BRPI0709282B1 - vacina contra estreptococos - Google Patents

Abstract

vacina contra estreptococos. a invenção se refere a composições de vacina ou subunidades imunogênicas as quais podem compreender pelo menos um polipeptídio de streptococcus equi e aos métodos para preparar e/ou formular tais composições. a invenção também se refere ao uso de tais composições de subunidades, tal como a um método para eliciar uma resposta imunogênica ou uma resposta imunoprotetora, a qual pode compreender a administração da composição a um mamífero suscetível à infecção por estreptococos.

Description

(54) Título: VACINA CONTRA ESTREPTOCOCOS (73) Titular: MERIAL, INC. Endereço: 3239 SATELLITE BOULEVARD, BUILDING 500, DULUTH, GEÓRGIA 30096, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: JEAN-CHRISTOPHE FRANCIS AUDONNET; JULES MAARTEN MINKE.

Código de Controle: 7205567C1923DA23 E237858681BEB9F5

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 21/11/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 21/11/2018

Assinado digitalmente por:

Alexandre Gomes Ciancio

Diretor Substituto de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: VACINA

CONTRA ESTREPTOCOCOS

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

Este pedido reivindica o beneficio do Pedido de

Patente Provisória americana número 60/786.936 depositado em 29 de março de 2006.

Os pedidos precedentes e todos os documentos citados neles ou durante seus processos (documentos citados nos pedidos) e todos os documentos citados ou referidos nos documentos citados nos pedidos, e todos os documentos por meio deste citados ou referidos (documentos por meio deste citados), e todos os documentos citados ou referidos em documentos por meio deste citados, junto com quaisquer instruções do fabricante, descrições, especificações de produto, e manuais de produtos para quaisquer produtos por meio deste mencionados ou em qualquer documento por meio deste incorporado por referência, são por meio deste incorporados por referência, e podem ser empregados na prática da invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere aos polipeptidios de bactérias estreptocócicas, mais particularmente de

Streptococcus equi, os quais podem ser usados para prevenir, diagnosticar e/ou tratar infecção por estreptococos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Streptococcus equi (S. equi subsp. equi) é um coco gram-positivo que tem uma grande cápsula. S. equi é o agente causador de garrotilho em eqüinos, caninos e Camelideos, notavelmente em cavalos, jumentos, mulas, cachorros, camelos e dromedários. 0 garrotilho é uma infecção altamente contagiosa do trato respiratório superior e linfonodos associados. Em eqüinos, a doença é caracterizada por febre, descarga nasal mucopurulenta espessa, inchaço e formação de abscesso dos linfonodos submandibulares, submaxilares, e retrofaringeos. Em casos severos, a infecção pode se tornar disseminada com formação de abscesso interno e externo e pode, em último caso, resultar em morte. Ele pode ocorrer em cavalos susceptíveis de qualquer idade. A transmissão ocorre através do contato direto ou indiretamente através de fômites que foram contaminados por secreções do trato respiratório ou saliva. Embora raro, S. equi é um patógeno zoonótico muito sério de Camelideos (Sechi L A et al, New Microbiol, 1999, 22(4) :

383-387), de humanos infectados por contato com cavalos (Elsayed S et al, Clin Microbiol Infect, 2003, 9(8): 869872). Em humanos, a mortalidade foi alta (25%), especialmente entre pacientes mais velhos e pacientes com endocardite, meningite e infecção disseminada (Bradley S F et al, Rev Infect Dis, al, South Med J, 2006,

Após a infecção,

S. equi geralmente tem um período de incubação de 3 a 14 dias antes do início dos sinais clínicos.

O organismo transloca rapidamente a mucosa para dentro dos vasos linfáticos e daí se move para um ou mais dos linfonodos regionais levando à inflamação e edema.

Os linfonodos aumentados logo desenvolvem centros purulentos com liquefação flutuante. Os linfonodos submandibulares tipicamente se rompem externamente através da pele, enquanto que abscessos formados nos linfonodos retrofaríngeos tipicamente se rompem para dentro da bolsa gutural. Isto pode levar até 2 semanas para ocorrer após o início dos sinais.

A maioria (70%) dos animais é imune a ataques posteriores de garrotilho após recuperação de uma primeira infecção. Entretanto, uma proporção substancial de animais (30%) pode contrair a doença uma segunda vez, e destes uma pequena proporção pode contrair a doença mais que duas vezes (Todd A.G., J. Comp. Pathol. Ther., 1910, 23, 212229). Até 10% dos animais afetados continua a disseminar S. equi intermitentemente por períodos prolongados após os sinais clínicos terem terminado. Este estado de portador é causado provavelmente por drenagem incompleta do exsudato das bolsas guturais (empiema) e/ou sinus após a ruptura do abscesso formado nos linfonodos retrofaringeos (Newton J R et al, Vet Record, 1997, 140: 84-90). O ressecamento e endurecimento do exsudato levam a formação de corpos discretos chamados condróides que permanecem na bolsa gutural por vários anos. Está se tornando cada vez mais reconhecido em todo o mundo que o transporte sub-clinico persistente de S. equi é fundamental para a persistência desta infecção entre os surtos (Fintl C et al, Vet Record, 2000, 147: 480- 484; Newton J R et al, Vet Record, 1997, 140: 84-90; Newton J R et al, Equine Vet J, 2000, 32: 515526; Timoney J F et al, Vet Record, 1998, 142: 648) e isto permanece verdadeiro apesar do advento das vacinas modernas (Newton R et al, Vet Record, 2005, 156: 291-292).

A proteção contra a doença é mediada primariamente por anticorpos das subclasses IgA e IgG produzidos localmente na nasofaringe.

Anticorpos séricos para Streptococcus equi (S. equi) podem ser medidos por uma variedade de ensaios incluindo ELISA (Reif et al., Proc. Am. Assoe. Equine Practitioners, 1982, 27, 33-40), o teste de proteção de camundongo (Bazely PX., Aust. Vet. J. , 1943, 19, 62-85), e o teste de precipitina de difusão em gel.

Vacinas disponíveis comercialmente que consistem em bacterina inativada pelo calor ou extratos ricos em proteína M têm sido amplamente usadas no campo. Embora eficazes em estimular anticorpos bactericidas séricos, estas vacinas aparentemente não estimulam um nível útil de anticorpo nasofaríngeo e assim o nível de proteção estimulada em uma população de cavalos é desanimadora. Uma cepa avirulenta geneticamente modificada de S. equi administrada intranasalmente foi recentemente mostrada como estimuladora de anticorpos nasofaríngeos locais similares àqueles encontrados em cavalos imunes convalescentes. Cavalos vacinados eram imunes a estímulo experimental subseqüente com S. equi virulento (Timoney & Galan, 1985, The protective response of the horse to an avirulent strain of Streptococcal equi. In Y. Kimura, S. Kotami & Y. Shokawa, eds., Recent Advances in Streptococci and Streptococcal disease. Reedbooks, Surrey, England, p. 294295). Portanto parece que uma vacina eficaz para garrotilho deverá ser capaz de estimular uma resposta imune nasofaríngea.

Vacinas do tipo bacterina frequentemente causam reações locais e sistêmicas indesejáveis que consistem em edema, endurecimento, rigidez, febre transitória, e neutrofilia, efeitos que são provavelmente devidos ao peptidoglicano da parede celular. Além disso, púrpura hemorrágica pode se desenvolver após a vacinação de cavalos previamente sensibilizados a antigenos estreptocócicos.

Streptococcus zooepidemicus (S. equi subsp. zooepidemicus) é uma importante causa de doença respiratória e metrite em equinos. S. zooepidemicus é um patógeno oportunista que causa infecções respiratórias purulentas de cavalos desmamados menores de um ano de idade e infecções uterinas em éguas mais velhas. Na situação de infecção concomitante por influenza, alta temperatura ou estresse devido ao transporte, ele pode ser um patógeno fatal rápido e devastador no trato respiratório. Embora raro, S. zooepidemicus é um patógeno zoonótico muito grave de Camelídeos (Younan M et al, J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health, 2005, 52(3): 142-146), de humanos infectados pelo contato com cavalos (Downar J et al, J Clin Microbiol, 2001, 39(6): 2358-2359; Ural 0 et al, Scand J Infect Dis, 2003, 35(3) : 206-207) e de animais caninos que têm doença respiratória, notavelmente já infectados por Bordetella bronchiseptica (Chalker V J et al, Vet Microbiol, 2003, 95(1-2): 149-156).

Mamíferos afetados por S. equi podem carregar a bactéria por vários meses, dentre outros lugares, nas bolsas guturais e, assim disseminam e agem como reservatórios de S. equi. Embora S. equi seja altamente sensível à penicilina e outros antibióticos, o tratamento com antibiótico é, por várias razões, o menos eficaz. A fim de combater a doença e mitigar complicações clínicas sérias, pesquisas têm sido focadas principalmente em desenvolver vacinas eficazes.

O desenvolvimento tem sido lento, possivelmente em parte, porque as vacinas devem ser capazes de controlar a infecção sem induzir uma resposta inflamatória acentuada.

Portanto, é desejável desenvolver vacinas que tenham um alto grau de imunogenicidade e que exibam boa segurança com pouco ou nenhum efeito colateral.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção se refere a composições de vacina ou subunidades imunogênicas as quais podem compreender pelo menos um polipeptídio da invenção; por exemplo, polipeptídios de Streptococcus equi. A invenção, portanto, também se refere aos métodos para preparar e/ou formular tais composições, por exemplo, misturar os polipeptídios com um veículo, excipiente, diluente, ou veículo e/ou adjuvante e/ou estabilizante farmacêutica ou veterinariamente adequado. A uso das tais composições de método para desencadear uma invenção também se refere ao subunidades; por exemplo, um resposta imunogênica ou uma resposta imunoprotetora, a qual pode compreender a administração da composição a um mamífero suscetível à infecção por estreptococos.

A invenção se refere a composições de vacina ou subunidades imunogênicas as quais compreendem pelo menos um vetor de expressão recombinante que codifica pelo menos um polipeptidio da invenção, capaz de expressar in vivo este polipeptidio em um mamífero suscetível à infecção por estreptococos. Neste documento, tal composição de vacina ou imunogênica a qual pode compreender pelo menos um vetor de expressão recombinante é chamada uma composição de vacina ou imunogênica recombinante. A invenção, portanto, se refere também aos métodos para preparar tais vetores, por exemplo, inserir pelo menos um polinucleotídeo que codifica um polipeptidio de acordo com a invenção em um vetor de plasmídeo ou vetor viral tal que o vetor contenha e expresse o polinucleotídeo no hospedeiro. A invenção, portanto refere-se aos métodos para formular tais composições de vacina ou imunogênicas recombinantes, por exemplo, misturar os vetores com um veículo, excipiente, diluente, ou transportador e/ou um adjuvante e/ou estabilizante veterinário ou farmaceuticamente aceitável. A invenção também se refere ao uso das tais composições de vacina ou imunogênicas recombinantes; por exemplo, um método para desencadear uma resposta imunogênica ou uma resposta imune protetora, a qual pode compreender a administração da composição a um mamífero suscetível à infecção por estreptococos.

Por definição, mamíferos suscetíveis à infecção por estreptococos abrangem equinos (cavalos, éguas, potros, jumentos e mulas), camelídeos (isto é, camelos, dromedários), caninos (isto é, cachorros, cadelas, filhotes de cachorros), bovinos (isto é, bois, vacas, bezerros), ovinos (isto em carneiros, ovelhas, cordeiros) e humanos.

Mamíferos suscetíveis a infecção por Streptococcus equi abrangem eqüínos (isto é, cavalos éguas, potros, jumentos e mulas), camelídeos (isto é, camelos, dromedários), caninos (isto é, cachorros, cadelas, filhotes de cachorros) e humanos. Mamíferos suscetíveis a infecção por Streptococcus zooepidemicus abrangem eqüínos (isto é, cavalos, éguas, potros, jumentos e mulas), caninos (isto é, cachorros, cadelas, filhotes de cachorros), camelídeos (isto é, camelos, dromedários), e humanos.

A invenção também se refere aos usos de vetores de expressão recombinantes; por exemplo, a um método para produzir um polipeptídio da invenção, o qual pode compreender cultivar, crescer ou propagar células procarióticas ou eucarióticas transformadas para conter os vetores de expressão recombinantes e para expressar um polinucleotídeo que codifica o polipeptídio sob condições adequadas para expressão, e cultivar ou isolar ou separar o polipeptídio de células transformadas para expressá-lo.

A invenção ainda se refere aos métodos para induzir em um eqüíno, isto é, um cavalo, um jumento e uma mula, uma resposta imune protetora ou imunogênica contra bactérias estreptocócicas, tais como Streptococcus equi ou Streptococcus zooepidemicus, os quais podem compreender a administração, ao equino, de uma composição de vacina, subunidade imunogênica da invenção ou uma composição de vacina ou subunidade imunogênica recombinante da invenção.

A invenção ainda se refere aos métodos para induzir em um canino, isto é um cachorro, uma cadela, um filhote, uma resposta imunogênica contra bactérias estreptocócicas, tais como Streptococcus equi ou Streptococcus zooepidemicus, os quais podem compreender administrar ao canino uma composição de vacina ou subunidade imunogênica da invenção ou uma composição de vacina ou subunidade imunogênica recombinante da invenção.

A invenção ainda se refere aos métodos para induzir em um Camelídeo, isto é, um camelo e um dromedário, uma resposta imunogênica contra bactérias estreptocócicas, tais como Streptococcus equi ou Streptococcus zooepidemicus, os quais podem compreender administrar ao Camelideo uma composição de vacina ou subunidade ou uma composição de vacina ou imunogênica da invenção subunidade imunogênica recombinante da invenção.

A invenção ainda se refere aos métodos para induzir em um humano uma resposta imunogênica contra estreptocócicas, tais como Streptococcus

Streptococcus zooepidemicus, os quais podem administrar ao humano uma composição de bactérias equi ou compreender vacina ou subunidade imunogênica da invenção ou uma composição de vacina ou subunidade imunogênica recombinante da invenção.

A invenção ainda se refere a um polipeptidio que tem uma sequência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste nos polinucleotídeos identificados nas SEQ ID NOS: 17, 19, 21, 23 e 25. A invenção também se refere a um polipeptidio que tem uma identidade que é igual ou maior do que cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% com uma sequência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste nos polipeptídios identificados nas SEQ ID NOS: 17, 19, 21, 23 e 25. A invenção se refere a um polipeptidio selecionado do grupo que consiste de polipeptídios identificados nas SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52. A invenção também

se refere	a	um	análogo	de polipeptidio	que tem uma
identidade	que	é	igual ou	maior do que cerca	de 70%, 75%,
80%, 85%,	90%,	91	3- QO2- O f Já. Q f	93%, 94%, 95%, 96%,	97%, 98%, ou

99% com um polipeptidio selecionado do grupo que consiste nos polipeptidios identificados nas SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52. A invenção também se refere a um fragmento de polipeptidio, contento pelo menos um epitopo, o qual é parte de um polipeptidio selecionado do grupo que consiste nos polipeptidios identificados nas SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52 ou seus análogos, e notavelmente um fragmento contendo pelo menos um epitopo selecionado do grupo que consiste nos polipeptidios identificados nas SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e

58. E, a invenção se refere aos usos, composições e métodos que envolvem tais polipeptidios, seus análogos ou seus fragmentos conforme descrito aqui.

Desta forma, a invenção se refere a um vetor de expressão recombinante em que o dito vetor contém pelo menos um polinucleotídeo o codifica para um polipeptidio selecionado do grupo de polipeptidios identificados nas SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e

52, e suas combinações. A invenção também se refere a um vetor de expressão recombinante, em que o dito vetor tem pelo menos um polinucleotídeo o qual codifica para um análogo de polipeptidio que tem uma identidade que é igual ou maior do que cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% com um polipeptidio selecionado do grupo que consiste nos polipeptidios identificados nas SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52, e suas combinações. A invenção também se refere a um vetor de expressão recombinante, em que o dito vetor tem pelo menos polinucleotídeo o qual codifica para um fragmento de polipeptidio, contendo pelo menos um epitopo que é parte de um polipeptidio selecionado do grupo que consiste nos polipeptidios identificados nas SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52 ou seus análogos e notavelmente um fragmento selecionado do grupo que consiste no grupo que consiste nos polipeptidios identificados nas SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e 58. A invenção se refere a um vetor de expressão recombinante, em que o dito vetor tem pelo menos um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste nos polipeptidios identificados pelo grupo que consiste nos polinucleotídeos identificados nas SEQ ID NOS: 17, 19, 21, 23, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 47, 49, 51, 53, 55 e 57, e suas combinações. A invenção também se refere a um vetor de expressão recombinante, em que o dito vetor tem pelo menos uma identidade que é igual ou maior do que cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,

95%, 96%,	97%	, 98%, ou 99% com	um	polinucleotídeo
selecionado	do	grupo que consiste	nos	polinucleotideos
identificados nas SEQ ID NOS: 17, 19,	21,	23, 25, 31, 33,
35, 37, 39,	47,	49, 51, 53, 55 e 57, e	suas	combinações. E,

a invenção se refere aos usos, composições e métodos que envolvem tais vetores conforme descrito aqui.

Os polinucleotideos da invenção podem ser usados em reações de hibridização (por exemplo, Northern ou Southern blots, em microarranjos de ácido nucléico ou em chips de genes), em reações de amplificação (por exemplo, reação em cadeia da polimerase ou PCR) .

Deve ser observado que a invenção fornece polinucleotideos que podem compreender sequências complementares àquelas descritas acima.

Polinucleotideos de acordo com a invenção podem ser preparados de várias formas (por exemplo, por síntese química, de bibliotecas genômicas ou de cDNA, do estreptococo em si, etc.) e pode ter várias formas (por exemplo, fita simples, fita dupla, iniciadores, sondas etc. ) .

Os polinucleotideos de acordo com a invenção podem ser marcados, por exemplo, com um marcador radioativo ou fluorescente.

Os polinucleotideos de acordo com a invenção podem ser marcados, por exemplo, com um marcador radioativo ou fluorescente. Isto é particularmente útil como um iniciador ou como uma sonda.

Além disso, o termo polinucleotídeo inclui DNA, RNA, e também seus análogos, tais como aqueles contendo esqueletos modificados.

Ainda adicionalmente, a invenção prevê uma preparação de anticorpo que pode compreender pelo menos um anticorpo específico para um polipeptidio da invenção. Este anticorpo pode ser policlonal ou monoclonal. A preparação de anticorpo pode compreender também um fragmento do dito anticorpo.

A invenção também envolve um kit de diagnóstico para detectar infecção por bactérias estreptocócicas, incluindo pelo menos um polipeptidio de acordo com a invenção ou uma preparação de anticorpo que pode compreender pelo menos um anticorpo especifico para um polipeptidio da invenção. A invenção também envolve um método de diagnóstico para detectar infecção por bactérias estreptocócicas em mamíferos, o qual compreende usar um kit de diagnóstico da invenção e detectar em uma amostra o polipeptidio ou um anticorpo específico para aquele polipeptidio.

A invenção ainda diz respeito a um método de imunização passiva que pode compreender administrar a preparação de anticorpo a um mamífero suscetível à infecção por bactérias estreptocócicas ou infectado por bactérias estreptocócicas. Em particular, o método de imunização passiva compreende administrar a preparação de anticorpo a um eqüíno suscetível à infecção por bactérias estreptocócicas ou infectado por bactérias estreptocócicas, notavelmente suscetível à infecção por Streptococcus equi ou infectado por Streptococcus equi.

