CH617667A5 - - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Tripeptidamiden, die eine antidepressive und/oder die Schilddrüsenhormonabgabe stimulierende Wirkung haben.

Das natürliche, Thyrotropin (Thyreotropin) freisetzende Hormon (TRH) ist das Tripeptid L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamid. Die Synthese dieses Peptids ist bekannt. Spezielle Herstellungsmethoden sind in den USA-Patentschriften 3 753 569, 3 746 697, 3 757 003 und 3 752 800 beschrieben. Homologe, Derivate und Isomere von TRH sind ferner in «Vitamins and Hormones, Advances in Research and Applications», Band 29 (1971), Academic Press, N.Y. und London, Seiten 1 bis 39; «Chemistry and Biology of Peptides, Procee-dings of the Third American Peptide Symposium» (1972). Ann Arbor Science Publishers Inc., Ann Arbor, Michigan, Seiten 601 bis 608; Zh. Obshch, Khim 42 Nr. 2 (Februar 1972), Seite 483, J. Med. Chem. 15 (1972), Seiten 8, 219 und 479; J. Med. Chem. 16 (1973), Seiten 1137 bis 1140; C. A. 75 (1971), 49547 w, 49548 x, 77268 z und 88942 r; C. A. 74 (1971), 13401 m und C. A. 73 (1970), 21767 c und 95001 v beschrieben. Es wurde gefunden, dass TRH ausser seiner die Schilddrüsenhormonabgabe stimulierenden Wirksamkeit eine nahezu sofort einsetzende antidepressive Wirkung besitzt; vgl. Präge Jr. et al., LANCET (11. November 1972), Seite 999 und Plot-nikoff et al., SCIENCE 178, 417 (1972).

Erfindungsgemäss werden neue Tripeptidamide hergestellt, welche antidepressive Wirksamkeit und eine entsprechende thyreotrope (Thyrotropin freisetzende) Hormonaktivität wie TRH aufweisen.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines Tripeptidamids der Formel

Mr-M2-M3-NH2 (I)

sowie deren Säureadditionssalze,

worin Mx der Rest einer Aminosäure aus der Gruppe kic, kpc oder pca, M2 der Rest his oder N3im-substituiert-his ist, M3 den Rest einer Aminosäure aus der Gruppe L-pip, L-pro und L-tca bedeutet und wobei pca und L-pro im Tripeptid nicht gemeinsam vorkommen, dadurch gekennzeichnet, dass man die entsprechenden Aminosäuren bzw. deren aktivierte Derivate in beliebiger zeitlicher Reihenfolge und unter intermediärem Schutz von jeweils von der Reaktion auszuschliessenden reaktiven funktionellen Gruppen miteinander kondensiert und dass man zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Carbo-xylgruppe des terminalen Aminosäurerestes M3 in die Amid-gruppe überführt.

Der Einfachheit halber werden die Aminosäuren bzw. deren Reste in der vorliegenden Anmeldung wie folgt abgekürzt:

Aminosäure

Abkürzung

Histidin his

Pyroglutaminsäure pca

Prolin pro

2-Ketoimidazolidin-5-carbonsäure kic

2-Ketopiperidin-6-carbonsäure kpc

Thiazolidin-4-carbonsäure tea

2-Pyrrolcarbonsäure prl

L-2-Piperidincarbonsäure

L-pip

2-Ketooxazolidin-4-carbonsäure koc

Die vorangestellten Buchstaben L- bzw. D,L- bezeichnen einzelne Aminosäure-Stereoisomere bzw. Stereoisomergemische. Wenn kein Buchstabe vorangestellt wird, umfasst die Aminosäure sowohl das L-Stereoisomere als auch D,L-Mi-schungen. Somit umfasst pca beispielsweise L-pca und D,L-pca-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

617 667

Gemische einschliesslich racemischer Gemische. Im allgemeinen werden jene Tripeptide der Formel (I) bevorzugt, bei denen Mi, M2 und M3 sämtlich die L-Konfiguration aufweisen.

Ausser den Aminosäureabkürzungen werden in der vorliegenden Anmeldung folgende Abkürzungen für weitere bei der Peptidherstellung angewendete Ausgangsverbindungen, Rea-gentien, Lösungsmittel, Schutzgruppen u. a. verwendet:

Verbindungen, Schutzgruppen, Lösungsmittel u. a.

Abkürzung

Benzyloxycarbonyl

2,4-Dinitrophenyl

Dicyclohexylcarbodiimid

Dimethylformamid

1 -Hydroxybenzotriazol tert.-Butyloxycarbonyl

Trifluoressigsäure

Harze

Azid

Z

DNP

DCCI

DMF

HBT

BOC

TFE

N3

Besonders bevorzugt werden jene Tripeptide, bei denen Mi in der Formel (I) den Rest einer einen 6gliedrigen hetero-cyclischen Ring enthaltenden Aminosäure darstellt. Das am meisten bevorzugte Tripeptid dieses Typs ist L-kpc-L-his-L-pro-NH2 mit der nachstehenden Formel

Eine Gruppe von bevorzugten Tripeptiden sind jene, bei denen Mi in der Formel (I) kic oder kpc ist. Beispiele für diese Tripeptide sind:

kpc-his-L-pro-NH2

D,L-kpc-his-L-tca-NH2

L-kic-his-L-pro-NH2

30

Eine weitere Gruppe von bevorzugten Tripeptiden sind jene, bei denen M3 in der allgemeinen Formel (I) L-tca oder L-pip ist. Beispiele für diese bevorzugten Tripeptide sind: pca-N3,m-substituiert-his-L-tca-NH2 kpc-L-his-L-pip-NH2 und kpc-his-L-pip-NH2.

Besonders bevorzugt werden pca-his-L-tca-NH2 und pca-his-L-pip-NH2. Die am meisten bevorzugten Tripeptide dieses Typs sind L-pca-L-his-L-tca-NH2 (1) bzw. L-pca-L-his-L-pip-NH2:

.NH

„ H . C-N-C H

ÇHg il

-N

0 u C

0

ti

C -NH,

)

N

(1)

(2)

Eine weitere Gruppe von bevorzugten Tripeptiden sind jene, bei denen M2 in der Formel (I) N3im-substituiert-his ist. «N3,m-substituiert» zeigt die Substitution des in 3-Stellung befindlichen Imidazolinstickstoffatoms von Histidin an, wie die nachstehende Formel erläutert:

617 667

4

N-r substituiert

H —N

C H

1

-N

CHg

0

il

-Clio

15

Bevorzugte Substituenten sind Cj—C6-Alkylreste und Reste der Formel -(CH2)bCOOH, wobei b eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist. Als Substituenten bevorzugt werden Alkylreste, wie die

Methyl-, oder tert.-Butylreste, die Cyclohexylgruppe sowie die Gruppe -CH2—COOH. Beispiele für bevorzugte Tripeptide, bei denen M2 N3im-substituiert-his ist, sind: D,L-kpc-N3im-C2Hs-D,L-his-L-tca-NH2 kpc-N3im-C3H7-his-L-pip-NH2.

