JP2001095585A - パラコート耐性カルス由来のペルオキシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ペルオキシダーゼ及び該酵素をコードする遺
伝子の提供。 【解決手段】 以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質又
は該タンパク質をコードする遺伝子。 (a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク
質 (b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若し
くは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列を含み、かつペルオキシダーゼ活性を有する
タンパク質

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、活性酸素により引
き起こされる植物の障害の発生に関与しており、植物の
活性酸素障害耐性の向上に寄与していると考えられ、活
性酸素発生条件下で誘導される植物のペルオキシダーゼ
遺伝子に関する。さらに、本発明は、様々な環境ストレ
ス（高低温、乾燥、強光、塩、大気汚染ガス、病原菌
等）条件下で発生する活性酸素に対して耐性の高いトラ
ンスジェニック植物に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物は、日ごろより高低温、乾燥、強
光、塩、大気汚染ガス、病原菌等の様々な環境ストレス
にさらされている。そして、これら環境ストレス下でも
十分生育できる有用な植物、例えば穀物などが開発でき
れば、環境ストレスにより穀物が生育できない地域にお
いても食料生産が可能となり、将来予想されている深刻
な食糧危機への備えとなる可能性が高い。このため、こ
れら環境ストレスに対する耐性が向上した植物の作出が
世界的に繰り広げられている。例えば、低温耐性（Natu
re，356, 710−703，1992、Plant Physiol．，105，601
−605，1994）、乾燥耐性（Plant Physiol．，107，125
−130，1995、Nature，379，683-684，1996、 Nature B
iotech. , 17，287-291，1999）、塩耐性（Science, 25
9, 508-510,1993、Biotechnology, 14, 177-180, 199
6、Plant J., 12, 133-142, 1997）、大気汚染物質耐性
（Plant Cell Physiol.，34，129-135，1993、 Biotech
nology, 12, 165-168, 1994）、病害抵抗性（化学と生
物, 37, 295-305, 385-392, 1999）等を遺伝子組換え技
術により付与された植物が作出されている。また遺伝子
組換え技術により農薬耐性（Nature，317, 741-744，19
85、Proc.Natl.Acad.Sci.USA , 85, 391-395, 1988、EM
BO J., 6, 2513-2518, 1987、EMBO J., 7, 1241-1248,
1988）を付与された植物は実用化されているものもあ
る。

【０００３】これら環境ストレスは、生体内の活性酸素
分子種（スーパーオキシドラジカル：O^2-、過酸化水
素：H₂O₂、ヒドロキシラジカル：OH^-）の発生と密接に
関係している。活性酸素分子種は、呼吸、光合成、環境
ストレス等により発生し、タンパク質、核酸、膜構造等
を過度に酸化することにより細胞に致命的な障害を与え
る。遺伝子組換え技術により作出された活性酸素耐性植
物が、これら環境ストレス耐性の向上につながった報告
も見うけられる（Plant Physiol．，111，1177−1181，
1996、FEBS Letters, 428, 47-51, 1998）。

【０００４】活性酸素耐性植物の作出には、主に活性酸
素分子種の消去系酵素（スーパーオキシドディスムター
ゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ及びグルタチオンレ
ダクターゼ等）の遺伝子を植物に導入する方法がとられ
ており、またパラコート（活性酸素を発生させ殺草効果
を示す除草剤）に耐性な植物のパラコート耐性の機構に
関する解析もみられる（Pestic. Biochem. Physiol., 2
6, 22-28, 1986、Theor. Appl. Genet. 75, 850-856, 1
988、Plant Physiol., 91, 1174-1178, 1989）。しか
し、パラコート耐性培養細胞から再生した植物体がパラ
コートに対し耐性をもち、その耐性に関与すると考えら
れる遺伝子を単離した報告は見られない。そのようなパ
ラコート耐性に関与する遺伝子が単離されれば、様々な
環境ストレス（高低温、乾燥、強光、塩、大気汚染ガ
ス、病原菌等）条件下で発生する活性酸素に対して耐性
の高い植物の開発に有用であると思われる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、活性酸素を
発生させ殺草効果を示す除草剤であるパラコートに対し
耐性を示すカルス由来のタンパク質をコードし、また植
物体においてもパラコート処理により誘導される遺伝子
を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意検討を重ねた結果、パラコート耐性
植物に存在する遺伝子に着目し、パラコート耐性タバコ
カルス（Plant Cell Physiol., 25, 1247-1254, 1984）
を用い、McCordとFridovichによるスーパーオキシドデ
ィスムターゼの活性測定法（J.Biol.Chem., 246, 6049-
6055, 1969）で特異的に見られるチトクロームＣの再酸
化パターンを指標にタンパク質を部分精製した。そし
て、このタンパク質がペルオキシダーゼであることを見
出し、このタンパク質をコードする遺伝子を単離するこ
とに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、以下の(a)又は(b)の
組換えタンパク質である。 (a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク
質 (b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若し
くは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列を含み、かつペルオキシダーゼ活性を有する
タンパク質

【０００８】さらに、本発明は、以下の(a)又は(b)のタ
ンパク質をコードするペルオキシダーゼ遺伝子である。 (a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク
質 (b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若し
くは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列を含み、かつペルオキシダーゼ活性を有する
タンパク質

【０００９】さらに、本発明は、以下の(c)又は(d)のDN
Aを含む遺伝子である。 (c) 配列番号１で表される塩基配列を含むDNA (d) 配列番号１で表される塩基配列を含むDNAとストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペルオキ
シダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA

【００１０】さらに、本発明は、上記遺伝子を含む組換
えベクターである。さらに、本発明は、上記組換えベク
ターを含む形質転換体である。さらに、本発明は、上記
遺伝子が組み込まれた形質転換植物である。さらに、本
発明は、上記形質転換体を培養し、得られる培養物から
ペルオキシダーゼを採取することを特徴とするペルオキ
シダーゼの製造方法である。以下、本発明を詳細に説明
する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明は、活性酸素を発生させ殺
草効果を示す除草剤であるパラコートに対し耐性を示す
カルス由来のペルオキシダーゼであり、さらに、該ペル
オキシダーゼをコードする遺伝子である。本発明の遺伝
子は、植物体（例えばタバコ植物体）においてパラコー
ト処理により誘導することができるものである。一例と
して、タバコ属のペルオキシダーゼ遺伝子を示す。タバ
コ属に属する植物と同じように、他の植物種において、
パラコートに対し耐性を示す植物カルス由来のペルオキ
シダーゼをコードし、また植物体においてもパラコート
処理により誘導されるペルオキシダーゼ遺伝子が存在す
ると考えられる。これまで、パラコート耐性培養細胞か
ら再生した植物体が、パラコートに対し耐性をもち、そ
の耐性に関与すると考えられるペルオキシダーゼ及びそ
れをコードするDNAは知られていない。

【００１２】本発明のペルオキシダーゼは、配列番号２
に示したアミノ酸配列を有する。しかし、植物間でも品
種等によって多少のアミノ酸配列の相違はあり得る。ま
た、同一植物品種であっても突然変異等によってアミノ
酸が変化する場合がある。よって、本発明では、配列番
号２のアミノ酸配列のうち複数個（1若しくは数個、例
えば１〜10個）のアミノ酸が置換、欠失または付加され
たアミノ酸配列を有するペルオキシダーゼも含有する。

【００１３】本発明は、例えば配列番号１に示したペル
オキシダーゼ遺伝子を提供する。但し、当該遺伝子に限
定されず、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする
すべての遺伝子を含む。また、本発明では、配列番号２
のアミノ酸配列のうち複数個（1若しくは数個、例えば
１〜10個）のアミノ酸が、置換、欠失または付加された
アミノ酸配列を有し、実質的なペルオキシダーゼをコー
ドするすべての遺伝子を含む。

【００１４】１．本発明の遺伝子のクローニング (1) cDNAライブラリーの作製及びスクリーニング 本発明の遺伝子は、パラコート耐性タバコカルスから、
McCordとFridovichによるスーパーオキシドディスムタ
ーゼの活性測定法で特異的に見られるチトクロームＣの
再酸化パターンを指標に、タンパク質を部分精製し、そ
のアミノ酸配列をもとにパラコート耐性タバコカルスか
ら作製したライブラリーからクローニングすることがで
きる。パラコート耐性タバコカルスとは、除草剤である
パラコートを125μM以上培地に添加しても生育・増殖で
きるタバコカルスを意味する(Plant Cell Physiol., 2
5, 1247-1254, 1984)。

【００１５】タバコカルスからのmRNAの抽出及びcDNAラ
イブラリーの作製は常法に従って行うことができる。mR
NAの供給源としては、例えばパラコート耐性タバコカル
スが挙げられるが、これに限定されるものではない。mR
NAの調製は、通常行われる手法により行うことができ
る。例えば、上記供給源から、グアニジウムチオシアネ
ート-トリフルオロ酢酸セシウム法などにより全RNAを抽
出した後、オリゴdT-セルロースやポリU-セファロース
等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバ
ッチ法によりポリ(A)⁺RNA(mRNA)を得ることができる。
さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ(A)⁺RNAを
さらに分画してもよい。