É observado que nesta descrição e particularmente nas reivindicações, termos tais como compreende, compreendido, compreendendo e semelhantes podem ter o significado atribuído a ele na lei de patentes americana; por exemplo, eles podem significar inclui, incluído, incluindo e semelhantes; e que termos tais como consistindo essencialmente em e consiste essencialmente em têm o significado atribuído a eles na lei de patentes americana, por exemplo, eles permitem elementos não explicitamente citados, mas excluem elementos que são encontrados na técnica anterior ou que afetam uma característica nova ou básica da invenção.

Estas e outras modalidades são descritas ou são óbvias a partir da, e abrangidas pela, seguinte Descrição

Detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A seguinte descrição detalhada, dada como exemplo, mas não pretendida para limitar a invenção unicamente às modalidades especificas descritas, pode melhor ser mais bem compreendida conjuntamente com os desenhos anexos, nos quais

FIG. 1: mostra as pontuações clínicas médias de camundongos vacinados e de controle após o estímulo com Streptococcus equi;

FIG. 2: mostra a porcentagem média da mudança na massa de camundongos vacinados e de controle após o estímulo com Streptococcus equi;

FIG. 3: mostra as pontuações médias de toques com

focinho	de	camundongos vacinados e	de controle após	o
estímulo	com	Streptococcus	equi;
FIG.	. 4	: mostra as	pontuações	clínicos	médias	de
camundongos	vacinados com	Sel631,	Sel681, e	Sla e	de

controle após o estímulo com Streptococcus equi;

FIG. 5: mostra a porcentagem média da mudança na massa de camundongos vacinados com Sel631, Sel681, e Sla e de controle após o estímulo com Streptococcus equi;

FIG. 6: mostra as pontuações médias de toques com o focinho de camundongos vacinados com Sel631, Sel681, Sla e de controle após o estímulo com Streptococcus equi (expressos como unidade formadora de colônia (ufc)) e

FIG. 7: mostra a porcentagem dos camundongos que sobreviveram e que não perderam mais do que 7% do peso de camundongos vacinados com Sel631, Sel681,

Sla e de controle após o estimulo com Streptococcus equi.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção se refere à identificação dos polipeptidios de

Streptococcus equi capazes, quando administrados a um mamífero, de desencadear uma resposta imunogênica ou imune, à identificação dos polinucleotideos que codificam estes polipeptidios. Estes polipeptidios são úteis para a produção de composições de subunidades imunogênicas ou vacinas de subunidades. Estes polinucleotideos são úteis para a produção de composições imunogênicas de

DNA, vacinas de DNA, composições imunogênicas de vetor viral recombinante ou vacinas de vetor viral recombinante.

A invenção diz respeito a composições, usos e métodos contra infecções causadas por bactérias da família

Streptococcal, causadas notavelmente por

Streptococcus equi, por exemplo, a doença do garrotilho em eqüinos, camelídeos, caninos e humanos, e contra infecções causadas caninos e humanos por Streptococcus zooepidemicus em eqüinos, camelídeos,

A invenção diz respeito aos polipeptidios, polinucleotídeos e genes obtidos ou derivados do

Streptococcus equi.

A presente invenção pode se referir também aos polipeptidios, polinucleotídeos e genes obtidos ou derivados de outros estreptococos, notavelmente de

Streptococcus zooepidemicus,

Streptococcus suis,

Streptococcus uberis,

Streptococcus dysgalactiae,

Streptococcus agalactiae,

Streptococcus pneumoniae,

Atreptococcus pyogenes.

Um aspeto particular da invenção é um polipeptidio selecionado das sequências

SEQ

ID NOS. 18, 20,

22, 24, 26,

48, 50 e 52.

O genoma completo de

Streptococcus equi está disponível na base de dados da

Sanger:

(http://www.sanger.ac.uk/Proj ects/S_equi/) .

Os polipeptidios são identificados como SEQ ID

18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e e por Se50, Sel459,

Se5 95,

Se528, Se358, Sel631, Sel681 e Sla, respectivamente.

Um aspeto particular da invenção é um polinucleotídeo selecionado das sequências de nucleotídeo SEQ ID NOS: 17,

19, 21, 23 e 25.

Os polinucleotídeos são identificados como SEQ ID

NOS.: 17, 19, 21, 23 e 25 e por Se50, Sel459, Se595, Se528 e Se358, respectivamente.

A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra maneira, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, tecnologia de DNA recombinante, e imunologia, que estão dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são explicadas inteiramente na literatura. Veja, por exemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^a ed., Cold Spring Harbor Press; DNA Cloning, Vols. I e II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); a série, Methods In Enzymology (S. Colowick e N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); e Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir e C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications).

Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve ser compreendido que esta invenção não está limitada a DNA, sequências de polipeptídios ou parâmetros de processo particulares já que tais podem, naturalmente, variar. Deve também ser compreendida que a terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades particulares da invenção somente, e não pretende ser limitante.

A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que compreendido geralmente por um versado na técnica a que a invenção pertence. Embora vários métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste documento possam ser usados na prática da presente invenção, os materiais e métodos preferidos são descritos aqui.

Pelo termo complementaridade ou complementar entende-se, para as finalidades do relatório descritivo ou das reivindicações, um número suficiente nos pares de bases complementares de oligonucleotídeos na sua sequência para interagir especificamente (hibridizar) com uma sequência de ácido nucléico alvo do polimorfismo gênico a ser amplificado ou detectado. Conforme conhecido daqueles versados na técnica, um grau muito alto de complementaridade é necessário para especificidade e sensibilidade envolvendo a hibridização, embora não precise ser 100%. Desta forma, por exemplo, um oligonucleotideo que é idêntico em sequência de nucleotídeos a um oligonucleotídeo por meio disso descrito, exceto por uma alteração ou substituição de base, pode funcionar de forma equivalente aos oligonucleotídeos descritos. Um gene de

DNA complementar ou cDNA inclui genes recombinantes sintetizados por transcrição reversa de RNA mensageiro(mRNA).

Uma reação cíclica mediada por polimerase refere-se a uma reação bioquímica na qual uma molécula molde ou uma população de moléculas molde é periodicamente e repetidamente copiada para criar uma molécula molde complementar ou moléculas molde complementares, aumentando desse modo o número das moléculas molde com o tempo.

Pelo termo porção detectável entende-se, para as finalidades do relatório descritivo ou reivindicações, uma molécula marcadora (isotópica ou não-isotópica) que é incorporada indiretamente ou diretamente em um oligonucleotídeo, em que a molécula marcadora facilita a detecção do oligonucleotídeo no qual ela está incorporada, por exemplo, quando o oligonucleotídeo é hibridizado a sequências polimórficas gênicas amplificadas. Desta forma porção detectável é usada de forma sinônima com molécula marcadora. A síntese dos oligonucleotídeos pode ser executada por qualquer de diversos métodos conhecidos daqueles versados na técnica. As moléculas marcadoras, conhecidas daqueles versados na técnica como sendo úteis para detecção, incluem moléculas quimioluminescentes, fluorescentes ou luminescentes. Várias moléculas fluorescentes são conhecidas na técnica, as quais são adequadas para uso para marcar um ácido nucléico para o método da presente invenção. O protocolo para tal incorporação pode variar dependendo da molécula fluorescente usada. Tais protocolos são conhecidos na técnica para a respectiva molécula fluorescente.

Amplificação de DNA conforme usado aqui, se refere a qualquer processo que aumenta o número de cópias de uma sequência de DNA específica por amplificar enzimaticamente a sequência de ácido nucléico. Uma variedade de processos é

conhecida.	Um dos mais	comumente usados é o	processo de
reação em	cadeia da polimerase (PCR) de Mull	is conforme
descrito	nas Patentes Americanas Nos. 4	.683.195 e
4.683.202.	Os métodos,	dispositivos	e reagentes descritos
nas Patentes Americanas Nos.	6.951.726;	6.927.024;
6.924.127;	6.893.863;	6.887.664;	6.881.559;	6.855.522;
6.855.521;	6.849.430;	6.849.404;	6.846.631;	6.844.158;
6.844.155;	6.818.437;	6.818.402;	6.794.177;	6.794.133;
6.790.952;	6.783.940;	6.773.901;	6.770.440;	6.767.724;
6.750.022;	6.744.789;	6.733.999;	6.733.972;	6.703.236;
6.699.713;	6.696.277;	6.664.080;	6.664.064;	6.664.044;
RE38.352;	6.650.719;	6.645.758;	6.645.720;	6.642.000;
6.638.716;	6.632.653;	6.617.107;	6.613.560;	6.610.487;
6.596.492;	6.586.250;	6.586.233;	6.569.678;	6.569.627;

6.566.103;

6.551.783;

6.514.750;

6.492.114;

6.468.743;

6.432.646;

6.403.341;

6.379.932;

6.355.422;

6.316.192;

6.300.073;

6.270.977;

6.261.431;

6.251.607;

6.221.595;

6.183.963;

6.146.834;

6.087.097;

6.046.039;

6.015.664;

5.985.619;

5.955.274;

5.888.740;

5.869.318;

6.566.067;

6.544.782;

6.514.706;

6.485.907;

6.465.638;

6.428.987;

6.399.320;

6.372.484;

6.348.336;

6.312.930;

6.300.072;

6.270.966;

6.258.570;

6.248.567;

D441.091;

6.180.372;

6.143.496;

6.072.369;

6.037.129;

6.015.534;

5.976.842;

5.952.200;

5.883.924;

5.863.772;

6.566.052;

6.537.752;

6.503.750;

6.485.903;

6.465.637;

6.426.215;

6.395.518;

6.368.834;

6.346.384;

6.309.840;

6.287.781;

6.268.153;

6.258.567;

6.235.468;

6.218.153;

6.180.349 ;

6.140.613;

6.068.974;

6.033.854;

6.004.747;

5.972.602;

5.936.968;

5.876.978;

5.863.731;

6.558.929;

6.524.830;

6.503.705;

6.482.588;

6.465.171;

6.423.499;

6.391.559;

6.365.375;

6.319.673;

6.309.837;

6.284.455;

6.268.143;

6.258.537;

6.232.079;

6.207.425;

6.174.670;

6.140.110;

6.063.563;

6.031.960;

6.001.612;

5.968.730;

5.909.468;

5.876.977;

5.861.251;

6.558.909;

6.518.020;

6.493.640;

6.475.729;

6.448.014;

6.410.223;

6.383.755;

6.358.680;

6.316.195;

6.303.343;

6.277.605;

D445.907;

6.258.529;

6.225.093;

6.183.999;

6.153.412;

6.103.468;

6.048.688;

6.017.699;

6.001.572;

5.958.686;

5.905.732;

5.874.221;

5.861.245;

5.858.725;

5.837.4 68;

5.824.516;

5.811.296;

5.776.686;

5.747.251;

5.710.381;

5.681.741;

5.656.461;

5.639.871;

5.627.054;

5.602.756;

5.565.340;

5.527.898;

5.501.947;

5.484.699;

5.436.144;

5.389.512;

5.279.952;

5.229.297;

5.187.060;

5.023.171 prática da

5.858.718;

5.830.663;

5.824.479;

5.804.383;

5.774.497;

5.741.656;

5.705.627;

5.674.717;

5.654.144;

5.639.611;

5.618.703;

5.599.674;

5.565.339;

5.527.510;

5.494.795;

5.476.774;

5.426.026;

5.364.790;

5.254.469;

5.224.778;

5.142.033;

e 5.008.182 também podem ser empregados na presente invenção. O PCR envolve o uso de uma

5.856.086;

5.827.695;

5.817.797;

5.800.997;

5.766.889;

5.716.784;

5.702.884;

5.665.572;

5.652.102;

5.639.606;

5.618.702;

5.589.333;

5.556.774;

5.514.568;

5.491.225;

5.475.610;

5.420.009;

5.364.758;

5.241.363;

5.219.727;

5.091.310;

5.853.991;

5.827.661;

5.814.489;

5.780.271;

5.759.822;

5.712.125;

5.693.467;

5.665.539;

5.650.268;

5.631.128;

5.614.388;

5.585.238;

5.556.773;

5.512.463;

5.487.993;

5.447.839;

5.411.876;

5.340.728;

5.232.829;

5.213.961;

5.082.780;

5.849.497;

5.827.657;

5.814.453;

5.780.222;

5.750.347;

5.712.090;

5.691.146;

5.656.493;

5.643.765;

5.629.178;

5.610.017;

5.576.197;

5.538.871;

5.512.462;

5.487.985;

5.437.975;

5.393.657;

5.283.171;

5.231.015;

5.198.337;

5.066.584;

DNA polimerase termoestável, sequências conhecidas como iniciadoras, e ciclos de aquecimento, os quais separam o ácido desoxirribonucléico (DNA) replicante, estendem e amplificam exponencialmente um gene de interesse. Qualquer tipo de PCR, tal como PCR quantitativo, RT-PCR, PCR hot start, LAPCR, PCR multiplex, PCR touchdown, etc., podem ser usados. Vantajosamente, PCR em tempo real é utilizado. Em geral, o processo de amplificação por PCR envolve uma reação enzimática cíclica em cadeia para preparar quantidades exponenciais de uma sequência de ácido nucléico específica. Isso requer uma pequena quantidade de uma sequência para iniciar a reação em cadeia e iniciadores de oligonucleotídeo que irão hibridizar a sequência. No PCR, os iniciadores são anelados para desnaturar o ácido

nucléico	seguido pela extensão com um agente indutor
(enzima)	e nucleotídeos. Isto resulta em produtos de
extensão	recentemente sintetizados. Já que sequências

recentemente sintetizadas se tornam moldes para os iniciadores, ciclos repetidos de desnaturação, anelamento dos iniciadores e extensão resultam em acúmulo exponencial da sequência específica sendo amplificada. O produto de extensão da reação em cadeia será um duplex de ácido nucléico distinto com terminações que correspondem às extremidades dos iniciadores específicos empregados.

Pelos termos amplificar enzimaticamente ou amplificar entende-se, para os propósitos do relatório descritivo ou reivindicações, amplificação de DNA, isto é, um processo pelo qual sequências de ácido nucléico são amplificadas em número. Há vários meios para amplificar enzimaticamente sequências de ácido nucléico. Atualmente o método mais comumente usado é a reação em cadeia da polimerase (PCR). Outros métodos de amplificação incluem LCR (reação em cadeia da ligase) o qual utiliza DNA ligase, e uma sonda que consiste em duas metades de um segmento de DNA que é complementar à sequência do DNA a ser amplificado, enzima replicase Q5, e uma sequência molde de ácido ribonucléico (RNA) ligada a uma sonda complementar ao DNA a ser copiado, o qual é usado para fazer um molde de DNA para a produção exponencial de RNA complementar; amplificação por deslocamento de fita (SDA); amplificação por replicase Q5 (Q5RA); replicação auto-sustentada (3SR); e NASBA (amplificação baseada em sequência de ácido nucléico) , a qual pode ser realizada em RNA ou DNA como a sequência de ácido nucléico a ser amplificada.

Um fragmento de uma molécula tal como uma proteína ou ácido nucléico entende-se por referir a qualquer porção da sequência genética de nucleotídeo ou aminoácido.

Conforme usado neste documento, o termo genoma se refere a todo o material genético nos cromossomos de um organismo particular. Seu tamanho é, geralmente, dado como seu número total de pares de base. Dentro do genoma, o termo gene se refere a uma sequência ordenada de nucleotideos localizados em uma posição particular ou em um cromossomo particular o qual codifica um produto funcional específico (por exemplo, uma molécula de RNA ou proteína). Em geral, características genéticas de um animal, conforme definido pela sequência de nucleotideos do seu genoma, são conhecidas como seu genótipo enquanto que as características físicas de um animal são descritas como seu fenótipo.

Por hibridização ou hibridizar, conforme usado neste documento, entende-se como a formação de pares de bases A-T e C-G entre a sequência de nucleotídeo de um fragmento de um segmento de um polinucleotídeo e uma sequência de nucleotídeo complementar de um oligonucleotídeo.

Por complementar entende-se que no lócus de cada A, C, G ou T (ou U em um ribonucleotideo) na sequência do fragmento, o oligonucleotídeo sequenciado tem um

T,

G, ou

A, respectivamente, fragmento/oligonucleotídeo hibridizado é chamado um duplex.

Um complexo de hibridização, tal como em um ensaio sanduíche, significa um complexo de moléculas de ácido

nucléico que incluem, pelo menos, o ácido nucléico alvo e uma sonda sensora.

Ele também pode incluir uma sonda âncora .

Uma temperatura de fusão significa a temperatura na qual duplexes hibridizados desibridizam e voltam ao seu estado de fita simples. Da mesma forma, a hibridização não ocorrerá originalmente entre dois oligonucleotideos, ou, neste documento, um oligonucleotideo e um fragmento, em temperaturas acima da temperatura de fusão do duplex resultante.

É atualmente vantajoso que a diferença nas temperaturas do ponto de fusão de duplexes de oligonucleotideo-fragmento desta invenção seja de cerca de

1°C a cerca de 10°C a fim de ser facilmente detectável.

Conforme usado neste documento, o termo molécula de ácido nucléico pretende incluir moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico), moléculas de RNA (por exemplo, mRNA), análogos de DNA ou RNA gerados usando análogos de nucleotídeo e derivados, fragmentos e seus homólogos. A molécula de ácido nucléico pode ser simples ou fita dupla, mas vantajosamente, é DNA fita fita dupla.

DNA se refere à forma polimérica de desoxirribonucleotídeos (adenina, guanina, timina citosina) , tanto no seu estado de fita simples como ou de hélice fita dupla e não se limita a nenhuma forma terciária em particular. Desta forma, este termo inclui DNA fita dupla encontrado inter alia, em moléculas de DNA lineares (por exemplo, fragmentos de restrição, vírus, plasmídeos, e cromossomos. Ao discutir a estrutura de moléculas de DNA fita dupla particulares, as sequências podem ser descritas neste documento de acordo com a convenção normal de dar apenas a sequência na direção 5' para 3' na direção da fita de DNA não-transcrita (isto é, a fita que tem uma sequência homóloga ao mRNA). Uma molécula de ácido nucléico isolada é uma que está separada de outras moléculas de ácido nucléico que estão presentes na fonte natural do ácido nucléico.

Um nucleosídeo se refere a uma base ligada a um açúcar. A base pode ser adenina (A), guanina (G) (ou sua substituta, inosina (I)), citosina (C) , ou timina (T) (ou sua substituta uracila (U) ) . 0 açúcar pode ser ribose (o açúcar de um nucleotídeo natural no RNA) ou 2-desoxirribose (o açúcar de um nucleotídeo natural no DNA) . Um nucleotídeo se refere a um nucleotídeo ligado a um único grupo fosfato.

Conforme utilizado aqui, o termo oligonucleotídeo se refere a uma série de resíduos de nucleotídeos ligados, nos quais o oligonucleotídeo tem um número suficiente de bases nucleotídeos para serem usadas em uma reação de PCR. Uma sequência curta de oligonucleotídeo pode ser baseada em, ou desenhada a partir, de uma sequência genômica ou de cDNA e é usada para amplificar, confirmar ou revelar a presença de um DNA ou RNA idêntico, similar ou complementar em uma célula ou tecido particular. Oligonucleotídeos podem ser sintetizados quimicamente e podem ser usados como iniciadores ou sondas. Oligonucleotídeo significa qualquer nucleotídeo de mais de 3 bases de comprimento usado para facilitar a detecção ou identificação de um ácido nucléico alvo, incluindo sondas e iniciadores.