Beispiele für besonders bevorzugte Tripeptide dieses Typs sind:

kpc-N3im-CH3-his-L-pro-NH2 kic-N3,m-CH3-his-L-tca-NH2 pca-N3im-CH2-COOH-his-L-pip-NH2.

Eine weitere Gruppe von bevorzugten Tripeptiden mit der Formel (I) sind jene, bei denen Ma kpc und M34-tca oder 4-pip sind. Beispiele für diese Tripeptide sind:

kpc-his-L-tca-NH2

kpc-N3im-(CH2)2-COOH-his-L-tca-NH2 kpc-N3im-cyclohexyl-L-his-L-pip-NH2.

Die am meisten bevorzugten Peptide dieses Typs sind L-kpc-L-his-L-pip-NH2 mit der nachstehenden Formel:

S H

■C-N-

"N' H

NH

CHr

C H

-N

0 n c

0

II

C-NH,

N

V

35

Erfindungsgemäss hergestellte Salze sind z. B. pharmakologisch verträgliche Salze von anorganischen Säuren, wie Salz-, Schwefel-, Bromwasserstoff- oder Phosphorsäure sowie von organischen Säuren, wie Cyclohexylcarbon-, Wein-, Oxal-, Fumar-, Zitronen-, Äpfel-, Ascorbin-, Essig- und Milchsäure sowie Fettsäuren, z, B. Öl-, Pamoa- oder Palmitinsäure. «Pharmakologisch verträglich» bedeutet, dass die Salze im wesentlichen nichttoxisch sind und eine entsprechende pharmakologische Wirksamkeit wie das Tripeptid selbst aufweisen.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden entsprechende Aminosäurebausteine über die Peptidbindung

O H

II II

-C-N- miteinander verknüpft. Wenn das hergestellte Peptid linear ist, erfolgt die Verknüpfung durch Umsetzung zwischen einer a-Aminogruppe und einer Carboxylgruppe verschiedener Aminosäuren. Gemäss allgemeiner Übung lenkt man diese Verknüpfung dadurch, dass man jene funktionellen Gruppen der Aminosäurebausteine, welche an der Errichtung der Peptidbindung nicht teilnehmen sollen, schützt bzw. blockiert. Wichtig für die Schutzgruppen ist, dass sie

(1) die Verknüpfungsreaktion nicht stören und

(2) bei der Peptidsynthese nach Bedarf leicht abspaltbar sein sollen.

Es sind mehrere Arten von blockierenden Gruppen bzw. Schutzgruppen bekannt und anwendbar. Geeignete Schutzgruppen für die Aminogruppe sins z. B. Acylgruppen mit den allgemeinen Formeln wobei Ra ein Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkaryl- oder substituierter Alkyl- oder Arylrest ist, Gruppen vom Urethan-Typ mit der allgemeinen Formel

40

O

O

' JL und Rb-S-C-

Rb—O

wobei Rb z. B. ein Alkyl-, Aryl-, Alkaryl-, Aralkyl- oder sub-45 stituierter Alkyl- oder Arylrest, ein Alkylaminorest oder ein heterocyclischer Rest ist, ferner Alkyl-, Aryl- und substituierte Alkyl- oder Arylreste sowie Arylidenreste mit der allgemeinen Formel

50

H

RC=C-

wobei Rc ein Aryl- oder substituierter Arylrest ist.

Typische Beispiele für Acylgruppen sind die Formyl-, p-55 Toluolsulfonyl-, Chloracetyl-, Trifluoracetyl-, Phthaloyl-, Phos-phoryl-, Benzolsulfonyl-, o-Nitrophenoxy-, Acetyl-, o-Nitro-phenylsulfenyl- und Dibenzylphosphorylgruppe. Beispiele für Alkyl- und Aryl-Schutzgruppen sind die Triphenylmethyl-, Benzyl-, Benzylthiomethyl-, Dinitrophenyl- und Diphenyl-60 gruppe sowie Trialkylsilylreste. Beispiele für geeignete Arylidenreste sind die Benzyliden- und 2-Hydroxy-5-chlorbenzyli-dengruppe.

Die am besten geeigneten Schutzgruppen für die Aminogruppe sind die Urethangruppen der Formel

R

O

•J-.

R-S02-, Ra—S— und (Ra0)2-P-0-,

O

R—O—C—

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Beispiele für Schutzgruppen vom Urethan-Typ mit spezieller Eignung sind jene, bei denen Rb eine Benzyl- oder substituierte Benzylgruppe, wie eine p-Methoxybenzyl-, p-Nitro-benzyl-, p-Phenylazobenzyl-, p-Brombenzyl- oder 2-Nitro-benzylgruppe, ein Cycloalkylrest, wie eine Methylcyclohexyl-oder Cyclopentylgruppe, ein substituierter Cycloalkylrest, wie eine Methylcyclohexyl-, Dodecylcyclohexyl- oder Isobutylcy-clopentylgruppe, eine Adamantyl-, Piperidino- oder Dimethyl-aminogruppe oder ein Alkylrest, wie eine n-Propyl-, tert.-Bu-tyl-, tert.-Amyl-, Octyl- oder Dodecylgruppe, ist.

Ausser mit Hilfe der vorstehend beschriebenen blockierenden Gruppen kann man die Aminogruppe auch durch Salzbildung schützen, vorausgesetzt, dass sie eine genügende Basizität aufweist.

Die Carboxylgruppen der Aminosäurebausteine werden im allgemeinen durch Veresterung, Amid- oder Hydrazidbildung und Salzbildung geschützt.

Beispiele für zum Schutz der Carboxylgruppe geeignete Ester sind Alkylester, wie Methyl-, Äthyl-, tert.-Butyl- und Decylester, Arylester, wie Benzyl-, Phenyl- und Benzhydryl-ester, substituierte Alkylester und substituierte Phenylester, wie Pentamethylbenzyl-, Phenylazophenyl- und o-Cyanbenzyl-ester.

