CN100535117C - 百草枯抗性基因及维管束和毛状体特异性启动子 - Google Patents

Abstract

提供了百草枯抗性基因以及提供了维管束和毛状体特异启动子。通过鉴定和分析鼠耳芥基因而分离了百草枯抗性基因以及维管束和毛状体特异启动子。

Description

百草枯抗性基因及维管束和毛状体特异性启动子

发明背景

发明领域

本发明涉及赋予百草枯抗性的百草枯抗性基因以及维管束和毛状体特异性启动子。

背景技术

植物经常暴露于多种环境压力，包括高温和低温、干旱、强光、盐、大气污染气体、致病性微生物等。因此，如果开发可在这些环境压力下充分生长的有用植物如作物，在由于环境压力甚至在当前不能生长作物等的地区进行粮食生产是可能的，并且未来预测的严重粮食危机的可能性将会增加。因此，在全球范围，对这种环境压力具有提高抗性的植物的生产正在进行中。例如，通过遗传重组技术，已产生了赋予寒冷抗性(Nature，356，710-703，1992；Plant Physiol.，105，601-605，1994)、干旱抗性(Plant Physiol.，107，125-130，1995；Nature，379，683-684，1996；Nature Biotech.，17，287-291，1999)、盐抗性(Science，259，508-510，1993；Biotechnology，14，177-180，1996；Plant J.，12，133-142，1997)、大气污染抗性(Plant CellPhysiol.，34，129-135，1993；Biotechnology，12，165-168，1994)、病害抗性(化学和生物体(Chemistry and Organisms)，37，295-305，385-392，1999)等的植物。此外，通过遗传重组技术赋予对农业化学品抗性的一些植物实际上也在使用(Nature，317，741-744，1985；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，391-395，1988；EMBO J.，6，2513-2518，1987；EMBO J.，7，1241-1248，1988)。

这些环境压力与体内产生活性氧类(超氧化物自由基(O₂ ^-)、过氧化氢(H₂O₂)、羟基自由基(OH^-)密切相关。活性氧类通过呼吸作用、光合作用、环境压力等产生，并通过对蛋白质、核酸、膜结构等的过度氧化而对细胞产生致命伤害。也报道，通过遗传重组技术产生的活性氧抗性植物显示对上述环境压力的抗性增强(Plant Physiol.，111，1177-1181，1996；FEBS Letters，428，47-51，1998)。

为产生活性氧抗性植物，主要采用将清除活性氧类的酶(超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶等)的基因导入植物的方法。

百草枯是非选择性和强效的除草剂，通过在光系统中连续产生活性氧，它可杀死所有植物。因此，百草枯抗性可用作对活性氧抗性的指标，并分析植物中关于百草枯抗性的机制(Pestic.Biochem.Physiol.，26，22-28，1986；Theor.Appl.Genet.75，850-856，1988；以及Plant Physiol.，91，1174-1178，1989)。

同时，已公开了细胞凋亡抑制基因(日本特开平10-309142、特开2000-23583和特开2002-300822)、编码与醛糖还原酶同源的蛋白质的基因(日本特表2001-523466)以及编码铁结合蛋白质(铁蛋白)的基因(日本特表2001-519671)为赋予百草枯抗性的基因。此外，在日本特开2002-281979和2001-95585中，公开了来源于百草枯抗性愈伤组织的过氧化物酶为可赋予百草枯抗性的基因。

据认为，如果分离对百草枯赋予强大抗性的百草枯抗性基因，将有利于开发对活性氧具有高抗性的植物，其中这些活性氧在多种环境压力条件下(高温和低温、干旱、强光、盐、大气污染气体、致病性微生物等)产生。然而，最近显示，活性氧作为植物调节生长和压力反应的分子，扮演了重要的角色。因此，为避免影响重要特征如作物产量，增加植物对压力如百草枯的抗性同时不影响植物依赖于活性氧的生长和生理防御机制是极为重要的。

维管束是通过羊齿类和种子植物如茎、叶和根的每一器官分化成的束中组织系统。木质部和韧皮部是维管束的组成部分，并且它们作为导管运输水和内部物质至植物体。此外，在维管束中发现了包括维管束间形成层和维管束内形成层的维管束形成层。维管束形成层是细胞增殖的位置，因此是植物生长极为重要的位置。因此，维管束是植物有关运输水份和内部物质以及细胞增殖的场所。因此，如果可将参与运输水份或内部物质或细胞增殖的基因导入植物，并在维管束中特异性表达，这将使植物调节水份或内部物质的运输或细胞增殖成为可能。

另外，从植物病害的观点看，维管束是感染茄科植物的枯萎病真菌增殖和转移的位置。当植物病毒感染植物时，植物病毒迁移长距离，从一片叶子移至其上面的叶子，因此，维管束也是导致植物全株感染的迁移位置。因此，如果可将参与真菌或植物病毒增殖或迁移的基因导入植物，并在维管束中特异性表达，植物可得到保护而免于真菌或植物病毒的感染。

毛状体是发现于植物体的叶、茎、萼片等表面存在的毛状突起物。毛状体参与植物体表面的分泌和排泄。例如，据报道，当植物暴露于重金属(镉)压力时，叶表面的毛状体数量增加，并且包含镉或钙的晶体粘附于叶表面，换言之，通过毛状体排泄镉(Planta，213(1)，45-50，2001年5月)。毛状体也是侵入植物的丝状真菌、细菌、昆虫等最初接触的位置。此外，作为对病害和昆虫伤害的防御，例如具有抗微生物活性和阻碍摄入的液体从蔷微科玫瑰的腺毛或腺状突起物中分泌。因此，如果将与重金属等排泄有关的基因、或与分泌具有抗微生物活性或阻碍摄入的液体有关的基因作为外源基因导入植物并在毛状体中特导表达，则重金属可有效地从植物中排泄，或植物可有效地得到保护而免于丝状真菌、细菌或昆虫侵入植物。

如上所述，希望特异性基因可在维管束或毛状体中进行表达。作为进行特异性基因表达的方法，可考虑涉及到使用在维管束或毛状体中显示特异启动子活性的启动子的方法。然而，目前尚未在维管束和毛状体中鉴定出均特异性显示启动子活性的启动子。

发明概述

本发明的主题是，通过确认和分析鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)的基因，提供例如百草枯抗性基因以及提供维管束和毛状体特异性启动子。

本发明通过提供下述几点完成上述主题：

(1)编码下述(a)或(b)的蛋白质的基因：

(a)由SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)与SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列相比，由具有替代、缺失或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、且赋予百草枯抗性的蛋白质；

(2)由上述(1)的基因编码的赋予百草枯抗性的蛋白质；

(3)包含上述(1)的基因的重组载体；

(4)根据(3)的重组载体，其中重组载体还包含外源基因或外源DNA片段；

(5)具有上述(3)或(4)的重组载体的转化体；

(6)具有上述(3)或(4)的重组载体、并具有百草枯抗性的植物体；

(7)筛选转基因植物的方法，包括将上述(4)的重组载体导入植物，并以百草枯抗性指标为基础筛选转基因植物；

(8)包含下述(a)、(b)或(c)的DNA的维管束和毛状体特异启动子：

(a)由SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列组成的DNA；

(b)与SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列相比，由具有替代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并作为维管束和毛状体特异启动子发挥功能的DNA；以及

(c)在严谨条件下，与由SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列组成的DNA杂交、并作为维管束和毛状体特异启动子发挥功能的DNA；

(9)包含上述(8)的维管束和毛状体特异启动子的重组载体；

(10)根据(9)的重组载体，其中重组载体包含维管束和毛状体特异启动子下游的外源基因或外源DNA片段；

(11)根据(10)的重组载体，其中外源基因是上述(1)所述的基因；以及

(12)具有上述(9)-(11)中任何一项所述的重组载体的转基因植物。

附图简述

图1.是来源于AtMVR基因转化体的cDNA的电泳照片；

图2A.是显示AtMVR基因转化体和非转化体在图2B和2C中的位置简图。图2B是显示AtMVR基因转化体和非转化体在无百草枯的1/2MS培养基中生长的照片。图2C是显示AtMVR基因转化体和非转化体在含有百草枯的1/2MS培养基中生长的照片。

图3.是包含GUS基因和AtMVR启动子的完整转化体用GUS通过组织化学染色的显微照片；

图4.是包含GUS基因和AtMVR启动子的转化体的叶用GUS通过组织化学染色的显微照片；

图5.是包含GUS基因和AtMVR启动子的转化体的根用GUS通过组织化学染色的显微照片；

优选实施方案的详述

下面详细描述本发明。

根据本发明的基因是编码下述(a)或(b)的蛋白质的基因：

(a)由SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列组成的蛋白质，以及

(b)相对于SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列，由具有替代、缺失或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、且赋予百草枯抗性的蛋白质；

编码上述(a)所述的蛋白质的基因是编码由SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列组成的赋予百草枯抗性的蛋白质的基因(以后称其为AtMVR基因)。

本发明人基于AtMVR基因的核苷酸序列，在包括鼠耳芥的全部核苷酸序列的数据库(例如GenBank、EMBL、DDBJ、tair：Arabidopsis信息源)中进行搜索，并在鼠耳芥基因组发现13个与AtMVR基因同源的基因(AtMVR 3-1至AtMVR 3-13)。任何一个AtMVR同源基因的核苷酸序列和通过相关AtMVR同源基因编码的预测氨基酸序列通过下面表1中所列出的序列号表示。表1也列出AtMVR和每一AtMVR同源基因之间的同源性分析结果。利用BLAST P，在氨基酸水平上实施同源性分析。氨基酸的分类基于其侧链的化学特征。在BLOSUM62氨基酸替代矩阵(Proc.Natl.Acad.Sci.，89，10915-10919，1992)中，氨基酸分为：带有巯基的氨基酸(C)；低分子量的亲水氨基酸(S，T，P，A，G)；酸性氨基酸(N，D，E，Q)；碱性氨基酸(H，R，K)；低分子量疏水氨基酸(M，I，L，V)和芳香族氨基酸(F，Y，W)。在表1中，术语“同一性”在氨基酸方面指100％一致性，术语“阳性率”指当在BLOSUM62氨基酸替代矩阵中具有阳性分值的氨基酸添加至那些具有100％一致性的氨基酸时的数值(见Bioinfomatics(日本)，Okazaki Y.& Bono H.编辑(Medical Science International出版)。

[表1]

AtMVR同源基因的名称	核苷酸序列	氨基酸序列	同一性(％)	阳性率(％)
					AtMVR3-1	SEQ ID NO：4	SEQ ID NO：5	57	70
AtMVR3-2	SEQ ID NO：6	SEQ ID NO：7	55	69
					AtMVR3-3	SEQ ID NO：8	SEQ ID NO：9	39	56
AtMVR3-4	SEQ ID NO：10	SEQ ID NO：11	39	55
					AtMVR3-5	SEQ ID NO：12	SEQ ID NO：13	37	54
AtMVR3-6	SEQ ID NO：14	SEQ ID NO：15	36	52
					AtMVR3-7	SEQ ID NO：16	SEQ ID NO：17	34	52
AtMVR3-8	SEQ ID NO：18	SEQ ID NO：19	34	51
					AtMVR3-9	SEQ ID NO：20	SEQ ID NO：21	37	58
AtMVR3-10	SEQ ID NO：22	SEQ ID NO：23	25	44
					AtMVR3-11	SEQ ID NO：24	SEQ ID NO：25	33<sup>＊</sup>	51<sup>＊</sup>
AtMVR3-12	SEQ ID NO：26	SEQ ID NO：27	25	41
					AtMVR3-13	SEQ ID NO：28	SEQ ID NO：29	22	41

^＊与AtMVR3-11的比较显示的是与AtMVR3-11部分序列比较的同源性结果。

如表1所示，AtMVR与13个AtMVR同源基因的同源性在同一性上为22-57％，阳性率上为41-70％。这些AtMVR同源基因认为与AtMVR基因一样，可赋予百草枯抗性。

此外，AtMVR基因与衰老相关蛋白质DSA5(GenBank登录号AF082030)(Plant Molecular Biology 40，237-248，1999)具有同源性。利用BLAST X的同源性分析结果显示，在氨基酸水平上，AtMVR基因编码的蛋白质与DSA5编码的蛋白质具有89％的同一性。据报道，DSA5是百合花花瓣衰老时表达的基因(萱草属(Hemerocallis)杂交品系)(PlantMolecular Biology 40，237-248，1999)。然而，由于DSA5编码的蛋白质与任何公知的蛋白质无同源性，仍不清楚该蛋白质具有何种功能。因此，AtMVR基因是赋予百草枯抗性的新基因。

如此处所使用的，术语“百草枯抗性”指对百草枯具有抗性。更为特别地，术语“百草枯抗性植物”指，为从百草枯获得给定的效果，比非抗性植物需要更大量百草枯的植物。百草枯是非选择的和强效的除草剂，百草枯是通过在光化学系统中连续产生活性氧而杀死所有植物。通过检查导入该基因的转化体是否可在百草枯中生长，可确定AtMVR基因是否为可赋予百草枯抗性的百草枯抗性基因。

编码上述(b)所述蛋白质的基因是编码这些蛋白质的基因，这些蛋白质的序列与SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列比较，由具有替代、缺失或添加一个或多个氨基酸(例如1-10或1-5个)的氨基酸序列组成、并且赋予百草枯抗性。

一旦确定本发明基因的核苷酸序列，然后通过化学合成、或使用已克隆的克隆作为模板进行聚合酶链反应(此后指“PCR”)、或使用具有所述核苷酸序列的DNA片段作为探针进行杂交，从而获得根据本发明的基因是可能的。此外，可通过如定点诱变技术而合成与突变前具有相同功能的本发明基因的突变体。

在根据本发明的基因中引入突变的方法的实例包括公知的方法，如Kunkel法或缺口双链体法或与根据这些方法的方法。例如，引入突变可利用通过定点诱变引入突变的试剂盒(例如Mutant-K(TAKARA，Inc.制造)、或Mutant-G(TAKARA，Inc制造)、或利用TAKARA.Inc制造的LA PCR体外诱变系列试剂盒进行。

根据本发明的赋予百草枯抗性的蛋白质是根据本发明的基因编码的蛋白质。例如，将根据本发明的基因整合入来源于大肠杆菌等的载体，然后用获得的重组载体转化大肠杆菌。此后，通过提取大肠杆菌中合成的蛋白质可获得根据本发明的蛋白质。

此外，根据本发明的重组载体是包含根据本发明的基因的重组载体。通过将根据本发明的基因插入合适的载体可获得根据本发明的重组载体。用于插入根据本发明的基因的载体不受到特别限制，只要该载体可在宿主中复制，并且其实例包括质粒、穿梭载体和辅助质粒。另外，当载体自身不能复制时，可使用通过如插入宿主染色体而可复制的DNA片段。

