CN112830959B - 一种降解百草枯的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

一种降解百草枯的蛋白及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种降解百草枯的蛋白及其编码基因PQT11/CYP86A4，以及该蛋白或基因在降解百草枯中的应用。本发明的发明人创造性的发现基因PQT11/CYP86A可降解非选择灭生性除草剂百草枯，过量表达该基因的植物具有对百草枯的抗性。进一步实验证明，通过体外的生化质谱检测，发现百草枯是因为在该基因表达的蛋白的催化下，被降解成去一个氮甲基或去两个氮甲基的产物。这是第一次在植物中获得可以直接降解百草枯的方式。

Description

一种降解百草枯的蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种降解百草枯的蛋白及其编码基因PQT11/CYP86A4，以及该蛋白或基因在降解百草枯中的应用。
背景技术
拟南芥(Arabidopsis thaliana)，是一种广泛分布于欧洲、亚洲和北美的十字花科植物。由于其基因组较简单、生长周期短，故作为植物科学研究的优良的模式植物。对拟南芥的研究可作为对其他农作物研究的一种重要理论模型。
百草枯(1，1-二甲基-4，4二氯联吡啶化合物，paraquat)即甲基紫精(methylviologen)，是一类广谱非选择灭生性除草剂。百草枯具有速效、广谱、在土壤中迅速钝化等优点，使其在果园、田埂、行间及非耕地得到快速推广和应用科学研究中，百草枯常被用作自由基引发剂来研究植物对氧化胁迫的反应。
因为百草枯可以通过影响植物叶绿体的电子传递，阻断能量转换引起植物的死亡。目前植物中对百草枯抗性的报道主要是集中在影响百草枯体内运输或增强抗性酶的活性。到目前为止并没发现对百草枯代谢能力增强或者直接清除的突变体，也没有找到百草枯可能在植物体内的降解物。所以寻找一种来源于植物且可以直接降解百草枯的突变体对于理解植物如何抵御氧化胁迫提供了一种全新的思路。为以后培育可抗氧化的农作物品种提供了理论基础。
发明内容
本发明的目的在于提供降解百草枯的蛋白及其编码基因PQT11/CYP86A4在提高植物对百草枯的抗性、培育抗百草枯植物或选育对百草枯抗性提高的植物品种中的应用，该基因过表达可以降解百草枯从而获得对百草枯的抗性。
为此，本发明第一方面提供了降解百草枯的蛋白在提高植物对百草枯的抗性中的应用，其特征在于，所述蛋白为：
1)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或
2)由与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比存在保守取代、缺失或添加一个以上的氨基酸序列组成，且活性与具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白相同的衍生蛋白。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述衍生蛋白具有的氨基酸序列与SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列具有至少90％的同源性。
在本发明的另一些优选的实施方式中，所述衍生蛋白具有的氨基酸序列与SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列具有至少95％的同源性。
在本发明的一些实施方式中，所述蛋白由与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比存在保守取代、缺失或添加不超过10个氨基酸的氨基酸序列组成。
在本发明的一些实施方式中，所述降解百草枯的蛋白与百草枯结合，并通过去氮甲基化方式降解百草枯，所述降解百草枯的蛋白为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白，百草枯与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白的结合位点包括309Gly和/或462Cys和/或464Gly。
在本发明的另一些实施方式中，编码所述降解百草枯的蛋白的基因为：
1)SEQ ID NO：1所示的DNA分子；
2)与SEQ ID NO：1所示的DNA序列相比存在保守取代、缺失或添加一个以上碱基，且与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子的DNA序列与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有至少90％的同源性。
在本发明的另一些优选的实施方式中，所述与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子的DNA序列与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有至少95％的同源性。
