ES2879886T3 - Composiciones para el tratamiento de la fibrosis - Google Patents

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Moses Kasembeli
Marvin Xu
Sandeep Agarwal
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Abstract

Un compuesto para usar en un método de tratamiento, prevenir o reducir el riesgo o la gravedad de la fibrosis de la piel, corazón, intestino, páncreas, articulaciones, hígado, retroperitoneo o riñones en un individuo que lo necesite, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en N-(1',2-dihidroxi-1,2'-binaftalen-4'-il)-4- metoxibencensulfonamida, N-(3,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, N-(4,1'-dihidroxi- [1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, N-(5,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi- bencensulfonamida, N-(6,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, N-(7,1'-dihidroxi- [1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, N-(8,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4- metoxibencensulfonamida y 4-bromo-N-(1,6'-dihidroxi-[2,2']binaftalenil-4-il)-bencensulfonamida, o una mezcla o una sal de las mismas.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones para el tratamiento de la fibrosis
La presente invención se realizó con apoyo gubernamental en virtud de las P50 CA058183, K08 HL085018-01A2, P50 CA097007, R21 CA149783 y R41 CA153658 otorgadas por los National Institutes of Health. El gobierno de Estados Unidos tiene determinados derechos sobre la invención.
Campo técnico
La presente invención generalmente se refiere al menos a los campos de la biología celular, la biología molecular y la medicina.
Antecedentes de la invención
La fibrosis es un proceso patológico que implica la acumulación de un exceso de matriz extracelular en los tejidos, lo que da lugar a daños tisulares y una disfunción de los órganos, que puede progresar hasta una insuficiencia de los órganos y la muerte. En la esclerosis sistémica, una enfermedad de fibrosis idiopática, se postula que el factor desencadenante es una respuesta autoinmunitaria que da lugar a daños tisulares, a la producción de factores de crecimiento, de citocinas proinflamatorias y profibróticas, y a la acumulación de miofibroblastos. Dos fuentes potenciales de miofibroblastos son la diferenciación de los fibroblastos locales y el proceso de transición de epitelial a mesenquimatosa (EMT). La IL-6 es una citocina proinflamatoria y profibrótica cada vez más reconocida como un importante mediador de la fibrosis que puede contribuir a la acumulación de miofibroblastos. Después de interactuar con su receptor, la IL-6 señaliza a través de la STAT3. Para ser completamente activa, la STAT3 se fosforila en el Y705; se miden los niveles de pY705-STAT3 como un indicador del nivel de STAT3 activada.
La presente divulgación satisface una necesidad de la técnica de proporcionar novedosos compuestos para usar en métodos de tratamiento y/o prevención de la fibrosis de la piel, corazón, intestino, páncreas, articulaciones, hígado, retroperitoneo o riñones en los individuos.
Topal et al,; Rheumatol Int (2013) 33: 1-18 se refiere a la terapia de la esclerodermia y proporciona un análisis general de la parte clínica de las tendencias y la perspectiva.
Sumario de la invención
La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que esté fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines de información
Las realizaciones de la invención incluyen compuestos para el tratamiento, la prevención o la reducción del riesgo de fibrosis. En la invención, la fibrosis es una fibrosis de la piel, corazón, intestino, páncreas, articulaciones, hígado, retroperitoneo o riñones.
Las realizaciones de la invención incluyen compuestos para el tratamiento de la fibrosis en un individuo que se sabe que padece fibrosis, que es susceptible de padecer fibrosis o que está en riesgo de padecer fibrosis. Los pacientes con riesgo de fibrosis pueden ser aquellos que tienen enfermedades autoinmunitarias, tales como la esclerodermia o la esclerosis sistémica, aquellos expuestos a determinados fármacos, incluyendo la quimioterapia, aquellos expuestos a toxinas o alérgenos ambientales o de otro tipo, aquellos que hayan sufrido una lesión por isquemia/reperfusión tal como un infarto de miocardio o una hipotensión, y/o aquellos con fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis hepática idiopática, hepatitis inducida por el alcohol, toxinas, fármacos o infecciones, cirrosis hepática, cirrosis biliar primaria, infecciones víricas que afectan al corazón, el hígado o el pulmón, y fibrosis retroperitoneal idiopática. Los compuestos incluyen pequeñas moléculas, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el individuo está recibiendo una terapia adicional para la fibrosis. Un individuo que lo necesita es un individuo que tiene al menos un síntoma de fibrosis o que es susceptible a, o está en riesgo de, padecer fibrosis.
En algunos aspectos de los métodos divulgados en el presente documento, un individuo recibe más de una dosis de uno o más compuestos descritos en el presente documento o de derivados funcionales de los mismos. El esquema posológico puede incluir dosis separadas en el tiempo por horas, días, meses o años. La administración del compuesto de la invención puede producirse por cualquier vía adecuada, incluyendo sistémica o local, aunque en algunas realizaciones específicas, la vía de administración es oral, intravenosa, tópica, subcutánea, intraarterial, intraperitoneal, bucal, y así sucesivamente.
En algunas realizaciones de la invención, los compuestos de la invención son útiles para tratar y/o prevenir y/o reducir el riesgo o la gravedad de la fibrosis y, en algunos casos específicos, dicho tratamiento se produce inhibiendo la actividad de la Stat3 y/o de la Stat1, aunque en algunos aspectos el o los compuestos no inhiben la Stat3 o la Stat1 o ambas. En determinadas realizaciones, los compuestos inhiben la Stat3, pero no consiguen inhibir la Stat1. En algunas realizaciones, los compuestos de la invención interactúan con el dominio SH2 de la Stat3, inhiben competitivamente la unión de la Stat3 recombinante a su ligando peptídico con pY inmovilizado y/o inhiben la fosforilación de tirosina mediada por la IL-6 de la Stat3, por ejemplo. En realizaciones particulares, los compuestos de la invención cumplen los criterios del análisis de interacción (CIA): 1) puntuación de energía mínima global <-30; 2) formación de un puente salino y/o de una red de puentes de H dentro del sitio de unión al resto pY de la Stat3; y/o 3) formación de un puente de H con o bloqueando el acceso al hidrógeno de la amida del E638 de la Stat3, por ejemplo. En algunas realizaciones, el o los compuestos interactúan con una cavidad de unión hidrófoba con el dominio SH2 de la Stat3.
La presente invención proporciona un compuesto para usar en un método para tratar, prevenir o reducir el riesgo o la gravedad de la fibrosis de la piel, corazón, intestino, páncreas, articulaciones, hígado, retroperitoneo o los riñones en un individuo que lo necesite, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en N-(1',2-dihidroxi-1,2-binaftalen-4'-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(3,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, N-(4,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(5,1-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(6,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, N-(7,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, N-(8,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida y 4-bromo-N-(1,6'-dihidroxi-[2,2']binaftalenil-4-il)-bencensulfonamida, o una mezcla o una sal de las mismas.
En realizaciones específicas, el individuo no tiene cáncer y/o no se sospecha que tenga cáncer ni se le ha diagnosticado un cáncer.
Los compuestos para usar de la presente invención pueden ser para el tratamiento de mamíferos, incluyendo seres humanos, perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, ovejas y cabras, por ejemplo.
La fibrosis puede producirse externamente en el individuo, tal como en la piel, y/o la fibrosis puede producirse internamente en el individuo.
En algunas realizaciones de la invención, el o los compuestos son para usar en el tratamiento o la prevención de las cicatrices, tales como de una herida o una incisión quirúrgica, por ejemplo.
En algunos casos, los compuestos son para usar en métodos en los que el individuo recibe el compuesto en dosis múltiples, tal como en dosis múltiples separadas por horas, días o semanas. En realizaciones específicas, los compuestos son para usar en métodos en los que el individuo recibe una terapia adicional para la fibrosis. El compuesto puede inhibir la Stat3, la Statl o ambas, en realizaciones específicas. En aspectos particulares, los compuestos son para usar un método que comprende además la etapa de diagnosticar la fibrosis.
Los compuestos para usar de acuerdo con la invención pueden suministrarse por vía intravenosa, por vía intradérmica, por vía intraarterial, por vía intraperitoneal, por vía intralesional, por vía intracraneal, por vía intraarticular, por vía intraprostática, por vía intrapleural, por vía intratraqueal, por vía intranasal, por vía intravítrea, por vía intravaginal, por vía intrarrectal, por vía tópica, por vía intratumoral, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía subcutánea, por vía subconjuntival, por vía intravesicular, por vía mucosa, por vía intrapericárdica, por vía intraumbilical, por vía intraocular, por vía oral, por vía tópica, por vía local, por inyección, por infusión, por infusión continua, por perfusión localizada, mediante un catéter, mediante un lavado, en composiciones lipídicas, en composiciones de liposomas o como un aerosol. El compuesto para usar de acuerdo con la invención puede suministrarse por vía sistémica o local. En determinados casos, el individuo no padece cáncer. En determinados casos, no se sospecha que el individuo padezca cáncer. En realizaciones específicas, la fibrosis es esclerodermia.
Lo anterior ha esbozado de manera bastante amplia las características y ventajas técnicas de la presente invención para que la descripción detallada de la invención que sigue se pueda entender mejor. A continuación en el presente documento se describirán características y ventajas adicionales de la invención. Los expertos en la materia apreciarán que la concepción y las realizaciones específicas divulgadas pueden utilizarse fácilmente como una base para modificar o diseñar otras estructuras para llevar a cabo los mismos fines de la presente invención. Las características novedosas que se cree que son características de la invención, tanto en su organización como en su método de funcionamiento, junto con objetos y ventajas adicionales, se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción cuando se considere en relación con las figuras adjuntas. Debe entenderse expresamente, sin embargo, que cada una de las figuras se proporciona con fines ilustrativos y descriptivos únicamente y no pretende ser una definición de los límites de la presente invención.
Descripción de los dibujos
En la medida en que los dibujos se refieren a compuestos no definidos en las reivindicaciones, se proporcionan únicamente con fines de referencia
La FIG. 1 muestra la inhibición de la unión de la Stat3 al ligando fosfopeptídico inmovilizado por los compuestos. La unión de la Stat3 recombinante (500 nM) a un chip sensor de BiaCore recubierto con un fosfododecapéptido basado en la secuencia de aminoácidos que rodea al Y1068 dentro del EGFR se midió en tiempo real por RPS (unidades de respuesta) en ausencia (0 j M) o en presencia de concentraciones crecientes (de 0,1 a 1.000 j M) de Cpd3 (panel A), Cpd30 (panel B), Cpd188 (panel C), Cpd3-2 (panel D), Cpd3-7 (panel E) y Cpd30-12 (panel F).
Los datos mostrados son representativos de 2 o más experimentos. Los niveles de equilibrio de unión obtenidos en ausencia o presencia de compuestos se normalizaron (respuesta obtenida en presencia del compuesto la respuesta obtenida en ausencia del compuesto x 100) y se representaron gráficamente frente al logaritmo de la concentración (nM) de los compuestos (panel G). Los puntos experimentales se ajustan a una curva de unión competitiva que usa una ecuación logística de cuatro parámetros (véanse los ejemplos de métodos para más detalles). Estas curvas se usaron para calcular la CI50 (Tabla 1).
La FIG. 2 muestra la inhibición de la activación mediada por la IL-6 de la Stat3 por parte de los compuestos. Las células HepG2 se trataron previamente con DMSO solo o con DMSO que contenía Cpd3 (panel A), Cpd188 (panel B), Cpd30 (panel C), Cpd3-2 (panel D), Cpd3-7 (panel E) o Cpd30-12 (panel F) a la concentración indicada durante 60 min. Las células se estimularon después con IL-6 (30 ng/ml) durante 30 minutos. Los extractos de proteínas de las células se separaron por SDS-PAGE, se transfirieron y se desarrollaron en serie con anticuerpos contra la pStat3, la Stat3 total y la actina p. Las manchas se desprendieron entre cada investigación de anticuerpos. Las intensidades de las bandas de inmunotransferencia se cuantificaron por densitometría. El valor de la intensidad de cada banda de pStat3 se dividió por cada valor correspondiente de la intensidad total de la banda de la Stat3, y los resultados se normalizaron al valor de control tratado con DMSO y se representaron gráficamente en función del logaritmo de la concentración del compuesto. Las curvas con mejor ajuste se generaron tomando como base un modelo logístico de 4 parámetros/un sitio de respuesta a la dosis/XLfit 4.2, IDBS. Cada panel es representativo de 3 experimentos o más.
La FIG. 3 proporciona fórmulas químicas y nombres de los compuestos ilustrativos. Las fórmulas químicas y los nombres están indicados para Cpd3 (panel A), Cpd30 (panel B), Cpd188 (panel C), Cpd3-2 (panel D), Cpd3-7 (panel E) y Cpd30-12 (panel F).
La FIG. 4 muestra el efecto de los compuestos sobre la activación de la Statl. Las células HepG2 se trataron previamente con DMSO solo o con DMSO que contenía cada uno de los compuestos a una concentración de 300 |jM durante 60 min. Las células se estimularon después con IFN-y (30 ng/ml) durante 30 min. Los extractos de proteínas de las células se separaron por SDS-PAGE y se inmunotransfirieron en serie con anticuerpos contra la pStatl, la Statl total y la actina p. Las manchas se desprendieron entre cada inmunotransferencia. Los resultados mostrados son representativos de 2 experimentos o más.
La FIG. 5 proporciona comparaciones de las secuencias de los dominios SH2 de la Stat3 y la Statl, de las estructuras tridimensionales y de las energías de van der Waals de la unión del compuesto. La alineación de secuencias de los dominios SH2 de la Stat3 y la Stat1 se muestra en el panel A. Los restos que se unen al resto pY se resaltan y señalan con una flecha continua, el resto (E638) que se une al resto 3 se resalta y señala con una flecha discontinua y el Buclepc_pD y el BucleaB -ac, que comprenden el sitio de unión hidrófobo consistente, se resaltan y señalan con flechas discontinuas punteadas y discontinuas, respectivamente. El panel B muestra una superposición de un modelo de superficie de van der Waals de tubo y niebla del dominio SH2 de la Stat3 y un modelo de superficie de van der Waals de tubo y niebla del SH2 de la Statl. Los restos del dominio SH2 de la Stat3 que representan el Buclepc_pD se resaltan y se muestran con círculos discontinuos, y los restos que representan el BucleaB-ac se resaltan y se muestran con un círculo discontinuo punteado; los restos de bucle correspondientes dentro del dominio SH2 de la Stat1 se muestran en una niebla ligera que rodea los círculos. Esta superposición se muestra unida por el Cpd3-7, ya que se uniría al dominio SH2 de la Stat3. Se calculó la energía de van der Waals de cada compuesto unido al dominio SH2 de la Statl o al dominio SH2 de la Stat3, normalizada al valor de la Statl y representada en el panel C.