Uma polimerase é uma enzima que catalisa a adição sequencial de unidades monoméricas a uma cadeia polimérica, ou liga duas ou mais unidades monoméricas para iniciar uma cadeia polimérica. A polimerase funcionará pela adição de unidades monoméricas cuja identidade é determinada por, e que é complementar a, uma molécula molde de uma sequência específica. Por exemplo, DNA polimerases tais como a DNA pol 1 e Taq polimerase adicionam desoxirribonucleotídeos à extremidade 3' de uma cadeia polinucleotídica de uma maneira molde-dependente, deste modo sintetizando um ácido nucléico que é complementar à molécula molde. As polimerases podem ser usadas para estender um iniciador uma vez ou repetitivamente ou para amplificar um polinucleotídeo pela iniciação repetitiva de duas fitas complementares usando dois iniciadores. Uma polimerase termoestável se refere a uma enzima DNA ou RNA polimerase

que pode resistir	a temperaturas extremamente altas, por
exemplo, próximas	a 100°C. Frequentemente, polimerases
termoestáveis são	derivadas de organismos que vivem em

temperaturas extremas, tal como Thermus aquaticus. Exemplos de polimerases termoestáveis incluem Taq, Tth, Pfu, Vent, deep vent, UlTma, e suas variações e derivados.

Um polinucleotídeo se refere a uma cadeia linear de nucleotídeos conectados por uma ligação fosfodiéster entre o grupo hidroxila-3' de um nucleosídeo e o grupo hidroxila5' de um segundo nucleosídeo que por sua vez está ligado através de seu grupo hidroxila-3' ao grupo hidroxila-5' de um terceiro nucleosídeo e assim por diante para formar um polímero constituído de nucleosídeos ligados por um esqueleto de ligações fosfodiéster. Um polinucleotídeo modificado se refere a um polinucleotídeo no qual um ou mais nucleotídeos naturais foram parcialmente, substancialmente, ou completamente substituídos com nucleotídeos modificados.

Um iniciador é um oligonucleotídeo, a sequência de pelo menos uma porção do qual é complementar a um segmento de um DNA molde que deve ser amplificado ou replicado.

Tipicamente, iniciadores são usados na realização de uma reação em cadeia da polimerase (PCR). Um iniciador hibridiza com o (ou anela ao) DNA molde e é usada pela enzima polimerase como o ponto de partida para o processo de replicação/amplificação. Os iniciadores aqui contidos são selecionados para serem substancialmente complementares a diferentes fitas de uma sequência de DNA alvo particular. Isso significa que os iniciadores devem ser suficientemente complementares para hibridizar com suas respectivas fitas. Portanto, a sequência do iniciador não precisa refletir a exata sequência do molde. Por exemplo, um fragmento de nucleotideo não-complementar pode ser ligado à extremidade 5' do iniciador, com o restante da sequência do iniciador sendo complementar à fita. Alternativamente, bases não-complementares ou sequências longas podem ser intercaladas dentro do iniciador, contanto que a sequência do iniciador tenha complementaridade suficiente com a sequência da fita para hibridizar com ela e assim formar o molde para a síntese do produto de extensão.

Sondas referem-se a sequências oligonucleotídeo de ácido nucléico de comprimento variável, usadas na detecção de sequências de ácidos nucléicos idênticas, similares, ou complementares por hibridização. Uma sequência de oligonucleotídeo usada como uma sonda de detecção pode ser marcada com uma porção detectável.

A seguir polinucleotídeos estão exemplos não limitantes de um gene ou um fragmento gênico, éxons, íntrons, mRNA, tRNA, rRNA, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmideos, vetores

DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, iniciadores e sondas de acido nucléico. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos, uracila, outros açúcares e grupos ligantes tais como fluororribose e tiolato, e ramificações de nucleotídeo. A sequência dos nucleotídeos pode ser ainda modificada após a polimerização, tal como por conjugação com um componente marcador. Outros tipos de modificações incluídas nesta definição são caps, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo, e introdução de meios para ligar o polinucleotídeo a proteínas, íons de metal, componentes de marcação, outros polinucleotídeos ou um suporte sólido.

Um polinucleotídeo ou polipeptidio isolado é um que é substancialmente livre dos materiais com os quais ele está associado no seu ambiente nativo. Por substancialmente livre, entende-se pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo

menos	60%,	pelo	menos	65%, vantajosamente	pelo	menos	70%,
pelo	menos	75%,	mais	vantajosamente pelo	menos	80%,	pelo
menos	85%,	ainda	mais	vantajosamente pelo	menos	90%,	pelo
menos	91%,	pelo menos	92%, pelo menos 93%,	pelo	menos	94%,
pelo	menos	95%,	pelo	menos 96%, pelo menos 97	%, ou	mais

vantajosamente pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos

99,5%, pelo menos 99,9% livre destes materiais.

Uma molécula de ácido nucléico isolada é uma molécula de ácido nucléico que está substancialmente separada e distinta do organismo inteiro com o qual a molécula é encontrada na natureza;

ou uma molécula de ácido nucléico desprovida, em todo ou parte, de sequências normalmente associadas com ela na natureza; ou uma sequência, conforme ela existe na natureza, mas que tem sequências heterólogas (conforme definido abaixo) em associação com ela.

O termo polinucleotídeo que codifica uma proteína, conforme usado aqui, se refere a um fragmento de DNA ou molécula de DNA isolada que codifica uma proteína, ou a fita complementar a ela; mas RNA não está excluído, conforme é compreendido na técnica que timidina (T) em uma sequência de DNA é considerada igual à uracila em uma sequência de RNA. Desta forma sequências de DNA para uso na invenção, por exemplo, para uso em vetores de RNA, pode ser derivada de sequências de DNA, por timidina (T) na sequência de DNA sendo considerada igual a uracila (U) nas sequências de RNA.

Uma sequência codificante de DNA ou uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína particular é uma sequência de DNA que é transcrita e traduzida em um polipeptídio in vitro ou in vivo quando colocada sob o controle de elementos regulatórios apropriados. Os limites da sequência codificante são determinados por um códon de início na terminação 5' (amino) e um códon de parada na terminação 3' (carboxi). Uma sequência codificante pode incluir, mas não é limitada a, sequências procarióticas, cDNA de mRNA eucariótico, sequências de DNA genômico de DNA eucariótico (por exemplo, de mamífero) e ainda sequências de DNA sintéticas. Uma sequência de terminação da transcrição estará localizada geralmente a 3' da sequência codificante.

Homologia se refere ao percentual de identidade entre duas porções de polinucleotídeo ou duas porções de polipeptídio. Duas sequências de DNA, ou de proteína são substancialmente homólogas uma a outra quando as sequências exibem pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, preferivelmente pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94% e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% de identidade de sequência ao longo de uma extensão definida das moléculas. Conforme usado aqui, substancialmente homólogo também se refere a sequências que

mostram identidade	completa (100%	de	identidade	de
sequência) ao	DNA	especificado	ou	sequência	de
polipeptídio.
A homologia	pode	ser determinada	por	hibridização	de

polinucleotideos sob condições que formam duplexes estáveis entre as regiões homólogas, seguido por digestão com nucleases específicas para fitas simples, e determinação do tamanho dos fragmentos digeridos. Sequências de DNA que são substancialmente homólogas podem ser identificadas para aquele sistema particular. Definir condições apropriadas de hibridização está dentro do conhecimento na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook et al. supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Dois fragmentos de ácido nucléico são considerados seletivamente hibrídizáveis a um polinucleotídeo se eles forem capazes de hibridizar especificamente a um ácido nucléico ou sua variante ou iniciar especificamente uma reação em cadeia da polimerase: (i) sob condições típicas de hibridização e lavagem, conforme descrito, por exemplo, em Sambrook et al. supra e Nucleic Acid Hybridization, supra, (ii) usando condições de lavagem de severidade reduzida, que permitam no máximo 25 a 30% de não pareamentos de pares de bases, por exemplo, SSC 2x, SDS 0,1%, temperatura ambiente duas vezes cada, e então SSC 2x, SDS 0,1%, 37°C uma vez, 30 minutos; então SSC 2 x a temperatura ambiente duas vezes, 10 minutos cada, ou (iii) selecionar os iniciadores para uso em reações de PCR típicas (PCR) sob condições usuais (descritas por exemplo, em Saiki, et al. (1988) Science 239:487-491).

O termo capaz de hibridizar sob condições severas, conforme usado neste documento, refere-se ao anelamento de um primeiro ácido nucléico a um segundo ácido nucléico sob condições severas conforme definidas abaixo. Condições severas de hibridização permitem tipicamente a hibridização de moléculas de ácido nucléico que têm pelo menos 70% de identidade de sequência de ácido nucléico com a molécula de ácido nucléico que está sendo usada como uma sonda na reação de hibridização. Por exemplo, o primeiro ácido nucléico pode ser uma amostra de teste ou uma sonda, e o segundo ácido nucléico pode ser a fita senso ou antisenso de um ácido nucléico ou seu fragmento. A hibridização do primeiro e segundo ácidos nucléicos pode ser conduzida sob condições severas, por exemplo, alta temperatura e/ou baixo conteúdo de sal tendem e desfavorecer a hibridização de sequências de nucleotideo dissimilares. Alternativamente, a hibridização do primeiro e do segundo ácido nucléico pode ser conduzida sob condições de severidade reduzida, por exemplo, baixa temperatura e/ou alto conteúdo de sal, o que tende a favorecer a hibridização de sequências de nucleotídeos dissimilares. As condições de hibridização de baixa severidade podem ser seguidas por condições de alta severidade ou condições de severidade média para aumentar a seletividade da ligação do primeiro e segundo ácidos nucléicos. As condições de hibridização podem ainda incluir reagentes tais como, mas não limitados a, dimetil sulfóxido (DMSO) ou formamida para desfavorecer ainda a hibridização de sequências de nucleotideo dissimilares. Um protocolo de hibridização adequado pode, por exemplo, envolver hibridização em SSC 6 x (em que SSC lx compreende citrato de sódio 0,015 M e cloreto de sódio 0,15 M) a 65° Celsius em uma solução aquosa, seguido por lavagem com SSC lx a 65° C. Fórmulas para calcular condições de hibridização e lavagem para obter hibridização que permitem 30% ou menos de não pareamentos entre duas moléculas de ácido nucléico são descritas, por exemplo, em Meinkoth et al. (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284; o conteúdo dos quais está por meio disso incorporado por referência na sua totalidade. Protocolos para técnicas de hibridização são bem conhecidos daqueles versados na técnica e manuais de biologia molecular podem ser consultados para selecionar um experimentação protocolo de hibridização adequado sem

excessiva.	Veja,	por exemplo, Sambrook	et	al.
Molecular	Cloning:	A Laboratory Manual, 3a	ed.,	Cold
Harbor Press, os	conteúdos dos quais	estão	por

(2001)

Spring disso incorporados por referência nas suas totalidades.

Tipicamente, condições severas serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor do que cerca de 1,5 M de íon sódio, tipicamente concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de íon Na⁺ (ou outros sais), de cerca de pH 7,0 a cerca de pH

8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca 30° Celsius para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas maiores (por exemplo, mais do que 50 nucleotídeos). Condições severas também podem ser obtidas com a adição de agentes desestabilizantes tais como formamida. Condições de baixa severidade exemplares incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 50% de formamida, NaCl 1 M, SDS 1% (dodecil sulfato de sódio) a 37° Celsius, e uma lavagem em SSC 1 a 2 x em 50 a 55° Celsius. Condições de severidade moderada exemplares incluem hibridização em formamida 40 a 45%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37° Celsius, e uma lavagem em SSC 0,5 a 1 x em 55 a 60° Celsius. Condições de alta severidade exemplares incluem hibridização em formamida 50%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37° Celsius, e uma lavagem em SSC 0,1 x em 60 a 65° Celsius.

Também abrangido pela presente invenção são fragmentos de polipeptídios selecionados das sequências SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52. Procedimentos de determinação de fragmentos de polipeptídios e epítopos, tais como, gerar bibliotecas de peptídeos sobreponíveis (Hemmer B. et al., Immunology Today, 1998, 19 (4), 163168), Pepscan (Geysen Η. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1984, 81 (13), 3998-4002; Geysen Η. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1985, 82 (1), 178-182; Van der Zee R. et al., Eur. J. Immunol, 1989, 19 (1), 43-47; Geysen Η. M., Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 1990, 21 (4), 523-533; Multipin® Peptide Synthesis Kits de Chiron) e algoritmos (De Groot A. et al., Nature Biotechnology, 1999, 17, 533-561), podem ser usados na prática da invenção, sem experimentação excessiva.

Os polipeptídios ou fragmentos são produzidos vantajosamente por expressão in vitro.

Outro aspecto da invenção é o uso dos polinucleotídeos de acordo com a invenção, para a expressão e produção de peptídeos, polipeptídios ou proteínas, ou mais geralmente, produtos de expressão, por exemplo, imunógenos, antígenos ou epítopos.

Em uma modalidade, os polipeptidios ou peptídeos ou proteínas codificados por estes polinucleotídeos podem ser usados como imunógenos ou antígenos ou epítopos de subunidades em composições imunogênicas ou vacinas. A invenção também abrange os fragmentos imunogênicos destes polipeptidios, os quais têm pelo menos uma cadeia de 8 aminoácidos do polipeptídio, pelo menos 10, pelo menos 20, tal como pelo menos 30, vantajosamente pelo menos 50 e mais vantajosamente pelo menos 70, por exemplo, fragmentos dos polipeptidios que contêm pelo menos 8 aminoácidos contíguos do polipeptídio, pelo menos 10 aminoácidos contíguos do polipeptídio, vantajosamente pelo menos 20, tal como pelo menos 30 e mais vantajosamente pelo menos 50 aminoácidos contíguos do polipeptídio, e ainda mais vantajosamente pelo menos 70 aminoácidos contíguos do polipeptídio. Logicamente, um fragmento é menor do que o polipeptídio inteiro. Um fragmento pode ser combinado com outros polipeptidios, por exemplo, em polipeptidios de fusão; por exemplo, um polipeptídio da invenção ou um fragmento seu, pode ser uma porção de um polipeptídio de fusão que inclui outra porção (outro polipeptídio) (isto é, fundido ao gene de glutationa S-transferase (GST) (Chanter N et al., Microb. Pathog., 1999, 27(3): 133-143), ou à toxina colérica (Sheoran A S et al., Vaccine, 2002, 20(11-12) :

1653- 1659)), por exemplo, porção que aumenta a imunogenicidade e/ou porção que aumenta a secreção tal como uma porção de lipoproteína que aumenta a imunogenicidade, tal como um peptídeo de epítopo de célula T ou uma porção de sequência líder ou de sinal. Conseqüentemente, a invenção prevê a expressão de polipeptídios, proteínas, antígenos, imunógenos ou epítopos - quer sejam sequências identificadas aqui ou seus fragmentos ou aquelas que são heterólogas aos vetores da invenção - como fusões, por exemplo, como uma porção de um polipeptídio de fusão, por exemplo, um polipeptídio de fusão que inclui, vantajosamente, uma porção que aumenta a imunogenicidade tal como uma porção de lipoproteína e/ou uma porção que aumenta a secreção tal como uma porção de sequência líder ou de sinal.

Conforme usado aqui, o termo antígeno ou imunógeno significa uma substância que induz uma resposta imune específica em um animal hospedeiro. 0 antígeno pode compreender um organismo inteiro, morto atenuado ou vivo; uma subunidade ou porção de um organismo; um vetor recombinante que contêm um inserto com propriedades imunogênicas; um pedaço ou um fragmento de DNA capaz de induzir uma resposta imune mediante apresentação a um animal hospedeiro; uma proteína, um polipeptídio, um peptídeo, um epítopo, um hapteno, ou qualquer uma de suas combinações. Alternativamente o imunógeno ou antígeno pode compreender uma toxina ou antitoxina.

O termo proteína ou peptídeo imunogênico, conforme usado neste documento, também se refere e inclui peptídeos e polipeptídios que são imunologicamente ativos no sentido de que uma vez administrado ao hospedeiro, é capaz de evocar uma resposta imune do tipo humoral e/ou celular direcionada contra a proteína. Preferivelmente o fragmento da proteína é tal que ele tem substancialmente a mesma atividade imunológica que a proteína inteira. Desta forma, um fragmento de proteína de acordo com a invenção compreende, consiste essencialmente ou consiste em pelo menos um epítopo ou determinante antigênico. O termo epítopo se refere a um sítio de proteína capaz de induzir uma reação imune do tipo humoral (células B) e/ou do tipo celular (células T).

termo proteína ou peptídeo imunogênico contempla também deleções, adições e substituições à sequência, contanto que o polipeptídio funcione par produzir uma resposta imunológica conforme definida neste documento. Com relação a isto, substituições particularmente preferidas geralmente serão conservativas na natureza, isto é, aquelas substituições que ocorrem, dentro de uma família de aminoácidos. Por exemplo, os aminoácidos geralmente são divididos em quatro famílias: (1) ácidos — aspartato e glutamato; (2) básicos — lisina, arginina, histidina; (3) não-polares — alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polar não-carregado — glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano, e tirosina são algumas vezes classificados como aminoácidos aromáticos. De forma razoável é previsível que uma substituição isolada de leucina por serina ou vice-versa; um aspartato por glutamato ou vice-versa; uma treonina por uma serina ou vice-versa; ou uma substituição conservativa similar de um aminoácido por outro aminoácido estruturalmente relacionado, não terá um efeito importante sobre a atividade biológica. Proteínas que têm substancialmente a mesma sequência de aminoácido que a molécula de referência, mas que possuem substituições de aminoácido secundárias que não afetam substancialmente a imunogenicidade da proteína estão, portanto, dentro da definição do polipeptidio de referência.

termo epítopo se refere ao local em um antígeno ou hapteno ao qual células B e/ou células T específicas respondem. 0 termo também é usado intercambiavelmente com determinante antigênico ou sítio determinante antigênico. Anticorpos que reconhecem o mesmo epitopo podem ser identificados em um imunoensaio simples que mostra a habilidade de um anticorpo de bloquear a ligação de outro anticorpo a um antigeno alvo.

Uma resposta imunológica a uma composição ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpo a uma composição ou vacina de interesse. Geralmente uma resposta imunológica inclui, mas não é limitada a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção de anticorpos, células B, células T auxiliares, e/ou células T citotóxicas, direcionadas especificamente a um antigeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. Preferivelmente, o hospedeiro irá apresentar uma resposta imunológica terapêutica ou protetora tal que a resistência a nova infecção será aumentada e/ou a severidade clínica da doença reduzida. Tal proteção será demonstrada por uma redução ou por uma falta de sintomas normalmente apresentados por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápido e/ou uma titulação viral reduzida no hospedeiro infectado.

Uma proteína ou polipeptídio imunogênico conforme usado neste pedido também se refere a uma sequência de aminoácido que elicia uma reposta imunológica conforme descrita acima. Uma proteína ou polipeptídio imunogênico, conforme usado aqui, inclui a sequência de extensão completa da proteína, seus análogos, ou seus fragmentos imunogênicos. Por fragmento imunogênico entende-se um fragmento de uma proteína que inclui um ou mais epítopos e assim elicia uma resposta imunológica descrita acima. Tais fragmentos podem ser identificados usando qualquer número de técnicas de mapeamento de epítopo, bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed. , 1996) Humana Press, Totowa, N.J. Por exemplo, epítopos lineares podem ser determinados, por exemplo, por sintetizar concomitantemente grandes números de peptídeos sobre suportes sólidos, os peptídeos correspondendo a porções da molécula de proteína, e reagir os peptídeos com os anticorpos enquanto que os peptídeos ainda são ligados aos suportes. Tais técnicas são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, na Patente Americana No. 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 :39984002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715, todos por meio deste incorporados por referência nas suas totalidades. Similarmente, epítopos conformacionais são facilmente identificados por determinar a conformação espacial dos aminoácidos tais como, por exemplo, por cristalografia de raio-X e por ressonância magnética nuclear bidimensional. Veja por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra.