在本发明的一些实施方式中，编码所述降解百草枯的蛋白的基因的DNA序列还可以为在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA序列杂交的核苷酸序列；
其中，所述高严谨条件为：在6×SSC(柠檬酸钠缓冲液)，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
在本发明的另一些实施方式中，所述植物为拟南芥。
在本发明的一些实施方式中，编码所述降解百草枯的蛋白的基因为PQT11/CYP86A4。
本发明第二方面提供降解百草枯的蛋白或其编码基因在培育抗百草枯植物或选育对百草枯抗性提高的植物品种中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述降解百草枯的蛋白为：
1)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或
2)由与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比存在保守取代、缺失或添加一个以上的氨基酸序列组成，且活性与具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白相同的衍生蛋白。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述衍生蛋白具有的氨基酸序列与SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列具有至少90％的同源性。
在本发明的另一些优选的实施方式中，所述衍生蛋白具有的氨基酸序列与SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列具有至少95％的同源性。
在本发明的一些实施方式中，所述蛋白由与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比存在保守取代、缺失或添加不超过10个氨基酸的氨基酸序列组成。
在本发明的另一些实施方式中，编码所述降解百草枯的蛋白的基因为：
1)SEQ ID NO：1所示的DNA分子；
2)与SEQ ID NO：1所示的DNA序列相比存在保守取代、缺失或添加一个以上碱基，且与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子的DNA序列与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有至少90％的同源性。
在本发明的另一些优选的实施方式中，所述与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子的DNA序列与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有至少95％的同源性。
在本发明的另一些实施方式中，所述植物为拟南芥。
本发明第三方面提供一种培育百草枯抗性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：
1)将所述基因导入目的植物细胞，获得转基因植物；
2)从步骤1)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比百草枯抗性提高的转基因植物。
在本发明的一些实施方式中，所述基因为：
1)SEQ ID NO：1所示的DNA分子；
2)与SEQ ID NO：1所示的DNA序列相比存在保守取代、缺失或添加一个以上碱基，且与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子的DNA序列与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有至少90％的同源性。
在本发明的另一些优选的实施方式中，所述与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子的DNA序列与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有至少95％的同源性。
在本发明的一些实施方式中，在所述转基因植物中，所述降解百草枯的蛋白或所述降解百草枯的蛋白的编码基因过量表达。
在本发明的另一些实施方式中，所述降解百草枯的蛋白为
1)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或
2)由与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比存在保守取代、缺失或添加一个以上的氨基酸序列组成，且活性与具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白相同的衍生蛋白。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述衍生蛋白具有的氨基酸序列与SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列具有至少90％的同源性。
