaron de que un receptor actRIIB soluble inhibía la miostatina y el UPS, bloqueando las pérdidas de masa muscular en varios modelos de cáncer (Zhou et al., 2010).
El mecanismo por el que un aumento de miostatina da lugar a la pérdida de masa muscular podría ser una disminución de p-Akt en el músculo. Una disminución de p-Akt activa la caspasa-3, lo que da lugar a la escisión de la estructura compleja de las proteínas musculares y la activación de la proteólisis por el proteasoma 26S (Du et al., 2004; Wang et al., 2010). Además, un nivel bajo de p-Akt reduciría la fosforilación de los factores de transcripción Forkhead que estimulan la expresión de las ligasas de ubiquitina E3 específicas de músculo, atrogina-1/MAFbx o MuRF-1 y aceleran la proteólisis en el UPS (Sandri et al., 2004; Lee et al., 2004; Stitt et al., 2004; Lecker et al., 2006). En los presentes experimentos, la inhibición de p-Stat3 con C188-9 disminuyó la expresión de miostatina y la activación de sus mediadores de señalización posteriores, p-Smad2/3; también hubo un aumento en p-Akt. En el músculo de pacientes con IRC, además, hubo una abrupta disminución en p-Akt con un aumento de las expresiones de ARNm y proteínas de C/EBPS y miostatina.
Resumiendo, los resultados han descubierto una nueva ruta que estimula la atrofia muscular en respuesta a la activación de Stat3. La ruta se activa por IRC o diabetes aguda y proporciona nuevos conocimientos sobre las relaciones entre las moléculas de señalización, Stat3, C/EBPS y miostatina. Los resultados de estudios de células de músculo esquelético cultivadas o ratones son coherentes con cambios en los niveles de las mismas moléculas de señalización en biopsias musculares de pacientes con IRC. Como consecuencia, estos resultados son trasladables a estrategias de tratamiento para afecciones catabólicas como IRC que provoca atrofia muscular. El desarrollo de un inhibidor de Stat3 micromolecular seguro y potente es una estrategia terapéutica útil para la atrofia muscular en afecciones catabólicas.
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Modelos de ratón
Todos los experimentos y procedimientos con animales los aprobó el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de Baylor (IACUC). Se usó nefrectomía parcial para crear IRC en ratones (Zhang et al., 2011; May et al., 1987). Para inducir la diabetes, a ratones Stat3flox/flox y Stat3 KO de 12 semanas de edad se les inyectó por vía intraperitoneal 2 dosis de 150 mg/kg/d de STZ (Sigma-Aldrich) en tampón de citrato 0,1 M (pH 4). A los ratones de control se les inyectó el tampón de citrato. Los ratones se alojaron en jaulas individuales y los ratones diabéticos Stat3flox/flox se alimentaron en paralelo con los ratones diabéticos Stat3 KO durante 9 días.
Biopsias Musculares
Durante la colocación de un catéter de diálisis peritoneal en pacientes con IRC, se realizó una biopsia del músculo recto del abdomen, se congeló a -80 °C y se almacenó hasta su análisis. La biopsia de este músculo se obtuvo de sujetos sanos durante cirugías de hernia abdominal. Los procedimientos se aprobaron por el Comité de Ética del Departamento de Medicina Interna de la Universidad, Génova, Italia, de acuerdo con la Declaración de Helsinki sobre ética en la investigación en seres humanos.
Análisis de ARNm
Los ARNm se analizaron mediante RT-PCR como se describe (Takeda et al., 1998). Los cebadores se enumeran en la tabla 13. Los niveles relativos de ARNm se calcularon a partir de los valores del umbral de ciclo (Ct) usando GAPDH como control interno [expresión relativa = 2(Ct de muestra - Ct de GAPDH)].
Figure imgf000032_0001
Medición de la fuerza muscular
La fuerza de agarre de los ratones se midió diariamente durante 4 días consecutivos usando un medidor de fuerza de agarre (Columbus Instrument Co., Columbus, Ohio). Cada día, se evaluaron 5 fuerzas de agarre a intervalos de 1 minuto y se calculó el promedio de fuerza de agarre sobre 4 días.
Análisis estadístico
Los datos se expresaron como la media ± EEM. Las diferencias entre dos grupos se analizaron mediante la prueba de la t; las comparaciones múltiples se analizaron mediante ANOVA con un análisis a posteriori mediante la prueba de Student-Newman-Keuls para comparaciones múltiples. Los resultados se consideraron estadísticamente significativas a un valor de p <0,05.
Reactivos
Anticuerpos contra p-Akt (Ser473), Akt, p-Stat3 (Tyr705), Stat3, P-Smad2 (Ser465/467)/Smad3 (Ser423/425), p-IRS1 (Ser307) e IRS1 eran de Cell Signaling Technology (Beverly, MA); C/EBPS eran de ACRIS (San Diego, CA); Smad3, miostatina, IL-6 y TNFa eran de Abcam (Cambridge, MA); mientras que aquellos contra laminina y MHC fueron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El anticuerpo contra GAPDH era de Chemicon (Temecula, CA). La proteína IL-6 recombinante era de R&D Systems (Minneapolis, MN).
Inhibidor de pStat3
Se identificaron tres sondas de micromoleculares (C3, C30 y C188) que se dirigen al sitio de unión del péptido fosfotirosilo (pY) dentro del dominio SH2 de Stat3 usando cribado virtual de ligandos (Xu et al., 2009). Cada compuesto inhibió competitivamente la unión de Stat3 a su ligando peptídico pY y la fosforilación de Stat3 inducida por ligando. C188 fue el más potente de los tres compuestos identificados. El cribado de similitud usando el armazón de naftalenilbencensulfamida de C188 seguido de un análisis de farmacóforos tridimensionales identificó C188-9, que inhibía potentemente tanto la unión de Stat3 a su ligando peptídico pY (Ki = 136 nM) como la fosforilación de Stat3 inducida por G-CSF (CI50 = 3 ± 2 |jM). De manera importante, C188-9 a una concentración 10 jM no inhibió las tirosina cinasas anteriores que se sabe que activan Stat3, incluyendo las cinasas Janus (Jak1, Jak2) o las cinasas de la familia de Src (Hck, Lyn o Srms) según se determina en una matriz de fosfoproteínas (RayBiotech, Norcross, GA) (Xu et al., 2009; Redell et al., 2011).
Cultivo celular
Se cultivaron mioblastos C2C12 (ATCC, Manassas, VA) en medio de Eagle modificado por Dulbecco con alto contenido de glucosa (DMEM) complementado con FBS al 10 %, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, 100 mg/ml de piruvato de sodio y L-glutamina 2 mM. Para obtener miotubos, los mioblastos se cultivaron hasta un 80­ 95 % de confluencia y el medio se cambió a DMEM complementado con suero de caballo al 2 % (Sigma-Aldrich). Los miotubos se incubaron en medio sin suero antes de tratarlos durante diferentes tiempos con IL-6 recombinante con/sin el inhibidor de Stat3, C188-9. Los tamaños de los miotubos se evaluaron mediante el programa informático NIS-element. La transfección celular se logró mediante electroporación con Amaxa Nucleofector (Lonza, Allendale, NJ). Los mioblastos C2C12 (106) se sometieron a electroporación con 0,5 jg de ARNip de control o de C/EBPS. Como alternativa, se transfectaron 2 jg de plásmidos que expresaban Stat3C o C/EBPS o construcción indicadora de promotor de C/EBPS- o promotor de miostatina-luciferasa (control, de Renilla) y se midieron las actividades de luciferasa usando el ensayo Promega (Madison, WI).
Inmunoelectrotransferencia
Se homogeneizaron muestras de músculo (1 mg por 10 j l de tampón RIPA) o miotubos C2C12 en tampón RIPA que contenía inhibidor de proteasa Mini completo e inhibidor de fosfatasa PhosStop (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Los lisados se centrifugaron durante 5 min a 16.200 x g a 4 °C y se separaron cantidades iguales de proteína del sobrenadante en geles de SDS-poliacrilamida en tampón Tris/SDS, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Después de lavar con TBST, la membrana se incubó con anticuerpos secundarios conjugados con IRDye (Cell Signaling, Beverly, MA) a temperatura ambiente durante 1 h. Las bandas de proteínas se examinaron usando el sistema Odyssey (LI-COR, Lincoln, Nebraska). La densidad de las bandas de las proteínas diana se cuantificó usando el programa informático NIH ImageJ.
Tinción inmunohistoquímica
Las criosecciones (10 jm ) de la región media del vientre de los músculos tibial anterior (TA) se fijaron en paraformaldehído al 4 % y se incubaron con antilaminina antes de exponerlas a un anticuerpo secundario contra IgG de ratón conjugado con Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Grand Island, NY). Los núcleos se tiñeron con DAPI. Los tamaños de las miofibras se midieron utilizando el programa informático NIS-Elements Br 3.0 (Nikon) y la distribución de tamaños se calculó a partir de 2000 miofibras por observadores desconocedores de los tratamientos. Secciones en parafina (5 mm) de músculos humanos se tiñeron inmunohistoquímicamente para la expresión de p-Stat3, IL-6 y TNFa incubándolas con el anticuerpo primario durante 1 h a temperatura ambiente seguido de incubación durante 30 min con anticuerpos biotinilados. Se analizó la expresión de lL-6 y TNFa en 3 áreas representativas de las secciones musculares y se expresó como el porcentaje del área de miofibras que se tiñó positivamente. Stat3 en los núcleos se expresó como el porcentaje de núcleos positivos para p-Stat3 en un total de 550 núcleos; el observador era desconocedor del paciente frente al sujeto sano.