【００１６】このようにして得られたmRNAを鋳型とし
て、オリゴdTプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖
cDNAを合成した後、該一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを合成
する。次に、得られた二本鎖cDNAを適当なクローニング
ベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。そし
てこの組換えベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、
テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性等を指標とし
て形質転換体を選択することにより、cDNAのライブラリ
ーを得ることができる。 ここで、大腸菌の形質転換
は、Hanahanの方法(J. Mol. Biol. 166：557-580, 198
3)、すなわち塩化カルシウム、塩化マグネシウム又は塩
化ルビジウムを共存させて調製したコンピテント細胞
に、組換えベクターを加える方法等により行うことがで
きる。なお、ベクターとしてプラスミドを用いる場合は
テトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を
含有することが必要である。また、プラスミド以外のク
ローニングベクター、例えばλファージ（λgt11等)を
用いることもできる。

【００１７】上記のようにして得られる形質転換体から
目的のDNAを有する株を選択するには、例えば、ペルオ
キシダーゼタンパク質ファミリーのアミノ酸配列に対応
する縮重センスプライマー及び縮重アンチセンスプライ
マーを合成し、これを用いてPCRを行い、得られた断片
をプローブとして、cDNAライブラリーからスクリーニン
グする方法、あるいはλファージ（λgt11等)を用いた
場合は、λgt11インサート増幅用のプライマーを用いて
PCRを行う方法を採用することができる。但し、本発明
においてはこれらのプライマーに限定されるものではな
い。なお、プライマーは化学合成により調製することが
できる。

【００１８】このようにして得られたDNA増幅断片を、
³²P、³⁵S又はビオチン等で標識してプローブとし、これ
を形質転換体のDNAを変性固定したニトロセルロースフ
ィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株
を検索することによりスクリーニングすることができ
る。好ましくは、クローニングした部分配列のうち配列
番号13に示す配列を有するオリゴヌクレオチドと、ライ
ブラリー作製時にcDNAをλファージDNAにライゲーショ
ンしたcDNA集団のλファージDNAの配列を有するオリゴ
ヌクレオチドとの間でPCR法を行い、より長い部分配列
を取得する。その取得した配列を参考としPCR法により
プローブを作製し、cDNAライブラリーから該遺伝子をス
クリーニングすることが望ましい。

【００１９】タンパク質の部分精製からアミノ酸配列決
定までについては、実施例１及び２にその具体例を記載
した。mRNAの抽出、cDNAライブラリーの作製はそれぞれ
実施例３にその具体例を示した。プローブの作製は実施
例４に、cDNAライブラリーから該遺伝子のスクリーニン
グについては実施例５に具体例を示した。また、この該
遺伝子がタバコ植物体でパラコート処理により誘導され
ることは、発現解析手法であるノーザンブロット解析法
又はRT-PCR法などにより確認することができる。その確
認については実施例６に具体例を示した。次に、得られ
たクローンから全長のcDNAをクローニングする。cDNAの
クローニングには、例えばRACE(Rapid Amplification o
f cDNA ends)法が用いられる。RACE法とは、cDNAの5'又
は3'欠失部位をPCRにより迅速に回収する方法である。
なお、RACE法は、市販のキット(Marathon^TM cDNA Ampli
fication Kit(Clonetech社))を用いて行うこともでき
る。

【００２０】(2) 塩基配列の決定 本発明においては、上記スクリーニングにおいて得られ
たcDNAの単離クローンについて、PCR産物をテンプレー
トにしてcDNAの塩基配列を決定する。塩基配列の決定は
マキサム-ギルバートの化学修飾法、又はM13ファージを
用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法に
より行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置
（例えばApplied Biosystems社製ABI373シークエンサー
等）を用いて配列決定が行われる。

【００２１】配列番号１に本発明のペルオキシダーゼ遺
伝子の塩基配列を、配列番号２に本発明のペルオキシダ
ーゼのアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列を
含むタンパク質がペルオキシダーゼ活性を有する限り、
当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しく
は数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じて
もよい。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の
１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失しても
よく、配列番号２で表わされるアミノ酸配列に１〜10
個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、
あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜10
個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置
換してもよい。

【００２２】ここで、本発明においてペルオキシダーゼ
活性とは、 donor + H₂O₂ → oxd. donor + 2H₂O の反応を触媒する活性を意味し、donorとなる電子供与
体としては、グアヤコール、ピロガロール、アスコルビ
ン酸、チトクロムC、グルタチオン、FAD、NADH、NADPH
他等が挙げられる。なお、本発明のタンパク質の上記活
性は、タンパク質を加えた反応液に上記電子供与体とH₂
O₂を添加し、その反応液の吸光度変化などを測定するこ
とでその有無を確認することができる（浅田浩二・中野
稔・柿沼カツ子編, 活性酸素測定マニュアル, 1992, 20
5-222pp,講談社サイエンティフィク, 東京）。

【００２３】また、上記遺伝子とストリンジェントな条
件下でハイブリダイズすることができるDNAも本発明の
遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、いわ
ゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイ
ブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が
高い核酸同士、すなわち60％以上、好ましくは80％以上
の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それよ
り相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が
挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜9
00mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜68℃、
好ましくは65℃での条件をいう。

【００２４】なお、遺伝子に変異を導入するには、Kunk
el法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ず
る方法を採用することができる。例えば部位特異的突然
変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant
-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用い
て、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesi
s シリーズキットを用いて変異の導入が行われる。一旦
本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化
学合成によって、又はクローニングされたcDNAを鋳型と
したPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片
をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、
本発明の遺伝子を得ることができる。さらに、部位特定
変異誘発等によってペルオキシダーゼをコードする修飾
されたDNAを合成することもできる。

【００２５】２．組換えベクター及び形質転換体の作製 (1) 組換えベクターの作製 本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の
遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で
複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラ
スミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。プラスミド
DNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR32
2, pBR325,pUC118, pUC119, pUC18, pUC19等）、枯草菌
由来のプラスミド（例えばpUB110,pTP5,等)、酵母由来
のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などが挙
げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、C
haron21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）
が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニア
ウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの
昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。

【００２６】ベクターに本発明の遺伝子を挿入するに
は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、
適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニ
ングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採
用される。本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮
されるようにベクターに組み込まれることが必要であ
る。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本
発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシ
スエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シ
グナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）
などを含有するものを連結することができる。なお、選
択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子
等が挙げられる。

【００２７】(2) 形質転換体の作製 本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目
的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによ
り得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の
遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるもので
はない。例えば、大腸菌(Escherichia coli）等のエッ
シェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtil
is)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomo
nas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリ
ロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する
細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ(Sacchar
omyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Sch
izosaccharomyces pombe)等の酵母が挙げられ、COS細
胞、CHO細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはSf9等の
昆虫細胞が挙げられる。

【００２８】大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発
明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると
同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の
遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ま
しい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれて
いてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・
コリ(Escherichia coli) DH1などが挙げられ、枯草菌と
しては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtil
is)などが挙げられるが、これらに限定されるものでは
ない。

【００２９】プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現
できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrp
プロモーター、lacプロモーター、P_Lプロモーター、P_R
プロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロ
モーターが用いられる。tacプロモーターなどのよう
に、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよ
い。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNA
を導入する方法であれば特に限定されるものではない。
例えばカルシウムイオンを用いる方法(Proc. Natl.Aca
d. Sci., USA, 69, 2110, 1972)、エレクトロポレーシ
ョン法等が挙げられる。

【００３０】酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロ
ミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾ
サッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pomb
e)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用い
られる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できる
ものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモータ
ー、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プ
ロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、P
GKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、
AOX1プロモーター等を用いることができる。酵母への組
換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法
であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーショ
ン法(Methods. Enzymol., 194, 182, 1990)、スフェロ
プラスト法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓ
ｃｉ．， ＵＳＡ， ７５， １９２９， １９７
８）、酢酸リチウム法（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，
１５３， １６３， １９８３）等が挙げられる。

【００３１】動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞CO
S-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細
胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などが用い
られる。プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プ
ロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が用
いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子
プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベ
クターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーシ
ョン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が
挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞な
どが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方
法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクシ
ョン法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。

【００３２】植物を宿主とする場合は、形質転換植物
（トランスジェニック植物）の作製は以下の通り行う。
本発明の形質転換植物は、本発明のペルオキシダーゼ遺
伝子が自己の遺伝子中に組み込まれたものである。本発
明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、
植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織
(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組
織、海綿状組織等)又は植物培養細胞のいずれをも意味
するものである。形質転換に用いられる植物としては、
例えばアカザ科、ナス科、イネ科、マメ科、バラ科、キ
ク科、ユリ科、ナデシコ科、ウリ科、ヒルガオ科、アブ
ラナ科等に属する植物が挙げられるが、これらの植物に
限定されるものではない。