在本发明的另一些优选的实施方式中，所述衍生蛋白具有的氨基酸序列与SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列具有至少95％的同源性。
在本发明的一些实施方式中，所述蛋白由与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比存在保守取代、缺失或添加不超过10个氨基酸的氨基酸序列组成。
在本发明的另一些实施方式中，所述降解百草枯的蛋白与百草枯结合，并通过去氮甲基化方式降解百草枯，所述降解百草枯的蛋白为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白，百草枯与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白的结合位点包括309Gly和/或462Cys和/或464Gly。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述植物为拟南芥。
在本发明的另一些实施方式中，本发明中所用植物为哥伦比亚生态型的野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)；所述转基因株系PQT11/CYP86A4的过表达株系，在本发明中命名为OX；缺失突变体Salk_073078，在本发明中命名为KO。
在本发明的具体实施方案中，“PQT11/CYP86A”或“CYP86A4”均指拟南芥中具有降解百草枯功能的基因PQT11/CYP86A。百草枯(1，1-二甲基-4，4二氯联吡啶化合物，paraquat)在本发明中简称PQ。
在本发明中，“Col”及“WT”均指未经转基因的野生型的拟南芥哥伦比亚株系。
本发明的发明人在拟南芥中，创造性的发现基因PQT11/CYP86A可降解非选择灭生性除草剂百草枯，过量表达该基因的植物具有着对百草枯的抗性。进一步实验证明，通过体外的生化质谱检测，发现百草枯是因为在该基因表达的蛋白的催化下，被降解成去一个氮甲基或去两个氮甲基的产物。该降解产物是百草枯第一次被发现跟植物代谢相关的降解产物，也是第一次在植物中找到可以直接降解百草枯的方式。同时本发明的发明人找到了百草枯与该基因表达的蛋白结合或者作用的具体氨基酸残基。本发明为植物对百草枯产生抗性提供了一种全新的思路，为农业生产中培育新的抗百草枯的农作物提供了参考。
附图说明
下面将结合附图来说明本发明。
图1.(A)示出成功构建的命名为pCB2004-CYP86A4的最终载体的图谱示意图；
(B)示出WT、PQT11/CYP86A的过表达株系(OX3-1和OX1-4)及缺失突变体(KO)在RNA水平上的鉴定结果；
(C)示出WT、PQT11/CYP86A的过表达株系OX3-1及OX1-4中CYP86A4基因的qPCR结果；
(D)示出Salk_073078的插入位点示意图；
(E)示出基因组水平用三引物法确定Salk_073078为缺失纯合突变体的电泳结果；
图2.(A)示出本发明中WT、PQT11/CYP86A的过表达株系OX3-1及OX1-4和缺失突变体Salk_073078的种子在分别添加0、1μM PQ和1.5μM PQ的MS培养基上的萌发情况(培养一周)；
(B)示出本发明中WT、过表达株系OX3-1及OX1-4和缺失突变体Salk_073078的种子在不同PQ浓度处理下种子萌发率的统计结果；
图3.(A)示出本发明中WT、PQT11/CYP86A的过表达株系OX3-1及OX1-4和缺失突变体KO的幼苗在分别添加0、3μM PQ的MS培养基上的根系生长情况；
(B)示出本发明中WT、过表达株系OX3-1及OX1-4和缺失突变体KO的幼苗在MS培养基上生长(未经PQ处理)的鲜重统计结果；
(C)示出本发明中WT、过表达株系OX3-1及OX1-4和缺失突变体KO的幼苗在添加3μMPQ的MS培养基上生长的鲜重统计结果；
图4.对在土壤中生长至莲台期的四种株系(WT、过表达株系OX3-1及OX1-4和缺失突变体KO)不进行PQ处理及每天外源性喷洒6μM PQ，幼苗的生长情况；
图5.将生长在MS培养基一周大的WT小苗进行不同时间的10μM PQ处理，检测不同时间点幼苗PQT11/CYP86A基因的表达量；
图6.Western Blot检测体外PQT11/CYP86A蛋白表达；
图7.(A)质谱仪检测出百草枯在液相环境下三种不同形态的峰图以及对应的面积强度大小，以及其分别对应的结构式与质荷比，矩形框内分别示出质谱仪检测出的百草枯的三种质荷比形式的检测面积以及百草枯主要的存在形式(即质荷比为186的形式)的相关检测数据；
(B)根据表1的数据，做出百草枯检测面积值与浓度的标准曲线图；
(C)百草枯与其可能被降解的方式对应的化学结构式与质荷比数据；
(D)质谱检测体外孵育体系实验组与对照组中百草枯以及其可能的降解物的强度与面积。a所指矩形框内对应的是百草枯的数据，b所指矩形框对应的是百草枯去单氮甲基的数据，c所指矩形框对应的是百草枯去双氮甲基的数据；
(E)未加PQT11/CYP86A蛋白以及加入PQT11/CYP86A蛋白后体外孵育体系中百草枯及其去单氮甲基、去双氮甲基的质量变化；
