CN1436248A - 利用聚合酶链式反应对球腔菌属的检测 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在聚合酶链式反应分析中引物的使用，该分析用于检测一种香蕉的真菌病原体，即一个迄今尚未知的球腔菌属的物种。已确定特定的引物在利用基于PCR的技术来鉴定真菌分离物中是有用的。
Description
本发明涉及在聚合酶链式反应分析中引物的使用，该分析用于检测一种迄今尚未知的香蕉的病原体球腔菌属(Mycosphaerella)物种。这些引物的使用使得对真菌病原体特定分离物的检测和对植物群体中疾病发展的监控成为可能。
植物的疾病年年都导致相当大的农作物减产，这造成了两方面的结果，使得农场主经济贫困以及在世界上许多地方造成当地居民营养供应的不足。杀真菌剂的普遍使用提供了相当大的对抗植物病原体攻击的保障。然而，尽管在杀真菌剂中的花费价值10亿美圆，在l981年，全世界作物的减产总量仍约为作物价值的10％(James，1981；SeedSci．&Technol.9：679-685)。
疾病破坏性作用的严重性依赖于病原体的侵染性及宿主的反应。大多数植物育种项目的目的之一是提高宿主植物对疾病的抗性。一般地，病原体的不同品种与同一作物物种的不同变种有差异地相互作用，并且宿主抗性的许多来源仅能针对特定的病原体品种起到保护作用。此外，一些病原体品种显示了疾病症状的早期迹象，但对作物损害较小。Jones和Clfford(1983；谷类作物疾病(Cereal Diseases)，John Wiley)报道，作为对将抗性引入宿主栽培品种的反应，可以预期在病原体群体中会有病原体的致命型出现，因此有必要监控病原体群体。另外，有几个已有文献报道的有关真菌品系进化的例子，这些真菌品系对特定的杀真菌剂具有抗性。早在1981年，Fletcher和Wolfe(1981；Proc.1981 Brit.Crop Prot.Conf.)就主张，来自春大麦的白粉菌群体的24％和来自冬大麦该群体的53％在对杀真菌剂三唑醇的反应中显示相当大的变异，这些群体的分布在不同变种间也有差异，对于最易感的变种而言，其产生较不易感的变种的概率也最高。已有文献证明下列真菌对杀真菌剂的敏感性有相似的变异，即小麦霉菌(也是针对三唑醇)，葡萄孢属(Botrytis)(针对苯菌灵)，核腔菌属(Pyrenophora)(针对有机汞)，假尾孢霉属(Pseudocercosporella)(针对MBC-型杀真菌剂)及Mycosphaerellafijiensis针对三唑的情况，这里只提及少数几种情况(Jones和Clfford；谷类作物疾病(Cereal Diseases)，John Wiley，1983)。
影响香蕉的香蕉叶斑病有两种众所周知的形式，即由香蕉褐条斑球腔菌(Mycosphaerella musicola)引起的黄色香蕉叶斑病和由Mycosporella fijiensis引起的黑色香蕉叶斑病。黑色香蕉叶斑病具有更大的经济破坏性，可导致叶面区域相当大地缩小，使产量减少50％或更多，也可导致果实早熟，造成出口水果的一个严重的缺陷(
www.scisoc.org/feature／banana/top.html于2000年4月17日发现)。它比相关的黄色香蕉叶斑病的破坏性更大并更难控制，它还有更大的宿主范围，其中包括通常不被黄色香蕉叶斑病侵染的车前草、餐后甜点及ABB烹饪用香蕉。
在供应出口的大农场中，经常使用杀真菌剂来控制黑色香蕉叶斑病。这种措施非常昂贵，因为它要用到飞机或直升机，永久的飞机起落跑道及用以混合并加载杀真菌剂的设备，以及喷雾剂材料再用的高额费用。据估计这些总的成本最终占了这些水果在进口国最后零售价格的25％(
www.scisoc.org/feature/banana/top.html于2000年4月17日发现)。不同的固醇脱甲基抑制剂(DMIs)是目前用来控制香蕉叶斑病的最常用的化合物，但是病原体对DMI杀真菌剂逐渐增加的耐受性使得有必要将几个国家香蕉产区该杀真菌剂的使用提高到每年25到40次的次数(
www.scisoc.org/feature/banana/top.html于2000年4月17日发现)。
虽然通常可以通过视觉识别黑色香蕉叶斑病，但是在香蕉叶子上有其他病原体存在时要得到明确的诊断是很困难的。利用从坏死的叶子中放出子囊孢子就可以很成功地完成病原体的分离，但是在没有成熟的子囊壳时分离就常常失败了，同时即使是培养得来的，M.fijiensis和香蕉褐条斑球腔菌也不容易通过视觉区分开来(Johanson和Jeger Mycol.Res.97(6)：670-674(1993))。