Die zum Schutz der Carboxylgruppe dienenden Hydrazide sind gewöhnlich substituiert, wie das Benzyloxyhydrazid, tert.-Butyloxycarbonylhydrazid, Phenylhydrazid und Tritylhy-drazid.

Von einem Schutz der Carboxylgruppe durch Amidbildung wird in der Regel nur selten Gebrauch gemacht, da sich die Amidgruppe nur schwierig abspalten lässt, ohne dass die Peptidbindung selbst aufgespalten wird. Wenn jedoch - wie im vorliegenden Fall - die Tripeptid-Endgruppe eine Amidgruppe sein kann, lässt sich die Carboxylgruppe mit Vorteil auf diese Weise schützen.

Einige die Carboxylgruppe schützende Estergruppen weisen zusätzlich eine aktivierende Wirkung auf. Aufgrund der Aktivierung wird die für die Verknüpfung massgebliche Reaktionsfähigkeit erhöht. Der Aktivierungsgrad hängt von der speziellen chemischen Struktur des Esters ab; dabei gilt allgemein, dass die Aktivierung durch das Ausmass bestimmt wird, mit welchem die Schutzgruppe die Empfänglichkeit der Car-boxylfunktion gegenüber einem nukleophilen Angriff erhöht. Beispiele für die Carboxylgruppe aktivierende Estergruppen sind die p-Nitrophenyl-, 2,4-Dinitrophenyl-, N-Hydroxysuccin-imidyl-, Ferfluorphenyl-, Cyanmethyl-, Perchlorphenyl-,

2,4,5-Trichlorphenyl-, 4-Methylthiophenyl-, 8-Hydroxychino-lyl- und 1-Hydroxybenzotriazolgruppe sowie Thioestergruppen, wie die p-Nitrobenzylthio-, p-Nitrophenylthio- und Phenyl-thiogruppe.

s Die Verknüpfung der Aminosäurebausteine kann nach verschiedenen Methoden erfolgen. Beispiele für der Verknüpfung zugrundeliegende Umsetzungen sind:

(a) direkte Kondensation einer Ntt-geschützten Aminosäure mit einer Aminosäure mit geschützter Carboxylgruppe; io (b) Überführung einer Na-geschützten Aminosäure in das

Azid und Umsetzung des Azids mit einer Aminosäure mit geschützter Carboxylgruppe;

(c) Umsetzung eines Halogenids oder gemischten Anhydrids einer N"-geschützten Aminosäure mit einer Aminosäure

15 mit geschützter Carboxylgruppe;

(d) Umsetzung eines aktiven Esters einer Na-geschützten Aminosäure mit einer Aminosäure mit geschützter Carboxylgruppe und

(e) direkte Verknüpfung einer Na-geschützten Aminosäure 20 mit einer eine geschützte Carboxylgruppe aufweisenden

Aminosäure mit Hilfe eines Verknüpfungsmittels, z. B. mit einem Carbodiimid, einem Carbodiimid und einem Hydroxybenzotriazol, einem Carbodiimid und N-Hydro-xybernsteinsäureimid, Triphenylphosphit und Imidazol, 25 Triphenylphosphin und Dipyridyl-2,2'-disulfid, oder Woodward-Reagens.

Von den Verknüpfungsverfahren sind die Azidmethode (b) und die mit Hilfe eines Carbodiimids durchgeführte Methode (e) besonders gut geeignet.

30 Die erfindungsgemäss hergestellten Peptide können durch verschiedene Reaktionsfolgen hergestellt werden. Ein vorteilhaftes Syntheseschema beruht auf der stufenweisen Verknüpfung der einzelnen Aminosäuren, wobei zuerst ein Dipeptid als Zwischenprodukt und aus diesem das Tripeptid-Endprodukt 35 hergestellt werden.

Bei der Durchführung der Verknüpfungsstufen wird die an der Carboxylgruppe reagierende Aminosäurekomponente im allgemeinen an der a-Aminogruppe geschützt, während die an der a-Aminogruppe reagierende Aminosäure gewöhnlich an 40 der Carboxylgruppe geschützt wird. Wenn die betreffende Aminosäure auch eine sekundäre funktionelle Gruppe (wie die Imidazolgruppe bei Histidin) aufweist, kann diese ebenfalls geschützt werden. Die nachstehenden Gleichungen veranschaulichen eine derartige Stufensynthese. Y in den Gleichungen be-45 deutet eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe.

(a) L-pca + L-his~Y

Verknüpfung

-> L-pca-L-his-Y

(b) L-pca-L-his-Y

(-Y)

-> L-pca-L-his

Verknüpfung

(c) L-pca-L-his + L-tca-N^ > L-pca-L-his-L-tca-NI^

Wenn Y in der Stufe (a) eine aktivierende Gruppe dar- 60 stellt, können die Stufen (b) und (c) kombiniert werden. Ferner kann L-pca (obwohl dies im vorstehenden Reaktionsschema nicht angezeigt wird) an der Aminogruppe geschützt sein. In diesem Fall muss man die Schutzgruppe in einer zusätzlichen Verfahrensstufe abspalten, um L-pca-L-his-L-tca- 65 NH2 zu erhalten.

Die durch die Gleichungen (a) bis (c) veranschaulichte Reaktionsfolge dient nur der Erläuterung und ist nicht im einschränkenden Sinne aufzufassen. Bei der Synthese kann man somit auch die Aminosäure M2 mit der Aminosäurekomponente M3-NH2 zum Dipeptid M2-M3-NH2 und dieses mit der Aminosäure Mt zum gewünschten Tripeptid Mi—M2—M3—NH2 verknüpfen.

Bei einer weiteren Methode zur Herstellung der Tripeptide verwendet man eine Harzmatrix, an welcher man das Peptid stufenweise aufbaut. Bei diesem Verfahren kann ein lösliches oder unlösliches Harz verwendet werden. Unlösliche Harze

617 667

6

werden bevorzugt; die entsprechende Methode wird gewöhnlich als Festphasen- oder Merrifield-Synthese bezeichnet. Die unlöslichen Harze weisen im allgemeinen Stellen auf, an welche Carboxylgruppen gebunden werden können. Ein derartiges Harz ist beispielsweise das sog. «Merrifield-Harz». Eine : Form dieses Harzes besteht aus einem Styrol/Divinylbenzol-Copolymeren, welches als gegenüber Carboxylgruppen reaktionsfähige Gruppierungen Chlormethylgruppen aufweist.

(1) X-L-pip + (?) ^

Beim Peptidaufbau wird jeweils eine Aminosäure angefügt, bis man das gewünschte Tripeptid erhält. Dieses wird anschliessend vom Harz befreit.