(F)未加PQT11/CYP86A蛋白以及加入PQT11/CYP86A蛋白后体外孵育体系中百草枯及其去单氮甲基、去双氮甲基的强度变化；
图8.PQT11/CYP86A蛋白酶促反应的米氏方程曲线；
图9.(A)pCB2004-309Gly点突变质粒的测序结果；
(B)pCB2004-462Cys点突变质粒的测序结果；
(C)pCB2004-464Gly点突变质粒的测序结果；
(D)pCB2004-309Gly不同过表达纯合株系PQT11/CYP86A的qPCR表达量检测结果；
(E)pCB2004-462Cys不同过表达纯合株系PQT11/CYP86A的qPCR表达量检测结果；
(F)pCB2004-464Gly不同过表达纯合株系PQT11/CYP86A的qPCR表达量检测结果；
图10.(A)加入1mM的IPTG与1mM的PQ后，五种转入不同质粒的重组菌OD600值的检测结果；
(B)不加IPTG和PQ，五种转入不同质粒的重组菌OD600值的检测结果；
图11.(A)MS培养皿上萌发五天后，不同株系幼苗移至不同PQ浓度处理下根系的生长情况；
(B)0μM PQ处理条件下不同株系鲜重大小的统计结果；
(C)4μM PQ处理条件下不同株系鲜重大小的统计结果；
(D)在不同PQ浓度处理下，不同株系的种子在分别添加0和1.5μM PQ的MS培养基上的萌发情况(培养一周)；
(E)不同PQ处理条件下不同株系种子萌发率的统计结果。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。
在本发明的一些具体的实施方式中，PQT11/CYP86A过表达的纯合转基因株系的获得方法如下：
1)将包含PQT11/CYP86A基因编码区片段的重组表达载体导入植物细胞；
2)通过步骤1)，获得转基因植物细胞，由转基因植物细胞产生过表达PQT11/CYP86A基因的转基因阳性苗；
3)将获得的转基因阳性苗进行抗性筛选，扩繁后代，获得纯合体株系，并在转录水平上鉴定基因的表达量，确定目的基因的表达水平被提高，从而获得纯合过表达转基因株系。
在本发明的另一些具体的实施方式中，含有本发明PQT11/CYP86A的植物表达载体可通过使用农杆菌介导的转化、外源DNA转化(电转、基因枪)、植物病毒载体转化等本领域常规转化方法进行植物细胞或组织的转化。
在本发明的一些实施方式中，在植物中过量表达PQT11/CYP86A基因可获得抗百草枯的植物。
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
下述实施例中的实验方法，如果没有特殊说明，均为常规实验方法。实验所用到的试剂盒实验仪器，如无特殊说明，均可在生物仪器和试剂公司购买到。
实施例1拟南芥PQT11/CYP86A相关材料在DNA和RNA水平上的鉴定
拟南芥PQT11/CYP86A过表达株系与缺失突变体的获得：
因为PQT11/CYP86A这个基因为获得性功能基因，首先构建其过表达OX株系。
首先利用GatewayTM克隆技术系统(Invertrogen)设计带有全接头包含整个PQT11/CYP86A编码区的引物。通过BP与LR两步(汪宗桂，郑文岭，马文丽；通路克隆系统：DNA重组技术的新进展.中国生物工程杂志(2003)，第23卷第7期)将PQT11/CYP86A-CDS成功克隆到含有4个35S启动子作为过表达载体的pCB2004(High-throughput Binary Vectors forPlant Gene Function Analysis，Zhi-Yong Lei et al.，Journal of Integrative PlantBiology 2007，49(4)：556-567，该文献所属实验室惠赠)终载体上。得到如图1A所示的重组质粒。经过测序鉴定重组质粒没有任何点突变的情况下，将重组质粒通过电转到C58C1农杆菌(美国ISU大学Oliver D.J.教授惠赠，也可以通过商购)中，通过侵花到生长状态良好的野生型拟南芥(购自拟南芥生物资源中心，Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC)中。收获得到T0代种子后经过50mg/L的草铵膦(Liberty，法国Aventis作物科学公司)筛选得到阳性苗，单株收种得到T1代种子后，继续通过草铵膦筛选统计性状分离比后确定获得纯合的过表达单株。将经过鉴定后的纯合过表达单株抽提RNA，反转成cDNA后，通过RT-PCR(图1B)与qPCR检测过表达株系中PQT11/CYP86A(图1C)的表达量是否明显上调(Ubiquitin5基因作为内参基因)。最后在表达量明显上调的所有株系中选择两个代表OX1-3与OX4-1作为后续的研究，两者的表达量如图1C所示。