Antígenos sintéticos também estão incluídos dentro da definição, por exemplo, poliepítopos, epítopos flanqueadores, e outros antígenos recombinantes. Veja por exemplo, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:27772781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol, e Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al. (1998) 12^a World AIDS Conference, Geneva, Suiça, 28 Jun. a 3 Jul., 1998. Fragmentos imunogênicos, para os propósitos da presente invenção, incluirão geralmente pelo menos cerca de 3 aminoácidos , preferivelmente pelo menos cerca de 5 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 a 15 aminoácidos, e o mais preferivelmente 25 ou mais aminoácidos, da molécula. Não há limite superior crítico para o cumprimento da sequência de proteína, ou ainda uma proteína de fusão que compreende pelo menos um epítopo da proteína.

Consequentemente, uma estrutura mínima de um polinucleotídeo que expressa um epítopo é que ele compreende ou consiste essencialmente em nucleotídeos para codificar um epítopo ou determinante de antígeno da proteína ou poliproteína de interesse. Um polinucleotídeo que codifica um fragmento da proteína total ou poliproteina, mais vantajosamente compreende ou consiste

essencialmente	em	um mínimo	de	21 nucleotídeos,
vantaj osamente	pelo	menos	42	nucleotídeos, e
preferivelmente	pelo	menos 57,	87 ou	150 nucleotídeos

consecutivos ou contíguos da sequência que codifica a proteína total ou poliproteina. Procedimentos de determinação de epítopo, tais como, gerar bibliotecas de peptídeo sobreponíveis (Hemmer B. et al., Immunology Today,

1998,	19 (4), 163-168), Pepscan	(Geysen et	al. ,	(1984)
Proc.	Nat. Acad.	Sei.	USA, 81, 3998-4002; Geysen	et al.,
(1985)	Proc. Nat.	Acad.	Sei. USA,	82, 178-182;	Van	der Zee
R. et	al., (1989)	Eur.	J. Immunol,	19, 43-47;	Geysen Η.M.,
(1990)	Southeast	Asian	J. Trop.	Med. Public	Health, 21,

523-533; Multipin.RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) e algoritmos (De Groot A. et al, (1999) Nature Biotechnology, 17, 533-561), e no Pedido PCT No. de série PCT/US2004/022605 todos os quais estão por meio deste incorporados por referência nas suas totalidades, podem ser usados na prática da invenção, sem experimentação excessiva. Outros documentos citados e incorporados por meio disso por referência também podem ser consultados por métodos para determinar os epítopos de um imunógeno ou antígeno e assim moléculas de ácido nucléico que codificam tais epítopos.

Em uma modalidade, os fragmentos de polipeptidio são selecionados a partir das sequências SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e 58, os quais são respectivamente codificados pelas sequências de nucleotídeo SEQ ID NOS: 31, 33, 35, 37, 39, 53, 55 e 57. Os fragmentos de polipeptídios SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e 58 são parte de Se50, Sel459, Se595, Se528, Se358, Sel631, Sel681 e Sla, respectivamente.

Os polinucleotídeos que codificam polipeptídios de acordo com a presente invenção, seus análogos ou seus fragmentos são inseridos em um vetor, ligados a elementos regulatórios tais como promotor, região de ligação de ribossomo e terminador, e códon de início e de parada. Os polipeptídios, seus análogos e seus fragmentos podem ser produzidos por expressão in vitro nas células hospedeiras. Os vetores de expressão in vitro são vetores de expressão usados para a expressão in vitro de proteínas em um sistema celular apropriado. Isso pode ser produzido em células hospedeiras procarióticas, isto é, em Escherichia coli (Mahona F et al, Biochimie 1994, 46(1): 9-14; Watt Μ A et al, Cell Stress Chaperones 1997, 2(3): 180-90; Frey J Res. Microbiol. 1992, 143(3): 263-9) ou em Lactobacillus (Seegers J F, Trends Biotechnol. 2002, 20(12): 508-515; Pouwels P H et al, Methods Enzymol. 2001, 336: 369-389), ou em células hospedeiras eucarióticas, isto é, em levedura (Gerngross T U, Nat Biotechnol. 2004, 22(11): 1409-1414;

Malissard M et al, Glycoconj J. 1999, 16(2): 125-139), em células de inseto (Oker-Blom C et al, Brief Funct Genomic Proteomic. 2003, 2(3), 244-253), células de mamífero ou células de ave. Para Escherichia coli, diferentes cepas podem ser usadas, notavelmente a cepa BL21(DE3) (Novagen ou Invitrogen; veja Hedayati Μ A et al, Protein Expr Purif, 2005, 43(2): 133-139) cepa 0rigami2(DE3) (Novagen ou

Invitrogen) , Y1089 (Galan J E et al, Infect Immun, 1987,

55(12): 3181-3187). Os vetores são vantajosamente plasmídeos, isto é, plasmídeos pGEX (GE Healthcare), plasmídeos pET (Novagen ou Invitrogen) (Jiang X Y et al, J Biochem Mol Biol. 2006, 39(1): 22-25; Hedayati Μ A et al,

Protein Expr Purif, 2005, 43(2): 133-139; Jedrzejas M J et al, Protein Expr Purif, 1998, 13(1): 83-89). O vetor também pode ser um vírus, notavelmente um bacteriófago, isto é, fago lambda-gtl 1 (Galan J E et al, Infect Immun, 1987, 55(12): 3181- 3187). Outra abordagem é usar genes fundidos para a produção de proteínas quiméricas entre uma proteína de Streptococcus e uma proteína de Escherichia coli, notavelmente lipoproteína (Cullen P A et al, Plasmid, 2003, 49(1): 18-29), ou com GST (Zhao G et al, Protein Expr

Purif, 1999, 16(2): 331-339). O inserto estreptocócico pode ser ligado a um promotor, isto é, promotor de bacteriófago T7 (Yamamoto M et al, FEMS Microbiol Lett, 1995, 132(3):

209-213), uma sequência de peptídeo de sinal, isto é, peptídeo de sinal da proteína A externa de Borrelia burgdorferi (De B K et al, Vaccine, 2000, 18(17): 18111821), uma sequência de sinal da lipoproteína da membrana externa principal de Escherichia coli (Cullen P A et al, Plasmid, 2003, 49(1): 18-29).

Para Lactobacillus, diferentes cepas podem ser usadas, notavelmente Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei (Seegers J F, Trends Biotechnol., 2002, 20(12): 508-515). Promotores e genes regulatórios envolvidos na produção de sacacina P são adequados para estabelecer expressão gênica de alto nível indutível em Lactobacillus (Mathiesen G et al, Lett Appl Microbiol, 2004, 39(2): 137-143), ou promotor de operon de lactose (Oliveira M L et al, FEMS Microbiol Lett., 2003, 227(1):

25-31) . Outra abordagem é usar os genes fundidos para a produção de proteínas quiméricas entre uma proteína de Lactobacillus e uma proteína de Streptococcus (Hung J et al, FEMS Microbiol Lett, 2002, 211(1): 71-75).

Para a expressão in vitro em células de inseto, os vetores são vantajosamente vírus, expressão em células de inseto, vetores são vantajosamente vírus, isto é, baculovírus [veja, por exemplo, patente americana No.

4,745,051; Vialard J. et al, J.

Virol,

1990 64 (1), 37-50;

Verne A. , Virology,

1988, 167,

56-71;

Oker-Blom C et al,

Brief Funct Genomic

Proteomic.

2003, , 244-253), por exemplo, Vírus da

Poliedrose Nuclear de Autographa californica AcNPV, células de inseto são células de

Spodoptera frugiperda

Sf9 (ATCC CRL 1711;

veja também as de proteína pode ocorrer pela transfecção de células mamífero por plasmídeos, pela replicação ou expressão replicação produtiva de vetores virais em células mamífero, ou ser usadas exemplo, CHO

COS ou VERO) de sem de células de ave. Células de mamífero que podem são ou ou vantajosamente células de hamster (por

BHK-21) ou células de macaco (por exemplo, células bovinas (por exemplo, MDBK), isto é, cultura de vetores de EHV-I

S M et al, Microbiol. Immunol, células Vera (US-A-4.110.433)

VEEV em células BHK (Lee em células MDBK (Ibrahim

2004, 48 (11) : 831-842) ou ou cultura de replicons el em de et al, Infect. Immun., 2001,

É compreendido por um versado na técnica que as condições para cultivar uma célula hospedeira in vitro variam de acordo com o gene particular e que experimentação de rotina é necessária em momentos para determinar as condições ótimas para cultivar uma proteína dependendo da célula hospedeira. Uma célula hospedeira denota uma célula procariótica ou eucariótica que foi alterada geneticamente, ou que é capaz de ser alterada geneticamente pela administração de um polinucleotídeo exógeno, tal como um plasmídeo ou um vetor recombinante. Quando se refere a células alteradas geneticamente, o termo se refere tanto à célula originalmente alterada quanto a sua progênie.

Os vetores de expressão in vitro podem ser introduzidos em uma célula hospedeira replicação e amplificação. Os vetores polinucleotídeos de interesse podem ser adequada para que contêm os introduzidos na célula hospedeira por qualquer um de vários meios apropriados, incluindo absorção direta, endocitose, transfecçao, conjugação-f (parelhamento-f) , eletroporação, transfecçao empregando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextran ou outras substâncias; bombardeio com microprojéteis; lipofecção, e infecção (onde o vetor é infeccioso, por exemplo, um vetor retroviral). A escolha da introdução de vetores ou polinucleotídeos geralmente dependerá de aspectos da célula hospedeira.

As proteínas expressas podem ser coletadas no, ou a partir do, sobrenadante da cultura após, ou antes, da secreção (se não há secreção a lise celular tipicamente ocorre ou é realizada) , opcionalmente concentradas por métodos de concentração, tais como ultrafiltração e/ou purificadas por meios de purificação, tais como métodos de cromatografia de afinidade, troca de ion ou do tipo de filtração em gel, notavelmente por cromatografia por afinidade, isto é, usando Ni NTA Superflow (Qiagen) ou Ni Sepharose fastflow (Amersham) ou por filtração em gel, isto é, usando Sephacryl® ou Superdex® (Amersham GE Healthcare).

Os polipeptidios e seus fragmentos também podem ser obtidos por extração, notavelmente extração ácida ou extração com mutanolisina (Boschwitz J S et al., Cornell Vet., 1991, 81(1): 25- 36) e purificação, notavelmente imunoprecipitação (Erickson E D et al., Can J Comp Med., 1975, 39(2): 110-115), a partir de cultura bruta de bactérias estreptocócicas, principalmente de Streptococcus equi.

Os polipeptidios e seus fragmentos também podem ser sintetizados quimicamente (Luo Y et al., Vaccine 1999, 17 (7-8) : 821-31) .

Por composição de vacina de subunidade entende-se uma composição que contém pelo menos um polipeptidio ou um polinucleotídeo imunogênico capaz de expressar pelo menos um, mas não todos os antígenos derivados de, ou homólogos a, um antígeno de um patógeno de interesse. Tal composição é substancialmente livre de partículas ou células patogênicas intactas, ou o lisado de tais células ou partículas. Assim, uma composição de vacina de subunidade é preparada a partir de polipeptídios imunogênicos pelo menos parcialmente purificados (preferivelmente substancialmente purificados) do patógeno ou seus análogos recombinantes. Uma composição de vacina de subunidade pode compreender o antígeno ou antígenos de subunidade de interesse substancialmentes livre de outros antígenos ou polipeptídios do patógeno.

Um objetivo da invenção é uma composição imunogênica de subunidades ou vacina de subunidade que compreende pelo menos um polipeptídio, seu análogo ou seu fragmento de acordo com a invenção e um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável e opcionalmente um adjuvante e/ou um estabilizante.

A subunidade imunogênica ou composição de vacina pode compreender pelo menos um polipeptídio selecionado do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24,

26, 48, 50	e 52 ou seus análogos ou seus fragmentos. A
subunidade	imunogênica ou composição de vacina pode
compreender	vantajosamente dois, três, quatro ou cinco

polipeptídios selecionados do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52 ou seus análogos ou seus fragmentos.

A subunidade imunogênica ou composição de vacina pode compreender pelo menos um polipeptidio selecionado do grupo que consiste das sequências de SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e 58 ou suas análogas. A subunidade imunogênica ou composição de vacina pode compreender vantajosamente dois, três, quatro ou cinco polipeptidios selecionados do grupo que consiste de sequências de SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e 58 ou seus análogos

Outro objeto da invenção é uma composição imunogênica ou vacina recombinante que compreende pelo menos um vetor de expressão recombinante in vivo e um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável e opcionalmente um adjuvante e/ou um estabilizante. Os vetores de expressão recombinantes in vivo são vetores que compreendem polinucleotídeos ou seus fragmentos inseridos nesses e capazes de expressar in vivo, no mamífero alvo, o polipeptidio codificado por esse polinucleotídeo ou seu fragmento. Os vetores podem ser vetores de polinucleotídeo ou plasmideos (EP-A2- 1001025; Chaudhuri P Res. Vet. Sei. 2001, 70(3), 255-6) para composições imunogênicas de DNA e vacinas de DNA ou podem ser vírus (por exemplo, herpesvirus tal como herpesvirus eqüíno tipo 1 (Trapp S et al., J.

Virol. 2005, 79(9): 5445- 5454), herpesvírus eqüíno tipo 2, herpesvírus eqüino tipo 4; poxvírus tal como vírus da varíola ou vírus avipox, como fowlpox (US-A-5, 174.993 USA-5.505.941 e US-A-5.766.599) ou canarypox (US-A5.756.103); adenovírus tal como adenovírus humano (Chroboczek J et al., Virol. 1992, 186: 280-285); vírus da encefalite tal como vírus da encefalite eqüina venezuelana (Pushko P et al. Virol. 1997, 239: 389-401; Davis N L et al. J. Virol. 2000, 74: 371-378)) para composições imunogênicas de vetor viral recombinante e vacinas de vetor viral recombinante. Em uma modalidade adicional, os polinucleotídeos ou seus fragmentos podem ser inseridos em vetores de expressão bacterianos in vivo, notavelmente em Salmonella, para produzir composições ou vacinas imunogênicas bacterianas recombinantes vivas

O termo plasmídeo cobre qualquer unidade de transcrição de DNA que compreende um polinucleotídeo de acordo com a invenção e os elementos necessários para sua expressão in vivo em uma célula ou células do hospedeiro desejado ou alvo; e com relação a isto, é observado que um plasmídeo circular superenovelado ou não-superenovelado, um plasmídeo circular, assim como uma forma linear, são pretendidos estar dentro do escopo da invenção. Em um exemplo específico, não-limitante, o plasmídeo pVR1020 ou

1012 (VICAL Inc.; Luke C. et al, Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97; Hartikka J. et al, Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217) pode ser utilizado como um vetor para a inserção de uma sequência de polinucleotídeo. O plasmídeo pVR1020 é derivado de pVR1012 e contém a sequência de sinal tPA humana. Cada plasmídeo compreende ou contém, ou consiste essencialmente em, além do polinucleotídeo ou seu análogo ou seu fragmento, operativamente ligado a um promotor ou sob o controle de um promotor ou dependente de um promotor. Em geral, é vantajoso empregar um promotor funcional forte em células eucarióticas. 0 promotor forte preferido é o promotor imediato precoce de citomegalovírus (CMV-IE) de origem humana ou de murino, ou opcionalmente de outra origem tal como de rato ou porco da guiné. O promotor de CMV-IE pode compreender uma parte promotora real, que pode ou não pode estar associada com a parte intensificadora. Pode se fazer referência a to EP-A-260 148, EP-A-323 597, Patentes Americanas Nos. 5.168.062, 5.385.839, e 4.968.615, assim como Pedido PCT No. WO-A-87/03905. O promotor de CMV-IE é vantajosamente um CMV-IE humano (Boshart M. et al., Cell, 1985, 41, 521-530) ou um CMV-IE de murino. Em termos mais gerais, o promotor tem uma origem viral ou celular. Um promotor viral forte com exceção de CMV-IE que pode ser empregado com utilidade na prática da invenção é o promotor precoce/tardio do vírus SV40 ou o promotor de LTR do vírus do sarcoma de Rous. Um promotor celular forte que pode ser empregado com utilidade na prática da invenção é o promotor de um gene do citoesqueleto, tal como, por exemplo, o promotor desmina (Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344) ou o promotor de actina (Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79, 269-277). Subfragmentos funcionais desses promotores, isto é, porções desses promotores que mantêm uma atividade promotora adequada, estão incluídos dentro da presente invenção, por exemplo, promotores de CMV-IE truncados de acordo com o Pedido PCT No. WO-A-98/00166 ou Patente Americana No. 6.156.567 e podem ser usados na prática da invenção. Um promotor na prática da invenção inclui, consequentemente, derivados e subfragmentos de um promotor de extensão completa que mantém uma atividade promotora adequada e, portanto, funcionam como um promotor, promovendo preferivelmente atividade substancialmente similar àquela do promotor real ou de extensão completa do qual o derivado ou subfragmento é derivado, por exemplo, semelhante à atividade dos promotores de CMV-IE truncados da Patente Americana No. 6.156.567 para a atividade de promotores de CMV-IE de extensão completa. Assim, um promotor de CMV-IE na prática da invenção pode compreender ou consistir essencialmente em, ou consistir na porção promotora do promotor de extensão completa e/ou na porção intensificadora do promotor de extensão completa, assim como derivados e subfragmentos. Vantajosamente, os plasmídeos compreendem ou consistem essencialmente em outros elementos de controle da expressão. É particularmente vantajoso incorporar sequência(s) estabilizadora(s), por exemplo, sequência(s) de íntron, preferivelmente o primeiro íntron de hCMV-IE (Pedido PCT No. WO-A-89/01036) , o íntron II do gene de β-globina de coelho (van Ooyen et al., Science, 1979, 206, 337-344).

Para vetores recombinantes baseados em herpesvírus eqüíno, em particular cepas atenuadas (isto é, cepas EVH-1 KyA (Zhang Y et al., Virology, 2000, 268(2): 482-492)) ou atenuadas por mutação ou deleção de genes envolvidos na patogenicidade (Kirisawa R et al., Vet. Microbiol., 2003, 95(3): 159-174) ou por passagens seriadas em cultura (US-A4.110.433) podem ser usadas. Para EHV-1, a inserção pode ser feita na região intergênica entre ORF 62 e ORF 63(Ibrahim el S M et al., Microbiol. Immunol, 2004, 48(11): 831-842; Csellner H et al., Arch. Virol, 1998, 143(11) : 2215-2231) ou nos genes, eventualmente após a deleção parcial ou completa dos genes, isto é, no gene da timidina quinase (TK) , nos genes 1 ou 71 (Kirisawa R et al., Vet.

Microbiol, 2003, 95(3): 159-174), no gene da glicoproteina I e gene da glicoproteina E (Matsumura T. et al., Virology, 1998, 242(1): 68-79), no gene da proteína IR6 (Osterrieder N et al., Virology, 1996, 217(2): 442-451), no gene 15 (EP-B1-0.668.355) . Para EHV-4, a inserção pode ser feita no gene da glicoproteina I e no gene da glicoproteina E (Damiani A M et al., Virus Res., 2000, 67(2): 189-202), no gene de US2 ou TK ou glicoproteina E (US-A-5. 741.696; US-A-5. 731. 188), eventualmente após a deleção parcial ou completa dos genes. Em uma modalidade, o polinucleotídeo a ser expresso é inserido sob o controle de um promotor funcional em células eucarióticas, vantajosamente um promotor de CMV-IE (murino ou humano). Uma sequência de poli(A) e uma sequência de terminação podem ser inseridas à j usante do polinucleotídeo a ser expresso, por exemplo, sinal de poliadenilação do gene do hormônio do crescimento bovino ou de β-globina de coelho. Para um vetor recombinante baseado no vetor de poxvírus, um vírus de varíola ou um vírus de varíola atenuado (por exemplo, MVA, uma cepa

Ankara modificada obtida após mais de 570 passagens do cepa da vacina

Ankara em fibroblastos de embrião de galinha: veja Stickl &

Hochstein- Mintzel,

Munch. Med.