La FIG. 6 muestra un modelo informático de cada compuesto unido por el dominio SH2 de la Stat3. Se muestran los resultados del acoplamiento por ordenador al dominio SH2 de la Stat3 para Cpd3 (panel A), Cpd30 (panel B), Cpd188 (panel C), Cpd3-2 (panel D), Cpd3-7 (panel E) y Cpd30-12 (panel F). La imagen a la izquierda de cada panel muestra la unión del compuesto a un modelo de relleno espacial del dominio SH2 de la Stat3. El sitio de unión al resto pY está representado por un círculo discontinuo, el sitio de unión al resto 3 está representado por un círculo continuo, el bucle Buclepo_pD está representado por un círculo discontinuo y el bucle BucleaB-aC está representado por un círculo discontinuo punteado. Los restos R609 y K591 críticos para la unión a pY se muestran dentro de un círculo discontinuo, el resto E638 que se une el resto 3 se muestra dentro de un círculo continuo, y el sitio de unión hidrófobo que consiste en el BuclepC_pD y en el Bucle aB-aC se muestra dentro de un círculo discontinuo punteado y de un círculo discontinuo, respectivamente. La imagen en el lado derecho de cada panel es una vista más cercana de esta interacción con los puentes de hidrógeno indicados por líneas discontinuas. En la FIG. 6A, el resto de ácido benzoico cargado negativamente del Cpd3 tiene interacciones electrostáticas con el sitio de unión al resto pY con carga positiva que consiste principalmente en el grupo catión guanidinio de R609 y el grupo amonio básico de K591. El grupo ácido benzoico también forma una red de puentes de hidrógeno que consiste en dobles puentes de H entre el oxígeno carboxílico y el hidrógeno del amonio de R609 y el hidrógeno de la amida de E612. La formación de puentes de H también se produce entre el oxígeno del carbonilo del ácido benzoico y el hidrógeno hidroxílico de la cadena lateral de la Serina 611. Dentro del sitio de unión al resto 3, el átomo de oxígeno de la 1,4-benzodioxina forma un puente de hidrógeno con el hidrógeno de la amida de E638. Adicionalmente, la 2,3-dihidro-1,4-benzodioxina del Cpd3 interactúa con los bucles que forman el sitio de unión hidrófobo. En la FIG. 6B, el extremo carboxílico del resto de ácido benzoico del Cpd30, que está cargado negativamente en condiciones fisiológicas, forma un puente salino con el grupo guanidinio de R609 dentro del sitio de unión al resto pY. Dentro del sitio de unión al resto 3, el oxígeno del grupo tiazolidino forma un puente de H con el hidrógeno de la amida de la cadena principal peptídica de E638. Adicionalmente, el resto de tiazolidina se sumerge en el sitio de unión hidrófobo. En la FIG. 6C existe una interacción electrostática entre el resto (carboximetil) tio del Cpd188 que porta una carga negativa y el sitio de unión al resto pY, que consiste en R609 y K591, que porta carga positiva en condiciones fisiológicas. Existen puentes de H entre el oxígeno del hidroxilo del grupo (carboximetil) tio del Cpd188 y el hidrógeno del guanidinio de R609, entre el oxígeno del hidroxilo del grupo (carboximetil) tio y el hidrógeno de la amida de la cadena principal de E612, y entre el oxígeno del carboxilo del grupo (carboximetil) tio del Cpd188 y el hidrógeno del hidroxilo de S611. Dentro del sitio de unión al resto 3, existe un puente de H entre el oxígeno del hidroxilo del grupo ácido benzoico del Cpd188 y el hidrógeno de la amida de E638. Adicionalmente, el grupo ácido benzoico se extiende e interactúa con el sitio de unión hidrófobo. En la FIG.
6D, el grupo ácido benzoico del Cpd3-2 tiene interacciones electrostáticas significativas con la cavidad del sitio de unión al resto pY, aportado principalmente por R609 y K591, y forma dos puentes de H; el oxígeno carboxílico del grupo ácido benzoico se une al hidrógeno del guanidinio de R609, y el oxígeno del carbonilo del grupo ácido benzoico se une al hidrógeno del carbonilo de S611. Dentro del sitio de unión al resto 3, el oxígeno dentro del grupo 1,3-dihidro-2H-inden-2-ilideno forma un puente de H con el hidrógeno de la amida de la cadena principal de E638. Adicionalmente, el grupo 1,3-dihidro-2H-inden-2-ilideno se sumerge en el sitio de unión hidrófobo. En la FIG.
6E, se forman puentes de H entre el oxígeno del carbonilo del resto 4-benzoato de metilo del Cpd 3-7 y el guanidinio de la cadena lateral de R609, y entre el oxígeno del metoxi y el hidrógeno del extremo de amonio de K591. El grupo (2-metoxi-2-oxoetil)-4,8-dimetil-2-oxo-2H-cromeno del Cpd3-7 bloquea el acceso al hidrógeno de la amida de E638 dentro del sitio de unión al resto 3. Adicionalmente, este grupo se sumerge en el sitio de unión hidrófobo. En la FIG. 6F existen interacciones electrostáticas entre el grupo derivado del ácido benzoico del Cpd30-12 y R609 y 591 dentro del sitio de unión al resto pY. También se forman puentes de H entre el oxígeno del hidroxilo del Cpd30-12 y el hidrógeno del guanidinio de R609, entre el oxígeno del carboxilo del Cpd30-12 y el hidrógeno del hidroxilo de S611, y entre el grupo furilo del Cpd30-12 y el hidrógeno del amonio de K591. Los grupos 1,3-dietil-4,6-dioxo-2-tioxotetrahidro-5(2H)-pirimidinilideno bloquean el acceso al sitio de unión del resto 3; sin embargo, se extiende hacia el surco entre el sitio de unión al resto pY y el Bucle pC-pD, evitando el sitio de unión hidrófobo.
La FIG. 7 muestra la inhibición de la translocación de citoplásmica a nuclear de la Stat3 evaluada por microscopia de fluorescencia confocal y de alto rendimiento. En el panel A, las células MEF/GFP-Stat3 cultivadas en cubreobjetos se trataron previamente con DMSO que contenía (fila cuatro) o no contenía (fila tres) Cpd3 (300 j M) durante 60 minutos antes de estimularse sin (fila uno) o con IL-6 ( 200 ng/ml) e IL-6sR (250 ng/ml) durante 30 minutos (filas dos, tres y cuatro). Los cubreobjetos se examinaron mediante microscopia de fluorescencia confocal usando filtros para detectar la GFP (columna uno), el DAPI (columna dos) o ambos (combinación; columna tres). En el panel B, las células MEF-GFP-Stat3 se cultivaron en placas de 96 pocillos con fondos de vidrio óptico y se trataron previamente con el compuesto indicado a las concentraciones indicadas por cuadruplicado durante 1 hora y después se estimularon con IL-6 (200 ng/ml) e IL-6sR (250 ng/ml) durante 30 minutos. Se fijaron las células y se examinaron las placas mediante microscopia de alto rendimiento para determinar la intensidad de fluorescencia en el núcleo (FLIN) y se calculó el % de a Fl INméx como se describe en el Ejemplo 1. Los datos mostrados son la media ± DE y son representativos de 2 estudios o más. Las curvas con mejor ajuste se generaron tomando como base un modelo logístico de 4 parámetros/un sitio de respuesta a la dosis/XLfit 4.2, IDBS y se usaron para calcular la CI50 (Tabla 1).
La FIG. 8 muestra la inhibición de la unión al ADN de la Stat3 por parte de los compuestos. Los ensayos del cambio en la movilidad electroforética se realizaron usando extractos de células completas preparados a partir de células HepG2 sin y con estimulación con IL-6 (30 ng/ml) durante 30 min. La proteína (20 jg ) se incubó con oligonucleótido de doble hélice radiomarcado (hSIE) y DMSO sin o con los compuestos indicados (300 j M) durante 60 minutos a 37 °C y después se separó por PAGE. El gel se secó y se autorradiografió; se muestra la porción del gel correspondiente a la banda de hSIE unido a la Stat3. Los datos mostrados son representativos de 2 estudios.
La FIG. 9 muestra los Cpd3, Cpd30 y Cpd188 y la hidrofobia o hidrofilia de la superficie de la molécula. Las flechas discontinuas apuntan a superficies hidrófilas y las flechas continuas apuntan a superficies hidrófobas.
La FIG. 10 ilustra el compuesto ilustrativo 3 (Cpd3). La imagen superior izquierda de la FIG. 11 muestra el Cpd3 acoplado a la Stat3 y la interacción entre el Cpd3 y la superficie de la proteína, y derivados del Cpd3 que pueden encajar en la superficie de la proteína. Las estrellas representan átomos y grupos químicos que pueden reemplazarse por otros átomos o grupos químicos para crear uno o más derivados funcionales. Las superficies hidrófobas/hidrófilas del Cpd3 también se muestran en la imagen superior derecha. Las flechas discontinuas apuntan a superficies hidrófilas y las flechas continuas apuntan a superficies hidrófobas. R1 y R2 podrían ser idénticos o diferentes y pueden comprender hidrógeno, carbono, azufre, nitrógeno, oxígeno, alcanos, alcanos cíclicos, derivados basados en alcanos, alquenos, alquenos cíclicos, derivados basados en alquenos, alquinos, derivados basados en alquinos, cetonas, derivados basados en cetonas, aldehídos, derivados basado en aldehídos, ácidos carboxílicos, derivados basados en ácidos carboxílicos, éteres, derivados basados en éteres, ésteres y derivados basados en ésteres, aminas, derivados basados en aminas, amidas, derivados basados en amidas, arenos monocíclicos o policíclicos, heteroarenos, derivados basados en arenos, derivados basados en heteroarenos, fenoles, derivados basados en fenoles, ácido benzoico o derivados basados en ácido benzoico.
La FIG. 11 ilustra el compuesto ilustrativo 30 (Cpd30). La imagen superior izquierda de la FIG. 12 muestra el Cpd30 acoplado a la Stat3 y la interacción entre el Cpd30 y la superficie de la proteína, y derivados del Cpd30 que encajan en la superficie de la proteína. Las estrellas representan átomos y grupos químicos que pueden reemplazarse por otros átomos o grupos químicos para crear uno o más derivados funcionales. Las superficies hidrófobas/hidrófilas del Cpd30 también se muestran en la imagen superior derecha. Las flechas discontinuas apuntan a superficies hidrófilas y las flechas continuas apuntan a superficies hidrófobas. La estructura bidimensional del Cpd30 se muestra en la imagen inferior, R1, R2 R3 y R4 podrían ser idénticos o diferentes y pueden comprender hidrógeno, carbono, azufre, nitrógeno, oxígeno, alcanos, alcanos cíclicos, derivados basados en alcanos, alquenos, alquenos cíclicos, derivados basados en alquenos, alquinos, derivados basados en alquinos, cetonas, derivados basados en cetonas, aldehídos, derivados basado en aldehídos, ácidos carboxílicos, derivados basados en ácidos carboxílicos, éteres, derivados basados en éteres, ésteres y derivados basados en ésteres, aminas, derivados basados en aminas, amidas, derivados basados en amidas, arenos monocíclicos o policíclicos, heteroarenos, derivados basados en arenos, derivados basados en heteroarenos, fenoles, derivados basados en fenoles, ácido benzoico, o derivados basados en ácido benzoico.
La FIG. 12 ilustra el compuesto ilustrativo 188 (Cpd188). La imagen superior izquierda de la FIG. 12 muestra el Cpd188 acoplado al dominio SH2 de la Stat3 y la interacción entre el Cpd188 y la superficie de la proteína, y derivados del Cpd188 que encajan en la superficie de la proteína. Las estrellas representan átomos y grupos químicos que pueden reemplazarse por otros átomos o grupos químicos para crear uno o más derivados funcionales. Las superficies hidrófobas/hidrófilas del Cpd188 también se muestran en la imagen izquierda en la parte inferior. Las flechas discontinuas apuntan a superficies hidrófilas y las flechas continuas apuntan a superficies hidrófobas. En la imagen inferior derecha se muestran, R1 y R2 podrían ser idénticos o diferentes y pueden comprender hidrógeno, carbono, azufre, nitrógeno, oxígeno, alcanos, alcanos cíclicos, derivados basados en alcanos, alquenos, alquenos cíclicos, derivados basados en alquenos, alquinos, derivados basados en alquinos, cetonas, derivados basados en cetonas, aldehídos, derivados basado en aldehídos, ácidos carboxílicos, derivados basados en ácidos carboxílicos, éteres, derivados basados en éteres, ésteres y derivados basados en ésteres, aminas, derivados basados en aminas, amidas, derivados basados en amidas, arenos monocíclicos o policíclicos, heteroarenos, derivados basados en arenos, derivados basados en heteroarenos, fenoles, derivados basados en fenoles, ácido benzoico o derivados basados en ácido benzoico.
La FIG. 13 ilustra diagramas esquemáticos de la Stat1 y la Stat3.
La FIG. 14 muestra que la CI50 de RPS de las sondas químicas de la Stat3 de 2a generación se correlaciona inversamente con la puntuación del farmacóforo tridimensional.
La FIG. 15. muestra la CI50 de RPS y la CE50 de la apoptosis en la LMA del Cpd188 precursor y dos sondas químicas de la Stat3 de tipo 188 de 2a generación.
La FIG. 16 proporciona una ilustración de las relaciones de estructura-actividad de 38 sondas de la Stat3 de tipo Cpd188 de 2a generación.
La FIG. 17 muestra un esquema de modificación ilustrativo para el desarrollo de la sonda de la Stat3 de 3a generación usando el Cpd188-15 como armazón.
La FIG. 18 proporciona una ilustración de la superficie electrostática del dominio SH2 de la Stat3 (área positiva en azul, neutra en blanco y negativa en rojo en una figura en color) y 20 posiciones de acoplamiento de 5 (R = CH2PO32-), que muestra interacciones fuertes entre los grupos fosfonato (en morado y rojo) y K591/R609.
La FIG. 19 muestra el aumento de la activación de la STAT-3 en un modelo de fibrosis cutánea.
La FIG. 20 ilustra la generación de un modelo subcutáneo ilustrativo de bleomicina de fibrosis cutánea y estudios ilustrativos de inhibición de la STAT3.
La FIG. 21 muestra que la inhibición de la STAT-3 está asociada a una disminución de la fibrosis (tinción con hematoxilina y eosina).
La FIG. 22 muestra la cuantificación de que la inhibición de la STAT-3 da lugar a una disminución de la fibrosis (espesor dérmico).
La FIG. 23 ilustra que la inhibición de la STAT-3 está asociada a una disminución de la fibrosis, usando la tinción tricrómica de Masson como indicador.
La FIG. 24 muestra que la inhibición de la STAT-3 está asociada a una disminución de la fibrosis, tomando como base la tinción de la actina de músculo liso alfa.
La FIG. 25 muestra el efecto del C188-9 sobre la producción de fibroblastos dérmicos de colágeno de tipo I (C o lla l), la actina del músculo liso (aSMA) y el factor de transcripción Snail.
La FIG. 26 muestra la cuantificación de los efectos antifibróticos del C188-9 en un modelo de fibrosis cutánea por bleomicina. Se usó una RT-PCR para evaluar la expresión de genes fibróticos que aumentó con la bleomicina pero se atenuó con el tratamiento con C188-9.
Descripción detallada de la invención
Otros objetos, características y ventajas de la presente divulgación serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.
La presente invención proporciona un compuesto para usar en un método para prevenir, tratar o reducir el riesgo o la gravedad de la fibrosis de la piel, corazón, intestino, páncreas, articulaciones, hígado, retroperitoneo o los riñones en un individuo que lo necesite, en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en N-(1',2-dihidroxi-1,2'-binaftalen-4'-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(3,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, N-(4,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, -N-(5,1-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxibencensulfonamida, -N-(6,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, N-(7,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, N-(8,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida y 4-bromo-N-(1,6'-dihidroxi-[2,2']binaftalenil-4-il)-bencensulfonamida, o una mezcla o una sal de las mismas.