其次，为了获得该基因的缺失突变体，从ABRC(Arabidopsis BiologicalResource Center，The Ohio State University，Columbus，OH 43210，USA)获得了一个T-DNA插入在At1g01600第一个外显子上的的缺失突变体Salk_073078(图1D)。取该订购种子萌发后的小苗或者成苗莲台叶，经研磨等相关步骤抽提出了植物的基因组。通过T-DNAprimer design网站查找出检测该salk的一对引物，经过三引物法的PCR扩增在基因组水平上完成纯合体的鉴定(图1E)。PCR扩增体系中，以WT的基因组作为对照。同时抽提基因组水平上鉴定过的株系的RNA，反转成cDNA后，图1B所示通过RT-PCR在RNA水平上鉴定该纯合株系基本不表达PQT11/CYP86A基因，Tubulin基因作为内参基因。
上述实施过程涉及的引物与步骤方法如下所示：
通过GatewayTM克隆的PQT11/CYP86A的CDS序列的引物为：
上游引物LP1：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGAAATATCCAATGCCATGC-3’，如SEQ ID NO：3所示；
下游引物RP1：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAACCACTGCAACTCCCGTA-3’，如SEQ ID NO：4所示。
SALK_073078纯合体鉴定引物序列如下：
上游引物LP2：5’-TTCACCACATACAGCTGCATC-3’，如SEQ ID NO：5所示；
下游引物RP2：5’-AAATGTTGTCGAATGTGAGCC-3’，如SEQ ID NO：6所示。
三引物法中间引物LBb1.3∶5’-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3’，如SEQ ID NO：7所示。
qPCR引物(RT-PCR引物与之相同)如下：
上游引物LP3：5’-CCCCAAGGGTTTCACTGAATTC-3’，如SEQ ID NO：8所示。
下游引物RP3：5’-AAGTAAATGCGAAGCCTGCTTG-3’，如SEQ ID NO：9所示。
Ubiquitin5基因引物序列为：
上游引物LP4：5’-AGAAGATCAAGCACAAGCAT-3’，如SEQ ID NO：10所示；
下游引物RP4：5’-CAGATCAAGCTTCAACTCCT-3’，如SEQ ID NO：11所示。
Tubulin基因引物序列为：
上游引物LP5：5’-CTTAACCTCACCACTCCAAGCT-3’，如SEQ ID NO：12所示；
下游引物RP5：5’-GCACTTCCACTTCGTCTTCTTC-3’，如SEQ ID NO：13所示。
植物基因组的抽提方法如下：
1)取100mg左右的新鲜拟南芥组织，用液氮冻碎研磨成粉末，加入400μl的DNA抽提buffer，上下倒置混匀，再加入5μl的RNA酶消化RNA，将样品放置55℃的水浴锅中温浴10分钟；
2)取出样品，再次颠倒混合后，加入142μl的5M的醋酸钾去除蛋白，置于冰上不少于10分钟；
3)12000rpm离心10分钟，取上清约300μl转移到新的1.5ml EP管中，加入等体积的异丙醇再次颠倒混匀，静置10分钟；
4)12000rpm离心10分钟，此时可看到沉淀，倒掉上清，用70％的乙醇洗涤沉淀两次，再倒掉乙醇并烘干；
5)加入20μl的水溶解沉淀，可在65℃水浴锅中助溶，得到植物的基因组。
PQT11/CYP86A基因的PCR克隆体系如下所示：
本发明采用KOD酶的扩增体系，总体积为50μl。
2×KOD缓冲液 25μl
2.5mM dNTP 5μl
10μM P1 1μl
10μM P2 1μl
KOD FX 1μl
模板 1μl
ddH<sub>2</sub>O 16μl
PCR的程序如下：
1)95℃预变性3分钟；
2)98℃变性10秒，58℃退火30秒，68℃条件下延伸90秒为一个循环，总共40个循环；
3)68℃充分延伸10分钟，保存于25℃。
植物RNA的抽提方法如下：
1)取100mg左右的新鲜拟南芥组织(在MS培养皿上萌发一周的幼苗)，用液氮冻碎研磨成粉末，加入1ml的TRIZOL试剂(北京全式金生物技术有限公司)，待融化后，继续研磨充分，并转移到新的灭菌后的1.5ml EP管中；
2)向管中加入200μl的氯仿，震荡混匀，静置约10分钟；
3)12000rpm离心15分钟，离心条件需在4℃进行；
4)离心后可见分层，转移上清约300μl至新的EP管中。并加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，静置10分钟；
5)12000rpm离心10分钟，此时可看到沉淀，倒掉上清，用70％的乙醇洗涤沉淀两次，再倒掉乙醇并烘干；
6)加入20μl的DEPC水溶解沉淀，可在65℃水浴锅中助溶，得到植物的RNA。
RNA反转录成cDNA步骤如下：
采用TAKARA公司的反转录试剂盒，按照如下体系反转录：
5×primeScript缓冲液 2μl
primeScript RT酶混合物I 0.5μl
50uM Oligo dT引物 0.5μl
RNA 2μl
不含RNA酶的ddH<sub>2</sub>O 5μl
总体积 10μl
该反应体系置于37℃的水浴锅中温浴约2小时，可直接作为qPCR的模板。
RT-PCR反应体系如下：
2×PCR mix 10μl
10uM P1 0.5μl
10μM P2 0.5μl
模板 0.5μl