质粒DNA的实例包括来源于大肠杆菌的质粒(pBI221等，例如，pET系统如pET30b、pBR系统如pBR322和pBR325、pUC系统如pUC118、pUC119、pUC18和pUC19、pBluescript和pBI221)、来源于枯草芽胞杆菌的质粒(例如pUB110和pTP5)、来源于根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的二元质粒(例如来源于pBIN19、pBI101或pBI121的pBI系统)、来源于酵母的质粒(例如YEp系统如YEp13、或YCp系统如YCp50)等。噬菌体DNA的实例包括λ噬菌体(Charon 4A，Charon 21A，EMBL3，EMBL4，λgt10，λgt11，λZAP等)。此外，也可使用动物病毒载体如逆转录病毒或痘苗病毒载体、植物病毒载体如花椰菜花叶病毒、或昆虫病毒载体如杆状病毒载体。

为将根据本发明的基因插入载体，使用这种方法，该方法首先将根据本发明的基因的cDNA利用合适的限制性酶切割，然后插入合适载体DNA的限制性酶位点或多克隆位点，并连入载体。此外，还可使用这种方法，该方法中分别提供载体和根据本发明基因cDNA的一部分的同源区，并且载体和cDNA通过利用PCR等体外方法或利用酵母等体内方法连接。

根据本发明的重组载体也可包括除了本发明基因外的外源基因或外源DNA片段。将外源基因或外源DNA片段插入载体的方法与将根据本发明的DNA片段插入载体一样。任何基因或DNA片段可作为外源基因或外源DNA片段。因此，根据本发明的基因可作为选择性标志基因以显示百草枯抗性，例如，如卡那霉素或潮霉素等抗生素抗性基因一样。

根据本发明的转化体是具有根据本发明的重组载体的转化体。通过将根据本发明的重组载体导入宿主可获得根据本发明的转化体。宿主不特别受到限制，只要它可表达根据本发明的基因，然而植物是优选的。当宿主是植物时，按下述方法获得转基因植物是可能的。

在本发明中，欲转化的“植物”可以是任何一种完整的植物、植物器官(例如叶、花瓣、茎、根或种子)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织或木质部)或植物培养细胞。在转化中可使用的植物的实例包括但不限制于属于禾本科(Poaceae)、芸苔科(Brassicaceae)、茄科(Solanaceae)或豆科(Leguminosae)植物(见下面)。

禾本科：稻(Oryza sativa)，玉蜀黍(Zea mays)

芸苔科：鼠耳芥

茄科：烟草(Nicotiana tabacum)

豆科：大豆(Glycine max)

通过常规转化方法如，例如电穿孔法、农杆菌法、粒子枪法或PEG法，可将根据本发明的重组载体导入植物。

例如，当使用电穿孔法时，通过利用装备有脉冲控制器的电穿孔仪器，在电压500-1600伏特、25-1000微法拉第、20-30毫秒的条件下，将根据本发明的重组载体导入宿主。

当使用粒子枪方法时，可使用未经任何处理的完整植物、植物器官或植物组织自身，可制备其切片并然后使用它，或制备原生质体并使用它。然后利用基因转移设备(例如Bio-Rad Inc制造的PDS-1000/He)处理已制备的样品。虽然处理条件随着使用的植物或样品而不同，但处理一般在压力约450-2000psi和距离约3-12厘米的条件下实施。

使用农杆菌Ti质粒或Ri质粒的方法是利用了以下特征，当属于农杆菌属的细菌感染植物时，细菌所拥有的质粒DNA的一部分转移至植物的基因组。因此，这种方法可用于将根据本发明的基因导入植物宿主。在属于农杆菌属的细菌中，当根癌农杆菌感染植物时，它可导致形成称为“冠瘿”的肿瘤。此外，当发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物时，它刺激产生毛细根。这些是通过将Ti质粒或Ri质粒中称为“T-DNA(转移DNA)区”的区域在感染时转移至植物，并整合进植物的基因组而导致的。因此，首先将欲整合进植物基因组的DNA插入Ti质粒或Ri质粒的T-DNA区，然后通过利用农杆菌属的细菌感染植物宿主，将DNA整合进植物基因组。

将农杆菌属的细菌转化植物宿主的方法的实例包括上述的电穿孔法、基因枪和PEG方法，以及植物原位(in planta)转化法。植株原位转化法的实例包括直接农杆菌接种法和渗入法。

可使用转化时获得的肿瘤组织或芽、毛细根等，而不对细胞培养物、组织培养物或器官培养物作任何处理。备选的是，利用常规植物组织培养法，通过施用合适浓度的植物激素(生长素、促细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯、油菜素内酯等)，它可在植物体中再生。

通过使用植物病毒作为载体，也可将根据本发明的基因导入植物。可使用的植物病毒的实例包括花椰菜花叶病毒。首先，将病毒基因组插入来源于大肠杆菌等的载体，以产生重组体，然后将根据本发明的基因插入病毒基因组。随后，利用限制性酶将按这种方法修饰的病毒基因组切下，然后通过将病毒基因组接种植物宿主，而将根据本发明的基因导入植物宿主。

除了按上面所述导入植物宿主中外，也可将根据本发明的重组载体导入细菌，这些细菌包括属于埃希氏菌属如大肠杆菌、芽胞杆菌属如枯草芽胞杆菌或假单胞菌属如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、以及酵母如酿酒酵母和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、动物细胞如COS细胞或CHO细胞、和昆虫细胞如Sf9。当使用细菌如大肠杆菌或酵母等作为宿主时，优选的是根据本发明的重组载体可在细菌中自主复制，并且该重组载体包含启动子、核糖体结合序列、转录终止序列和根据本发明的基因。它也可包含调节启动子的基因。

将根据本发明的重组载体导入细菌的方法不受到特别限制，只要它是可将DNA导入细菌的方法，例如可提到的是使用钙离子的方法或电穿孔法。

将根据本发明的重组载体导入酵母的方法不受到特别限制，只要它是可将DNA导入酵母的方法，例如可提到的是电穿孔法、原生质体法和醋酸锂法。

当使用动物细胞作为宿主时，可使用猴细胞COS-7、Vero、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、小鼠L-细胞等。将根据本发明的重组载体导入动物细胞的方法不受到特别限制，只要它是可将DNA导入动物细胞的方法，例如可提到的是电穿孔法、磷酸钙法和脂质体法。

当使用昆虫细胞作为宿主时，可使用Sf9细胞等。将根据本发明的重组载体导入昆虫细胞的方法不受到特别限制，只要它是可将DNA导入昆虫细胞的方法，例如可提到的是磷酸钙法、脂质体法和电穿孔法。

通过使用PCR法、Southern杂交方法、Northern杂交方法等，可确定根据本发明的基因是否已整合进宿主。例如，从转化体制备DNA和设计DNA特异引物后，可实施PCR。下一步，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳等，然后将其产物用溴化乙锭、SYBRGreen溶液等染色。此后，通过检测扩增产物为单一条带，确定转化是否已发生。也可使用已预先标记荧光染料等的引物实施PCR后检测扩增产物。另外，可应用将扩增产物结合至微孔板等的固相上以通过荧光或酶反应等确认扩增产物的方法。

根据本发明的植物体是具有包含本发明基因的重组载体并具有百草枯抗性的植物体。如此处所使用的，术语“植物体”指用包含根据本发明的基因的重组载体转化的完整植物。通过将上述重组载体导入植物细胞等，并从获得的转基因植物细胞中再生转基因植物体，可获得根据本发明的植物体。作为再生方法，可应用这种方法，该方法将愈伤组织形成中的转化细胞转移至培养基，并允许不定胚形成以获得完全植物体，其中该培养基已改变了激素的类型和浓度，并允许培养。使用的培养基的实例包括LS培养基和MS培养基。通过类似于上述方法的方法，可将重组载体导入植物细胞等。

在根据本发明的植物体中，本发明基因编码的赋予百草枯抗性的蛋白质在完整植物体中过量表达。因此，根据本发明的植物体具有对百草枯的抗性。

筛选根据本发明的转基因植物的方法是将根据本发明的重组载体导入植物，并以百草枯抗性作为指标来筛选转基因植物的方法。转化可通过应用根据本发明的基因为选择性标记基因以显示百草枯抗性而得到证实。筛选方法的实例包括将通过根据本发明的重组载体转化的植物在含百草枯的培养基中生长，并且基于植物的生、死和生长变化而实施筛选的方法。用于筛选的百草枯的浓度随植物的种类和大小等而不同，然而，例如当将鼠耳芥作为宿主，百草枯在培养基中的浓度优选为0.1-3.0μM，更为优选的为1.0-3.0μM，以及最为优选的为3.0μM。非转基因植物，即野生型植物，发展为萎黄病并死于含百草枯的培养基中。相反，用根据本发明的重组载体转化的植物甚至在含百草枯的培养基中保持绿色。因此，在非转基因植物和用根据本发明的重组载体转化的植物之间，可证实它们在含百草枯培养基中生长的明显差异。

当应用抗生素抗性或除草剂抗性作为指标时，因为在植物之间存在敏感性差异，在筛选时可观察到假阳性。相反，百草枯是非选择性并为强效的除草剂，百草枯可杀死所有植物。因此，在筛选根据本发明的转基因植物的方法中，在筛选时不会观察到假阳性。此外，根据筛选本发明转植物基因的方法，在生长的早期可有效确定抗性。

根据本发明的启动子是包含下述(a)、(b)或(c)的DNA的维管束和毛状体特异性启动子：

(a)由SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列组成的DNA；

(b)相对于SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列，由具有替代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成，并可作为维管束和毛状体特异启动子发挥功能的DNA；以及

(c)在严谨条件下，与由SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列组成并可作为维管束和毛状体特异启动子发挥功能的DNA杂交。

上述(a)所述的维管束和毛状体特异启动子是发现于AtMVR基因5’上游非翻译区的维管束和毛状体特异启动子，由SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列组成。(a)中所述的启动子可通过在含有鼠耳芥完整核苷酸序列的数据库中，基于AtMVR基因5’上游的约3000个核苷酸进行搜索。

如此处所用，术语“维管束和毛状体特异性启动子”指显示特异于植物维管束和毛状体活性的启动子。术语“维管束”指通过羊齿类和种子植物的每一器官如茎、叶和根中分化成的束中组织系统。木质部和韧皮部是维管束的组成部分，并且它们作为导管运输水和内部物质至植物体而发挥功能。同时，术语“毛状体”指存在于植物体的叶、茎或萼片等表面的毛状突起物。毛状体参与从植物体表面的分泌和排泄。

可根据常规方法确定维管束和毛状体特异启动子的活性。例如，构建含有可操作地连接至启动子下游的报告基因的表达载体。下一步，用表达载体转化合适的植物。然后，将获得的转化体在预定的条件下培养，并且报告基因在维管束和毛状体中的表达量可在mRNA或蛋白质水平上测定，以在相应条件下测量启动子活性。此外，当报告基因是β-葡糖醛酸酶(GUS)时，可通过观察表达的GUS导致的组织化学染色而确定维管束和毛状体中启动子活性的特异性。

例如，作为使用GUS进行组织化学染色的方法，提到将含5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)作为GUS底物的反应混合物加至已导入GUS基因的转化体的组织。当GUS基因得到表达时，X-Gluc得到脱酯化以产生3-吲哚氧基衍生物单体，并且该单体与空气氧化聚合形成蓝色靛蓝颜料。在转化的细胞或组织中，该蓝色颜料聚集显示蓝色。

此外，AtMVR基因5’上游特异的非翻译区可易于通过实施PCR而获得，其中该PCR以从鼠耳芥提取的基因组作为模板，使用与该区域两端核苷酸序列互补的引物。

根据本发明的启动子可以是SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列，更为特别的是，5’上游完整的非翻译区，或该启动子可以是由SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列组成的DNA的一部分，只要它显示维管束和毛状体特异启动子的功能。

与SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列比较，上述(b)中所述的维管束和毛状体特异启动子由具有替代、缺失或添加一个或多个核苷酸(例如1-10或1-5个)、并发挥维管束和毛状体特异启动子功能的核苷酸序列组成。

上述(c)中所述的维管束和毛状体特异启动子在严谨条件下与由SEQID NO：3代表的核苷酸序列组成的DNA杂交，并发挥维管束和毛状体特异启动子特异供能。

如此处使用的一样，术语“严谨条件”指，例如，当使用标记P-32的探针DNA时，在由5×SSC(0.75M NaCl，0.75M柠檬酸钠)、5×Denhardt试剂(0.1％菲可，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％牛血清白蛋白)和0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)组成的杂交溶液中杂交，温度45-68℃，优选的为60-68℃。此外，在洗涤步骤，在由2×SSC和0.1％SDS组成的洗涤溶液中进行洗涤，温度为45-55℃，更为优选的是由0.1×SSC和0.1％SDS组成的洗涤溶液，温度为45-55℃。当使用利用AlkPhos直接标记组件试剂盒(Amersham Biotech)进行酶促标记的探针DNA时，可在含有试剂盒附带的说明书中所述成分的杂交溶液(含有0.5M NaCl和4％封闭试剂)中实施杂交，温度为55-75℃。此外，在洗涤步骤，根据试剂盒附带的说明书中的指导，洗涤在初期洗涤溶液(含有2M尿素)中实施，温度为55-75℃，并在二级洗涤溶液和室温中实施。也可使用其它检测技术，在这些情况下，条件为相关检测技术的标准条件。

一旦确定根据本发明的启动子的核苷酸序列，接下来可通过化学合成、或应用克隆探针作为模板的PCR、或应用具有核苷酸序列的DNA片段作为探针进行杂交而获得本发明的启动子。此外，可通过如定点诱变技术而合成与突变前具有相同功能的本发明启动子的突变体。

将突变引入根据本发明的启动子的方法的实例包括公知的方法，如Kunkel法、或缺口双链体法、或根据这些方法的方法。例如，引入突变可使用通过定点诱变引入突变的试剂盒(例如Mutant-K或Mutant-G(均由TAKARA Inc制造))或可使用TAKARA Inc制造的LA PCR体外诱变系列试剂盒进行。

通过将根据本发明的启动子插入合适的载体可获得包含本发明启动子的本发明重组载体。用于插入本发明启动子的载体不受到特别限制，只要它可在宿主内复制，并且其实例包括质粒、穿梭载体和辅助质粒。另外，当载体自身不能复制时，可使用通过如插入宿主染色体而可复制的DNA片段。

