ES2332464T3 - Gen resistente al paraquat y promotor especifico de tejido vascular y trichomo. - Google Patents
Gen resistente al paraquat y promotor especifico de tejido vascular y trichomo. Download PDFInfo
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Abstract
Un vector recombinante que comprende un promotor específico de tejido vascular y tricomo que comprende el ADN de los siguiente (A), (B) o (C) y un gen foraneo o un fragmento de ADN foraneo insertado en la corriente descendente de dicho promotor. (A) ADN consistente en la secuencia de nucleótidos representado por SEQ ID NO:3; (B) ADN consistente de una secuencia nucleótida que tiene una sustitución, supresión o adición de 1 a 10 nucleótidos relativos a la secuencia de nucleótidos representados por la SEC ID NO:3 y funcionando como un promotor específico de tejido vascular y tricoma; Y (C) ADN hibridizando bajo condiciones estrictas el ADN consistente de la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO:3 y funcionando como un promotor específico de tejido vascular y tricoma.
Description
Gen resistente al paraquat y promotor específico
de tejido vascular y trichomo.
La presente invención se refiere a un vector
recombinante comprendiendo un tejido vascular y promotor específico
-trichomo-, a una planta transgénica teniendo este vector y a un
método para expresión genética en esta planta.
Las plantas están expuestas habitualmente a
diversas tensiones ambientales que incluyen temperaturas altas y
bajas, sequía, elevada intensidad luminosa, salinidad, gases
contaminantes, microbios patógenos y similares. Por lo tanto, si se
pueden desarrollar plantas útiles que puedan crecer suficientemente
incluso en dichas condiciones ambientales, por ejemplo, cultivos,
la producción de alientos será posible incluso en regiones en las
que los cultivos y cosechas no puedan crecer habitualmente debido a
las tensiones ambientales, y aumentara la posibilidad de prepararse
para una crisis alimenticia grave que es previsible en el futuro.
Como consecuencia de ello, la producción de plantas que han
adquirido resistencia a dichos tipos de tensiones ambientales esta
en camino a nivel global. Por ejemplo, se han fabricado plantas que
poseían una resistencia al frió (Nature 356,
710-703, 1992; Plant Physiol, 105,
601-605, 1995), resistencia a la sequía (Plant
Physiol, 107, 125-130, 1995; Nature, 379,
683-684, 1996; Nature Biotech, 17,
287-291, 1999), resistencia a la sal (Science, 259,
508-510, 1993; Biotechnology, 14,
177-180, 1996; Plant J., 12,
133-142, 1997), resistencia a los contaminantes del
aire (Plant Cell Physiol., 34, 129-135, 1993;
Biotechnology, 12, 165-168, 1994), resistencia a
las enfermedades (Kagaku a Seibutsu (Chemistry and Organisms), 37,
295-305, 385-392, 1999) y similares
mediante técnicas de recombinación genética. Además, ya se emplean
algunas plantas a las que se las ha dotado de resistencia a los
productos químicos para la agricultura mediante técnicas de
recombinación genética (Nature, 317, 741-744, 1985;
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 391-395, 1988, EMBO
J., 6, 2513-2518, 1987; EMBO J., 7,
1241-1248, 1988).
Estas tensiones ambientales, están íntimamente
relacionadas con la generación in vivo de especies de
oxigeno activo (radical súper oxido (O2^{-}), peróxido de
hidrógeno (H2O2), radical oxidrilo (OH^{-}). Las especies de
oxigeno activo son generadas por la respiración, la fotosíntesis,
las tensiones ambientales y similares, y crean daños fatales a las
células por una oxidación excesiva de las proteínas, ácidos
nucleicos, estructura de la membrana o similares. También se ha
informado que una planta resistente al oxigeno activo fabricada por
técnicas de recombinación genética mostraba una gran resistencia a
las tensiones ambientales anteriormente mencionadas (Plant Physiol,
111, 1177-1181, 1996; FEBS Letters, 428,
47-51, 1998).
Para fabricar una planta resistente al oxigeno
activo, se emplea principalmente un método en el cual un gen de la
especie del oxigeno activo que barre enzimas (la súperoxido
dismutasa, ascorbato peroxidasa, catalasa y glutationreductasa y
otras) se introduce en la planta.
El Paraquat es un potente herbicida no selectivo
que puede matar las plantas ya que genera oxígenos activos de forma
continuada en los foto sistemas. Por consiguiente, la resistencia al
Paraquat se puede utilizar como un indicador de la resistencia a
los oxígenos activos, y se ha llevado a cabo un análisis respecto
al mecanismo de la resistencia del Paraquat en plantas (Pestic.
Biochem. Physiol., 26, 22-28, 1986: Theor. Appl.
Genet. 75, 850-856, 1988; y Plant Physiol., 91,
1174-1178, 1989).
Mientras tanto, un gen supresor de la apoptosis
(Publicaciones de patentes JP (Kokai) No.10-309142;
No 2000-23583; y No. 2002-300822),
un gen codifica una proteína homologa a la aldosa reductasa
(Publicaciones de patente JO (Kohyo) No.
2001-523466) y n gen que codifica una proteína
unida al hierro (ferritina) (Publicación de patente JP (Kohyo) No.
2001-519671) se han revelado como genes que pueden
impartir resistencia al paraquat. Además, en las publicaciones de
patente JP (Kokai) No. 2002-281979 y No.
2001-95585, la peroxidasa derivada del callo
resistente al paraquat se revela como un gen capaz de impartir
resistencia al paraquat.
WO 01/20008 A muestra un promotor específico
vascular de la corriente ascendente del gen Oshox 1 del
arroz.
KLOTZ KAREN L Y AL "Expresión del gen
peroxidazo aniónico del tabaco es un tejido específico y regulado
desarrolladamente" (PLANT MOLECULAR BIOLOGY, vol 36, no 4, 1
Marzo 1988) muestra un promotor derivado de el gen peroxidasa
aniónico del tabaco.
La base de datos EMBL (online) del 16 de Marzo
del 2000 (2000-03-16)
"Arabidopsis thaliana cromosoma 4 DNA, fragmento
contingente No 73" XP002318410 encontrado desde el acceso EBI No
EM_PRO:ATCHRIV73 Acceso a la base de datos num ATCHRIV73 muestra la
secuencia nucleótida complementaria a la secuencia nucleótida como
mostrada en SEQ ID NO:3 de la presente aplicación (la secuencia
nucleótida consistente en las posiciones nucleótidas
26000-27721 de las secuencias nucleótidas tal como
son mostradas).
Base de datos EMBL (Online) 23 Junio 1999
(1999-06-23), "Arabidopsis
thaliana BAC F17/23" XP002318411 encontrados desde el acceso
EBI numero EM_PRO:AF160182 acceso a la base de datos num AF 1601822
muestra la secuencia nucleótida como mostrada en SEQ ID NO 3 de la
presente aplicación (secuencia nucleótida consistente de posiciones
nucleótidas 73596- 75317 de las secuencia nucleótida tal como
mostrada).
Se había creído que si se podía aislar un gen de
resistencia al paraquat que pudiera impartir fuerte resistencia al
paraquat, seria útil en el desarrollo de plantas con elevada
resistencia a los óxidos activos generados en varias clases de
condiciones ambientales de estrés (temperaturas altas y bajas,
sequía, elevada intensidad luminosa, salinidad, gases contaminantes,
microbios patógenos y similares). Sin embargo, recientemente se ha
revelado que los oxígenos activos cumplen un papel importante como
una molécula reguladora del crecimiento y de la respuesta al estrés
de una planta. Por lo tanto, para evitar características que
influyen mucho como el rendimiento del cultivo, es importante
aumentar la resistencia de una planta a las tensiones como el
paraquat sin afectar a su crecimiento y a los mecanismos del control
fisiológico de una planta que depende de los oxígenos activos.
El tejido vascular es un sistema de tejido
fascicular que diferencia a través de cada órgano de peritoditas y
espermatofitas, tal como tallo, hojas y raíz Xylem y phloelm son los
componentes del tejido vascular y su función como tubos para
transportar agua y sustancias internas a través de la planta.
Además, el cambium vascular, que incluye el cambium interfascicular
y el cambium intrafascicular es encontrado en el tejido vascular.
El cambium vascular es un sitio de proliferación de células y es
por ello un sitio extremadamente importante para el crecimiento de
la planta. Por ello, el tejido vascular es un emplazamiento
involucrado en el transporte de agua y sustancias internas así como
en la proliferación de células en una planta. Concordantemente, si
un gen involucrado en el transporte de agua, o en sustancias
internas o en proliferación de células puede ser introducido dentro
de una planta y específicamente expresado como
tejido vascular será posible regular el transporte de agua o sustancias internas o proliferación de células en la planta.
tejido vascular será posible regular el transporte de agua o sustancias internas o proliferación de células en la planta.
Además, desde un punto de vista desde
enfermedades de la planta, el tejido vascular es un sitio donde una
enfermedad marchitadora de hongos infectando plantas de la familia
solanácea prolifera y transfiere. Cuando un virus de planta infecta
una planta, el virus de la planta emigra a larga distancia desde
una hoja a otra hoja, y de esta manera el tejido vascular es también
un sitio de migración que conduce a la infección sistemática de una
planta. Concordantemente si un gen involucrado en proliferación o
migración de un hongo o un virus de la planta puede ser introducido
en una planta y específicamente expresado en el tejido vascular, la
planta puede ser protegida del hongo o del virus de la planta.