ddH<sub>2</sub>O 8.5μl
总体积 20μl
RT-PCR反应程序如下：
1)95℃预变性20秒；
2)95℃变性10秒，60℃退火延伸30秒，进行25个循环。
荧光实时定量PCR使用的SYBR green试剂来自TaKaRa公司，通过荧光实时定量PCR仪器(StepOne real-time PCR system)检测PQT11/CYP86A基因在转录水平的表达量。如下(10μl体系)：
SYBR green 5ul
20μM P1 0.25μl
20μM P2 0.25μl
模板 1μl
ddH<sub>2</sub>O 3.5μl
qPCR的程序如下：
1)95℃预变性20秒；
2)95℃变性10秒，60℃退火延伸30秒，总共40个循环。
SALK_073078纯合体鉴定的PCR反应体系如下：
2×PCR mix 10μl
10μM LBb1.3 0.5μl
10μM LP2 0.5μl
10μM RP2 0.5μl
模板 1μl
ddH<sub>2</sub>O 7.5μl
总体积为20μl。
PCR的程序如下：
1)95℃预变性3分钟；
2)95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃条件下延伸1分钟为一个循环，总共30个循环；
3)72℃充分延伸10分钟，保存于25℃。
实施例2拟南芥种子萌发实验
在含有不同浓度PQ的MS皿上，进行不同株系点种实验，在水平方向上培养生长7天后，观察不同株系的存活率来表征其耐氧化的程度(图2A)。以能完整生长出两片子叶定义为可存活。经统计后可以得知PQT11/CYP86A的两种过表达植株OX1-4与OX3-1在1μM PQ与1.5μM PQ的培养基上较野生型更具有耐氧化性。而其缺失突变体Salk_073078的耐氧化性不如野生型。
具体的萌发存活率统计如下(图2B)：
在0μM PQ条件下，WT、OX3-1、OX1-4、Salk_073078存活率均为100％。
在1μM PQ条件下，WT存活率为28.5％，OX3-1的存活率为71.4％，OX1-4的存活率为74.7％，Salk_073078存活率为8.3％。
在1.5μM PQ条件下，WT存活率为6.7％，OX3-1的存活率为35.5％，OX1-4的存活率为36.8％，Salk_073078存活率为2.6％。
实施例3拟南芥竖直移苗鲜重分析实验
将在MS培养基上生长一周的四种不同株系小苗移至含3μM PQ的培养皿上，再生长一周后观察表型。同时相同的操作将四种株系小苗移到MS皿上作为对照(图3A)。通过观察可知，在3μM PQ培养皿上，两种过表达株系比野生型长出更大更多的子叶，其鲜重也明显重于野生型(图3C)，且野生型明显显得更加衰老。缺失突变体与野生型无明显差异。在MS培养皿上的对照组中，四种株系小苗的生长基本无差异(图3B)。
两种不同处理下一周后四种不同小苗平均鲜重统计如下：
转移到0μM PQ培养皿重新培养五天条件下，WT平均鲜重为0.0052g/颗，OX3-1为0.0054g/颗，OX1-4为0.0050g/颗，Salk_073078为0.0053g/颗。
转移到在3μM PQ培养皿重新培养七天条件下，WT平均鲜重为0.0024g/颗，OX3-1为0.0055g/颗，OX1-4为0.0057g/颗，Salk_073078为0.0025g/颗。
实施例4土壤中培育拟南芥并外源喷洒百草枯的表型分析实验
实施例2与3证明了在种子萌发与拟南芥生长早期，过表达PQT11/CYP86A基因的植株表现出较野生型更耐百草枯的表型，其缺失突变体相对野生型则不耐。为了探究该基因功能是否还在后续阶段起作用，进行了成苗表型跟踪分析。
将四种不同株系种植于土壤中，待其生长进入莲台期(含约8片莲台叶左右)且未抽苔前，每隔一天对其外源性喷洒6μM PQ，观察其莲台叶的变化(图4)。经过一周以后可发现缺失突变体植株的莲台叶最先衰老，莲台叶最先枯萎且颜色变成棕紫色，野生型其次。而两种过表达植株的莲台叶较野生型更绿且衰老莲台叶更少，体现出了更好的耐氧化性。
实施例5 PQT11/CYP86A表达量在PQ处理后显著上调
从实施例2、3、4的结果可知过表达PQT11/CYP86A这个基因可以增强拟南芥对PQ的耐受性，对于PQT11/CYP86A基因是否直接响应PQ处理尚未可知，将在MS皿上生长一周的WT小苗进行不同时间的PQ处理，PQ的浓度为10μM，抽提处理后小苗的RNA并反转成cDNA，通过qPCR检测CPY86A4基因的表达量(抽提RNA、反转录cDNA以及qPCR的检测步骤如实施例1所述)。如图5所示，可以发现PQT11/CYP86A表达量在短时间内(1-3h)PQ处理后显著上调，在6h后逐渐降低，说明该基因响应PQ胁迫且在PQ处理约3h左右表达量达到最大。
实施例6 PQT11/CYP86A蛋白的体外表达
为了测定PQT11/CYP86A是否催化百草枯发生相应的降解，需要构建包含PQT11/CYP86A蛋白以及百草枯的体外孵育体系再做关于百草枯的质谱检测。首先第一步是能在体外表达出PQT11/CYP86A蛋白。将包含PQT11/CYP86A的CDS全长序列通过T4连接的方式与pET28a载体(购自淼灵生物公司)相连从而构建融合质粒。在测序正确的情况下，将重组质粒导入到Rosetta菌株(北京华越洋公司)中表达。因为pET28a载体带有HIS-Tag的标签，可将转有融合质粒的大肠杆菌集菌超声破碎收集上清后，将上清液进行过镍柱的蛋白回收纯化。