Wschr., 1971, 113, 1149-1153; Sutter et al,

Proc. Natl.

Acad. Sei.

disponível como ATCC VR-1508; ou NYVAC, veja Patente

Americana No. 5.494.807, por exemplo, Exemplos 1 a 6 e et seq de Patente Americana No. 5.494.807 que discute a construção de NYVAC, assim como variações de NYVAC com ORFs adicionais deletadas do genoma do vírus da varíola cepa Copenhague, assim como a inserção de moléculas de ácido nucléico codificante heterólogo nos sítios dessa recombinação e, também, o uso de promotores pareados; veja também WO-A-96/40241) , um vírus avipox ou um vírus avipox atenuado (por exemplo, canarypox, vírus fowlpox, dovepox, pigeonpox, quailpox, ALVAC ou TROVAC; veja, por exemplo,

Patente Americana No.. 5.505.941, 5.494.807) podem ser usados. Vírus canarypox atenuados estão descritos na

Patente Americana No. 5.756.103 (ALVAC) e WO-A-01/05934.

Também é feita referência a Patente Americana No. 5.766.599 que está ligada a cepa de vírus fowlpox atenuada TROVAC. É feita referência ao canarypox disponibilizado pela ATCC sob o número de acesso VR-111. Numerosas cepas para vacinação do vírus fowlpox também estão disponíveis, por exemplo, a cepa DIFTOSEC CT, comercializada por MERIAL e a vacina NOBILIS VARIOLE comercializada pela INTERVET. Para informação sobre o método para gerar recombinantes desses e como administrar recombinantes desses, os versados na técnica podem consultar os documentos citados nesse e WO-A

90/12882, por exemplo, em relação ao vírus da varíola é feita menção nas Patentes Americanas No.s. 4.769.330, 4.722.848, 4.603.112, 5.110.587, 5.494.807, e 5.762.938 entre outras; em relação ao vírus fowlpox é feita menção nas Patentes Americanas No.s. 5.174.993, 5.505.941 e 5.766.599 entre outras; em relação ao vírus canarypox é feita menção na Patente Americana No.. 5.756.103 entre outras. Quando o vetor de expressão é um virus de varíola, sitio ou sítios de inserção para o polinucleotídeo ou polinucleotídeos a serem expressos estão vantajosamente no gene ou sítio de inserção de timidina quinase (TK), no gene ou sítio de inserção de hemaglutinina (HA), a região que codifica o corpo de inclusão do tipo A (ATI) ; veja também os documentos citados aqui, especialmente aqueles que se relacionam com o vírus da varíola. No caso de canarypox, o sítio ou sítios de inserção são, vantajosamente, ORF(s) C3,

C5 e/ou C6; veja também especialmente aqueles que canarypox. No caso do vírus inserção são, vantajosamente os documentos citados aqui, os documentos citados aqui, se relacionam com o vírus fowlpox, o sítio ou sítios de , ORFs F7 e/ou F8; veja também especialmente aqueles que se relacionam com o vírus fowlpox. 0 sítio ou sítios de inserção para o vírus MVA são vantajosamente como em várias outras publicações, incluindo Carroll M. W. et al, Vaccine,

1997, 15 (4), 387-394; Stittelaar K. J. et al, J. Virol, 2000, 74 (9), 4236- 4243; Sutter G. et al., 1994, Vaccine, 12 (11), 1032-1040; e, nesse aspecto também é observado que o genoma completo de MVA está descrito em Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396, o que possibilita ao versado na técnica usar outros sítios de inserção ou outros promotores. Vantajosamente, o polinucleotídeo a ser expresso é inserido sob o controle de um promotor de poxvirus específico, por exemplo, o promotor de 7,5 kDa de varíola (Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35), o promotor I3L de varíola (Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434), o promotor HA de varíola (Shida, Virology, 1986, 150, 451-457), o promotor ATI de cowpox (Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47), o promotor H6 de varíola (Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo

P.	et al.	J. Virol,	1989, 63,	4189-4198; Perkus	M. et al,
J.	Virol,	1989, 63,	3829-3836),	inter alia.
	Para	o vetor	recombinante baseado em	vetor de

adenovírus, um adenovírus humano (HAV), vantajosamente, um vetor de adenovírus humano sorotipo 5 (Ad5), um adenovírus El-deletado e/ou interrompido, um adenovírus E3-deletado e/ou interrompido ou um adenovírus El- e E3-deletado e/ou interrompido podem ser usados. Opcionalmente, E4 pode ser deletado e/ou interrompido a partir de qualquer um dos adenovírus descritos acima. Por exemplo, os vetores de Ad5 humanos descritos em Yarosh et al. e Lutze-Wallace et al. podem ser usados (veja, por exemplo, Yarosh et al., Vacina. 1996 Set; 14 (13):1257-64 e Lut ze-Wallace et al., Biologicals. 1995 Dez; 23 (4):271-7). Em uma modalidade o vetor viral é um adenovírus humano, particularmente um adenovírus sorotipo 5, tornado incompetente para replicação por uma deleção na região El do genoma viral. 0 adenovírus deletado é propagado em células 293 que expressam El ou células PER, particularmente PER.C6 (F. Falloux et al. Human Gene Therapy 1998, 9, 1909-1917). O adenovírus humano pode ser eventualmente deletado na região E3 eventualmente em combinação com uma deleção na região El (veja, por exemplo J. Shriver et al. Nature, 2002, 415, 331-335, F. Graham et al. Methods in Molecular Biology Vol .7: Gene Transfer and Expression Protocols editado por E. Murray, The Human Press Inc, 1991, p 109-128; Y. Ilan et al. Proc. Natl.

Acad. Sei. 1997, 94, 2587-2592; S. Tripathy et al. Proc. Natl. Acad. Sei. 1994, 91, 11557-11561; B. Tapnell Adv. Drug Deliv. Rev.1993, 12, 185-199;X. Danthinne et al Gene Therapy 2000, 7, 1707-1714; K. Berkner Bio Techniques 1988, 6, 616-629; K. Berkner et al. Nucl. Acid Res. 1983, 11, 6003-6020; C. Chavier et al. J. Virol. 1996, 70, 4805

4810) . Os sítios de inserção podem ser os loci El e/ou E3 eventualmente após uma deleção parcial ou completa das regiões El e/ou E3. Vantajosamente, quando o vetor de expressão é um adenovírus, o polinucleotídeo a ser expresso é inserido sob controle de um promotor funcional em células eucarióticas, tal como um promotor forte, preferivelmente um promotor gênico imediato precoce de citomegalovírus (promotor CMV-IE). 0 promotor CMV-IE é preferencialmente de origem murina ou humana. O promotor do fator de alongamento la também pode ser usado. Um promotor músculo-específico também pode ser usado (X. Li et al. Nat. Biotechnol. 1999, 17, 241-245). Promotores fortes também são discutidos neste documento em relação a vetores plasmidiais. Uma sequência poli(A) e uma sequência terminadora podem ser inseridas à jusante do polinucleotídeo a ser expresso, por exemplo um gene do hormônio de crescimento bovino ou um sinal de poliadenilação do gene da β-globína de coelho.

Para o vetor recombinante baseado no vírus de encefalite, um vírus de encefalite eqüina venezuelana (VEEV) pode ser usado (Nelson E L et al., Breast Câncer Res. Treat., 2003, 82(3): 169-183), em particular como um replicon, ou seja, como um RNA auto-replicante contendo todos os genes não estruturais de VEEV e um sítio de clonagem múltipla no lugar dos genes estruturais de VEEV (Lee J S et al., Infect. Immun., 2003, 71 (3): 1491-1496; Velders Μ P et al., Câncer Res., 2001, 61(21): 7861-7867). Os polinucleotideos a serem expressos são inseridos neste sítio de clonagem múltipla, opcionalmente ligados à sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência secretória ou uma sequência secretória ativadora de plasminogênio tecidual. Os polinucleotideos a serem expressos também podem ser inseridos à jusante do promotor 26S subgenômico no lugar dos genes virais estruturais de VEEV (Lee J S e al, Infect. Immun., 2001, 69 (9): 57095715; Pushko P et al., Vaccine, 2000, 19 (1): 142-153).

Para vetores recombinantes baseados em bactérias, Salmonella, notavelmente Salmonella typhimurium (Yang X L et al, Biomed. Environ. ScL, 2005, 18 (6): 411-418; Dunstan S J et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol, 2003, 37 (2-3): 111-119), Salmonella typhi (Santiago-Machuca A E et al., Plasmid., 2002, 47(2): 108-119) pode ser usada. Os polinucleotideos a srem expressos podem ser inseridos no gene da flagelina de Salmonella (Chauhan N et al, Mol Cell Biochem., 2005, 276(1-2): 1-6), ou no gene aroC (SantiagoMachuca A E et al., Plasmid., 2002, 47 (2): 108-119). Os polinucleotideos a serem expressos também podem ser inseridos sob o controle do promotor nirB induzível anaerobicamente (Santiago-Machuca A E et al., Plasmid.,

A composição de vacina ou imunogênica recombinante pode conter pelo menos um vetor de expressão recombinante que compreende pelo menos um polinucleotídeo que codifica um polipeptídio selecionado do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NOS: 18,

20, 22, 24, 26,

48, 50 e 52, ou seus análogos ou seus fragmentos. A composição de vacina ou imunogênica recombinante pode conter pelo recombinante de expressão que compreende menos um vetor pelo menos um polinucleotídeo que codifica um polipeptídio selecionado do grupo que consiste nas sequências de SEQ

ID NOS: 32, 34,

36, 38, 40, 54, 56 e 58, ou seus análogos.

A composição de vacina ou imunogênica recombinante podem conter vantajosamente pelo menos um vetor de expressão recombinante que compreende pelo menos um polinucleotídeo que codifica dois ou três ou quatro ou cinco polipeptidios selecionados do grupo que consiste nas sequências SEQ ID

NOS: 32, 34,

36,

38, 40, 54, 56 e 58, ou seus análogos.

Os vetores da invenção podem compreender ainda, além disso, pelo menos um polinucleotídeo heterólogo. Isto é útil para reproduzir ou replicar polinucleotideos heterólogos e/ou para a expressão de polinucleotideos heterólogos, in vivo ou in vitro. Tais vetores também são úteis para preparar composições de vacina ou imunogênicas multivalentes, notavelmente composições imunogênicas ou vacinas de DNA multivalente e composições imunogênicas ou vacinas de vetor viral recombinante multivalente. A sequência de ácido nucléico heteróloga codifica vantajosamente para um imunógeno, um antígeno ou um epítopo de um agente viral patogênico, agente parasítico ou bacteriano, tal agente bacteriano é diferente das bactérias estreptocócicas na origem dos polinucleotídeos que codificam os polipeptídios de acordo com a invenção. Esta sequência heteróloga pode codificar um imunógeno, antígeno ou epítopo do vírus de encefalite eqüina ocidental (WEEV), vírus de encefalite eqüina oriental (EEEV), vírus de encefalite eqüina venezuelana (VEEV), vírus da influenza eqüina, herpesvírus eqüíno tipo 1 (EHV-I), herpesvírus eqüíno tipo 2 (EHV-2), herpesvírus eqüíno tipo 4 (EHV-4), vírus da Arterite Eqüina (EAV), vírus do Oeste do Nilo (WNV), tétano, rodococos. Em uma modalidade particular, a sequência heteróloga pode codificar um imunógeno, antígeno ou epítopo do vírus da influenza eqüina e de EHV-I e/ou EHV-4. Um imunógeno ou antígeno é uma proteína ou polipeptídio capaz de induzir uma resposta imune contra o agente patogênico ou um antígeno secretado do agente patogênico, e contém um ou mais epítopos; um epítopo é um peptídeo ou polipeptídio que é capaz de induzir uma resposta imune contra o agente patogênico ou um antígeno secretado do agente patogênico.

Opcionalmente, a composição ou vacina imunogênica de subunidade da invenção pode ser combinada com um ou mais imunógenos, antígenos ou epítopos selecionados de outros microorganismos patogênicos ou vírus para formar uma composição ou vacina imunogênica de subunidade multivalente. Para equinos, tal composição ou vacina imunogênica de subunidade multivalente pode compreender pelo menos um polipeptídio de acordo com a presente invenção e pelo menos um imunógeno, antígeno ou epítopo de WEEV, EEEV, VEEV, vírus da influenza equina, EHV-1, EHV-4, EAV, WNV, tétano, rodococos. Em uma modalidade particular, tal composição ou vacina imunogênica de subunidade multivalente pode compreender pelo menos um polipeptídio de acordo com a presente invenção e pelo menos um imunógeno, antígeno ou epítopo do vírus da influenza eqüina e de EHV-1 e/ou EHV-4.

O excipiente, diluente ou veículo veterinário ou farmaceuticamente aceitável pode ser água ou salina, tampão, mas ele também pode, por exemplo, compreender o meio de cultura de estreptococos.

Os transportadores ou veículos ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis são bem conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, um transportador ou um veículo ou um excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser uma solução de NaCI 0,9 % (por exemplo, salina) ou um tampão fosfato. Outro transportador ou veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável que pode ser usado para métodos desta invenção incluem poli- (L-glutamato) ou polivinilpirrolidona, mas não são limitados a eles. O transportador ou veículo ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável podem ser qualquer composto ou combinação de compostos que facilitem a administração do vetor (ou proteína expressa in vitro pelo vetor da invenção); vantajosamente, o transportador, o veículo ou excipiente pode facilitar a transfecção e/ou melhorar a preservação do vetor (ou proteína). As doses e volumes de doses são discutidos neste documento na descrição geral e também podem ser determinados pelos versados na técnica a partir desta descrição e invenção lida em conjunto com o conhecimento na técnica, sem qualquer experimentação indevida.

Os lipídios catiônicos que contêm um sal de amônio quaternário os quais são vantajosamente, mas não exclusivamente adequados para plasmídeos, são vantajosamente os que têm a seguinte fórmula:

na qual Ri é um radical alifático de cadeia linear saturada ou insaturada, que tem um 12 a 18 átomos de carbono, R₂ é outro radical alifático que contém 2 ou 3 átomos de carbono e X é um grupo amina ou hidroxila, por exemplo, DMRIE. Em outra modalidade o lipidio catiônico pode estar associado com um lipidio neutro, por exemplo, DOPE.

Dentre estes lipidios catiônicos, a preferência é dada para DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3bis(tetradeciloxi)-1-amônio propano; WO96/34109), vantajosamente vantaj osamente associado com um lipidio neutro,

DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina; Behr

J. P., 1994,

Bioconjugate Chemistry,

5, 382-389, para formar DMRIE-DOPE.

Vantajosamente, a mistura de adjuvante é formada extemporaneamente plasmideos com o e vantajosamente, contemporaneamente com a administração da preparação ou pouco antes da administração da preparação; por exemplo, pouco antes ou antes, da administração, a mistura plasmideo-adjuvante é formada, vantajosamente a fim de dar tempo suficiente antes da administração para a mistura formar um complexo, por exemplo, entre cerca de 10 e cerca de 60 minutos antes da administração, tal como aproximadamente 30 minutos antes da administração.

Quando DOPE está presente, a proporção molar de DMRIE:DOPE é vantajosamente de cerca de 95: cerca de 5 a cerca de 5: cerca de 95, mais vantajosamente cerca de 1: cerca de 1, por exemplo, 1:1.

A proporção em peso do plasmídeo:adjuvante de DMRIE ou DMRIE-DOPE pode estar entre cerca de 50: cerca de 1 e cerca de 1: cerca de 10, tal como cerca de 10: cerca de 1 e cerca de 1: cerca de 5, e vantajosamente cerca de 1: cerca de 1 e cerca de 1: cerca de 2, por exemplo, 1:1 e 1:2.

As composições imunogênicas e vacinas de acordo com a invenção podem compreender ou consistir essencialmente em um ou mais adjuvantes. Adjuvantes adequados para uso na prática da presente invenção são (1) polímeros de acrílico ou ácido metacrílico, anidrido maléico e polímeros de derivados de alquenila, (2) sequências imunoestimuladoras (ISS), tais como sequências de oligodesoxirribonucleotídeos que têm uma ou mais unidades CpG não-metiladas (Klinman et al., Proc. Natl. Acad. Sei., EUA, 1996, 93, 2879-2883; WO98/16247), (3) uma emulsão óleo em água, tal como a emulsão SPT descrita na página 147 do Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach publicado por M. Powell, M.

Newman, Plenum Press 1995, e a emulsão MF59 descrita na página 183 do mesmo trabalho, (4) lipidios catiônicos que contêm um sal de amônio quaternário, por exemplo, DDA (5) citocinas, (6) hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, (7) saponina ou (8) outros adjuvantes discutidos em qualquer documento citado e incorporado por referência na presente invenção, ou (9) quaisquer de suas combinação ou misturas.

A emulsão óleo em água (3) , que é especialmente apropriada para vetores virais, pode ser baseada em: óleo de parafina líquida leve (do tipo da Farmacopéia Européia), óleo de isoprenóide, tal como esqualano, esqualeno, óleo resultante da oligomerização de alcenos, por exemplo isobuteno ou deceno, ésteres de ácidos ou alcoóis que têm um grupo alquila de cadeia linear, tais como óleos vegetais, oleato de etila, propílenoglicol, di(caprilato/caprato), tri(caprilato/caprato) de glicerol e dioleato de propilenoglicol, ou ésteres ramificados de alcoóis ou ácidos graxos, especialmente ésteres de ácido isoesteárico.

O óleo é usado em combinação com emulsificantes para formar uma emulsão. Os emulsificantes podem ser tensoativos não-iônicos, tais como: ésteres, por um lado, de sorbitano, manida (por exemplo, oleato de anidromanitol), glicerol, poliglicerol ou propilenoglicol e por outro lado, de ácidos oléico, isosteárico, ricinoleico ou hidroxiesteárico, os ditos ésteres sendo opcionalmente etoxilados, ou blocos de copolimero polioxipropileno-polioxietileno, tais como Pluronic, p. ex., L121. Dentre os polímeros adjuvantes tipo (1), a preferência é dada para polímeros de acido acrílico de metacrílico reticulados, especialmente reticulados com éteres de polialquenila de açúcares ou polialcoóis. Estes compostos são conhecidos pelo nome de carbômeros (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, Junho de 1996). Um versado na técnica também pode se referir à patente Americana No. 2.909.462, a qual fornece tais polímeros acrílicos de cadeia reticulados por um composto poliidroxila que tem pelo menos três grupos hidroxila, preferivelmente não mais do que oito de tais grupos, os átomos de hidrogênio de pelo menos três grupos hidroxila sendo substituídos por radicais alifáticos insaturados que têm pelo menos dois átomos de carbono. Os radicais preferidos são os que contêm 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, vinilas, alilas e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados também podem conter outros substituintes, tais como metila. Os produtos vendidos sob o nome Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EUA) são especialmente adequados. Eles são reticulados pela alil sacarose ou por alil pentaeritritol.

Dentre eles, referência é feita para Carbopol 974P, 934P e

971P. Quanto aos copolímeros de anidrido maléico -derivados de alquenila, a preferência é dada ao EMA (Monsanto) , os quais são copolímeros de etileno-anidrido maléico reticulados ou de cadeia linear e eles são, por exemplo, reticulados por éter de divinila. Referência também é feita para J. Fields et al., Nature 186: 778-780, 4 de junho de

1960.