Modelos de ratón
Se cruzaron ratones transgénicos que expresaban creatina cinasa muscular-Cre (Mck-Cre) de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) con ratones Stat3flox/flox con sitios loxP flanqueando las porciones de los exones 21 y 22 del gen Stat3. Este sitio codifica un residuo de tirosina (Tyr705) que es esencial para la activación de Stat3 (Takeda et al., 1998). Los ratones que expresaban tanto Mck-Cre como Stat3flox/flox (es decir, Stat3 KO) se identificaron mediante genotipado e inmunoelectrotransferencia. Los ratones deficientes de C/EBP8 heterocigóticos fueron un regalo del Dr. E. Sterneck (NIH-NCI, Frederick, MD). Los ratones C/EBP8 KO homocigóticos se desarrollaron mediante cruzamiento de ratones C/EBP8 heterocigóticos y genotipado por PCR. Se usó nefrectomía parcial para crear IRC en ratones con IRC sin mutaciones, Stat3flox/flox, Stat3 KO y deficientes en C/EBP8 (Zhang et al., 2011; May et al., 1987). En resumen, los ratones anestesiados se sometieron a nefrectomía parcial en dos etapas, seguida de una recuperación de una semana mientras consumían una dieta con un 6 % de proteínas para reducir la mortalidad por hiperuremia. Posteriormente, se indujo hiperuremia alimentando a estos ratones y a los de control con una dieta con un 40 % de proteínas. Los ratones se alojaron en ciclos de luz-oscuridad de 12 h y se evaluaron diariamente los pesos corporales y los alimentos consumidos. La influencia del inhibidor de Stat3, C188-9, se sometió a prueba en ratones con IRC emparejados para BUN, los pesos corporales y la ingesta de pienso; a un ratón se le inyectó por vía subcutánea 6,25 mg/kg de C188-9 en D5W diariamente durante 14 días, mientras que al ratón con IRC emparejado se le inyectó la misma cantidad de D5W. Los ratones Stat3 KO con IRC recibieron la misma cantidad de pienso que los ratones sin mutaciones con IRC. Se alimentó a ratones homocigóticos y heterocigóticos para inactivación de C/EBP8 con IRC con la misma cantidad de comida que consumieron los ratones sin mutaciones con IRC durante 14 días.
Producción y transfección de lentivirus
Para producir lentivirus para expresar Stat3C-GFP o GFP, se cotransfectaron 5 x 106 células 293T con 2 |jg de EF.STAT3C.Ubc.GFP o Gf P (Addgene Cambridge, MA) más 1 jg de vector de empaquetamiento de VIH-1 88.1 más 0,4 jg de envoltura de VSVG usando Lipofectamine 2000. Después de 48 h, el precipitado de virus se recogió por centrifugación (50.000 x g durante 2 h), se resuspendió en tampón Tris-NaCl-EDTA y se almacenó a -80 °C. Los miotubos C2C12 se transfectaron con 107 partículas de virus/ml de DMEM más FBS al 10 % y 5 jg/m l de polibreno y, 48 h después, las proteínas se evaluaron por inmunoelectrotransferencia.
Para transfección in vivo, se inyectaron lentamente 10 j l de 107 partículas de virus/ml de Stat3C-GFP en la pata trasera derecha de ratones C57/BL6 recién nacidos; se inyectó GFP en la pata trasera izquierda como control. Dos semanas después, se repitieron las inyecciones de lentivirus. Los ratones se dividieron en dos grupos: 1) tratamiento con pepticuerpo antimiostatina durante dos semanas como se describe (Zhang et al., 2011); o 2) un volumen igual de PBS. A las 6 semanas después de la inyección inicial, se midieron los tamaños de las miofibras que expresaban GFP. Las partículas de lentivirus de ARNhc de miostatina y de control eran de Santa Cruz Technology; los mioblastos C2C12 ~50 % confluyentes se transfectaron con 105 unidades de virus en 8 jg/m l de polibreno y se seleccionaron con 5 jg/m l de puromicina. Los clones seleccionados se transfectaron con Stat3C o C/EBPó y se usaron para medir la degradación de proteínas después de la diferenciación en miotubos.
Síntesis y degradación de proteínas
Los músculos extensores largos de los dedos (EDL) se mantuvieron en reposo y se incubaron en tampón de bicarbonato de Krebs-Henseleit con glucosa 10 mM como se describe (Zhang et al., 2011). Se midió la incorporación de L-[U-14C] fenilalanina en la proteína muscular y la liberación de tirosina como tasas de síntesis y degradación de proteínas (Clark y Mitch, 1983). En miotubos C2C12 cultivados tratados para atenuar la miostatina o sobreexpresar Stat3C o C/EBP8, se calculó la degradación de proteínas en células premarcadas con L-[U-14C] fenilalanina a partir de la liberación de fenilalanina radiomarcada (Zhang et al., 2009). Las mediciones se repitieron seis veces.
EJEMPLO 12
LA INHIBICIÓN DE LA ACTIVACIÓN DE STAT3 SUPRIME LA ATROFIA MUSCULAR INDUCIDA POR CÁNCER
Como se describe en este ejemplo, al evaluar la caquexia, se encontró que los medios acondicionados de células de carcinoma de colon C26 o carcinoma de pulmón de Lewis (LLC), activaban p-Stat3 en miotubos C2C12, seguido de la expresión de C/EBP8 y miostatina con masa reducida de los miotubos. En ratones, LLC provocó atrofia muscular mediante una ruta de p-Stat3 a C/EBP8 a miostatina y activación de la proteólisis por caspasa-3 y el sistema ubiquitinaproteasoma. La inactivación de Stat3 específica de músculo suprimió la caquexia por cáncer sin reducir el crecimiento del tumor. En ratones con LLC, la inactivación de C/EBP8 bloqueó la miostatina y la pérdida de peso corporal y muscular con una fuerza de agarre mejorada. Dado que p-Stat3 inicia la atrofia muscular, se evaluó si un inhibidor micromolecular de p-Stat3, C188-9, bloquea la caquexia por cáncer. En ratones con cáncer C26, C188-9 bloqueó la activación de Stat3, aumentó el peso corporal y muscular al tiempo que mejoraba la fuerza de agarre. C188-9 mejoró la síntesis y la degradación de las proteínas musculares, lo que dio como resultado un aumento del tamaño de las miofibras. Por tanto, la inhibición de p-Stat3 suprime genética o químicamente una ruta que provoca atrofia muscular en estos modelos de cáncer. El bloqueo de la ruta podría dar lugar a novedosas estrategias terapéuticas para prevenir la atrofia muscular inducida por cáncer.
Material y métodos
Animales
Todos los experimentos y procedimientos con animales los aprobó el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de Baylor (IACUC). Se estudiaron ratones CD2F1 (Charles River; Houston, TX) a las 8-10 semanas de edad después de inyección subcutánea de células tumorales C26 (5 x 106 células en 500 pl de medio) en el flanco derecho. Después de 5 días, los ratones portadores de tumores se trataron con inyecciones diarias del diluyente, D5W (control) o C188-9 (12,5 mg de inhibidor de Stat3/kg de peso corporal). Los ratones de control y portadores de cáncer se alimentaron en paralelo durante 14 días y se midió el crecimiento. Para la alimentación en paralelo, la cantidad ingerida por el ratón portador de cáncer se alimentó al ratón de control emparejado al día siguiente.
Los ratones se estudiaron con ratones con inactivación de Stat3 específica de músculo (Stat3 KO) o C/EBP8 KO. Los ratones Stat3 KO se crearon cruzando ratones transgénicos que expresaban Stat3flox/flox con ratones que expresaban creatina cinasa muscular Cre (MCK-Cre) (Zhang et al., 2013). A los ratones Stat3 KO o C/EBPS KO se les implantaron 5 x 106 células cancerosas LLC y se midieron los pesos corporales durante 12-14 días de alimentación en paralelo. Posteriormente, se disecaron los músculos tibial anterior (TA) y gastrocnemio de fibras mixtas, el músculo sóleo predominantemente de miofibras rojas y los músculos extensor largo de los dedos (EDL) de miofibras blancas, se pesaron, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C.
Reactivos
Los anticuerpos contra Stat3 total y fosfo-Stat3 se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Los anticuerpos contra C/EBPS fueron de Acris Antibodies (San Diego, CA), contra atrogina1/MAFbx y MuRF1 de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), contra miostatina de Abcam (Cambridge, MA) y contra gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) de Milipore (Temecula, CA).
Estudios de cultivo celular
Se cultivaron mioblastos C2C12 de ratón (ATCC, Manassas, VA) y células LLC (Dr. Yi-Ping Li; Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas, Houston, TX) en DMEM (Cellgro Mediatech, Manassas, VA), complementado con FBS al 10 % (Invitrogen, Carlsbad, CA) más 100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina. Se cultivaron células C26 (un regalo de la Dra. Vickie Baracos, Universidad de Alberta, Edmonton, Alberta, Canadá) en medio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich), complementado con FBS al 10 % (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina.
A >80 % de confluencia, el medio se cambió a DMEM complementado con suero de caballo al 2 % (Sigma-Aldrich) para inducir la diferenciación de los mioblastos en miotubos (Zhang et al., 2011). Después de 36 h, se recogieron y centrifugaron los medios acondicionados (CM) de células C26 o LLC cultivadas (450 x g, 5 min, 4 °C); el medio se diluyó 1:5 con suero de caballo al 2 % antes de añadir los miotubos C2C12 cultivados (Zhang et al., 2011).
PCR instantánea
El ARN de los músculos gastrocnemios se obtuvo usando RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Los ADNc se sintetizaron utilizando el kit de síntesis de ADNc avanzado iScript (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). La PCR instantánea se realizó con una máquina de RT-PCR CFX96 y SYBR Green (Bio-Rad Laboratories). Los niveles relativos de expresión de ARNm se calcularon a partir de los valores de umbral del ciclo (Ct) usando gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control interno (expresión relativa = 2(Ct de muestra - Ct de GAPDH>). Las secuencias de los cebadores se han descrito (Zhang et al., 2013).
Síntesis y degradación de proteínas
Como se describe, los músculos sóleo y EDL se retiraron rápidamente de los ratones (Zhang et al., 2011; Clark y Mitch, 1983). Los músculos se mantuvieron en reposo durante la incubación en tampón de bicarbonato de Krebs-Henseleit con glucosa 10 mM y L-[U-14C] fenilalanina. La síntesis de proteínas se midió como la tasa de incorporación de L-[U-14C] fenilalanina en la proteína muscular, mientras que la degradación de proteínas se evaluó como la liberación de tirosina de las proteínas musculares que experimentaban degradación. Se estudiaron la fenilalanina y la tirosina porque el músculo no las sintetiza ni las degrada y se equilibran rápidamente con la reserva intracelular de aminoácidos libres en el músculo.
Ensayo del promotor de caspasa-3
Usando el programa MI Inspector, se identificaron 3 supuestos sitios de unión a STAT3 en el promotor de caspasa-3. El Dr. Sabbagh (Montreal, Quebec, Canadá) nos proporcionó amablemente una serie de eliminaciones del promotor de caspasa-3 en una construcción indicadora de luciferasa. Diferentes construcciones contenían cero, 1, 2 o 3 supuestos sitios de unión a Stat3, mientras que se usó una secuencia promotora de caspasa-3 inversa como control negativo. Cada construcción indicadora de promotor de caspasa-3-luciferasa se sometió a electroporación en células C2C12. Las células que contenían las diferentes construcciones se trataron con 100 ng/ml de IL-6 o un plásmido que expresaba Stat3 activo de manera constitutiva o ambos. La actividad luciferasa en estas células se comparó con la actividad luciferasa en células incubadas en medio sin suero. La actividad luciferasa en los lisados celulares se midió usando el sistema de ensayo indicador de luciferasa doble.