将纯化后的PQT11/CYP86A蛋白跑蛋白胶，加入能与HIS-Tag标签特异性结合的一抗与二抗，漂洗蛋白胶后显影，可以发现在蛋白marker 55KD与72KD之间有一条亮带(图6)。而At1G01600的CDS全长为1665bp，理论表达蛋白的大小在63KD左右，Western的图谱证明His-PQT11/CYP86A可在体外成功表达。
实施例7质谱检测百草枯在PQT11/CYP86A催化下可能的降解产物
百草枯结构的改变可导致其相对分子质量的变化，而这种变化可以通过精密的质谱仪检测出。先制备百草枯的标品，摸索出最佳的上样条件与检测条件，证明百草枯可以通过液相质谱的方式被检测出。
百草枯的化学式是C12H14Cl2N2，当其溶于水后，两个非共价结合的氯游离出去，剩下C12H14N2。按照其在溶液中不同的得电子状态，可以形成质荷比为186、185、93的三种形态。根据图7A的结果可知，在该仪器的检测条件下，百草枯主要是通过质荷比为186的形式被检测出。选取四个不同浓度，按照检测出四个浓度对应峰的面积(如表1所示)制作出百草枯的标准曲线(图7B)，回归值表明该标准曲线符合要求。
表1：
PQ浓度(ng/m1) M/Z 面积
1.5625 186 8385
6.25 186 28412
25 186 99179
100 186 366562
取体外纯化的HIS-PQT11/CYP86A蛋白，加入相应浓度的百草枯，其他需要加入的有提供还原态氢的NADPH、可以帮助稳定HIS-PQT11/CYP86A蛋白的BSA、可稳定生成还原态氢的磷酸-6-葡萄糖与磷酸-6-葡萄糖脱氢酶以及终浓度为50mM且pH为7的磷酸缓冲液。该体外孵育体系在室温中孵育45分钟后最后加入等体积的乙腈终止反应，离心得到上清液后进入液相质谱检测。对照组中除不添加HIS-PQT11/CYP86A蛋白，其他的物质与含量与实验组一致。
液相质谱可以得到实验组与对照组中目标检测物的强度大小与峰的面积值。图7C给出百草枯可能发生结构改变的质荷比大小作为质谱中搜索的主要对象。因为氮甲基的键能较低，样品离子化的过程中会使得一定比例的氮甲基脱落，所以会本底水平产生百草枯的去氮甲基化的形式。通过对比发现，实验组中百草枯的含量较对照组出现了明显的下降，而其去单氮甲基化以及去双氮甲基化的代谢物出现了明显的升高(图7D)。通过图7E的含量与图7F的强度计算，百草枯减少的量约等于其去单氮甲基与去双氮甲基增加的量。而在实验组或者对照组中，基本都没有检测出百草枯环甲基羟基化或者芳基羟基化这两种可能的结构。所以可以得出PQT11/CYP86A蛋白主要是催化百草枯通过脱氮甲基的方式完成对百草枯的解毒过程。其主要代谢产物为百草枯去单氮甲基，次要产物为去双氮甲基。
其中，质谱条件如下：
流动相水相A相为50mM的甲酸铵，用甲酸调pH为3.7，流动相有机相B相为纯乙腈。
质谱程序为总时间为12分钟。起始条件为80％B与20％A。前5分钟维持起始条件，5-7分钟时间段内，B由80％线性降到20％，A由20％线性增到80％。7-10分钟内，B由20％线性增到80％，A由80％线性降到20％。10分钟后，维持80％B与20％A，流速为0.3ml/min。
实施例8 PQT11/CYP86A蛋白的酶活测定
上述实施例7的实验已证明PQT11/CYP86A蛋白可以在体外的孵育体系下将百草枯通过去氮甲基化达到解毒的功效。对该蛋白的活性进行表征则是下一步需要完成的任务。
百草枯在体外孵育下可发生降解，选择体外孵育体系下不同终浓度的百草枯，包含20mM、40mM、80mM、100mM、400mM五个条件。分别测试这五个条件下百草枯在不加PQT11/CYP86A蛋白以及加入PQT11/CYP86A蛋白前后在质谱中的检测含量。计算出同样条件下实验组与对照组中百草枯的质量变化，绘制出如图8所示该蛋白的酶活曲线。最终换算得到PQT11/CYP86A蛋白的Km值为37.06μM，最大反应速率Vmax为5.165pmol min-1 mg-1蛋白质。
实施例9构建三种不同点突变的过表达株系
上述的实施例可证明PQT11/CYP86A主要是通过去氮甲基化方式降解百草枯从而使得过表达PQT11/CYP86A基因的植株获得对百草枯的抗性。为了探索PQT11/CYP86A蛋白中具体哪些氨基酸残基与百草枯发生结合或作用，选择309Gly、462Cys、464Gly这三个氨基酸位点，并且分别将这三个位点突变成Ala，以验证是否影响该蛋白降解百草枯的功能。
首先需要构建3种点突变的过表达重组质粒。以构建好的pCB2004-PQT11/CYP86A为模板，通过后续展示的三组不同的特异性引物，按照实施例1的KOD扩增体系获得含单个氨基酸突变的目的片段。胶回收目的条带后用Dpn酶进行去甲基的消化以方便宿主细菌的识别，最后转化到DH5α通过摇菌并涂板获得相应菌落。挑取单克隆并抽提质粒，对质粒进行测序，验证是否发生定点突变。