Com relação à estrutura, os polímeros acrílicos ou metacrílicos e EMA são formados preferivelmente por unidades básicas que têm a seguinte fórmula:

R i R₂

COOH COOH na qual:

- Ri e R₂, os quais podem ser iguais ou diferentes, representam H ou CH3

- x = 0 ou 1, preferivelmente χ = 1

- y = 1 ou 2, com x + y = 2.

Para EMA, x=0ey=2e para carbômeros x = y = 1.

Estes polímeros são solúveis em água ou solução salina fisiológica (20 g/l NaCl) e o pH pode ser ajustado de 7,3 a

7,4, por exemplo, por soda (NaOH), para fornecer a solução de adjuvante na qual a expressão do(s) vetor(es) pode ser incorporada. A concentração de polímero na composição final da vacina pode variar entre 0,01 e 1,5 % p/v, vantajosamente 0,05 a 1 % p/v e preferivelmente 0,1 a 0,4 % p/v.

A citocina ou citocinas (5) podem estar na forma de proteína na composição ou vacina imunogênica, ou podem ser co-expressas no hospedeiro com imunógeno ou imunógenos ou seus epítopo(s). A preferência é dada para co-expressão da citocina ou citocinas, quer pelo mesmo vetor que expressa o imunógeno ou por imunógenos ou seus epítopo(s), ou por um vetor separado para isto.

A invenção abrange preparar tais composições de

combinação;

por exemplo, por misturar os componentes

ativos, vantajosamente em conjunto e com um adjuvante, transportador, citocina, e/ou diluente.

Citocinas que podem ser usadas na presente invenção incluem, mas não são limitadas a, fator de estimulação de colônia por granulócito (G-CSF), fator de estimulação de colônia por granulócito/macrófago (GM-CSF), interferon oí (IFN a), interferon β (IFN β) , interferon γ, (IFN γ) , interleucina-1 α (IL-I a), interleucina -1 β (IL-I β), interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina— (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), interleucina-7 (IL-7), interleucina-8 (IL-8), interleucina9 (IL-9), interleucina-10 (IL-IO), interleucina-11 (IL-I

1), interleucina-12 (IL-12) , fator de necrose tumoral α (TNF a), fator de necrose tumoral β (TNF β) , e fator de crescimento transformante β (TGF β). É conhecido que citocinas podem ser co-administradas e/ou administradas sequencialmente com a composição imunogênica ou de vacina da presente invenção. Assim, por exemplo, a vacina da presente invenção também pode conter uma molécula exógena de ácido nucléico que expressa in vivo uma citocina adequada, por exemplo, uma citocina combinada a este hospedeiro a ser vacinado ou no qual uma resposta imunológica deve ser produzida (por exemplo, uma citocina canina para preparações a serem administradas a cães).

Vantajosamente, as composições farmacêuticas e/ou terapêuticas e/ou as formulações de acordo com a invenção compreendem ou consistem essencialmente em uma quantidade eficaz para desencadear uma resposta terapêutica de um ou mais vetores de expressão e/ou polipeptidios, conforme discutido neste documento; e, uma quantidade eficaz pode ser determinada a partir desta descrição, incluindo os documentos por meio deste incorporados, e o conhecimento da técnica, sem experimentação indevida.

O vetor viral recombinante das composições imunogênicas e o vetor viral recombinante das vacinas, de acordo com a invenção, podem ser secos por congelamento vantajosamente com um estabilizador. Secagem por congelamento pode ser feita segundo os procedimentos usuais de secagem por congelamento bem conhecidos. Os estabilizadores veterinários ou aceitáveis farmaceuticamente podem ser carboidratos (por exemplo, sorbitol, manitol, lactose, sacarose, glicose, dextran,

trealose),	glutamato de	sódio	(Tsvetkov T	et	al. ,
Cryobiology	1983,	20(3) :	318-23;	Israeli E	et	al. ,
Cryobiology	1993,	30(5) :	519-23),	proteínas,	tais	como

peptona, albumina lactoalbumina ou caseina agentes que contêm proteína tais como leite desnatado (Mills C K et al., Cryobiology 1988, 25(2): 148-52; Wolff E et al.,

Cryobiology 1990, 27(5): 569-75), e tampões (por exemplo, tampão fosfato, tampão fosfato de metal alcalino). Um adjuvante pode ser usado para fazer as preparações secas por congelamento.

Além disso, a presente invenção se refere ao uso de pelo menos um polipeptídio que tem uma sequência de aminoácido conforme mostrada nas SEQ ID NOS: 18, 20, 22,

24, 26, 48, 50 e 52, ou seus análogos ou seus fragmentos, para o tratamento e/ou vacinação de mamíferos contra infecção estreptocócica, especialmente das espécies eqüínos, de caninos e humana. Em uma modalidade, estes fragmentos são selecionados do grupo que consiste nas sequências SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e 58, ou seus análogos. Uma modalidade particular diz respeito ao uso de pelo menos um polipeptidio selecionado do grupo que consiste nas sequências SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 32, 34, 36, 38, 40, 48, 50, 52, 54, 56 e 58, ou seus análogos, para o tratamento e/ou vacinação de equinos contra garrotilho. Uma modalidade preferida diz respeito ao uso de pelo menos um peptídeo selecionado do grupo que consiste nas sequências SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e 58, ou seus análogos, para o tratamento e/ou vacinação de eqüínos contra garrotilho.

Uma modalidade adicional diz respeito ao uso de pelo menos um polipeptidio que tem uma sequência de aminoácidos conforme mostrada em SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52, ou seus análogos ou seus fragmentos, para a preparação de uma vacina de subunidade que protege eqüínos contra infecção por Streptococcus equi. Esta modalidade adicional diz respeito preferivelmente ao uso de pelo menos um polipeptidio que tem uma sequência de aminoácidos conforme mostrada em SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e 58, ou seus análogos, para a preparação de uma vacina de

subunidade	que protege eqüínos	contra	infecção	por
Streptococcus equi.
Outra	modalidade adicional diz	respeito	ao	uso de	pelo
menos um	vetor recombinante e	de pelo	menos	um

polinucleotídeo inserido nele que codifica um polipeptidio que tem uma sequência de aminoácidos conforme mostrada nas SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52, ou um seu análogo ou seus fragmento, e o dito vetor é capaz de expressar in vivo este polipeptidio em um mamífero suscetível à infecção estreptocócica, para a preparação de uma vacina recombinante que protege o eqüíno contra infecção por Streptococcus equi.

Uma modalidade adicional diz respeito preferivelmente ao uso de pelo menos um vetor recombinante e de pelo menos um polinucleotídeo inserido nesse, em que o dito polipeptidio tem uma sequência de nucleotídeo conforme mostrada nas SEQ ID 17, 19, 21, 23, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 47, 49, 51, 53, 55 e 57, ou seus análogos, e o dito vetor é capaz de expressar in vivo o polipeptidio codificado pelo dito polinucleotídeo em um mamífero suscetível à infecção por Streptococcus equi.

Em particular, combinações de polipeptídios a serem usados para o tratamento e/ou vacinação de equinos contra garrotilho são uma combinação de pelo menos um polipeptidio selecionado de um primeiro grupo de polipeptídios que consistem em SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 32, 34, 36, 38, 40, 48, 50, 52, 54, 56 e 58, ou seus análogos ou suas combinações, e pelo menos outro imunógeno de Streptococcus equi, o qual não está presente neste primeiro grupo, notavelmente pelo menos um imunógeno selecionado de um segundo grupo de polipeptídios que consistem na proteína FNZ, proteína EAG, proteína SFS, proteína SEC, fragmento de SFSC1, fragmento de FNZN, fragmento de SEC2.16, fragmento de SEC 1.18, fragmento de SclCl (WO-A-2004/032957) e SEQ ID NOS: 28, 30 ou seus análogos ou seus fragmentos, ou suas combinações. Em combinações preferidas de polipeptídios, este primeiro grupo consiste em SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e 58, ou seus análogos ou suas combinações. Adicionalmente, a presente invenção também diz respeito ao uso destas combinações de peptídeos para a preparação de vacinas de subunidades que protegem equinos contra infecção por Streptococcus equi. Nestas modalidades, o uso dos polipeptídios pode ser substituído pelo uso de vetores de expressão recombinantes de acordo com a presente invenção, os quais compreendem pelo menos um polinucleotídeo que codifica os ditos polipeptídios. Em particular, pelo menos um vetor de expressão recombinante que compreende pelo menos um polinucleotídeo que codifica pelo menos um

polipeptídio selecionado	de um	primeiro	grupo	de
polipeptídios que consistem	em SEQ ID	NOS: 18,	20, 22,	24,
26, 32, 34, 36, 38, 40, 48,	50, 52,	54, 56 e	58, ou	seus

análogos, e pelo menos um polinucleotídeo que codifica pelo menos outro imunógeno de Streptococcus equi, o qual não está presente neste primeiro grupo, notavelmente pelo menos um imunógeno selecionado de um segundo grupo de polipeptídios que consistem na proteína FNZ, proteína EAG, proteína SFS, proteína SEC, fragmento de SFSC 1, fragmento de FNZN, fragmento de SEC2.16, fragmento de SEC 1.18, fragmento de SclCl (WO-A-2004/032957) e ID NOS: 28, 30 ou seus análogos ou seus fragmentos, ou suas combinações são usados para o tratamento e/ou vacinação de equinos contra garrotilho. Em uma modalidade preferida, este primeiro grupo consiste em SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e 58, ou seus análogos ou suas combinações. Adicionalmente, a presente invenção também diz respeito ao uso desses vetores de expressão recombinantes para a produção de vacinas recombinantes que protegem eqüínos contra a infecção por Streptococcus equi.

Em uma modalidade particular as combinações dos polipeptídios a serem usados para o tratamento e/ou vacinação de eqüínos contra garrotilho são combinação de polipeptídios SEQ ID NOS: 52, 48, 22 e 26, ou seus análogos, ou seus fragmentos. Em uma modalidade mais preferida, as combinações de polipeptidios a serem usados para o tratamento de/ou vacinação de equinos contra garrotilho são uma combinação de polipeptidios SEQ ID NOS:

58, 54, 36 e 40, ou seus análogos.

Em uma modalidade particular, as combinações de polipeptidios a serem usadas para o tratamento e/ou vacinação de equinos contra a doença do garrotilho são combinações de polipeptidios de SEQ ID NOS: 52, 48, 22, 26 e 50, ou seus análogos ou seus fragmentos. Em uma modalidade mais preferida, as combinações de polipeptidios a serem usadas para o tratamento e/ou vacinação de equinos contra a doença do garrotilho são combinações de polipeptidios de SEQ ID NOS: 58, 54, 36, 40 e 56, ou seus análogos. Em uma modalidade particular, as combinações de polipeptidios a serem usadas para o tratamento e/ou vacinação de equinos contra a doença do garrotilho são combinações de polipeptidios de SEQ ID NOS 52, 48, 22, 26 e 20, ou seus análogos ou seus fragmentos. Em uma modalidade mais preferida, as combinações de polipeptidios a serem usadas para o tratamento e/ou vacinação de equinos contra a doença do garrotilho são combinações de polipeptidios de SEQ ID NOS: 58, 54, 36, 40 e 34, ou seus análogos.

Em uma modalidade particular, as combinações de polipeptidios a serem usadas para o tratamento e/ou vacinação de eqüinos contra a doença do garrotilho são combinações de polipeptidios de SEQ ID NOS: 52, 48, 22, 26 e 18, ou seus análogos ou seus fragmentos. Em uma modalidade mais preferida, as combinações de polipeptidios a serem usadas para o tratamento e/ou vacinação de eqüinos contra a doença do garrotilho são combinações de polipeptidios de SEQ ID NOS: 58, 54, 36, 40 e 32, ou seus análogos.

Posteriormente, a presente invenção refere-se a métodos para imunizar contra ou prevenir infecção estreptocócica em mamíferos, preferivelmente em espécies de eqüinos, caninos e humanos. De acordo com esses métodos, (1) uma composição ou vacina de subunidade imunogênica da presente invenção ou (2) uma composição ou vacina imunogênica recombinante da presente invenção ou suas combinações, são administradas. É claro, modalidades da presente invenção podem ser empregadas com outras vacinas ou composições imunogênicas que não são da invenção, por exemplo, processos de prime-boost, tais como onde uma vacina ou composição imunogênica da invenção é administrada primeiro e uma vacina ou composição imunogênica diferente é administrada depois ou vice-versa. Processos de prime-boost particulares podem ser aquele em que uma subunidade de vacina ou composição imunogênica é administrada primeiro e uma vacina ou composição imunogênica recombinante da invenção é administrada depois ou vice-versa.

A administração pode ser feita notadamente por injeção intramuscular (IM), intradérmica (ID), subcutânea (SC) ou transdérmica ou por via intranasal, intratraqueal administração oral ou através das orelhas ou do lábio. A composição imunogênica ou vacina de acordo com a invenção é administrada por uma seringa, uma seringa com microagulha (isto é, BD™ Intradermal Delivery System of Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) , equipamentos sem agulhas (como por exemplo, Pigjet, Avijet, Dermojet ou Biojector (Bioject, Oregon, USA), veja US-A2006/0034867) ou um spray. A administração é preferivelmente feita por injeção IM com uma seringa ou por injeção transdérmica com um equipamento sem agulha ou com uma seringa com microagulha (isto é, BD™ Intradermal Delivery System), ou por administração intranasal ou oral de uma vacina com um spray, isto é, uma nebulização líquida de uma vacina da invenção, ou por administração oral ou nasal de um pó micronizado de uma vacina liofilizada de acordo com a invenção.

A quantidade de composições imunogênicas ou vacinas pode ser determinada e otimizada para pessoa versada na técnica, sem experimentação exaustiva a partir dessa descrição e do conhecimento da técnica. Geralmente, um animal (incluindo um humano) pode ser tratado com aproximadamente 10⁴-10⁹ CFUs, vantajosamente aproximadamente 10⁵-10⁸ CFUs e mais vantajosamente com aproximadamente 10⁶-10⁸ CFUs em uma unidade de dosagem única de composições ou vacinas imunogênicas virais recombinantes da presente invenção; aproximadamente 10 ng-1 mg, vantajosamente aproximadamente lOOng a 500pg e mais vantajosamente aproximadamente lpg a 250pg por tipo de plasmídeo em uma unidade de dosagem única de composições ou vacinas imunogênicas de DNA da presente invenção; aproximadamente 5pg a lmg, vantajosamente aproximadamente 50pg a 500pg e mais vantajosamente aproximadamente 100 pg a 200pg em uma unidade de dosagem única de composições ou vacinas imunogênicas da presente invenção. No caso de composições terapêuticas e/ou farmacêuticas baseadas em um vetor de plasmídeo, uma dose pode compreender, consistir essencialmente ou consistir de, em termos gerais, cerca de pg a cerca de 2000 pg, vantajosamente cerca de 50 pg a cerca de 1000 pg e mais vantajosamente entre cerca de 100 pg a cerca de 800 pg de plasmídeo que expressa o antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse. Quando as composições terapêuticas e/ou farmacêuticas baseadas em um vetor de plasmídeo é administrada por eletroporação, a dose de plasmídeo está geralmente entre cerca de 0,1 pg e 1 mg, vantajosamente entre cerca de 1 pg e 100 pg, vantajosamente entre cerca de 2 pg e 50 pg. Os volumes da dose podem estar entre cerca de 0,1 e cerca de 2 mL, vantajosamente entre cerca de 0,2 a 1 mL. Essas doses e volume de doses são adeguadas para o tratamento das espécies-alvo de mamíferos. 0 volume de uma unidade de dosagem única por seringa pode estar entre 0,2 mL e cerca de 5,0 mL e vantajosamente entre cerca de 0,5 mL e cerca de 2,0 mL e mais vantajosamente cerca de 1,0 mL. O volume de uma unidade de dosagem única por um eguipamento sem agulha pode estar entre cerca de 0,1 mL e cerca de 1,0 mL e vantajosamente entre cerca de 0,2 mL e cerca de 0,5 mL. O volume de uma unidade de dosagem única por spray líquido pode estar entre cerca de 2,0 mL e cerca de 10,0 mL e vantajosamente cerca de 5,0 mL (para spray em pó, as quantidades administradas são correspondentes aos volumes equivalentes).

Em um método particular, potros, ou seja cavalos com 2 a 6 meses de idade e preferivelmente 3 a 4 meses de idade, são vacinados com vacinas de subunidade da presente invenção, suplementadas com CTB e/ou CTA e/ou Carbopol®, através da via intranasal ou oral. Em outro método particular, potros são vacinados com vacinas virais recombinantes da presente invenção, suplementadas ou não com Carbopol®, através da via oral com um spray e nebulização líquida. Preferivelmente, os vetores virais dessas vacinas virais recombinantes são EHV-4 ou EHV-2, ou EHV-1.

Em outro método particular, potros são vacinados com vacinas virais recombinantes da presente invenção através dos lábios com uma seringa. Preferivelmente, os vetores virais dessas vacinas virais recombinantes são EHV-4 ou EHV-2, ou EHV-1.

Preferivelmente, para a vacinação de cavalos e éguas, duas administrações de vacinas de subunidade da presente invenção, suplementadas com Carbopol® e/ou CpG e/ou emulsão são feitas por injeção IM com uma seringa. Administrações de reforço podem ser injetadas a cada 6 meses ou anualmente. Para éguas prenhas, uma administração de reforço pode ser injetada de 2 a 4 semanas antes da data provável do parto.

Preferivelmente para a vacinação de cavalos e éguas, duas administrações das vacinas de subunidade da presente invenção, auxiliadas com Carbopol® e/ou CpG, e ou emulsão são feitas por injeção IM com uma seringa. Administrações de reforço podem ser injetadas a cada 6 meses ou anualmente. Para éguas grávidas, uma administração de reforço pode ser injetada de 2 a 4 semanas antes da data esperada para dar cria.

Os polipeptidios da invenção e seus fragmentos também podem ser usados na terapia.

Os polipeptidios e fragmentos também podem ser usados como reagentes em reações anticorpo-antigeno. Concordantemente, outro aspecto da invenção é, desta forma, um método de diagnóstico e/ou kit para detectar infecção por bactérias estreptococos. Kits, por exemplo ELISA, podem incluir pelo menos um polipeptidio ou fragmento de acordo com a invenção (por exemplo, pelo menos um polipeptidio identificado pela sequência aqui ou um fragmento seu conforme aqui discutido).

Anticorpos contra os polipeptidios daqui ou fragmentos (por exemplo, polipeptidios identificados pela sequência aqui ou seus fragmentos conforme aqui discutidos) podem ser usados como reagentes de diagnóstico ou na imunização passiva ou na vacinação ou na terapia. As quantidades de anticorpo administradas na imunização passiva podem ser as mesmas ou análogas às quantidades usadas na técnica, tal como aquelas do conhecimento da técnica, o artesão da técnica podendo praticar imunização passiva sem experimentação demasiada.

As proteínas codificadas pelo novo vírus da presente invenção, ou seus fragmentos, podem ser usadas para produzir anticorpos, tanto policlonais quanto monoclonais. Se os anticorpos policlonais forem desejados, um mamífero selecionado (por exemplo, camundongo, coelho, cabra, cavalo, etc.) é imunizado com um antígeno da presente invenção, ou seu fragmento, ou um antígeno modificado. Soro do animal imunizado é coletado e tratado de acordo com os procedimentos conhecidos. Ver, por exemplo, Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 348: 363-370. Se soro contendo anticorpos policlonais for usado, os anticorpos policlonais podem ser purificados por cromatografia de imunoafinidade, usando procedimentos conhecidos.