Das Verfahren wird durch das nachstehende Reaktions-s schema erläutert. In den einzelnen Gleichungen bedeutet (P) das Harz, während X und X1 Amino-Schutzgruppen darstellen.

X-L-pip-0

(2) X-L-pip-(p

(-X)

L-pip-(P

(3) X1-L-his +.L-pip-(p)

Verknüpfung

5 1 /—\

^ X -L-his-L-pip-(?)

(4) x'' -L-his-L-pip- (p)

(-X1)

L-his-L-pip-(?)

(5) L-kic + L-his-L-pip- (p) ■ >> L-kic-L-his-L-pip-^P

In der (den) nächsten Synthesestufe(n) wird das Tripeptid vom Harz (P) befreit. Abhängig vom angewendeten Reaktionssystem kann das freie Tripeptid eine Säure-, Ester- oder Amid-Endgruppe aufweisen. Wenn das Tripeptid nach der Harzabspaltung eine Säure-Endgruppe aufweist, kann man es nach herkömmlichen Methoden in das entsprechende Amid überführen. Ebenso kann man, wenn das freie Tripeptid eine Ester-Endgruppe besitzt, diese nach Bedarf in herkömmlicher Weise durch eine Amidgruppe ersetzen.

Ein sehr zweckmässiges Verfahren zur Abtrennung des Tripeptids vom Harn (P) besteht in der Umesterung mit einem geeigneten Alkohol. Ein Vorteil dieser Methode besteht 35 darin, dass der Ester erhalten wird und dieser leicht in das Amid umgewandelt werden kann. Das Verfahren erfolgt gemäss nachstehendem Reaktionsschema:

40

Tripeptidester

L-kic-L-his-L-pip-(p) + ROH L-kic-L-his-L-pip-OR

Tripeptidamid

L-kic-L-his-L-pip-OR + NH^ >•» L-kic-L-his-L-pip-N^

Obwohl dies im vorstehenden Reaktionsschema nicht gezeigt ist, können die Stickstoffatome von kic und der Histi-din-Imidazolgruppe nach Bedarf während der Umsetzung geschützt werden, wobei man die Schutzgruppen in einer geeigneten Stufe der Peptidherstellung abspaltet. N3im-substituiert-his enthaltende Tripeptide können ebenfalls nach der Festpha-sensynthesemethode hergestellt werden, wobei man den Sub-stituenten entweder vor oder im Verlauf der Synthese einführt.

Bei beiden vorstehend beschriebenen Methoden und generell bei der Peptidsynthese werden Schutzgruppen und/oder aktivierende Gruppen eingeführt und wiederum abgespalten. Sowohl die Einführung als auch die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgen nach herkömmlichen Methoden und unter Verwendung bekannter Reaktionssysteme. Beispiele für zur Schutzgruppenabspaltung herangezogene Umsetzungen sind die Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak, die Hy-55 drogenolyse (z. B. mit Hilfe von Palladium-Aktivkohle als Katalysator), die Umsetzung mit Halogenwasserstoffsäure (z. B. Chlor- oder Bromwasserstoffsäure) in Essigsäure oder die Umsetzung mit Trifluoressigsäure. Das spezielle Reaktionssystem für die Abspaltung einer Schutzgruppe sowie ihre Einfüh-60 rung in einen Aminosäurebaustein wird so gewählt, dass

(1) die Abspaltung der Schutzgruppen nötigenfalls selektiv erfolgt und

(2) die Peptidsynthese nicht gestört wird.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Herstellung von 65 Tripeptiden der Formel (I) und einiger Zwischenprodukte. Teile bedeuten stets Gewichtsteile, sofern es nicht anders angegeben ist.

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617 667

Beispiel 1

(A) Herstellung von L-2-Ketoimidazolidin-5-carbonsäure Eine Lösung von 25 g NaOH in 760 ml Wasser, die sich in einem in ein Kühlbad gestellten Gefäss befindet, wird unter Rühren mit 5 ml Brom versetzt. Wenn der Ansatz eine Temperatur von etwa 0°C erreicht hat, werden darin 26,6 g N°-Benzyloxycarbonylasparagin gelöst. Man erwärmt die Lösung auf 75° C und hält sie 45 Minuten bei dieser Temperatur. Anschliessend kühlt man die Lösung ab und extrahiert zweimal mit jeweils 150 ml Methylendichlorid. Der Extrakt wird zur Trockene eingedampft und der Rückstand über Nacht im Vakuum ofengetrocknet. Die trockene Festsubstanz wird mit Äthanol extrahiert. Man dampft den Extrakt ein, bis die L-2-Ketoimidazolidin-5-carbonsäure

HN

0'

■N-H

-C00H

ausfällt.

Die Säure wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Man erhält etwa 4,20 g Säure vom Fp 166 bis 170° C.

Analyse:

berechnet: C 36,93 H 4,65 N 21,53%

gefunden: C 34,87 H 4,52 N 19,5 %

(B) Herstellung von L-2-Ketoimidazolidin-5-carbonyl-

L-histidyl-L-prolin-OCH3 19,8 g (6,36 mMol) Na-tert.-Butyloxycarbonyl-N3lm-2,4-dinitrophenyl-L-histidyl-L-prolin- (P), 2 Äquivalente L-2-Ke-toimidazolidin-5-carbonsäure, 2 Äquivalente Dicyclohexylcar-bodiimid und 1,3 g 1-Hydroxybenzotriazol werden in DMF gemischt und etwa 5 Stunden bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach dieser Zeitspanne ist die Umsetzung im wesentlichen beendet; die Ausbeute an L-kic-Nim3-DNP-L-his-L-pro- (P) beträgt 98 %. Man spaltet die Dinitrophenyl-Schutz-gruppe mit HSC2H4OH/DMF ab und wäscht die erhaltene L-kic-L-his-L-pro- (P) mit Essigsäure, Methanol und Methylendichlorid.

Die gewaschene L-kic-L-his-L-pro- (P) (4,7 g) wird in ein Gemisch von 188 ml Methanol und 47,1 ml Triäthylamin eingetragen. Man rührt das Gemisch 5 Tage bei Raumtemperatur und lässt es dann etwa 6 Tage bei Raumtemperatur stehen. Anschliessend filtriert man, dampft das Filtrat zur Trockene ein und reinigt das Produkt durch Elution durch eine Kieselgelsäule (Verhältnis 200:1). Als Elutionsmittel verwendet man ein Gemisch aus 70 Volumteilen Chloroform, 30 Volumteilen Methanol und 3 Volumteilen Wasser. Das erhaltene L-kic-L-his-L-pro-OCH3 wird durch Gefriertrocknung isoliert. Die Ausbeute beträgt 1,54 g.