Ensayo de ChIP:
Los mioblastos C2C12 se infectaron con un adenovirus que expresaba Stat3 y a continuación se trataron con o sin IL-6. Los mioblastos se reticularon con formaldehído al 1 % durante 15 min a t A y se lavaron 3 veces con PBS enfriado con hielo que contenía un inhibidor de proteasa (Roche). Los mioblastos se lisaron en tampón de lisis, se agitaron y se sonicaron durante 10 segundos en la opción de potencia 4; esto se repitió 4 veces (VibraCell Sonicator). Los promedios de longitud de los fragmentos de ADN variaron entre 300 y 800 pb. Después de la centrifugación, el lisado de proteína-ADN se diluyó 10 veces en tampón ChIP (Tris 15 mM (pH 8,0), Triton X-100 al 1 %, SDS al 0,01 %, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, p Ms F 1 mM y cóctel de inhibidores de proteasa 1/100) , las muestras se preaclararon utilizando ADN de esperma de salmón y microesferas de agarosa de proteína A/G durante 1 h a 4 °C. Cada 100 pl de lisado de proteína-ADN se usó como control de introducción.
Las muestras se inmunoprecipitaron con anticuerpos contra Stat3, p-Stat3 o IgG de conejo (Santa Cruz Biotechnology) durante la noche a 4 °C seguido de incubación con microesferas de agarosa de proteína A/G durante 1 hora a 4 °C. Los inmunocomplejos se lavaron como se describe por el fabricante. El ADN inmunoprecipitado se sometió a reticulación inversa a 65 °C durante 4 h en presencia de NaCl 0,2 M y se purificó usando fenol/cloroformo/alcohol isoamílico. Un total de 5 pl del ADN purificado se sometió a amplificación por PCR de un fragmento de 190 pb usando cebadores específicos que se obtuvieron de la región promotora del gen de caspasa-3.
Actividad del proteasoma
Los proteasomas se purificaron parcialmente mediante centrifugación diferencial; se usaron cantidades iguales de proteína de las preparaciones de proteasomas para medir la actividad del proteasoma como la liberación de 7-amino-4-metilcumarina (AMC) del sustrato peptídico fluorogénico LLVY-AMC (W-Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC). La fluorescencia de AMC se midió usando longitudes de onda de excitación de 380 nm y de emisión de 460 nm. La diferencia entre la fluorescencia medida en presencia y ausencia de lactacistina de 100 pm se usó para calcular la actividad del proteasoma.
Fuerza muscular
La fuerza de agarre de los ratones se midió como se describe (Zhang et al., 2013). En resumen, se evaluaron 5 fuerzas de agarre a intervalos de 1 min usando el medidor de fuerza de agarre (Columbus Instrument Co., Columbus, Ohio). Se calculó el promedio de fuerza de agarre sobre 4 días.
Análisis estadístico
Se usó la prueba de la t de Student cuando se compararon 2 grupos experimentales y ANOVA cuando se estudiaron datos de 3 o 4 grupos. Después de los análisis ANOVA, se realizaron comparaciones por pares mediante la prueba de Student-Newman-Keuls. Los datos se presentan como la media ± EEM.
El medio acondicionado de células cancerosas C26 o LLC cultivadas estimulan la atrofia de miotubos C2C12 mediante una ruta de p-Stat3 a C/EBP5 a miostatina.
La presencia de caquexia por cáncer en pacientes o modelos de roedor sugiere que las células cancerosas liberan uno o más factores que estimulan la pérdida de masa muscular (Todorov et al., 1996). En la exploración de los posibles mediadores de la caquexia, se añadió medio acondicionado de cultivos de C26 a miotubos C2C12. Al cabo de 5 minutos, los medios acondicionados estimularon las respuestas de los miotubos, que incluían un aumento de >10 veces de Stat3 activado (fosforilado) (p-Stat3) (figura 36A). Sin embargo, cuando se añadió el inhibidor de Stat3 C188-9 a los miotubos C2C122 h antes de añadir los medios acondicionados de C26 o LLC, se bloquearon los aumentos en p-Stat3 (15 min para medios acondicionados) (figura 36B). Los medios acondicionados también aumentaron las expresiones de C/EBP5 y miostatina en miotubos C2C12 cultivados y se suprimieron por C188-9 (figura 36C). Estos resultados son relevantes para el desarrollo de la caquexia porque los medios acondicionados redujeron el tamaño de los miotubos y el tratamiento con el inhibidor de Stat3, C188-9, evitó la disminución del tamaño de los miotubos (figura 36D).
La inactivación de Stat3 específica de músculo en ratones con tumores LLC mejora el metabolismo del músculo esquelético
El hallazgo de que los medios de cultivo de células cancerosas activan Stat3, aumentan la expresión de C/EBP8 y miostatina y provoca la atrofia de los miotubos, sugiere que C/EBPS y la miostatina son "posteriores" a la activación de Stat3 (figura 36) (Zhang et al., 2013). Debido a que los aumentos en los niveles de C/EBPS y miostatina en los miotubos C2C12 se suprimen por el inhibidor C188-9 de p-Stat3, podría ser que, en otra realización, C188-9 no fuera específico, pero también inhibe C/EBPS y miostatina dando como resultado mejoras en el metabolismo muscular (Zhang et al., 2013). Para evaluar esta última consideración, se generaron ratones con inactivación de Stat3 específica de músculo. Estos ratones Stat3 KO son fértiles y se desarrollan con normalidad (Zhang et al., 2013). A estos ratones KO y ratones Stat3flox/flox de control se les inyectó LLC por vía subcutánea y a continuación se alimentaron en paralelo durante 18 días. Durante la alimentación en paralelo, a los ratones genéticamente alterados se les inyectó LLC y se les administró la misma cantidad de comida que la consumida el día anterior por los ratones Stat3flox/flox portadores de tumor LLC. En los ratones Stat3flox/flox, el tumor LLC provocó una disminución significativa del peso corporal (figura 37A). Por el contrario, los ratones con inactivación de Stat3 específica de músculo tuvieron una mejora en su crecimiento, alcanzando un nivel que era indistinguible del de los ratones de control sin el cáncer LLC (figura 37A). Los ratones Stat3 KO portadores de tumor tenían un peso corporal más alto, tal vez debido a una cantidad aumentada de masa muscular frente a los ratones de control portadores de tumor (figura 37C). Cuando los ratones se examinaron en ausencia del tumor LLC, se encontró que los ratones con inactivación de Stat3 específica de músculo tenían el mismo crecimiento que los ratones Stat3flox/flox. Este resultado indica que la inactivación específica de músculo de Stat3 no interfirió con el crecimiento del ratón alterado genéticamente. Además, las respuestas fueron independientes de los cambios en la masa del tumor (figura 37B). Ambas expresiones de C/EBPS y miostatina en ratones con inactivación de Stat3 específica de músculo, disminuyeron de manera similar a las respuestas observadas cuando el inhibidor de Stat3, C188-9, se añadía a miotubos C2C12 que se estaban tratando con medios acondicionados de células cancerosas (figura 37D; 36C), en consonancia con el aumento de la masa muscular, Los ratones KO Stat3 portadores de tumor mostraron una mayor fuerza de agarre muscular frente a los ratones de control Stat3flox/flox portadores de tumor (figura 37E). Por tanto, la inhibición genética in vivo de p-Stat3 produce resultados como los logrados al suprimir p-Stat3 con C188-9 in vitro, coherente con la conclusión de que C188-9 funciona como un inhibidor de p-Stat3.
La inactivación de C/EBP5 en ratones suprime la caquexia inducida por tumores LLC
Debido a que los cánceres LLC o C26 aumentan las expresiones de p-Stat3, C/EBPS más miostatina en el músculo, más la inhibición de la miostatina que bloquea la atrofia muscular (Han et al., 2013), se examinó si C/EBPS también es necesario para la atrofia muscular que sigue a la activación de p-Stat3. Se crearon ratones homocigóticos para inactivación de C/EBPS en todo el cuerpo a partir de ratones C57BL6; los ratones son fértiles y se desarrollan con normalidad y responden adversamente al cáncer. Cuando las células cancerosas LLC se inyectaron por vía subcutánea en los ratones genéticamente alterados y de control, la ausencia de C/EBPS no afectó el crecimiento de los tumores LLC. Los pesos del cuerpo y los músculos de los ratones C/EBPS KO se conservaron, pero en los ratones WT con LLC, hubo pérdida de peso corporal y muscular (figura 38A, B). De manera destacable, LLC provocó una disminución en el peso de los diferentes tipos de músculos, incluyendo los músculos gastrocnemio y tibial anterior de fibras mixtas, así como los músculos de fibras rojas (sóleo) y fibras blancas (extensor largo de los dedos).
Un mecanismo que interviene en la pérdida de masa muscular en ratones WT con LLC es un aumento en la degradación de proteínas en los músculos. Esta respuesta se redujo significativamente en ratones C/EBPS KO (figura 38C). Las mejoras en la masa muscular y el metabolismo se asociaron con un aumento en la fuerza de agarre en ratones C/EBPs KO (figura 38D). De acuerdo con la ruta de señalización propuesta, la inactivación de C/EBPS suprimió el nivel de miostatina inducido por tumor en el músculo de los ratones (figura 38E). Considerados en conjunto, los resultados demuestran que se requiere C/EBPS para la ruta que vincula p-Stat3 con la pérdida de masa muscular.
La inhibición de la activación de Stat3 mejora la atrofia muscular inducida por cáncer
Para examinar los posibles mecanismos que provocan pérdida de masa muscular inducida por cáncer, se inyectaron células cancerosas C26 en ratones CD2F1. Según lo informado por otros (Aulino et al., 2010), el injerto de tumores C26 en ratones provoca una pérdida pronunciada de peso corporal (figura 39B). Además de la pérdida de masa muscular, hubo un aumento significativo en pStat3 en los músculos de ratones que portaban tumores C26 (figura 39A). Para investigar si la pérdida de peso corporal dependía de la activación de Stat3, los ratones que portaban células tumorales C26 se trataron un inhibidor micromolecular de p-Stat3, C188-9, durante 14 días comenzando a los 5 días después del injerto del tumor. En ratones portadores de tumor tratados con C188-9, se suprimió la activación de Stat3.