Un tricoma es un crecimiento exterior flocoso
encontrado en la superficie de una hoja, tallo, o sépalo o similar
del cuerpo de la planta. Un tricoma esta involucrado en secreción y
excreción desde la superficie del cuerpo de la planta. Por ejemplo,
esta demostrado que cuando una planta esta expuesta al estrés de un
metal pesado (cadmio), el numero de tricomas en la superficie de
las hojas se incrementa y cristales conteniendo cadmio o calcio se
adhiere a la superficie de las hojas, en otras palabras, que el
cadmio es excretado por un tricoma (Planta, 213 (1),
45-50, 2001, Mayo). Un tricoma es también el sitio
de primer contacto para un hongo filamentoso, bacteria, insecto o
similar invadiendo una planta. Además, como una defensa contra las
enfermedades y los daños de los insectos, por ejemplo, un fluido
teniendo actividad microbiana y un efecto disuasivo de alimentación
es segregado de un pelo glandular o un trichoma glandular de la
rosa rugosa de la familia Rosacea, un tipo de trichoma. Por ello, si
un gen esta involucrado en la excreción de un metal pesado o
similar, o un gen esta involucrado en la secreción de un fluido
teniendo actividad antimicrobiana o un efecto DETERRENT de
alimentación puede ser introducido en una planta y expresado
específicamente en un trichoma, el metal pesado puede ser
eficientemente excretado de la planta o la planta puede ser
efectivamente protegida contra el hongo filamentoso, bacteria, o
insecto invadiendo la planta.
Como descrito arriba, es deseable que la
expresión del gen específico sea llevado a cabo en un tejido
vascular o trichoma como un método para llevar a cabo la expresión
de un gen específico, un método que envuelve el uso de un promotor
exhibiendo actividad especifica de promotor en un tejido vascular o
trichoma puede ser considerado. Sin embargo, un promotor que exhibe
actividad de promotor específicamente en ambos tejido vascular y
trichoma no ha sido identificado hasta el presente.
Es objeto de la presente invención suministrar,
por ejemplo, un vector recombinante comprendiendo un promotor
específico de tejido vascular y trichoma identificando y analizando
genes de la Arabidosis thaliana.
El presente invento cumple el objeto arriba
mencionado suministrando lo siguiente:
(1) un vector recombinante como definido en la
reivindicaciones 1 y 2
(2) una planta transgénica teniendo el vector
recombinante como mostrado en (1); y
(3) un método para expresión de gen como es
definido en la reivindicación 4
Fig. 1 es una fotografía de la electroforesis
del cADN derivado de un gen transformante AtMVR.
Fig 2A es un diagrama esquemático que muestra la
posición de un gen transformante AtMVR y un no transformante en las
Fig. 2B y 2C. La Fig 2B es una fotografía que muestra el
crecimiento de un gen transformante AtMVR y un no transformante en
un medio de cultivo MS sin paraquat. La Fig 2C es una fotografía
que muestra el crecimiento de un gen transformante AtMVR y un no
transformante en un medio de cultivo ½ MS con paraquat.
Fig 3 es un foto micrografía de un transformante
completo conteniendo el gen GUS y un promotor AtMVR
histoquimicamente coloreado con GUS;
Fig 4 es una foto micrografía de una hoja de un
transformante conteniendo el gen GUS y un promotor AtMVR
histoquimicamente coloreado con GUS; y
Fig 5 es una foto micrografía de una raíz de un
transformante conteniendo el gen GUS y un promotor AtMVR
histoquimicamente coloreado con GUS
Como descrito aquí es un gen codificante de
proteína de los siguientes (a) o (b):
(a) una proteína consistente de la secuencia de
aminoácidos representada por SEQ ID NOS: 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15,
17, 19, 21, 23, 25, 27, y 29;
(b) una proteína consistente en una secuencia de
aminoácido teniendo una sustitución borrado o adición de 1 al 10
aminoácido relativo a la secuencia de aminoácidos representada por
secuencia ID No: 2 y impartiendo resistencia al paraquat.
El gen codificando la proteína descrita en el
arriba (a) es un gen codificando una proteína que imparte
resistencia al paraquat y consiste en una secuencia de aminoácidos
representada por SEQ ID Nos: 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,
23, 25, 27, 29.
Los actuales inventores realizan una búsqueda de
bases de datos que tuvieran la secuencia completa de nucleótidos de
la Arabipdosis thaliana (por ejemplo, GenBank, EMBL, DDBJ,
tair: La fuente de información de la Arabipdosis) basada en la
secuencia de nucleótidos del gen AtMVR y descubrieron que existen
13 genes homólogos al gen AtMVR (AtMVR3-1 a
AtMVR3-13) presente en el genoma de Arabidopsis
thaliana. La secuencia de nucleótidos de cada uno de estos
genes homólogos del AtMVR y la supuesta secuencia de aminoácidos
codificada por el gen homologo relevante AtMVR son representados
por los números de la SEQ ID indicados en la tabla 1 siguiente. La
tabla 1 enumera además los resultados del análisis de homología
entre el gen de AtMVR y cada gen homologo de AtMVR. El análisis de
homología se realizaba usando BLAST P a nivel de aminoácidos. Los
aminoácidos pueden clasificarse en base a las propiedades químicas
de sus cadenas laterales. En la matriz de sustitución de aminoácidos
BLOSUM62 (Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 10915-10919,
1992), los aminoácidos se clasifican en un aminoácido con un grupo
mercapto (C); los aminoácidos hidrofilitos que tienen peso
molecular bajo (S, T, P, A, G); los aminoácidos aciditos (N, D, E,
Q); los aminoácidos básicos (H, R, K); los aminoácidos hidrofobitos
que tienen pesos moleculares bajos (M, 1, L, V); y los aminoácidos
aromáticos (F, Y, W). En la tabla 1, el termino "Identidades"
se refiere a la correspondencia del 100% en términos de aminoácidos
y el termino "Positivos" se refiere al valor numérico cuando
los aminoácidos que tienen una puntuación positiva en la matriz de
sustitución de aminoácidos BLOSUM 62 se añaden a los que tienen una
correspondencia del 100% (ver Bioinformatics (en japonés), Eds.
Okazaki Y&Bono H. (publicados por Medical Science
Internacional).
Tal como se muestra en la tabla 1, la homología
de AtMVR con los 13 genes homólogos de AtMVR oscilaba entre el 22 y
el 57% para las identidades y entre el 41 y el 70% para los
positivos. Se considera que estos genes homólogos AtMVR imparten
resistencia al Paraquat del mismo modo que el gen de AtMVR.
Adicionalmente, el gen de AtMVR tiene homología
a una proteína asociada a la senescencia, DSA 5 (número de acceso
al GenBank AF082030) (Plant Molecular Biology 40,
237-248,1999). El resultado del análisis de
homología usando BALST X indicaba que la proteína codificada por el
gen AtMVR tienen una identidad del 89% a nivel de aminoácido
respecto a la proteína codificada por DSA 5. Se informa que el DSA
5 es un gen que se expresa con el envejecimiento del pétalo de la
liliácea (cultivo híbrido de Hemerocallis)(Plant Molecualr
Biology 40, 237-248, 1999). Sin embargo, puesto que
la proteína codificada por el DSA 5 no tiene homología con ninguna
proteína conocida, se desconoce que funciones tiene la proteína. De
acuerdo con ello, el gen de AtMVR es un gen nuevo que imparte
resistencia al Paraquat.
Tal como se utiliza aquí, el termino
"resistencia al paraquat" se refiere a tener resistencia al
paraquat. Mas específicamente, el termino "planta resistente al
paraquat" hace referencia a una planta que requiere una mayor
cantidad de paraquat que una planta no resistente, con el fin de
obtener un efecto determinado del paraquat. El paraquat es un
herbicida potente y no selectivo que mata todas las plantas
generando de forma continuada oxígenos activos en el sistema
fotoquímico. Es posible confirmar si el gen de AtMRV es un gen
resistente al paraquat que imparte resistencia al paraquat
examinando si un gen transformante al que se ha introducido un gen
puede crecer en presencia de
paraquat.
paraquat.
El gen que codifica la proteína descrita en el
apartado (b) anterior es un gen que codifica una proteína formada
por una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución,
anulación o adición de 1 a 10 (o 1 a 5) respecto a la secuencia de
aminoácidos representada por SEQ ID NO:2 y que imparte resistencia
al paraquat.
Una vez se ha determinado la secuencia de
nucleótidos del gen es posible entonces obtener el gen por síntesis
química, o por la reacción en cadena de la polimerasa (a
continuación, conocida como "RCP"), que emplea como plantilla
un clon que ha sido donado, o bien realizando la hibridación que
emplea un fragmento de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos
como una prueba. Además, es posible sintetizar un mutante del gen
que tenga funciones equivalentes a las anteriores a la mutación por
una técnica como la mutagénesis dirigida al lugar.
Los ejemplos del método para introducir una
mutación en el gen incluyen un método conocido como el método
Kunkel o el método duplex a intervalos o un método de acuerdo con
dichos métodos. Por ejemplo, se puede realizar la introducción de
una mutación usando un equipo para introducir una mutación (por
ejemplo, Mutant-K (fabricado por TAKARA, Inc) o
Mutant-G (fabricado por TAKARA, Inc.) utilizando la
mutagénesis dirigida o usando el equipo de la Mutagenesis in
Vitro con la PCR, fabricado por TAKARA, Inc.
Una proteína que imparte resistencia al paraquat
es la proteína codificada por el gen descrito mas adelante. Por
ejemplo, el gen es integrado en un vector derivado del
Escherichia coli o similares, y el E. coli es
entonces transformado con el vector recombinante obtenido. A
continuación, la proteína puede ser obtenida extrayendo la proteína
sintetizada en la E. coli.
Además, un vector recombinante puede ser
obtenido insertando el gen aquí descubierto en un vector apropiado.