(C) Herstellung von L-2-Ketoimidazolidin-5-carbonyl-

L-histidyl-L-prolin-amid Man trägt 0,8 g L-kic-L-his-L-pro-OCH3 in etwa 10 ml flüssiges Ammoniak ein und lässt den Ansatz 7 Tage bei Raumtemperatur stehen. Anschliessend löst man das Reaktionsgemisch in Methanol. Der bei der Vakuumeindampfung erhaltene Rückstand wird gefriergetrocknet. Man erhält als Hauptprodukt L-kic-L-his-L-pro-NH2.

Beispiel 2

Herstellung von D,L-2-Ketopiperidin-6-carbonyl-L-histi-

dyl-L-prolin-OCH3; -NH2 Unter Einsatz von D,L-2-Ketopiperidin-6-carbonsäure anstelle von L-2-Ketoimidazolidin-5-carbonsäure werden analog

Beispiel 1B und IC die Tripeptide D,L-kpc-L-his-L-pro-OCH3 und D,L-kpc-L-his-L-pro-NH2 hergestellt.

Beispiele für weitere nach der allgemeinen Methode von Beispiel 1B hergestellte Tripeptide sind: 5 kpc-his-L-tca-OC2Hs

D,L-pca-L-his-L-tca-OC6H12 und kic-his-L-pip-OC(CH3)3.

Diese Ester werden gemäss Beispiel IC in die entsprechenden Amide übergeführt.

10

Beispiel 3

(A) Herstellung von L-Pyroglutamyl-L-histidin-OCH3 In einem mit Rührer und Kühlvorrichtung ausgestatteten Gefäss werden 72,9 g L-Histidinmethylester-dihydrochlorid 15 und 39,1 g L-Pyroglutaminsäure sowie 1200 ml Acetonitril vorgelegt. Man kühlt die Mischung unter Rühren auf 0°C ab. Anschliessend fügt man innerhalb von 10 Minuten unter Beibehaltung der Temperatur von 0° C allmählich 84 ml Triäthylamin hinzu. Dann lässt man den Ansatz 15 Minuten stehen. 20 Hierauf wird eine Lösung von 76,5 g Dicyclohexylcarbodiimid in 180 ml Acetonitril allmählich innerhalb von 5 bis 10 Minuten eingetragen. Man hält die entstehende Mischung 30 Minuten bei 0° C, lässt sie auf Raumtemperatur erwärmen und rührt sie 24 Stunden bei Raumtemperatur. Anschliessend fil-25 triert man die Mischung und wäscht den Filterkuchen dreimal mit jeweils 100 ml Acetonitril aus. Das Filtrat wird verworfen.

Der ausgewaschene Filterkuchen wird in Trichter viermal jeweils mit 150 ml Methanol aufgeschlämmt. Das dabei erhaltene Filtrat wird im Vakuum bis auf 300 ml eingeengt und an-30 schliessend langsam unter Rühren mit 1200 ml Diäthyläther versetzt. Man lässt die Mischung über Nacht stehen (ein 30mi-nütiges Stehenlassen reicht aus) und filtriert anschliessend. Der Filterkuchen wird zweimal mit jeweils 75 ml eines Gemisches aus 9 Volumteilen Diäthyläther und 1 Volumteil Methanol 35 ausgewaschen und anschliessend 2 Stunden mit 500 ml Chloroform aufgeschlämmt. Man filtriert die Aufschlämmung und wäscht den Filterkuchen viermal mit jeweils 45 ml Chloroform.

Der ausgewaschene Filterkuchen (42,1 g) wird in 168 ml 4o Methanol eingetragen. Man erhitzt den Ansatz rasch bis zum Sieden und filtriert ihn in heissem Zustand. Das Filtrat wird nach Abkühlung 3 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Dabei fallen weisse Kristalle von L-Pyroglutamyl-L-histi-din-OCH3 aus. Die Kristalle werden abfiltriert, mit 10 ml Me-45 thanol ausgewaschen und getrocknet. Man erhält 24,1 g (28,7 %) L-Pyroglutamyl-L-histidin-OCH3 vom Fp 208 bis 210° C. Die dünnschichtchromatographische Analyse ergibt einen Reinheitsgrad von 99%.

so (B) Herstellung von L-Pyroglutamyl-L-histidin-hydrazid In einem mit Thermometer und Rührer ausgestatteten und in ein Eisbad gestellten Gefäss werden 33,6 g L-Pyroglut-amyl-L-histidin-OCH3 in 640 ml Methanol gelöst. Wenn die Lösung eine Temperatur von 10° C erreicht hat, trägt man in-55 nerhalb von 5 Minuten allmählich 400 ml mindestens 97 %iges wasserfreies Hydrazin ein, wobei man die Temperatur unter 20° C hält. Dann rührt man den Ansatz weitere 6 Minuten bei 18 bis 20° C und überträgt ihn dann in ein zweites Gefäss, wo die flüchtigen Anteile im Vakuum abgedampft werden. 60 Der erhaltene weisse Feststoff wird neuerlich in 1040 ml Äthanol-2BA (mit Benzol denaturiertes absolutes Äthanol) dispergiert und das entstehende Gemisch vom Äthanol befreit. Dieser Prozess der Dispergierung und anschliessenden Äthanolabdampfung wird wiederholt.

65 Der erhaltene weisse Feststoff wird sodann in 800 ml DMF dispergiert. Die Dispersion wird im Vakuum bis auf ein Gewicht von 230 g eingedampft. Man dispergiert das eingedampfte Material in 800 ml Äthanol-2BA, lässt die Dispersion

617 667

8

45 Minuten bei Raumtemperatur stehen und filtriert. Der Filterkuchen wird zweimal mit jeweils 80 ml Äthanol-2BA ausgewaschen und getrocknet. Man dispergiert das trockene Produkt in 3200 ml Methanol und erhitzt den Ansatz bis zum Sieden. Anschliessend lässt man das Gemisch unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen, filtriert und wäscht den Filterkuchen zweimal mit jeweils 60 ml Methanol aus. Nach Vakuumtrocknung erhält man 25,69 g (76,5%) L-Pyroglutamyl-L-hi-stidin-hydrazid. Die dünnschichtchromatographische Analyse ergibt, dass das Produkt im wesentlichen rein ist.