【００３３】上記組換えベクターは、通常の形質転換方
法、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン
法、PEG法、エレクトロポレーション法等によって植物
中に導入することができる。 例えばアグロバクテリウ
ム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適
当なアグロバクテリウム、例えばアグロバクテリウム・
チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) LBA4
404株に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文
著,植物遺伝子操作マニュアル,1990,27-31pp,講談社サ
イエンティフィック,東京）に従ってタバコの無菌培養
葉片に感染させ、形質転換タバコを得ることができる。

【００３４】また、パーティクルガン法を用いる場合
は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用し
てもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロト
プラストを調製して使用してもよい。このように調製し
た試料を遺伝子導入装置（例えばPDS-1000(BIO-RAD社)
等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又
は試料により異なるが、通常は450〜2000psi程度の圧
力、4〜12cm程度の距離で行う。

【００３５】植物培養細胞を宿主として用いる場合は、
形質転換は、組換えベクターをパーティクルガン法、エ
レクトロポレーション法等で培養細胞に導入する。形質
転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根など
は、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いる
ことが可能であり、また従来知られている植物組織培養
法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サ
イトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、
ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させ
ることができる。

【００３６】遺伝子が植物に組み込まれたか否かの確認
は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザ
ンハイブリダイゼーション法等により行うことができ
る。例えば、形質転換植物からDNAを調製し、DNA特異的
プライマーを設計してPCRを行う。PCRは、前記プラスミ
ドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うこ
とができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲ
ル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャ
ピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Gre
en液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドと
して検出することにより、形質転換されたことを確認す
ることができる。また、予め蛍光色素等により標識した
プライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出するこ
ともできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅
産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を
確認する方法も採用することができる。

【００３７】３．本発明のタンパク質の生産 本発明のタンパク質は、本発明のペルオキシダーゼ遺伝
子によりコードされるアミノ酸配列を有するもの、又は
該アミノ酸配列において複数個のアミノ酸に前記変異が
導入されたアミノ酸配列を有し、かつペルオキシダーゼ
活性を有するものである。なお、本発明のタンパク質を
ペルオキシダーゼタンパク質ともいう。本発明のペルオ
キシダーゼタンパク質は、前記形質転換体を培養し、そ
の培養物から採取することにより得ることができる。
「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは
培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意
味するものである。

【００３８】本発明の形質転換体を培養する方法は、宿
主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大
腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換
体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素
源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を
効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合
成培地のいずれを用いてもよい。

【００３９】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピ
オン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアル
コール類が挙げられる。窒素源としては、無機酸若しく
は有機酸のアンモニウム塩（例えばアンモニア、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム等）が挙げられ、その他含窒素化合物
（例えばペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー
等）が挙げられる。

【００４０】無機物としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、
振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、37℃で
行う。なお、培地のpHの調整は、無機又は有機酸、アル
カリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピ
シリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加し
てもよい。

【００４１】プロモーターとして誘導性のプロモーター
を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する
場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加して
もよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクタ
ーで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピ
ル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロ
モーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を
培養するときにはインドール酢酸(IAA)等を培地に添加
してもよい。

【００４２】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地として、一般に使用されているRPMI1640
培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加
した培地等が用いられる。 培養は、通常、５％CO₂存
在下、37℃で１〜30日行う。培養中は必要に応じてカナ
マイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加しても
よい。

【００４３】培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は
細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕する
ことによりペルオキシダーゼタンパク質を抽出する。ま
た、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産され
る場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等
により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の
単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫
酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることによ
り、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製す
ることができる。

【００４４】宿主が植物の場合は、形質転換植物を培養
又は栽培すれば、ペルオキシダーゼタンパク質を生産す
ることができる。形質転換体が植物細胞又は植物組織で
ある場合は、培養は、通常の植物培養用培地、例えばMu
rashige & Skoog(MS)(Physiol. Plant., 15, 473-497,
1962)の培地、Linsmaier & Skoog(LS)(Physiol. Plan
t., 18, 100-127, 1965)の培地、プロトプラスト培養培
地(LS培地を改変したもの)等を用いることにより行うこ
とができる。培養方法は、通常の固体培養法でもよい
が、液体培養法を採用することが好ましい。

【００４５】上記培地に、細胞、組織又は器官を0.1〜
2.0g新鮮重/l接種し、必要によりNAA、2,4-D、BA、カイ
ネチン等を適宜添加して培養する。培養開始時の培地の
pHは5〜７に調節し、培養は通常20〜30℃、好ましくは2
5℃前後で、また、0.2〜1 vvm通気、50〜200rpm攪拌で
1〜6週間培養する。形質転換体が植物体である場合は、
圃場やガラスハウスなどで栽培又は水耕培養することが
できる。培養細胞又は培養組織から本発明のタンパク質
を採取するには、セルラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素を
用いた細胞溶解処理、超音波破砕処理、磨砕処理等によ
り細胞を破壊する。次いで、濾過又は遠心分離等を用い
て不溶物を除去し、粗タンパク質溶液、あるいは植物の
一次及び／又は二次代謝産物を含む溶液を得る。

【００４６】上記粗タンパク質溶液から本発明のタンパ
ク質をさらに精製するには、通常のタンパク質精製法を
使用することができる。例えば、硫安塩析法、イオン交
換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル
ろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、電気泳動法等を、単独又は適宜組み合わせるこ
とにより行う。植物器官又は植物体から本発明のタンパ
ク質を採取するには、超音波破砕処理、磨砕処理等を行
って上記有用物質の抽出液を調製し、その後は上記の精
製手法と同様にして行うことができる。

【００４７】

【実施例】以下、実施例により、本発明をより具体的に
説明するが、本発明の技術的範囲がこれらの実施例によ
り限定されるべきものではない。 〔実施例1〕パラコート耐性タバコカルス由来ペルオキ
シダーゼの精製 (1) パラコート耐性タバコカルスの増殖 パラコート耐性タバコカルスは、α-ナフタレン酢酸(NA
A)(10μM)、ベンジルアミノプリン(BAP) (1μM)、パラ
コート(125μM)及び0.8%寒天（又は0.25%GELLAN GUM）
を含むMurashige & Skoog（MS）（Physiol. Plant. 15,
473-497, 1962）の培地に移植し、約1000 lx照明下
（明期16時間、暗期8時間）、25℃で培養した。カルス
は、約20日毎に移植し増殖させた。増殖させたカルス
は、使用時まで-80℃で保存した。なお、パラコート
は、市販の商品名「グラモキソン」（武田薬品工業社
製）を使用した。

【００４８】(2) 活性測定 McCordとFridovichによるスーパーオキシドディスムタ
ーゼ（SOD）の活性測定法に従って、 O^2-生成系として
キサンチン-キサンチン酸化酵素系、O^2-反応系としてチ
トクロームC還元系を用いた。なお、ペルオキシダーゼ
タンパク質の精製は、上記のSOD活性測定法において特
異的に見られるチトクロームＣの再酸化パターンを指標
にして行った。

【００４９】(3) パラコート耐性タバコカルス由来のペ
ルオキシダーゼ部分精製 カルス（生重約1kg）を500mlの50mM PEM（リン酸緩衝
液, pH7.8 ; 1mM EDTA ;1mMβ-メルカプトエタノール）
と共にワーリングブレンダー（DX-11：日本精器社製）
で摩砕し、摩砕液をガーゼでろ過し、ろ液を6000rpm、1
0分、4℃で遠心分離した（J-6M：BECKMAN社製）。その
上清３に対して７の割合で-20℃アセトンを加え、氷中
に1時間静置後、これを上記と同様に遠心し、沈殿を40m
lの10mM PEMに懸濁し、5 Lの同バッファーに対して一晩
透析した。透析後これを10000rpm、10分、4℃で遠心分
離し（J2-21M/E：BECKMAN社製）、その上清を10mM PEM
で平衡化したDEAE-Sephadex（ファルマシア社製）カラ
ムに添加し、10mM PEMで溶出した。

【００５０】未吸着画分に(NH₄)₂SO₄を加えて（60g/100
mlの割合）一晩塩析し、上記と同様に遠心分離し、沈殿
を10mM PEMに懸濁し、5 LのPEMに対して一晩透析した。
これを上記と同様に遠心分離し、上清（10ml）を得た。
以上の操作は、低温条件下（4℃）で行った。ペルオキ
シダーゼの精製は、ファルマシア社製のFPLCシステムを
使用し、カラムはハイドロフォービッククロマトグラフ
ィーとして Hi Trap Phenyl Sepharose HP (5ml)及びPh
enyl Superose HR 5/5、アフィニティクロマトグラフィ
ーとして銅（0.1M CuSO₄）を保持させたHi Trap Chelat
ing (5ml) を使用した。