质粒DNA的实例包括来源于大肠杆菌的质粒(pBI221等，例如，pET系统如pET30b、pBR系统如pBR322和pBR325、pUC系统如pUC118、pUC119、pUC18和pUC19、pBluescript和pBI221)、来源于枯草芽孢杆菌的质粒(例如pUB110和pTP5)、来源于根癌农杆菌的双元质粒(例如，来源于pBIN19、pBI101或pBI121的pBI系统)、来源于酵母的质粒(例如，YEp系统如YEp13、或YCp系统如YCp50)等。噬菌体DNA的实例包括λ噬菌体(Charon 4A、Charon 21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等)。此外，也可使用动物病毒载体如逆转录病毒或痘苗病毒载体、或昆虫病毒载体如杆状病毒载体。

为将根据本发明的启动子插入载体，可使用这样的方法，该方法首先用合适的限制性酶将纯化的DNA切下，然后插入合适载体DNA的限制性酶位点或多克隆位点，并连接至载体。此外，也可使用这样的方法，该方法中分别提供载体和本发明启动子的一部分的同源区，并通过使用PCR等体外方法或使用酵母等体内方法将载体和启动子连接起来。

包含本发明启动子的本发明重组载体可进一步包括插入本发明启动子下游的外源基因或外源DNA片段。插入外源基因或外源DNA片段的方法与将根据本发明的启动子插入载体一样。

在包含本发明启动子的本发明重组载体中，欲插入本发明启动子下游的外源基因的实例包括任何外源基因，具体的实例包括与运输水或内部物质有关、或细胞增殖有关的基因、与细菌或植物病毒增殖或运输有关的基因、与排泄重金属等有关的基因、或与分泌具有抗微生物活性或阻碍摄入的液体有关的基因。更为特别的是，该基因可以是用于运输或泵吸的基因、编码PR-蛋白质的基因(发病相关的蛋白质)(几丁质酶、过氧化物酶等)、防卫素家族基因、植物防御素合成基因或害虫等的驱除信息素合成基因。作为外源基因进一步的实施例可提及上述根据本发明的基因，AtMVR基因。

欲插入本发明启动子下游的外源DNA片段实例包括RNA自身发挥功能的反义RNA或核酶。

根据本发明的转基因植物是具有根据本发明的重组载体的转基因植物，其中本发明重组载体包含本发明的启动子。通过将根据本发明的重组载体导入植物，可获得根据本发明的转基因植物，其中本发明重组载体包含本发明的启动子。转基因植物可按下述方法获得。

在本发明中，欲转化的“植物”可以是任一完整的植物、具有维管束和/或毛状体的植物器官(例如叶、花瓣、茎、根或种子)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织或木质部)或植物培养细胞。在转化中可使用的植物的实例包括但不限制于属于禾本科(Poaceae)、芸苔科(Brassicaceae)、茄科(Solanaceae)或豆科(Leguminosae)植物(见下面)。

禾本科：稻(Oryza sativa)，玉蜀黍(Zea mays)

芸苔科：鼠耳芥

茄科：烟草(Nicotiana tabacum)

豆科：大豆(Glycine max)

通过常规转化方法如，例如电穿孔法、农杆菌法、粒子枪法或PEG法，可将包含本发明启动子的本发明重组载体导入植物。

例如，当使用电穿孔法时，通过利用装备有脉冲控制器的电穿孔仪器，在电压500-1600伏特、25-1000微法拉第、20-30毫秒的条件下，将包含本发明启动子的本发明重组载体导入宿主。

当使用粒子枪方法时，可使用未经任何处理的完整植物、植物器官或植物组织自身，可制备其切片并然后使用它，或制备原生质体并使用它。然后利用基因转移设备(例如Bio-Rad Inc制造的PDS-1000/He)处理已制备的样品。虽然处理条件随着使用的植物或样品而不同，但处理一般在压力约450-2000psi和距离约3-12厘米的条件下实施。

使用农杆菌Ti质粒或Ri质粒的方法是利用了以下特征，当属于农杆菌属的细菌感染植物时，细菌所拥有的质粒DNA的一部分转移至植物的基因组。因此，这种方法可用于将根据本发明的启动子和外源基因或外源DNA片段导入植物宿主。在属于农杆菌属的细菌中，当根癌农杆菌感染植物时，它可导致形成称为“冠瘿”的肿瘤。此外，当发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物时，它刺激产生毛细根。这些是通过将Ti质粒或Ri质粒中称为“T-DNA(转移DNA)区”的区域在感染时转移至植物，并整合进植物的基因组而导致的。因此，首先将欲整合进植物基因组的DNA插入Ti质粒或Ri质粒的T-DNA区，然后通过利用农杆菌属的细菌感染植物宿主，将DNA整合进植物基因组。

将农杆菌属的细菌转化植物宿主的方法的实例包括上述的电穿孔法、基因枪和PEG方法，以及植物原位(in planta)转化法。植株原位转化法的实例包括直接农杆菌接种法和渗入法。

可使用转化时获得的肿瘤组织或芽、毛细根等，而不对细胞培养物、组织培养物或器官培养物作任何处理。备选的是，利用常规植物组织培养法，通过施用合适浓度的植物激素(生长素、促细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯、油菜素内酯等)，它可在植物体中再生。

此外，通过使用植物病毒作为载体，可将根据本发明的启动子和外源基因或外源DNA片段导入植物。此处所使用的植物病毒的实例包括花椰菜花叶病毒。首先，将病毒基因组插入来源于大肠杆菌等的载体，以产生重组体，然后将根据本发明的启动子和外源基因或外源DNA片段插入病毒基因组。随后，使用限制性酶将用这种方法修饰的病毒基因组从重组体上切下，通过将病毒基因组接种植物宿主，将根据本发明的启动子和外源基因或外源DNA片段导入植物宿主。

上述方法产生的本发明转基因植物可在使用本发明启动子的维管束和毛状体中特异表达外源基因或外源DNA片段。

维管束是与植物中运输水和内部物质以及细胞增殖有关的位置。因此，当将与运输水或内部物质或细胞增殖有关的基因作为外源基因导入根据本发明的转基因植物时，可调节植物中水和内部物质的运输或细胞增殖。维管束也是感染茄科植物的枯萎病真菌增殖和转移的位置。当植物病毒感染植物时，植物病毒迁移很长距离，从一片叶子移至其上面的叶子，因此，维管束也是导致植物全株感染的迁移位置。因此，当将与真菌或植物病毒增殖或迁移有关的基因作为外源基因导入根据本发明的转基因植物时，植物可得到保护而免受真菌或植物病毒的感染。

同时，毛状体与植物体表面的分泌和排泄有关。例如，据报道，当植物暴露于重金属(镉)压力时，叶表面上的毛状体数量增加，并且含有镉或钙的晶体粘附于叶表面，换言之，通过毛状体排泄镉(Planta，213(1)，45-50，2001年5月)。毛状体也是侵入植物的丝状真菌、细菌、昆虫等最初接触的位置。此外，作为对病害和昆虫伤害的防御，例如具有抗微生物活性和阻碍摄入的液体从蔷微科玫瑰的腺毛或腺状突起物中分泌。因此，如果将与重金属等排泄有关的基因、或与分泌具有抗微生物活性或阻碍摄入的液体有关的基因作为外源基因导入本发明的转基因植物，重金属可有效地从植物中排泄，或植物可有效地得到保护而免于丝状真菌、细菌或昆虫侵入植物。

此外，当将根据本发明的基因作为外源基因导入根据本发明的转基因植物时，通过促进植物体内百草枯的运输和排泄等，可赋予对百草枯的抗性。

[实施例]

本发明将参照下述实施例进行详细阐述。然而，这些实施例不用于限制本发明的技术范围。

[实施例1]分离百草枯抗性基因

在该实施例中，将从Nottingham Arabidopsis StockCenter(http://nasc.nott.ac.uk/)获得的Weigel T-DNA品系作为鼠耳芥的活化标记品系。

(1)使用鼠耳芥的活化标记品系(Weigel T-DNA品系)筛选可在 含有百草枯的培养基中生长的克隆

将Weigel T-DNA品系的种子无菌接种至含有3μM百草枯(甲基紫精，Sigma Chemical Co制造)的1/2MS琼脂(1％)培养基(2.3g/lMurashige and Skoog Plant Salt Mixture(Wako Pure Chemical IndustriesLtd.制造)、1.5mg/l盐酸硫胺素、2.5mg/l尼克酸、0.25mg/l盐酸吡哆醇、1.5％蔗糖、1％琼脂)，并于22℃、光照射60μE/m²/s(每个循环为16小时光期间/8小时暗期间)下培养。培养后约10天，对在含有百草枯的培养基中生长的个体进行筛选。

(2)通过TAIL-PCR方法，从筛选的活化标记品系中评估T-DNA 的插入位点

将由经筛选个体获得的Weigel T-DNA品系的种子种于含有蛭石(Asahi Kagaku Kogyo Co.，Ltd.制造)的罐中，并于23℃、在光强度为100μE/m²/s、16小时光周期/8小时暗周期的光周期条件下生长约1月。

使用DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN制造)，从培养个体的叶制备基因组DNA，并且在用于Weigel T-DNA品系的活化标记载体(pSKI015：GenBank登录号AF187951)的T-DNA左侧序列(T-DNA左边界：SEQID NO：30)的邻近区设计3种特异引物(TL1：SEQ ID NO：31；TL2：SEQID NO：32；TL3：SEQ ID NO：33)。然后，使用特异引物和随机引物1(SEQID NO：34)实施TAIL-PCR(用于植物的PCR实验方法(Protocols ofPCR Experiments for Plants)，(Shimamoto K.&Sasaki T.编辑)，新版，2000，pp 83-89，ShujunSha Co.，Ltd.，Tokyo；Genomics，25，674-681，1995；Plant J.，8，457-463，1995)，并且按下述的PCR反应混合物和反应条件扩增T-DNA邻近的基因组DNA。在SEQ ID NO：34中，n代表a、g、c或t(位置：1和11)、s代表g或c(位置：7)和w代表a或t(位置：8和13)。

第一轮PCR反应混合物的组分和PCR条件列于表2和3。

[表2]

模板(基因组DNA)：                    10ng

10×PCR缓冲液(TAKARA BIO Inc制造。)：2μl

2.5mM dNTPs(TAKARA BIO Inc.制造)：   1.6μl

第一特异引物(TL1：SEQ ID NO：31)：   3pmol

随机引物1(SEQ ID NO：34)：           80pmol

AmpliTaq(Applied Biosystems制造)：   0.8单位

总体积                               20μl

[表3]

#1：94℃(1分钟)/95℃(1分钟)

#2：94℃(1分钟)/65℃(1分钟)/72℃(3分钟)×5个循环

#3：94℃(1分钟)/25℃(3分钟)→72℃3分钟/72℃(3分钟)×1个循环

#4：94℃(30秒)/68℃(1分钟)/72℃(3分钟)

94℃(30秒)/68℃(1分钟)/72℃(3分钟)

94℃(30秒)/44℃(1分钟)/72℃(3分钟)×14个循环

#5   72℃(5分钟)

第二轮PCR反应混合物的组分和PCR条件列于表4和5。

[表4]

模板(第一轮PCR产物50倍稀释)：         1μl

10×PCR缓冲液：                       2μl

250μM dNTPs：                        2μl

第二特异引物(TL2：SEQ ID NO：32)：    4pmol

随机引物1(SEQ ID NO：34)：                60pmol

AmpliTaq：                                0.6单位

总体积                                    20μl

[表5]

#6：94℃(30秒)/64℃(1分钟)/72℃(3分钟)

94℃(30秒)/64℃(1分钟)/72℃(3分钟)

94℃(30秒)/44℃(1分钟)/72℃(3分钟)×10个循环

#5   72℃(5分钟)

第三轮PCR反应混合物的组分和PCR条件列于表6和7。

[表6]

模板(第二轮PCR产物50倍稀释)：        1μl

10×PCR缓冲液：                      10μl

2.5mM dNTPs：                        1μl

第三特异引物(TL3：SEQ ID NO：33)：   30pmol

随机引物1(SEQ ID NO：34)：           300pmol

AmpliTaq：                           3单位  

总体积                               100μl

[表7]

#7：94℃(1分钟)/44℃(1分钟)/72℃(3分钟)×20个循环

#5  72℃(5分钟)

下一步，第二轮和第三轮PCR的反应产物经过琼脂糖凝胶电泳后，证明扩增的存在与否和反应产物的特异性。

此外，使用特异引物TL3(SEQ ID NO：33)，利用ABI PRISM DyeTerminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)，对第三轮PCR的扩增产物直接测序，然后，利用ABI PRISM 310基因分析仪(AppliedBiosystems)确定核苷酸序列。结果获得278bp序列信息(SEQ ID NO：35)。在SEQ ID NO：35中，n代表a、g、c或t(位置：13、35、73、108、156、190、198和201)。在含有鼠耳芥完整核苷酸序列的数据库中，对获得的序列进行搜索，发现插入位点位于BAC克隆F17I23的77240bp处。

(3)分离百草枯抗性基因的cDNA

将鼠耳芥(鼠耳芥生态型Columbia(Col-0))的种子种于含有蛭石(Asahi Kagaku Kogyo Co.，Ltd.)的罐中，并允许于23℃、光强度为100μE/m²/s、16小时光周期/8小时暗周期的光周期下生长约1个月。

生长后，使用液氮对个体的叶进行冷冻。随后，使用RNeasy Plant MiniKit(QIAGEN制造)提取总RNA。此后，使用ProSTAR First StrandRT-PCR Kit(STRATAGEN制造)，从提取的总RNA中合成cDNA。

基于从具有上述(2)中获得的核苷酸序列(SEQ ID NO：35)的结构基因的邻近10kb内推测的开发读码框(ORF)的序列，设计用于推测的结构基因的引物141dF(SEQ ID NO：36)和引物141dR(SEQ ID NO：37)，然后，应用上述合成的cDNA作为模板，使用这些引物和下述含有TakaraEX-Taq(TAKARA BIO Inc.制造)的反应混合物(表8)实施PCR。

[表8]

模板(cDNA)：           50ng

10×Ex Taq缓冲液(TAKARA BIO Inc.)：   2μl

dNTPs：                               200μM

每一引物：                            0.2μM

Takara EX-Taq：                       1单位

总体积                                20μl

应用94℃(30秒)/55℃(30秒/72℃(60秒)进行30个循环作为反应条件。

将扩增产物克隆进pGEM-T Easy载体(Promega制造)，然后使用ABI PRISM 310基因分析仪(Applied Biosystems)，确定其核苷酸序列。结果获得857bp的cDNA片段(SEQ ID NO：1)。将该cDNA片段称为AtMVR基因，并且含有AtMVR基因的pGEM-T Easy载体称为pAtMVR。AtMVR基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[实施例2]搜索相对于AtMVR基因的AtMVR同源基因