También hubo un aumento significativo en el peso corporal aunque el tumor C26 había estado en su sitio durante 19 días. La capacidad de C188-9 de mejorar el peso corporal incluía el bloqueo de la atrofia muscular, ya que los pesos de los músculos tibial anterior (TA) y gastrocnemio de fibras mixtas, así como los músculos sóleo predominantemente de fibras rojas y EDL de fibras blancas eran significativamente mayores que los pesos de los ratones portadores de tumor alimentados en paralelo que se trataron con D5W (figura 39C). Los tamaños de las miofibras son coherentes con la masa muscular (figuras 39D y E). De manera destacable, el aumento de la masa muscular en ratones portadores de tumor dios lugar a una fuerza de agarre mejorada, una medida de la función muscular (figura 37G). Los mecanismos subyacentes a las mejoras en la masa muscular incluían un aumento en la síntesis de proteínas más una disminución en la degradación de proteínas que daba como resultado una mejora en el tamaño de las miofibras (figuras 39F y G). Hubo un aumento en la tasa de síntesis y degradación de proteínas tanto en las fibras blancas (EDL) como en las rojas (sóleo).
p-Stat3 estimula la transcripción de caspasa-3, que participa en el desarrollo de la caquexia por cáncer.
La caspasa-3 es una etapa inicial para el atrofia muscular, porque la caspasa-3 desempeña dos funciones en la promoción de la proteólisis muscular: en primer lugar, la caspasa-3 escinde la estructura compleja de las proteínas musculares para proporcionar sustratos para el UPS (Du et al., 2004; Song et al., 2005; Zhang et al., 2009). En segundo lugar, la caspasa-3 escinde subunidades específicas de la partícula del proteasoma 19S que estimula la actividad proteolítica del proteasoma 26S (Wang et al., 2010). Además de estas propiedades, la activación de la caspasa-3 puede reconocerse por la presencia de un fragmento de actina de 14 kDa que queda en la fracción insoluble de las biopsias musculares (Du et al., 2004; Workeneh et al., 2006). Para evaluar si el tumor induce la expresión y activación de caspasa-3 en la pérdida de masa muscular, se midió la procaspasa-3 y la caspasa-3 escindida en el músculo de ratones portadores de tumor C26 o LLC; ambos tumores estimulaban el nivel de procaspasa-3 y caspasa-3 escindida en el músculo (figura 40A). La actividad caspasa-3 también aumentó, porque en el músculo de los ratones portadores de alguno de los tumores, había un aumento del fragmento de actina de 14 kDa (figura 40B).
A continuación, se midió si el aumento de la expresión de caspasa-3 está vinculado con p-Stat3 inducido por tumor en el músculo. Usando el programa MatInspector, había tres supuestos sitios de unión a Stat3 en la región promotora de 3 kb de caspasa-3. Para someter a prueba si p-Stat3 inducido por el medio de células cancerosas estimula su unión con el promotor de caspasa-3, las células C2C12 se trataron con medio acondicionado C26 durante 24 h y se sometieron a un ensayo ChIP usando anti-p-Stat3, el ADN asociado con p-Stat3 se amplificó usando cebadores del promotor de caspasa-3, había un fragmento de ADN de la amplificación por PCR en los miotubos C2C12 tratados con medios acondicionados C26, pero no en las células de control (miotubos C2C12 en medio sin suero) (figura 40C). Para determinar adicionalmente que Stat3 podría unirse con el promotor de caspasa-3 para estimular la transcripción de caspasa-3, los miotubos C2C12 se infectaron con adenovirus que expresaba Stat3. Las células de control se infectaron con adenovirus que expresaba GFP. Estas células se trataron con o sin IL-6 (100 ng/ml) durante 24 h. El ensayo ChIP que usa anti-Stat3 indica que las células que no sobreexpresan Stat3 o el tratamiento con IL-6 no muestran unión de Stat3 con caspasa-3. Stat3 se une con caspasa-3 en células que sobreexpresan Stat3 y tratadas con IL-6. p-Stat3 se unía a caspasa-3 en cualquier condición y había una fuerte interacción entre caspasa-3 y p-Stat3 en células que sobreexpresaban Stat3 y estimuladas con IL-6 (figura 40D). Para someter a prueba si la unión de p-Stat3 con el promotor de caspasa-3 estimula la transcripción de caspasa-3, el mioblasto C2C12 se transfectó con el plásmido del promotor de caspasa-3 en la construcción de luciferasa y el plásmido que expresa Stat3 activo de manera constitutiva (Stat3C). Las células de control se transfectaron con ADNc3. Las células se trataron con o sin IL-6 durante 6 horas. Hubo actividad promotora de caspasa-3 estimulada por IL-6 o StatC, pero las células estimuladas tanto por IL-6 como por la sobreexpresión de Stat3 estimularon la mayor actividad promotora de caspasa-3. Cuando se eliminaron los tres sitios de unión a Stat3 en el promotor de caspasa-3 (-178/+14), no se encontró actividad de promotor de caspasa-3 estimulada incluso con IL-6 o Stat3C o ambos (figura 40E). Estos resultados indican que la unión de p-Stat3 a caspasa-3 estimula su expresión.
La activación de Stat3 induce el sistema ubiquitina-proteasoma en la caquexia inducida por cáncer.
Cuando los miotubos C2C12 se trataron con medios acondicionados de células C26 con o sin C188-9 durante 72 horas, hubo un nivel de proteínas disminuido de la cadena pesada de miosina, y esta respuesta se bloquea por C188-9 (figura 41A). Para someter a prueba si esta proteólisis implicaba el UPS, en estas células se midió la expresión de ARNm de atrogina y MuRF-1; hubo una expresión significativamente aumentada de ambas ligasas de ubiquitina E3 específicas de músculo, y esta respuesta se suprime por C188-9 (figura 41A). Para someter a prueba si este es el caso en el músculo de los ratones, los niveles de expresión de atrogina-1 y MuRF-1 se midieron en músculo de ratones portadores de tumor con inactivación de Stat3 o tratamiento con C188-9, y estos resultados son coherentes con los resultados de cultivo celular. Para finalizar, hubo actividad del proteasoma aumentada en el músculo de ratones portadores de tumor C26 y se suprimió por C188-9 (figura 41D). Por lo tanto, la activación de Stat3 se produce en el músculo de ratones portadores de tumor con UPS estimulado para inducir la atrofia muscular.
A modo de ejemplo, la figura 42 ejemplifica la manera en que en una realización el cáncer que activa p-Stat3 en el músculo puede estimular la pérdida de masa muscular. La activación de Stat3 estimula la expresión de C/EBP5, que a continuación aumenta la miostatina y MAFbx/atrogina-1 y MuRF-1 para aumentar la atrofia muscular por el UPS. La activación de Stat3 también aumenta la expresión y actividad de caspasa-3 para coordinar la proteólisis muscular con el UPS.
REFERENCIAS
Las citas completas de las referencias citadas en el presente documento se proporcionan en la siguiente lista.
PUBLICACIONES
Akira, S., 2000. Roles of STAT3 defined by tissue-specific gene targeting. Oncogene 19: 2607-2611.
Akira, S., 1997, IL-6-regulated transcription factors. Int J Biochem Cell Biol 29: 1401-1418.
Akira, S., Isshiki, H., Sugita, T., Tanabe, O., Kinoshita, S., Nishio, Y., Nakajima, T., Hirano, T. y Kishimoto, T. (1990). A nuclear factor for IL-6 expression (NF-IL6) is a member of a C/EBP family. EMBO J. 9, 1897-1906.
Al-Hajj, M., Wicha, M.S., Benito-Hernández, A., Morrison, S.J., y Clarke, M.F. 2003. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 3983-3988.
Allen, D.L. y Unterman, T.G. (2007). Regulation of myostatin expression and myoblast differentiation by FoxO and SMAD transcription factors. Am. J. Physiol Cell Physiol 292, C188-C199.
Alonzi, T., Gorgonas, B., Screpanti, I., Gulino, A., y Poli, V. (1997). Interleukin-6 and CAAT/enhancer binding protein beta-deficient mice act as tools to dissect the IL-6 signalling pathway and IL-6 regulation. Immunobiology 198, 144­ 156.
Baltgalvis, K.A., Berger, F.G., Pena, M.M., Davis, J.M., Muga, S.J., y Carson,J.A. (2008). Interleukin-6 and cachexia in ApcMin/+ mice. Am. J. Physiol Regul. Integr. Comp Physiol 294, R393-R401.
Becker, S., Groner B, Muller CW (1998) Three-dimensional structure of the Stat3[beta] homodimer bound to DNA. Nature 394 (6689): 145-151.
Bhasin, D., Cisek, K., Pandharkar, T., Regan, N., Li, C., Pandit, B., Lin, J., y Li, P.K. (2008). Design, synthesis, and studies of small molecule STAT3 inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 18, 391-395.
Bonetto, A., Aydogdu, T., Kunzevitzky, N., Guttridge, D.C., Khuri, S., Koniaris, L.G., y Zimmers, T.A. (2011). STAT3 activation in skeletal muscle links muscle wasting and the acute phase response in cancer cachexia. PLoS. Onc. 6, e22538.
Brinkley, BR, Beall PT, Wible LJ, Mace ML, Turner DS et al. (1980) Variations in Cell Form and Cytoskeleton in Human Breast Carcinoma Cells in vitro. Cancer Res 40 (9): 3118-3129.
Bromberg, J., 2002. Stat proteins and oncogenesis. J Clin Invest 109: 1139-1142.
Bromberg, J., y Darnell, J.E., Jr. 2000. The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene 19: 2468-2473.
Bromberg, J.F., Horvath, C.M., Besser, D., Lathem, W.W., y Darnell, J.E., Jr. 1998. Stat3 activation is required for cellular transformation by v-src. Mol Cell Biol 18: 2553-2558.
Bromberg, J.F., Wrzeszczynska, M.H., Devgan, G., Zhao, Y., Pestell, R.G., Albanese, C., y Darnell, J.E., Jr. 1999. Stat3 as an oncogene [la errata publicada aparece en Cell, 15 de octubre de 1999; 99 (2): 239]. Cell 98: 295-303. Cailleau R OM, Crueiger QVJ. (1978) Long term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization. In vitro 14: 911-915.