Un vector usado para insertar dicho gen no se encuentra
especialmente limitado siempre que sea capaz de replicarse en un
huésped, y ejemplos de ello incluye un plásmido, un vector
lanzadera, y un plásmido auxiliar. Además, cuando el vector
propiamente no es capaz de replicarse, se puede usar un fragmento
de ADN capaz de replicarse mediante un método como la inserción en
el cromosoma de un huésped.
Ejemplos de ADN plasmídico incluyen un plásmido
derivado de la E. coli (pBI221 y similares, por ejemplo, un
sistema pET como el pET30b, el sistema pBR como el pBR322 y el
pBR325, el sistema pUC como el pUC118, pUC119, pUC18 y pUC19,
pBluescript, y pBI221), un derivado plasmídico del Bacillus
subtilis (por ejemplo, pUB110 y pTP5), un plásmido derivado del
Agrobacterium tumefaciens (por ejemplo, el sistema pBI
derivado del Pbin19, pBI101 ó pBI121), un plásmido derivado de
levadura (por ejemplo, el sistema YEp como YEp13 o el sistema YCp
como el YCp5O) o similares. Ejemplos de ADN mágicos incluyen el
bacteriófago A (Charon 4A, Charon 21A, EMBL3, EMBL4, \lambdagt10,
\lambdagt11, \lambdaZAP y similares). Además, también se puede
utilizar un vector de un virus animal como el retrovirus o el virus
de la variolovacuna, un vector del virus de una planta como el
virus del mosaico de la coliflor, o un vector de un virus de un
insecto como un baculovirus.
Para insertar el gen en un vector, se puede usar
un método en el cual el cADN del gen aquí revelado se parte
inicialmente usando un enzima de restricción apropiado y luego se
inserta en un lugar o punto del enzima de restricción o un lugar de
multiclonaje de un vector de ADN apropiado y se liga al vector.
Además, se puede usar un método en el cual una región homologa se
disponga respectivamente en una parte de un vector y el cADN del gen
y el vector y el cADN se conectan por un método in Vitro
usando la RCP o algo similar o bien un método in vivo que
use levadura o algo similar.
Un vector recombinante puede incluir también un
gen exógeno o un fragmento de ADN exógeno además del gen aquí
revelado. Cualquier gen o fragmento de ADN puede ser utilizado con
un gen o un fragmento de ADN. Por consiguiente, el gen o fragmento
de ADN aquí descrito se puede utilizar como un gen marcador
selectivo para indicar la resistencia al paraquat, por ejemplo,
como un gen de resistencia antibiótica para la canamicina o
higromicina o similares.
Un transformante según la presente invención es
un transformante que tiene el vector recombinante como se define en
las reivindicaciones. El transformante conforme al presente
invención se puede obtener introduciendo el vector recombinante en
un huésped. Un huésped no esta limitado mientras sea capaz de
expresar el gen aquí descrito, sin embargo se refiere a una planta.
Cuando el huésped es una planta, es posible obtener una planta
transgénica del modo anteriormente descrito.
Una "planta" que se transforma en la
presente invención puede ser tanto: una planta entera, un órgano de
una planta (por ejemplo, hoja, pétalo, tallo, raíz o semilla),
tejido de planta (por ejemplo, epidermis, floema, parenquima o
xilema) o bien una célula de cultivo de planta. Los ejemplos de
plantas que se pueden usar en la transformación incluyen, pero no
ser limitan a, una planta perteneciente a la familia
Poaceaoe, Brassicaceae; Solanaceae, o
Leguminosas (ver a continuación).
El vector recombinante conforme a la presente
invención se puede introducir en una planta mediante un método de
transformación convencional como, por ejemplo, el método de
electroporación, método Agrobacterium, método de lanzamiento de
partículas o método PEG.
Por ejemplo, cuando se utiliza el método de
electroporación, el vector recombinante conforme a la presente
invención se introducen en un huésped realizando el tratamiento que
usa un aparato de electroporación equipado con un controlador del
pulso en unas condiciones de voltaje de 500 a 1600 V, a 25 hasta
1000 \muF, durante 20 a 30 mseg.
Cuando se utiliza el método del lanzamiento de
partículas, toda la planta, un órgano de la planta o un tejido de
la misma se pueden usar sin ningún tratamiento, por ello se puede
preparar una sección y luego usarla o un protoplasto se puede
preparar y usarlo. La muestra preparada se puede tratar usando un
dispositivo para la transferencia de genes (por ejemplo,
PDS-1000/He fabricado por Bio-Rad
Inc). Aunque las condiciones de tratamiento pueden variar
dependiendo de la planta o muestra utilizada, el tratamiento se
realiza normalmente a una presión de aproximadamente 450 a 2000 psi
y a una distancia de aproximadamente 3 a 12 cm.
Un método que usa el plásmido Ti o el plásmido
Ri de Agrobacterium tiene la ventaja de una característica
por la cual cuando una bacteria perteneciente al genero
Agrobacterium infecta una planta, una parte del ADN
plasmídico que posee la bacteria es transferida al genoma de la
planta. Este método se puede utilizar para introducir el gen aquí
descrito en una planta huésped. Entre las bacterias que pertenecen
al genero Agrobacterium, cuando el Agrobacterium
tumefaciens infecta una planta, provoca la formación de un tumor
que se conoce como "agalla de la corona". Además, cuando el
Agrobacterium rhizogenes infecta una planta, incita la
generación de una raíz capilar. Estas son causadas por una región
que se conoce como "región del T-ADN (ADN
transferida)" de una plásmido Ti o plásmido Ri que es
transferido a una planta en el momento de la infección para ser
integrado en el genoma de la planta. De acuerdo con ello, el ADN
que va a ser integrado en un genoma de planta se inserta por
primera vez en la región del T-ADN de un plásmido Ti
o plásmido Ri, y luego el ADN puede ser integrado en el genoma de
la planta infectando la planta huésped con una bacteria del genero
Agrobacterium.
Ejemplos del método para transformar una
bacteria del genero Agrobacterium en una planta huésped
incluyen el método de electroporación anteriormente descrito, el
método de lanzamiento y el método PEG, así como un método in
planta. Ejemplo del método in planta incluyen un método de
inoculación directa del Agrobaterium y un método de
infiltración.
El tejido tumoral o brote, la raíz capilar o
algo similar que se obtiene como resultado de la transformación se
puede utilizar sin tratamiento alguno para el cultivo celular, el
cultivo tisular o el cultivo de los órganos. Alternativamente, se
puede regenerar en un cuerpo de planta por la administración de una
hormona de planta (auxina, citoquinina, giberelina, ácido abscisico,
etileno, brasinolida o similares) de una concentración apropiada
usando un método de cultivo del tejido de la planta
convencional.
El gen o fragmento de ADN aquí descrito puede
ser introducido también en una planta utilizando un virus de planta
como un vector. Ejemplos de virus de plantas que se pueden usar
incluyen el virus del mosaico de la coliflor. En primer lugar, se
inserta el genoma vírico en un vector derivado de la E. coli
o similar para producir un recombinante, y luego se introduce el
gen en el genoma vírico. El genoma vírico modificado de esta forma
se separa posteriormente del recombinante usando un enzima de
restricción, y el gen se puede introducir luego en una planta
huésped por inoculación del genoma vírico en la planta huésped.
Además de la introducción en una planta huésped
tal como se ha descrito antes, el vector recombinante según la
presente invención también se puede introducir en bacterias que
pertenecen al genero Escherichia como la E. coli, el
genero Bacillus como el Bacillus subtilis, o el
genero Pseudomonas como la Pseudomonas putida, así
como levaduras como las Saccharomyces cerevisiae y
Schizosaccharomyces pombe, células animales como la células
COS o la célula CHO, y células de insectos como la Sf9. Cuando se
utiliza una bacteria como la E. coli o una levadura o algo
similar como un huésped, es preferible que el vector recombinante
conforme a la presente invención sea capaz de una replicación
autónoma en la bacteria y ello comprende un promotor, una secuencia
unida al ribosoma, una secuencia de terminación de la trascripción
y el gen conforme a la presente invención. Puede implicar también
un gen que regule el promotor.
El método para introducir el vector recombinante
conforme a la presente invención en una bacteria no se encuentra
limitado mientras que sea un método que pueda introducir ADN en una
bacteria, y por ejemplo, puede mencionarse un método que utilice
calcio o el método de electroporación
El método para introducir el vector recombinante
conforme a la presente invención en la levadura no se encuentra
limita mientras sea un método que pueda introducir ADN en la
levadura, y por ejemplo se pueden mencionar el método de
electroporación, el método de esferoplastos y el método del acetato
de litio.
Cuando se utiliza una célula animal como
huésped, se puede usar una célula de mono COS-7,
Vero, célula de ovario de hamster chino (célula CHO), células L de
ratón o similares. El método para introducir el vector recombinante
conforme a la presente invención en una célula de animal no esta
especialmente limitado mientras se trate de un método que pueda
introducir ADN en una célula animal, y por ejemplo, se pueda
mencionar el método de electroporación, el método de fosfato de
calcio y el método de lipofección.
Cuando se utiliza una célula de insecto como un
huésped, se puede usar una célula de Sf9 o algo similar. El método
para introducir el vector recombinante conforme a la presente
invención en una célula de insecto no se encuentra limitado
mientras pueda introducir ADN en una célula de insecto, y por
ejemplo, se puedan mencionar el método del fosfato de calcio, el
método de lipofección y el método de electroporación
Es posible conformar si el gen aquí descrito se
ha integrado en un huésped mediante el uso del método RCP, el
método de hibridación meridional, el método de hibridación
septentrional o similar. Por ejemplo, la RCP se puede realizar
después de preparar el ADN del transformante y designando un
cebador de ADN específico. A continuación, el producto de
amplificación se comete a la electroforesis en gel de agarosa, a la
electroforesis en gel de poliacrilamida o a la electroforesis
capilar o algo similar, y el producto de la misma se colorea con
bromuro de etidio, solución de verde SYBR o algo similar. Luego si
se ha producido o no transformación se puede confirmar mediante la
detección del producto de amplificación como una banda única.