(C) Herstellung von L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-thiazolidin-4-carbonsäureamid Man suspendiert 800 mg (3 mMol) L-Pyroglutamyl-L-hi-stidinhydrazid in 80 ml DMF, kühlt die Suspension auf -20° C ab und stellt den pH-Wert mit 5,9 m HCl in THF auf 1,5 ein. Anschliessend fügt man 4 ml 10%iges Isoamylnitrit in DMF hinzu. Man rührt den Ansatz 25 Minuten, wobei man die Temperatur bei —20° C hält. Hierauf fügt man 500 mg (3 mMol) L-Thiazolidin-4-carbonsäure hinzu und stellt den pH-Wert mit 4,1 ml Triäthylamin auf 8,5 ein. Dann lässt man das Gemisch 7 Tage bei -15° C stehen. Anschliessend wird das DMF im Vakuum abgedampft. Man löst den Rückstand in 40 ml 0,4 m Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH =10) und extrahiert die Lösung viermal mit einem Gemisch aus 30 ml n-Bu-tanol und 40 ml Chloroform. Die wässrige Schicht wird eingedampft und der Rückstand mit 50, 25 und nochmals 25 ml Methanol extrahiert. Die vereinigten Methanolextrakte werden im Vakuum eingedampft. Als Rückstand verbleibt L-Py-roglutamyl-L-histidyl-L-thiazolidin-4-carbonsäure.

Man löst die L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-thiazolidin-4-carbonsäure (615 mg; 1,5 mMol) in 30 ml DMF. Die Lösung wird mit 260 mg (1,7 mMol) HBT versetzt und mit Triäthylamin auf einen pH-Wert von 4 eingestellt. Anschliessend fügt man 180 mg (3,4 mMol) NH4C1 und hierauf 385 mg (1,7 mMol + 10% Überschuss) DCC1 hinzu. Der Ansatz wird sodann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend filtriert. Man dampft das Filtrat ein, löst den Rückstand in 20 ml eines Elutionsmittels (Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis 80:20:2) und gibt die Lösung auf eine mit 200 g Kieselgel gefüllte Säule auf. Die das gewünschte L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-thiazolidin-carbonsäureamid enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft; man erhält 370 mg des Produkts, das sich aufgrund der dünn-schichtchromatographischen Analyse als im wesentlichen rein erweist.

Weitere nach dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 3 herstellbare Tripeptide sind:

L-kic-L-his-L-pro-NH2 D,L-kpc-his-L-pip-NH2 pca-his-L-pip-NH2 L-kpc-his-L-pip-NH2 kic-his-L-tca-NH2.

In einigen Fällen kann ein N3im-substituiert-L-his enthaltendes Produkt in Form des Jodids eluiert werden. Aus diesem erhält man das freie Tripeptid durch Neutralisation, beispielsweise mit Dowex 1 (Hydroxid).

Beispiele für N3im-substituiert-his enthaltende Tripeptide, welche aus dem entsprechenden Tripeptid analog dem allgemeinen Verfahren hergestellt werden können, sind: kic-N3im-(CH2)2-COOH-his-L-tca-NH2 und pca-N3un-cyclohexyl-D,L-his-L-tca-NH2.

Zur Herstellung von Tripeptidamiden eignen sich ausser den vorstehend beschriebenen Verfahren auch die im vorgenannten Schrifttum erläuterten Synthesemethoden für Tripeptide vom TRH-Typ. Auf die betreffenden Literaturstellen wird hier ausdrücklich Bezug genommen.

Die erfindungsgemäss hergestellten Tripeptide besitzen antidepressive Wirkung sowie eine Thyrotropinabgabe anregende Hormonaktivität. Die antidepressive Wirkung beruht auf einer Stimulierung des Zentralnervensystems und wurde durch einen an typischen erfindungsgemässen Tripeptiden vorgenommenen in vivo-Test, der auf der Wiederherstellung der antikonvulsiven Wirkung von Methazolamid bei mit Picolinsäure behandelten Mäusen beruht, bestimmt. Die Bestimmung der die Thyrotropinabgabe stimulierenden Aktivität der erfindungsgemässen Tripeptide erfolgte nach einem in vivo-Test, wie er im wesentlichen von R.S. Harris et al. in «Vitamins and Hormone» 29 (1971), Seiten 3 und 4 beschrieben wird.

In einigen Fällen zeigten die erfindungsgemäss hergestellten Tripeptide im Gegensatz zu TRH eine Aktivitätsdifferenzierung; beispielsweise erwies sich ihre antidepressive Wirksamkeit als höher als die die Thyrotropinabgabe fördernde Hormonaktivität. Diese differenzierte Wirksamkeit bringt den Vorteil mit sich, dass sich die Tripeptide bei richtiger Dosierung besonders gut für die Behandlung von Depressionen eignen, ohne eine merkliche Thyrotropinfreisetzung zu verursachen, wenn eine solche nicht erwünscht oder nicht notwendig ist.

Tabelle I zeigt die Wirkung für mehrere erfindungsgemäss hergestellte Produkte. Die Werte wurden nach den vorstehend beschriebenen Testvorschriften erhalten. Die in den mit «TS» bzw. «AD» überschriebenen Spalten angeführten Ergebnisse stellen jeweils die Vielfachen der thyrotropinstimulierenden Wirksamkeit bzw. der antidepressiven Wirksamkeit dar, wobei als Vergleichsbasis die betreffenden Aktivitäten von TRH (denen jeweils der Wert 1 zugeordnet wird) dienen. «N.F.» bedeutet, dass bei der getesteten Dosis nahezu keine Wirkung feststellbar ist.

Beispiel 6

(A) Herstellung von Boc(DNP)his-hydroxy-succinimid-ester Eine Lösung von 4,21 g (10 mMol) Boc-(DNP)-histidin und 1,15 g (10 mMol) N-Hydroxysuccinimid in 24 ml THF werden in einem Eisbad abgekühlt und bei 5 ° C mit 2,27 g (11 mMol) DCCI 2,5 Stunden behandelt. Innerhalb von 3 Minuten fiel Dicyclohexylharnstoff aus. Die Mischung wurde filtriert und das Filtrat zu einem viskosen Öl eingedampft. Das Aufschlämmen des Öls mit zwei Portionen Äther ergab einen gummiartigen Feststoff, der aufgrund von IR leichte Verunreinigungen durch DCCI zeigte. Das Rohprodukt wurde in 20 ml CH2C12 gelöst, filtriert und mit Cyclohexan ausgefällt. Die wolkige überstehende Lösung wurde dekantiert und das verbleibende Öl (5,06 g) im Vakuum auf konstantes Gewicht getrocknet.

