KR100350825B1 - 파라쿠아트 내성 유전자, 이 유전자를 함유한 플라스미드벡터및 이를 이용한 형질전환 식물체 선발방법 - Google Patents

파라쿠아트 내성 유전자, 이 유전자를 함유한 플라스미드벡터및 이를 이용한 형질전환 식물체 선발방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파라쿠아트(Paraquat) 내성유전자에 의해 형질전환된 식물체를 선택마커(Selectable Marker)인 파라쿠아트 존재하에 배양하므로써 선발하는 방법에 관한 것으로 파라쿠아트를 함유하는 배지에 정상인 식물체와 파라쿠아트 내성유전자를 함유하는 형질전환된 식물체를 배양할 경우, 정상인 식물체는 고사하므로써 형질전환된 식물체를 선발할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

파라쿠아트 내성 유전자, 이 유전자를 함유한 플라스미드 벡터 및 이를 이용한 형질전환 식물체 선발방법 {Paraquat-resistance gene, plasmid vector containing the gene and selection method of transformant plant using the same}
본 발명은 형질전환된 식물을 선발하는 선택마커(Selectable Marker)에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 선택마커를 사용하여 파라쿠아트 내성(Paraquat resistance) 유전자를 가진 형질전환체 식물을 선발하는 방법에 관한 것이다.
지금까지 형질전환 식물체의 선택마커는 카나마이신(Kanamycin)과 같은 아미노-글라이코시드(amino-glycoside) 항생제 내성과 관련된 nptⅡ(neomycin phosphotransferase Ⅱ) 유전자를 이용하였다. 그러나 카나마이신은 옥수수(maiz), 쌀(rice), 귀리(oat), 밀(wheat)과 같은 화본과에서는 내생내성(endogenouse tolerance)의 수준이 높기 때문에 선택마커로는 적당하지 않았다. 본 발명은 이와 같은 사실에 착안하여 형질전환체 선발에 있어서, 제초제 저항성 유전자를 이용하는 방법을 제공한다. 제초제 저항성 유전자를 이용하는 방법은 조직배양 및 형질전환을 연구함에 있어서, 낮은 제초제의 농도에서 형질전환되지 않은 식물체를 모두 고사시키므로 간편하고 효과적인 선발방법이 되는 것이다. 최근 이러한 잇점을 이용해 외국에서는 글라이포스페이트(glyphosphate)나 바 유전자(bar gene)와 같은 제초제 내성유전자를 도입한 벡터를 이미 개발하였다.
본 발명의 목적은 이와 같이 형질전환된 식물을 간편한 방법으로 선발하는 방법을 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 파라쿠아트를 선택마커로 사용하여파라쿠아트 내성유전자를 함유하는 형질전환된 식물을 선발함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 파라쿠아트 내성유전자의 염기서열과 상기 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터를 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 파라쿠아트(Paraquat) 제초제 내성균으로부터 파라쿠아트 내성유전자를 분리한 후, CaMV-35S 프로모터를 가진 벡터에 도입하여 플라스미드를 제조하고, 이 플라스미드로 식물을 형질전환시킨 후 안정성을 검정하였다. 이어서, 형질전환된 식물체와 정상 식물체인 대조구를 파라쿠아트가 함유된 배지에서 배양한 후 두 식물체를 비교하므로써 달성하였다.
이하, 본 발의 구성 및 작용을 설명한다.
도 1은 1mM 파라쿠아트(Paraquat)를 함유하는 LB 플레이트 상에서E.coliDH5α 성장을 나타낸 사진도이다.
도 2는 pBpq2.5의 아가로스 겔 전기영동결과 사진도이다.
도 3은Ochrobactrum anthropiJW2의 서던 블럿 분석 사진도이다.
도 4a와 4b는 파라쿠아트 내성유전자의 염기서열 및 이 염기서열에서 유래된 아미노산 서열을 나타낸다.
도 5는 파라쿠아트 내성유전자를 식물에 도입 및 발현시키기 위한 플라스미드 유전자 지도이다.
도 6은 pJW1-pq2.1 유전자에 의해 형질전환된 담배의 서던 블럿 분석을 나타낸 사진도이다.
도 7은 형질전환된 담배의 노던 블럿 분석을 나타낸 사진도이다.
도 8은 형질전환된 담배잎에 대한 파라쿠아트의 영향을 나타낸 사진도이다.
본 발명은 파라쿠아트로 장기간 처리된 토양으로부터 파라쿠아트 내성균을 분리, 동정하는 단계; 파라쿠아트 내성균의 게놈 DNA를 추출하여 클로닝하는 단계; 클로닝된 유전자의 염기서열을 분석하는 단계; 염기서열이 밝혀진 파라쿠아트 내성유전자를 함유하는 플라스미드를 제조하여 식물을 형질전환시키는 단계 및; 형질전환된 식물을 정상 식물인 대조구와 함께 파라쿠아트가 함유된 배지에서 배양하고 차이점을 조사하는 단계로 구성된다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법은 실시예를 들어 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정하는 것은 아니다.
실시예 1 : 파라쿠아트 내성균의 분리 및 동정
파라쿠아트를 장기간 처리한 과수원의 토양을 증류수에 교반한 후, 상충액을 5mM 파라쿠아트가 첨가된 LB 플레이트에 도말하여 살아남은 균주를 선발하고, 이를 동정한 결과Ochrobactrum anthropi임이 밝혀졌으며 이 균주는 파라쿠아트 10mM의 고농도에서도 정상적인 성장을 나타냈다.
실시예 2 : 파라쿠아트 내성(pqr)유전자의 클로닝
파라쿠아트 내성균인Ochrobactrum anthropiJW2의 게놈 DNA를 제한효소Sau3AⅠ으로 부분 digestion한 후 벡터 pBluscriptⅡ SK(+)의BamHⅠ 부위에 라이게이션하였다. 이것으로 파라쿠아트 민감성균인E.coliDH5 α을 형질전환한 후 파라쿠아트 1mM 첨가된 LB 플레이트에 도말하여 살아남은 콜로니를 선발하였으며(도 1), 이를 배양하여 플라스미드를 분리한 결과 인서트의 크기는 약 2.5kb였으며 이 플라스미드를 pBpq2.5라고 명명하였다(도 2). 이 유전자의Ochrobactrum anthropiJW2상의 카피수를 알아보기 위하여 게놈 서던 하이브리디제이션(genomic southern hybridization)을 실시하였다. 실험결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 게놈상에 싱글 카피로 존재함을 알 수 있다.
실시예 3 : 파라쿠아트 내성유전자의 염기서열분석
실시예 2에서 클로닝된 유전자를 Sanger dideoxy chain-termination법으로 시퀀싱한 실험결과, 유전자의 총길이는 2.520bp이고 추정되는 ORF의 크기는 1.2kb였으며, -35지역, -10지역, 리보솜 결합부위의 교감시퀀스(consensus sequence)를 갖는 대략 70pb 크기의 프로모터 시퀸스를 구성하고 있었고, 아미노산의 수는 411개였다(도 4a, 도 4b).
실시예 4 : 파라쿠아트 내성유전자로 식물체 형질전환
실시예 2 및 3에서 클로닝되어 염기서열이 밝혀진 유전자 총 2.5kb중, 1.2kb ORF가 도입된 2.1kb를 CaMV-35S 프로모터를 가진 binary vector pGA748에 서브클로닝하고, 이 플라스미드를 pJW2-pqr2.1로 명명하였다(도 5). pJW2-pqr2.1을 도입한Agrobacterium tumefaciensLBA4404와 함께 배양하여 담배를 형질전환하였다. 형질전환체에서 도입된 유전자의 안정성을 검정하기 위해 방사선 동위원소로 라벨링한 프로브를 이용하여 게놈 DNA 서던 블럿 분석을 실시한 결과, 형질전환체에서 파라쿠아트 내성 유전자가 안정적으로 도입되었음을 확인하였고(도 6), 이어서 도입된 유전자의 식물체내에서의 발현을 확인하기 위해 노던 블럿 분석한 결과, 미생물 유래의 파라쿠아트 내성 유전자가 식물에서 발현됨을 알 수 있었다(도 7). 플라스미드 벡터 pJW2-pqr2.1이 도입된Agrobacterium tumefaciensLBA4404는Agrobacterium tumefaciensLBA4404/pJW1-pqr2.1로 명명하였으며 생명공학연구소 유전자 은행에 1998년 8월 27일 기탁번호 KCTC 0516BP로 기탁하였다.
실시예 5 : 형질전환된 담배의 파라쿠아트 내성 조사
실시예 4에서 형질전환된 담배의 엽조직과 정상식물체의 엽조직을 파라쿠아트가 첨가된 MS배지에서 배양하였다. 배양 2일 후 대조구인 정상식물체의 경우는 파라쿠아트 10μM의 농도에서 잎이 노랗게 변화하는 약해를 보이기 시작하여 3일후에는 식물조직의 70% 정도가 고사율을 보였으나 형질전환체 담배의 경우는 배양 3일후 약간의 갈변현상을 보이기 시작하였다(도 8).
이상 실시예에서 설명한 바와 같이, 형질전환된 식물체는 파라쿠아트가 첨가된 배지에서 정상 식물체인 대조구와 뚜렷한 차이를 나타내므로 파라쿠아트가 선택마커(Selectable Marker)로서 파라쿠아트 내성유전자에 의해 형질전환 식물을 간편하게 선발할 수 있는 효과가 있어 농업 및 미생물 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (5)