【００５１】上記で得られた上清は、50mMリン酸緩衝
液, pH7.0 ; 1.7M (NH₄)₂SO₄に置換し、 Hi Trap Pheny
l Sepharose HP (5ml)にかけ、50mMリン酸緩衝液, pH7.
0でリニアに溶出した後、活性画分を回収した。活性画
分を脱塩、濃縮した後、20mMリン酸緩衝液, pH8.5 ; 1M
NaClに置換した。置換した活性画分を銅（0.1M CuS
O₄）を保持させたHi Trap Chelating (5ml)にかけ、20m
Mリン酸緩衝液, pH8.5 ; 1M NH₄Clでリニアに溶出した
後、未吸着画分である活性画分を回収した。次に再び活
性画分を50mMリン酸緩衝液, pH7.0; 1.7M (NH₄)₂SO₄に
置換し、Phenyl Superose HR 5/5にかけ50mMリン酸緩衝
液,pH7.0でステップワイズに溶出した後、活性画分を回
収した。回収した活性画分は、濃縮後SDS-PAGE（一般的
なLaemmliの系、ゲル濃度：12%）を行ったが完全には精
製されていなかったため、その活性画分を部分精製物と
した。またタンパク質の定量は、Bradford法（PROTEIN
ASSAYキット：BIO-RAD社製）を用いた。

【００５２】〔実施例2〕部分精製物のアミノ酸配列の
決定 (1) 酵素消化のためのサンプル調製 トリクロロ酢酸（TCA）沈殿 実施例１で得られた部分精製物（約50μg ）を、約50μ
g/100μlになるように脱塩濃縮後、終濃度10% TCA水溶
液になるように調製し、氷上で30分間静置した。その
後、マイクロ遠心機（TOMY社製）で遠心し、上清を除き
沈殿を100μlの冷アセトンで２回洗浄後風乾した。

【００５３】カルボキシアミドメチル化 上記乾燥タンパク質に8M尿素-0.4M重炭酸アンモニウム
溶液50μlを加え、pHを確認後（pH：7.5〜8.5）、45mM
ジチオスレイトール5μlを加え、50℃で15分間インキュ
ベートした。インキュベート後室温に戻し、100mMヨー
ドアセトアミド5μlを加え、さらに室温で15分間インキ
ュベートし、水を140μl加えた。

【００５４】(2) トリプシン及びリシルエンドペプチダ
ーゼによるペプチドへの分解 トリプシン処理 トリプシン（Sequencing Grade Modified Trypshin: Pr
omega社製）20μg（9300units/mg protein）を20μlの
0.1N HClに溶かし、その1μl（9.3units）を（1）で準
備したサンプルに加え、37℃で24時間インキュベートし
た。インキュベート後、サンプルは使用時まで凍結保存
した。 リシルエンドペプチダーゼ処理 リシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製）0.71g
（2.8AU/mg）を1mlのトリス-塩酸緩衝液（pH9.0）に溶
かし、その5μl（0.01AU）を（1）で準備したサンプル
に加え、37℃で24時間インキュベートした。インキュベ
ート後、サンプルは使用時まで凍結保存した。

【００５５】(3) HPLCによるペプチドの遠心分離 Waters HPLCシステム（Waters 600E,484,741: Waters社
製）に逆相カラムHighPore RP-304（4.6mm i.d. x 250m
m: BIO-RAD社製）を装着し、トリプシン及びリシルエン
ドペプチダーゼ処理により分解したサンプル各々50μｌ
をアプライし、ペプチドを分離した。分離条件を以下に
示した。

【００５６】 緩衝液A=0.06% トリフルオロ酢酸（TFA）, 水 緩衝液B=0.052% TFA, 80%アセトニトリル UV検出=210nm 勾配：0-60分0-40%B 60-90分40-75%B 90-105分75-100%B流速：0.5ml/min

【００５７】(4) ペプチドのアミノ酸配列の決定 遠心分離した各ペプチドは、自動気相プロテインシーケ
ンサー（model473A :Applied Biosystems社製）によ
り、アミノ酸配列が決定された（配列番号３〜10）。こ
のアミノ酸配列を、タンパク質アミノ酸データベースで
検索したところ、ピーナッツのペルオキシダーゼPNC2
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87, 8874-8878, 1990）と高
い相同性を示した。

【００５８】〔実施例3〕パラコート耐性カルス cDNAラ
イブラリーの作製 (1) パラコート耐性カルスからのmRNAの抽出及び精製 パラコート耐性タバコカルスからのRNAの調製 RNAの調製は、クローニングとシークエンス・植物バイオ
テクノロジー実験マニュアル（農村文化社, 1989）記載
の「酢酸ナトリウム沈殿および塩化セシウム溶液による
超遠心分離を組み合わせたフェノール-SDS法」に従っ
た。パラコート耐性カルス（約20g）を液体窒素で凍結
し、乳鉢乳棒を用いて粉末状にした。作業中カルスが融
解しない様に、適宜乳鉢に液体窒素を加えた。抽出バッ
ファー（40ml）、フェノール/クロロホルム（80ml）混
液中に、粉末化したカルスを入れ、ポリトロンで破砕抽
出した。

【００５９】破砕抽出液を遠沈管（50ml：コーニング社
製）に分注し、3000rpm・30分・室温で遠心分離を行っ
た（GP：BECKMAN社製）。水層（上部）を遠沈管に回収
し、フェノール/クロロホルム（20ml）を加えて約10分
間振とうした。振とう後、上記と同様に遠心分離（15
分）を行い水層を回収した。水層とフェノール/クロロ
ホルム層との間に白い沈殿物がなくなるまで、さらに２
回、同操作を行った。回収した水層にさらにクロロホル
ム（20ml）を加え混和後、上記と同様に遠心分離し水層
を回収した。回収した水層に1/10容3M酢酸ナトリウムを
加え、-80℃に10分以上静置し多糖類を析出させた。静
置後6000rpm・15分・4℃で遠心分離し（J2-21M/E：BECK
MAN社製）、上清を回収した。多糖類を除くため再度遠
心分離を行った。回収した水層に2.5容エタノールを加
え、-80℃に30分以上放置した。

【００６０】放置後、液温が15℃以上になるまで室温に
放置し溶解した。溶解後6000rpm・15分・4℃で遠心分離
し沈殿を回収した。沈殿に20mlの70%エタノールを加
え、沈殿をリンス後6000rpm・5分・4℃で遠心分離し
た。回収した沈殿を減圧乾燥（約3分間）した。減圧乾
燥させた沈殿をTE/HPRI（8ml）に溶解した。溶解物を60
00rpm・5分・4℃で遠心分離し、ゴミを取り除き上清を
回収した。回収した上清に10M塩化リチウム（2ml）を加
え、-80℃に1時間以上放置しRNAを析出させた。析出が
悪い場合には再度エタノール沈殿を行い、リチウム沈殿
のスケールを1/4にして上記操作を再度行った。回収し
た沈殿（RNA）をTE/HPRI（3ml）に溶解した。溶解物を6
000rpm・5分・4℃で遠心分離し、ゴミを取り除き上清を
回収した（RNA溶液）。RNA溶液の一部を電気泳動し（1
％アガロース、TBE(89mM Tris-borate, pH8.3; 2mM EDT
A)バッファー）、RNAが分解されていないことを確認し
た。また分光光度計（DU-70：BECKMAN社製）で濃度及び
純度を検定した。

【００６１】次にRNAの純度を上げるために以下の様に
超遠心を行った。超遠心チューブ（13.5ml : BECKMAN社
製）に塩化セシウム液（3.6ml）を入れ、RNA溶液を上層
した。RNA溶液上層後、チューブをTE/HPRIで満たしシー
ルした。チューブをシール後、アングルローター（90TI
: BECKMAN社製）を用いて48000rpm・16時間・16℃で超
遠心を行った（XL-90 : BECKMAN社製）。チューブに
は、遠心方向がわかるようにマークしておいた。

【００６２】超遠心後、塩化セシウム液をシリンジで半
分ほど抜き取った。チューブをメスで半分に切断し、残
りの塩化セシウム液を壁面の不沈物に注意しながら取り
除いた。壁面の不沈物は、オートクレーブしたキムワイ
プで拭い取った。滅菌水（4℃）でRNAペレットを手早く
洗った（2回）。RNAペレットは、TE/HPRI（0.8ml）に溶
解した。RNA溶液の一部を電気泳動し、RNAが分解されて
いないことを確認した。また分光光度計で濃度及び純度
を検定した。すぐに使用した以外は、エタノール沈殿状
態（-80℃）で保存した。最終的に、約1.7mgのRNAが得
られた。

【００６３】 抽出バッファー： 200mM Tris-HCl,pH9.0 ; 100mM NaCl ;.10mM EDTA ; 0.5%SDS ; 14mM β-メルカトルエタノール TE/HPRI： 10mM Tris-HCl,pH7.5 ;.1mM EDTA ; 5units/ml RNase阻害剤 ; 1mM DTT 塩化セシウム液： 5.7M塩化セシウムを含むTE/HPRI

【００６４】オリゴ(dT)セルロースカラムを用いたポ
リ(A)+RNAの調製 ポリ(A)⁺RNAの調製は、 mRNA Purification Kit（Pharm
acia Biotech社製）を使用した。RNA(約850μg)をエタ
ノール沈殿後、溶出バッファー(Elution buffer)（1m
l）に溶解し、65℃で5分間処理後氷上に置き、サンプル
バッファー(Sample buffer)(0.2ml)を加え穏やかに混ぜ
た。