(B) Herstellung von Boc-(DNP)-his-L-tca-OH Eine Suspension von 16,1 g (0,21 M) L-Thiazolidin-4-carbonsäure und 62,5 g (0,121 M) des Produktes gemäss A in 400 ml DMF wurde portionsweise mit einer Gesamtmenge von 24 ml (0,165 ml) N(C2HS)3 während 7 Stunden behandelt, wobei das pH der Reaktionsmischung auf 7,2 bis 7,6 (feuchtes pH-Papier im Bereich von 6 bis 8) gehalten wurde. Die Reaktionsmischung wurde 24 Stunden bei Zimmertemperatur magnetisch gerührt, wonach sich das gesamte Ausgangsprodukt gelöst hatte. Die Lösung wurde im Vakuum zu einem dicken Öl eingedampft, in 11 CH2C12 gelöst und mit 500 ml Portionen von verdünnter wässriger Zitronensäure und zwei 500 ml Portionen Wasser extrahiert. Die CH2C12-Schicht wurde über wasserfreiem MgSÖ2 getrocknet, filtriert und das Filtrat zu einem Gummi (63 g) eingedampft.

(C) Herstellung von Boc-(DNP)-his-L-tca-ONH4 Rohes Boc-(DNP)-his-L-tca-OH (63 g) wurde gelöst in konzentrierter NH4OH und lyophilisiert, wobei 56,9 g (85 %) des Dipeptidammoniumsalzes erhalten wurden.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

617 667

(D) Herstellung von Boc-(DNP)-his-L-tca-NH2

Eine Suspension von 29,59 g (0,0525 M) rohes Boc-

(DNP)-his-L-tca-ONH4,12,3 g (0,08 M) Hydroxybenzotri-azolhydrat und 14,3 g (0,267 M) NH4C1 in 250 ml CH2C12 wurden bei Zimmertemperatur mit 15 g (0,073 mm) DCCI in 45 ml CH2C12 behandelt. Die Suspension wurde magnetisch gerührt und die Einstellung des pH-Wertes auf 7,2 wurde periodisch durch Zugabe von insgesamt 13,8 ml (0,095 M) N(C2H5)3 vorgenommen. Nach 1,5 Stunden wurde die Suspension filtriert, das Volumen des Filtrats wurde mit CH2C12 auf 1,5 1 eingestellt und die Reaktionslösung mit 3 Portionen von 350 ml H20 extrahiert. Die CH2C12-Schicht wurde über MgS04 getrocknet, filtriert und das Filtrat zu einem dicken Öl eingedampft. Die dreimalige Ausfällung des Rohproduktes mit Petroläther aus CH2C12 ergab 28,4 g des Dipeptidamids, verunreinigt mit Boc-(DNP)-his-NH2 und Dicyclohexyl-harnstoff, jedoch frei von DCCI.

Lösungsmittel 90-10-0,5 (CHCl3-i-C3H20H-H20) gelöst und in eine 2,2 kg Silikagelkolonne, beschickt mit 90-10-0,5, gegeben. Die Kolonne wurde emulgiert mit 90-10-0,5. Nach Abtrennen von 3,4 1 des Eluats wurden 70 ml Fraktionen alle 45 Sekunden abgetrennt. Die Fraktionen 71 bis 182 enthielten das meiste des gewünschten Produktes, sie wurden zu konstantem Gewicht eingedampft und ergaben 12,95 g (46,3 %) Boc-(DNP)-his-L-tca-NH2. Die Fraktionen 45 bis 70 und 183 bis 237 ergaben 3,12 g (11,1%) eines Produktes, enthaltend Spuren von Verunreinigungen.

(E) Herstellung von (DNP)-his-L-tca-NH2 2HC1

Eine Lösung von 12,7 g (0,0237 M) in 318 ml Äthylacetat wurde in einem 1-1-Rundkolben, versehen mit einer Trockenvorrichtung und Gaszuführungsrohren auf -25° C gekühlt. Bei -25° C wurde 5 Minuten unter starkem Rühren der Lösung Chlorwasserstoffgas durchgeleitet. Eine grosse Menge des HCl wurde entfernt durch Leiten eines kräftigen N2-Stroms während 5 Minuten bei 0° C, wonach das meiste des Produktes ausgefallen war. Zu der Suspension wurden 600 ml Petroläther zugegeben, die Mischung filtriert und der Feststoff mehrere Male mit Äther gewaschen. Das Produkt (11,9 g) wurde im Vakuum 2 Stunden getrocknet und unmittelbar beim nächsten Verfahrensschritt verwendet.

(F) Herstellung von kpc-(DNP)-his-L-tca-NH2

Eine Suspension von 11,9 g (0,0234 ml) (DNP)-his-L-

tca-NH2. 2HC1, 3,72 g (0,026 M) L-2-Oxo-piperidin-6-car-bonsäure und 5,96 g (0,039) N-Hydroxybenzotriazolhydrat in 450 ml CH2C12 wurde bei Zimmertemperatur mit 6,95 g (0,034 M) DCCI 8 Minuten lang behandelt. Triäthylamin (7,5 ml, 0,052 M) wurde während des magnetischen Rührens zugefügt. Nach 5 Minuten hatte sich der grösste Teil des Ausgangsproduktes gelöst und die Lösung wurde mit weiteren 6,5 ml (0,045 M) N(C2HS)3 auf ein pH von 7,2 eingestellt. Nach einer gesamten Reaktionszeit von 1 Stunde wurde das Dicyclohexylharnstoff-Granulat filtriert und das Filtrat im Vakuum auf ein Volumen von 75 ml eingedampft und das Produkt mit 250 ml Petroläther ausgefällt. Die Ausfällung des Produktes aus CH2C12 mit Petroläther wurde zweimal wiederholt, um das meiste des nicht umgesetzten DCCI zu entfernen, und es wurden dann 28,5 g Rohprodukt erhalten in Form eines Gummis.