En una realización específica de la invención, el compuesto para usar de acuerdo con la invención se administra in vivo en un mamífero. En otra realización, el mamífero es un ser humano. En otra realización específica, se sabe que el ser humano tiene fibrosis, se sospecha que padece fibrosis o está en riesgo de desarrollar fibrosis. En otra realización, se sabe que el ser humano padece fibrosis y está recibiendo una terapia adicional para la fibrosis y/o una afección subyacente que está relacionada con la fibrosis.
I. Definiciones
Como se usa en el presente documento, en la memoria descriptiva, "un/a" o "uno/una" puede significar uno/una o más. Como se usa en el presente documento en la o las reivindicaciones, cuando se usan junto con la expresión "que comprende", las palabras "un/a" o "uno/una" pueden significar uno/una o más de uno/una. Como se usa en el presente documento, "otro/a" puede significar al menos un/a segundo/a o más. Aún además, las expresiones "que tiene/n", "que incluye/n", "que contiene/n" y "que comprende/n" se usan indistintamente y un experto en la materia es consciente de que estos términos son términos abiertos. Algunas realizaciones de la invención pueden consistir o consisten esencialmente en uno o más elementos, etapas del método y/o métodos de la invención. Se contempla que cualquier método o composición descritos en el presente documento puedan implementarse con respecto a cualquier otro método o composición descritos en el presente documento.
El término "inhibidor" como se usa en el presente documento se refiere a una o más moléculas que interfieren al menos en parte con la actividad de la Stat3 para realizar una o más actividades, incluyendo la capacidad de la Stat3 para unirse a una molécula y/o la capacidad de ser fosforilada.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en el presente documento significa aquella cantidad de un compuesto, material o composición que comprende un compuesto de la presente invención que es eficaz para producir algún efecto terapéutico deseado, por ejemplo, tratar (es decir, prevenir y/o mejorar) el cáncer en un sujeto, o inhibir las interacciones proteína-proteína mediadas por un dominio SH2 en un sujeto, con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. En una realización, la cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para reducir o eliminar al menos un síntoma. Un experto en la materia reconoce que una cantidad puede considerarse terapéuticamente eficaz incluso si el cáncer no se erradica totalmente, pero se mejora parcialmente. Por ejemplo, la diseminación del cáncer puede detenerse o reducirse, un efecto secundario del cáncer puede reducirse parcialmente o eliminarse completamente, la esperanza de vida del sujeto puede aumentar, el sujeto puede experimentar menos dolor, y así sucesivamente.
En el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance de un criterio médico razonable, adecuados para usar en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin producir una excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, en proporción a una relación beneficio/riesgo razonable.
La expresión "en riesgo de padecer fibrosis" se usa en el presente documento para referirse a los individuos que tienen posibilidades de padecer fibrosis debido a factores pasados, presentes o futuros.
Como se usa en el presente documento, la "afinidad de unión" se refiere a la fuerza de una interacción entre dos entidades, tal como una interacción proteína-proteína. La afinidad de unión a veces se denomina Ka , o constante de asociación, que describe la probabilidad de que las dos entidades separadas estén en el estado unido. Generalmente, la constante de asociación se determina mediante una variedad de métodos en los que dos entidades separadas se mezclan entre sí, la porción no unida se separa de la porción unida y se miden las concentraciones de las no unidas y las unidas. Un experto en la materia se da cuenta de que existe una variedad de métodos para medir constantes de asociación. Por ejemplo, las porciones de no unidas y de unidas pueden separarse entre sí mediante adsorción, precipitación, filtración en gel, diálisis o centrifugación, por ejemplo. La medición de las concentraciones de las porciones unidas y no unidas se puede conseguir, por ejemplo, midiendo la radiactividad o la fluorescencia, por ejemplo. la Ka también se puede inferir indirectamente a través de la determinación de la Ki o constante de inhibición. La determinación de la Ki puede realizarse de varias formas, por ejemplo, midiendo la Ka de la unión de STAT3 a su ligando fosfopeptídico dentro del EGFR en la posición Y1068, y midiendo la concentración de una molécula que reduce la unión de la STAT3 en un 50 %. En determinadas realizaciones de la invención, la afinidad de unión de un inhibidor de la Stat3 por el dominio SH2 de la Stat3 es similar a, o mayor que, la afinidad de los compuestos enumerados en el presente documento.
El término "dominio" como se usa en el presente documento se refiere a una subsección de un polipéptido que posee una característica estructural y/o funcional única; normalmente, esta característica es similar en diversos polipéptidos. La subsección comprende normalmente aminoácidos contiguos, aunque también puede comprender aminoácidos que actúan en conjunto o que están muy cerca debido al plegamiento u otras configuraciones. Un ejemplo de un dominio de proteína es el dominio de homología Src 2 (SH2) de la Stat3. La expresión "dominio SH2" está reconocida en la técnica y, como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio de proteína implicado en interacciones proteína-proteína, tal como un dominio dentro de la tirosina cinasa Src que regula la actividad cinasa. La invención contempla la modulación de la actividad, tal como la actividad que depende de las interacciones proteína-proteína, mediada por dominios SH2 de proteínas (por ejemplo, tirosina cinasas tales como Src) o proteínas implicadas en la transmisión de una señal de tirosina cinasa en organismos que incluyen mamíferos, tales como seres humanos.
Como se usa en el presente documento, un "mamífero" es un sujeto apropiado para el método de la presente invención. Un mamífero puede ser cualquier miembro de la clase superior de vertebrados Mammalia, que incluye a los seres humanos; caracterizados por recién nacidos vivos, vello corporal y glándulas mamarias en la hembra que segregan leche para alimentar a las crías. Adicionalmente, los mamíferos se caracterizan por su capacidad para mantener una temperatura corporal constante a pesar de las condiciones climáticas cambiantes. Algunos ejemplos de mamíferos son los seres humanos, gatos, perros, vacas, ratones, ratas y chimpancés. Los mamíferos pueden denominarse "pacientes" o "sujetos" o "individuos".
II. Realizaciones generales
Las realizaciones generales incluyen uno o más compuestos para el tratamiento y/o la prevención de la fibrosis. También se divulgan métodos de uso. La fibrosis puede tener una causa desconocida o puede estar asociada a una afección subyacente. La afección subyacente puede ser una afección catabólica. La afección subyacente puede ser autoinmunitaria, una intoxicación química, una infección vírica, y así sucesivamente.
En algunos casos se sospecha que un individuo padece fibrosis; esta sospecha puede deberse a que el individuo presenta cambios respecto a lo normal en las características y la función de la piel, pulmón, corazón, hígado y riñones. En determinados aspectos, esta sospecha puede deberse a que el individuo tiene la piel tensa, disnea de esfuerzo, tos, amarilleamiento de la esclerótica o de la piel y/o reducción de la producción de orina. En algunos casos, un individuo puede tener al menos un síntoma de fibrosis, pero también puede tener otros síntomas.
En determinados casos, un individuo está en riesgo de padecer fibrosis. En dichos casos, el individuo tiene una afección médica que puede estar asociada con la fibrosis y no ha tenido suficiente progresión de la afección médica para manifestar la fibrosis o todavía no ha tenido un síntoma detectable de fibrosis.
En algunas realizaciones, se sabe que el individuo padece una afección subyacente que suele presentar la fibrosis como al menos un síntoma, y ese individuo puede o no haber mostrado otros síntomas o signos de padecer fibrosis. En los casos en donde un individuo tiene una afección subyacente que a menudo tiene la fibrosis como al menos un síntoma, el individuo puede recibir una cantidad eficaz de uno o más compuestos de la invención antes y/o después de la aparición de la fibrosis. Cuando el individuo recibe uno o más compuestos antes de la aparición de la fibrosis, el inicio de la fibrosis puede retrasarse o inhibirse por completo y/o puede reducirse la gravedad de la fibrosis, en comparación con la afección del individuo sin haber recibido el o los compuestos, por ejemplo.
En realizaciones particulares, a un individuo se le ha diagnosticado una afección subyacente conocida por presentar fibrosis como al menos un síntoma, y los métodos divulgados en el presente documento pueden incluir etapas de diagnóstico de la fibrosis y/o de la afección subyacente del individuo. Un individuo puede someterse a prueba de fibrosis por medios convencionales en la técnica.
La fibrosis puede producirse como respuesta a, o como parte de, enfermedades autoinmunitarias tales como esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico o enfermedad mixta del tejido conectivo, por ejemplo. La fibrosis del hígado puede producirse como respuesta a una enfermedad hepática crónica por infecciones víricas, infecciones parasitarias y toxinas (tales como el alcohol), por ejemplo.
Las realizaciones se refieren a inhibidores de la STAT3, ya que están relacionados con los mecanismos biológicos asociados a la fibrosis. Para evaluar si la STAT3 contribuye al desarrollo de la fibrosis tisular en el pulmón y la piel, y si lo hace en parte a través de la modulación de la EMT, se examinó el tejido fibrótico de pacientes con esclerosis sistémica, de pacientes con fibrosis pulmonar idiopática, y modelos de ratón de fibrosis pulmonar y cutánea. Los tejidos se evaluaron mediante inmunohistología usando un anticuerpo monoclonal contra el epítopo pY705 dentro de la STAT3. Los hallazgos mostraron que los niveles de pY705-STAT3 estaban aumentados en el tejido fibrótico de pacientes con esclerosis sistémica, de pacientes con fibrosis pulmonar idiopática, y modelos de ratón de fibrosis pulmonar y cutánea.
Se determinó además que la señalización de la STAT3 contribuía al desarrollo de la fibrosis usando un ejemplo de una pequeña molécula inhibidora de la STAT-3. Se administró N-(1',2-dihidroxM,2'-binaftalen-4'-il)-4-metoxibencensulfonamida (denominada también en el presente documento C188-9) a ratones tanto del modelo de ratón de fibrosis pulmonar por bleomicina intraperitoneal (IP) como del modelo de ratón de fibrosis cutánea por bleomicina subcutánea (SC). La administración de C-188-9 redujo los criterios de valoración fibróticos (deposición de colágeno por Sircol), la expresión de la actina del músculo liso alfa (SMA) y mejoró la saturación arterial de oxígeno en el modelo de fibrosis pulmonar por bleomicina IP. El C-188-9 también disminuyó el desarrollo de fibrosis dérmica en el modelo de bleomicina SC, evaluado por la disminución del espesor dérmico, una reducción de la acumulación de alfa-SMA y una disminución de la deposición de colágeno.
El papel de la STAT3 en la EMT y en la diferenciación de los miofibroblastos se determinó usando el C188-9 en experimentos de cultivo tisular con células epiteliales alveolares (AEC; MLE-12 y AEC primarias) y fibroblastos pulmonares murinos. Los estudios in vitro mostraron que el TGF-beta o la trans-señalización de la IL-6 (IL-6/sIL-6R-alfa) fueron capaces de inducir la EMT en la línea celular primaria AEC y MLE-12, así como la diferenciación de los fibroblastos en miofibroblastos. El C188-9 impidió la EMT inducida por el TGF-beta y la IL-6/sIL-6R-alfa de las AEC, evaluada por los niveles de ARNm de Col1a, alfa-SMA, Twist y Snail, y redujo la diferenciación de los miofibroblastos, evaluada por los niveles de ARNm de Col1a y alfa-SMA. Por lo tanto, los hallazgos mostraron que la STAT3 contribuye al desarrollo de la fibrosis tisular en la piel y el pulmón y desempeña un papel en el desarrollo de los miofibroblastos in vitro. Adicionalmente, los datos indican que la STAT3 es una diana terapéutica útil en el tratamiento de la fibrosis dérmica y pulmonar, así como la fibrosis de cualquier otro tejido.
III. Fibrosis
Las realizaciones de la invención se refieren a compuestos para usar en métodos de tratamiento y/o prevención de la fibrosis de la piel, corazón, intestino, páncreas, articulaciones, hígado, retroperitoneo o riñones. La fibrosis incluye la formación de un exceso de tejido conectivo fibroso en un proceso reparador o reactivo, tal como en un órgano o un tejido. El establecimiento de la fibrosis puede ser un estado reactivo, benigno o patológico. En los casos de lesión, la fibrosis puede denominarse cicatrización. En realizaciones particulares, la fibrosis está relacionada con la sobreproducción de la proteína colágeno. La fibrosis puede estar relacionada con la acumulación excesiva de proteínas de la matriz extracelular (ECM). La fibrosis puede estar relacionada con la acumulación de miofibroblastos.
En realizaciones fisiológicas, la fibrosis engloba la deposición de tejido conectivo que puede afectar gravemente a la estructura y/o la función del órgano y/o el tejido afectado. En determinados aspectos, la fibrosis es el estado patológico de deposición excesiva de tejido fibroso y/o el estado de deposición indeseable de tejido conectivo en la cicatrización que no es necesariamente patológico.
Algunos tipos específicos de fibrosis que pueden tratarse y/o prevenirse en la presente invención incluyen al menos cirrosis hepática, fibrosis endomiocárdica, infarto de miocardio, fibrosis auricular, fibrosis del mediastino, fibrosis retroperitoneal, fibrosis masiva progresiva, fibrosis sistémica nefrógena, enfermedad de Crohn, queloides, esclerodermia/esclerosis sistémica, artrofibrosis, capsulitis adhesiva, fibrosis tras la exposición a determinados fármacos, tales como la quimioterapia, fibrosis tras la exposición a toxinas o alérgenos ambientales o de otro tipo, fibrosis que se produce después de una lesión por isquemia/reperfusión, tal como un infarto de miocardio o por hipotensión, fibrosis que se produce después de una radiación, fibrosis tras una hepatitis inducida por el alcohol, toxinas, fármacos o infecciones, cirrosis biliar primaria, fibrosis tras infecciones víricas que afectan al corazón o al hígado, y/o fibrosis retroperitoneal idiopática.
En algunas realizaciones de la invención, la fibrosis es fibrosis cutánea (que también puede denominarse fibrosis dérmica), que puede ser o no parte de la esclerodermia. El diagnóstico de la fibrosis cutánea puede incluir el examen por parte de un profesional sanitario y puede incluir una biopsia. El artesano experto reconoce que la fibrosis puede ser evaluada, en determinados entornos (incluyendo los de investigación) de una o varias maneras, incluyendo al menos la tinción de tejidos (tal como la tinción con hematoxilina y eosina (H&E), la tinción de tricrómica de Masson (matriz extracelular (ECM, colágeno)) o Sircol (para el colágeno); una inmunohistoquímica; un análisis por inmunoelectrotransferencia; y/o un análisis de ácidos nucleicos, por ejemplo. Algunos medios ilustrativos de análisis de ácidos nucleicos incluyen un análisis de expresión, tal como el uso de la PCR (como la QRT-PCR); algunos ejemplos de genes para el análisis por PCR incluyen al menos a-SMA (actina alfa de músculo liso) y colágeno, de tipo 1, alfa 1 (Colla).
En realizaciones particulares y en determinados entornos (tales como la investigación), se puede analizar la fibrosis o la sospecha de fibrosis mediante una histología usando H&E y el tricrómico de Masson, y se pueden cuantificar determinadas mediciones mediante el espesor dérmico.