基于AtMVR基因的核苷酸序列，在含有鼠耳芥完整核苷酸序列的数据库中进行搜索，发现在鼠耳芥基因组上除了AtMVR基因的核苷酸序列还存在13个AtMVR同源基因。

将每一AtMVR同源基因称为AtMVR3-1-AtMVR3-13。每一AtMVR同源基因的核苷酸序列和对应的AtMVR同源基因编码的推测氨基酸序列如下面表9中所列出的序列号所示。表9也列出AtMVR基因和每一AtMVR同源基因之间的同源性分析结果。使用BLAST P在氨基酸水平上实施同源性分析。术语“同一性”指根据氨基酸的100％一致性。氨基酸的分类基于它们侧链的化学特征。在BLOSUM62氨基酸替代矩阵中，氨基酸分为带有巯基的氨基酸(C)、具有低分子量的亲水氨基酸(S，T，P，A，G)、酸性氨基酸(N，D，E，Q)、碱性氨基酸(H，R，K)、具有低分子量的疏水氨基酸(M，I，L，V)和芳香族氨基酸(F，Y，W)。在表9中，术语“同一性”在氨基酸方面指100％一致性，术语“阳性率”指当在BLOSUM62氨基酸替代矩阵中具有阳性分值的氨基酸添加至那些具有100％一致性的氨基酸时的数值

[表9]

AtMVR同源基因的名称	核苷酸序列	氨基酸序列	同一性(％)	阳性率(％)
					AtMVR3-1	SEQ ID NO：4	SEQ ID NO：5	57	70
AtMVR3-2	SEQ ID NO：6	SEQ ID NO：7	55	69
					AtMVR3-3	SEQ ID NO：8	SEQ ID NO：9	39	56
AtMVR3-4	SEQ ID NO：10	SEQ ID NO：11	39	55
					AtMVR3-5	SEQ ID NO：12	SEQ ID NO：13	37	54
AtMVR3-6	SEQ ID NO：14	SEQ ID NO：15	36	52
					AtMVR3-7	SEQ ID NO：16	SEQ ID NO：17	34	52
AtMVR3-8	SEQ ID NO：18	SEQ ID NO：19	34	51
					AtMVR3-9	SEQ ID NO：20	SEQ ID NO：21	37	58

AtMVR3-10	SEQ ID NO：22	SEQ ID NO：23	25	44
					AtMVR3-11	SEQ ID NO：24	SEQ ID NO：25	33<sup>＊</sup>	51<sup>＊</sup>
AtMVR3-12	SEQ ID NO：26	SEQ ID NO：27	25	41
					AtMVR3-13	SEQ ID NO：28	SEQ ID NO：29	22	41

^＊与AtMVR3-11的比较显示的是与AtMVR3-11部分序列同源性比较的结果。

如表9所示，AtMVR和13个AtMVR同源基因的同源性在同一性上为22-57％、在阳性率上为41-70％。

[实施例3]构建用于植物的AtMVR表达载体并产生AtMVR转基因植物

此处应用的转化技术为在Hinchee等(Plant Ceu and Tissue Culture，231-270页，I.K.Vasil，T.A Thorpe编辑，Kluwer Academic Publisher，1994)概述的农杆菌基因载体系统的基础上，由Pellegrineschi等(Biochemical Society Transitions 23，247-250，1995)所述的载体系统。

(1)构建用于植物的AtMVR表达载体

使用SacI/SacII将AtMVR基因序列从pAtMVR上切下，并克隆进pBlueScript(STRATAGENE)。随后，用XbaI/SacI切割含有AtMVR基因序列的片段，并导入出现于pBI121(Clontech制造)的CaMV 35S启动子下游的XbaI/SacI位点。由此得到的载体以下作为植物的AtMVR表达载体。

(2)产生AtMVR转基因植物

通过电穿孔法(Plant Molecular Biology Manual，第二版，B.G.Stanton，A.S.Robbert，Kluwer Academic Publishers，1994)，将上述(1)中产生的、用于植物的AtMVR表达载体导入根癌农杆菌LBA4404株。随后，通过Clough等(The Plant Journal 16：735-743，1998)所述的渗入法，将具有导入的用于植物AtMVR表达载体的根癌农杆菌导入野生型鼠耳芥生态型Col-0。

在含有卡那霉素的培养基中筛选转化体，并通过自花受粉产生T3代植物(具有导入的AtMVR基因的纯合子品系)。

下一步，检测导入的AtMVR基因的表达量。将上述产生的转化体和非转化体的种子分别种于含有蛭石(Asahi Kagaku Kogyo Co.，Ltd.)的罐中，并允许在光强度为100μE/m²/s、23℃、16小时光周期/8小时暗周期的光周期条件下，生长约1个月。

生长后，使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)，从转化体和野生型鼠耳芥生态型Col-0非转化体中提取总RNA。此后，使用ProSTAR FirstStrand RT-PCR Kit(STRATAGEN)，将1μg RNA进行逆转录。然后，应用1/50体积的所合成cDNA为模板，使用AtMVR基因的引物(引物141d1(SEQ ID NO：38)和引物141d2(SEQ ID NO：39))，用含有Takara EX-Taq(TAKARA BIO)的下述反应混合物(表10)实施PCR。

[表10]

PCR反应混合物：

模板(cDNA)：                            50ng

10×Ex Taq缓冲液(TAKARA BIO Inc.)：     2μl

dNTPs：                                 200μM

每一引物：                              0.2μM

Takara EX-Taq：                         1单位

总体积                                  20μl

应用94℃(30秒)/55℃(30秒/72℃(60秒)进行30个循环作为反应条件。

将扩增产物在琼脂糖凝胶上经过电泳。图1显示电泳结果。从图1可看出，与非转化体比较，产生的转化体过量表达AtMVR基因。

[实施例4]评估AtMVR基因转化体的百草枯抗性

将来源于所产生的AtMVR基因转化体和非转化体(野生型鼠耳芥生态型Col-0)的种子无菌接种至含有3μM百草枯(甲基紫精，SigmaChemical Co制造)的1/2MS琼脂(1％)培养基(2.3g/l Murashige andSkoog Plant Salt Mixture(Wako Pure Chemical Industries Ltd.制造)、1.5mg/l盐酸硫胺素、2.5mg/l尼克酸、0.25mg/l盐酸吡哆醇、1.5％蔗糖、1％琼脂)，并于22℃、光照射60μE/m²/s(每个循环为16小时光期间/8小时暗期间)下培养8天。培养后，评估发芽个体的生长。结果如图2所示，其中图2B是显示AtMVR基因转化体和非转化体在不含百草枯的1/2MS培养基中生长的图片，图2C是显示AtMVR基因转化体和非转化体在含有百草枯的1/2MS培养基中生长的图片。图2A是显示图2B和2C中AtMVR基因转化体和非转化体位置的简图。

从图2B可看出，结果显示在不含百草枯的培养基中，AtMVR基因转化体表现出与非转化体同样的生长。同时，从图2C可看出，在含有百草枯的培养基中，非转化体发展为黄萎病，并死亡，即生长受到显著抑制，而相反，AtMVR基因转化体的幼苗可以生长。因此，可确定在不含百草枯的培养基中，不管AtMVR基因表达与否，AtMVR基因转化体与非转化体表现出同样的生长，也可确定在含有百草枯的培养基中，AtMVR基因转化体无疑比非转化体具有更高的百草枯抗性。

[实施例5]分离维管束/毛状体特异启动子

将鼠耳芥(鼠耳芥生态型Columbia(Col-0)的种子种于含有蛭石(AsahiKagaku Kogyo Co.，Ltd.)的罐中，并允许在光强度为100μE/m²/s、23℃、在16小时光周期/8小时暗周期的光周期条件下，生长约1个月。

生长后，使用DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)，从个体的叶子中制备基因组DNA。下一步，在下述的反应条件下，应用获得的基因组DNA为模板，使用基于上述实施例1的AtMVR基因片段(SEQ ID NO：35)设计的引物141dpF(SEQ ID NO：40)和引物141dpR(SEQ ID NO：41)，使用下述含有Takara EX-Taq(TAKARA BIO Inc.)的反应混合物(表11)实施PCR。

[表11]

模板基因组DNA：                      50ng

10×Ex Taq缓冲液(TAKARA BIO Inc.)：  2μl

dNTPs：                              200μM

每一引物：                           0.2μM

Takara EX-Taq：                      1单位

总体积                               20μl

反应条件是94℃(30秒)/55℃(30秒/72℃(60秒)进行30个循环。

将扩增产物克隆进pGEM-T Easy载体(Promega Corp.)，然后使用ABI PRISM 310基因分析仪，确定其核苷酸序列。结果获得1722bp(SEQID NO：3)的AtMVR启动子。

[实施例6]分析维管束/毛状体特异启动子的组织特异性

(1)构建具有AtMVR启动子的表达载体

使用HindIII/PstI，将AtMVR启动子从实施例5中产生的具有AtMVR启动子(SEQ ID NO：3)的pGEM-T Easy载体上切下，然后亚克隆进pBI221(Clontech)的CaMV 35S启动子上游区。将得到的载体用PstI/SmaI处理，以除去CaMV 35S启动子，末端用DNA T4聚合酶(TAKARA BIOInc.)补平，并允许自连接。结果，AtMVR启动子连接入载体的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因上游。随后，使用HindIII/EcoRI，将含有AtMVR启动子和GUS基因的片段从上述载体中切下，然后替换为pBI121(Clontech)的CaMV 35S启动子-β-GUS基因。这样获得的载体用作下面使用的、具有AtMVR启动子的表达载体。

(2)产生转基因植物

以实施例3(2)中的类似方法，将上述具有AtMVR启动子的表达载体导入根癌农杆菌LBA4404株，然后通过渗入法，将所述农杆菌菌株导入野生型鼠耳芥生态型Col-0。此后，在含有卡那霉素的培养基中筛选转化体，并通过自花受粉产生T3代植物。

(3)分析AtMVR启动子的组织特异性

将来源于上述(2)产生的转化体的种子无菌接种于1/2MS琼脂(1％)培养基(2.3g/l Murashige and Skoog Plant Salt Mixture(Wako PureChemical Industries Ltd.制造)、1.5mg/l盐酸硫胺素、2.5mg/l尼克酸、0.25mg/l盐酸吡哆醇、1.5％蔗糖、1％琼脂)，并于22℃、光照射60μE/m²/s(每个循环为16小时光期间/8小时暗期间)下培养约7天。

培养后，将长出的转化体用丙酮固定。将含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)的反应混合物加至固定的组织以浸没全部组织。反应混合物的组成是：1.9mM X-Gluc、0.5mM K₃Fe(CN)₆、0.5mM K₄Fe(CN)₆和0.3％Triton X-100。

然后将容器密封，并在37℃保温箱中过夜孵育。此后，将70％乙醇加至混合物以终止反应，并观察染色(用于观察植物细胞的实验方法(Protocols of Experiments for Observing Cells of Plants)，Fukuda H.，Nishimura M.，& Nakamura K.编辑，(1997)，71-79页，Shujunsha Co.，Ltd.，Tokyo)。结果如图3-5所示，其中图3-5分别是完整转化体、转化体的叶子和转化体的根的显微照片。

从图3-5可看出，在维管束和毛状体中可观察到特异染色。因此，可确定获得的AtMVR启动子(SEQ ID NO：3)是在维管束和毛状体中具有组织特异转录活性的转录启动子。