Caldenhoven, E., van, D.T.B., Solari, R., Armstrong, J., Raaijmakers, J.A.M., Lammers, J.W.J., Koenderman, L., y de, G.R.P. 1996. STAT3beta, a splice variant of transcription factor STAT3, is a dominant negative regulator of transcription. Journal of Biological Chemistry 271: 13221-13227.
Carrero, J.J., Chmielewski, M., Axelsson, J., Snaedal, S., Heimburger, O., Barany, P., Suliman, M.E., Lindholm, B., Stenvinkel, P., y Qureshi, A.R. (2008). Muscle atrophy, inflammation and clinical outcome in incident and prevalent dialysis patients. Clin. Nutr. 27, 557-564.
Catlett-Falcone, R., Landowski, T.H., Oshiro, M.M., Turkson, J., Levitzki, A., Savino, R., Ciliberto, G., Moscinski, L., Fernández-Luna, J.L., Nunez, G., et al. 1999. Constitutive activation of Stat3 signaling confers resistance to apoptosis in human U266 myeloma cells. Immunity 10: 105-115.
Chakraborty, A., Dyer KF, Cascio M, Mietzner TA, Tweardy DJ (1999) Identification of a Novel Stat3 Recruitment and Activation Motif Within the Granulocyte Colony-Stimulating Factor Receptor. Blood 93(1): 15-24.
Chakraborty, A., White, S.M., Schaefer, T.S., Ball, E.D., Dyer, K.F., y Tweardy, D.J. 1996. Granulocyte colonystimulating factor activation of Stat3 alpha and Stat3 beta in immature normal and leukemic human myeloid cells. Blood 88: 2442-2449.
Chapman, R.S., Lourenco, P.C., Tonner, E., Flint, D.J., Selbert, S., Takeda, K., Akira, S., Clarke, A.R., y Watson, C.J.
1999. Suppression of epithelial apoptosis and delayed mammary gland involution in mice with a conditional knockout of Stat3. Genes Dev 13: 2604-2616.
Chen, X., Vinkemeier U, Zhao Y, Jeruzalmi D, Darnell JE et al. (1998) Crystal Structure of a Tyrosine Phosphorylated STAT-1 Dimer Bound to DNA. Cell 93(5): 827-839.
Cheung, W.W., Paik, K.H., y Mak, R.H. (2010). Inflammation and cachexia in chronic kidney disease. Pediatr. Nephrol.
25, 711-724.
Cohen, M.S., Zhang C, Shokat KM, Taunton J (2005) Structural Bioinformatics-Based Design of Selective, Irreversible Kinase Inhibitors. Science 308(5726): 1318-1321.
Coleman, DR, Ren Z, Mandal PK, Cameron AG, Dyer GA et al. (2005) Investigation of the Binding Determinants of Phosphopeptides Targeted to the Src Homology 2 Domain of the Signal Transducer and Activator of Transcription 3. Development of a High-Affinity Peptide Inhibitor. J Med Chem 48 (21): 6661-6670.
Costa-Pereira, A.P., Tininini, S., Strobl, B., Alonzi, T., Schlaak, J.F., Is'harc, H., Gesualdo, I., Newman, S.J., Kerr, I.M., y Poli, V. 2002. Mutational switch of an IL-6 response to an interferon-gamma-like response. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 8043-8047.
Daling, J.R., y Malone, K.E. 2003. Incidence of invasive breast cancer by hormone receptor status from 1992 to 1998. J Clin Oncol 21:28-34.
Darnell JE (2005), Validating Stat3 in cancer therapy. Nat Med 11 (6): 595-596.
Dave, B., , y Chang, J. 2009. Treatment resistance in stem cells and breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia 14: 79-82.
Diaz, N., Minton, S., Cox, C., Bowman, T., Gritsko, T., García, R., Eweis, I., Wloch, M., Livingston, S., Seijo, E., et al.
2006. Activation of stat3 in primary tumors from high-risk breast cancer patients is associated with elevated levels of activated SRC and survivin expression. Clin Cancer Res 12:20-28.
Dong, S., Chen S-J, Tweardy DJ (2003) Cross-talk between Retinoic Acid and Stat3 Signaling Pathways in Acute Promyelocytic Leukemia. Leuk Lymphoma 44:2023-2029.
Du, J., Wang, X., Meireles, C.L., Bailey, J.L., Debigare, R., Zheng, B., Price, S.R., y Mitch, W.E. (2004). Activation of caspase 3 is an initial step triggering muscle proteolysis in catabolic conditions. J. Clin. Invest 113, 115-123.
Dunn, GP, Bruce AT, Ikeda H, Old LJ, Schreiber RD (2002) Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol 3 (11): 991-998.
Durbin, J.E., Hackenmiller, R., Simon, M.C., y Levy, D.E. 1996. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell 84:443-450.
Eckert, H., Bajorath J (2007) Molecular similarity analysis in virtual screening: foundations, limitations and novel approaches. Drug discovery today 12(5-6): 225-233.
Epling-Burnette, P.K., Liu, J.H., Catlett-Falcone, R., Turkson, J., Oshiro, M., Kothapalli, R., Li, Y., Wang, J.M., Yang-Yen, H.F., Karras, J., et al. 2001. Inhibition of STAT3 signaling leads to apoptosis of leukemic large granular lymphocytes and decreased Mcl-1 expression. J Clin Invest 107: 351-362.
Feldman, B.J., Streeper, R.S., Farese, R.V., Jr., y Yamamoto, K.R. (2006). Myostatin modulates adipogenesis to generate adipocytes with favorable metabolic effects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 103, 15675-15680.
Fiala, S., 1968. The cancer cell as a stem cell unable to differentiate. A theory of carcinogenesis. Neoplasma 15: 607­ 622.
Fouque, D., Kalantar-Zadeh, K., Kopple, J.D., Cano, N., Chauveau, P., Cuppari, L., Franch, H.A., Guarnieri, G., Ikizler, T.A., Kaysen, G.A., Lindholm, B., Massy, Z., Mitch, W.E., Pineda, E., Stenvinkel, P., Trevinho-Becerra,T., y Wanner,C. (2008). A proposed nomenclature and diagnostic criteria for protein-energy wasting in acute and chronic kidney disease. Kidney Int. 73, 391-398.
Fu, X.-Y., Schindler, C, Improta, T., Aebersold, R., y Darnell, J.E., Jr. 1992. The proteins of ISGF-3, the interferon alpha-induced transcriptional activator, define a gene family involved in signal transduction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89:7840-7843.
García, R., y, Jove, R. 1998. Activation of STAT transcription factors in oncogenic tyrosine kinase signaling. Journal of Biomedical Science In press.
García R, Yu CL, Hudnall A, Catlett R, Nelson KL et al. (1997) Constitutive activation of Stat3 in fibroblasts transformed by diverse oncoproteins and in breast carcinoma cells. Cell Growth Differ 8(12): 1267-1276.
García R, Bowman TL, Niu G, Yu H, Minton S et al. (2001) Constitutive activation of Stat3 by the Src and Jak tyrosine kinases participates in growth regulation of human breast carcinoma cells. Oncogene 20:2499-2513.
Goodman, M.N. (1991). Tumor necrosis factor induces skeletal muscle protein breakdown in rats. Am. J. Physiol. 260, E727-E730.
Goodman, M.N. (1994). Interleukin-6 induces skeletal muscle protein breakdown in rats. Proc. Soc. Exp. Biol. Med.
205, 182-185.
Grandis, J.R., Drenning, S.D., Zeng, Q., Watkins, S.C., Melhem, M.F., Endo, S., Johnson, D.E., Huang, L., He, Y., y Kim, J.D. 2000. Constitutive activation of Stat3 signaling abrogates apoptosis in squamous cell carcinogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 4227-4232.
Gritsko, T., Williams, A., Turkson, J., Kaneko, S., Bowman, T., Huang, M., Nam, S., Eweis, I., Diaz, N., Sullivan, D., et al. 2006. Persistent activation of stat3 signaling induces survivin gene expression and confers resistance to apoptosis in human breast cancer cells. Clin Cancer Res 12:11-19.
Haan, S., Hemmann, U., Hassiepen, U., Schaper, F., Schneider-Mergener, J., Wollmer, A., Heinrich, P.C., y Grotzinger, J. 1999. Characterization and binding specificity of the monomeric STAT3-SH2 domain. J Biol Chem 274:1342-1348. Hirano, T., Nakajima, K., y Hibi, M. (1997). Signaling mechanisms through gp130: a model of the cytokine system. Cytokine Growth Factor Rev. 8, 241-252.
Horvath, C.M. (2004). The Jak-STAT pathway stimulated by interleukin 6. Sci. STKE. 2004, tr9.
Hu, Z., Wang, H., Lee, I.H., Du, J., y Mitch, W.E. (2009). Endogenous glucocorticoids and impaired insulin signaling are both required to stimulate muscle wasting under pathophysiological conditions in mice. J. Clin. Invest. 119, 7650­ 7659.
Huang, Y., Qiu J, Dong S, Redell MS, Poli V et al. (2007) Stat3 Isoforms, {alpha} and, Demonstrate Distinct Intracellular Dynamics with Prolonged Nuclear Retention of Stat3 Mapping to Its Unique C-terminal End. J Biol Chem 282(48): 34958-34967.
Hung, A.M., Ellis, C.D., Shintani, A., Booker, C., e Ikizler,T.A. (2011). IL-1beta receptor antagonist reduces inflammation in hemodialysis patients. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 437-442.
Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Murray, T., Xu, J., Smigal, C., y Thun, M.J. 2006. Cancer statistics, 2006. CA Cancer J Clin 56:106-130.
Jing, N., Tweardy DJ (2005) Targeting Stat3 in cancer therapy. anticancer Drugs 16 (6): 601-607.
Jing, N., Zhu Q, Yuan P, Li Y, Mao L et al. (2006) Targeting signal transducer and activator of transcription 3 with G-quartet oligonucleotides: a potential novel therapy for head and neck cancer. Mol Cancer Ther 5(2): 279-286.
Jing, N., Li Y, Xu X, Sha W, Li P et al. (2003) Targeting Stat3 with G-quartet oligodeoxynucleotides in human cancer cells. DNA Cell Biol 22(11): 685-696.
Jing, N., Li, Y., Xiong, W., Sha, W., Jing, L., y Tweardy, D.J. 2004. G-quartet oligonucleotides: a new class of signal transducer and activator of transcription 3 inhibitors that suppresses growth of prostate and breast tumors through induction of apoptosis. Cancer Res 64:6603-6609.