【００６５】カラムにRNAサンプルをアプライし、ゲル
にしみこませた。カラムを遠沈管にセットした状態で、
350×gで２分間遠心した（GP：BECKMAN社製）。遠心
後、高塩バッファー（High-salt buffer）（0.25ml）を
加え上記と同様に遠心した。この操作を再度行った。低
塩バッファー（Low-salt buffer）（0.25ml）を加え、
上記と同様に遠心した。この操作を３回行った。新しい
遠沈管をセットし、溶出バッファー（0.25ml）を加え上
記と同様に遠心した。この操作を４回行い溶出液を回収
した。なお、溶出バッファーは、前もって65℃で暖めて
おいた。溶出液はエタノール沈殿を行い、滅菌水に溶解
した。一部は電気泳動し、濃度はエチジウムブロマイド
を用いたスポットテストで決定した。精製後、約10μg
のポリ(A)⁺RNAを回収した。

【００６６】 High-salt buffer: 10mM Tris-HCl (pH7.4),1mM EDTA,0.5M NaCl Sample buffer: 10mM Tris-HCl (pH7.4),1mM EDTA,3.0M NaCl Low-salt buffer: 10mM Tris-HCl (pH7.4),1mM EDTA,0.1M NaClElution buffer: 10mM Tris-HCl (pH7.4),1m M EDTA

【００６７】(2) ポリ(A)⁺RNAからのcDNAの合成 cDNAの合成には、ZAP-cDNA SYNTHESIS KIT（STRATAGENE
社製）を使用した。上記(1)で調製したポリ(A)⁺RNA（5
μg）より、ファーストストランド合成、セカンドスト
ランド合成、合成した cDNAの平滑末端化、 EcoRIアダ
プターとのライゲーション、 EcoR I末端のリン酸化、
制限酵素（Xho I ）処理及びcDNA SpunColumn（Pharmac
ia社製）を用いてcDNAの精製を行った。精製後フェノー
ル/クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、沈殿を
6.0μlの滅菌水に溶解した。この内の一部を電気泳動
し、濃度はEtBrを用いたスポットテストで決定した。残
りは、-20℃で保存した。最終的にcDNAは、濃度が約50n
g/μl（全量約300ng）であった。

【００６８】(3) cDNAライブラリーの作製 cDNAライブラリーの作製には、ZAP-cDNA SYNTHESIS KIT
（STRATAGEN社製）、Gigapack II Gold Packaging Extr
act（STRATAGENE社製）を使用した。 cDNAとベクターとのライゲーション (2)で得られたcDNA（100ng）に1μgのUni-ZAP XRベクタ
ーの割合でライゲーションを行った。

【００６９】 In vitro パッケージング 上記で得られたライゲーション溶液（5μl）の内、1μl
をGigapack II Gold Packaging Extractに使用した。溶
かした直後のFreeze/Thaw 抽出物にライゲーション溶液
1μlを加え、氷上で溶解した。すぐに15μlのSonic 抽
出物を加え、ピペティングしてよく混合した。軽く遠心
後、室温に2時間放置した。500μlのファージ希釈バッ
ファー（SMバッファー）を加え、さらに20μlのクロロ
ホルムを加え混合した。保存は4℃で行った。

【００７０】ファージのプレーティング 菌（XL1-Blue及びSURE）は、LB/テトラサイクリン(12.5
μg/ml) 寒天培地で37℃一晩培養し、シングルコロニー
を、0.2%マルトースと 10mM MgSO₄ を加えたLB培地で30
℃振とう培養した。菌体は、1000×g、10分遠心分離し
て回収し（J-6M： BECKMAN社製）、10mM MgSO₄に懸濁し
た（使用時は、O.D.666=1.0まで希釈した）。

【００７１】In vitroパッケージングで得られたパッケ
ージング溶液をファージ希釈バッファーで10倍に希釈
し、希釈液（1μl）と宿主菌（200μl）とを、37℃で15
分培養した。3mlのTop Agar（48℃）に上記菌を加え、
直ちに37℃に温めておいたNZY Agar Plateへプレーティ
ングした。37℃で一晩培養した後、培養後プラークの数
より、ファージのプラーク形成能を求めた。またTop Ag
arに15μlの0.5M IPTG (in H₂O)と50μlの250mg/ml X-g
al (in DMF)を加えて、上記操作を行い、ライブラリー
の組換え頻度を求めた（カラーセレクション）。本実施
例では、プラーク形成能の判定にはSUREを、カラーセレ
クションにはXL1-Blueを使用した。ファージのタイトレ
ーションの結果、1.6×10⁶pfu/mlのcDNAライブラリーが
作製できた。またカラーセレクションによる組換え頻度
は約99％であった。

【００７２】〔実施例4〕プローブの作製 (1) 3'端を含む部分断片の取得 3'-RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法（Pro
c. Natl. Acad. Sci.USA 85, 8998, 1988）により、該
遺伝子の3'端を含む部分断片を取得した。すなわち、パ
ラコート耐性カルスより取得したポリ(A)⁺RNA（1μg）
と5'末端にアダプター配列の付いたdT11-アダプタープ
ライマー（RD29 primer: NEB社製）をプライマーにして
逆転写酵素SuperScript II（GIBCO BRL社製）で逆転写
反応を行い、ファーストストランドcDNAを合成した。さ
らに実施例2で得られたアミノ酸配列（配列番号８及び
９）をもとに、縮重プライマー（配列番号11）を作製
し、これをセンスプライマーとし、合成したファースト
ストランドcDNA内部のアダプター配列との間でPCR反応
を行った。

【００７３】PCR反応はTaKaRa Ex Taq（宝酒造社製）を
用い、プライマー濃度は各々0.5μM、PCR反応の温度条
件は、94℃（2分）/37℃（0.5分）/72℃（3分）を３サ
イクル、94℃（0.5分）/50℃（0.5分）/72℃（1分）を3
5サイクル、94℃（0.5分）/50℃（0.5分）/72℃（15
分）を１サイクルで行った。PCR反応物は低融点アガロ
ースゲルで電気泳動後、増幅されたバンドをゲルより切
り出し精製した。精製したPCR増幅物は、Original TA C
loning Kit（Invitrogen社製）を用いて、pCRII（Invit
rogen社製）ベクターにクローニングした。pCRIIベクタ
ーにクローニングされた各々のクローンは大腸菌に形質
転換後、常法によりプラスミドを回収し、制限酵素（Ec
oRII、HindIII）処理を行い、インサート断片の大きさ
と向きでスクリーニングを行った。

【００７４】その結果、約400bpのcDNA断片が得られ
た。この断片を持つクローンをABI PRISM Dye Terminat
er Cycle Sequencing Kit（パーキンエルマー社製）で
シーケンス反応を行い、ジェネティックアナライザー A
BI PRISM 310（パーキンエルマー社製）によって塩基配
列の決定を行った。その結果、縮重プライマーの配列を
含む3'端側の334bpのDNA断片（配列番号12）が得られ、
ピーナッツのペルオキシダーゼ（PNC2）のアミノ酸配列
とは約75%の相同性がみられた。

【００７５】(2) 5'端を含む部分断片の取得 (1)より、3'端を含む部分断片が取得できたが、より長
い断片を取得しプローブの作製に参考とするため、5'端
を含む部分断片の取得を行った。(1)より得られた3'端
を含む部分断片の内、終始コドンより3'端側の配列であ
るプライマー（配列番号13）とλZAP II Insert Screen
ing Amplimer Set（CLONTECH社製）に含まれる5'プライ
マーとの間で、実施例３の(2)で得られたcDNAをUni-ZAP
XRベクターに連結したライゲーション溶液をテンプレ
ートとし、PCR反応を行った。PCR反応はTaKaRa Taq（宝
酒造社製）を用い、プライマー濃度は各々0.4μM 、PCR
反応の温度条件は、94℃（0.5分）/50℃（0.5分）/72℃
（1分）を35サイクル、72℃（7分）を１サイクルで行っ
た。

【００７６】PCR反応物はアガロースゲルで電気泳動
後、増幅されたバンドをゲルより切り出し、GENECLEAN
II Kit（BIO 101社製）を用いて精製した。精製したPCR
増幅物は、Original TA Cloning Kit（Invitrogen社
製）を用いて、pCRII（Invitrogen社製）ベクターにク
ローニングした。 pCRIIベクターにクローニングされた
各々のクローンは大腸菌に形質転換後、常法によりプラ
スミドを回収し、制限酵素（EcoRII）処理を行い、イン
サート断片の大きさでスクリーニングを行った。

【００７７】その結果、約1kbpのcDNA断片が得られた。
この断片を持つクローンをプライマーウォーキング法に
より、ABI PRISM Dye Terminater Cycle Sequencing Ki
t（パーキンエルマー社製）でシーケンス反応を行い、D
NAシーケンサー ABI 373A（パーキンエルマー社製）に
よって塩基配列の決定を行った。その結果、3'端側の配
列(配列番号13)を含む5'端1090bpのcDNA断片（配列番号
14）が得られた。このcDNA断片をPER4、PER4を含むpCRI
IベクターをpPER4とした。