Outro aspecto da invenção é uma preparação de anticorpo compreendendo um anticorpo específico para um polipeptídio ou um fragmento de acordo com a invenção e métodos de diagnóstico usando os mesmos. Em relação a um anticorpo específico para um polipeptídio, se entende que o anticorpo se liga preferivelmente ao polipeptídio, por exemplo, o anticorpo se liga ao polipeptídio e não a outros polipeptídios ou tem uma especificidade pelo polipeptídio que é aceitavelmente particular para o polipeptídio, de forma que o anticorpo possa ser usado para isolar o polipeptídio de uma amostra ou detectar a sua presença numa amostra com não mais do que 5% de falsos positivos, usando técnicas conhecidas na arte ou discutidas em documentos aqui citados, incluindo Sambrook, infra.

Anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais.

Se anticorpos policlonais forem desejados, um animal selecionado (por exemplo, camundongo, coelho, cabra, cavalo, etc.) é imunizado com um polipeptidio ou um fragmento. Soro do animal imunizado é coletado e tratado de acordo com procedimentos conhecidos e possivelmente purificado. Ver, por exemplo, Jurgens et al., J. Chrom., 1985, 348: 363 - 370.

Anticorpos monoclonais para as proteínas e para os seus fragmentos também podem ser prontamente produzidos por uma pessoa versada na técnica. A metodologia geral para fazer anticorpos monoclonais pelo uso da tecnologia do hibridoma é bem conhecida. Linhagens celulares imortais produtodas de anticorpo podem ser criadas por fusão celular, e também por outras técnicas tais como tansformação direta de linfócitos B com DNA oncogênico, ou transfecção com vírus Epstein-Barr. Ver, por exemplo, M. Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981); Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980); ver também Patentes Americanas Nos. 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783;

4.444.887; 4.452.570; 4.466.917; 4.472.500, 4.491.632; e 4.493.890. Os painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra a proteína desejada ou seu fragento podem ser varridos para várias propriedades: isto é, para isotipo, epítopo, afinidade, etc. Anticorpos monoclonais são úteis na purificação, usando técnicas de imunoafinidade dos antígenos individuais para os quais eles são direcionados contra. Tanto anticorpos policlonais quanto monoclonais podem ser usados para imunização passiva ou podem ser combinados com preparações de vacina de subunidade para intensificar a resposta imune. Anticorpos policlonais e monoclonais também são úteis para propósitos de diagnóstico.

Uma modalidade da invenção é um método para desencadear uma resposta imune contra o antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse num animal, compreendendo a administração de uma formulação para distribuição e expressão de uma vacina recombinante numa quantidade eficaz para desencadear uma resposta imune. Ainda outra modalidade da invenção é um método de indução de uma resposta imunológica ou protetora num animal, compreendendo a administração ao animal de uma quantidade eficaz de uma formulação para distribuição e expressão de um antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse, em que a formulação compreende uma vacina recombinante e um carreador, veículo ou excipiente veterinariamente aceitável.

A invenção se refere a um método para desencadear, induzir ou estimular a resposta imune de um animal, vantajosamente de um animal ou de um vertebrado.

Outra modalidade da invenção é um kit para efetuar um método de indução de uma resposta imunológica ou protetora contra um antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse num animal compreendendo uma vacina recombinante e instruções para efetuar o método de distribuição numa quantidade eficaz para desencadear uma resposta imune no animal.

A invenção será agora adicionalmente descrita a título dos seguintes exemplos não-limitativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Estudo ELISA de polipeptidios de Streptococcus equi

As respostas de anticorpo IgG direcionadas contra as proteínas da superfície celular de Streptococcus equi em soros retirados de pôneis inoculados intranasalmente com 4 doses de Streptococcus equi cepa 4047 foram determinadas por ELISA. Essas proteínas de Streptococcus equi foram obtidas por expressão in vitro em Escherichia coli. As respostas do anticorpo nos soros de seis pôneis que receberam as doses mais elevadas de 3xl0⁷ e 3xl0⁵ cfu foram calculadas e comparadas com aquelas dos pôneis inoculados com 3000 e 30 cfu de Streptococcus equi 4047. Pôneis que receberam as doses mais elevadas desenvolveram garrotilho. Aqueles que receberam as doses menores permaneceram saudáveis durante o estudo. Com base nos resultados desse estudo, polipeptidios de Streptococcus equi foram selecionados para expressão em Escherichia coli e para teste de eficácia em camundongos e pôneis.

Exemplo 2: Expressão de polipeptidios recombinantes de Streptococcus equi em Escherichia coli

Polinucleotideos codificando fragmentos de Se50, Sel459 e Se358 foram produzidos usando Vent DNA polimerase (New England Biolabs® Inc.) nas condições como recomendadas pelos fabricantes com uma etapa de desnaturação de 5 minutos seguida por 35 ciclos de anelamento por 30 segundos a 50-55°C, 1 minuto de extensão a 72°C e 30 segundos de desnaturação a 95°C. Os produtos foram finalizados com uma extensão de 4 minutos a 72°C. O modelo em cada caso foi o DNA cromossômico de Streptococcus equi cepa 4047. Os fragmentos de Se50, Sel459 e Se358 são aqueles designados como SEQ ID NOS: 32, 34 e 40, respectivamente.

Polinucleotideos que codificam fragmentos de Se528 e

Se595 foram produzidos usando pfu polimerase nas mesmas condições acima exceto o tempo de extensão estendido para dois minutos a 72°C. Os fragmentos de Se528 e Se595 são aqueles designados como SEQ ID NOS: 38 e 36, respectivamente.

Tabela 1: Iniciadores usados para clonar e subunidades de sequência recombinante

Nome do iniciador	Sequência	Função	SEQ ID NO:
5'5-GST	AAAGGATCCTACAGCCAGCAGCACTAAAA	Clonagem de Se50	1
3'50GST	AAAGAATTCTTGGGCAGCTTCTTCTA	Clonagem de Se50	2
5'1459GST	TTTGGATCCTATCGGAACCCAATCCATAT	Clonagem de Sel459	3
3'1459GST	AAAGAATTCATTTTTAAGTTCAAACTC	Clonagem de Sel459	4
5'595GST	AAAGGATCCTAGCTACCCTCATCACAGGA	Clonagem de Se595	5
3'595GST	TTTGAATTCTTGTTTTTTAGGTGTTGC	Clonagem de Se595	6
5' 528	TTTGGATCCTAGAGGTAGTTGAAGTTTGGCCTAATGGG	Clonagem	7

Nome do iniciador	Sequência	Função	SEQ ID NO:
LONG		de Se528
3' 528 LONG	AAAGAATTCTTTTTCTGTCTTGTTGAAGTAATCTGCCC	Clonagem de Se528	8
ASW4 9	GACGGATCCCCTCTAATGGTGGAAACAAAGGAAGC	Clonagem de Se358	9
ASW50*	GACTGAATTCAAACAAAGCACAACACCAG	Clonagem de Se358	10
5'pGEX	GGGCTGCAAGCCACGTTTGGTG	Sequencia mento	11
3'pGEX	CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG	Sequencia mento	12
595 Seql	AAAGAGCTAATCTGGCAG	Sequencia mento de Se5 95	13
595 seq2	CTCAATTGGAGGCTACAG	Sequencia mento de Se595	14
595 seq3	TGACGCTTCCAAAGCAAG	Sequencia mento de Se595	15

Nome do iniciador	Sequência	Função	SEQ ID NO:
595 seq4	CTCCGGAAACACCAAAGG	Sequencia mento de Se595	16

* Se358 recombinante termina no códon de parada real para Se358 já que o sítio do iniciador ASW50 está localizado à jusante do gene.

Todos os produtos de PCR foram purificados usando o kit de purificação Qiaquick PCR (Qiagen) com um volume de eluição de 32pL, então digeridos com a adição de tampão de EcoRI (3,5pL) (New England Biolabs® Inc.), BamHI (0,75pL) e EcoRI (0,75pL) por 2 horas a 37°C. 1 pg de plasmideo pGEX3X (GE Healthcare) também foi digerido com EcoRI e BamHI como descrito acima. Os plasmídeos pGEX-3X têm sítios de clonagem múltipla, um promotor tac, gene de glutationa Stransferase (GST) e códons de parada em todas as três fases, para a produção de proteínas de fusão de GST e seu isolamento e purificação.

Todos os produtos de digestão foram corridos em gel de agarose TAE 0,7%, o produto de restrição desejado cortado e purificado usando o kit de extração Qiaquick gel (Qiagen)

100 com uma eluição final de 35pL.

As reações de ligação foram iniciadas usando 16,5pL de produto de PCR purificado digerido e lpL de plasmídeo pGEX3X com 2pL de tampão de ligase e 0,5pL de ligase, e incubadas durante a noite em temperatura ambiente (rtp).

As reações de ligação foram transformadas em E. coli cepa DH10B e plaqueadas sobre placas de L-ágar suplementadas com ampicilina 50 pg/mL e incubadas durante a noite a 37°C. Os transformantes foram testados quanto à presença do inserto por PCR de colônia. Uma única colônia foi ressuspensa em 4pL de água e 2pL disso foram adicionados a uma reação de PCR com Taq DNA polimerase contendo os iniciadores de clonagem apropriados para o polinucleotídeo de interesse e 35 ciclos de extensão foram realizados conforme descrito acima (1 minuto para Se50, Sel459 e Se358 e 2 minutos para Se595 e Se528). A presença do inserto desejado foi confirmada pela corrida da reação de PCR sobre géis de TAE agarose 0,7%.

Os plasmídeos de cada um dos clones foram preparados e sequenciados usando iniciadores 5' e 3' pGEX-3X PCR para todos os clones (Tabela 1). Devido a seu tamanho, Se595 também foi sequenciado usando os iniciadores adicionais listados acima (Tabela 1). Todos os polinucleotídeos clonados foram confirmados ter a mesma sequência como a

101 sequência montada do genoma de Streptococcus equi cepa 4047 (http://www.sanger.ac.uk/Projects/S equi/).

Clones de Sel459, Se595, Se528, Se50 e Se358 foram induzidos para expressão usando o seguinte protocolo. Uma única colônia foi inoculada em 50 mL de meio de cultura 2 x YT contendo ampicilina 50pg/mL e foi cultivada durante a noite com agitação a 220 rpm a 37°C. Essa cultura foi então adicionada a 500 mL de YT 2 x pré-aquecido (37°C) e prégaseificado e incubada por 1 hora a 37°C. Para todas as culturas, após 1 hora, 200 pL foram removidos e as células foram coletadas para análise (essa sendo a amostra de préindução), ITPG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranosideo) foi adicionado para uma concentração final de 0,1 mM e uma amostra de 100 pL foi removida para análise, após o que as células foram coletadas por centrifugação e armazenadas a -

70°C.	Todas as amostras	foram	analisadas	usando	SDS-PAGE
10%.
	Para Sel459,	Se595,	Se528,	Se50 e Se358, os	péletes
foram	ressuspensos	em 20	mL de	PBS gelado	(Oxoid	Limited,

catálogo # BR0014G), PMSF (Fluoreto de Fenilmetil sulfonil) foi adicionado para uma concentração final de 0,1 mM e as células foram lisadas por sonicação sobre gelo com pulsos de 6 x 10 segundos com 10 segundos de repouso entre cada pulso. Triton X-100 0,1% (v/v) foi adicionado e as células

102 insolúveis e intactas foram removidas por centrifugação (ll.OOOg, 5 min 4°C) . Amostras do lisado bacteriano solúvel e do material insolúvel foram analisadas por SDS-PAGE. DTT (ditiotreitol; reagente de Cleland) (5 mM) foi adicionado e 1,3 mL de glutationa sefarose 4B foram adicionados (igual a 1 mL de esferas, essas foram pré-lavadas três vezes com 20 mL de PBS). A mistura foi incubada em temperatura ambiente por 1 hora e então as esferas foram coletadas por centrifugação (800 g, 2 min, rtp) e lavadas três vezes com 50 mL de PBST gelado (PBS com Triton X-100 0,1% v/v) . Amostras de cada lavagem (lavagens 1 a 3) foram retiradas para análise por SDS-PAGE como foi a amostra de proteína de fusão acoplada às esferas. Todas as amostras foram analisadas usando SDS-PAGE 10%.

A remoção do veículo de GST foi feita para todas as proteínas de fusão por divagem com protease.

Para Sel459, Se595, Se528, Se50 e Se358, as reações de divagem foram realizadas com a proteína de fusão acoplada a esferas de glutationa sefarose. As esferas foram equilibradas primeiro uma vez com 20 mL de tampão de lavagem (Tris-HCl, 50 mM, pH 7.5, NaCl, 150 mM) e depois duas vezes com 20 mL tampão de divagem (tampão de lavagem com CaCl₂, 1,0 mM) e finalmente ressuspensas em 1 mL de tampão de divagem. Fator Xa (New England Biolabs® Inc.)

103 (50 unidades) foi adicionado e incubado em um misturador rotatório por 16 horas em temperatura ambiente. A proteína

liberada foi recuperada	pela	peletização	das	esferas de
glutationa	(800 g, 2 min,	rtp:	) e retenção	do sobrenadante.
As esferas	foram lavadas	duas	vezes com 1	mL de	tampão de
lavagem e	o sobrenadante	foi	retido a cada vez.	Alíquotas
de cada	sobrenadante	e	as esferas	de	glutationa

remanescentes foram analisadas por SDS-PAGE. As esferas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem 2 (Tris-HCL, 10 50 mM, pH 8,0) e eluídas com 3 mL de tampão de lavagem 2 contendo glutationa reduzida 0,5 mM por 2 min em temperatura ambiente seguido pela peletização das esferas (800 g, 2 min, rtp) e retenção do sobrenadante. Essa eluição foi repetida duas vezes e a pureza de cada fração 15 foi analisada por SDS-PAGE.

Todas as proteínas foram dialisadas duas vezes em 5 litros de tampão fosfato de sódio 20 mM pH 7.4 a 4°C durante a noite.

Após a diálise, qualquer material insolúvel foi 20 removido por centrifugação (10.000 g, 2 min, 4°C) e então foi armazenada a -70°C.

Exemplo 3: Proteção em camundongos depois da administração da vacina de subunidade e estímulo com Streptococcus equi

O objetivo deste estudo foi determinar se a vacinação

104 com a vacina de subunidade de Streptococcus equi protegeu camundongos do estímulo com Streptococcus equi intranasal subsequente.

Cinco vacinas de subunidade de Streptococcus equi foram usadas, Se595, Se358, Sel459, Se50 e Se528. Todas essas vacinas usaram as proteínas de Streptococcus equi obtidas no Exemplo 2. As proteínas de Streptococcus equi recombinantes Se595, Se358, Sel459, Se50 e Se528 foram purificadas por tampão trocado em fosfato de sódio pH 7,4

20 mM e concentradas para proporcionar uma concentração equivalente à concentração molar de Se358 a 10 pg/mL, onde possível. Proteínas, Se595 e Se528 foram insolúveis na concentração desejada. As concentrações de proteína verdadeiras estão mostradas na Tabela 2.

Tabela 2: Doses efetivas das subunidades recombinantes administradas

Proteína	Dose administrada	Dose equivalente a Se358
Se595	11,2 pg	5,3 pg
Se358	10 pg	10 pg
Sel459	1,7 pg	10 pg
Se50	1,9 pg	9, 6 pg

105

Proteína	Dose administrada	Dose equivalente a Se358
Se528	4,2 pg	3, 4 pg

As proteínas purificadas em fosfato de sódio 20 mM, pH

7,4, foram diluídas 1:3 em adjuvante TS6 (exemplo 1 de USA-2005/0079185) antes da administração.

Grupos de 2 0 de camundongos BalbC fêmeas de 3 a 4 semanas de idade foram vacinados no dia zero (D0) com cada uma das cinco vacinas de subunidade de Streptococcus equi. As vacinações foram efetuadas por injeção intramuscular na coxa e intranasalmente. Esses camundongos receberam uma vacinação de reforço depois de 4 semanas (D28) e foram estimulados com Streptococus equi depois de mais 2 semanas (D42) . Um grupo de controle adicional que não recebeu vacinação também foi incluído, e foi estimulado em D42. Um grupo de 5 camundongos de controle não foi vacinado ou estimulado com Streptococcus equi (veja Tabela 3).

O tamanho do grupo é suficiente para detectar 50% de proteção do camundongo vacinado com 80% de infecção dos controles. Sangue foi retirado antes da vacinação, antes do reforço, antes do estímulo e na eutanásia para determinar o nível de resposta de anticorpo em relação à vacinação e estímulo.

106

A cepa de Streptococcus equi 4047 foi cultivada para o estímulo em caldo Todd Hewitt (THB) suplementado com soro fetal bovino 10% (FCS) . Uma cultura de um dia para o outro foi diluída de 1:20 para inocular THB + FCS 10% préaquecido e gaseificado fresco e a cultura cresceu até ser alcançada uma OD₆oo nm de 0,3. Nesse ponto, foram feitas diluições da cultura. Após o preparo da dose necessária da cepa de Streptococcus equi 4047, os camundongos foram sedados com 100 mg/Kg de Ketaset por injeção intramuscular e foram estimulados por administração intranasal de 10 qL de inóculo estímulo contendo aproximadamente 1 χ 10⁴ cfu de

S. equi.

Imediatamente após o estímulo, a dose administrada foi quantificada por titulação reversa e foi verificada como contendo 0,9 χ 10⁴ cfu.

Todos os camundongos foram cuidadosamente monitorados para assegurar a completa recuperação da sedação e verificados regularmente quanto ao início dos sinais clínicos de doença; Esses incluíram mal-estar, calafrio ou falta de secreção sebácea e foram tomados como um sinal de efeito moderado com o início de efeitos mais severos possível. Os camundongos foram, finalmente, eutanasiados.

As observações clínicas foram registradas diariamente através do estudo e os camundongos foram pesados antes da

107 vacinação, antes do reforço, antes do estímulo e, a seguir, diariamente após o estímulo. Esfregaços nasais foram retirados dos camundongos após o estímulo para quantificar o nível de liberação de Streptococcus equi. Um exame pós5 morte foi efetuado em todos os camundongos.

Tabela 3: Resumo do protocolo de estudo

N° de camundon gos	Idade do camundon go	Subunida de da vacina	Dose	Reforço	Dose de estimulo (cfu)	Via
20	3-4 semanas	Se595 + adjuvant e	20 μΐ IN + IM	Sim	1 χ 104	10 μΣ de IN
20	3-4 semanas	Se358 + adjuvant e	20 μ! IN + IM	Sim	1 χ 104	10 μΙ> de IN
20	3-4 semanas	Sel459 + adjuvant e	20 μΣ IN + IM	Sim	1 χ 104	10 μ!> de IN
20	3-4 semanas	Se50 + adjuvant e	20 μΐι IN + IM	Sim	1 χ 104	10 μΙ. de IN
20	3-4 semanas	Se528 + adjuvant e	20 μΙ, IN + IM	Sim	1 χ 104	10 μΒ de IN

108

N° de camundon gos	Idade do camundon go	Subunida de da vacina	Dose	Reforço	Dose de estimulo (cfu)	Via
60	3-4 semanas	Sem vacina	Sem vacina	Não	1 x 104	10 μΣ de IN
5	3-4 semanas	Nenhum	Nenhum	Não	Nenhum	10 μΣ de IN

A fase de vacinação procedeu sem incidente, todos os grupos ganharam peso de acordo com os controles. Nenhuma reação de sítio de injeção adversa foi identificada. Todos os camundongos soroconverteram em relação à vacinação 5 administrada.