También es posible detectar el producto de amplificación después de
realizar la RCP usando un cebador que previamente se habrá marcado
con un colorante fluorescente o algo similar. Además, se puede
emplear un método en el cual el producto de amplificación se una a
una fase sólida de una micro placa o algo similar para permitir la
confirmación del producto de amplificación por la reacción
enzimático o de fluorescencia.
Un cuerpo de una planta conforme a la presente
invención es aquel que tiene un vector recombinante como es
definido en las reivindicaciones. Tal como se utiliza aquí, el
termino "cuerpo de la planta" se refiere a una planta entera
transformada con un vector recombinante que comprende el gen
conforme a la presente invención. El cuerpo de la planta conforme a
la presente invención se puede obtener introduciendo el anterior
vector recombinante en una célula de planta o algo similar y
regenerando un cuerpo de planta transgénico de la célula de la
planta transgénica obtenida. Como método de regeneración, se puede
emplear un método en el cual las células transformadas en forma de
callo son transferidas a un medio de cultivo en el cual el tipo y
la concentración de hormonas se han modificado y se han podido
cultivar, y un embrión adventicio se ha podido crear para obtener
un cuerpo de planta completo. Ejemplos del medio de cultivo que se
utilizara incluyen un medio LS y un medio MS. La introducción de un
vector recombinante en una célula de planta o similar se puede
efectuar mediante un método similar al método anteriormente
descrito.
Un método de cribado para las plantas
transgénicas aquí descrito es un método en el cual el vector
recombinante aquí descrito se introduce en las plantas y la
resistencia al paraquat se utiliza como indicador para el cribado
en plantas transgénicas. La transformación se puede verificar
empleando el gen conforme a la presente invención como un marcador
selectivo para indicar la resistencia al paraquat. Ejemplos del
método de cribado incluyen un método en el cual las plantas
transformadas por el vector recombinante crecen en un medio que
contiene paraquat y el cribado se realiza en base a las variaciones
en la vida y en la muerte así como en el crecimiento de las
plantas. La concentración de paraquat usada para el cribado puede
variar dependiendo de las especies y del tamaño de las plantas. Sin
embargo, si se utiliza, por ejemplo, Arabipdosis thaliana
como huésped, el paraquat puede estar presente en un medio en una
concentración de preferiblemente 0,1 a 3,0 \muM, mas
preferiblemente 1,0 a 3,0 \muM y mas preferiblemente de 3,0
\muM. Una planta no transgénica, es decir, una planta tipo
salvaje, desarrolla clorosis y muere en un medio que contiene
paraquat. En contraste con ello, una planta transformada con el
vector recombinante aquí descrito se mantiene verde incluso en un
medio que contiene paraquat. Por consiguiente, es posible verificar
una diferencia clara en el crecimiento en un medio que contiene
paraquat entre una planta no transgénica y una planta transformada
con el vector recombinante aquí descrito.
\newpage
Cuando se emplea resistencia a antibióticos,
resistencia a herbicidas como un indicador, se pueden observar
falsos positivos a nivel de cribado por la existencia de una
diferencia en la sensibilidad en la planta. En contraste con ello,
el paraquat es un herbicida no selectivo y potente que puede matar
todas las plantas. Consecuentemente, en el método de cribado de
plantas transgénicas conforme a lo aquí revelado, no se observa una
positividad falsa en la etapa de cribado. Además, según el método
de cribado de plantas transgénicas conforme a lo aquí revelado, la
resistencia se puede confirmar efectivamente en una etapa prematura
del crecimiento.
El presente invento será descrito a
continuación.
El promotor en el vector recombinante de acuerdo
con el presente invento es un tejido vascular y promotor específico
de trichoma comprendiendo el ADN de los siguientes (a), (b) o
(c):
(a) ADN consistente en la secuencia nucleótida
representada por SEQ ID No 3
(b) ADN consistente en la secuencia nucleótida
teniendo una sustitución supresión o adición de 1 a las 11
especificaciones nucleótidas de la secuencia nucleótida representada
por secuencia ID Nº 3 y funcionando como un promotor específico de
tejido vascular- un trichoma; y
(c) ADN con condiciones hibridizantes y
astringentes del DNA consistente en la secuencia nucleótida
representada por SEQ ID No 3 y funcionando como promotor de tejido
vascular - y trichoma.
El promotor específico del tejido vascular y
-trichoma descrito en el apartado de arriba (a) es un promotor
específico de tejido vascular y - trichoma encontrado en una región
no traducida del lado de la corriente ascendente 5'- del lado de la
corriente ascendente del gen AtMVR y consiste en la secuencia
nucleótida representada por SEQ ID Nº 3. El promotor descrito en (a)
puede ser determinado llevando a cabo una búsqueda basada en
aproximadamente 3.000 nucleótidos en el lado de la corriente
ascendente 5' del gen AtMVR sobre una base de datos teniendo la
secuencia nucleótida completa del Arabidoosis thaliana.
Tal como es usado aquí, el termino "promotor
específico de tejido vascular y -trichoma" se refiere a un
promotor que exhibe actividad especifica de un tejido vascular y
-trichoma de una planta. El termino "tejido vascular" se
refiere a un sistema de tejido fascicular que diferencia a través
de cada órgano de perito fiítas y espermatofitas tales como tronco,
hoja y raíz. El Xilema y el Folema son componentes de 1 tejido
vascular, y su función como tubos para transportar agua y
sustancias internas a través de la planta. Entretanto, el termino
"trichoma" se refiere al crecimiento externo de flocosa
existente en la superficie de la hoja, tallo o sépalo del cuerpo de
una planta. Un trichoma participa en la secreción y excreción de la
superficie del cuerpo de la planta.
La actividad de un promotor específico de tejido
vascular y -trichoma puede ser determinada de acuerdo con un método
convencional. Por ejemplo, un vector de expresión puede ser
construido tendiendo un gen reportante operablemente unido desde
aquí a la corriente descendente de un promotor. Próximamente, en
una planta adecuada es transformado con un vector de expresión. El
transformante obtenido es entonces cultivado bajo determinadas
condiciones y el montante de expresión que lleva el gen reportante
en un tejido vascular y trichoma puede ser determinado en mRNA o
nivel de proteínas para permitir la medición de la actividad del
promotor bajo condiciones relevantes. Además, cuando el gen
reportante es el gen \beta-glucurodinasa, (GUS),
la especificidad de la actividad del promotor en un tejido vascular
y trichoma puede ser determinada observando el coloreado
histoquímica causado por el expresado GUS.
Por ejemplo, como un método de coloración
histoquímica usando GUS un método puede ser mencionado en el cual
una mezcla de reacción conteniendo 5-bromo,
4-cloro,
3indolyl-\beta-D-glucuronide
(X-Gluc) como un sustrato GUS es añadido a un tejido
de un transformante en el cual el gen GUS ha sido introducido.
Cuando el gen GUS es expresado x-Gluc es
de-esterificado para generar un derivado monómero
indoxyl, y este monómero es oxidación-polimerizada
con aire para formar un pigmento azul índigo tina. En una célula
transformada o tejido, este pigmento azul se acumula para exhibir
color azul.
Además, una región especifica no traducida del
lado de la corriente ascendente 5 del gen AtMVR puede ser
rápidamente obtenida conduciendo RCP empleando el genoma extractado
de la Arabidposis thaliana como una plantilla y usando
primerizas que son complementarias de la secuencias nucleótidas en
ambos finales de la región.
El promotor de acuerdo con el presente invento
puede ser la secuencia nucleótida representada por SEQ ID No 3, mas
específicamente, la completa región no traducida del lado de la
corriente ascendente 5' o puede ser una parte de DNA consiente en la
secuencia nucleótida representada por SEQ ID No3 tan lejos como
ella exhibe una función como promotor específico de tejido vascular
y -trichoma.
El promotor específico de tejido vascular y
-trichoma en el arriba mencionado (b) consisten en una secuencia
nucleótida que tiene una sustitución, supresión, o adición, de una o
una pluralidad de nucleótidos (por ejemplo de 1 a 10, o de 1 a 5)
relativo a la secuencia de nucleótidos representados por SEQ ID No
3 y funciona como promotor específico de tejido vascular y
-trichoma
\newpage
El promotor específico de tejido vascular y
-trichoma descrito en el arriba mencionada (c) hibridiza bajo
condiciones astringentes el DNA consistente en la secuencia
nucleótida representada por SEQ ID No 3 y funciona como un promotor
específico de tejido vascular y -trichoma.