En realizaciones particulares y en determinados entornos (tales como el clínico), se puede analizar la fibrosis o la sospecha de la misma. El análisis puede incluir un examen físico. Por ejemplo, los pacientes con esclerodermia tienen la piel tensa y fibrótica que comienza en los dedos y trepa hacia la parte proximal (en algunos pacientes los envuelve totalmente - esclerosis sistémica difusa/esclerodermia; mientras que en otros permanece distal hasta los codos -esclerosis sistémica limitada/esclerodermia). El diagnóstico puede confirmarse mediante una histología/biopsia cutánea.
En algunas realizaciones, la fibrosis de la piel puede ser parte de esclerodactilia, esclerodermia, amiloidosis, contractura de Dupuytren, enfermedad de Peyronie, polimiositis, tumor carcinoide o la enfermedad del injerto contra el hospedador, por ejemplo. Las causas de la fibrosis cutánea pueden ser de cualquier tipo, tal como desconocido, ainhum, amiloidosis, atrofodermia de Pasini y Pierini, tumores carcinoides y síndrome carcinoide, contractura de Dupuytren, fascitis eosinófila, enfermedad del injerto contra el hospedador, síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford, liquen mixedematoso, enfermedad mixta del tejido conectivo, morfea, fibrosis sistémica nefrógena, enfermedad de Peyronie, polimiositis, porfiria cutánea tardía de tipo 1 (esporádica), escleredema o esclerosis sistémica.
Un individuo puede estar en riesgo de padecer fibrosis cutánea debido a sus antecedentes familiares o a la exposición a circunstancias o condiciones que lo hacen propenso a la fibrosis, tales como radioterapia o cirugía.
Otro tipo de fibrosis que se puede tratar, prevenir o tener el riesgo reducido es la fibrosis quística (CF). La CF incluye la formación de cicatrices y quistes en el páncreas y también puede afectar a los pulmones, hígado e intestino. Algunos síntomas incluyen dificultad para respirar, infección pulmonar frecuente, infecciones de los senos, crecimiento deficiente, infecundidad, acumulación de mucosidad espesa y pegajosa, y piel salada. Un individuo puede estar en riesgo de padecer CF si existen antecedentes familiares, por ejemplo. El tratamiento de los síntomas de la fibrosis quística incluye antibióticos intravenosos, inhalados y orales; trasplantes; medicamentos y/o técnicas mecánicas para liberar y expectorar el esputo, y así sucesivamente. El o los compuestos de la invención pueden utilizarse junto con dicho o dichos regímenes de tratamiento.
La fibrosis del hígado puede producirse como respuesta a una enfermedad hepática crónica por infecciones víricas, infecciones parasitarias y toxinas (tales como el alcohol).
La fibrosis renal puede producirse por enfermedades renales crónicas, hipertensión, diabetes y enfermedades autoinmunitarias, por ejemplo.
IV. Composiciones
Las realizaciones de la invención engloban compuestos para tratar, prevenir y/o reducir el riesgo o la gravedad de la fibrosis. Los compuestos específicos para usar en la presente invención se definen en las reivindicaciones. Los derivados funcionales de dichos compuestos también se divulgan en el presente documento. El término "derivado", tal como se usa en el presente documento, es un compuesto que se forma a partir de un compuesto similar o un compuesto que puede considerarse que surge a partir de otro compuesto, si se sustituye un átomo por otro átomo o grupo de átomos. El derivado también puede referirse a los compuestos que, al menos teóricamente, pueden formarse a partir del compuesto precursor.
En realizaciones particulares, los compuestos como se describen en el presente documento son para usar en el tratamiento y/o la prevención de la fibrosis.
La expresión "derivado funcionalmente activo" o "derivado funcional" es un derivado, tal como se ha definido anteriormente, que conserva la función del compuesto del que deriva. Como se divulga en el presente documento, un derivado de un compuesto como se define en las reivindicaciones conserva la actividad inhibidora de la Stat3.
Los compuestos para usar en la presente invención pueden obtenerse por cualquier medio adecuado. En realizaciones específicas, los derivados de la invención se proporcionan comercialmente.
V. Realizaciones para el direccionamiento a la Stat3
Las proteínas STAT, de las cuales existen siete (1, 2, 3, 4, 5A, 5B y 6), transmiten señales de hormonas peptídicas desde la superficie celular al núcleo. La información estructural detallada de las proteínas STAT actualmente está limitada a la Stat1 y la Stat3. La Stat1 fue la primera STAT que se descubrió (Fu et al., 1992) y es necesaria para la señalización de los IFN de tipo I y II (Meraz et al., 1996; Wiederkehr-Adam et al., 2003; Durbin et al., 1996; Haan et al., 1999). Los estudios en ratones deficientes en Stat1 (Meraz et al., 1996; Durbin et al., 1996; Ryan et al., 1998) apoyan un papel esencial para la Statl en la inmunidad innata, especialmente contra patógenos víricos. Adicionalmente, la Stat1 es un potente inhibidor del crecimiento y un promotor de la apoptosis (Bromberg y Darnell, 2000). También, debido a que los tumores de animales naturales tratados con un carcinógeno crecen más rápidamente cuando se trasplantan en animales deficientes en Stat1 que en un hospedador natural, la Stat1 contribuye a la vigilancia del tumor (Kaplan et al., 1998).
La Stat3 se denominó originalmente factor de respuesta de fase aguda (APRF) porque se identificó por primera vez como un factor de transcripción que se unía a elementos de respuesta a la IL-6 dentro de la región potenciadorapromotora de varios genes de proteínas de fase aguda (Akira, 1997). Además de los receptores para la familia de las citocinas IL-6, otras vías de señalización están vinculadas a la activación de la Stat3 incluyen receptores para otros receptores de citocinas de tipo I y tipo II, tirosina cinasas receptoras, receptores acoplados a proteínas G y cinasas Src (Schindler y Darnell, 1995; Turkson et al., 1998). La alteración dirigida del gen Stat3 de ratón conduce a una mortalidad embrionaria a los 6,5 a 7,5 días (Takeda et al., 1997), lo que indica que la Stat3 es esencial para el desarrollo embrionario temprano, posiblemente la gastrulación o la función del endodermo visceral (Akira, 2000). La eliminación específica de tejidos de la Stat3 usando la tecnología Cre-lox ha revelado una disminución de la apoptosis de las células epiteliales mamarias que da como resultado una involución mamaria retrasada durante el destete (Chapman et al., 1999). Hallazgos recientes indican que el cambio de la proteína STAT predominante activada por un receptor dado puede producirse cuando se elimina genéticamente una STAT cadena abajo de ese receptor (Costa-Pereira et al., 2002; Qing y Stark, 2004). Estos hallazgos sugieren la posibilidad de que el efecto de la eliminación de la Stat3 en el tejido mamario pueda estar mediado indirectamente por un aumento en la activación de otras proteínas STAT, especialmente la Stat5.
Isoformas de la Stat1 y de la Stat3. Se han identificado dos isoformas de la Stat1 y de la Stat3: a (p91 y p92, respectivamente) y p (p84 y p83, respectivamente) (Schindler et al., 1992; Schaefer et al., 1995; Caldenhoven et al., 1996; Chakraborty et al., 1996) - que surgen debido al empalme de ARNm alternativo (FIG. 13). A diferencia de la Stat1p (712 aa), en la que la transactivación en el extremo carboxílico simplemente se elimina, los 55 restos de aminoácidos de la Stat3a se reemplazan en la Stat3 p por 7 restos de aminoácidos únicos en su extremo carboxílico. A diferencia de la Stat1 p, la Stat3 p no es simplemente un negativo dominante de la Stat3a (Maritano et al., 2004) y regula las dianas génicas de una manera distinta a la de la Stat3 p (Maritano et al., 2004; Yoo et al., 2002). Se ha demostrado que la Stat3a contribuye a la transformación en modelos celulares y muchos cánceres humanos, incluyendo el cáncer de mama. Se demostró que la Stat3a se activa constitutivamente en fibroblastos transformados por oncoproteínas tales como v-Src (Yu et al., 1995; García y Jove, 1998) y que es esencial para la transformación mediada por la v-Src (Turkson et al., 1998; Costa-Pereira et al., 2002). A diferencia de la Stat3a, la Stat3p antagonizó la transformación de la v-Src mediada por la Stat3a (Turkson et al., 1998). La sobreexpresión de una forma constitutivamente activa de la Stat3a en fibroblastos de rata o ratón inmortalizados indujo su transformación y les confirió la capacidad de formar tumores en ratones atímicos (Bromberg et al., 1999). Se ha demostrado que la Stat3 está activada constitutivamente en una variedad de tumores hematológicos y sólidos, incluyendo el cáncer de mama (Dong et al., 2003; Redell y Tweardy, 2003) como resultado de la producción autocrina del factor de crecimiento o la desregulación de las proteínas tirosina cinasas. En prácticamente todos los casos, la isoforma que muestra una mayor actividad es la Stat3a.
Direccionamiento a la Stat3a evitando la Stat1. Dados sus múltiples papeles contribuyentes a la oncogénesis, la Stat3 ha llamado recientemente la atención como una diana potencial para la terapia contra el cáncer (Bromberg, 2002; Turkson, 2004). Si bien se han empleado con éxito varios métodos de inhibición de la Stat3 y se ha establecido una prueba preliminar de que el direccionamiento a la Stat3 es potencialmente beneficioso en varios sistemas tumorales, incluyendo el cáncer de mama en el que la Stat3 está activada constitutivamente (Epling-Burnette et al., 2001; Yoshikawa et al., 2001; Li y Shaw, 2002; Catlett-Falcone et al., 1999; Mora et al., 2002; Grandis et al., 2000; Leong et al., 2003; Jing et al., 2003; Jing et al., 2004; Turkson et al., 2001; Ren et al., 2003; Shao et al., 2003; Turkson et al., 2004; Uddin et al., 2005); todos tienen potenciales limitaciones para su traslado al uso clínico para la terapia contra el cáncer relacionadas con problemas relativos al suministro, la especificidad o la toxicidad.
Varios grupos han seguido estrategias específicas que se dirigen a la Stat3 mediante la identificación de inhibidores del reclutamiento y/o dimerización de la Stat3 (Turkson et al., 2001; Ren et al., 2003; Shao et al., 2003; Uddin et al., 2005; Song et al., 2005; Schust et al., 2006). Como se describe a continuación, esta estrategia tiene el potencial de conseguir una especificidad basada en la observación de que el motivo peptídico pY preferido de cada proteína STAT es distinto. Cuando se combina con un enfoque de molécula pequeña, esta estrategia tiene el potencial de superar los problemas de suministro y de toxicidad.
Direccionamiento a la Stat3a evitando la Stat3p. Algunas de las características bioquímicas distintas de la Stat3p con respecto a la Stat3a, especialmente la activación constitutiva y un aumento de 10 a 20 veces en la afinidad de unión al ADN, se han atribuido a la ausencia del dominio de transactivación en el extremo carboxílico (TAD) que da como resultado una mayor estabilidad del dímero Stat3p (Park et al., 1996; Park et al., 2000). El aumento de la estabilidad del dímero probablemente sea el resultado de una mayor afinidad de unión del dominio SH2 a los motivos peptídicos pY en el contexto de la Stat3p en comparación con la Stat3a debido a un impedimento estérico reducido conferido por la eliminación del TAD. Estas características bioquímicas diferenciales entre la Stat3a y la Stat3p se explotan para desarrollar un compuesto químico que se dirige selectivamente a la Stat3a, en algunas realizaciones. Esta selectividad mejora el efecto antitumoral de dichos compuestos, en determinados casos, porque evitarían la Stat3p, que funciona para antagonizar las funciones oncogénicas de la Stat3a.
En determinadas realizaciones de la invención, los compuestos de la invención pueden ser para usar en terapias específicas dirigidas a la señalización de la Stat3.
VI. Terapia combinada
Es un aspecto de esta invención que un compuesto para usar como se divulga en el presente documento se use junto con otro agente o método de terapia, tal como otro tratamiento de la fibrosis. En realizaciones en donde la fibrosis es fibrosis cutánea, la terapia adicional puede ser fototerapia, tal como la fototerapia con UVA1, ciprofloxacino, bosentán, metotrexato, péptido E4 (versión sintética de un bloque de construcción peptídico obtenido a partir de la proteína natural endostatina; Yamaguchi et al., 2012), P144, un compuesto que es un conocido inhibidor del TGF-p (patente de EE. UU. N.° 7582609), y así sucesivamente.
El o los compuestos (que pueden ser o no un inhibidor de la Stat3) pueden preceder o seguir al tratamiento con otro agente en intervalos que varían de minutos a semanas, por ejemplo. En realizaciones donde el otro agente y el compuesto de la invención se aplican por separado a un individuo con fibrosis, tal como en el momento de la administración a un individuo sospechoso de padecer fibrosis, que se sabe que padece fibrosis o que está en riesgo de padecer fibrosis, uno generalmente se aseguraría de que no pasara un periodo de tiempo significativo entre el momento de cada administración, de forma que el agente y el compuesto de la invención aún fueran capaces de ejercer un efecto combinado ventajoso en el individuo.
Por ejemplo, en dichos casos, se contempla que se pueda poner en contacto la célula, el tejido o el organismo con una, dos, tres, cuatro o más modalidades sustancialmente de forma simultánea (es decir, en menos de aproximadamente un minuto) con el compuesto de la invención. En otros aspectos, uno o más agentes pueden administrarse en aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos,
s, s, s, s, s, s, s, ,
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s,
de administrar el compuesto de la invención. En otras realizaciones determinadas, un agente puede administrarse dentro de aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 8 días, aproximadamente 9 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 13 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 15 días, aproximadamente 16 días, aproximadamente 17 días, aproximadamente 18 días, aproximadamente 19 días, aproximadamente 20, hasta aproximadamente 21 días antes y/o después de administrar el compuesto de la invención, por ejemplo. En algunas situaciones, puede ser deseable prolongar el periodo de tiempo para el tratamiento de manera significativa, tal como cuando transcurren varias semanas (por ejemplo, aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7 o aproximadamente 8 semanas o más) entre las respectivas administraciones. En algunas situaciones, puede ser deseable prolongar el periodo de tiempo para el tratamiento de manera significativa, tal como cuando transcurren varios meses (por ejemplo, aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7 o aproximadamente 8 semanas o más) entre las respectivas administraciones.
Se pueden emplear diversas combinaciones, el compuesto de la invención es "A" y el agente secundario, que puede ser cualquier otro agente terapéutico contra el cáncer, es B":
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
La administración de los compuestos terapéuticos de la presente invención a un paciente seguirá los protocolos generales para la administración de fármacos, teniendo en cuenta la toxicidad. Se espera que los ciclos de tratamiento se repitan según sea necesario.
En algunos casos, la terapia combinada es un agente antimicrobiano. Puede usarse cualquier agente antimicrobiano, tal como uno o más de metil, propil y clorocresol, por ejemplo.
VII. Composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz de un compuesto como se divulga en el presente documento disuelta o dispersada en un portador farmacéuticamente aceptable. Las expresiones "farmacéutica" o "farmacológicamente aceptable" se refieren a entidades y composiciones moleculares que no producen una reacción adversa, alérgica o perjudicial de otro tipo cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según sea apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos un inhibidor de la Stat3 de la invención y en algunos casos un principio activo adicional, será conocida por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación, como se ejemplifica en Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990. Además, para la administración a un animal (por ejemplo, un ser humano), se entenderá que las preparaciones deben cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza según sea requerido por la Oficina de Normas Biológicas de la FDA.