Kaplan, D.H., Shankaran, V., Dighe, A.S., Stockert, E., Aguet, M., Old, L.J., y Schreiber, R.D. 1998. Demonstration of an interferon gamma-dependent tumor surveillance system in immunocompetent mice. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 7556-7561.
Kato, T., Sakamoto E, Kutsuna H, Kimura-Eto A, Hato F et al. (2004) Proteolytic Conversión of STAT3 {alpha} to STAT3 {gamma} in Human Neutrophils: ROLE OF GRANULE-DERIVED SERINE PROTEASES. J Biol Chem 279(30): 31076­ 31080.
Kim, J.K., Xu Y, Xu X, Keene DR, Gurusiddappa S et al. (2005) A Novel Binding Site in Collagen Type III for Integrins {alpha} 1{beta}1 and {alpha}2{beta}1. J Biol Chem 280(37): 32512-32520.
Kimmel, P.L., Phillips, T.M., Simmens, S.J., Peterson, R.A., Weihs, K.L., Alleyne, S., Cruz, I., Yanovski, J.A., y Veis, J.H. (1998). Immunologic function and survival in hemodialysis patients. Kidney Int. 54, 236-244.
Kishimoto, T., Taga, T., y Akira, S. (1994). Cytokine signal transduction. Cell 76, 253-262.
Kortylewski, M., Kujawski M, Wang T, Wei S, Zhang S et al. (2005) Inhibiting Stat3 signaling in the hematopoietic system elicits multicomponent antitumor immunity. Nat Med 11 (12): 1314-1321.
Lalani, R., Bhasin, S., Porhower, F., Tarnuzzer, R., Grant, M., Shen, R., Asa, S., Ezzat, S., y González-Cadavid, N.F. (2000). Myostatin and insulin-like growth factor-I and -II expression in the muscle of rats exposed to the microgravity environment of the NeuroLab space shuttle flight. J Endocrinol. 167, 417-428.
Lecker, S.H., Goldberg, A.L., y Mitch, W.E. (2006). Protein degradation by the ubiquitin-proteasome pathway in normal and disease states. J. Am. Soc. Nephrol. 17, 1807-1819.
Lecker, S.H., Jagoe, R.T., Gomes, M., Baracos, V., Bailey, J.L., Price, S.R., Mitch, W.E., y Goldberg, A.L. (2004). Multiple types of skeletal muscle atrophy involve a common program of changes in gene expression. FASEB J. 18, 39­ 51.
Lee, S.W., Dai, G., Hu, Z., Wang, X., Du, J., y Mitch, W.E. (2004). Regulation of muscle protein degradation: coordinated control of apoptotic and ubiquitin-proteasome systems by phosphatidylinositol 3 kinase. J. Am. Soc. Nephrol. 15, 1537-1545.
Leong, P.L., Andrews, G.A., Johnson, D.E., Dyer, K.F., Xi, S., Mai, J.C., Robbins, P.D., Gadiparthi, S., Burke, N.A., Watkins, S.F., et al. 2003. Targeted inhibition of Stat3 with a decoy oligonucleotide abrogates head and neck cancer cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 4138-4143.
Li, C.I., Daling, J.R., y Malone, K.E. 2003. Incidence of invasive breast cancer by hormone receptor status from 1992 to 1998. J Clin Oncol 21:28-34.
Li, L., y Shaw, P.E. 2002. Autocrine-mediated activation of STAT3 correlates with cell proliferation in breast carcinoma lines. J Biol Chem 277:17397-17405.
Li, X., Lewis, M.T., Huang, J., Gutiérrez, C., Osborne, C.K., Wu, M.F., Hilsenbeck, S.G., Pavlick, A., Zhang, X., Chamness, G.C., et al. 2008. Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy. J Natl Cancer Inst 100:672-679.
Lin, Q., Lai R, Chirieac LR, Li C, Thomazy VA et al. (2005) Constitutive Activation of JAK3/STAT3 in Colon Carcinoma Tumors and Cell Lines: Inhibition of JAK3/STAT3 Signaling Induces Apoptosis and Cell Cycle Arrest of Colon Carcinoma Cells. Am J Pathol 167(4): 969-980.
Lin, L., Amin,R., Gallicano, G.I., Glasgow, E., Jogunoori, W., Jessup, J.M., Zasloff, M., Marshall, J.L., Shetty, K., Johnson, L., Mishra, L., y He, A.R. (2009). The STAT3 inhibitor NSC 74859 is effective in hepatocellular cancers with disrupted TGF-beta signaling. Oncogene 28, 961-972.
Lin, L., Hutzen, B., Li, P.K., Ball, S., Zuo, M., Deangelis, S., Foust, E., Sobo, M., Friedman, L., Bhasin, D., Cen, L., Li, C., y Lin, J. (2010). A novel small molecule, LLL12, inhibits STAT3 phosphorylation and activities and exhibits potent growth-suppressive activity in human cancer cells. Neoplasia. 12, 39-50.
Ma, K., Mallidis, C., Artaza, J., Taylor, W., González-Cadavid, N., y Bhasin, S. (2001). Characterization of 5'-regulatory region of human myostatin gene: regulation by dexamethasone in vitro. Am J Physiol Endocrinol. Metab 281, E1128-E1136.
Ma, K., Mallidis, C., Bhasin, S., Mahabadi, V., Artaza, J., González-Cadavid, N., Arias, J., y Salehian, B. (2003). Glucocorticoid-induced skeletal muscle atrophy is associated with upregulation of myostatin gene expression. Am. J. Physiol 285, E363-E371.
Maritano, D., Sugrue, M.L., Tininini, S., Dewilde, S., Strobl, B., Fu, X., Murray-Tait, V., Chiarle, R., y Poli, V. 2004. The STAT3 isoforms alpha and beta have unique and specific functions. Nat Immunol 5:401-409.
May, R.C., Kelly, R.A., y Mitch, W.E. (1987). Mechanisms for defects in muscle protein metabolism in rats with chronic uremia: The influence of metabolic acidosis. J. Clin. Invest. 79, 1099-1103.
McMurray JS (2006), A New Small-Molecule Stat3 Inhibitor. Chemistry & Biology 13(11): 1123-1124.
Meraz, M.A., White, J.M., Sheehan, K.C., Bach, E.A., Rodig, S.J., Dighe, A.S., Kaplan, D.H., Riley, J.K., Greenlund, A.C., Campbell, D., et al. 1996. Targeted disruption of the Stat1 gene in mice reveals unexpected physiologic specificity in the JAK-STAT signaling pathway. Cell 84:431-442.
Minino, A.M., Heron, M.P., Murphy, S.L., y Kochanek, K.D. 2007. Deaths: final data for 2004. Natl Vital Stat Rep 55:1-119.
Mora, L.B., Buettner, R., Seigne, J., Diaz, J., Ahmad, N., García, R., Bowman, T., Falcone, R., Fairclough, R., Cantor, A., et al. 2002. Constitutive activation of Stat3 in human prostate tumors and cell lines: direct inhibition of Stat3 signaling induces apoptosis of prostate cancer cells. Cancer Res 62:6659-6666.
Neculai, D., Neculai AM, Verrier S, Straub K, Klumpp K et al. (2005) Structure of the Unphosphorylated STAT5a Dimer. J Biol Chem 280(49): 40782-40787.
Nemethy, G., Gibson KD, Palmer KA, Yoon CN, Paterlini G et al. (1992) Energy Parameters in Polypeptides. 10. Improved Geometrical Parameters and Nonbonded Interactions for Use in the ECEPP/3 Algorithm, with Application to Proline-Containing Peptides. JPhys Chem 96: 6472-6484.
Park, O.K., Schaefer, T.S., y Nathans, D. 1996. In vitro activation of Stat3 by epidermal growth factor receptor kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93:13704-13708.
Park, O.K., Schaefer, L.K., Wang, W., y Schaefer, T.S. 2000. Dimer stability as a determinant of differential DNA binding activity of Stat3 isoforms. J Biol Chem 275:32244-32249.
Penner, G., Gang,G., Sun, X., Wray, C., y Hasselgren, P.O. (2002). C/EBP DNA-binding activity is upregulated by a glucocorticoid-dependent mechanism in septic muscle. Am. J. Physiol Regul. Integr. Comp Physiol 282, R439-R444. Poli, V. (1998). The role of C/EBP isoforms in the control of inflammatory and native immunity functions. J. Biol. Chem.
273, 29279-29282.
Price, S.R., Bailey, J.L., Wang, X., Jurkovitz, C., England, B.K., Ding, X., Phillips, L.S., y Mitch, W.E. (1996). Muscle wasting in insulinopenic rats results from activation of the ATP-dependent, ubiquitin-proteasome pathway by a mechanism including gene transcription. J. Clin. Invest. 98, 1703-1708.
Qing, Y., y Stark, G.R. 2004. Alternative activation of STAT 1 and STAT3 in response to interferon-gamma. J Biol Chem 279:41679-41685.
Ramana, C., Chatterjee-Kishore M, Nguyen H, Stark G (2000) Complex roles of Stat1 in regulating gene expression. Oncogene 19(21): 2619-2627.
Ramaji, D.P. y Foka, P. (2002). CCAAT/enhancer-binding proteins: structure, function and regulation. Biochem. J. 365, 561-575.
Real, P.J., Sierra, A., De Juan, A., Segovia, J.C., López-Vega, J.M., y Fernández-Luna, J.L. 2002. Resistance to chemotherapy via Stat3-dependent overexpression of Bcl-2 in metastatic breast cancer cells. Oncogene 21: 7611­ 7618.
Redell, MS, Tweardy DJ (2006) Targeting transcription factors in cancer: Challenges and evolving strategies. Drug Discovery Today: Technologies 3(3): 261-267.
Redell, M.S., y Tweardy, D.J. 2005. Targeting transcription factors for cancer therapy. Curr Pharm Des 11:2873-2887. Redell, M.S., Ruiz, M.J., Alonzo, T.A., Gerbing, R.B., y Tweardy, D.J. (2011). Stat3 signaling in acute myeloid leukemia: ligand-dependent and -independent activation and induction of apoptosis by a novel small-molecule Stat3 inhibitor. Blood 117, 5701-5709.
Ren, Z., Cabell, L.A., Schaefer, T.S., y McMurray, J.S. 2003. Identification of a high-affinity phosphopeptide inhibitor of stat3. Bioorg Med Chem Lett 13: 633-636.