序列表自由文本

SEQ ID NO：31-41是引物。

在SEQ ID NO：34中，n代表a、g、c或t(位置：1和11)，s代表g或c(位置：7)，以及w代表a或t(位置：8和13)。

在SEQ ID NO：35中，n代表a、g、c或t(位置：13、35、73、108、156、190、198和201)。

工业适用性

根据本发明，提供了百草枯抗性基因以及维管束和毛状体特异启动子。根据本发明的百草枯抗性基因可赋予百草枯抗性同时不影响在不同环境下植物通过产生活性氧而对生长的调节。

此外，根据本发明的维管束和毛状体特异启动子可调节植物的维管束和毛状体中的基因表达。

序列表

<110>丰田自动车株式会社

冈山县

<120>百草枯抗性基因及维管束和毛状体特异性启动子

<130>PH-2160

<140>

<141>

<150>JP 2003-322051

<151>2003-09-12

<160>41

<170>PatentIn版本2.1

<210>1

<211>855

<212>DNA

<213>鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

cttcttcaat catcaccatg gtacgtttta gtaacagtct tgtaggaata ctcaacttct 60

tcgtcttcct tctctcggtt cccatactct caaccggaat ctggctcagc cttaaagcca 120

cgacgcaatg cgagagattc ctcgacaaac ccatgatcgc tctcggtgtt ttcctcatga 180

taatcgcaat cgctggagtc gttggatctt gttgcagagt gacgtggctt ctctggtcct 240

atctctttgt gatgttcttc ttaatcctca tcgtcctctg tttcaccatc tttgccttcg 300

ttgtcactag taaaggctcc ggcgaaacta tccaaggaaa agcttataag gagtataggc 360

tcgaggctta ctctgattgg ttgcagaggc gtgtgaacaa cgctaagcat tggaacagca 420

ttagaagctg tctttatgag agcaagttct gttataactt ggagttagtc actgctaatc 480

acactgtttc tgatttctac aaagaagatc tcactgcttt tgagtctggt tgctgcaagc 540

cctctaatga ctgtgacttc acctacataa cttcaacaac ttggaataaa acatcaggaa 600

cacataaaaa ctcagattgc caactttggg acaacgaaaa gcataagctt tgctacaatt 660

gcaaagcctg caaggccggt tttctcgaca acctcaaggc cgcatggaaa agagttgcta 720

ttgtcaacat cattttcctt gtactcctcg ttgtcgtcta cgctatggga tgttgcgctt 780

tccgaaacaa caaagaagat agatatggcc gttccaatgg tttcaacaat tcttgatttg 840

cgccggttca agcta                                                  855

<210>2

<211>272

<212>PRT

<213>鼠耳芥

<400>2

Met Val Arg Phe Ser Asn Ser Leu Val Gly Ile Leu Asn Phe Phe Val

  1               5                  10                  15

Phe Leu Leu Ser Val Pro Ile Leu Ser Thr Gly Ile Trp Leu Ser Leu

             20                  25                  30

Lys Ala Thr Thr Gln Cys Glu Arg Phe Leu Asp Lys Pro Met Ile Ala

         35                  40                  45

Leu Gly Val Phe Leu Met Ile Ile Ala Ile Ala Gly Val Val Gly Ser

     50                  55                  60

Cys Cys Arg Val Thr Trp Leu Leu Trp Ser Tyr Leu Phe Val Met Phe

 65                  70                  75                  80

Phe Leu Ile Leu Ile Val Leu Cys Phe Thr Ile Phe Ala Phe Val Val

                 85                  90                  95

Thr Ser Lys Gly Ser Gly Glu Thr Ile Gln Gly Lys Ala Tyr Lys Glu

            100                 105                 110

Tyr Arg Leu Glu Ala Tyr Ser Asp Trp Leu Gln Arg Arg Val Asn Asn

        115                 120                 125

Ala Lys His Trp Asn Ser Ile Arg Ser Cys Leu Tyr Glu Ser Lys Phe

    130                 135                 140

Cys Tyr Asn Leu Glu Leu Val Thr Ala Asn His Thr Val Ser Asp Phe

145                 150                 155                 160

Tyr Lys Glu Asp Leu Thr Ala Phe Glu Ser Gly Cys Cys Lys Pro Ser

                165                 170                 175

Asn Asp Cys Asp Phe Thr Tyr Ile Thr Ser Thr Thr Trp Asn Lys Thr

            180                 185                 190

Ser Gly Thr His Lys Asn Ser Asp Cys Gln Leu Trp Asp Asn Glu Lys

        195                 200                 205

His Lys Leu Cys Tyr Asn Cys Lys Ala Cys Lys Ala Gly Phe Leu Asp

    210                 215                 220

Asn Leu Lys Ala Ala Trp Lys Arg Val Ala Ile Val Asn Ile Ile Phe

225                 230                 235                 240

Leu Val Leu Leu Val Val Val Tyr Ala Met Gly Cys Cys Ala Phe Arg

                245                 250                 255

Asn Asn Lys Glu Asp Arg Tyr Gly Arg Ser Asn Gly Phe Asn Asn Ser

            260                 265                 270

<210>3

<211>1722

<212>DNA

<213>鼠耳芥

<400>3

agccaagctt gtacattaac cgtgactatt attattattt ttaatgaaat tatttttttc 60

tttctcccat acattttata tgattcgttt cttttaggat tattataaaa tctaaatgat 120

tcgtttctct taagacaagc aaaaaccgaa aaaaggacag cctattatac cgcgttaatt 180

taaagttaat cgtgattgtg ttaatcttga aatgtatttg aacatttttg ttttcttaat 240

acagaattga ttgatgtaag gcagcaaata ttttcctacc aaaataattt gttagggatc 300

ttttagaaaa agaaataaaa taaaaaaaag ggaataagga cagctgggaa gagtgggaca 360

gcagagaaag tggtggtgta cggtaaccgt tggatccgat gaggaattta ataaaggtag 420

tcgtaatctt acggtccagc tgtgaagtac tcatgccacg ttatcttctc caccgacagt 480

acattgttac tatagcagct atagtatagc ctattcaatc atttgtattt taatggtaag 540

caaagaggaa actatgtaga agtttcttat cttatagttt ctcaagtctt ttagttttgg 600

ttccataatc ctttttttag tatgtgaagg tgaaggtgag tttagtatgt gatttttagt 660

atgatttggt tgataacgtt ttcactcgac taattatata cttcagaagg atagtaatag 720

aataccaaaa taattaaatg attggttagt gccttagtgg agacttttta accgattcta 780

atagactaat gatgtagcta agcatttatt tgggatcatc actgtttgaa aacgtgaaat 840

gtgataaaag ttatgaaacg attaaaatat aaaataaccg tacaaaacat tatgtaccgt 900

ttttttctct gttcttttgg cgatttggtt tagttcgtta cactctaaat gttattgcag 960

atatatatat aatgatgcat ttgcatctga ggaacatata attccggtta acacttccaa 1020

atcttatatc cgtctaggta gggattttat aaatcatttg tgtcatcatg cgttatgctt 1080

gtcggctttg accataacgc agagatatag aactagcttt tacttaactt ttagatttat 1140

tatttgatct agagttaagt ggagatatat agtgtttttg ttagattatt ggtggatgtg 1200

agagtttgtc tttagtttca agttgagaat ataaggcaag aggagactct gaggcaatca 1260

gaggttttga ttggcaaaat atccaaaagg cccaaaccaa gtcgaagccc atctcgtaca 1320

aaaaaagaaa gagatctgta agaaaaaata ttctttgata ttcttacaaa aataagtgta 1380

aaacttttat tagtcaaaat cttcaatctt taaaaactct catcactcct acgaaagcgc 1440

gtgagagtta tgagacattc cttaatagca ttactcacaa gtcacaagtt caaaacgtct 1500

gactgaaaca gaaacaagcc tttgttgaag tcttgaagaa gagacattag tactcgtcgt 1560

atagccataa aaggtaatat acgaaatttc ttcgctaatc tcttcacctt cctctacgcg 1620

tttcactttc actttataaa tccaaatctc ccttcgaaaa cataatcaca caaatccctt 1680

ttttggtttc tccaaatctt caaatcttct tcaatcatca cc                    1722

<210>4

<211>822

<212>DNA

<213>鼠耳芥

<400>4

atggctcgtt gtagcaacaa tctcgtaggg atactcaatt tcctagtatt tcttctctcg 60

atcccaatct tagctggtgg aatctggcta agccaaaaag ggtcaacaga gtgtgaaaga 120

ttcctagaca aaccagtgat tgctcttggt gttttcctta tggttgtagc aatagctggt 180

ctaataggtt catgttgtag agtcacatgg cttctttggg tttatctctt tgtcatgttc 240

cttttgattc tccttgtgtt ctgtataaca gtttttgcct ttgttgttac taacaaagga 300

gctggtgaag ctattgaagg aaaaggttat aaagagtata aacttggtga ttactctact 360

tggttacaga aacgtgttga gaatggtaaa aattggaata agattaggag ttgtcttgtg 420

gagagcaaag tttgttctaa gcttgaagcc aagtttgtta atgttcctgt caatagtttc 480

tacaaggaac atcttactgc tcttcagtct ggttgctgca aaccttcaga tgaatgtggt 540

ttcgagtacg taaacccaac aacctggacc aagaacacaa cgggaacaca cactaatcca 600

gactgccaaa cctgggacaa cgcaaaagaa aagctctgct tcgattgtca atcttgtaaa 660

gcgggtctac tcgacaacgt caaaagcgct tggaagaaag ttgcaatcgt taacatcgtc 720

ttccttgtct tcctcatcat tgtctactct gttggttgct gtgctttcag gaacaacaag 780

agggatgaca gttattcccg tacctacgga tataagcctt ga                    822

<210>5

<211>272

<212>PRT

<213>鼠耳芥

<400>5

Met Ala Arg Cys Ser Asn Asn Leu Val Gly Ile Leu Asn Phe Leu Val

  1               5                  10                  15

Phe Leu Leu Ser Ile Pro Ile Leu Ala Gly Gly Ile Trp Leu Ser Gln

             20                  25                  30

Lys Gly Ser Thr Glu Cys Glu Arg Phe Leu Asp Lys Pro Val Ile Ala

         35                  40                  45

Leu Gly Val Phe Leu Met Val Val Ala Ile Ala Gly Leu Ile Gly Ser

     50                  55                  60

Cys Cys Arg Val Thr Trp Leu Leu Trp Val Tyr Leu Phe Val Met Phe

 65                  70                  75                  80

Leu Leu Ile Leu Leu Val Phe Cys Ile Thr Val Phe Ala Phe Val Val

                 85                  90                  95

Thr Asn Lys Gly Ala Gly Glu Ala Ile Glu Gly Lys Gly Tyr Lys Glu

            100                 105                 110

Tyr Lys Leu Gly Asp Tyr Ser Thr Leu Gln Lys Arg Val Glu Asn Gly

        115                 120                 125

Lys Asn Trp Asn Lys Ile Arg Ser Cys Leu Val Glu Ser Lys Val Cys

    130                 135                 140

Ser Lys Leu Glu Ala Lys Phe Val Asn Val Pro Val Asn Ser Phe Tyr

145                 150                 155                 160

Lys Glu His Leu Thr Ala Leu Gln Ser Gly Cys Cys Lys Pro Ser Asp

                165                 170                 175

Glu Cys Gly Phe Glu Tyr Val Asn Pro Thr Thr Trp Thr Lys Asn Thr

            180                 185                 190

Thr Gly Thr His Thr Asn Pro Asp Cys Gln Thr Trp Asp Asn Ala Lys

        195                 200                 205

Glu Lys Leu Cys Phe Asp Cys Gln Ser Cys Lys Ala Gly Leu Leu Asp

    210                 215                 220

Asn Val Lys Ser Ala Trp Lys Lys Val Ala Ile Val Asn Ile Val Phe

225                 230                 235                 240

Leu Val Phe Leu Ile Ile Val Tyr Ser Val Gly Cys Cys Ala Phe Arg

                245                 250                 255

Asn Asn Lys Arg Asp Asp Ser Tyr Ser Arg Thr Tyr Gly Tyr Lys Pro

            260                 265                 270

<210>6

<211>792

<212>DNA

<213>鼠耳芥

<400>6

atggttcagt gtagcaacaa tctcctcgga atcctcaatt tcttcacatt cctcctctca 60

atcccaattc tctccgccgg gatctggctc ggcaaaaatg cagcaaccga atgcgaacgt 120

ttcctcgaca aaccaatggt cgtactcgga atcttcctca tgttcgtctc aatcgccgga 180

ctcgtcggtg cttgttgccg tgtctcttgc ctcctctggc tttacctctt cgctatgttc 240

ctcctcattc tcctcggctt ctgtttcaca atcttcgctt tcgcagtcac aaaccgcggc 300

gccggtgagg ttatatcgga tcgagggtat aaagagtatc atgtcgccga ttactctaat 360

tggttgcaga aacgtgtcaa caatgctaag aattgggaac ggatcaggag ttgtttgatg 420

tactctgacg tttgctccac ttatcgtact cgttatgcca gcattaacgt tgaagatttc 480

tacaaatcta atcttaatgc tcttcagtct ggttgttgta agccgtccaa tgactgtaac 540

ttcacctatg tgaacccgac tacttggaca aagactcctg gtccatacaa aaacgaggac 600

tgtaatgtgt gggacaacaa accaggaact ctctgctacg actgtgaagc ctgcaaggct 660

ggtctgcttg acaacatcaa gaactcatgg aaaaaggtgg ctaaggtcaa cattgtcttc 720

ctcatattcc tcattatcgt ctactctgtt ggttgttgtg cgttcaggaa caacaggaaa 780

cgcagttggt aa                                                     792

<210>7

<211>263

<212>PRT

<213>鼠耳芥

<400>7

Met Val Gln Cys Ser Asn Asn Leu Leu Gly Ile Leu Asn Phe Phe Thr

  1               5                  10                  15

Phe Leu Leu Ser Ile Pro Ile Leu Ser Ala Gly Ile Trp Leu Gly Lys

             20                  25                  30

Asn Ala Ala Thr Glu Cys Glu Arg Phe Leu Asp Lys Pro Met Val Val

         35                  40                  45

Leu Gly Ile Phe Leu Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Leu Val Gly Ala

     50                  55                  60

Cys Cys Arg Val Ser Cys Leu Leu Trp Leu Tyr Leu Phe Ala Met Phe

 65                  70                  75                  80

Leu Leu Ile Leu Leu Gly Phe Cys Phe Thr Ile Phe Ala Phe Ala Val

                 85                  90                  95

Thr Asn Arg Gly Ala Gly Glu Val Ile Ser Asp Arg Gly Tyr Lys Glu

            100                 105                 110

Tyr His Val Ala Asp Tyr Ser Asn Trp Leu Gln Lys Arg Val Asn Asn

        115                 120                 125

Ala Lys Asn Trp Glu Arg Ile Arg Ser Cys Leu Met Tyr Ser Asp Val

    130                 135                 140

Cys Ser Thr Tyr Arg Thr Arg Tyr Ala Ser Ile Asn Val Glu Asp Phe

145                 150                 155                 160

Tyr Lys Ser Asn Leu Asn Ala Leu Gln Ser Gly Cys Cys Lys Pro Ser

                165                 170                 175

Asn Asp Cys Asn Phe Thr Tyr Val Asn Pro Thr Thr Trp Thr Lys Thr

            180                 185                 190

Pro Gly Pro Tyr Lys Asn Glu Asp Cys Asn Val Trp Asp Asn Lys Pro

        195                 200                 205

Gly Thr Leu Cys Tyr Asp Cys Glu Ala Cys Lys Ala Gly Leu Leu Asp

    210                 215                 220

Asn Ile Lys Asn Ser Trp Lys Lys Val Ala Lys Val Asn Ile Val Phe

225                 230                 235                 240

Leu Ile Phe Leu Ile Ile Val Tyr Ser Val Gly Cys Cys Ala Phe Arg

                245                 250                 255

Asn Asn Arg Lys Arg Ser Trp

            260

<210>8

<211>984

<212>DNA

<213>鼠耳芥

<400>8

atgagatcga gaagtaacct tataggtctc ataaacttct tcactttcct cctgtcgatt 60

cctatcctcg gcggtggaat atggcttagc agccgagcta actcaaccga ttgcctcaga 120

ttcctccagt ggccactcat tatcatcgga atatcaatca tggtcatatc tttagccgga 180

atcgccggag cttgttacca aaacaagttc ctcatgtggc tttacctttt caccatgttc 240

tttgtaatcg ctgctcttat aggattcaca atcttcgctt acgtagttac tgataaaggc 300

tcaggccggt ttgtgatgaa ccgtcggtat cttgattatt atctcaatga ttattccggt 360

tggttaaagg accgtgtcac agataatgga tattggagag atatcggatc gtgtgttaga 420

gattctggag tttgtaagaa gattggaaga gatttaaatg gtgttccaga aactgctcat 480

atgttttact tcagaaatct ttctcctgtt gagtccggat gttgcaagcc gccaacagat 540

tgtggctata cgtacgtgaa cgagacagtg tggattccgg gaggagaaat ggtgggaccg 600

aacccggact gtatgttgtg gaacaatgac cagagactac tctgttacca atgcagctct 660

tgtaaagccg gtgttcttgg tagcttgaaa aagagttgga gaaaagtctc ggtgatcaac 720

atcgtggttg tgatcatact tgttatcttc tatgtcatcg cgtgtgcggc ttaccagaat 780

gttaagagga tgtataatga cgaaccggtc ggtgaggcta ggatgaccaa tctcatccta 840

gtcattttca aatttaagga gattttggta cagtttttct tcggaattgt gtttttatta 900

ctctttaatg gtttaatggt ctgttgttgt aatgataaat ttgcttttag tgttttcttc 960

tttggatatg ttacatatgc atga                                        984

<210>9

<211>327

<212>PRT

<213>鼠耳芥

<400>9

Met Arg Ser Arg Ser Asn Leu Ile Gly Leu Ile Asn Phe Phe Thr Phe

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ser Ile Pro Ile Leu Gly Gly Gly Ile Trp Leu Ser Ser Arg