生物医学研究者有时采用了基于PCR的技术并在受感染的动物组织中检测病原体时取得了一定的成功。然而，最近在检测植物病原体中也采用了这种技术。利用病原体线粒体基因组特异序列的PCR已经在受感染的小麦中检测到了禾顶囊壳(Gaumannomyces graminis)的存在(Schlesser等人，1991；Applied and Environ.Microbiol.57：553-556)，随机扩增多态DN(即RAPD)标记能够区分Gremmeniellaabietina的众多品种，后者是针叶树中溃疡(scleroderris canker)的致病因素。美国第5,585,238号专利(此处整体引用作为参考)描述了从下列菌株中核糖体RNA基因区的ITS序列得来的引物，分别来自小麦壳针孢(Septoria tritici)、颖枯壳针孢(Septoria nodorum)、曲毛假尾孢霉(Pseudocercosporella herpotrichoides)(R-和W-型)、Mycosphaerella fijiensis和香蕉褐条斑球腔菌，以及这些引物在用基于PCR的技术鉴定这些真菌分离物中的使用。另外，美国第5,955,274号专利(此处整体引用作为参考)描述了从镰孢属(Fusarium)菌株的核糖体RNA基因区的ITS序列得来的引物以及该引物在用基于PCR的技术鉴定这些真菌分离物中的使用。此外，美国第5,800,997号专利(此处整体引用作为参考)描述了从尾孢属(Cercospora)，长蠕孢属(Helminthosporium)，球梗孢属(Kabatiella)和柄锈菌属(Puccinia)菌株的核糖体RNA基因区的ITS序列得来的引物以及这些引物在用基于PCR的技术鉴定这些真菌分离物中的使用。
考虑到上述情况，真正需要发展一种技术以使得在感染过程的早期可以鉴定病原体真菌另外的特定品种。通过在作物中产生明显的疾病症状之前鉴定病原体的特定品种，农学家可以估计病原体在作物变种中进一步发展的可能结果(其中在该作物变种中已经鉴定出了病原体)，并可以在认为必要时选用合适的杀真菌剂。
因而本发明提供：ξ寡核苷酸引物，用于基于PCR方法对球腔菌属物种的检测，其中所述的引物从由SEQ ID NOs：5-13组成的引物组中选择得来。ξ一对寡核苷酸引物，用于基于PCR方法对球腔菌属物种的检测，其中至少一个所述的引物是根据本发明的寡核苷酸引物。ξ一对寡核苷酸引物，用于基于PCR方法对球腔菌属物种的检测，其中所述的引物对从由下列引物对组成的引物对组中选择得来：
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：13；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：12；
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：13；
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：12；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：13；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：12；
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：13；
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：13；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：12；以及
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：13；
特别的，其中所述的引物对由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：12组成。
本发明进一步提供了检测球腔菌属物种的方法，包括：
(a)从用所述球腔菌属物种感染的植物组织中分离DNA；
(b)以该DNA为模板用一对引物通过聚合酶链式反应扩增出该球腔菌属物种中内转录间隔区的部分序列，其中一条或两条所述的引物是根据本发明的引物；以及
(c)通过形象化扩增的内转录间隔区的序列来检测该球腔菌属物种。
本发明进一步提供了用于检测球腔菌属物种的诊断试剂盒，包括根据本发明的一个引物或引物对。
本发明涉及鉴定植物致病性真菌的不同致病型的方法。本发明提供了在不同真菌致病型间有可变性的内转录间隔区(ITS)DNA序列。这些DNA序列之所以在本发明的方法中有用是因为它们可以用来得到引物以用于基于聚合酶链式反应(PCR)的诊断分析。在以特定的真菌致病型提供的DNA为模板的PCR反应中，这些引物产生独特的片段，从而用来在宿主植物的疾病症状发作之前鉴定是否存在特定的致病型。
特别的，本发明提供了来自一个迄今尚未知的球腔菌属物种的内转录间隔区(ITS)DNA序列，以及源于ITS的诊断引物以用于检测该球腔菌属物种并将它与其他球腔菌属物种如Mycosphaerellafijiensis和香蕉褐条斑球腔茵区分开来。
在一个实施方案中，本发明提供了一个从某一真菌病原体的核糖体RNA基因区分离得来的DNA分子，其中所述的DNA分子即为一个迄今尚未知的球腔菌属物种的内转录间隔区(ITS)DNA序列。在一个优选实施方案中，来自一个迄今尚未知的球腔菌属物种的内转录间隔区(ITS)序列是从由SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：19组成的集合中选择得来的。