Rui, L., Fisher, T.L., Thomas, J., y White, M.F. (2004). Regulation of insulin/insulin-like growth factor-1 signaling by proteasome-mediated degradation of insulin receptor substrate-1. J. Biol. Chem. 276, 40362-40367.
Rui, L., Yuan, M., Frantz, D., Shoelson, S., y White, M.F. (2002). SOCS-1 and SOCS-3 block insulin signaling by ubiquitin-mediated degradation of IRS1 and iRs 2. J Biol. Chem. 277, 42394-42398.
Ryan, J.J., McReynolds, L.J., Huang, H., Nelms, K., y Paul, W.E. 1998. Characterization of a mobile Stat6 activation motif in the human IL-4 receptor. J Immunol 161:1811-1821.
Sandri, M., Sandri, C., Gilbert, A., Skuck, C., Calabria, E., Picard, A., Walsh, K., Schiaffino, S., Lecker, S.H. y Goldberg, A.L. (2004). Foxo transcription factors induce the atrophy-related ubiquitin ligase atrogin-1 and cause skeletal muscle atrophy. Cell 117, 399-412.
Sanford, D.C. y DeWille, J.W. (2005). C/EBPdelta is a downstream mediator of IL-6 induced growth inhibition of prostate cancer cells. Prostate 63, 143-154.
Satya-Prakash KL PS, Hsu TC, Olive M, Cailleau R (1981) Cytogenetic analysis on eight human breast tumor cell lines: high frequencies of 1q, 11q, and HeLa-like marker chromosomes. Cancer GenetCytogenet 3: 61-73.
Schaefer, T.S., Sanders, L.K., y Nathans, D. 1995. Cooperative transcriptional activity of Jun and Stat3 beta, a short form of Stat3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92:9097-9101. Schindler, C., y Darnell, J.E., Jr. 1995. Transcriptional responses to polypeptide ligands: the JAK-STAT pathway.
[Revisión]. Annual Review of Biochemistry 64: 621-651.
Schindler, C., Fu, X.Y., Improta, T., Aebersold, R., y Darnell, J.E., Jr. 1992. Proteins of transcription factor ISGF-3: one gene encodes the 91-and 84-kDa ISGF-3 proteins that are activated by interferon alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89:7836-7839.
Schust, J., Sperl, B., Hollis, A., Mayer, T.U., y Berg, T. (2006). Stattic: a small-molecule inhibitor of STAT3 activation and dimerization. Chem. Biol. 13, 1235-1242.
Shah, V.O., Dominic, E.A., Moseley, P., Pickett, G., Fleet, M., Ness, S., y Raj, D.S. (2006). Hemodialysis modulates gene expression profile in skeletal muscle. Am. J. Kidney Dis. 48, 616-628.
Shao, H., Cheng HY, Cook RG, Tweardy DJ (2003) Identification and Characterization of Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Recruitment Sites within the Epidermal Growth Factor Receptor. Cancer Res 63 (14): 3923­ 3930.
Shao, H., Xu X, Jing N, Tweardy DJ (2006) Unique Structural Determinants for Stat3 Recruitment and Activation by the Granulocyte Colony-Stimulating Factor Receptor at Phosphotyrosine Ligands 704 and 744. J Immunol 176(5): 2933-2941.
Shao, H., Xu X, Mastrangelo M-AA, Jing N, Cook RG et al. (2004) Structural Requirements for Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Binding to Phosphotyrosine Ligands Containing the YXXQ Motif. J Biol Chem 279(18): 18967-18973.
Sharp, Z.D., Mancini MG, Hinojos CA, Dai F, Berno V et al. (2006) Estrogen-receptor- {alpha} exchange and chromatin dynamics are ligand- and domain-dependent. J Cell Sci 119(19): 4101-4116.
Siddiquee, K., Zhang S, Guida WC, Blaskovich MA, Greedy B et al. (2007) Selective chemical probe inhibitor of Stat3, identified through structure-based virtual screening, induces antitumor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences 104(18): 7391-7396.
Song, H., Wang R, Wang S, Lin J (2005) A low-molecular-weight compound discovered through virtual database screening inhibits Stat3 function in breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences 102(13): 4700-4705.
Sterneck, E., Paylor, R., Jackson-Lewis, V., Libbey, M., Przedborski, S., Tessarollo, L., Crawley, J.N., y Johnson, P.F. (1998). Selectively enhanced contextual fear conditioning in mice lacking the transcriptional regulator CCAAT/enhancer binding protein delta. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 95, 10908-10913.
Stitt, T.N., Drujan, D., Clarke, B.A., Panaro, F., Timofeyva, Y., Klinenber, J.R., González, M., Yancopoulos, G.D., y Glass, D.J. (2004). The IGF-1/PI3K/Akt pathway prevents expression of muscle atrophy-induced ubiquitin ligases by inhibiting FOXO transcription factors. Mol. Cell 14, 395-403.
Strecker, T.E., Shen, Q., Zhang, Y., Hill, J.L., Li, Y., Wang, C., Kim, H.T., Gilmer, T.M., Sexton, K.R., Hilsenbeck, S.G., et al. 2009. Effect of lapatinib on the development of estrogen receptor-negative mammary tumors in mice. J Natl Cancer Inst 101:107-113.
Takeda, K., Noguchi, K., Shi, W., Tanaka, T., Matsumoto, M., Yoshida, N., Kishimoto, T., y Akira, S. 1997. Targeted disruption of the mouse Stat3 gene leads to early embryonic lethality. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 3801-3804. Takeda, K., Kaisho, T., Yoshida, N., Takeda, J., Kishimoto, T., y Akira, S. (1998). Stat3 activation is responsible for IL-6-dependent T cell proliferation through preventing apoptosis: generation and characterization of T cell-specific Stat3-deficient mice. J. Immunol. 161, 4652-4660.
Totrov, M., Abagyan R (1997) Proteins 1: 215-220.
Turkson, J., 2004. STAT proteins as novel targets for cancer drug discovery. Expert Opin Ther Targets 8:409-422. Turkson, J., Bowman, T., García, R., Caldenhoven, E., De Groot, R.P., y Jove, R. 1998. Stat3 activation by Src induces specific gene regulation and is required for cell transformation. Mol Cell Biol 18: 2545-2552.
Turkson, J., Jove R (2000) STAT proteins: novel molecular targets for cancer drug discovery. Oncogene 19:6613-6626. Turkson, J., Ryan, D., Kim, J.S., Zhang, Y., Chen, Z., Haura, E., Laudano, A., Sebti, S., Hamilton, A.D., y Jove, R.
2001. Phosphotyrosyl peptides block Stat3-mediated DNA binding activity, gene regulation, and cell transformation. J Biol Chem 276:45443-45455.
Turkson, J., Zhang, S., Palmer, J., Kay, H., Stanko, J., Mora, L.B., Sebti, S., Yu, H., y Jove, R. 2004. Inhibition of constitutive signal transducer and activator of transcription 3 activation by novel platinum complexes with potent antitumor activity. Mol Cancer Ther 3:1533-1542.
Tweardy, DJ, Redell MS (2005) Targeting Transcription Factors for Cancer Therapy. Curr Pharm Des 11: 2873-2887. Tweardy, DJ, Wright TM, Ziegler SF, Baumann H, Chakraborty A et al. (1995) Granulocyte colony-stimulating factor rapidly activates a distinct STAT- like protein in normal myeloid cells. Blood 86(12): 4409-4416.
Uddin, S., Hussain, A.R., Manogaran, P.S., Al-Hussein, K., Platanias, L.C., Gutiérrez, M.I., y Bhatia, K.G. 2005. Curcumin suppresses growth and induces apoptosis in primary effusion lymphoma. Oncogene 24: 7022-7030.
Verzola, D., Procopio, V., Sofia, A., Villaggio, B., Tarroni, A., Bonani, A., Manucci, I., De, C.F., Gianetta, E., Saffioti, S., y Garibotto, G. (2011). Apoptosis and myostatin mRNA are upregulated in the skeletal muscle of patients with chronic kidney disease. Kidney Int. 79, 773-782.
Wang, X.H., Zhang, L., Mitch, W.E., LeDoux, J.M., Hu, J., y Du, J. (2010). Caspase-3 Cleaves Specific 19 S Proteasome Subunits in Skeletal Muscle Stimulating Proteasome Activity. J. Biol. Chem. 285, 21249-21257.
Wiederkehr-Adam, M., Ernst, P., Muller, K., Bieck, E., Gombert, F.O., Ottl, J., Graff, P., Grossmuller, F., y Heim, M.H.
2003. Characterization of phosphopeptide motifs specific for the Src homology 2 domains of signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) and STAT3. J Biol Chem 278:16117-16128.
Xu, X., Kasembeli, M.M., Jiang, X., Tweardy, B.J., yTweardy, D.J. 2009. Chemical probes that competitively and selectively inhibit Stat3 activation. PLoS ONE 4:e4783.
Yang, H., Mammen, J., Wei, W., Menconi, M., Evenson, A., Fareed, M., Petkova, V., y Hasselgren, P.O. (2005). Expression and activity of C/EBPbeta and delta are upregulated by dexamethasone in skeletal muscle. J. Cell Physiol 204, 219-226.
Yoo, J.Y., Huso, D.L., Nathans, D., y Desiderio, S. 2002. Specific ablation of Stat3beta distorts the pattern of Stat3-responsive gene expression and impairs recovery from endotoxic shock. Cell 108:331-344.
Yoshikawa, H., Matsubara, K., Qian, G.S., Jackson, P., Groopman, J.D., Manning, J.E., Harris, C.C., y Herman, J.G.
2001. SOCS-1, a negative regulator of the JAK/STAT pathway, is silenced by methylation in human hepatocellular carcinoma and shows growth-suppression activity. Nat Genet 28:29-35.
Yu, C.L., Meyer, D.J., Campbell, G.S., Larner, A.C., Carter-Su, C., Schwartz, J., y Jove, R. 1995. Enhanced DNA-binding activity of a Stat3-related protein in cells transformed by the Src oncoprotein. Science 269:81-83.
Yu, H., Jove R (2004) The STATs of cancer-new molecular targets come of age. Nature Reviews Cancer 4(2): 97-105.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para su uso en un método de tratamiento de una afección seleccionada del grupo que consiste en atrofia muscular, debilidad muscular, caquexia, y una combinación de las mismas en un individuo que tiene atrofia muscular o caquexia o que está en riesgo de tener atrofia muscular o caquexia;
en donde dicha afección es el resultado de insuficiencia renal crónica subyacente;
en donde dicha composición se selecciona del grupo que consiste en N-(1',2-dihidroxi-1,2'-binaftalen-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(3,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(4,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(5,1-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(6,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(7,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(8,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, 4-bromo-N-(1,6'-dihidroxi-[2,2']binaftalenil-4-il)-bencensulfonamida y combinaciones de las mismas;
en donde dicho método comprende la etapa de proporcionar al individuo una cantidad eficaz de una o más de dichas composiciones.
2. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la atrofia muscular, la debilidad muscular, o ambas, son parte de la caquexia.
3. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde al individuo se le proporciona la composición en múltiples dosis.
4. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde las múltiples dosis están separadas por horas, días o semanas.
5. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde al individuo se le proporciona un tratamiento adicional para la afección seleccionada del grupo que consiste en atrofia muscular, debilidad muscular, caquexia y una combinación de las mismas.
6. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde al individuo se le proporciona un tratamiento para la afección médica subyacente.
7. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde al individuo se le proporciona un tratamiento adicional para la afección seleccionada del grupo que consiste en atrofia muscular, debilidad muscular, caquexia, y una combinación de las mismas y al individuo se le proporciona un tratamiento para la afección médica subyacente.
8. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición inhibe Stat3, Stat1 o ambos.
9. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho método comprende además la etapa de diagnosticar la afección seleccionada del grupo que consiste en atrofia muscular, debilidad muscular, caquexia y una combinación de las mismas.
10. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho método comprende además la etapa de diagnosticar la afección médica subyacente.
11. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición se administra por vía intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, por inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada, mediante un catéter, mediante un lavado, en composiciones lipídicas, en composiciones liposómicas o como un aerosol.
12. Una composición seleccionada del grupo que consiste en N-(3,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(4,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(5,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(6,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(7,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, N-(8,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida y 4-bromo-N-(1,6'-dihidroxi-[2,2']binaftalenil-4-il)-bencensulfonamida.
13. Una composición de acuerdo con la reivindicación 12, comprendida en un vehículo farmacéutico.
14. Una composición de acuerdo con la reivindicación 12, comprendida en un disolvente, polietilenglicol (PEG), o ambos, en donde, preferentemente:
(i) el disolvente es glicéridos EP de caprilcaproil macrogol-8; glicéridos NF de caprilcaproil polioxilo-8; y/o glicéridos caprílicos/cápricos de PEG-8; o
(ii) el PEG es PEG-400.
15. Una composición de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el disolvente es glicéridos EP de caprilcaproil macrogol-8; glicéridos NF de caprilcaproil polioxilo-8; y/o glicéridos caprílicos/cápricos de PEG-8 y el PEG es PEG-400,
en donde más preferentemente el disolvente que es glicéridos EP de caprilcaproil macrogol-8; glicéridos NF de caprilcaproil polioxilo-8; y/o glicéridos caprílicos/cápricos de PEG-8 está presente en un intervalo de un 40 % a un 80 % y el PEG-400 está presente en un intervalo de un 20 % a un 60 %,
en donde aún más preferentemente el disolvente que es glicéridos EP de caprilcaproil macrogol-8; glicéridos NF de caprilcaproil polioxilo-8; y/o glicéridos caprílicos/cápricos de PEG-8 es de un 60 % y el PEG-400 es de un 40 %.
ES14826845T 2013-07-18 2014-07-18 Métodos y composiciones para el tratamiento de la atrofia muscular, la debilidad muscular y/o la caquexia Active ES2934319T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361847778P 2013-07-18 2013-07-18
PCT/US2014/047325 WO2015010107A1 (en) 2013-07-18 2014-07-18 Methods and compositions for treatment of muscle wasting, muscle weakness, and/or cachexia

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2934319T3 true ES2934319T3 (es) 2023-02-21

Family

ID=52343751

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14826845T Active ES2934319T3 (es) 2013-07-18 2014-07-18 Métodos y composiciones para el tratamiento de la atrofia muscular, la debilidad muscular y/o la caquexia

Country Status (7)

Country Link
US (2) US10676455B2 (es)
EP (2) EP4082538B1 (es)
AU (2) AU2014290368B2 (es)
CA (1) CA2918071C (es)
ES (1) ES2934319T3 (es)
HK (1) HK1224180A1 (es)
WO (1) WO2015010107A1 (es)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3021839T3 (da) 2013-07-18 2021-07-26 Baylor College Medicine Sammensætninger for behandling af fibrose
WO2015010107A1 (en) 2013-07-18 2015-01-22 Baylor College Of Medicine Methods and compositions for treatment of muscle wasting, muscle weakness, and/or cachexia
CN109705045B (zh) * 2017-10-25 2020-07-14 中国医科大学 嘧啶类抗肿瘤化合物及其制备方法和应用
WO2019109050A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 University Of South Florida Prevention and treatment of muscle wasting with ketone supplementation
US11026905B2 (en) 2018-04-19 2021-06-08 Tvardi Therapeutics, Inc. STAT3 inhibitors
KR20210011925A (ko) 2018-04-19 2021-02-02 트발디 테라퓨틱스, 인크. Stat3 억제제
AU2020334194A1 (en) 2019-08-16 2022-02-24 Volker Adams Compounds suitable for the treatment and prophylaxis of muscle wasting and other conditions
AU2021209679A1 (en) 2020-01-24 2022-06-16 Tvardi Therapeutics, Inc. Therapeutic compounds, formulations, and uses thereof
WO2021150912A1 (en) * 2020-01-24 2021-07-29 Tvardi Therapeutics, Inc. Therapeutic compounds, formulations, and uses thereof
CN111973578A (zh) * 2020-08-03 2020-11-24 天津医科大学 C188-9、Venetoclax、Bumetanide在纤维化疾病药物中的应用
US11623918B2 (en) 2020-11-18 2023-04-11 Southern Research Institute Compounds for the treatment of acute and chronic kidney disease
WO2022109066A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Southern Research Institute Compounds for the treatment of acute and chronic kidney disease
CN113845476B (zh) * 2021-11-08 2024-04-30 中国药科大学 一种喹诺酮衍生物及其制备方法和用途
WO2023126951A1 (en) * 2022-01-03 2023-07-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Inhibitors of autophagy-related protein-protein interactions
WO2023244946A1 (en) * 2022-06-15 2023-12-21 Tvardi Therapeutics, Inc. Prodrugs of stat3 inhibitors

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4279909A (en) 1980-02-13 1981-07-21 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Antiallergic method
US6197749B1 (en) * 1997-10-29 2001-03-06 Ajinomoto Co., Inc. Method of suppressing immune responses by reducing intracellular content of glutathione in macrophages and monocytes
US20090264353A1 (en) * 2007-10-19 2009-10-22 Santaris Pharma A/S Splice Switching Oligomers for TNF Superfamily Receptors and their Use in Treatment of Disease
CA2726987C (en) * 2008-06-04 2014-02-18 Baylor College Of Medicine Stat3 inhibitors
GB2463514C (en) * 2008-09-11 2018-09-26 Galapagos Nv Imidazolidine compounds and uses therefor
WO2010080581A2 (en) * 2008-12-19 2010-07-15 The Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Education, On Behalf Of The University Of Nevada, Reno Valproic acid, derivatives, analogues, and compositions including same and methods for their therapeutic use
JPWO2010076884A1 (ja) * 2008-12-29 2012-06-21 武田薬品工業株式会社 新規縮合環化合物およびその用途
US9891213B2 (en) 2009-01-12 2018-02-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Granulocyte-based methods for detecting and monitoring immune system disorders
FR2962649A1 (fr) * 2010-07-19 2012-01-20 Conservatoire Nat Arts Et Metiers Traitement d'une pathologie liee a un effet excessif du tnf par un compose de benzene sulfonamide
WO2012159107A1 (en) * 2011-05-19 2012-11-22 Rhode Island Hospital Inhibition of renal fibrosis
US20140371188A1 (en) * 2011-11-23 2014-12-18 University Of Iowa Research Foundation Compositions and methods for inhibiting muscle atrophy and inducing muscle hypertrophy
EP2708535A1 (en) * 2012-05-11 2014-03-19 Les Laboratoires Servier Agents for treating disorders involving modulation of ryanodine receptors
DK3021839T3 (da) * 2013-07-18 2021-07-26 Baylor College Medicine Sammensætninger for behandling af fibrose
CA2918264C (en) 2013-07-18 2022-05-10 Baylor College Of Medicine Methods and compositions for prevention of allergic reaction
WO2015010107A1 (en) 2013-07-18 2015-01-22 Baylor College Of Medicine Methods and compositions for treatment of muscle wasting, muscle weakness, and/or cachexia

Also Published As

Publication number Publication date
CA2918071C (en) 2022-04-26
CA2918071A1 (en) 2015-01-22
US11161831B2 (en) 2021-11-02
EP3021841B1 (en) 2022-11-16
HK1224180A1 (zh) 2017-08-18
AU2014290368B2 (en) 2019-07-11
EP4082538B1 (en) 2024-02-14
US10676455B2 (en) 2020-06-09
EP3021841A4 (en) 2017-05-31
AU2014290368A1 (en) 2016-02-04
US20200331880A1 (en) 2020-10-22
US20150024032A1 (en) 2015-01-22
EP4082538A1 (en) 2022-11-02
AU2019240646B2 (en) 2021-04-08
EP3021841A1 (en) 2016-05-25
WO2015010107A1 (en) 2015-01-22
AU2019240646A1 (en) 2019-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2934319T3 (es) Métodos y composiciones para el tratamiento de la atrofia muscular, la debilidad muscular y/o la caquexia
ES2647562T3 (es) Inhibidores de STAT3
ES2879886T3 (es) Composiciones para el tratamiento de la fibrosis
TWI705815B (zh) 用於治療補體相關疾病之組合物及治療方法
ES2796850T3 (es) Composiciones para la prevención de una reacción alérgica
JP2023514328A (ja) Ｇｃｎ２モジュレーター化合物
JP2016517843A (ja) 新規なＳｔａｔ３阻害剤
JP2023504194A (ja) インスリン耐性における使用方法のための治療化合物
CA3082397A1 (en) Compounds for inhibiting ly6k and methods of using same
US20220194943A1 (en) Receptor tyrosine kinase inhibitors for treatment of protein kinase modulation-responsive disease or disorder
US20230210841A1 (en) Compounds for inhibiting ly6k and methods of using same
EP4313979A1 (en) Rnf4 targeting compounds and uses thereof