Tal como usado aquí, el termino "condiciones
astringentes" se refiere a, por ejemplo, cuando usando una
prueba etiquetada de DNA con fósforo-32,
hibridizando en una solución hibridizante consistente en 5xSSC
(0,75M NaCL, 0,75M citrato de sodio), 5xreactivo Denhardt
(0,1%Ficoll, 0,1%Polyvinylpyrrolidone, 0,1% albumina serica bobina)
y 0.01% de sulfato dodecyl de sodio (SDS) a una temperatura entre
45 y 68ºC, preferiblemente 60 a 68ºC. Además, en la etapa de
lavado, el lavado es llevado a cabo por una solución de lavado
consistente en 2xSSC y 0.1% SDS a una temperatura entre 45 y 55ºC, y
mas preferiblemente en aun solución de lavado consistente en 0.1x
SSC y 0.1%SDS a una temperatura entre 45 y 55ºC. Cuando se usa una
prueba de DNA enzimáticamente etiquetada usando el AlkPhos con un
kit directo de modulo etiquetado (Amersham Biotech), la
hibridizacion puede ser llevado a cabo en una solución hibrizante
(conteniendo 0.5 M NaCl y 4% de reactivo bloqueante) teniendo la
composición descrita en el manual que acompaña al kit a una
temperatura entre 55 a 75ºC. Además, en la etapa de lavado, el
lavado puede ser llevado a cabo en una solución primaria
(conteniendo 2M de urea) de acuerdo con las instrucciones del manual
que acompaña al kit a una temperatura entre 55 a 75ºC, y en una
solución secundaria de lavado a temperatura ambiente. Otras
detecciones técnicas pueden ser también usadas, en cuyo caso las
condiciones puede ser condiciones estándar para la técnica detección
relevante.
Una vez que la secuencia nucleótida del promotor
de acuerdo con el presente invento ha sido determinada, es entonces
posible obtener el promotor de acuerdo con el presente invento con
síntesis química o empleando RCP como muestra donada como una
plantilla o llevando a cabo la hibridizacion empleando un fragmento
de DNA teniendo la secuencia nucleótida como una muestra. Además,
es posible sintetizar un mutante del promotor de acuerdo con el
presente invento teniendo funciones equivalentes a aquel anterior
para mutar por una técnica tal como mutagénesis dirigidas a un
punto.
Ejemplos del método para introducir una mutación
en el promotor de acuerdo con el presente invento incluye métodos
conocidos tales como el método Kunkel o el método doble separación
o un método de acuerdo con tales métodos por ejemplo, la
introducción de una mutación a' puede ser llevada a cabo usando un
kit para introducir una mutación (por ejemplo,
mutante-K o mutante-G (ambos
manufacturados por TAKARA, Inc) utilizando el muta génesis dirigido
a un punto o usando el muta génesis in Vitro LA RCP kit de
series manufacturado por TAKARA Inc.
Un vector recombinante de acuerdo con el
presente invento comprendiendo el promotor de acuerdo al presente
invento puede ser obtenido insertando el promotor de acuerdo con el
presente invento dentro de un vector apropiado. Un vector para
insertar el promotor de acuerdo con el presente invento no esta
particularmente limitado tan largo como es capaz de replicarse
dentro de un receptor, y ejemplos de ello incluyen un plasmad, un
vector lanzadera, y un plasmad ayudante. Además, cuando el vector
el mismo no es capaz de replicación, un fragmento de DNA que es
capaz de replicación por un método tal como inserción dentro del
cromosoma de un receptor puede ser usado.
Ejemplos de DNA plasmad incluyen un plasmad
derivado del E. coli (pBI221 y el similar, por ejemplo
sistema pET tales como pET 30b, sistema pBR tales como pBR322 y
pBR325, sistema pUC tales como pUC118, pUC119, pUC18, y pUC19,
PBIuescript, y pBI221), un derivado de plasmad del Bacilus
subtilis (por ejemplo, Pub 110 y pTP5) y un plasmad binario
derivado del Agrobacterium tumefaciens (por ejemplo, sistema
pBI derivado del pBIN19, pBI101, o pBI121), y un plasmad derivado
de la levadura (por ejemplo, un sistema YEp como YEp13, o sistema
YCp tal como YCp50) o similares. Ejemplos del DNA fagico incluye A
fagico (Charon 4A, Charon 21A, EMBL4, \lambdagt10, \lambdagt11,
\lambdaZAP y similares). Además, un vector de virus animal tal
como un retrovirus o virus vacuna o un vector de virus insecto tal
como el baculovirus puede también ser usados.
Para insertar el promotor de acuerdo al presente
invento en un vector, un método puede ser usado en el cual ADN
purificado es primeramente partido con una enzima de restricción
apropiada y después insertado dentro de una localización de enzima
de restricción o una localización multiclonante de un vector
apropiado de ADN o ligada al vector. Además, un método puede
también ser usado en el cual una sección homologa es respectivamente
colocada en una parte del vector y el promotor de acuerdo con el
presente invento y el vector y el promotor están ligados por un
método in vitro usando RCP o similar o un método in
vivo usando levadura o similar.
El vector recombinante de acuerdo con el
presente invento comprendiendo el promotor de acuerdo con el
presente invento puede además incluir un gen foráneo o un fragmento
de ADN foráneo que es insertado en la corriente descendente del
promotor de acuerdo con el presente invento. Un método para
insertar el gen foráneo o el fragmento del gen foráneo es el mismo
que el método para insertar el promotor de acuerdo con el presente
invento en un
vector.
vector.
En el vector recombinante de acuerdo con el
presente invento comprendiendo el promotor de acuerdo con el
presente invento, ejemplo de un gen foráneo a ser insertado en la
corriente descendente del promotor de acuerdo con el presente
invento incluye cualquier gen foráneo, y ejemplo específicos
incluye un gen involucrado en el transporte de agua o sustancias
internas o en proliferación celular, un gen involucrado en el
transporte de bacterias o un virus de planta, un gen involucrado en
la descarga de los metales pesados o similares, o un gen involucrado
en la secreción de un liquido teniendo actividad antimicrobiana o
un efecto retardante de alimentación. Mas específicamente, el gen
puede ser un gen para transportar o bombear, un gen codificador de
una proteína PR (proteína relacionada con la patogénesis)
(chitinasa, peroxidasa, o similar), un gen de la familia defensin,
un gen de síntesis de phytoalexina, o un gen de síntesis repelente
de feromonas o pestes de insecto o similares. Como mas ejemplos de
gen foráneo, el gen de acuerdo al presente invento descrito arriba
el gen AtMVR puede ser mencionado.
Ejemplos de fragmento de ADN foráneo a ser
insertados en la corriente descendente de acuerdo con el presente
invento incluye el RNA antisentido o una ribozyma en la cual RNA el
mismo es funcionante.
La planta transgénica de acuerdo con el presente
invento es una planta transgénica que tiene un vector recombinante
de acuerdo con el presente invento comprendiendo el promotor de
acuerdo con el presente invento. La planta transgénica de acuerdo
con el presente invento puede ser obtenida introduciendo el vector
recombinante de acuerdo con el presente invento comprendiendo el
promotor de acuerdo con el presente invento dentro de una planta.
Una planta transgénica puede ser obtenida en la manera descrita mas
abajo.
Una "planta" a ser transformada en el
presente invento puede ser cualquiera de: una planta entera, un
órgano de una planta teniendo tejido vascular y/o -trichoma (por
ejemplo, hoja, pétalo, tallo, raíz, semilla) tejido de la planta
(por ejemplo, epidermis, floema, parénquima, o xilema) o una célula
cultivada de planta. Ejemplos de la planta que puede ser usada en la
transformación incluye pero no esta limitada a, una planta
perteneciente a la familia de las Poaceas,
brasicaceas, Solanaceas o leguminosas) ver mas
adelante).
El vector recombinante de acuerdo con el
presente invento comprende el promotor de acuerdo con el presente
invento puede ser introducido dentro de una planta por un método de
transformación convencional, por ejemplo, método de electro
transportación, método agro bacteriano, método de lanzamiento de
partículas, método PEG.
Por ejemplo, cuando se usa un método de electro
transportación el vector recombinante de acuerdo con el presente
invento comprendiendo el promotor de acuerdo con el presente
invento es introducido en un anfitrión por el tratamiento usando un
aparato de electro transportación equipado con un controlador de
pulsos bajo condiciones de un voltaje de 50 a 1600 V, a 25 hasta
1000 \muF, para 20 hasta 30 msec.
Cuando se usa el método del lanzador de
partículas la planta entera, un órgano de la planta o un tejido de
la planta el mismo puede ser usado sin ningún tratamiento una
sección de la misma puede ser preparada y luego usada, o el
protoplasma puede ser preparado y usado. La muestra preparada puede
entonces ser tratada usando un aparato transferidor de gen (por
ejemplo, PDS-100/He fabricado por
Bio-Rad Inc).Aunque las condiciones de tratamiento
pueden variar dependiendo de la planta o muestra usada el
tratamiento es normalmente llevado a cabo a una presión de
aproximadamente 450 a 2000 psi y a una distancia de aproximadamente
3 a 12 cm.
El método usando el plasmad Ti o el plasmad Ri
de Agrobacterium toma ventaja de una característica de la
cual, cuando una bacteria perteneciente al genero
Agrobacterium infecta una planta, una parte del plasmad ADN
poseída por la bacteria es transferida dentro del genoma de la
planta. Este método puede por ello ser usado para introducir el
promotor de acuerdo con el presente invento y un gen foráneo o
fragmento de ADN foráneo en una planta huésped. Entre una bacteria
perteneciente al genero Agrobacterium, cuando el
Agrobacterium tumefaciens infecta una planta, causa la
formación de un tumor que es referido como "tumor del cuello".
Además, cuando Agrobacterium rhizogenes infecta una planta,
el incita la generación de una raíz capilar. Estas son causadas por
una región referida como "región de T-ADN (ADN
transferido)" de un plasmad Ti o plasmad Ri transfiriendo dentro
de la planta al tiempo de la infección para ser integrado en el
genoma de la planta. Concordantemente el ADN a ser integrado en el
genoma de la planta es primeramente insertado en la región de
T-ADN o un plasmad Ti o plasmad Ri, y entonces el
ADN puede ser integrado dentro del genoma de la planta infectando
la planta huésped con una bacteria del genero
Agrobacterium.
Agrobacterium.