  1. 선택마커로써 파라쿠아트(Paraquat) 내성 유전자를 식물체에 도입하여 형질전환 식물체를 만든 후 파라쿠아트가 함유된 배지에서 선택하는 형질전환 식물체 선발방법에 있어서,
    상기 파라쿠아트 내성 유전자는 오크로박트럼 앤트로피(Ochrobactrum anthropi) 균주로부터 유래되었으며, 서열목록 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 형질전환식물체 선발방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 오크로박트럼 앤트로피(Ochrobactrum anthropi) 균주로부터 유래한 파라쿠아트 내성 유전자를 화본과에 속하는 식물의 형질전환체 제조시 선택마커로 이용함을 특징으로 하는 형질전환 식물체 선발방법.
  3. 오크로박트럼 앤트로피(Ochrobactrum anthropi) 균주로부터 유래되고, 서열목록 1에 나타낸 염기서열을 갖는 파라쿠아트(Paraquat) 내성유전자.
  4. 상기 제3항의 파라쿠아트(Paraquat) 내성유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 pJW1-pqr2.1.
  5. 상기 제4항의 플라스미드 벡터 pJW1-pqr2.1이 도입된Agrobacterium tumefaciensLBA4404/pJW1-pqr2.1(기탁번호 KCTC 0516BP).
KR1019990028030A 1999-07-12 1999-07-12 파라쿠아트 내성 유전자, 이 유전자를 함유한 플라스미드벡터및 이를 이용한 형질전환 식물체 선발방법 KR100350825B1 (ko)

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EP1514941A3 (en) * 2003-09-12 2005-05-04 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Paraquat resistance gene and a vascular tissue- and trichome-specific promotor

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