Como se usa en el presente documento, un "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizantes de fármacos, geles, aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, edulcorantes, aromatizantes, colorantes, materiales similares y combinaciones de los mismos, como sabría un experto en la materia (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, págs. 1289-1329). Excepto en la medida en que cualquier portador convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.
La o las composiciones pueden comprenden diferentes tipos de portadores dependiendo de si van a administrarse en forma sólida, líquida o de aerosol, y de si tienen que ser estériles para dichas vías de administración, tales como una inyección. La o las composiciones pueden administrarse por vía intravenosa, por vía intradérmica, por vía intraarterial, por vía intraperitoneal, por vía intralesional, por vía intracraneal, por vía intraarticular, por vía intraprostática, por vía intrapleural, por vía intratraqueal, por vía intranasal, por vía intravítrea, por vía intravaginal, por vía intrarrectal, por vía tópica, por vía intratumoral, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía subcutánea, por vía subconjuntival, por vía intravesicular, por vía mucosa, por vía intrapericárdica, por vía intraumbilical, por vía intraocular, por vía oral, por vía tópica, por vía local, por inyección, por infusión, por infusión continua, por perfusión localizada que riega directamente las células diana, mediante un catéter, mediante un lavado, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas), como un aerosol o por otro método o cualquier combinación de los anteriores, como sabría un experto en la materia (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990).
La cantidad de dosis real de una composición de la presente invención administrada a un individuo puede determinarse por factores físicos y fisiológicos tales como el peso corporal, la gravedad de la afección, el tipo de enfermedad que se está tratando, las intervenciones terapéuticas previas o simultáneas y la vía de administración. El médico responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la concentración del o los principios activos en una composición y la o las dosis apropiadas para el sujeto individual.
En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, al menos aproximadamente el 0,1 % de un compuesto. En otras realizaciones, el compuesto activo puede comprender entre aproximadamente el 2 % y aproximadamente el 75 % del peso de la unidad, o entre aproximadamente el 25 % y aproximadamente el 60 %, por ejemplo, y cualquier intervalo derivable entre los mismos. En otros ejemplos no limitantes, una dosis también puede comprender de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal, 0,5 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 750 mg/kg de peso corporal, a aproximadamente 1.000 mg/kg de peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo derivable entre los mismos. En algunos ejemplos no limitantes de un intervalo derivable de las cifras indicadas en el presente documento, puede administrarse un intervalo de aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, etc., tomando como base las cifras descritas anteriormente. En determinadas realizaciones de la invención, se contemplan diversos mecanismos de dosificación. Por ejemplo, la composición se puede administrar una o más veces al día, una o más veces a la semana o una o más veces al mes, y así sucesivamente.
En cualquier caso, la composición puede comprender varios antioxidantes para retardar la oxidación de uno o más componentes. Adicionalmente, la prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante conservantes tales como diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, que incluyen, pero sin limitación, parabenos (por ejemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal o combinaciones de los mismos.
La composición puede formularse en una base libre, neutra o en forma de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales formadas con los grupos carboxilo libres derivados de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico; o bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína.
En realizaciones donde la composición está en forma líquida, un portador puede ser un disolvente o un medio de dispersión que comprende, pero no se limita a, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido, etc.), lípidos (por ejemplo, triglicéridos, aceites vegetales, liposomas) y combinaciones de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, usando un recubrimiento, tal como lecitina; mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido por dispersión en portadores tales como, por ejemplo, poliol líquido o lípidos; mediante el uso de tensioactivos tales como, por ejemplo, hidroxipropilcelulosa; o combinaciones de los mismos dichos métodos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, tales como, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio o combinaciones de los mismos.
Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando la actual invención en la cantidad necesaria del disolvente apropiado con varias cantidades de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de una filtración esterilizante. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diferentes principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los otros ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsiones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son técnicas de secado al vacío o de liofilización que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de un medio líquido filtrado estéril del mismo. El medio líquido debe estar tamponado de manera adecuada si fuera necesario, y el diluyente líquido se hará previamente isotónico antes de la inyección con suficiente solución salina o glucosa. También se contempla la preparación de composiciones muy concentradas para inyección directa, donde se prevé el uso de DMSO como disolvente para dar como resultado una penetración extremadamente rápida, suministrando altas concentraciones de los agentes activos en un área pequeña.
La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas debe mantenerse al mínimo en un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína.
En realizaciones particulares, puede lograrse la absorción prolongada de una composición inyectable mediante el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.
VIII. Kits
Cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento puede estar comprendida en un kit y están alojadas en un recipiente adecuado. Los kits comprenderán por tanto, en un medio recipiente adecuado, una o más composiciones y, en algunos casos, un agente adicional de la presente invención. En algunos casos, existen uno o más agentes distintos a los de la composición de la divulgación que están incluidos en el kit, tales como uno o más de otros agentes para el tratamiento de la fibrosis y/o uno o más agentes para el tratamiento de una afección subyacente asociada a la fibrosis. En realizaciones particulares, existe un aparato o cualquier tipo de medio para el diagnóstico de la fibrosis.
Los componentes de los kits pueden envasarse bien en medios acuosos o bien en forma liofilizada. El medio recipiente de los kits generalmente incluirá al menos un vial, un tubo de ensayo, un matraz, un frasco, una jeringuilla u otro medio recipiente, en el cual pueda colocarse un componente y, preferentemente, alicuotarse adecuadamente. Cuando existe más de un componente en el kit, el kit también contendrá generalmente un segundo, tercer u otro recipiente adicional en el cual pueden colocarse los componentes adicionales por separado. Sin embargo, en un vial pueden estar comprendidas diversas combinaciones de componentes. Los kits de la presente invención también incluirán normalmente un medio para contener la composición, un agente adicional y cualquier otro recipiente de reactivos en aislamiento hermético para su venta comercial. Dichos recipientes pueden incluir recipientes de plástico moldeados por inyección o por soplado en los que se conserven los viales deseados.
Las composiciones también pueden formularse en una composición inyectable. En cuyo caso, el propio medio recipiente puede ser una jeringuilla, una pipeta y/u otro aparato similar, desde el que puede aplicarse la formulación a una zona infectada del cuerpo, inyectarse en un animal y/o incluso aplicarse a y/o mezclarse con los otros componentes del kit. Sin embargo, los componentes del kit pueden proporcionarse como un polvo o polvos secos. Cuando los reactivos y/o los componentes se proporcionan como un polvo seco, el polvo puede reconstituirse mediante la adición de un disolvente adecuado. Se prevé que el disolvente también pueda proporcionarse en otro medio recipiente.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen para mostrar las realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la materia apreciarán que, en la medida en que los siguientes ejemplos se refieren a compuestos no definidos en las reivindicaciones, se proporcionan con fines de referencia.
EJEMPLO 1
MATERIALES Y MÉTODOS ILUSTRATIVOS
Cribado virtual de ligandos. Los inventores aislaron la estructura tridimensional del dominio SH2 de la Stat3 de la estructura del fragmento central de los homodímeros de la Stat3 fosforilados unidos al ADN (Becker et al., 1998) depositada en el banco de datos RCSB Protein Data Bank (PDB) (código del PDB 1BG1) y convertida en un sistema compatible con Mecánica de Coordinación Interna (ICM) mediante la adición de átomos de hidrógeno, modificando aminoácidos inusuales, haciendo ajustes de carga y realizando etapas de limpieza adicionales. Adicionalmente, los inventores recuperaron las coordenadas del dominio SH2 de la Stat1 del banco de datos PDB (código del PDB 1BF5) para usarlas en el análisis de selectividad por ordenador (Chen et al., 1998). Las bases de datos de sustancias químicas comerciales (Chembridge, Asinex, ChemDiv, Enamine, Keyorganics y Life Chemicals) se eligieron como fuentes de compuestos para el cribado informático. La selección fue el hidrógeno de la amida de E638 dentro del sitio que se une al resto 3 (Q, C o T) dentro del ligando peptídico con pY (Shao et al., 2006) como punto central de la cavidad de unión, que consistía en un cubo con unas dimensiones de 16,0 x 16,9 x 13,7 ángstroms. Además del sitio de unión 3, este cubo contenía el sitio de unión al resto pY que consistía principalmente en R609 y K591 (Shao et al., 2006) y un sitio de unión hidrófobo que consiste en el BuclepC_pD y el BucleaB-aC. La alineación de la secuencia y la superposición de las estructuras de la Stat3 y la Stat1 revelaron diferencias sustanciales en la secuencia de estos bucles; la ausencia de su superposición indicó que esta región podría servir como filtro de selectividad (Cohen et al., 2005). Se realizó un cálculo de acoplamiento flexible (Totrov y Abagyan, 1997) para determinar la puntuación de la energía mínima global y, por lo tanto, predecir la conformación óptima del compuesto dentro de la cavidad. Se seleccionó un compuesto para adquisición y pruebas bioquímicas tomando como base el cumplimiento de los criterios del análisis de interacción (CIA): 1) puntuación de energía mínima global <-30, 2) formación de un puente salino y/o de una red de puentes de H dentro del sitio de unión al resto pY y 3) formación de un puente de H con o bloqueando el acceso al hidrógeno de la amida de E638. La mayor parte, pero no todos, los compuestos interactuaron también con el sitio de unión hidrófobo.
Ensayo de unión del SH2/péptido pY de la Stat3. Los ensayos de unión de la Stat3 se realizaron a 25 °C con un biosensor BIAcore 3000 usando tampón Tris 20 mM a pH 8 que contenía mercaptoetanol 2 mM y DMSO al 5 % como tampón de análisis (Kim et al., 2005). Los dodecapéptidos derivados de EGFR biotinilados fosforilados y no fosforilados basados en la secuencia que rodea a Y1068 (Shao et al., 2004) se inmovilizaron en un chip sensor recubierto con estreptavidina (BIAcore inc., Picataway NJ). La unión de la Stat3 se realizó en tampón Tris 20 mM a pH 8 que contenía p-mercaptoetanol 2 mM a un caudal de 10 pl/min durante 1-2 minutos. Se mezclaron previamente alícuotas de la Stat3 a 500 nM con compuesto para conseguir una concentración final de 1-1.000 pM y se incubaron a 4 °C antes de inyectarlas en el chip sensor. El chip se regeneró inyectando 10 pl de glicina 100 mM a pH 1,5 después de cada inyección de muestra. Se ejecutó un control (Stat3 con DMSO, pero sin compuesto) al principio y al final de cada ciclo (40 inyecciones de muestra) para garantizar que la integridad del chip sensor se mantuviera durante todo el ciclo. El promedio de los dos controles se normalizó al 100 % y se usó para evaluar el efecto de cada compuesto sobre la unión de la Stat3. Las respuestas se normalizaron dividiendo el valor a los 2 minutos por la respuesta obtenida en ausencia de compuestos a los 2 minutos y multiplicando por 100. Los valores de la CI50 se determinaron representando gráficamente el % de respuesta máxima en función del logaritmo de la concentración del compuesto y ajustando los puntos experimentales a un modelo de unión competitiva usando una ecuación logística de cuatro parámetros: R = Ralto - (Ralto - Rbajo)/ (1 conc/A1)AA2, donde R = porcentaje de respuesta a la concentración de inhibidor, Ralto = porcentaje de respuesta sin compuesto, Rbajo= porcentaje de respuesta a la concentración de compuesto más alta, A2 = parámetro de ajuste (pendiente) y A1 = CI50 (programa informático BIAevaluation versión 4.1).
Ensayo de inmunotransferencia. Se cultivó la línea celular de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) en placas de 6 pocillos en condiciones normales. Las células se trataron previamente con compuestos (0, 1,3, 10, 30, 100 y 300 pM) durante 1 hora y después se estimularon en condiciones óptimas bien con interferón gamma (IFN-y; 30 ng/ml durante 30 min) para activar la Stat1 o bien con interleucina-6 (IL-6; 30 ng/ml durante 30 min) para activar la Stat3 (30-31). Después se recuperaron los cultivos y se extrajeron las proteínas usando tampón de alta salinidad, como se describe (Shao et al., 2006). Resumiendo, los extractos se mezclaron con 2X de tampón de muestra de laurilsulfato de sodio (SDS) (125 mmol/l de Tris-HCl a pH 6,8; SDS al 4 %; glicerol al 20 %; 2-mercaptoetanol al 10 %) en una relación 1:1 y se calentaron durante 5 minutos a 100 °C. Las proteínas (20 pg) se separaron por SDS-PAGE al 7,5 % y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Waltham, MA) y se inmunotransfirieron. En cada gel se incluyeron marcadores de peso molecular teñidos previamente (Biorad, Hercules, CA). Las membranas se investigaron en serie con anticuerpos contra pY701 de la Stat1 o pY705 de la Stat3 seguido de anticuerpos contra la Stat1 o la Stat3 (Transduction labs, Lexington, KY) y después un anticuerpo contra la actina p (Abcam, Cambridge, MA). Las membranas se desprendieron entre cada investigación de anticuerpos usando tampón de desprendimiento de inmunoelectrotransferencia Western Restore™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) según las instrucciones del fabricante. Se usó anti-IgG de ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante como anticuerpo secundario (Invitrogen Carlsbad, CA) y las membranas se eluyeron con un sistema de detección de quimioluminiscencia potenciada (ECL) (Amersham Life Sciences Inc.; Arlington Heights, IL.).
Cribado de la similitud. Tres compuestos identificados en el cribado de ligando virtual inicial (VLS), Cpd3, Cpd30 y Cpd188, inhibieron la unión del SH2/péptido pY de la Stat3 y la fosforilación de la Stat3 mediada por la IL-6, y se eligieron como moléculas de referencia para el cribado de la similitud. Se envió una consulta de similitud de huella para cada compuesto de referencia a Molcart/ICM (distancia máxima, 0,4). Se calculó la similitud entre cada molécula de referencia y cada molécula de la base de datos, y los resultados de similitud se clasificaron en orden decreciente de puntuación de similitud de ICM (Eckert y Bajorath, 2007). Las bases de datos buscadas incluyeron ChemBridge, LifeChemicals, Enamine, ChemDiv, Asinex, AcbBlocks, KeyOrganics y PubChem para un total de 2,47 millones de compuestos. Todos los compuestos identificados se acoplaron informáticamente a la cavidad de unión del dominio SH2 de la Stat3. Los compuestos que cumplían los criterios del CIA se adquirieron y se analizaron como se describe para los compuestos identificados en el cribado primario.
Ensayo del cambio en la movilidad electroforética (EMSA): el EMSA se realizó usando el oligonucleótido de doble hélice radiomarcado hSIE como sonda como se describe (Tweardy et al., 1995). Resumiendo, se prepararon extractos de alta salinidad a partir de células HepG2 incubadas sin o con iL-6 (30 ng/ml) durante 30 minutos. La concentración de proteína se determinó mediante el ensayo de Bradford y se incubaron 20 |jg de extracto con compuesto (300 jM ) durante 60 minutos a 37 °C. La sonda hSIE unida y no unida se separó mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida (4,5 %). Los geles se secaron y se autorradiografiaron.