Ejemplos del método para transformar una
bacteria del genero Agrobacterium dentro de la planta
huésped incluye el arriba descrito método electro transportación,
método de lanzamiento de partículas, y método PEG así como un
método in planta. Ejemplos de método in planta incluye un
método de inoculación directa de Agrobacteria y un método de
infiltración.
El tejido tumoral o brote, la raíz capilar o
similar obtenida como resultado de la transformación puede ser
usada sin ningún tratamiento para cultivo de la célula, cultivo de
tejido o cultivo de órgano. Alternativamente, el puede ser
regenerado en el cuerpo de una planta por administración de una
hormona de planta (Auxina, citoquinina, biberelina, ácido axcisico,
etileno, brassinolida, o similar.) en una apropiada concentración
usando el método de cultivo de la planta conocido en la parte
anterior.
\newpage
Además, el promotor de acuerdo con el presente
invento y un gen foráneo o fragmento de ADN foraneo puede ser
introducido dentro de la planta utilizando un virus de planta como
un vector. Ejemplos de virus de planta que pueden ser usados aquí
incluye el virus del mosaico de la coliflor. Primero, el genoma
viral es insertado dentro de un vector derivado del E. coli o
similar para producir un recombinante, y entonces el promotor de
acuerdo con el presente invento y el gen foraneo o fragmento de ADN
foraneo es insertado dentro del genoma viral. El genoma vira)
modificado de esta manera es subsecuentemente fijado desde el
recombinante usando una encima restrictiva, y el promotor de
acuerdo con el presente invento y el gen foraneo o fragmento de ADN
foráneo puede ser introducido en la planta huésped por inoculación
del genoma viral dentro de la planta huésped.
La planta transgénica de acuerdo al presente
invento producida en la manera arriba referenciada puede expresar
específicamente el gen foráneo o el fragmento de ADN foráneo en un
tejido vascular y tricoma usando el promotor de acuerdo al presente
invento.
El tejido vascular es una localización
involucrada en el transporte de agua y sustancias internas así como
en la proliferación de células en una planta. Por ello, cuando un
gen involucrado en el transporte de agua o sustancias internas o en
proliferación de células es introducido como un gen foráneo dentro
de la planta transgénica de acuerdo con el presente invento, el
transporte de agua y sustancias internas o proliferación de células
en la planta puede ser regulada. El tejido vascular es también un
sitio donde hongos de enfermedades marchitas infectando plantas de
la familia de las solanaceas prolifera y transfiere. Cuando un virus
de planta infecta una planta, el virus de la planta emigra a larga
distancia desde una hoja a una hoja superior y por ello el tejido
vascular es también un sitio de migración y conduce a la infección
sistemática de una planta. De tal manera, cuando un gen involucrado
en la proliferación o migración de un hongo o un virus de planta es
introducido como un gen foráneo dentro de la planta transgénica de
acuerdo con el presente invento, la planta puede ser protegida desde
el hongo o desde el virus de la
planta.
planta.
Entre tanto un tricoma es involucrado en la
secreción y excreción desde la superficie del cuerpo de una planta.
Por ejemplo, se ha reportado que cuando una planta es expuesta al
estrés de un metal pesado (Cadmio) el numero de tricomas en la
superficie de las hojas se incrementa y cristales conteniendo
cadmio o calcio se adhieren a las superficie de las hojas, en otras
palabras, que el cadmio es excretado por un tricoma (planta 213 (1),
45-50, 2001 mayo). Un tricoma es también el sitio
de primer contacto para un hongo filamentoso, bacteria, insecto o
similar que invade una planta. Además, es una defensa contra
enfermedades y daños de insecto, por ejemplo, un fluido teniendo
actividad antimicrobiana y un efecto retardante de alimentación es
secretado desde un pelo grandular o un tricoma glandular de la rosa
rugosa de la familia de las rosaceas, un tipo de tricoma. Por ello,
cuando un gen involucrado en al excreción de un metal pesado, o un
gen involucrado en la secreción de un fluido teniendo actividad
antimicrobiana o un efecto retardante de alimentación es introducido
como un gen foráneo en la planta transgénica de acuerdo con el
presente invento, el metal pesado puede ser eficientemente
excretado desde la planta o la planta puede efectivamente ser
protegida contra un hongo filamentoso, bacteria o insecto que
invade la planta.
Además, cuando el vector de acuerdo con la
reivindicación 2 es introducido en una planta transgénica de
acuerdo con el presente invento, la resistencia al paraquat puede
ser impartida promocionando el transporte y excreción y parecido
del paraquat incorporada en el cuerpo de la planta.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se explicara con detalle a
continuación con referencia a los ejemplos 5 y 6. Sin embargo,
estos ejemplos no pretenden limitar el objetivo técnico de la
invención.
En este ejemplo, se utilizan las líneas de
T-ADN de Weigel adquiridas en Nottingham
Arabipdosis Stock Center (http://nasc.nott.ac.uk) como líneas
de referencia de activación de Arabipdosis thaliana.
Semillas de líneas de T-ADN de
Weigel se inoculan de forma estéril en un medio de cultivo de 1/2MS
agar (1%) 2,3 gil de mezcla salina de Murashide and Shook Plant
(fabricada por Wako Pure Chemical Industries Ltd), 1,5 mg de
clorhidrato de tiamina, 2,5 mg de ácido nicotínico, 0,25 mg de
clorhidrato de piridoxina, 1,5% de sacarosa, 1% de agar) que
contiene 3 \muM de paraquat (viologeno de metilo fabricado por
Sigma Chemical Co.,) y se cultivaban a 22ºC bajo la irradiación
luminosa de 60 \muE/m^{2}/s (ciclo de un fotoperiodo de 16
h/periodo de oscuridad de 8 h). Aproximadamente 10 días después del
cultivo, se detectaban e identificaban los individuos que crecían
en el medio que contenía paraquat.
\newpage
Semillas de las líneas de T-ADN
de Weigel de las cuales los individuos originados se plantaban en
un crisol que contenía vermiculita (fabricado por Asahi Kagaku
Kogyo, Co., Ltd) y se dejaban crecer durante aproximadamente un mes
a 23ºC bajo una intensidad luminosa de 100 \muE/m^{2}/s en unas
condiciones de 16 h de fotoperiodo/8 h de
oscuridad.
oscuridad.
El genoma de ADN se preparaba a partir de las
hojas de individuos cultivados usando el equipo DNeasy Plant Mini
(fabricado por Qiagen), y se diseñaban tres tipos de cebadores
específicos (TL1: SEQ ID NO:31; TL2:SEQ ID NO:32; TL3:SEQ ID NO:33)
para una secuencia izquierda de T-ADN (borde
izquierdo de T-ADN:SEQ ID NO:30) de un vector
marcado de activación (Psk1015: GenBank acceso nr. AF187951) usado
con las líneas de T-ADN de Weigel. El
TAIL-PCR (Shokubutsu nr. PCRJikken Purotokoru
(Protocolos de Experimentos con la RCP para plantas), (Eds.
Shimamoto K.&Sasaki T.), New Edition, 2000, pp
83-89, Shujunsha CO., Ltd., Tokio; Genomics, 25,
674-681,1995; Plant J., 8, 457-463,
1995) se preparaba luego usando los cebadores específicos y un
cebador aleatorio 1 (SEQ ID NO:34) y la mezcla de reacción de la
RCP y las condiciones de reacción descritas a continuación para
amplificar el ADN del genoma próximo al T-ADN. En
la SEQ ID NO:34, n representa a, g, c, o t (lugar: 1 y 11), s
representa g o c (lugar: 7) y w representa a o t (lugar: 8 y
13).
La composición de la mezcla de reacción y las
condiciones de la RCP para la primera vuelta RCP se enumeran en las
tablas 2 y 3.
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\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La composición de la mezcla de reacción y las
condiciones de RCP para la segunda vuelta se enumeran en las tablas
4 y 5.
\vskip1.000000\baselineskip
La composición de la mezcla de reacción y las
condiciones de la RCP para la tercera vuelta se enumeran en las
tablas 6 y 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Seguidamente, tras someter los productos de
reacción de la segunda vuelta de RCP y de la tercera vuelta de RCP
a electroforesis en gel de azarosa, se verificaba la presencia o
ausencia de amplificación y la especificidad de los productos de
reacción.
Además, usando el cebador específico TL3 (SEQ ID
NO:33), el producto de amplificación de la tercera vuelta de la RCP
se secuenciaba directamente usando el equipo de ABI PRISM Dye
Terminador Cycle Sequencing (Applied Biosystems) y la secuencia de
nucleótidos se determinaba luego usando el analizador genético ABI
PRISM 310 (Applied Biosystems). Como resultado, se obtenía
información de la secuencia 278-bp (SEQ ID NO:35).
En la SEQ ID NO:35, n representa a, g, c ó t (lugar: 13, 35, 73,
108, 156, 190, 198 y 201). Se realizaba una búsqueda de la
secuencia obtenida con las bases de datos que tienen la secuencia de
nucleótidos completa de Arabipdosis thaliana, y se
averiguaba que el punto de inserción se localiza en 77240 bp del
clon BAC F17123.
Se plantaban semillas de Arabipdosis
thaliana (arabidopsis thaliana ecotipo Columbia
(Col-0)) en un crisol que contiene vermiculita
(Asahi KAgau kogyo Co., Ltd) y se dejaba que crecieran durante
aproximadamente un mes a 23ºC bajo una intensidad de luz de 100
\muE/m^{2}/s en unas condiciones de un foto periodo de 16 horas
y un periodo de oscuridad de 8 horas.
Tras el crecimiento, las hojas de los individuos
se congelaban usando nitrógeno liquido. Posteriormente, todo el ARN
se extraía usando el equipo RNeasy Plant Mini (fabricado por
QIAGEN). Luego, el cADN se sintetizaba a partir de ARN total
extraído usando el equipo Prestar First Srand
RT-PCR (fabricado por STRATAGEN).