Das rohe Tripeptid wurde in einer Silikagelkolonne (Sili-kagel: Peptid = 75/1) beschickt mit 75-25-2,5 (CHCk3-Me0H-H20) gereinigt. Die Kolonne wurde eluiert mit dem Lösungsmittel 75-25-2,5, und zwar mit 70 ml/45 Sekunde/ Fraktion.

kpc-his-L-tca-NH2

Eine Lösung von 17 g (0,0304 M) kpc-(DNP)-his-L-tca-NH2 in 540 ml DMF wurde mit 60 ml Mercaptoäthanol 30 Minuten bei Zimmertemperatur behandelt. Die Lösungsmittel 5 wurden im Vakuum eingedampft und ergaben 29 g eines öligen Rückstandes, der in einer 2,2-kg-Silikagelkolonne unter Eluierung mit dem Lösungsmittel 70-30-3 (CHCl3MeOH-NH4OH) chromatographiert wurde. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden kombiniert, auf ein kleines Volu-10 men eingedampft, lyophilisiert und ergaben 10,72 g (90%) des Produktes in 99%iger Reinheit. Rf = 0,26 (Silikagel; 80:20:2 - CHCl3:CH3OH:NH4OH).

In ähnlicher Weise wurde hergestellt 1-kpc-L-his-L-pro-NH2, Rf = 0,42 (Silikagel; 80:20:2-CHCl3 : CH3OH : NH4OH).

15

Tabelle I

Die Thyrotropinabgabe stimulierende Hormonaktivität und antidepressive Wirksamkeit

20 Nr.

Peptid

TS

AD

Ver

gleich

TRH

1

1

1

L-2-Ketopiperidin-6-carbonyl-

25

L-histidyl-L-thiazolidin-4-carbox-amid

1

8

2

L-2-Ketopiperidin-6-carbonyl-

L-histidyl-L-prolinamid

1

4

3

D,L-2-Ketopiperidin-6-carbonyl-

30

L-histidyl-L-prolinamid

0,2

3

4

L-PyroglutamyI-D,L-histidyl-

L-thiazolidin-4-carboxamid

0,2

2

5

L-2-Ketoimidazolidin-5-carbonyl-

L-histidyl-L-prolinamid

0,1

1

35 6

D-2-Ketopiperidin-6-carbonyl-

L-histidyl-L-prolinamid

0,1

0,25

7

L-Pyroglutamyl-L-histidyl-

L-2-piperidincarboxamid

1

1

40

Die in Tabelle I aufgeführten Werte zeigen deutlich die pharmakologische Wirksamkeit und unerwartete Differenzierung der TS- bzw. AD-Aktivität der erfindungsgemässen Pep-45 tide.

Aufgrund ihrer in vivo-Wirksamkeit als Thyrotropinabga-be-Aktivatoren und als Zentralnervensystem-Stimulantien (infolge ihrer antidepressiven Wirkung) können die erfindungsgemäss hergestellten Peptide erfolgreich zur Behandlung von so Warmblütern eingesetzt werden, welche an einer Zentralnervensystemdepression leiden und/oder einer Aktivierung der Thyrotropinabgabe bedürfen.

Die Peptide können auf beliebige herkömmliche Weise, beispielsweise oral, parenteral, intravenös, sublingual, durch 55 Insufflation oder in Form von Suppositorien, verabfolgt werden.

Die Verabreichung erfolgt in zur Erzielung der gewünschten Wirkung ausreichenden Dosen. Im allgemeinen verwendet man - abhängig von der Verabreichungsmethode - Dosen von 60 jeweils 0,05 bis 100 mg. Die Zeitabstände zwischen den Verabreichungen hängen vom angestrebten therapeutischen Erfolg ab. Man kann die Tripeptide allein oder zusammen mit pharmakologisch verträglichen Trägern verabreichen. Nach Bedarf können auch Formulierungen mit anderen pharmakologischen 65 Wirkstoffen angewendet werden.

s

Claims (10)

617 667

1. M2 über eine Peptidbindung mit M3—(£), wobei (P) ein geeigneter Harzträger mit carbonsäurebindenden Stellen ist, zu M2-M3— (£) verknüpft,

1. Verfahren zur Herstellung eines Tripeptidamids der Formel

Mi—M2—M3—NH2 (I)

sowie deren Säureadditionssalze,

worin Mt der Rest einer Aminosäure aus der Gruppe kic, kpc oder pca, M2 der Rest his oder N3,m-substituiert-his ist, M3 den Rest einer Aminosäure aus der Gruppe L-pip, L-pro und L-tca bedeutet und wobei pca und L-pro im Tripeptid nicht gemeinsam vorkommen, dadurch gekennzeichnet, dass man die entsprechenden Aminosäuren bzw. deren aktivierte Derivate in beliebiger zeitlicher Reihenfolge und unter intermediärem Schutz von jeweils von der Reaktion auszuschliessenden reaktiven funktionellen Gruppe miteinander kondensiert und dass man zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Carbo-xylgruppe des terminalen Aminosäureesters M3 in die Amid-gruppe überführt.

2. M2-M2- (P) über eine Peptidbindung mit Mi zu Mi-M2-M3-(P) verknüpft,

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Mi, M2 und M3 stufenweise zu M2—M3 verknüpft und dieses anschliessend in Mi—M2-M3—NH2 überführt.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Mi—M2—M3— (P) mit ROH, worin R einen niederen Alkyl-rest bedeutet, unter Bildung von M!-M2-M3-OR und

® —H umestert,

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man M3-NH2 herstellt und darauf Ml5 M2 und M3-NH2 stufenweise zu Mi-M2-M3-NH2 verknüpft.

4. Mi-M2-M3-OR von (?) -H abtrennt und

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man M3—NH2 herstellt und dann zunächst M2 über eine Peptidbindung mit einer Komponente aus der Gruppe und M3-NH2 verknüpft und das erhaltene Dipeptid bzw. Dipeptid-amid anschliessend über eine Peptidbindung mit dem noch fehlenden Baustein verbindet.

5. den Rest -OR von Mi-M2-M3-OR mittels Umsetzung mit Ammoniak durch -NH2 ersetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass in M2 und Mi enthaltene Aminogruppen bei der zum Tripeptid führenden Verknüpfungsreaktion nach Bedarf intermediär geschützt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der letzten Stufe das Dipeptidamid M2-M3-NH2 kondensiert wird mit einer Aminosäure Mx.

7. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung des Tripep-tids L-pca-L-his-M3-NH2, dadurch gekennzeichnet, dass man einerseits L-pca-L-his-N3 und anderseits M3NH2 herstellt und diese beiden anschliessend miteinander kondensiert.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verknüpfung gemäss Stufe (1) mit Hilfe einer Verbindung X—M2, wobei X eine Amino-Schutzgruppe darstellt, durchführt, und aus dem erhaltenen X-M2-M3- (P) durch Abspaltung der Schutzgruppe M2-M3- (P) herstellt.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzgruppe X eine Gruppe vom Urethan-Typ ist.