             20                  25                  30

Ala Asn Ser Thr Asp Cys Leu Arg Phe Leu Gln Trp Pro Leu Ile Ile

         35                  40                  45

Ile Gly Ile Ser Ile Met Val Ile Ser Leu Ala Gly Ile Ala Gly Ala

     50                  55                  60

Cys Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Met Trp Leu Tyr Leu Phe Thr Met Phe

 65                  70                  75                  80

Phe Val Ile Ala Ala Leu Ile Gly Phe Thr Ile Phe Ala Tyr Val Val

                 85                  90                  95

Thr Asp Lys Gly Ser Gly Arg Phe Val Met Asn Arg Arg Tyr Leu Asp

            100                 105                 110

Tyr Tyr Leu Asn Asp Tyr Ser Gly Trp Leu Lys Asp Arg Val Thr Asp

        115                 120                 125

Asn Gly Tyr Trp Arg Asp Ile Gly Ser Cys Val Arg Asp Ser Gly Val

    130                 135                 140

Cys Lys Lys Ile Gly Arg Asp Leu Asn Gly Val Pro Glu Thr Ala His

145                 150                 155                 160

Met Phe Tyr Phe Arg Asn Leu Ser Pro Val Glu Ser Gly Cys Cys Lys

                165                 170                 175

Pro Pro Thr Asp Cys Gly Tyr Thr Tyr Val Asn Glu Thr Val Trp Ile

            180                 185                 190

Pro Gly Gly Glu Met Val Gly Pro Asn Pro Asp Cys Met Leu Trp Asn

        195                 200                 205

Asn Asp Gln Arg Leu Leu Cys Tyr Gln Cys Ser Ser Cys Lys Ala Gly

    210                 215                 220

Val Leu Gly Ser Leu Lys Lys Ser Trp Arg Lys Val Ser Val Ile Asn

225                 230                 235                 240

Ile Val Val Val Ile Ile Leu Val Ile Phe Tyr Val Ile Ala Cys Ala

                245                 250                 255

Ala Tyr Gln Asn Val Lys Arg Met Tyr Asn Asp Glu Pro Val Gly Glu

            260                 265                 270

Ala Arg Met Thr Asn Leu Ile Leu Val Ile Phe Lys Phe Lys Glu Ile

        275                 280                 285

Leu Val Gln Phe Phe Phe Gly Ile Val Phe Leu Leu Leu Phe Asn Gly

    290                 295                 300

Leu Met Val Cys Cys Cys Asn Asp Lys Phe Ala Phe Ser Val Phe Phe

305                 310                 315                 320

Phe Gly Tyr Val Thr Tyr Ala

                325

<210>10

<211>858

<212>DNA

<213>鼠耳芥

<400>10

atgagaacaa gcaaccatct cataggttta gtcaacttcc tcactttcct cctctcaata 60

ccaatcctcg gcggtggaat atggttaagc agccgagcta actccaccga ctgtttaaga 120

ttccttcaat ggcctctcat cgtcatcgga atctcaatca tggtcgtatc tttagctgga 180

ttcgctggag cttgttaccg taacaagttc cttatgtggc tatacctagt agtcatgctt 240

ctcatcatcg ctgctcttat cggtttcatc atcttcgctt acgcggttac agataaagga 300

tccggtcgaa ccgtacttaa ccggggttat cttgactatt atcttgaaga ttactctggt 360

tggttgaaag atcgagtttc tgatgatagc tattggggta aaattagttc ttgtcttaga 420

gattctggtg cttgtagaaa gattggaaga aattttaatg gtgtacctga aactgctgat 480

atgttcttcc ttagaagact tagccctgtt gagtccggtt gttgcaagcc accaacagat 540

tgcggttttt catatgtgaa tgagaccgga tgggacacga gaggagggat gataggaccg 600

aaccaggact gtatggtgtg gagcaacgac cagagcatgc tctgttatca gtgtagttct 660

tgtaaagctg gtgttcttgg gagtttgaag aagagttgga gaaaagtatc ggtgatcaac 720

attgtggtac ttatcattct agttatcttt tacgttatcg cttatgcagc ttataggaat 780

gtcaagagga tcgataacga tgaaccggct ggtgaagcta ggatgacaaa atcacatcct 840

agtcatttcc atctttga                                               858

<210>11

<211>285

<212>PRT

<213>鼠耳芥

<400>11

Met Arg Thr Ser Asn His Leu Ile Gly Leu Val Asn Phe Leu Thr Phe

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ser Ile Pro Ile Leu Gly Gly Gly Ile Trp Leu Ser Ser Arg

             20                  25                  30

Ala Asn Ser Thr Asp Cys Leu Arg Phe Leu Gln Trp Pro Leu Ile Val

         35                  40                  45

Ile Gly Ile Ser Ile Met Val Val Ser Leu Ala Gly Phe Ala Gly Ala

     50                  55                  60

Cys Tyr Arg Asn Lys Phe Leu Met Trp Leu Tyr Leu Val Val Met Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Ile Ile Ala Ala Leu Ile Gly Phe Ile Ile Phe Ala Tyr Ala Val

                  85                  90                  95

Thr Asp Lys Gly Ser Gly Arg Thr Val Leu Asn Arg Gly Tyr Leu Asp

            100                 105                 110

Tyr Tyr Leu Glu Asp Tyr Ser Gly Trp Leu Lys Asp Arg Val Ser Asp

        115                 120                 125

Asp Ser Tyr Trp Gly Lys Ile Ser Ser Cys Leu Arg Asp Ser Gly Ala

    130                 135                 140

Cys Arg Lys Ile Gly Arg Asn Phe Asn Gly Val Pro Glu Thr Ala Asp

145                 150                 155                 160

Met Phe Phe Leu Arg Arg Leu Ser Pro Val Glu Ser Gly Cys Cys Lys

                165                 170                 175

Pro Pro Thr Asp Cys Gly Phe Ser Tyr Val Asn Glu Thr Gly Trp Asp

            180                 185                 190

Thr Arg Gly Gly Met Ile Gly Pro Asn Gln Asp Cys Met Val Trp Ser

        195                 200                 205

Asn Asp Gln Ser Met Leu Cys Tyr Gln Cys Ser Ser Cys Lys Ala Gly

    210                 215                 220

Val Leu Gly Ser Leu Lys Lys Ser Trp Arg Lys Val Ser Val Ile Asn

225                 230                 235                 240

Ile Val Val Leu Ile Ile Leu Val Ile Phe Tyr Val Ile Ala Tyr Ala

                245                 250                 255

Ala Tyr Arg Asn Val Lys Arg Ile Asp Asn Asp Glu Pro Ala Gly Glu

            260                 265                 270

Ala Arg Met Thr Lys Ser His Pro Ser His Phe His Leu

        275                 280                 285

<210>12

<211>849

<212>DNA

<213>鼠耳芥

<400>12

atgtacagat tcagcaacac agttattggg gtcttaaacc ttctcacctt actagcctcg 60

attccaatca tcggaaccgc tttatacaag gcaagaagca gcacgacatg tgaaaacttc 120

ctccagacgc cgctacttgt tataggattc atcatactca tagtttccct tgcgggattc 180

ataggagcct gcttcaacgt ggcatgggct ctttgggtgt acttagtggt catgatcttc 240

ctcatcgcta ccctaatggg tctaacgcta tttggtctgg tggtgacgag ccaaggaggt 300

ggagtggaag tgccagggag gatttataaa gagtataggc ttggagacta tcatccatgg 360

ttgagagaga gagttaggga tcctgagtat tggaactcca ttagaagctg tatcttgagt 420

tccaagactt gtactaagat tgagtcttgg actacacttg attatttcca aagagacatg 480

acttctgttc agtcgggatg ttgtaagcca ccgacggcgt gtacgtacga agctggagta 540

gtggacggag gaggagattg cttcagatgg aacaatggag tggagatgtt atgctacgag 600

tgcgatgctt gcaaggctgg tgttctcgaa gagatccgtc tcgactggag aaagttatcg 660

gttgtcaaca ttctcgtcct cgtcctcctc atcgcggtct acgccgctgg ttgctgcgcc 720

ttccacaaca ctcgccacgc agctcatcct taccatccat ctgatgataa ccgcatgacc 780

agagtccgtc ctcgttggga ctattactgg tggagatggt ggcacgaaaa gaaagagcag 840

ctttactaa                                                         849

<210>13

<211>282

<212>PRT

<213>鼠耳芥

<400>13

Met Tyr Arg Phe Ser Asn Thr Val Ile Gly Val Leu Asn Leu Leu Thr

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Ser Ile Pro Ile Ile Gly Thr Ala Leu Tyr Lys Ala Arg

             20                  25                  30

Ser Ser Thr Thr Cys Glu Asn Phe Leu Gln Thr Pro Leu Leu Val Ile

         35                  40                  45

Gly Phe Ile Ile Leu Ile Val Ser Leu Ala Gly Phe Ile Gly Ala Cys

     50                  55                  60

Phe Asn Val Ala Trp Ala Leu Trp Val Tyr Leu Val Val Met Ile Phe

 65                  70                  75                  80

Leu Ile Ala Thr Leu Met Gly Leu Thr Leu Phe Gly Leu Val Val Thr

                 85                  90                  95

Ser Gln Gly Gly Gly Val Glu Val Pro Gly Arg Ile Tyr Lys Glu Tyr

            100                 105                 110

Arg Leu Gly Asp Tyr His Pro Trp Leu Arg Glu Arg Val Arg Asp Pro

        115                 120                 125

Glu Tyr Trp Asn Ser Ile Arg Ser Cys Ile Leu Ser Ser Lys Thr Cys

    130                 135                 140

Thr Lys Ile Glu Ser Trp Thr Thr Leu Asp Tyr Phe Gln Arg Asp Met

145                 150                 155                 160

Thr Ser Val Gln Ser Gly Cys Cys Lys Pro Pro Thr Ala Cys Thr Tyr

                165                 170                 175

Glu Ala Gly Val Val Asp Gly Gly Gly Asp Cys Phe Arg Trp Asn Asn

            180                 185                 190

Gly Val Glu Met Leu Cys Tyr Glu Cys Asp Ala Cys Lys Ala Gly Val

        195                 200                 205

Leu Glu Glu Ile Arg Leu Asp Trp Arg Lys Leu Ser Val Val Asn Ile

    210                 215                 220

Leu Val Leu Val Leu Leu Ile Ala Val Tyr Ala Ala Gly Cys Cys Ala

225                 230                 235                 240

Phe His Asn Thr Arg His Ala Ala His Pro Tyr His Pro Ser Asp Asp

                245                 250                 255

Asn Arg Met Thr Arg Val Arg Pro Arg Trp Asp Tyr Tyr Trp Trp Arg

            260                 265                 270

Trp Trp His Glu Lys Lys Glu Gln Leu Tyr

        275                 280

<210>14

<211>810

<212>DNA

<213>鼠耳芥

<400>14

atgcctttaa gcaacaatgt aattggttgc ataaacttca tcaccgtcct cctctccatt 60

ccggtcatcg gcgccggaat ctggctagcc ataggaacag taaactcatg cgtcaagctt 120

cttcaatggc cagtaataat cctcggagtc ttaatcctct tagtgggtct cgctggtttc 180

attggagggt tttggagaat cacatggctt cttgttgttt acttaatcgc catgcttatt 240

ctcattgtac ttttgggttg ccttgtcgga tttatttaca tggttaccat aagaggctct 300

ggtcatccag aaccaagtag agcttatctt gagtatagtc ttcaagattt ctctggttgg 360

ttacgtagaa gagttcagag atcttataaa tgggaaagga ttcgtacttg tttgagtaca 420

actaccattt gccctgaact aaatcagaga tacactttgg ctcaagattt cttcaatgct 480

catcttgatc ccattcaatc tggttgctgc aagcccccaa caaaatgtgg attcacattt 540

gttaatccta cttattggat aagtcccata gatatgtctg ctgatatgga ttgtctaaat 600

tggagcaatg accaaaacac tttgtgttac acttgtgatt cttgtaaagc cggcttgctc 660

gcaaatatta aggtagattg gttaaaagcg gatatctttc tactcttggc gcttatcgga 720

ttgattatcg tctacattat cgggtgctgc gcattccgta atgcggaaac tgaggatatt 780

ttcaggaagt acaagcaggg ttatacttga                                  810

<210>15

<211>269

<212>PRT

<213>鼠耳芥

<400>15

Met Pro Leu Ser Asn Asn Val Ile Gly Cys Ile Asn Phe Ile Thr Val

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ser Ile Pro Val Ile Gly Ala Gly Ile Trp Leu Ala Ile Gly