En base a la secuencia de un supuesto gen de
marco de lectura abierta presente en un 10 kb adyacente de un gen
estructural que tiene la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 35)
obtenida en el (2) anterior, se diseñaban un cebador 141 dF (SEQ ID
NOR:36) y in cebador 141 dR (SEQ ID NO:37) para el supuesto gen
estructural, y la RCP se realizaba luego usando estos cebadores y
la siguiente mezcla de reacción (tabla 8) que contiene Takara EX -
Taq (fabricado por TAKARA BIO Inc.) empleando el cADN anteriormente
sintetizado como un patrón
\vskip1.000000\baselineskip
Treinta ciclos de 94ºC (30 seg)/55ºC (30
seg)/72ºC (60 seg) se empleaban como condiciones de la
reacción.
El producto de amplificación se clonaba en el
vector pGEM-T Easy (fabricado por Promega), y la
secuencia de nucleótidos se determinaba luego usando el analizador
genético ABI PRISM 310 (Applied Biosystems). Como resultado, se
obtenía un fragmento de cADN de 857 bp (SEQ IF NO:1). Este
fragmento de cADN se designaba gen AtMVR, y el vector
pGEM-T que contiene AtMVR se conocía como pAtMVR.
La secuencia de aminoácidos codificada por el gen AtMVR se muestra
en SEQ ID NO:2.
\vskip1.000000\baselineskip
La búsqueda se realizaba con las bases de datos
que tienen la secuencia de nucleótidos integra de Arabipdosis
thaliana en base a la secuencia de nucleótidos del gen AtMVR y
se observaba que además de la secuencia de nucleótidos del gen
AtMVR existen 13 genes homólogos de AtMVR en el genoma de
Arabipdosis thaliana.
Los respectivos genes homólogos de AtMVR se
conocían como AtMVR3-1 a AtMVR-13.
La secuencia de nucleótidos de cada uno de los genes homólogos
AtMVR y la supuesta secuencia de aminoácido codificada por el gen
homologo relevante AtMVR se muestran en las SEQ ID enumeradas en la
tabla 9 siguiente. La tabla 9 también menciona los resultados del
análisis de homología entre el gen AtMVR y cada uno de los genes
homólogos AtMVR. El análisis de homología se realizaba utilizando
BLAST P a nivel aminoácido. El termino "Identidades" se
refiere a una correspondencia del 100% en los términos de
aminoácidos. Los aminoácidos se pueden clasificar en base a las
propiedades químicas de sus cadenas laterales. En la matriz de
sustitución del aminoácido BLOSUM62, los aminoácidos se clasifican
en: un aminoácido con un grupo mercapto (C); aminoácidos
hidrofilitos que tienen pesos moleculares bajos (S,T,P,A,G);
aminoácidos aciditos (N,D,E,Q); aminoácidos básicos (H,R,K);
aminoácidos hidrofobitos que tienen pesos moleculares bajos
(M,I,L,V); y aminoácidos aromáticos (F,Y,W). En la tabla 9, el
termino "identidades" se refiere a la correspondencia del 100%
en términos de aminoácidos y el termino "Positivos" se refiere
al valor numérico cuando los aminoácidos que tienen una puntuación
positiva en la matriz de sustitución del aminoácido BOSUM 62 se
añaden a los que tienen una correspondencia del 100%.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se muestra en la tabla 9, la homología
entre AtMVR y los 13 genes homólogos de AtMVR oscilaba entre el 22
y el 57% para las identidades y entre el 41 y el 70% para los
positivos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las técnicas de transformación aquí aplicadas
coincidían con un sistema de vectores descrito por Pellegrineschu y
cols. (Biochemical Society Transitions 23, 247-250,
1995) basado en el sistema de transporte de genes de Agrobacterium
mencionado por Hinchee y cols. (Plant Cell y Tissue Culture,
pp231-270, Eds. I.K. Vasil, T.A Thorpe, Kluwer
Academia Publisher, 1994).
La secuencia del gen AtMVR se dividía a partir
del pAtMVR usando SacI/SaclI y se subclonaba en pBlue/Script
(STRATAGENE). Posteriormente, un fragmento que contiene la
secuencia del gen AtMVR se escindía con XbaI/SacI y se introducía en
el lugal XbaI/SacI que esta presente corriente abajo del promotor
CaMV 35S de pBI121 (fabricado por Clontech). El vector resultante
se usaba a continuación como un vector de expresión de AtMVR para
plantas.
El vector de expresión AtMVR para plantas
fabricadas en el apartado (1) se introducía en la cepa LBA4404 de
Agrobacterium tumefaciens por el método de electroporación
(Plant Molecular Biology Manual, Segunda Edición, B.G. Stanton,
A.S. Robbert, Kluwer Academa Publishers, 1994). Posteriormente, el
Agobacterium tumefaciens que tiene el vector de expresión
AtMVR para la planta introducida en el mismo se introducía en una
Arabipdosis thaliana ecotipo Col.-0 tipo natural o de
referencia, mediante un método de infiltración descrito por Clough
y cols.(The Plant Journal 16: 735-743, 1998).
Los transformantes se detectaban en un medio que
contiene canamicina, y se fabricaba una planta de generación T3
(línea homocigótica que tiene 1 gen AtMVR introducido) por auto
polinización.
Seguidamente, se analizaba la cantidad de gen
AtMVR expresada introducida. Las semillas de transformante
producidas tal como se ha descrito y una no transformante se
plantaban, respectivamente, en crisoles que contenían vermiculita
(Asahi Kagaku Kogyo Co., Ltd) y se dejaban que crecieran durante
aproximadamente un mes bajo una intensidad luminosa de 100
\muE/m^{2}/s a 23ºC con un foto periodo de 16 horas/un periodo
de oscuridad de 8 horas.
Tras el crecimiento, se extraía el ARN total del
transformante y de la Aradbipdosis thaliana eco tipo
Col-0 no transformante tipo natural o de referencia
usando el equipo RNeasy Plant Mini (QIAGEN). Luego, 1 \mug de ARN
se sometía a una transcripción invertida usando el equipo ProSTAR
First Strand RT-PCR (STRATAGEN). La RCP se llevaba a
cabo luego usando la mezcla de reacción siguiente (tabla 10) que
contiene Takara EXTaq (TAKARA BIO) empleando 1/50 volúmenes de cADN
sintetizado como un patrón y usando cebadores para el gen AtMVR
(cebador 141d1 (SEQ ID NO: 38) y cebador 141d2 (SEQ ID NO:39)).
\vskip1.000000\baselineskip
Treinta ciclos de 94ºC (30 seg)/55ºC (30 seg)
/72ºC (60 seg) se empleaban como condiciones de la reacción.
Los productos de amplificación se sometían a
electroforesis en gel de agarosa. La figura 1 muestra los
resultados de la electroforesis. Como se puede ver en la figura 1,
en comparación con el no transformante, el transformante producido
sobre expresaba el gen AtMVR.
\vskip1.000000\baselineskip
Las semillas derivadas del gen transformante
AtMVR fabricado y del no transformante (Arabipdosis thaliana
ecotipo Col-0 tipo de referencia o natural) se
inoculaban de forma estéril en un medio de ½ MS agar (1%) (2,3 g/l
de Murashige y Skoog Plant Salt Mixture (Wako Pure Chemical
Industries Ltd.), 1,5 mg/l de clorhidrato de tiamina, 2,5 mg/l de
ácido nicotínico, 0,25 mg/l de clorhidrato de piridoxina, 1,5% de
sacarosa) que contienen 3 \muM de paraquat (viologeno de metilo
(Sigma Chemical CO)), y se cultivaban durante ocho días a 22ºC bajo
una irradiación luminosa de 60 \mumol/m^{2}/s (ciclo de
fotoperiodo de 16 horas/periodo de oscuridad de 8 horas). Tras el
cultivo, se evaluaba el crecimiento de los individuos germinados.
Los resultados se muestran en la figura 2, donde la figura 2B es
una fotografía que muestra el crecimiento de un gen transformante de
AtMVR y un no transformante en un medio de cultivo ½ MS sin
paraquat, y la figura 2 C es una fotografía que muestra el
crecimiento de un gen transformante AtMVR y un no transformante en
un medio de cultivo 1/2MS con paraquat. La figura 2A es un diagrama
esquemático que muestra la posición del gen transformante AtMVR y
la del no transformante en las figuras 2B y 2C.
Como se puede ver en la figura 2B, los
resultados indicaban que en el medio de cultivo sin paraquat, el
gen transformante AtMVR exhibía el mismo crecimiento que el no
transformante. Entretanto, como se puede ver en la figura 2C, en un
medio que contiene paraquat el no transformante desarrollaba
clorosis y moría, es decir, el crecimiento se veía inhibido de
forma notable, mientras que en contraste con ello, la plántula del
gen transformante AtMVR era capaz de crecer. Por consiguiente, se
confirmaba que en un medio sin paraquat, el gen transformante AtMVR
exhibía el mismo crecimiento que un no transformante,
independientemente de la expresión del gen AtMVR, y también que en
un medio con paraquat, el gen transformante AtMVR tenia claramente
mayor resistencia al paraquat que el no transformante.
\vskip1.000000\baselineskip
Semillas de Arabidopsis thaliana
(Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia
(Col-0)) fueron plantadas en macetas conteniendo
bermiculita (Asahi Kagaku Kogyo Co, Ltd) y permitiendo el
crecimiento por aproximadamente un mes bajo una intensidad de luz de
100 \muE/m^{2}/s a 23ºC, bajo una condición de foto periodo de
16 horas foto periodo/8 horas periodo de oscuridad.