【００７８】(3) cDNAライブラリーのスクリーニングに
用いるプローブの作製 プローブの合成には、PCR DIGプローブ合成キット（ベ
ーリンガーマンハイム社製）を用いた。すなわち、上記
(2)で取得したPER4をもとに、配列番号15と配列番号16
のプライマーを準備し、 pPER4をテンプレートにしてPC
R反応を行い、DIG-11-dUTPにより標識することにより作
製した。

【００７９】〔実施例5〕全長をコードするcDNAのクロ
ーニング (1) cDNAライブラリーのスクリーニング 菌（XL1-Blue MRF'）は、LB/テトラサイクリン(12.5μg
/ml) 寒天培地で37℃一晩培養し、シングルコロニー
を、0.2%マルトースと10mM MgSO₄ を加えたLB培地で30
℃、約７時間振とう培養した。菌体は、1000×g、10分
遠心分離して回収し（J-6M：BECKMAN）、10mM MgSO₄に
懸濁した（使用時は、O.D.600=0.5まで希釈した）。

【００８０】実施例３でパラコート耐性タバコカルスよ
り作製したcDNAライブラリー（λZAPII）の3μl（約5,0
00pfu）と上記10mM MgSO₄に懸濁した宿主菌（O.D.600=
0.5）200μlとを、37℃で15分培養した。3mlのTop Agar
（48℃）に上記菌を加え、直ちに、37℃に温めておいた
NZY Agar Plateへプレーティングした。プレートは、37
℃で約12時間培養し、プラークを形成させた。プラーク
が形成されたプレートは４℃で約２時間冷蔵した後、ニ
トロセルロース膜（BA83：Schleicher & Schuell社製）
を約２分間密着させ、注射針で穴をあけマーキングを行
った。その後、注意深くニトロセルロース膜をプレート
よりはがし、ファージDNAを写し取った。このニトロセ
ルロース膜をアルカリ変性液（1.5 M NaCl, 0.5M NaO
H）に１分間浸し、続いて中和液（1.5 M NaCl, 0.5M Tr
is-HCl pH7.5）に１分間浸し、濾紙上で風乾した。ニト
ロセルロース膜を風乾後、減圧しながら80℃で２時間ベ
ーキングすることによりDNAを固定した。

【００８１】以下、cDNAライブラリーのスクリーニング
は、DIG核酸検出キット（ベーリンガーマンハイム社
製）及び実施例４で作製したDIG-11-dUTP標識プローブ
を用いた。ファージDNAを固定した上記ニトロセルロー
ス膜を、ハイブリダイゼーション溶液〔5x SSC（15mMク
エン酸ナトリウム, 150mM NaCl ; pH7.0）, 1%ブロッキ
ング試薬(脱脂粉乳画分), 0.1% N-laurorysarcosine so
dium salt, 0.02% SDS 〕で68℃、１時間、振盪しなが
らプレハイブリダイゼーションを行った。次にハイブリ
ダイゼーション液を交換し、熱変性したDIG-11-dUTP標
識プローブを添加し、68℃、12時間、振盪しながらハイ
ブリダイゼーションを行った。

【００８２】ハイブリダイゼーション後、2x SSC ; 0.1
%SDSで室温、５分間、２回洗浄し、さらに0.1x SSC ;
0.1%SDSで68℃、15分間、２回洗浄した。シグナルの検
出は、DIG核酸検出キット（発色）を用いておこなっ
た。その結果、2.4万個のプラークをスクリーングし、
２次スクリーングの結果９個の陽性ファージクローンを
取得できた。また、λZAP II Insert Screening Amplim
er Set（CLONTECH社製）を用いてインサートDNAの確認
を行ったところ、８個のファージクローンに目的の大き
さのインサートDNAが確認された。

【００８３】(2) 陽性ファージクローン（λZAPII phag
e）からファージミド（pBluescript）への変換 pBluescriptへの変換は、ZAP-cDNA SYNTHESIS KIT（STR
ATAGENE社製）のThe ExAssist-SOLR システムを使用し
た。XL1-Blue MRF'（O.D.600=1.0）250μl、λZAPII フ
ァージ 100μl（1×10⁵以上のファージ粒子を含む）、E
xAssistヘルパーファージ 1μl（1×10⁶ pfu/ml以上）
を混合し、37℃で15分間培養した。培養物に2×YT（3m
l）を加え、37℃で約4時間ほど振とう培養した。

【００８４】70℃で20分間熱処理し、4000×g、15分遠
心分離した（J2-21M/E： BECKMAN社製）。遠心分離後上
清を回収し、回収したファージは、4℃で保存した。回
収したファージ100μlと200μlのSOLR（O.D.600=1.0）
を混合し、37℃で15分間培養した。培養した菌の内、20
0μl（100倍希釈）をLB/アンピシリンプレート(50μg/m
l)にプレーティングし、37℃で一晩培養した。プレート
上に現われたコロニーを回収した。１の陽性ファージク
ローン（８個）より５個のpBluescriptが回収できた。

【００８５】(3) インサートDNAの確認と塩基配列の決
定 pBluescriptのマルチクローニングサイトの制限酵素（X
hoIとEcoRI又はKpnIとSacI）を用いてインサートcDNAを
切り出し、電気泳動によりインサートcDNAの長さを確認
した。塩基配列の決定は、実施例４に示した方法で行っ
た。その結果、2種類のクローンが得られ、１つはPER4
と全く同じ塩基配列を含んでおり、このcDNA断片をNTPX
C2（配列番号17）、NTPXC2を含むpBluescriptベクター
をpNTPXC2とした。また、もう１つのcDNA断片をNTPXC1
（配列番号２）、NTPXC1を含むpBluescriptベクターをp
NTPXC1とした。

【００８６】２種類のクローンをピーナッツ他植物のペ
ルオキシダーゼと相同性を比較したところ、やはりピー
ナッツのペルオキシダーゼ（PNC2）のアミノ酸配列との
相同性が高く、またペルオキシダーゼの活性中心部分に
存在する２種類のヒスチジンも保存され、その近傍のア
ミノ酸の相同性も高いことより、２種類のクローンは、
Cationicタイプのペルオキシダーゼと判明した。またNT
PXC1は、新規な配列であることが判明した。

【００８７】〔実施例６〕パラコートによる発現誘導の
確認 取得したパラコート耐性タバコカルス由来のペルオキシ
ダーゼ遺伝子が、植物体でパラコートにより誘導される
かどうかを、RT-PCR法によって確認した。パラコート耐
性タバコカルスより再生したパラコート耐性タバコ（蛋
白質核酸酵素, 33, 3184-3186, 1988）と親株であるサ
ムソン（Nicotiana tabacum L. cv. Samsun）の種子を
バーミキュライト入りのトレーに播種し、コイトトロン
（小糸工業社製）で生育させ（16時間日長）、播種後2
ヶ月後の植物体（大きさ：15cm〜20cm）にパラコート
（625μM）を噴霧した。パラコート噴霧後、植物体をコ
イトトロン内に戻し、500μmol m^-2sec^-1の光を照射し
た。パラコート処理後、１、３、６、９、12、24時間後
に、各々のタバコ（12時間後はパラコート耐性タバコの
み）各３個体の１〜３葉（上葉より大きさが1cm以上の
葉）を採取し、直ちに液体窒素で凍結した（保存する場
合は、-80℃で保存した）。凍結した葉は、液体窒素
下、乳鉢で細かくすりつぶし、RNeasy Plant Mini Kit
（キアゲン社製）を用いて全RNAを抽出した。今回抽出
した全RNAと実施例３で示したパラコート耐性カルスよ
り抽出した全RNA（超遠心は行わず）をDNaseI（アマシ
ャムファルマシアバイオテク社製）で処理し、混入した
ゲノムDNAを取り除き、再度RNeasy Plant Mini Kitを用
いて全RNAを精製した。精製した各全RNA（0.4μg）は、
GeneAmp RNA PCR Kit（パーキンエルマー社製）を用い
て、NTPXC1の内部配列である配列番号18と配列番号19の
プライマー間でRT-PCR反応を行った。RT-PCR反応後、反
応液の一部を電気泳動した[0.8％アガロース、TAE(40mM
Tris-acetate, pH7.6; 1mM EDTA)バッファー]。DNAマ
ーカーには、Perfect DNA Markers (Novagen社製)を用
いた。その結果、パラコート処理により、今回取得した
ペルオキシダーゼ遺伝子：NTPXC1が誘導されることが確
認された（図１）。

【００８８】〔実施例７〕植物用発現ベクターの構築と
形質転換植物の作出 制限酵素BamHIサイトを付加した配列番号20及び21と制
限酵素SacIサイトを付加した配列番号22のプライマーを
準備し、実施例５で取得したpNTPXC1をテンプレートに
各々PCR反応を行った。PCR反応はTaKaRa Ex Taq（宝酒
造社製）を用い、プライマー濃度は各々0.4μM 、PCR反
応の温度条件は、95℃（7分）を１サイクル、95℃（45
秒）/60℃（1分/）72℃（2分）を30サイクルで行った。
PCR反応物は、フェノール/クロロホルム処理、エタノー
ル沈殿後、制限酵素BamHI及びSacI処理を行った。制限
酵素処理後アガロースゲルで電気泳動し、目的のバンド
をゲルより切り出し精製し（QIAquick Gel Extaraction
Kit：キアゲン社製）、インサート遺伝子としてNTPXC1
を準備した。