             20                  25                  30

Thr Val Asn Ser Cys Val Lys Leu Leu Gln Trp Pro Val Ile Ile Leu

        35                  40                  45

Gly Val Leu Ile Leu Leu Val Gly Leu Ala Gly Phe Ile Gly Gly Phe

    50                  55                  60

Trp Arg Ile Thr Trp Leu Leu Val Val Tyr Leu Ile Ala Met Leu Ile

 65                  70                  75                  80

Leu Ile Val Leu Leu Gly Cys Leu Val Gly Phe Ile Tyr Met Val Thr

                 85                  90                  95

Ile Arg Gly Ser Gly His Pro Glu Pro Ser Arg Ala Tyr Leu Glu Tyr

            100                 105                 110

Ser Leu Gln Asp Phe Ser Gly Trp Leu Arg Arg Arg Val Gln Arg Ser

        115                 120                 125

Tyr Lys Trp Glu Arg Ile Arg Thr Cys Leu Ser Thr Thr Thr Ile Cys

    130                 135                 140

Pro Glu Leu Asn Gln Arg Tyr Thr Leu Ala Gln Asp Phe Phe Asn Ala

145                 150                 155                 160

His Leu Asp Pro Ile Gln Ser Gly Cys Cys Lys Pro Pro Thr Lys Cys

                165                 170                 175

Gly Phe Thr Phe Val Asn Pro Thr Tyr Trp Ile Ser Pro Ile Asp Met

            180                 185                 190

Ser Ala Asp Met Asp Cys Leu Asn Trp Ser Asn Asp Gln Asn Thr Leu

        195                 200                 205

Cys Tyr Thr Cys Asp Ser Cys Lys Ala Gly Leu Leu Ala Asn Ile Lys

    210                 215                 220

Val Asp Trp Leu Lys Ala Asp Ile Phe Leu Leu Leu Ala Leu Ile Gly

225                 230                 235                 240

Leu Ile Ile Val Tyr Ile Ile Gly Cys Cys Ala Phe Arg Asn Ala Glu

                245                 250                 255

Thr Glu Asp Ile Phe Arg Lys Tyr Lys Gln Gly Tyr Thr

            260                 265

<210>16

<211>813

<212>DNA

<213>鼠耳芥

<400>16

atggcgttag cgaataactt aacggcgata ctcaacttac tagcgttact ctgttccata 60

ccaataacgg cgtcaggtat atggctagct tcaaagccag acaacgagtg tgtcaatctc 120

ctccgttggc ccgttgtcgt cctcggcgtt ctcatcctcg tcgtctccgc cacaggcttc 180

atcggcgcct acaagtacaa ggaaactcta ctggcggttt acttgtgctg tatggcgata 240

ttgatcggac ttttgctggt ggttcttata tttgcattcg tcgtgacccg gcccgatgga 300

tcgtatcggg ttccgggtag aggttataaa gagtataggc ttgaagggtt ctcgaattgg 360

cttaaggaga acgttgtgga ttccaagaac tggggaaggc taagggcttg tttggctgat 420

actaatgttt gtcctaaact caaccaagaa ttcatcaccg ccgatcagtt cttctcctcc 480

tctaagatca ctcctctcca gtccggctgc tgcaaaccac caaccgcatg tggctacaac 540

tttgtgaacc caacactgtg gctaaatcca accaatatgg ctgcagacgc agactgttac 600

ttatggagca atgaccaaag ccagctttgt tacaattgca actcatgcaa agctggttta 660

ttgggaaacc ttagaaaaga atggcgtaaa gcaaatctca tacttatcat cacagtcgtt 720

gttctcatat gggtttatgt tattgcttgt agcgcgttta ggaatgctca gactgaggat 780

ctcttccgca aatacaaaca aggttgggtc taa                              813

<210>17

<211>270

<212>PRT

<213>鼠耳芥

<400>17

Met Ala Leu Ala Asn Asn Leu Thr Ala Ile Leu Asn Leu Leu Ala Leu

  1               5                  10                  15

Leu Cys Ser Ile Pro Ile Thr Ala Ser Gly Ile Trp Leu Ala Ser Lys

             20                  25                  30

Pro Asp Asn Glu Cys Val Asn Leu Leu Arg Trp Pro Val Val Val Leu

         35                  40                  45

Gly Val Leu Ile Leu Val Val Ser Ala Thr Gly Phe Ile Gly Ala Tyr

     50                  55                  60

Lys Tyr Lys Glu Thr Leu Leu Ala Val Tyr Leu Cys Cys Met Ala Ile

 65                  70                  75                  80

Leu Ile Gly Leu Leu Leu Val Val Leu Ile Phe Ala Phe Val Val Thr

                 85                  90                  95

Arg Pro Asp Gly Ser Tyr Arg Val Pro Gly Arg Gly Tyr Lys Glu Tyr

            100                 105                 110

Arg Leu Glu Gly Phe Ser Asn Trp Leu Lys Glu Asn Val Val Asp Ser

        115                 120                 125

Lys Asn Trp Gly Arg Leu Arg Ala Cys Leu Ala Asp Thr Asn Val Cys

    130                 135                 140

Pro Lys Leu Asn Gln Glu Phe Ile Thr Ala Asp Gln Phe Phe Ser Ser

145                 150                 155                 160

Ser Lys Ile Thr Pro Leu Gln Ser Gly Cys Cys Lys Pro Pro Thr Ala

                165                 170                 175

Cys Gly Tyr Asn Phe Val Asn Pro Thr Leu Trp Leu Asn Pro Thr Asn

            180                 185                 190

Met Ala Ala Asp Ala Asp Cys Tyr Leu Trp Ser Asn Asp Gln Ser Gln

        195                 200                 205

Leu Cys Tyr Asn Cys Asn Ser Cys Lys Ala Gly Leu Leu Gly Asn Leu

    210                 215                 220

Arg Lys Glu Trp Arg Lys Ala Asn Leu Ile Leu Ile Ile Thr Val Val

225                 230                 235                 240

Val Leu Ile Trp Val Tyr Val Ile Ala Cys Ser Ala Phe Arg Asn Ala

                245                 250                 255

Gln Thr Glu Asp Leu Phe Arg Lys Tyr Lys Gln Gly Trp Val

            260                 265                 270

<210>18

<211>816

<212>DNA

<213>鼠耳芥

<400>18

atgtttcgag ttagcaattt catggttggt ctagcaaaca cattggtgat gttagtgggc 60

gcttcggcca ttggttattc gatttacatg ttcgttcacc aaggcgtcac tgattgtgaa 120

tctgccattc ggataccact tctcacgacc ggactcatcc tcttcttggt gtctttgctc 180

ggagtgattg gatcttgttt caaggagaat ttggcaatgg tttcctactt gatcatattg 240

tttgggggca ttgttgcatt gatgattttc tccatatttc tcttctttgt gaccaacaaa 300

ggagccggtc gtgtggtgtc cggtcgaggg tataaagagt accggacggt ggatttctcg 360

acgtggctta atgggttcgt tggtgggaag agatgggttg ggataaggtc ttgtttggct 420

gaggctaacg tttgtgatga tttgagtgat ggtcgtgtta gtcagatcgc tgatgcgttt 480

tatcacaaga acttgtctcc catccagtca ggttgttgta agccaccatc ggattgcaac 540

ttcgagttca gaaacgcgac gttctggata ccgccgagca aaaacgaaac ggcagttgcg 600

gaaaacgggg actgtggtac gtggagcaac gtgcaaacag agttatgttt caactgcaac 660

gcatgcaaag cgggtgtgtt agcgaacata agagagaagt ggaggaatct tcttgttttc 720

aacatttgtc tcctcattct cctcataacc gtctattcct gcggttgctg tgctcgtcgt 780

aacaatcgga cggctaggaa aagtgattct gtctga                           816

<210>19

<211>271

<212>PRT

<213>鼠耳芥

<400>19

Met Phe Arg Val Ser Asn Phe Met Val Gly Leu Ala Asn Thr Leu Val

  1               5                  10                  15

Met Leu Val Gly Ala Ser Ala Ile Gly Tyr Ser Ile Tyr Met Phe Val

             20                  25                  30

His Gln Gly Val Thr Asp Cys Glu Ser Ala Ile Arg Ile Pro Leu Leu

         35                  40                  45

Thr Thr Gly Leu Ile Leu Phe Leu Val Ser Leu Leu Gly Val Ile Gly

     50                  55                  60

Ser Cys Phe Lys Glu Asn Leu Ala Met Val Ser Tyr Leu Ile Ile Leu

 65                  70                  75                  80

Phe Gly Gly Ile Val Ala Leu Met Ile Phe Ser Ile Phe Leu Phe Phe

                 85                  90                  95

Val Thr Asn Lys Gly Ala Gly Arg Val Val Ser Gly Arg Gly Tyr Lys

            100                 105                 110

Glu Tyr Arg Thr Val Asp Phe Ser Thr Trp Leu Asn Gly Phe Val Gly

        115                 120                 125

Gly Lys Arg Trp Val Gly Ile Arg Ser Cys Leu Ala Glu Ala Asn Val

    130                 135                 140

Cys Asp Asp Leu Ser Asp Gly Arg Val Ser Gln Ile Ala Asp Ala Phe

145                 150                 155                 160

Tyr His Lys Asn Leu Ser Pro Ile Gln Ser Gly Cys Cys Lys Pro Pro

                165                 170                 175

Ser Asp Cys Asn Phe Glu Phe Arg Asn Ala Thr Phe Trp Ile Pro Pro

            180                 185                 190

Ser Lys Asn Glu Thr Ala Val Ala Glu Asn Gly Asp Cys Gly Thr Trp

        195                 200                 205

Ser Asn Val Gln Thr Glu Leu Cys Phe Asn Cys Asn Ala Cys Lys Ala

    210                 215                 220

Gly Val Leu Ala Asn Ile Arg Glu Lys Trp Arg Asn Leu Leu Val Phe

225                 230                 235                 240

Asn Ile Cys Leu Leu Ile Leu Leu Ile Thr Val Tyr Ser Cys Gly Cys

                245                 250                 255

Cys Ala Arg Arg Asn Asn Arg Thr Ala Arg Lys Ser Asp Ser Val

            260                 265                 270

<210>20

<211>705

<212>DNA

<213>鼠耳芥

<400>20

atgagcaata cagtgatagg attcttgaat atcctaacac taatttcctc catagttcta 60

ttaggatcag ctctatggat gggtaggagc aaaacgacat gcgagcattt tcttcagaag 120

ccacttttga tcttaggcct agctatcttg atcttgtcag tagctggtct agtcggtgca 180

tgttgtgacg tggcttgggt cttgtgggtg tacctcttct tcatggtctt catcatagtc 240

gcactcatgg gtttgacctt gtttggattc atagtgacta gccatagtgg tggtgtggtt 300

gtcgatggta gggtttataa agagtttaag cttgaagcat atcacccttg gcttaagaca 360

agggtggtag atactaatta ttgggttact ataaagactt gtctcttggg ctcagtcact 420

tgttccaagc tcgctctttg gactcctctt gattatctcc aaaaagactt atctcctctt 480

cagctgttta ctgtgttggc tgttgcgcgt ttaaaaacgc caaacgccct caacattacg 540

gcttccctta tggacgttac ggcatgtcca aatccagacc tggatgggaa cagtcctggt 600

ttgttctctt ttctaatgca acaattattt ttattatttt cgcggcatgt aggtcaaggt 660

ggtggcatgg gagagatcgg tattagtgaa aaatatttat gttaa                 705

<210>21

<211>234

<212>PRT

<213>鼠耳芥

<400>21

Met Ser Asn Thr Val Ile Gly Phe Leu Asn Ile Leu Thr Leu Ile Ser

  1               5                  10                  15

Ser Ile Val Leu Leu Gly Ser Ala Leu Trp Met Gly Arg Ser Lys Thr

             20                  25                  30

Thr Cys Glu His Phe Leu Gln Lys Pro Leu Leu Ile Leu Gly Leu Ala

         35                  40                  45

Ile Leu Ile Leu Ser Val Ala Gly Leu Val Gly Ala Cys Cys Asp Val

     50                  55                  60

Ala Trp Val Leu Trp Val Tyr Leu Phe Phe Met Val Phe Ile Ile Val

 65                  70                  75                  80

Ala Leu Met Gly Leu Thr Leu Phe Gly Phe Ile Val Thr Ser His Ser

                 85                  90                  95

Gly Gly Val Val Val Asp Gly Arg Val Tyr Lys Glu Phe Lys Leu Glu

            100                 105                 110

Ala Tyr His Pro Trp Leu Lys Thr Arg Val Val Asp Thr Asn Tyr Trp

        115                 120                 125

Val Thr Ile Lys Thr Cys Leu Leu Gly Ser Val Thr Cys Ser Lys Leu

    130                 135                 140

Ala Leu Trp Thr Pro Leu Asp Tyr Leu Gln Lys Asp Leu Ser Pro Leu

145                 150                 155                 160

Gln Leu Phe Thr Val Leu Ala Val Ala Arg Leu Lys Thr Pro Asn Ala

                165                 170                 175

Leu Asn Ile Thr Ala Ser Leu Met Asp Val Thr Ala Cys Pro Asn Pro

            180                 185                 190

Asp Leu Asp Gly Asn Ser Pro Gly Leu Phe Ser Phe Leu Met Gln Gln

        195                 200                 205

Leu Phe Leu Leu Phe Ser Arg His Val Gly Gln Gly Gly Gly Met Gly

    210                 215                 220

Glu Ile Gly Ile Ser Glu Lys Tyr Leu Cys

225                 230

<210>22

<211>795

<212>DNA

<213>鼠耳芥

<400>22

atgctccggc taagcaacgc cgccgtaata acaaccaatg caattctcgc attgatcggc 60

ctcgccgctc tatctttttc cgtctacgtc tacgttcaag gcccatcaca gtgtcaacgt 120

ttcgttcaaa accctctcat tgtaactgcg gctctcctct tcttcatctc gtccttaggc 180

cttatcgctg ctctctacgg tagccacatc atcatcacac tctatctctt cttccttttc 240

ctctccattc ttctgcttct tgtcctctct gtctttatct tcctcgtcac gaatcccacc 300

gccggaaaag cgttatccgg tagaggaata ggcaatgtca agaccggaga ttatcagaac 360

tggatcggga accatttcct tcgtgggaag aattgggaag ggatcaccaa atgtttgtct 420

gattctaggg tttgtaaaag gtttggtcca cgtgacattg actttgactc caaacatctc 480

tctaatgtac agtttggttg ttgtcgacct cccgtagaat gtgggttcga atcaaagaat 540

gccacgtggt ggacagttcc tgccacagcg actacggcga ttatagggga ttgtaaggca 600

tggagtaaca cgcagagaca gttatgttac gcgtgcgagt cgtgtaagat tggagtttta 660

aaagggataa gaaaaagatg gaggatactt attgtcgtca atctccttct tatccttctc 720

gtcgtttttc tttactcgtg tggctgttgc gtgagaaaga acaatcgtgt tccatggaag 780

cgccggttct tctaa                                                  795

<210>23

<211>264

<212>PRT

<213>鼠耳芥

<400>23

Met Leu Arg Leu Ser Asn Ala Ala Val lle Thr Thr Asn Ala Ile Leu

  1               5                  10                  15

Ala Leu Ile Gly Leu Ala Ala Leu Ser Phe Ser Val Tyr Val Tyr Val

             20                  25                  30

Gln Gly Pro Ser Gln Cys Gln Arg Phe Val Gln Asn Pro Leu Ile Val

        35                  40                  45

Thr Ala Ala Leu Leu Phe Phe Ile Ser Ser Leu Gly Leu Ile Ala Ala

     50                  55                  60

Leu Tyr Gly Ser His Ile Ile Ile Thr Leu Tyr Leu Phe Phe Leu Phe

 65                  70                  75                  80

Leu Ser Ile Leu Leu Leu Leu Val Leu Ser Val Phe Ile Phe Leu Val

                 85                  90                  95