Después del crecimiento, el genoma ADN fue
preparado desde las hojas de individuos usando DNeasy Plant Mini
Kit (QIAGEN). Después, PCR fue llevado a cabo usando la siguiente
mezcla de reacción (Tabla 11) conteniendo Takara ExTaq (TAKARA BIO
Inc) usando el genoma ADN obtenido como una plantilla y usando una
imprimación 141dpF (SEQ ID NO:40) y una imprimación 141 dpR (SEQ ID
NO:41) basado en un fragmento del gen AtMVR (SEQ ID NO:35) descrito
en el Ejemplo 1 arriba citado bajo las condiciones de reacción
descritas a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de reacción fueron 30 ciclos de
94ºC (30 sec) /55ºC (30 sec)/72ºC (60 sec)
El producto de amplificación fue clonado dentro
de pGEM-T vector fácil (Promega Corp.) y la
secuencia nucleótido fue después determinada usando ABI PRISM 310
(Applied Biosystems). Como resultado, se obtuvo un promotor AtMVR
de 1722 bp (SEQ ID NO:3).
\vskip1.000000\baselineskip
El promotor AtMVR fue separado del
pGEM-T vector fácil que tiene el promotor AtMVR
(SEQ ID NO:3) producido en el Ejemplo 5 usando HindIII/PstI y
subsiguientemente subclonado dentro de la región de la corriente
ascendente del promotor CaMV 35S pBI221 (Clontech). El vector
resultante fue tratado con PstI/SmaI para remover el promotor CaMV
35S, y el final fue despuntado usando polimerasa de ADN T4 (TAKARA
BIO Inc) y permitido qutorecomponerse. Como resultado, el promotor
AtMVR fue ligado en el vector de la corriente ascendente del gen
\beta-Glucuronidase (GUS). Subsiguientemente un
fragmento conteniendo el promotor AtMVR y el gen GUS fue separado
desde el vector arriba referenciado usando HindIII/EcoRI, y después
substituido por promotor CaMV35S del gen
\beta-GUS del pBI121 (Clontech). El vector así
obtenido fue empleado como un vector de expresión que tiene el
promotor AtMVR para el uso que se describirá mas abajo.
De una manera similar al ejemplo 3 (2) el vector
de expresión arriba descrito que tiene el promotor AtMVR fue
introducido a presión dentro Agrobacterium tumefaciens
LBA4404 y este fue posteriormente introducido en el tipo salvaje
del ecotipo de Arabidopsis thaliana Col-0 T3
por el método de infiltración.
Posteriormente los transformantes fueron vistos
en pantalla en un medio conteniendo canamicina, y una planta de
generación T3 fue producida por autopolinización.
Las semillas derivadas del transformantes
producido en el ejemplo arriba citado (2) fueron inoculadas
esterilizadas en ½ MS de agar (1%) médium (2.3 g/l de Murashige y
Skoog Plant Salt Mixture (Wako Pure Chemical Industries Ltd), 1.5
mg/I de hidroclorido de tiamina, 2.5 mg/l de ácido nicotínico, 0.25
mg/l de hidroclórido de pirodixina, 1.5% de sucrosa), y cultivado a
22ºC bajo una irradiación de luz de 60 \muE/m^{2}/s (ciclo de de
16 hrs fotoperiodo/8 hrs periodo de oscuridad) por aproximadamente
7 días.
Después cultivados los transformantes que
crecieron fueron fijados por transformante con acetona. Una mezcla
reactiva conteniendo
5-bromo4-cromo-3-indolit-\beta-D-glucoronide
(X-GUS) fue añadido a los tejidos fijados de tal
manera para emerger el tejido entero. La composición de la mezcla
de reacción fue 1.9 mM de X-Gluc, 0.5 mM de K3 Fe
(CN)6, 0.5 mM de K4Fe(CN)6 y 0,3% de TRiton
X-100.
El container fue sellado e incubado una noche a
una temperatura de incubador de 37ºC después etanol al 70% fue
añadido a la mezcla para terminar la reacción y coloración y fue
observado (Shokubutsu No Saibo Wo Miru Jikken Purotokoru (protocolos
para experimento de observación de células), Eds. Fukuda H.,
Nishimura M., & Nakamura K., (1997), pp 71-79,
Shujunsha Co., Ltd., Tokio). El resultado es mostrado en la Fig 3 a
5, en donde las figuras 3 a 5 son fotomicrografos de un
transformante completo, una hoja de un transformante, y una raíz de
un transformante respectivamente.
Como se puede ver de las Fig 3 a 5 coloreado
específico fue observado en el tejido vascular y trichoma. De tal
manera que ello confirmo que el promotor obtenido AtMVR (SEQ ID
NO:3) es un promotor trasncripcional que tiene tejido específico de
actividad transcripcional en un tejido vascular y trichoma.
SEQ ID NOS: 31 A 41 son cebadores.
En la SEQ ID NO: 34, n representa a, g, c o t
(lugar: 1 a 11), s representa g o c (lugar 7), y w representa a o t
(lugar 8 y 13).
En la SEQ ID NO: 35, n representa a, g, c, o t
(lugar: 13, 35, 73, 108, 156, 190, 198 y 201).
De acuerdo con el presente invento se
proporciona un tejido vascular y un promotor específico
-tricoma.
El tejido vascular y el promotor específico
-tricoma de acuerdo con el presente invento permite la regulación
del gen expresado en un tejido vascular y tricoma de una planta.
<110> TOYOTA MOTOR CORPORATION OKAYAMA
PREFECTURE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> A PARAQUAT RESISTANCE GENE AND A
VASCULAR TISSUE-AND
TRICHOME-SPECIFIC PROMOTER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PH-2160
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2003-322051
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-09-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2. 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 855
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 272
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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<210> 3
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<211> 1722
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 272
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 792
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 283
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 984
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 327
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 858
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 285
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 849
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 282
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 814
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
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<400> 14
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 813
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 270
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 17
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<210> 18
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<211> 816
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<212> DNA
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<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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<210> 19
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<211> 271
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
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<211> 705
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
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<211> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 21
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 22
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<211> 795
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 22
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
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<211> 264
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
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<210> 24
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<211> 654
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<212> DNA
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<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
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<210> 25
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<211> 217
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 25
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<210> 26
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<211> 837
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<212> DNA
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 26
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<210> 27
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<211> 278
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
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<211> 816
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 271
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggcagcgg cggcaggata tatt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial
Sequence:primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptgctttcgcc tataaatacg acgg
\hfill24
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<210> 32
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<211> 23
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<400> 32
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\hskip-.1em\dddseqskipcgctgcggac atctacattt ttg
\hfill23
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<210> 33
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<400> 33
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\hskip-.1em\dddseqskiptcccggacat gaagccattt ac
\hfill22
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<210> 34
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<211> 16
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<212> DNA
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<221> modified base
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<222> 1 and 11
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<223> n represents a, g, c or t
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<220>
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<221> modified base
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<222> 7
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<223> s representa g or c
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<220>
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<221> modified base
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<222> 8 and 13
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<223> w represents a or t
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\hskip-.1em\dddseqskipngtcgaswga nawgaa
\hfill16
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<210> 35
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<220>
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<221> modified base
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<222> 13, 35, 73, 108, 156, 190, 198 and
201
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n represents a, g, c or t
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<400> 35
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<210> 36
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<400> 36
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\hskip-.1em\dddseqskipcttcttcaat catcaccatg
\hfill20
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\hskip-.1em\dddseqskiptagcttgaac cggcgcaaat
\hfill20
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\hskip-.1em\dddseqskipgtacgtttta gtaacagtct
\hfill20
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\hskip-.1em\dddseqskipgattagcagt gactaactcc
\hfill20
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\hskip-.1em\dddseqskipagcttgtaca ttaaccgtga
\hfill22
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<400> 41
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\hskip-.1em\dddseqskipctgcagggtg atgattgaag aagat
\hfill25
Claims (4)
1. Un vector recombinante que comprende un
promotor específico de tejido vascular y tricomo que comprende el
ADN de los siguiente (A), (B) o (C) y un gen foraneo o un fragmento
de ADN foraneo insertado en la corriente descendente de dicho
promotor. (A) ADN consistente en la secuencia de nucleótidos
representado por SEQ ID NO:3; (B) ADN consistente de una secuencia
nucleótida que tiene una sustitución, supresión o adición de 1 a 10
nucleótidos relativos a la secuencia de nucleótidos representados
por la SEC ID NO:3 y funcionando como un promotor específico de
tejido vascular y tricoma; Y (C) ADN hibridizando bajo condiciones
estrictas el ADN consistente de la secuencia de nucleótidos
representada por SEQ ID NO:3 y funcionando como un promotor
específico de tejido vascular y tricoma.
2. El vector recombinante de acuerdo con la
reivindicación 1 donde el dicho gen foráneo es un gen que codifica
una proteína de los siguientes (A) o (B), (A) una proteína
consistente en una secuencia de aminoácido seleccionada de un grupo
consistente de secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID
NO: 2, 3. 7. 9. 11. 13. 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 y 29, y (B) una
proteína consistente de una secuencia de aminoácido teniendo una
sustitución, sustracción o adición de aminoácidos 1 al 10 relativos
a la secuencia de aminoácidos tal y como descritos en (A) y
impartiendo resistencia al paraquat
3. Una planta transgénica que tiene el vector
recombinante de acuerdo a las reivindicaciones 1 o 2.
4. Un método de expresión de gen que usa
promotor específico de tejido vascular y tricoma, comprendiendo el
expresado gen foráneo o fragmento de ADN foráneo en el tejido
vascular y tricoma de la planta transgénica de acuerdo a la
reivindicación 3.
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