【００８９】一方、pBIN19由来のβ-グルクロニダーゼ
（GUS）発現バイナリーベクターpBI121（CLONTECH社
製）を、同様に制限酵素BamHI及びSacIで処理し、制限
酵素処理後アガロースゲルで電気泳動し、目的のバンド
をゲルより切り出し精製しGUS遺伝子を取り除いた断片
を回収した。両断片をTakara DNA Ligation Kit（宝酒
造社製）を用いてライゲーションし、ついで大腸菌（HB
101：宝酒造社製）を形質転換、組換えプラスミドを選
抜し、植物用発現ベクターを得た。さらに、トリペアレ
ンタルメイティング法（GusGene Fusion System：CLONT
ECH社製）により、構築した植物用発現ベクターをアグ
ロバクテリウム・チュメファシエンス(Agrobacterium t
umefaciens) LBA4404株に導入した。Agrobacterium tum
efaciens LBA4404株をリーフディスク法（内宮博文著,
植物遺伝子操作マニュアル,1990,27-31pp,講談社サイエ
ンティフィック,東京）により、タバコ（Nicotiana tab
acum L. cv. Petit Havana SR1）無菌培養葉片に感染さ
せ、形質転換タバコを得た。

【００９０】

【発明の効果】本発明により、活性酸素を発生させ殺草
効果を示す除草剤であるパラコートに対し耐性を示すカ
ルス由来のタンパク質をコードし、また植物体において
もパラコート処理により誘導されるペルオキシダーゼ遺
伝子が提供される。該遺伝子は、様々な環境ストレス
（高低温、乾燥、強光、塩、大気汚染ガス、病原菌等）
条件下で発生する活性酸素に対して耐性の高い植物の開
発に有用である。

【００９１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOYOTA JIDOSHA KABUSHIKI KAISHA <120> Peroxidase <130> P99-0537 <140> <141> <160> 22 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1191 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <220> <221> CDS <222> (49)..(1038) <400> 1 atttacttac tcaaatctca gaattcgttt atactgttaa cacgtacc atg gag tac 57 Met Glu Tyr 1 tat cac cat tca att aac aaa atg gcc atg ttt atg gtt att cta gtg 105 Tyr His His Ser Ile Asn Lys Met Ala Met Phe Met Val Ile Leu Val 5 10 15 cta gcc ata gat gtg act atg gtt tta ggc caa ggt acc cgt gtt gga 153 Leu Ala Ile Asp Val Thr Met Val Leu Gly Gln Gly Thr Arg Val Gly 20 25 30 35 ttt tat tcc agt acg tgc cca agg gcc gaa tcc ata gtt caa tca acg 201 Phe Tyr Ser Ser Thr Cys Pro Arg Ala Glu Ser Ile Val Gln Ser Thr 40 45 50 gtg agg gct cat ttt cag tct gat cca acg gtg gca cca gga atc ctg 249 Val Arg Ala His Phe Gln Ser Asp Pro Thr Val Ala Pro Gly Ile Leu 55 60 65 aga atg cac ttc cat gat tgt ttt gta cta ggt tgt gat ggt tcc atc 297 Arg Met His Phe His Asp Cys Phe Val Leu Gly Cys Asp Gly Ser Ile 70 75 80 ctc att gaa ggt tca gac gct gag aga act gct atc cca aat aga aat 345 Leu Ile Glu Gly Ser Asp Ala Glu Arg Thr Ala Ile Pro Asn Arg Asn 85 90 95 ttg aga gga ttc gac gtt att gag gat gct aag aag caa att gaa gct 393 Leu Arg Gly Phe Asp Val Ile Glu Asp Ala Lys Lys Gln Ile Glu Ala 100 105 110 115 atc tgt cct gga gtt gtt tcc tgc gct gac att ctt gct ctt gct gct 441 Ile Cys Pro Gly Val Val Ser Cys Ala Asp Ile Leu Ala Leu Ala Ala 120 125 130 cgt gat tct gtt gtc gcg act agg gga ctg aca tgg tct gtg ccc acg 489 Arg Asp Ser Val Val Ala Thr Arg Gly Leu Thr Trp Ser Val Pro Thr 135 140 145 gga cgt aga gat ggg cga gtt tct aga gca gct gat gcg ggt aat ctg 537 Gly Arg Arg Asp Gly Arg Val Ser Arg Ala Ala Asp Ala Gly Asn Leu 150 155 160 cca gct ttt ttt gat tcc gtg gat gtt caa aag caa aag ttt act gca 585 Pro Ala Phe Phe Asp Ser Val Asp Val Gln Lys Gln Lys Phe Thr Ala 165 170 175 aag ggt ctc aac act caa gat ctt gtc gct ctt act ggt gcg cac act 633 Lys Gly Leu Asn Thr Gln Asp Leu Val Ala Leu Thr Gly Ala His Thr 180 185 190 195 att gga acc gca ggt tgc gca gtc atc aga ggc agg cta ttc aat ttc 681 Ile Gly Thr Ala Gly Cys Ala Val Ile Arg Gly Arg Leu Phe Asn Phe 200 205 210 aac tcc act ggc ggc cct gac cct tca ata gat gca acc ttt ctt cct 729 Asn Ser Thr Gly Gly Pro Asp Pro Ser Ile Asp Ala Thr Phe Leu Pro 215 220 225 cag ctt caa gca tta tgt cca caa aat ggg gac gcc gca agg cgt gtg 777 Gln Leu Gln Ala Leu Cys Pro Gln Asn Gly Asp Ala Ala Arg Arg Val 230 235 240 gca cta gac act gga agc gca aac aat ttc gac acc tcg tat ttc tcc 825 Ala Leu Asp Thr Gly Ser Ala Asn Asn Phe Asp Thr Ser Tyr Phe Ser 245 250 255 aac ctc agg aat ggt cgt gga gtt ctg gaa tca gac cag aag ctg tgg 873 Asn Leu Arg Asn Gly Arg Gly Val Leu Glu Ser Asp Gln Lys Leu Trp 260 265 270 275 acc gat gct tct aca aag gtg ttt gtc caa agg ttc ttg ggt att agg 921 Thr Asp Ala Ser Thr Lys Val Phe Val Gln Arg Phe Leu Gly Ile Arg 280 285 290 gga ttg ctt ggg ttg aca ttc ggc gtc gag ttt ggc agg tcc atg gtt 969 Gly Leu Leu Gly Leu Thr Phe Gly Val Glu Phe Gly Arg Ser Met Val 295 300 305 aaa atg agc aat att gag gtt aag act ggc act aat ggt gaa att cgt 1017 Lys Met Ser Asn Ile Glu Val Lys Thr Gly Thr Asn Gly Glu Ile Arg 310 315 320 aaa gtt tgc tct gcc atc aac taatgcagat attgtaccct tttatgaact 1068 Lys Val Cys Ser Ala Ile Asn 325 330 tgctactctt gtacttggtt tatttcagtc agcgcaagct ggaaaatcca attgtgtggt 1128 aaccaatatc aataaataaa agtatttacc gagtgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1188 aaa 1191 <210> 2 <211> 330 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 2 Met Glu Tyr Tyr His His Ser Ile Asn Lys Met Ala Met Phe Met Val 1 5 10 15 Ile Leu Val Leu Ala Ile Asp Val Thr Met Val Leu Gly Gln Gly Thr 20 25 30 Arg Val Gly Phe Tyr Ser Ser Thr Cys Pro Arg Ala Glu Ser Ile Val 35 40 45 Gln Ser Thr Val Arg Ala His Phe Gln Ser Asp Pro Thr Val Ala Pro 50 55 60 Gly Ile Leu Arg Met His Phe His Asp Cys Phe Val Leu Gly Cys Asp 65 70 75 80 Gly Ser Ile Leu Ile Glu Gly Ser Asp Ala Glu Arg Thr Ala Ile Pro 85 90 95 Asn Arg Asn Leu Arg Gly Phe Asp Val Ile Glu Asp Ala Lys Lys Gln 100 105 110 Ile Glu Ala Ile Cys Pro Gly Val Val Ser Cys Ala Asp Ile Leu Ala 115 120 125 Leu Ala Ala Arg Asp Ser Val Val Ala Thr Arg Gly Leu Thr Trp Ser 130 135 140 Val Pro Thr Gly Arg Arg Asp Gly Arg Val Ser Arg Ala Ala Asp Ala 145 150 155 160 Gly Asn Leu Pro Ala Phe Phe Asp Ser Val Asp Val Gln Lys Gln Lys 165 170 175 Phe Thr Ala Lys Gly Leu Asn Thr Gln Asp Leu Val Ala Leu Thr Gly 180 185 190 Ala His Thr Ile Gly Thr Ala Gly Cys Ala Val Ile Arg Gly Arg Leu 195 200 205 Phe Asn Phe Asn Ser Thr Gly Gly Pro Asp Pro Ser Ile Asp Ala Thr 210 215 220 Phe Leu Pro Gln Leu Gln Ala Leu Cys Pro Gln Asn Gly Asp Ala Ala 225 230 235 240 Arg Arg Val Ala Leu Asp Thr Gly Ser Ala Asn Asn Phe Asp Thr Ser 245 250 255 Tyr Phe Ser Asn Leu Arg Asn Gly Arg Gly Val Leu Glu Ser Asp Gln 260 265 270 Lys Leu Trp Thr Asp Ala Ser Thr Lys Val Phe Val Gln Arg Phe Leu 275 280 285 Gly Ile Arg Gly Leu Leu Gly Leu Thr Phe Gly Val Glu Phe Gly Arg 290 295 300 Ser Met Val Lys Met Ser Asn Ile Glu Val Lys Thr Gly Thr Asn Gly 305 310 315 320 Glu Ile Arg Lys Val Cys Ser Ala Ile Asn 325 330 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 3 Ala Glu Ser Ile Val Gln Ser Thr Val Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 4 Ala His Phe Gln Ser Asp Pro Thr Val Ala Pro Gly Ile Leu Arg 1 5 10 15 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 5 Gly Phe Asp Val Ile Glu Asp Ala Lys Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 6 Gly Leu Thr Trp Ser Val Pro Thr Gly Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 7 Gly Leu Asn Thr Gln Asp Leu Val Ala Leu Thr Gly Ala His Thr Ile 1 5 10 15 Gly Thr Ala Gly 20 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 8 Gly Val Leu Glu Ser Asp Gln Lys 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 9 Leu Trp Thr Asp Ala Ser Thr Lys 1 5 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 10 Val Phe Val Gln Arg Phe Leu Gly Ile Arg Gly Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 11 gaycaraart trtggac 17 <210> 12 <211> 334 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 12 gaccagaagt tgtggaccga tgcttctaca caggtgtttg tccaaaggtt tttaggtatt 60 aggggattac ttggattgac attcggcgtg gagtttggca ggtccatggt taaaatgagc 120 aatattgaag ttaagactgg cactaatggt gaggttcgta aagtttgctc tgctatcaac 180 tgatacagat attgtaccct tttatgtact tactactctt gtacttagtt tctttcagtc 240 agcgcaagct gcaaaatcga attgttgtga tatccaacaa ttaataaata aaagcattta 300 cagagtgaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 334 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 13 caagagtagt aagtacataa aaggg 25 <210> 14 <211> 1090 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 14 aaatagtaga aatttactta ctcaaatctc agaattcgtt tatactgtta acacgtacca 60 tggagtacta tcaccattca attaacaaaa tggccatgtt tatggttatt ctagtgctag 120 ccatagatgt gactatggtt ttaggccaag gaacccgtgt tggattttat tccagtacgt 180 gcccaagggc cgaatccata gttcaatcaa cggtgagggc tcattttcag tctgatccaa 240 cggtggcacc aggaatcctg agaatgcact tccatgattg ttttgtacta ggttgtgatg 300 gttctatcct cattgaaggt tcagacgctg agagaactgc tatcccaaac agaaatttga 360 aaggattcga cgttattgag gatgctaaga cgcaaattga agctatctgt cctggagttg 420 tttcctgtgc tgatattctt gctctagctg ctcgtgattc cgttgttgcg actaggggac 480 tgacatggtc tgtgcctacg ggacgtagag atgggcgagt ttcgagagca gctgatgcgg 540 gtgacctgcc agcttttttt gattctgtgg atattcaaaa gcgaaagttt cttacaaagg 600 gtctcaacac tcaagatctt gtcgccctta ctggtgcgca cactattgga accgcaggtt 660 gcgcagtcat cagagacagg ctattcaatt tcaactccac tggtggccct gacccttcaa 720 tagatgcaac ctttcttcct cagcttcgag cattatgtcc acaaaatggg gatgcctcaa 780 ggcgtgtggg actagacact ggaagcgtaa acaatttcga cacttcgtat ttctccaacc 840 tcaggaatgg tcgtggagtt ctggaatcag accagaagct gtggaccgat gcttctacac 900 aggtgtttgt ccaaaggttt ttaggtatta ggggattact tggattgaca ttcggcgtgg 960 agtttggcag gtccatggtt aaaatgagca atattgaagt taagactggc actaatggtg 1020 aaattcgtaa agtttgctct gctatcaact gatacagata ttgtaccctt ttatgtactt 1080 actactcttg 1090 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 15 atggagtact atcaccattc 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 16 tcagctgctc tcgaaactc 19 <210> 17 <211> 1229 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 17 aaatagtaga aatttactta ctcaaatctc agaattcgtt tatactgtta acacgtacca 60 tggagtacta tcaccattca attaacaaaa tggccatgtt tatggttatt ctagtgctag 120 ccatagatgt gactatggtt ttaggccaag gaacccgtgt tggattttat tccagtacgt 180 gcccaagggc cgaatccata gttcaatcaa cggtgagggc tcattttcag tctgatccaa 240 cggtggcacc aggaatcctg agaatgcact tccatgattg ttttgtacta ggttgtgatg 300 gttctatcct cattgaaggt tcagacgctg agagaactgc tatcccaaac agaaatttga 360 aaggattcga cgttattgag gatgctaaga cgcaaattga agctatctgt cctggagttg 420 tttcctgtgc tgatattctt gctctagctg ctcgtgattc cgttgttgcg actaggggac 480 tgacatggtc tgtgcctacg ggacgtagag atgggcgagt ttcgagagca gctgatgcgg 540 gtgacctgcc agcttttttt gattctgtgg atattcaaaa gcgaaagttt cttacaaagg 600 gtctcaacac tcaagatctt gtcgccctta ctggtgcgca cactattgga accgcaggtt 660 gcgcagtcat cagagacagg ctattcaatt tcaactccac tggtggccct gacccttcaa 720 tagatgcaac ctttcttcct cagcttcgag cattatgtcc acaaaatggg gatgcctcaa 780 ggcgtgtggg actagacact ggaagcgtaa acaatttcga cacttcgtat ttctccaacc 840 tcaggaatgg tcgtggagtt ctggaatcag accagaagct gtggaccgat gcttctacac 900 aggtgtttgt ccaaaggttt ttaggtatta ggggattact tggattgaca ttcggcgtgg 960 agtttggcag gtccatggtt aaaatgagca atattgaagt taagactggc actaatggtg 1020 aaattcgtaa agtttgctct gctatcaact gatacagata ttgtaccctt ttatgtactt 1080 actactcttg tacttagttt ctttcagtca gcgcaagctg caaaatcgaa ttgttgtgat 1140 atccaacatt aataaataaa agcatttaca gagtgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1229 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 18 cgtatttctc caacctcagg 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 19 attggttacc acacaattg 19 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 20 cgcggatcca tggagtacta tcaccattc 29 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 21 cgcggatcct actgttaaca cgtaccatg 29 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 22 cgagctctta gttgatggca gagcaaa 27