Thr Asn Pro Thr Ala Gly Lys Ala Leu Ser Gly Arg Gly Ile Gly Asn

            100                 105                 110

Val Lys Thr Gly Asp Tyr Gln Asn Trp Ile Gly Asn His Phe Leu Arg

        115                 120                 125

Gly Lys Asn Trp Glu Gly Ile Thr Lys Cys Leu Ser Asp Ser Arg Val

    130                 135                 140

Cys Lys Arg Phe Gly Pro Arg Asp Ile Asp Phe Asp Ser Lys His Leu

145                 150                 155                 160

Ser Asn Val Gln Phe Gly Cys Cys Arg Pro Pro Val Glu Cys Gly Phe

                165                 170                 175

Glu Ser Lys Asn Ala Thr Trp Trp Thr Val Pro Ala Thr Ala Thr Thr

            180                 185                 190

Ala Ile Ile Gly Asp Cys Lys Ala Trp Ser Asn Thr Gln Arg Gln Leu

        195                 200                 205

Cys Tyr Ala Cys Glu Ser Cys Lys Ile Gly Val Leu Lys Gly Ile Arg

    210                 215                 220

Lys Arg Trp Arg Ile Leu Ile Val Val Asn Leu Leu Leu Ile Leu Leu

225                 230                 235                 240

Val Val Phe Leu Tyr Ser Cys Gly Cys Cys Val Arg Lys Asn Asn Arg

                245                 250                 255

Val Pro Trp Lys Arg Arg Phe Phe

            260

<210>24

<211>654

<212>DNA

<213>鼠耳芥

<400>24

atgattgatt ttcctttgaa gtatcttgcc gtgctcctga tcgttttgat cgcgattctt 60

gtctttaccg tactggcgtt cattgtaaca aacaatggtt ctggccatac taaccctggt 120

ttaaggtaca aggagtataa gctgaatgat tacagctcat ggtttctaaa acagcttaac 180

aacaccagta actggataag actaaagagt tgtcttgtta aatccgagca atgtcggaag 240

ctttccaaga aatacaagac catcaaacag ttgaaatccg cagaattaac cccgatagaa 300

gctggatgtt gtcgaccacc atctgagtgt ggttatcctg cggtgaatgc ttcttactat 360

gacttgagct ttcattcgat aagttctaac aaagattgta agctttacaa gaatttgagg 420

actatcaagt gctacaactg tgattcttgc aaagctggag ttgctcagta catgaaaacc 480

gagtggcgac ttgttgcgat cttcaatgtg gtcctgtttg ttgtcttgat aagctctctt 540

cttagcacga gatttgactc tgaacaaagt tttggccttt taaacggttt agtgcaaatt 600

tccaacataa cctttaaaga ttgccaaacc acaacagtac caaaacagtt ttaa       654

<210>25

<211>217

<212>PRT

<213>鼠耳芥

<400>25

Met Ile Asp Phe Pro Leu Lys Tyr Leu Ala Val Leu Leu Ile Val Leu

  1               5                  10                  15

Ile Ala Ile Leu Val Phe Thr Val Leu Ala Phe Ile Val Thr Asn Asn

             20                  25                  30

Gly Ser Gly His Thr Asn Pro Gly Leu Arg Tyr Lys Glu Tyr Lys Leu

         35                  40                  45

Asn Asp Tyr Ser Ser Trp Phe Leu Lys Gln Leu Asn Asn Thr Ser Asn

     50                  55                  60

Trp Ile Arg Leu Lys Ser Cys Leu Val Lys Ser Glu Gln Cys Arg Lys

 65                  70                  75                  80

Leu Ser Lys Lys Tyr Lys Thr Ile Lys Gln Leu Lys Ser Ala Glu Leu

                 85                  90                  95

Thr Pro Ile Glu Ala Gly Cys Cys Arg Pro Pro Ser Glu Cys Gly Tyr

            100                 105                 110

Pro Ala Val Asn Ala Ser Tyr Tyr Asp Leu Ser Phe His Ser Ile Ser

        115                 120                 125

Ser Asn Lys Asp Cys Lys Leu Tyr Lys Asn Leu Arg Thr Ile Lys Cys

    130                 135                 140

Tyr Asn Cys Asp Ser Cys Lys Ala Gly Val Ala Gln Tyr Met Lys Thr

145                 150                 155                 160

Glu Trp Arg Leu Val Ala Ile Phe Asn Val Val Leu Phe Val Val Leu

                165                 170                 175

Ile Ser Ser Leu Leu Ser Thr Arg Phe Asp Ser Glu Gln Ser Phe Gly

            180                 185                 190

Leu Leu Asn Gly Leu Val Gln Ile Ser Asn Ile Thr Phe Lys Asp Cys

        195                 200                 205

Gln Thr Thr Thr Val Pro Lys Gln Phe

    210                 215

<210>26

<211>837

<212>DNA

<213>鼠耳芥

<400>26

atggcgagag ataaagaaga tcaaaacaat gagaatcctt caattgtcca gaacatgtca 60

tttccattca acaccatttt cttgatctca agcgcaatct tcctcgtcac agccgctttc 120

tggttcgtag ccgtcatgac attacattac aggaccgatg aatgtaaccg gttcgtcaca 180

actcccggaa tattcataag cttctcattg cttgctatgt ccctcactgg attctacgca 240

gcttacttca aatccgattg tctctttcga atccacttct ttatcttctt cttgtggatg 300

ttcgttgtcg tgtctaaagc aatctttgtc atctttctac ataaggagac caatcctaga 360

ttgtttcctg ggaccaagat ttatgagttt aggtacgagg attactcagg atgggttagt 420

agattggtca tcaaagacga tgaatggtat cgtacaagga gatgtcttgt taaggacaat 480

gtttgtaaca ggctaaacca taagatgcca gcttctgagt tttatcagat gaatctaact 540

cctatacagt cgggttgttg caaaccacca ctttcatgtg gattgaatta cgagaaacca 600

aataattgga cagtttcaag atattataac aatttagaag ttgattgcaa gagatggaac 660

aattctgcag atacattatg cttcgattgt gattcatgta aagctgtgat tattgctgat 720

gtacataata cttcattttc cataacagtt aacattattc atatcatctt tagtctttgt 780

atcggcatga ccggttggtt tgcctggtta aggatccttc gagaaagtca gaaatag    837

<210>27

<211>278

<212>PRT

<213>鼠耳芥

<400>27

Met Ala Arg Asp Lys Glu Asp Gln Asn Asn Glu Asn Pro Ser Ile Val

  1               5                  10                  15

Gln Asn Met Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ile Phe Leu Ile Ser Ser Ala

             20                  25                  30

Ile Phe Leu Val Thr Ala Ala Phe Trp Phe Val Ala Val Met Thr Leu

         35                  40                  45

His Tyr Arg Thr Asp Glu Cys Asn Arg Phe Val Thr Thr Pro Gly Ile

     50                  55                  60

Phe Ile Ser Phe Ser Leu Leu Ala Met Ser Leu Thr Gly Phe Tyr Ala

 65                  70                  75                  80

Ala Tyr Phe Lys Ser Asp Cys Leu Phe Arg Ile His Phe Phe Ile Phe

                 85                  90                  95

Phe Leu Trp Met Phe Val Val Val Ser Lys Ala Ile Phe Val Ile Phe

            100                 105                 110

Leu His Lys Glu Thr Asn Pro Arg Leu Phe Pro Gly Thr Lys Ile Tyr

        115                 120                 125

Glu Phe Arg Tyr Glu Asp Tyr Ser Gly Trp Val Ser Arg Leu Val Ile

    130                 135                 140

Lys Asp Asp Glu Trp Tyr Arg Thr Arg Arg Cys Leu Val Lys Asp Asn

145                 150                 155                 160

Val Cys Asn Arg Leu Asn His Lys Met Pro Ala Ser Glu Phe Tyr Gln

                165                 170                 175

Met Asn Leu Thr Pro Ile Gln Ser Gly Cys Cys Lys Pro Pro Leu Ser

            180                 185                 190

Cys Gly Leu Asn Tyr Glu Lys Pro Asn Asn Trp Thr Val Ser Arg Tyr

        195                 200                 205

Tyr Asn Asn Leu Glu Val Asp Cys Lys Arg Trp Asn Asn Ser Ala Asp

    210                 215                 220

Thr Leu Cys Phe Asp Cys Asp Ser Cys Lys Ala Val Ile Ile Ala Asp

225                 230                 235                 240

Val His Asn Thr Ser Phe Ser Ile Thr Val Asn Ile Ile His Ile Ile

                245                 250                 255

Phe Ser Leu Cys Ile Gly Met Thr Gly Trp Phe Ala Trp Leu Arg Ile

            260                 265                 270

Leu Arg Glu Ser Gln Lys

        275

<210>28

<211>816

<212>DNA

<213>鼠耳芥

<400>28

atgggaacat tgatggcact tgtgaacatt ttagccgctg gtgtccttcc gatcttcact 60

ttcgtcctct cacttacact cctcggctac gcagtgtggc ttctttacat gcgtagctac 120

gactgcgaag atattctcgg tctgccacgt gtccagacgc tagctagtgt cggtcttctc 180

gcggtgtttg ttgtcagcaa cgcagctctg tttttgcggc ggaagtttcc gatgcctgca 240

cttgtggtga tggtggtggt cttgttgtta atgcttttca tcggtttggc gtatgccgga 300

gtaaatgaga tgcaaagccg gcggtttccg gcgacaagga tgtggttcaa gctcaaaatc 360

atggacgatc atgtgacctg gaacaatatc aaatcgtgtg tctatgataa aggagcttgc 420

aacgacctca tttacggatc tccaaatgaa aaaccttaca atagaagaaa aatgccacca 480

atcaagaatg gatgttgtat gccaccagag acatgtaaca tggacgcgat aaacgcgacg 540

ttttggtaca gaagaaaaga cgaaggacca ccgtcgtcta tgaacctaat gtacggtgat 600

gagatgatgg tgggaaggat tagcgactgt caactatgga ggaacgattg gagcatttta 660

tgctatgatt gtagatcttg taagttcgga ttcataagat cggtaaggag gaaatggtgg 720

cagctcggta tcttcttgat cgtcatttcc attcttcttc tcatgtctca tctcttgatc 780

ttcttggcta ctttttggga acgattcaag ggttag                           816

<210>29

<211>271

<212>PRT

<213>鼠耳芥

<400>29

Met Gly Thr Leu Met Ala Leu Val Asn Ile Leu Ala Ala Gly Val Leu

  1               5                  10                  15

Pro Ile Phe Thr Phe Val Leu Ser Leu Thr Leu Leu Gly Tyr Ala Val

             20                  25                  30

Trp Leu Leu Tyr Met Arg Ser Tyr Asp Cys Glu Asp Ile Leu Gly Leu

         35                  40                  45

Pro Arg Val Gln Thr Leu Ala Ser Val Gly Leu Leu Ala Val Phe Val

     50                  55                  60

Val Ser Asn Ala Ala Leu Phe Leu Arg Arg Lys Phe Pro Met Pro Ala

 65                  70                  75                  80

Leu Val Val Met Val Val Val Leu Leu Leu Met Leu Phe Ile Gly Leu

                 85                  90                  95

Ala Tyr Ala Gly Val Asn Glu Met Gln Ser Arg Arg Phe Pro Ala Thr

            100                 105                 110

Arg Met Trp Phe Lys Leu Lys Ile Met Asp Asp His Val Thr Trp Asn

        115                 120                 125

Asn Ile Lys Ser Cys Val Tyr Asp Lys Gly Ala Cys Asn Asp Leu Ile

    130                 135                 140

Tyr Gly Ser Pro Asn Glu Lys Pro Tyr Asn Arg Arg Lys Met Pro Pro

145                 150                 155                 160

Ile Lys Asn Gly Cys Cys Met Pro Pro Glu Thr Cys Asn Met Asp Ala

                165                 170                 175

Ile Asn Ala Thr Phe Trp Tyr Arg Arg Lys Asp Glu Gly Pro Pro Ser

            180                 185                 190

Ser Met Asn Leu Met Tyr Gly Asp Glu Met Met Val Gly Arg Ile Ser

        195                 200                 205

Asp Cys Gln Leu Trp Arg Asn Asp Trp Ser Ile Leu Cys Tyr Asp Cys

    210                 215                 220

Arg Ser Cys Lys Phe Gly Phe Ile Arg Ser Val Arg Arg Lys Trp Trp

225                 230                 235                 240

Gln Leu Gly Ile Phe Leu Ile Val Ile Ser Ile Leu Leu Leu Met Ser

                245                 250                 255

His Leu Leu Ile Phe Leu Ala Thr Phe Trp Glu Arg Phe Lys Gly

            260                 265                 270

<210>30

<211>24

<212>DNA

<213>

<400>30

gcggcagcgg cggcaggata tatt                                      24

<210>31

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>31

tgctttcgcc tataaatacg acgg                                      24

<210>32

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>32

cgctgcggac atctacattt ttg                                      23

<210>33

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>33

tcccggacat gaagccattt ac                                      22

<210>34

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>1和11

<223>n代表a，g，c或t

<220>

<221>修饰碱基

<222>7

<223>s代表g或c

<220>

<221>修饰碱基

<222>8和13

<223>w代表a或t

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>34

ngtcgaswga nawgaa                                            16

<210>35

<211>278

<212>DNA

<213>

<220>

<221>修饰碱基

<222>13，35，73，108，156，190，198和201

<223>n代表a，g，c或t

<400>35

tgtggcaaac tcngagtagg aatggagaat ccaancgttt gggtctttct caaggaagaa 60

agtgacgact gcncattgta ttgctccgaa taaacacatc catgctgnta aagagaggtt 120

atctggatag taggcagaga ttggaaccta gggttntgtt gaaacaaaac tcacatttct 180

tgtaagacan gaaacatnca ncaacaaaaa gtttagactt ttgatttatt taatgaagtt 240

acctgaagta taagccaaaa ggaccaacaa agagtgct                         278

<210>36

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>36

cttcttcaat catcaccatg                                             20

<210>37

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>37

tagcttgaac cggcgcaaat                                      20

<210>38

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>38

gtacgtttta gtaacagtct                                      20

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>39

gattagcagt gactaactcc                                      20

<210>40

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>40

agcttgtaca ttaaccgtga ct                                   22

<210>41

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>41

ctgcagggtg atgattgaag aagat                                25

Claims (7)

1.编码下述(a)或(b)的蛋白质的基因：

(a)由SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列组成的蛋白质，以及

(b)与SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列相比，由具有替代、缺失或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列组成且赋予百草枯抗性的蛋白质。

2.赋予百草枯抗性的蛋白质，其由如权利要求1所述的基因编码。

3.重组载体，其包含如权利要求1所述的基因。

4.根据权利要求3的重组载体，其中重组载体还包含外源基因或外源DNA片段。

5.经转化的微生物或动物细胞，其具有如权利要求3或4所述的重组载体。

6.转基因植物细胞，其具有如权利要求3或4所述的重组载体并具有百草枯抗性。

7.筛选转基因植物的方法，其包括将权利要求4所述的重组载体导入植物，并在以百草枯抗性为指标的基础上筛选转基因植物。

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