通过图9A、9B、9C所示测序正确后，按照实施例1所示的侵花转染WT的方法，经过两代的特异性筛选获得不同的纯合过表达点突变单株。按照实施例1所示的qPCR方法检测其过表达含量，按照图9D、9E、9F所示结果并挑选出合适的单株作为后续表型研究的材料。最后选择了OX309Gly-7、OX462Cys-8、OX464Gly-5这三个单株。
三种点突变的引物序列如下：
309Gly突变的引物为：
上游引物LP6：5'-AACTTTATCCTAGCTGCACGTGACACGT-3’，如SEQ ID NO：14所示。
下游引物RP6：5'-GCACCGCGAATTGAAATAGGATCGACG-3’，如SEQ ID NO：15所示。
462Cys突变的引物为：
上游引物LP7：5’-AATGCTGGACCAAGGATCGCATTGGGGAAAGATCTGGCG-3’，如SEQ IDNO：16所示。
下游引物RP7：5'-TTACGACCTGGTTCCTAGCGG AACCCCTTTCTAGACCGC-3’，如SEQ IDNO：17所示。
464Gly突变的引物为：
上游引物LP8：5'-CCAAGGATCTGCTTGGCGAAAGATCTG-3’，如SEQ ID NO：18所示。
下游引物RP8：5’-GTTACGACCTGGTTCCTAGACGAACCG-3’，如SEQ ID NO：19所示。
实施例10三种不同点突变原核表达质粒的体内耐百草枯测试
为了研究对3个特异氨基酸位点点突变是否影响PQT11/CYP86A蛋白的功能，将实施例6所提到的pET28a-PQT11/CYP86A作为模板，按照实施例9提到的点突变方式，得到3种不同点突变原核表达质粒。将这三种质粒以及作为对照的pET28a的空质粒与pET28a-PQT11/CYP86A通过化转导入Rosetta大肠杆菌中，挑取单克隆并摇浓至OD600值为1.6。将OD600为1.6左右的重组菌按照1％体积比接种于新鲜的LB液体培养基，同时加入终浓度为1mM的IPTG与1mM的PQ，测量不同时间不同重组菌的OD值。不加IPTG与PQ的另一组作为对照。从图10B可知，在不加入IPTG与PQ的对照组中，加入五种不同质粒的大肠杆菌的生长趋势基于一致，但是在如图10A所示的加入终浓度为1mM的IPTG与1mM的PQ的实验组中，加入pET28a-PQT11/CYP86A的大肠杆菌表现出明显的抗性，其浓度明显高于其他四种。而发生点突变的三种质粒转入Rosetta后，在PQ的胁迫下，并没有表现出相应的抗性，其表型和加入pET28a的空质粒表现接近一致。实验结果证明，在大肠杆菌中PQT11/CYP86A基因编码的蛋白也能完成对百草枯的降解。与之前体外孵育体系共同说明该蛋白在体内和体外均能参与降解百草枯。
实施例11三种不同点突变过表达株系的表型分析
将实施例9得到的3种不同点突变过表达株系按照实施例2与3进行表型分析。发现无论是在种子萌发(图11D)还是幼苗早期胁迫生长(图11A)中，3种不同点突变过表达株系已经无法和未突变的过表达株系一样表现出对百草枯的抗性，其恢复到接近于野生型或者略好于野生型的水平。且图11B、11C、11E的统计结果也支持这结论。从而结合实施例10可以得出，改变PQT11/CYP86A蛋白的这三个氨基酸位点，确实可以影响其对百草枯的降解能力。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Figure IDA0002284471520000011
Figure IDA0002284471520000021
Figure IDA0002284471520000031
Figure IDA0002284471520000041
Figure IDA0002284471520000051
Figure IDA0002284471520000061
Figure IDA0002284471520000071
Figure IDA0002284471520000081
Figure IDA0002284471520000091

Claims (4)

1.降解百草枯的蛋白在提高植物对百草枯的抗性中的应用，其特征在于，所述蛋白为：由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白；所述植物为拟南芥。
2.编码降解百草枯的蛋白的基因在提高植物对百草枯的抗性中的应用，其特征在于，所述基因为SEQ ID NO:1所示的DNA分子；所述植物为拟南芥。
3.降解百草枯的蛋白或其编码基因在培育抗百草枯植物或选育对百草枯抗性提高的植物品种中的应用，其特征在于，所述降解百草枯的蛋白为权利要求1中所述的蛋白，编码所述降解百草枯的蛋白的基因为权利要求2中所述的基因，所述植物为拟南芥。
4.培育百草枯抗性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：
1)将权利要求2中所述的基因导入目的植物细胞，获得转基因植物；
2)从步骤1)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比百草枯抗性提高的转基因植物；
所述植物为拟南芥。
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