Modelado molecular. Todas las configuraciones tridimensionales del dominio SH2 de la Stat3 complejadas con compuestos se determinaron mediante una optimización de la energía global que implica múltiples etapas: 1) la ubicación de las moléculas orgánicas se ajustó como un todo en una amplitud de 2 A mediante traslaciones y rotaciones aleatorias pseudobrownianas alrededor del centro de gravedad molecular, 2) las variables internas de las moléculas orgánicas se cambiaron al azar. 3) los grupos acoplados dentro de los ángulos de torsión de la cadena lateral del dominio SH2 de la Stat3 se muestrearon con sacudidas de probabilidad sesgadas mientras se fijaban las otras variables de la proteína, 4) las minimizaciones de la energía local se realizaron usando el Programa de Energía de Conformación Empírica para Péptidos de tipo 3 (ECEPP3) en el vacío (Nemethy et al., 1992) con una constante dieléctrica dependiente de la distancia £ = 4r, la energía del disolvente basada en la superficie y las contribuciones entrópicas de las cadenas laterales de la proteína evaluadas añadidas, y 5) las conformaciones del complejo, que se determinaron según los criterios de Metrópolis, se seleccionaron para el siguiente círculo de cribado de la conformación. La configuración tridimensional inicial del dominio SH2 de la Stat1 en un complejo con cada compuesto se predijo y generó mediante superposición, dentro del modelo informático, de las características tridimensionales del SH2 de la Stat1 sobre la configuración tridimensional del dominio SH2 de la Stat3 en un complejo con cada compuesto. El modelo informático final del SH2 de la Statl en un complejo con cada compuesto se determinó por minimización local usando mecánica molecular basada en el Campo de Fuerzas de Coordenadas Internas (ICFF) (Totrov y Abagyan, 1997). Los inventores calcularon la energía de van der Waals del complejo de la Statl o 3-SH2 unido a cada compuesto usando el potencial de Lennard-Jones con el campo de fuerza ECEpP/3 (Nemethy et al., 1992).
Microscopía de fluorescencia confocal y de alto rendimiento. La microscopia de fluorescencia confocal y de alto rendimiento (HTFM) de las células MEF/GFP-Stat3a se realizó como se describe (Huang et al., 2007). Resumiendo, para la microscopia de fluorescencia confocal, las células se cultivaron en placas de 6 pocillos que contenían un cubreobjetos. Para la HTFM, las células se sembraron en placas CC3 de 96 pocillos a una densidad de 5.000 células/pocillo usando un sistema de siembra en placa automático. Las células se cultivaron en condiciones normales hasta un 85-90 % de confluencia. Las células se trataron previamente con compuesto durante 1 hora a 37 °C y después se estimularon con IL-6 (200 ng/ml) e IL-6sR (250 ng/ml) durante 30 minutos. Las células se fijaron con formaldehído al 4 % en tampón PEM (PIPES potásico 80 mM, pH 6,8, EGTA 5 mM a pH 7,0, MgCb 2 mM) durante 30 minutos a 4 °C, se inactivaron en 1 mg/ml de NaBH4 (Sigma) en tampón PEM y se contratiñeron durante 1 minuto en 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Sigma; 1 mg/ml) en tampón PEM. Los cubreobjetos se examinaron por microscopia de fluorescencia confocal. Las placas se analizaron mediante una HTFM automatizada usando la plataforma Cell Lab IC Image Cytometer (IC100) y el programa informático de análisis Cytoshop Versión 2.1 (Beckman Coulter). La translocación nuclear se cuantifica usando la fracción localizada en la medición del núcleo (FLIN) (Sharp et al., 2006).
Ensayo de apoptosis en una línea celular de cáncer de mama. Las líneas celulares de carcinoma de mama humano MDA-MB-468, MDA-MB-231, MBA-MD-435 y MCF7 fueron amablemente proporcionadas por el Dr. Powe1H. Brown (Breast Cancer Center, Baylor College of Medicine). La línea celular de cáncer de mama, MDA-MB-453, fue amablemente proporcionada por el Dr. Shou Jiang (Breast Cancer Center, Baylor College of Medicine). Todas las líneas celulares se cultivaron en medio DMEM complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 %, 25.000 unidades de penicilina G, 25.000 jg de estreptomicina y 131,4 mg de L-glutamina, y se cultivaron en la estufa de incubación en unas condiciones de un 95 % de aire, un 5 % de CO2 a 37 °C (García et al., 2001). Las células se sembraron a 2.500 células/cm2 en placas de 12 pocillos. Al 80 % de confluencia, las células se lavaron con PBS y se complementaron con medio reciente que contenía el compuesto o el inhibidor de la topoisomerasa I, camptotecina, a 0, 0,1, 03, 1, 3, 10, 30, 100, 300 jM . A las 24 horas, el tratamiento se terminó retirando el medio de cada pocillo. Las células se lisaron con tampón de lisis celular (600 |jl durante 30 minutos a 25 °C). El lisado celular (200 |jl) se centrifugó a 200 xg durante 10 minutos y se analizaron 20 j l de cada sobrenadante en busca de nucleosomas usando el Cell Death Detection ELISA (Roche Applied Science) como describe el fabricante. El nivel máximo porcentual de nucleosomas se calculó dividiendo el nivel de nucleosomas por el nivel máximo de nucleosomas alcanzado en el ensayo y multiplicando por 100. Este valor se representó gráficamente como una función del logaritmo de la concentración del compuesto, y la curva de mejor ajuste se generó usando el modelo logístico de 4 parámetros/respuesta a la dosis/XLfit 4.2, programa informático IDBS.
EJEMPLO 2
IDENTIFICACIÓN POR VLS DE COMPUESTOS QUE BLOQUEARON LA UNIÓN DE LA STAT3 A SU LIGANDO FOSFOPEPTÍDICO E INHIBIERON LA FOSFORILACIÓN DE LA STAT3 MEDIADA POR LA IL-6
Se usó el protocolo de VLS para evaluar un total de 920.000 compuestos medicamentosos. De éstos, 142 compuestos cumplieron los criterios del CIA. Estos compuestos se adquirieron y analizaron para determinar su capacidad de bloquear la unión de la Stat3 a su ligando fosfopeptídico en un ensayo de unión basado en resonancia de plasmón superficial (RPS) y para inhibir la fosforilación mediada por la IL-6 de la Stat3. Los experimentos de competencia por RPS mostraron que, de los 142 compuestos analizados, 3 compuestos, Cpd3, Cpd30 y Cpd188, fueron capaces de competir directamente con el péptido pY por la unión a la Stat3 con unos valores de la CI50 de 447, 30 y 20 jM , respectivamente (FIG. 1 y 3; Tabla 4).
T l 4. V l r l I mM ^ m iv
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1Los datos presentados son la media o la media ± DE; ND = no determinado.
Adicionalmente, cada compuesto inhibió la fosforilación mediada por la IL-6 de la Stat3 con unos valores de la CI50 de 91, 18 y 73 jM , respectivamente (FIG. 2; Tabla 4).
El cribado de similitud con Cpd3, Cpd30 y Cpd188 identificó 4.302 compuestos adicionales. Se realizó un cribado de VLS con cada uno de estos compuestos, que identificó 41 compuestos que cumplían los criterios del CIA; éstos se adquirieron y se analizaron. Los experimentos de competencia por RPS mostraron que, de estos 41 compuestos, 3 compuestos, Cpd3-2, Cpd3-7 y Cpd30-12, fueron capaces de competir directamente con el péptido pY por la unión a la Stat3 con unos valores de la CI50 de 256, 137 y 114 jM , respectivamente (FIG. 1 y 3; Tabla 4). Adicionalmente, cada compuesto inhibió la fosforilación de la Stat3 mediada por la IL-6 con unos valores de la CI50 de 144, 63 y 60 jM , respectivamente (FIG. 2; Tabla 4).
EJEMPLO 3
LA INHIBICIÓN MEDIADA POR COMPUESTO DE LA FOSFORILACIÓN ESTIMULADA POR LIGANDO DE LA STAT3 ES ESPECÍFICA PARA LA STAT3 CON RESPECTO A LA STAT1
Mientras que la Stat3 contribuye a la oncogénesis, en parte, a través de la inhibición de la apoptosis, la Stat1 es antioncogénica; media en los efectos apoptóticos de los interferones y contribuye a la vigilancia del tumor (Kaplan et al., 1998; Ramana et al., 2000). Por consiguiente, los compuestos que se dirigen a la Stat3 evitando la Stat1, dejando sus funciones antioncogénicas sin oposición, pueden dar como resultado un efecto antitumoral sinérgico. Para evaluar la selectividad de los compuestos para la Stat3 con respecto a la Stat1, se incubaron células HepG2 con Cpd3, Cpd30, Cpd188, Cpd3-2, Cpd3-7 y Cpd30-12 (300 jM ) durante 1 hora a 37 °C antes de la estimulación con If N-y (FIG. 4). Solo el tratamiento con Cpd30-12 bloqueó la fosforilación de la Stat1, mientras que cada uno de los otros cinco compuestos, Cpd3, Cpd30, Cpd188, Cpd3-2 y Cpd3-7, no lo hicieron. Por lo tanto, cinco de los seis compuestos ilustrativos identificados fueron selectivos e inhibieron la fosforilación estimulada por ligando de la Stat3, pero no de la Stat1.
EJEMPLO 4
ANÁLISIS DE LA SECUENCIA Y MODELADO MOLECULAR DE LA INTERACCIÓN DE CADA COMPUESTO CON EL DOMINIO SH2 DE LA STAT3 CON RESPECTO A LA STAT1
Para comprender a nivel molecular la base de la selectividad de los Cpds 3, 30, 188, 3-2 y 3-7 y la ausencia de selectividad en el caso del Cpd 30-12, se compararon las secuencias de aminoácidos y las estructuras disponibles del dominio SH2 de la Stat1 y de la Stat3 y también se examinó cómo interactuaba cada compuesto con ambos. La alineación de las secuencias reveló identidad en los restos dentro de la Stat3 y de la Stat1 correspondientes al sitio de unión para el resto pY y el resto 3 (FIG. 5A). Adicionalmente, la superposición de las estructuras del SH2 de la Stat3 y de la Statl reveló que los bucles que contenían estos sitios de unión estaban superpuestos (FIG. 5B). Por el contrario, la alineación de las secuencias reveló diferencias sustanciales en la secuencia de las regiones del dominio SH2 correspondientes a los bucles que forman el sitio de unión hidrófobo (FIG. 5A). Adicionalmente, la revisión de la superposición de los dominios SH2 de la Stat3 y de la Stat1 reveló que, a diferencia de la estrecha yuxtaposición de los dos bucles de la Stat3 que forman el sitio de unión hidrófobo, los dos bucles correspondientes de la Stat1 no están estrechamente yuxtapuestos para formar una cavidad (FIG. 5B).
La revisión de los modelos informáticos de Cpd3, Cpd30, Cpd188, Cpd3-2 y Cpd3-7 en un complejo con el dominio SH2 de la Stat3 reveló que cada uno tiene interacciones significativas con la cavidad de unión del dominio SH2 de la Stat3 en los tres sitios de unión, el sitio de unión al resto pY, el sitio de unión al resto 3 y el sitio de unión hidrófobo (FIG. 6A, B, C, D y E). Por el contrario, el Cpd30-12 interactúa con el sitio de unión al resto pY y bloquea el acceso al sitio de unión al resto 3, pero no interactúa ni bloquea el acceso al sitio de unión hidrófobo (FIG. 6F). Adicionalmente, las energías de van der Waals de los 5 compuestos selectivos eran mucho más favorables para su interacción con los bucles de la Stat3 que forman el sitio de unión hidrófobo que con los bucles correspondientes de la Stat1 (FIG. 5C). Por lo tanto, el modelado por ordenador indicó que la actividad de los compuestos contra la Stat3 deriva de su capacidad para interactuar con los sitios de unión para los restos pY y 3 dentro de la cavidad de unión, mientras que la selectividad para la Stat3 con respecto a la Stat1 deriva de la capacidad de los compuestos para interactuar con el sitio de unión hidrófobo dentro de la cavidad de unión del SH2 de la Stat3, lo que sirvió como filtro de selectividad.
EJEMPLO 5
INHIBICIÓN DE LA TRANSLOCACIÓN NUCLEAR DE LA STAT3 FOSFORILADA POR PARTE DE CPD3, CPD30, CPD188, CPD3-2 Y CPD3-7 EVALUADA POR HTFM
Después de su fosforilación en Y705, la Stat3 experimenta un cambio en la conformación desde la dimerización de cabeza a cabeza mediada a través de su dominio de oligomerización aminoterminal hasta la dimerización de cola a cola mediada por interacciones recíprocas de SH2/ligando peptídico con pY705. Este cambio conformacional está seguido por una acumulación nuclear. Se esperaría que los compuestos que se dirigen a las interacciones SH2/ligando peptídico con pY de la Stat3 inhibieran la acumulación nuclear de la Stat3. Para determinar si este era el caso con los compuestos del presente documento, se empleó un ensayo de translocación nuclear (FIG. 7) usando células de fibroblastos embrionarios murinos (MEF) que son deficientes en la Stat3 endógena pero que expresan constitutivamente la Stat3a marcada con GFP a niveles endógenos, MEF/GFP-Stat3 a (Huang et al., 2007). La incubación previa de células MEF/GFP-Stat3 a con Cpd3, Cpd30, Cpd188, Cpd3-2 y Cpd3-7, pero no con Cpd30-12, bloqueó la translocación nuclear mediada por ligando de la GFP-Stat3 a con unos valores de la CI50 de 131, 77, 39, 150 y 20 |jM (FIG. 7 y Tabla 4).
EJEMPLO 6
DESESTABILIZACIÓN DE COMPLEJOS DE ADN-STAT3 POR PARTE DEL CPD3 Y EL CPD3-7
Una vez en el núcleo, los dímeros de Stat3 se unen a elementos de ADN específicos para activar y, en algunos casos, reprimir la transcripción génica. Los dodecapéptidos con tirosina fosforilada basados en motivos dentro de los receptores que reclutan la Stat3 han demostrado previamente que desestabilizan la Stat3 (Chakraborty et al., 1999; Shao et al., 2003). Se puede esperar que los compuestos que se unen al sitio de unión a fosfopéptidos de la Stat3 hagan lo mismo. Para determinar si este era el caso de cualquiera de los compuestos identificados, se incubaron extractos de células HepG2 estimuladas con IL-6 en reacciones de unión que contenían hSIE radiomarcado (FIG. 8) y cada uno de los cinco compuestos selectivos (300 j M). La incubación con Cpd3 o Cpd3-7 redujo la cantidad de hSIE desplazada a la mitad o más. Los otros compuestos no tuvieron un efecto detectable sobre la intensidad de la banda Stat3:hSIE. Por lo tanto, 2 de los 5 compuestos selectivos desestabilizaron los complejos Stat3:hSIE.
EJEMPLO 7
ENFOQUE ILUSTRATIVO DE INHIBIDORES DE LA STAT3 PARA CÉLULAS MADRE CANCEROSAS
En el campo del desarrollo de la sonda de la Stat3, los inventores se han centrado en las sondas de la Stat3 de molécula pequeña (Xu et al., 2009) y son útiles varias características del programa de moléculas pequeñas, que incluyen: 1) un modo de acción claramente definido de estas sondas: se dirigen al dominio de homología Src (SH) 2 de la Stat3 que está implicado en 2 etapas en la ruta de activación de la Stat3; 2) su especificidad de acción; y 3) el potencial para usar sondas guía identificadas hasta ahora para identificar sondas con una actividad mayor en 2 a 3 unidades logarítmicas tomando como base los análisis de la SAR recientes e ilustrativos y las consideraciones de química de la medicina que se presentan a continuación.