Após o estímulo, os grupos vacinados com Se595, Se358, Sel459, Se528 e Se50 geralmente têm sinais reduzidos de doença, perda de peso reduzida, mais ganho de peso, colonização nasal reduzida e sobrevivência melhorada em 10 comparação com os controles. Cada camundongo foi examinado no dia do estímulo e em cada um dos 7 dias a seguir para a ocorrência de sintomas associados com Streptococcus equi (letargia, perda de peso, espirro, ereção de pêlos, agachamento, desequilíbrio do ouvido interno). Os 15 camundongos foram examinados pelo menos 4 vezes por dia. O método de pontuação e registro a seguir foi aplicado

109 (Tabela 4).

Tabela 4: Método de pontuação de garrotilho

Observação	Pontuação
Normal	0
Leve piloereção	1
Piloereção	3
Quieto	3
Espirro acentuado	3
Encurvado	5
Respiração rápida	5
Desequilíbrio do ouvido	5
Imóvel	10

Por exemplo: um camundongo com ereção de pêlos que

esteja quieto,	encurvado e imóvel poderia	pontuar 3 +	3 + 5
5 + 10 = 21.
Os pesos	dos	camundongos foram	analisados	numa
planinha diariamente	para determinar a %	de perda de	peso

em relação ao dia do estímulo.

Após o estímulo, o nariz de cada camundongo foi tocado numa placa de ágar seletiva para estreptococos claramente marcados diariamente (bioMerieux) . As placas foram riscadas para determinar se bactérias S. equi viáveis estavam presentes. 0 nível de esfoliação de S. equi foi

110 classificado de acordo com o seguinte sistema de pontuação de 4 pontos: 0 = sem crescimento, 1 = 1 - 10 colônias presentes, 2 = 11 - 100 colônias presentes, 3 = mais de 100 colônias e 4 - crescimento confluente.

As amostras de sangue foram retiradas da veia da coxa. O soro foi preparado e armazenado, congelado a -20°C ou abaixo até o uso.

Os sinais clínicos foram observados a partir dos dias D44, 2 dias após o estímulo. Os grupos vacinados geralmente tinham sinais clínicos menores do que os grupos de controle. Os camundongos vacinados com Se50 e Se358 tinham o menor dos sinais clínicos de doença. Aqueles vacinados com Se595 tinham sinais clínicos de doença por um período reduzido comparado com os controles (FIG. 1) . No exame na alteração percentual média na massa após o estimulo, em relação ao dia do estimulo (D42), ficou claro que os Grupos vacinados com Se528, Sel459 e Se50 tinham uma perda de peso levemente reduzida. Entretanto, camundongos vacinados com Se358 e Se595 pareceram mais protegidos (FIG. 2). Conforme esperado, o número médio de bactérias β-hemolíticas isoladas toques com o focinho aumentou após o estímulo, atingindo o pico no D45 (3 dias após o estímulo) . No D45, as menores pontuações de toques nasais foram vistas nos grupos vacinados com Se358, Se595, Se50 e Sel459. Os grupos

111 vacinados geralmente tinham pontuações menores que os grupos de controle. A exceção sendo camundongos vacinados com Se358, os quais atingiram o pico no D46 (FIG. 3).

Tabela 5: respostas sorológicas de IgG

	Diluição dos soros em ELISA	Soroconversão
Se595	1:80000*	Todos os camundongos soroconverteram
Se358	1:160000*	Todos os camundongos soroconverteram
Sel459	1:100**	Todos os camundongos soroconverteram
Se50	1:160000*	Todos os camundongos soroconverteram
Se528	1:3000*	Todos os camundongos soroconverteram

*diluição dos soros para se obter uma leitura de ELISA de cerca de 1,5 em estudos preliminares.

** diluição dos soros para se obter uma leitura de ELISA de cerca de 0,3 em estudos preliminares.

Exemplo 4: Expressão de polipeptidios recombinantes d.e Streptococcus equi Sel631, Sel681 e Sla em Escherichia coli

Polinucleotideos que codificam os fragmentos de Se

112

1631, Se 1681 e Sla foram produzidos usando Vent DNA polimerase (New England Biolabs® Inc.) de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante com uma etapa de desnaturação de 5 minutos seguida por 35 ciclos usando 30 segundos de anelamento a 50 a 55°C, 1 minuto extensão a 72 C, e 30 segundos de desnaturação a 95°C. Os produtos foram finalizados com uma extensão de 4 minutos. O molde em cada caso foi DNA cromossômico de cepa 4047 de Streptococcus equi.

Os fragmentos de Sel631, Sel681 e Sla são aqueles designados como SEQ ID NOS: 53, 55 e 57, respectivamente.

Tabela 6:

Iniciadores usados para clonar e sequências subunidades recombinantes.

Nome do iniciador	Sequência	Função	SEQ ID NO:
5’1631GST	AAAGGATCCTGCAGTCTACAAATGACAATAC	Clonagem de Sel631	41
3’1631GST	AAAGAATTCTTATTTTTCTGACTTAGATTTAGAAG	Clonagem de Sel631	42
5’1681GST	AAAGGATCCTGGCGACTACCCTAGCAGGACAAAC	Clonagem de Sel681	43
3’168JGST	AAAGAATTCTTATGTATCTTGACAGTGCTTAAG	Clonagem	44

113

		de Sel681
5?SLAGST	CCCGGATCCTAGAAGGGATAAATGATAAAATAG	Clonagem de Sla	45
3’SLAGST	TTTGAATTCTTACAAAACATCTACTACTGGCAAC	Clonagem de Sla	46

Todos os produtos de PCR foram purificados usando o kit de purificação Qiaquick PCR (Qiagen) com um volume de eluição de 32pL, e então digeridos com a adição de tampão de EcoRI (3,5pL) (New England Biolabs® Inc.), BamHI (0,75pL) e EcoRI (0,75pL) por 2 horas a 37°C. 1 pg de plasmideo pGEX-3X (GE Healthcare) também foi digerido com

EcoRI e BamHI como descrito acima. Os plasmídeos pGEX-3X têm sítios de clonagem múltipla, um promotor de tac, gene de glutationa S-transferase (GST) e códons de parada em 10 todas as três fases, para a produção de proteínas de fusão de GST e seu isolamento e purificação.

Todos os produtos de digestão foram corridos em géis de agarose TAE 0,7%, o produto de restrição desejado cortado e purificado usando o kit de extração Qiaquick gel 15 (Qiagen) com uma eluição final de 35pL.

As reações de ligação foram iniciadas usando 16,5pL de produto de PCR purificado digerido e lpL de plasmideo pGEX3X com 2pL de tampão de ligase e 0,5pL de ligase, e

114 incubadas durante a noite em temperatura ambiente (rtp).

As reações de ligação foram transformadas em E. coli cepa DH10B e plaqueadas sobre placas de L-ágar suplementadas com ampicilina 50 pg/mL e incubadas durante a noite a 37°C. Os transformantes foram testados quanto à presença do inserto por PCR de colônia. Uma única colônia foi ressuspensa em 4pL de água e 2pL disso foram adicionados a uma reação de PCR com Taq DNA polimerase contendo os iniciadores de clonagem apropriados para o polinucleotídeo de interesse e 35 ciclos de extensão foram realizados conforme descrito acima. A presença do inserto desejado foi confirmada pela corrida da reação de PCR sobre géis de TAE agarose 0,7%.

Os plasmídeos de cada um dos clones foram preparados e sequenciados usando iniciadores 5' e 3' pGEX-3X PCR para todos os clones (Tabela 6) . Todos os polinucleotídeos clonados foram confirmados ter a mesma sequência como a sequência montada do genoma de Streptococcus equi cepa 4047 (http://www.sanger.ac.uk/Projects/S equi/) .

Todos os clones foram induzidos para expressão usando o seguinte protocolo. Uma única colônia foi inoculada em 50 mL de meio de cultura 2 x YT contendo ampicilina 50pg/mL e foi cultivada durante a noite com agitação a 220 rpm a 37°C. Essa cultura foi então adicionada a 500 mL de YT 2 x

115 pré-aquecido (37°C) e pré-gaseifiçado e incubada por 1 hora a 37°C. Após 1 hora, 200 pL foram removidos e as células foram coletadas para análise (essa sendo a amostra de préindução), ITPG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranosideo) foi adicionado para uma concentração final de 0,1 mM e a temperatura foi reduzida para 28°C. A cultura foi induzida por mais quatro horas e uma amostra de 100 pL foi removida para análise, após o que as células foram coletadas por centrifugação e armazenadas a -70°C.

Todas as amostras foram analisadas usando SDS-PAGE

10%.

Os péletes foram ressuspensos em 20 mL de PBS gelado (Oxoid Limited, catálogo # BR0014G), PMSF (Fluoreto de

Fenilmetil sulfonil) foi adicionado para uma concentração final de 0, 1 mM e as células foram lisadas por sonicação sobre gelo com pulsos de 6 x 10 segundos com 10 segundos de repouso entre cada pulso. Triton X-100 0,1% (v/v) foi adicionado e as células insolúveis e intactas foram removidas por centrifugação (ll.OOOg, 5 min 4°C) . Amostras do lisado bacteriano solúvel e do material insolúvel foram analisadas por SDS-PAGE. DTT (ditiotreitol; reagente de Cleland) (5 mM) foi adicionado e 1,3 mL de glutationa sefarose 4B foram adicionados (igual a lml de esferas, essas foram pré-lavadas três vezes com 20 mL de PBS) . A

116 mistura foi incubada em temperatura ambiente por 1 hora e então as esferas foram coletadas por centrifugação (800 g, 2 min, rtp) e lavada três vezes com 50 mL de PBST gelado (PBS com Triton X-100 0,1% v/v) . Amostras de cada lavagem (lavagens 1 a 3) foram retiradas para análise por SDS-PAGE como foi a amostra de proteína de fusão acoplada as esferas. Todas as amostras foram analisadas usando

SDS-PAGE

10%.

A remoção do veículo de GST foi feita para todas as proteínas de fusão por divagem com protease

As reações de divagem foram realizadas com a proteína de fusão acoplada a esferas de glutationa sefarose.

As esferas foram equilibradas primeiro uma vez com 20 mL de tampão de lavagem (Tris-HCl, 50 mM, pH 7.5, NaCI, 150 mM) depois duas vezes com 20 mL tampão de divagem (tampão de lavagem com CaCl₂, e finalmente ressuspensas em 1 mL de tampão de divagem.

Fator Xa (New England Biolabs® unidades) foi adicionado e incubado em um misturador rotatório por 16 horas em temperatura ambiente.

A proteína liberada foi recuperada pela peletização das esferas de glutationa (800 g, 2 min, rtp) e retenção do sobrenadante. As esferas foram lavadas duas vezes com 1 mL de tampão de lavagem e o sobrenadante foi retido a cada vez.

Alíquotas de cada sobrenadante e as esferas de

117 glutationa remanescentes foram analisadas por SDS-PAGE. As esferas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem 2 (Tris-HCL, 50 mM, pH 8,0) e eluidas com 3 mL de tampão de lavagem 2 contendo glutationa reduzida 0,5 mM por 2 min em temperatura ambiente seguido pela peletização das esferas (800 g, 2 min, rtp) e retenção do sobrenadante. Essa eluição foi repetida duas vezes e a pureza de cada fração foi analisada por SDS-PAGE.

Todas as proteínas foram dialisadas duas vezes em 5 litros de tampão fosfato de sódio 20 mM pH 7.4 a 4°C durante a noite.

Após a diálise, qualquer material insolúvel foi removido por centrifugação (10.000 g, 2 min, 4°C) e então foi armazenada a -70°C.

Exemplo 5: Proteção em camundongos após administração de vacina de subunidade Sel631, Sel681 ou Sla e estimulo com Streptococcus equi

Grupos de 20 de camundongos BalbC fêmeas de 3 a 4 semanas de idade foram vacinados no dia o (D0) com cada um dos peptídeos de S. equi Sel631, Se 1681 e Sla e um grupo de controle com GST + adjuvante. Este tamanho de grupo é suficiente para detectar 50% de proteção de camundongos com 80% de infecção de controles. Um grupo controle adicional de 5 camundongos que não recebeu nenhuma vacinação ou

118 estimulo foi incluído (veja a Tabela 7). Três vacinas de subunidade de Streptococcus equi foram usadas, Sel631, Sel681358 e Sla. Todas estas vacinas usaram as proteínas de Streptococcus equi obtidas no Exemplo 4.

As proteínas recombinantes foram preparadas para vacinação por concentração de centricon em tampão fosfato em tampão fosfato 0,02 M pH 7,4 a 7,5 mg/mL e adicionar 2 partes de adjuvante TS6 (exemplo 1 de US-A-2005/0079185).

Os camundongos foram vacinados no Dia 0 e o reforço no Dia 28. Vacinações de IM foram administradas na coxa esquerda no Dia o e na coxa direita no Dia 28 de acordo com a seguinte tabela. Vacinações de IN serão administradas através de uma pipeta nas narinas dos camundongos.

Sangue foi retirado antes da vacinação, antes do reforço, antes do estímulo e na eutanásia para determinar o nível de resposta de anticorpo em relação à vacinação e estímulo.

Os camundongos foram estimulados com S. equi após mais 2 semanas. A cepa de S. equi 4047 foi preparada conforme o exemplo 3. Após a diluição para a dose necessária, 10 pL foram administrados a camundongos sedados pela via intranasal em um ambiente contido. Os camundongos foram cuidadosamente monitorados para garantir a completa recuperação da sedação e checados regularmente quanto ao

119 inicio dos sinais clínicos de doença. Estes incluem malestar, mal-estar, calafrio ou falta de secreção sebácea e foram tomados como um sinal de efeito oderado com o início de efeitos mais severos possível.

Tabela 7: Resumo do protocolo de estudo

N° de camundon gos	Idade do camun dongo	Subunida de da vacina	Dose	Reforço	Dose de estimulo (cfu)	Via
			20
	3-4	Sel631 +	μΣ					10	μΣ
20	seman	adjuvant	IN +	Sim	1	X	104	de	IN
	as	e	IM
			20
	3-4	Sel681 +	μΣ					10	μΣ
20	seman	adj uvant	IN +	Sim	1	X	104	de	IN
	as	e	IM
			20
	3-4	Sla +	μΣ					10	μΣ
20	seman	adj uvant	IN +	Sim	1	X	104	de	IN
	as	e	IM
	3-4	GST +	20					10	μΣ
20	seman	adj uvant	μΣ	Sim	1	X	104	de	IN

120

	as	e	IN + IM
5	3-4 seman as	Nenhum	Nenh um	Não	Nenhum	10 gL de IN

As observações clínicas foram registradas diariamente por todo o estudo (para o método de pontuação veja a Tabela

4) e camundongos foram pesados antes da vacinação, antes do reforço, antes do estímulo e então diariamente após o 5 estímulo. Toques nos focinhos foram tomados de camundongos após o estímulo para quantificar o nível de liberação de S. equi.

Os sinais clínicos foram observados a partir dos dias

D44, 2 dias após o estímulo. Os grupos vacinados geralmente tinham sinais clínicos menores do que os grupos de controle. Os camundongos vacinados com Sel631 tinham o menor dos sinais clínicos de doença. Aqueles vacinados com Sel681 e Sla tinham sinais clínicos de doença por um período reduzido comparado com os controles (FIG. 4).

No exame na alteração percentual média na massa após o estimulo, em relação ao dia do estimulo (D42), ficou claro que os Grupos vacinados com Sel681, Sel631 e Sla tinham uma perda de peso levemente reduzida. No dia D49, os

121 camundongos vacinados com Sla pareceram menos protegidos (FIG. 5) .

Conforme esperado, o número médio de bactérias βhemoliticas isoladas toques com o focinho aumentou após o estímulo, atingindo o pico no D49 (7 dias após o estímulo). No D49, as menores pontuações de toques nasais foram vistas nos grupos vacinados com Sel631 e Sel681. Os grupos vacinados geralmente tinham pontuações menores que os grupos de controle. A exceção sendo camundongos vacinados com Sla os quais atingiram o pico no D48 (FIG. 6).

No exame da porcentagem de camundongos que sobrevieram e não perderam mais do que 7% do peso (FIG. 7), ficou claro que os grupos vacinados com Sel631, Sel681 e Sla tiveram uma perda de peso reduzida e uma melhor taxa de sobrevida que os grupos de controle.

Tendo assim descrito em detalhe as modalidades preferidas da presente invenção, deve ser entendido que a invenção definida pelos parágrafos acima não deve ser limitada aos detalhes particulares descritos na descrição acima já que muitas variações claras desta são possíveis sem se afastar do objeto ou escopo da presente invenção.

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Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Vacina caracterizada pelo fato de compreender um polipeptídio de sequência SEQ ID NO: 32, e um carreador, excipiente, diluente ou veículo veterinariamente adequado ou farmaceuticamente aceitável e/ou um adjuvante e/ou estabilizador.
2. 2. Vacina caracterizada pelo fato de compreender um vetor recombinante que contém a sequência nucleotídica SEQ ID NO:31 e um carreador, excipiente, diluente ou veículo veterinariamente adequado ou farmaceuticamente aceitável e/ou um adjuvante e/ou estabilizador, em que o referido vetor é capaz de expressar in vivo o polipeptídio de SEQ ID NO: 32 em um mamífero suscetível a infecções estreptocócicas causadas por Streptococcus equi.
3. 3. Vacina, de acordo com a reivindicação

   3, caracterizada pelo fato de que o vetor é um vetor de expressão.
4. 4. Vacina, de acordo com reivindicação

   4, caracterizada pelo fato de que o vetor é um plasmídeo, um vírus, notavelmente um poxvírus, um herpesvírus equino (EHV), um adenovírus humano, um vírus de encefalite equina.
5. 5. Uso de um polipeptídio de sequência SEQ ID

   No: 32, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para provocar uma resposta imune em equinos contra infecção por Streptococcus equi.
6. 6. Uso de um vetor contendo a sequência nucleotídica

   SEQ ID No: 31, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para provocar uma resposta imune em equinos contra infecção por Streptococcus equi.

   Petição 870180132169, de 19/09/2018, pág. 10/11

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7. 7. Uso, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o medicamento é uma vacina que protege equinos contra sufocamentos causados por infecção por Streptococcus equi.
8. 8. Kit de diagnóstico para detectar infecções por uma bactéria estreptocócica, caracterizado pelo fato de compreender um polipeptídio conforme definido na reivindicação 1 ou 2.
9. 9. Método de diagnóstico in vitro para detectar infecção por uma bactéria estreptocócica caracterizado pelo fato de compreender o uso de um kit de diagnóstico, como definido na reivindicação 8, e a detecção em uma amostra do polipeptídio.

   Petição 870180132169, de 19/09/2018, pág. 11/11

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   Pontuação de observação média

   4.5 -

   3.5 €> Se 1459

   ....0..... Se50 ~-θ— Se528

   HBH' Sem desafio

   Sem vacina

   Dia de estudo

   Se595

   Se358

   FIGURA 1

   2/7

   Alteração percentual média de massa

   Sem desafio

   A Sem vacina

   Dia de estudo

   FIGURA 2

   3/7

   Dia de estudo

   Escore médio em aplicação nasal ♦ Se595

   ......A........Se358 -θ—Se 1459 —<·>·— Sg50 -Θ™ Se528

   Sem desafio Sem vacina

   FIGURA 3

   4/7

   Escore médio de observação

   - · < · Sem vacina ——Sem desafio

   SC1631

   Sel6Ôf

   FIGURA 4

   5/7

   Porcentagem de alteração em massa

   -8 · —*—Se1631 -*-Se1681 —Sla

   - Sem vacina —«—Sem desafio

   Dia de estudo

   FIGURA 5

   6/7

   Escore médio em aplicação nasal

   - · ♦ - - Sem vacina .......».......Sem desafio

   Sel63i

   Seieei

   FIGURA 6

   7/7

   Porcentagem de ratos que sobreviveram sem perder >7% em peso

   FIGURA 7