【００９２】

【配列表フリーテキスト】

配列番号11：合成ＤＮＡ 配列番号１３：合成DNA 配列番号15：合成DNA 配列番号16：合成DNA 配列番号18：合成DNA 配列番号19：合成DNA 配列番号20：合成DNA 配列番号21：合成DNA 配列番号22：合成DNA

【図面の簡単な説明】

【図１】パラコート処理により誘導されたペルオキシダ
ーゼ遺伝子NTPXC1をRT-PCR反応で検出したアガロース電
気泳動像の写真を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ Ｃ (72)発明者 古澤 巌 京都府京都市左京区高野東開町１−23 36 −303 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD06 CD10 CD13 CD17 4B024 AA08 BA08 CA04 CA06 CA09 DA01 DA02 DA05 DA12 EA03 EA04 GA11 GA17 HA01 HA12 4B050 CC03 CC04 DD13 LL10 4B063 QA01 QA13 QQ09 QQ44 QR08 QR14 QR32 QR41 QR42 QR50 QR56 QR62 QR75 QR78 QR84 QS25 QS36 QS38 QX01 4B065 AA01X AA19X AA26X AA44X AA79X AA80X AA88X AA89Y AB01 AC14 AC20 BA02 CA28 CA53

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質。 (a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク
   質 (b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若し
   くは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列を含み、かつペルオキシダーゼ活性を有する
   タンパク質
2. 【請求項２】 以下の(a)又は(b)のタンパク質をコード
   するペルオキシダーゼ遺伝子。 (a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク
   質 (b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若し
   くは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列を含み、かつペルオキシダーゼ活性を有する
   タンパク質
3. 【請求項３】 以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。 (c) 配列番号１で表される塩基配列を含むDNA (d) 配列番号１で表される塩基配列を含むDNAとストリ
   ンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペルオキ
   シダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
4. 【請求項４】 請求項２又は３記載の遺伝子を含む組換
   えベクター。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えベクターを含む形
   質転換体。
6. 【請求項６】 請求項２又は３記載の遺伝子が組み込ま
   れた形質転換植物。
7. 【請求項７】 請求項５記載の形質転換体を培養し、得
   られる培養物からペルオキシダーゼを採取することを特
   徴とするペルオキシダーゼの製造方法。