En realizaciones específicas, la afinidad de los compuestos se mejora al obtener una mayor afinidad en la escala logarítmica al pasar de sondas de 1a generación a 2a generación usando un análisis tridimensional de farmacóforos. Adicionalmente, la selectividad se mejora a través de realizaciones de modelado, en particular a través de la identificación de un dominio de unión hidrófobo distinto en la cavidad de unión a fosfopéptidos del SH2 de la Stat3 con respecto al SH2 de la Statl (Xu et al., 2009).
Identificación de sondas químicas de la Stat3 de 1a generación. Para desarrollar sondas químicas que se dirijan selectivamente a la Stat3, los inventores cribaron casi 920.000 compuestos pequeños medicamentosos acoplando cada uno en la cavidad de unión a péptidos del dominio SH2 de la Stat3, que consiste en tres sitios: el sitio de unión al resto pY, el sitio de unión al resto 3 y un sitio de unión hidrófobo, que sirvió como filtro de selectividad (Xu et al., 2009). Tres compuestos (Cpd3, Cpd30 y Cpd188) cumplieron los criterios de análisis de interacción, inhibieron competitivamente la unión de la Stat3 recombinante a su ligando peptídico con pY inmovilizado e inhibieron la fosforilación de la tirosina de la Stat3 mediada por la IL-6. Estos compuestos se usaron en un cribado de similitud de 2,47 millones de compuestos, que identificó 3 compuestos más (Cpd3-2, Cpd3-7 y Cpd30-12) con actividades similares. Los análisis de los 6 compuestos activos para evaluar la capacidad de inhibir la fosforilación de la Stat1 mediada por el IFN-y revelaron que todos excepto el Cpd30-12 eran selectivos para la Stat3. El modelado molecular de los dominios SH2 de la Stat3 y la Stat1 unidos al compuesto reveló que la interacción del compuesto con el sitio de unión hidrófobo era la base de la selectividad. Los 5 compuestos selectivos inhibieron la translocación nuclear a citoplásmica de la Stat3, mientras que 3 de los 5 compuestos (Cpd3, Cpd30 y Cpd188) indujeron la apoptosis preferentemente de líneas celulares de cáncer de mama ilustrativas con una activación constitutiva de la Stat3.
Identificación de sondas químicas de la Stat3 de 2a generación. El cribado de similitud descrito anteriormente no produjo ningún resultado usando el Cpd188, el más activo de los 3 compuestos cabeza de serie, tal como el compuesto de consulta. Por consiguiente, los inventores repitieron el cribado de similitud bidimensional usando el armazón del Cpd188 como estructura de consulta y la biblioteca de Life Chemicals, lo que produjo 207 resultados. Se realizó un análisis tridimensional de farmacóforos con estos 207 compuestos usando Ligand Scout y se adquirieron los 39 compuestos con mejor puntuación y se ensayaron mediante RPS para evaluar la inhibición de la unión de la Stat3 a su ligando fosfopeptídico. Todos excepto seis de estos 39 compuestos tienen unas CI50 medibles por RPS, teniendo 19 de ellos unos valores de CI50 iguales o menores a los del compuesto precursor, y teniendo 2 de ellos (Cpd188-9 y Cpd188-15) unos valores de CI50 una unidad logarítmica menor. El análisis de estos 19 compuestos ha revelado una correlación estadísticamente significativa entre las puntuaciones de farmacóforos tridimensionales y las CI50 por RPS, así como la puntuación de farmacóforos tridimensionales y las CI50 para la inhibición de la translocación de citoplásmica a nuclear mediada por ligando. Adicionalmente, tanto el Cpd188-9 como el Cpd188-15 mostraron una actividad mayor en una unidad logarítmica en la inducción de apoptosis de la línea celular leucémica humana que el Cpd188 precursor (FIG. 15). Adicionalmente, el Cpd188-38 mostró una actividad 2 unidades logarítmicas mayor que el Cpd188 precursor en la inhibición de la translocación de citoplásmica a nuclear en el ensayo de HTFM, mientras que el Cpd188-15 mostró una actividad 1 unidad logarítmica mayor que el Cpd188 precursor en la disminución de MSFE (Tabla 5). Adicionalmente, varios de los compuestos similares a 188 de segunda generación representan una mejora sustancial con respecto al Cpd188 desde un punto de vista de química de la medicina, metabolismo y biodisponibilidad. En particular, el Cpd188-9 carecía de ambos grupos carboxilo, lo que en casos particulares mejora la permeabilidad celular y/o el grupo tioéter, que está sujeto a oxidación. R2 = 0,2 P = 0,013 (j M)
T abla : m ri ^ rmin m imil r 1 2 n ración
Figure imgf000019_0001
*media ± DE
** Xu et al PLoS ONE
*** Células SUM159PT y HS578T en placa (6 pocillos por ensayo) sin o con compuesto a 1,10 o 100 j M, incubadas 3 d: esferas
contadas el día 3.
Análisis de la relación de estructura-actividad (SAR) de las sondas de la Stat3 de 2a generación. La totalidad de los 39 compuestos de segunda generación descritos anteriormente, más el propio Cpd188, son derivados de N-naft-1-ilbencensulfamida. Tras un cuidadoso análisis de sus relaciones de estructura-actividad (SAR), los inventores descubrieron que la mayoría de estos compuestos similares al Cpd188 (38 de 40: los 2 restantes son débiles y se describirán a continuación en EXP ID) se pueden dividir en tres grupos estructurales en una tendencia general de disminución de la actividad, como se muestra en la FIG. 16. Cinco compuestos del Grupo III son en realidad los precursores de los compuestos de los Grupos I y II. La adición de una variedad de grupos (el grupo -R resaltado en rojo en la estructura general del Grupo I en la FIG. 16), tal como un grupo triazol-3-il-mercapto (188-15) o cloro (188­ 10), a la posición 3 del anillo de naftilamina condujo a los compuestos del Grupo I, que son la serie más potente de sondas de la Stat3. En una realización específica, este es el contribuyente más importante a la actividad inhibidora: en los compuestos del Grupo I se encuentra un total de ocho sustituyentes en 3, que mejoran invariablemente la actividad en varios órdenes de magnitud.
La mayoría de las sondas de la Stat3 del Grupo II contienen un anillo de 5 miembros que combina los grupos 3-R y 4-OR2, tal como un furano (188-11). Sin embargo, los compuestos de este grupo son, en promedio, ~5 veces menos activos que los compuestos del Grupo I, lo que indica que, en determinados aspectos, el átomo de H del grupo 4-hidroxi (resaltado en azul en la estructura general del Grupo I en la FIG. 16) es importante, por ejemplo, está implicado en un puente de H favorable con la proteína. La falta de capacidad para formar el puente de H se atribuye a las actividades más débiles de las sondas del Grupo II, en casos particulares. Estas consideraciones subyacen a un enfoque de química de la medicina que se presenta a continuación.
EJEMPLO 8
QUÍMICA DE LA MEDICINA PARA LA SÍNTESIS DE SONDAS DE SULFAMIDA DE LA STAT3 SIMILARES A 188 DE 3a GENERACIÓN
La estructura cristalina de la Stat3 muestra que el dominio SH2 tiene un área de unión grande, muy dispersa y generalmente poco profunda, con varios valles y colinas que reconocen el ligando del péptido pY (FIG. 18). El modelado molecular basado en la estructura (acoplamiento) fue útil para identificar la contribución de la superficie de unión hidrófoba del dominio SH2 de la Stat3 como filtro de selectividad (Xu et al., 2009). Sin embargo, diferentes programas de acoplamiento dieron distintas posiciones de unión para la misma sonda sobre la superficie de unión, con unas afinidades de unión pronosticadas similares. Los inventores, por lo tanto, en realizaciones particulares, tomando como base los resultados iniciales de la SAR descritos anteriormente, usan la química tradicional de la medicina para llevar a cabo además un estudio ilustrativo integral de la relación de estructura-actividad, para optimizar la actividad, así como la selectividad, de esta novedosa clase de sondas de sulfamida de la Stat3. El compuesto 188­ 15 sirve de armazón para preparar los compuestos de nueva generación, como se muestra esquemáticamente (FIG.
16).
Adicionalmente, la química para preparar estos compuestos es sencilla con un buen rendimiento, lo que implica la reacción de un cloruro de sulfonilo con una anilina/amina, que puede obtenerse comercialmente o sintetizarse fácilmente.
Para las modificaciones propuestas que se describen a continuación, se puede consultar la FIG. 17. EXP IA. Modificación 1. Dado que casi todas las sondas de 2a generación contienen un grupo fenilsulfonilo, la primera etapa hacia la optimización de la actividad se centra en sintetizar una serie de compuestos que tienen un grupo (por ejemplo, bicíclico o tricíclico) más grande o un alquilsulfonilo. La ruta sintética general se muestra a continuación:
existen alrededor de 4.300 cloruros de sulfonilo disponibles comercialmente, entre los cuales 25, tales como los mostrados anteriormente, se seleccionan para preparar sondas. La anilina 2, que es el componente de amina del compuesto 188-10 (FIG. 16), una de las sondas más activas, se prepara fácilmente en una reacción simple de dos etapas a partir del compuesto nitro 1. Primero se pueden preparar 25 compuestos (por ejemplo) y ensayar sus actividades en unos ensayos de RPS in vitro de rendimiento rápido e in vivo de HTFM. Tomando como base los resultados del estudio de la relación de estructura-actividad, se pueden diseñar, sintetizar y analizar más compuestos de forma iterativa hasta la optimización de esta modificación.
EXP IB. Modificación 2. A continuación, se puede modificar el sustituyente 3 del anillo de naftilamina, tomando como base la estructura del compuesto 188-15, por ejemplo. Estudios previos de la SAR demostraron que este sustituyente es útil para la actividad de esta clase de sondas, en determinadas realizaciones. Sin embargo, un total de 8 grupos en esta posición con una gran diferencia de tamaño, desde un solo átomo Cl hasta un gran grupo benzotiazol-2-ilmercapto bicíclico, mostraron actividades similares. Esta característica indica que, en determinadas realizaciones, las modificaciones en esta posición deberían centrarse más en otras propiedades, tales como las interacciones electrostáticas con la proteína, como se ejemplifica a continuación. Adicionalmente, muchos de estos grupos son tioéteres, que pueden estar sujetos a una oxidación/degradación in vivo y dar lugar a un perfil farmacocinético desfavorable, en aspectos particulares. El átomo central -S- se cambia a isósteros metabólicamente más estables, tales como -CH2-, -NH- y -O-, en determinados casos. En determinados aspectos, se pueden sintetizar los siguientes compuestos para optimizar el sustituyente en 3:
La síntesis también se inicia desde 1, en determinados casos. La halogenación regioselectiva y la formilación en la posición 3 da lugar a dos compuestos, es decir, compuesto 3 con bromo o yodo y aldehído 4, que son compuestos de partida versátiles, comunes para introducir una amplia gama de sustituyentes en esta posición (por ejemplo, los enumerados anteriormente).
Además, la estructura cristalina del dominio SH2 de la Stat3 también proporciona una prueba importante de que más compuestos con diferentes propiedades electrostáticas son útiles para la caracterización. La superficie molecular electrostática de la proteína muestra dos características distintas, como se muestra en la FIG. 18. La primera es la superficie Glu638 cargada negativamente que sobresale en el centro. A continuación, es de particular interés un área cargada positivamente, compuesta por la Arg609 y la Lys591, ubicadas en el borde del dominio, que es en realidad el sitio de unión a pY (tirosina fosforilada) del receptor. Los inventores también descubrieron que la introducción de un grupo con carga negativa dirigido al sitio de unión a pY da lugar a sondas particularmente activas, en determinadas realizaciones. Por ejemplo, el estudio de acoplamiento del compuesto 5 con 3-fosfometilo (R = CH2PO32-) mostró que todos los grupos fosfonato de las 20 posiciones de acoplamiento están estrechamente agrupados entre sí y ubicados en el sitio de unión a pY, lo que indica fuertes interacciones electrostáticas y de puente de H con los restos Arg609 y Lys591 (FIG. 18).
EXP IC. Modificaciones 3 y 4. En conjunto, las modificaciones 3 y 4 ensayan los efectos de cambiar los sustituyentes en las posiciones 4, 5 y 6. El -OH en la posición 4 puede ser superior a -OR, en determinados aspectos. Se puede analizar si el átomo de H del -OH es responsable de una mejor actividad sintetizando los compuestos 6 (acilados o alquilados en la posición 5), como se muestra esquemáticamente a continuación. Adicionalmente, también pueden prepararse los compuestos 7 deshidroxi, partiendo de 3-bromonaftil-1-amina.
Con respecto a los métodos sintéticos generales para modificar las posiciones 5 y 6, primero se puede sintetizar aproximadamente una docena de estos compuestos en esta categoría y, si surgen compuestos muy activos, se pueden hacer más compuestos para optimizar la actividad para estas dos posiciones.
EXP ID. Modificación 5. Aquí se muestran los únicos dos compuestos no incluidos en el análisis de la SAR (debido a un sustituyente en 4 diferente), así como sus actividades inhibidoras contra la Stat3:
A pesar de la débil actividad, es favorable enmascarar el H polar de la sulfamida para el segundo compuesto, en determinados aspectos, lo que proporciona una ruta fácil para preparar sondas más potentes. Por lo tanto, se puede usar el siguiente método para preparar una serie de N-acil o N-alquil sulfamidas 5:
EJEMPLO 9
IDENTIFICACIÓN DE SONDAS QUÍMICAS SELECTIVAS DE LA STAT3 A PARTIR DE COMPUESTOS DE SULFAMIDA SINTETIZADOS EN EL EJEMPLO 11
Se analiza la capacidad de cada nuevo compuesto de sulfamida de inhibir la unión de la Stat3 a su ligando fosfopeptídico por RPS, y la capacidad de bloquear la translocación de citoplásmica a nuclear estimulada por la IL-6 en el ensayo de HTFM. Las sondas con una actividad en estos ensayos equivalente o mayor a la de los compuestos de 2a generación más activos se ensayan para evaluar la inhibición de la fosforilación de la Stat3 estimulada por la IL-6 y la ausencia de capacidad para inhibir la fosforilación de la Statl estimulada por el IFN-y, como se describe a continuación.
EXP IIA. Ensayo de RPS de inhibición de la unión Stat3/péptido pY. Los ensayos de unión de la Stat3 al péptido pY se realizan a 25 °C usando un biosensor BIAcore 3000, como se describe (Xu et al., 2009). Resumiendo, los dodecapéptidos derivados del EGFR biotinilados fosforilados y no fosforilados de control basados en la secuencia que rodea a Y1068 se inmovilizan en un chip sensor recubierto con estreptavidina (BIAcore Inc., Piscataway NJ). La unión de la Stat3 se realiza en tampón Tris 20 mM a pH 8 que contenía p-mercaptoetanol 2 mM a un caudal de 10 pl/min durante 1-2 minutos. Se mezclaron previamente alícuotas de la Stat3 a 500 nM con compuesto para conseguir una concentración final de 1-1.000 pM y se incubaron a 4 °C antes de inyectarlas en el chip sensor. El chip se regenera inyectando 10 pl de glicina 100 mM a pH 1,5 después de cada inyección de muestra. Se ejecuta un control (Stat3 con DMSO, pero sin compuesto) al principio y al final de cada ciclo (40 inyecciones de muestra) para garantizar que la integridad del chip sensor se mantenga durante toda la ejecución del ciclo. El promedio de los dos controles se normaliza al 100 % y se usa para evaluar el efecto de cada compuesto sobre la unión de la Stat3. Las respuestas se normalizan dividiendo el valor a los 2 minutos por la respuesta obtenida en ausencia de compuestos a los 2 minutos y multiplicando por 100. Los valores de la CI50 se determinan representando gráficamente el % de respuesta máxima en función del logaritmo de la concentración del compuesto y ajustando los puntos experimentales a un modelo de unión competitiva usando una ecuación logística de cuatro parámetros: R = Ralto - (Ralto -Rbajo)/ (1 conc/A1)A2, donde R = porcentaje de respuesta a la concentración de inhibidor, Ralto = porcentaje de respuesta sin compuesto, Rbajo= porcentaje de respuesta a la concentración de compuesto más alta, a 2 = parámetro de ajuste (pendiente) y A1 = CI50 (programa informático BIAevaluation versión 4.1).
EXP IIB. Microscopia de fluorescencia de alto rendimiento (HTFM), ensayos de inhibición de la translocación de citoplasma a núcleo. La HTFM de las células MEF/GFP-Stat3a se realiza para evaluar la capacidad de las sondas para inhibir la translocación de citoplásmica a nuclear de GFP-Stat3, como se describe (Xu et al., 2009), utilizando el sistema robótico disponible como parte del John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics en la Facultad de Medicina de la Universidad de Texas-Houston. Resumiendo, las células se siembran en placas CC3 de 96 pocillos a una densidad de 5.000 células/pocillo y se cultivan en condiciones normales hasta un 85-90 % de confluencia. Las células se tratan previamente con compuesto durante 1 hora a 37 °C y después se estimulan con IL-6 (100 ng/ml) e IL-6sR (150 ng/ml) durante 30 minutos. Las células se fijan con formaldehído al 4 % en tampón PEM (PIPES potásico 80 mM, pH 6,8, EGTA 5 mM a pH 7,0, MgCb 2 mM) durante 30 minutos a 4 °C, se inactivan en 1 mg/ml de NaBH4 (Sigma) en tampón PEM y se contratiñen durante 1 minuto en 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Sigma; 1 mg/ml) en tampón PEM. Las placas se analizan mediante una HTFM automatizada usando la plataforma Cell Lab IC Image Cytometer (IC100) y el programa informático de análisis Cytoshop Versión 2.1 (Beckman Coulter).
La translocación nuclear se cuantifica usando la fracción localizada en la medición del núcleo (FLIN). Los valores de la FLIN se normalizan restando la FLIN para las células no estimuladas y dividiendo después esta diferencia por la diferencia máxima (delta, A) en la FLIN (la FLIN en células estimuladas con IL-6/sIL-6R en ausencia de compuesto menos la FLIN de células no estimuladas). Esta relación se multiplica por 100 para obtener el porcentaje de diferencia máxima en la FLIN y se representa gráficamente en función del logaritmo de la concentración de compuesto. Se determinan la curva con mejor ajuste y el valor de la CI50 usando el modelo logístico de 4 parámetros/respuesta a la dosis/XLfit 4.2, programa informático IDBS.
EXP IIC. Ensayos de inhibición de la pStat3 y la pStat1 mediada por ligando. Las sondas Stat3 recién sintetizadas con una actividad equivalente o mayor que la del compuesto precursor 188 en los ensayos de RPS y HTFM se ensayarán para evaluar la capacidad de inhibir selectivamente la fosforilación mediada por ligando de la Stat3, como se describe (Xu et al., 2009). Resumiendo, las células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) se cultivan en placas de 6 pocillos y se tratan previamente con compuestos (0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 j M) durante 1 hora y después se estimulan en condiciones óptimas bien con interleucina-6 (IL-6; 30 ng/ml durante 30 min) para activar la Stat3, o bien interferón gamma (IFN-y; 30 ng/ml durante 30 min) para activar la Stat1. Las células se recuperan y las proteínas se extraen usando un tampón de alta salinidad, mezclado con 2X de tampón de muestra de laurilsulfato de sodio (SDS) (125 mmol/l de Tris-HCl a pH 6,8; SDS al 4 %; glicerol al 20 %; 2-mercaptoetanol al 10 %) en una relación 1:1 y después se calentaron durante 5 minutos a 100 °C. Las proteínas (20 jg ) se separan por SDS-PAGE al 7,5 % y se transfieren a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Waltham, mA) y se inmunotransfieren. Las membranas se investigan en serie con anticuerpos contra pY701 de la Stat1 o pY705 de la Stat3, seguido de anticuerpos contra la Stat1 o la Stat3 (Transduction labs, Lexington, KY) y después un anticuerpo contra la actina p (Abcam, Cambridge, MA). Las membranas se desprenden entre cada investigación de anticuerpos usando tampón de desprendimiento de inmunoelectrotransferencia Western Restore™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) según las instrucciones del fabricante. Se usa anti-IgG de ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante como anticuerpo secundario (Invitrogen Carlsbad, CA) y las membranas se eluyen con un sistema de detección de quimioluminiscencia potenciada (ECL) (Amersham Life Sciences Inc.; Arlington Heights, IL.). Las intensidades de las bandas se cuantifican por densitometría. El valor de cada banda de la pStat3 se divide por su correspondiente intensidad de banda de la Stat3 total; los resultados se normalizan al valor de control tratado con DMSO. Este valor se representó gráficamente en función del logaritmo de la concentración de compuesto. La curva con mejor ajuste se determina usando un modelo logístico de 4 parámetros/respuesta a la dosis/XLfit 4.2, programa informático IDBS, y se usó para calcular el valor de la CI50.
EXP IID. Modelado molecular de las interacciones sonda-Stat3. Los resultados del modelado de la unión de la sonda de primera generación a los dominios SH2 de la Stat3 con respecto a la Stat1 sugirieron que la base de la selectividad experimental de las sondas para la Stat3 con respecto a la Stat1 se basaba en la capacidad de las sondas de tener una mayor interacción con el sitio de unión hidrófobo dentro de la cavidad de unión del péptido pY de la Stat3 en comparación con la Stat1. Por lo tanto, el sitio de unión hidrófobo sirvió como filtro de selectividad. Para ensayar si este sigue siendo el caso de las sondas de 3a generación recién sintetizadas, se pueden usar 2 programas de acoplamiento complementarios GLIDE (Schrodinger) e ICM (MolSoft) para determinar la configuración de acoplamiento de energía más baja de cada sonda dentro del dominio de unión al péptido pY del dominio SH2 de la Stat3 y de la Stat1. Se pueden revisar los modelos informáticos de cada sonda en un complejo con el dominio SH2 de la Stat3 con respecto a la Stat1 y, en particular, comparar las energías de van der Waals y determinar si son equivalentes para su interacción con el dominio SH2 de la Stat3 con respecto al dominio SH2 de la Stat1. Fue este cálculo el que determinó la selectividad de las sondas de 1a generación para a Stat3 con respecto a la Stat1. En particular, los cálculos de las energías de van der Waals implicaban restos que forman el sitio de unión hidrófobo (W623, Q635, V637, Y640 e Y657) como críticos para esta selectividad.
En realizaciones específicas de la invención, hay una identificación de las sondas con una actividad de una unidad logarítmica o mayor que las sondas de 2a generación en ensayos de SPR, HTFM y pStat3. Adicionalmente, en determinados aspectos, algunas de las sondas de 3a generación más activas que surgen de este análisis son selectivas para la Stat3 con respecto a la Stat1, tomando como base su mayor interacción con el sitio de unión hidrófobo dentro de la cavidad de unión al péptido pY del SH2 de la Stat3 con respecto a la Stat1.
EJEMPLO 11
EL INHIBIDOR DE LA STAT3 COMO TRATAMIENTO DE LA FIBROSIS DÉRMICA
Las biopsias de piel del modelo cutáneo con bleomicina subcutánea en ratones naturales y en sujetos humanos (control sano con respecto a esclerodermia) se ilustran en la FIG. 19. La esclerodermia es una enfermedad autoinmunitaria que se manifiesta como una fibrosis en la piel y en los órganos internos. Tanto la piel con fibrosis por la bleomicina inyectada como la piel con esclerodermia demuestran una mayor tinción para la Stat3 fosforilada (activa), lo que indica la activación de la señalización de la Stat3 en estos tejidos fibróticos.
La FIG. 20 ilustra un diseño de estudio ilustrativo que usa un modelo de bleomicina subcutánea (SQ) para la fibrosis cutánea. En un modelo básico, se administra bleomicina a ratones naturales (C57/B16) a través de una inyección subcutánea 5 días a la semana durante un total de 4 semanas. Se usa PBS como control para la bleomicina. Se evalúa la fibrosis en la biopsia de piel el día 28. La fibrosis se evalúa mediante una histología (tinción con hematoxilina y eosina), donde el espesor dérmico se cuantifica como la distancia lineal media desde la unión dermis-epidermis hasta la capa muscular subQ. También se realiza la tinción tricrómica de Masson para teñir de azul el colágeno. Se realiza una inmunohistoquímica para la actina del músculo liso alfa, el marcador de los miofibroblastos (la célula que fabrica el colágeno durante el proceso de fibrosis). Se evalúan los criterios de valoración futuros, incluyendo el contenido de colágeno. Para ilustrar que el inhibidor de la STAT3 es una terapia útil al menos para la fibrosis dérmica, se administró un ejemplo de inhibidor de la STAT3 (C188-9) por vía intraperitoneal diariamente, comenzando la semana 3 del modelo con bleomicina. Se usó DMSO como control para el inhibidor de la STAT3.
Como se muestra en la FIG. 21, los ratones naturales a los que se les administró bleomicina (BLM, panel central) tienen un mayor espesor dérmico, que disminuye cuando se les administra el inhibidor de la STAT3 (panel derecho). Las imágenes son imágenes representativas de 1 ratón por grupo, con un total de 5 ratones por grupo en el estudio.
La FIG. 22 proporciona la cuantificación de las imágenes de la FIG. 22, y se promedian las 5 de cada grupo. No hubo diferencias en el espesor dérmico entre los ratones a los que se les inyectó PBS con el tratamiento con DMSO o con el inhibidor de la STAT3. Sin embargo, la bleomicina aumenta el espesor dérmico, que está reducido en el grupo con Bleo/inhibidor de la STAT3.
Los ratones naturales a los que se les administró bleomicina (BLM, panel central) tienen un mayor contenido de colágeno (azul en la tinción tricrómica de Masson), que disminuye cuando se les administra el inhibidor de la STAT3 (panel derecho) (FIG. 23). Las imágenes son imágenes representativas de 1 ratón por grupo, con un total de 5 ratones por grupo en el estudio.
En la FIG. 24, los ratones naturales a los que se les ha administrado bleomicina (BLM, panel central) presentan un aumento en la tinción de la actina del músculo liso alfa (rosa brillante), que disminuye cuando se les administra el inhibidor de la STAT3 (panel derecho). Las imágenes son imágenes representativas de 1 ratón por grupo, con un total de 5 ratones por grupo en el experimento. La aSMA tiñe los miofibroblastos; por lo tanto, el inhibidor de la STAT3 disminuye la fibrosis y la acumulación de miofibroblastos en el modelo con bleomicina subcutánea.
La FIG. 25 muestra el efecto del Cpd188-9 sobre la producción de fibroblastos dérmicos de colágeno de tipo I (Col1a1), la actina del músculo liso (aSMA) y el factor de transcripción Snail. Col1a1, aSMA y Snail son genes importantes implicados en el desarrollo de la fibrosis de la piel y de otros órganos. Durante la fibrosis, el TGFbeta y/o la IL-6 pueden aumentar la expresión de estos genes en los fibroblastos dérmicos y contribuir al desarrollo de la fibrosis tisular. Como se observa en la FIG. 25, el CPD188-9 bloquea el aumento en la expresión del ARNm de Col1a1, aSMA y Snail inducido por el TGF-beta o la IL6 (más el receptor de la IL6) en los fibroblastos dérmicos de ratón. Estos datos demuestran que el CPD188-9 es antifibrótico in vitro y confirman y amplían los hallazgos in vivo en el modelo de fibrosis dérmica.
La FIG. 26 proporciona una evaluación cuantitativa por PCR en tiempo real de la expresión génica fibrótica en la piel de ratones naturales en el modelo con bleomicina subcutánea tratados con el control (DMSO) o con el Cpd188-9 (inhibidor ilustrativo de la Stat3). Como se esperaba, la inyección subcutánea de bleomicina durante 28 días aumentó la expresión dérmica de los transcritos de actina de músculo liso (Acta2) y de colágeno de tipo I (Col1a1 y Col1a2). Estos aumentos se evitaron con el tratamiento intraperitoneal de los ratones con el Cpd188-9 desde los días 14-28 del modelo de 4 semanas. N = 5 ratones por grupo.
REFERENCIAS
Las citas completas de las referencias citadas en el presente documento se proporcionan en la siguiente lista.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto para usar en un método de tratamiento, prevenir o reducir el riesgo o la gravedad de la fibrosis de la piel, corazón, intestino, páncreas, articulaciones, hígado, retroperitoneo o riñones en un individuo que lo necesite, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en N-(1',2-dihidroxi-1,2'-binaftalen-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, N-(3,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, N-(4,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, N-(5,1-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida, N-(6,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, N-(7,1'-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4'-il)-4-metoxi-bencensulfonamida, N-(8,1-dihidroxi-[1,2']binaftalenil-4-il)-4-metoxibencensulfonamida y 4-bromo-N-(1,6'-dihidroxi-[2,2']binaftalenil-4-il)-bencensulfonamida, o una mezcla o una sal de las mismas.
2. El compuesto para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho método comprende proporcionar el compuesto a dicho individuo en dosis múltiples, en donde preferentemente las dosis múltiples están separadas por horas, días o semanas.
3. El compuesto para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho individuo recibe una terapia adicional para la fibrosis.
4. El compuesto para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto inhibe la Stat3, la Stat1 o ambas.
5. El compuesto para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho método comprende además el diagnóstico de la fibrosis.
6. El compuesto para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en dicho método el compuesto se administra por vía intravenosa, por vía intradérmica, por vía intraarterial, por vía intraperitoneal, por vía intralesional, por vía intracraneal, por vía intraarticular, por vía intraprostática, por vía intrapleural, por vía intratraqueal, por vía intranasal, por vía intravítrea, por vía intravaginal, por vía intrarrectal, por vía tópica, por vía intratumoral, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía subcutánea, por vía subconjuntiva, por vía intravesicular, por vía mucosa, por vía intrapericárdica, por vía intraumbilical, por vía intraocular, por vía oral, por vía tópica, por vía local, por inyección, por infusión, por infusión continua, por perfusión localizada, mediante un catéter, mediante un lavado, en composiciones lipídicas, en composiciones de liposomas o como un aerosol.
7. El compuesto para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en dicho método el compuesto se administra mediante una inyección.
8. El compuesto para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en dicho método el compuesto se administra por vía subcutánea.
9. El compuesto para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en dicho método el compuesto se administra por vía tópica.
10. El compuesto para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en dicho método el compuesto se administra por vía sistémica.
11. El compuesto para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en dicho método el compuesto se administra localmente.
12. El compuesto para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho individuo no tiene cáncer.
13. El compuesto para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde no se sospecha que dicho individuo padezca cáncer.
14. El compuesto para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha fibrosis es esclerodermia.
15. El compuesto para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto es N-(1',2-dihidroxi-1,2'-binaftalen-4'-il)-4-metoxibencensulfonamida o una sal de la misma.
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