根据另外一个实施方案，本发明提供了一个寡核苷酸引物以用于基于PCR方法对球腔菌属物种的检测，其中所述的引物与来自迄今尚未知的球腔菌属物种的内转录间隔区(ITS)序列至少有10个相邻核苷酸的序列一致性。优选地，该引物从由SEQ ID NOs：5-13组成的引物组中选择得来。
根据再一个实施方案，本发明提供了一对寡核苷酸引物以用于基于PCR方法对球腔菌属物种的检测，其中至少一条所述的引物是前面一段中描述的寡核苷酸引物。优选地，该引物对从由下列引物对组成的集合中选择得来，即SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：5和SEQID NO：13；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：12；SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：7和SEQID NO：12；SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：11；SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：9和SEQID NO：11；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：10；SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：12；及SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：13。最优选地，该引物对是SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：12。
根据再另外一个实施方案，本发明提供了一种检测球腔菌属物种的方法，包括：(a)从被所述球腔菌属物种感染的植物组织中分离DNA；(b)以该DNA为模板用一对上面所述的引物通过聚合酶链式反应扩增出该球腔菌属物种中内转录间隔区的部分序列；以及(c)通过形象化内转录间隔区序列的扩增部分来检测该球腔菌属物种。
本发明提供了在一个特定的作物变种与病原体菌株相互关系中估计潜在损害以及明智地利用不同的可用杀真菌剂宝库的可能性。此外，本发明可用于提供有关在广大地理区域中特定病原体品种的发展与传播的详细信息。本发明提供了一种检测方法，该方法尤其适用于具有长潜伏期的疾病。
也提供了在本发明实施中有用的试剂盒。这些试剂盒在鉴定球腔菌属真菌病原体中有特殊的用处。
序列列表中序列的简要描述
SEQ-ID-NO：1寡核苷酸引物ITS1。
SEQ-ID-NO：2寡核苷酸引物ITS2。
SEQ-ID-NO：3寡核苷酸引物ITS3。
SEQ-ID-NO：4寡核苷酸引物ITS4。
SEQ-ID-NO：5寡核苷酸引物J-BP1。
SEQ-ID-NO：6寡核苷酸引物J-BP2。
SEQ-ID-NO：7寡核苷酸引物J-BP3。
SEQ-ID-NO：8寡核苷酸引物J-BP4。
SEQ-ID-NO：9寡核苷酸引物J-BP5。
SEQ-ID-NO：10寡核苷酸引物J-BP6。
SEQ-ID-NO：11寡核苷酸引物J-BP7。
SEQ-ID-NO：12寡核苷酸引物J-BP8。
SEQ-ID-NO：13寡核苷酸引物JB-473。
SEQ-ID-NO：14从香蕉样品“Capesterre-babin 2”
(pCRBPCapbabB2-1)中扩增的一个真菌的内转录间
隔区的截短的DNA序列。
SEQ-ID-NO：15从香蕉样品“Matouba bas 3”(pCRBPMatbasB3-2)
中扩增的一个真茵的内转录间隔区的截短的DNA序
列。
SEQ-ID-NO：16从香蕉样品“Temoin Infest Forte”(pCRBPMf9)
中扩增的一个真菌的内转录间隔区的截短的DNA序
列。
SEQ-ID-NO：17Mycosphaerella fijiensis的ATCC分离物#22116
的内转录间隔区的DNA序列(美国第5,585,238号
专利)。
SEQ-ID-NO：18香蕉褐条斑球腔菌的ATCC分离物#22115的内转录
间隔区的DNA序列(美国第5,585,238号专利)。
SEQ-ID-NO：19从三个受感染的香蕉样品中扩增的真菌内转录间隔
区DNA的共有序列(SEQ ID NOs：14-16的共有序列)。
本发明提供了可用于鉴定植物致病性真菌不同致病型的独特DNA序列。特别的，这些DNA序列可以作为引物用于基于PCR的分析以鉴定真菌致病型。本发明的DNA序列包括特殊的球腔菌属真菌病原体核糖体RNA基因区内转录间隔区(ITS)的序列以及来源于该区域的引物，这些引物可以鉴定该球腔茵属病原体。来源于一个病原体种或属的不同致病型的ITS DNA序列(在种或属的不同成员有差异)能够用来鉴定那些特定的成员。
核糖体基因由于有高的拷贝数而适合用作分子探针的靶子。尽管成熟的rRNA序列间高度保守，非转录和转录间隔区的序列却通常很不保守，因此适合用作检测新近进化多样性的靶序列。真菌rRNA基因以单元方式组织，每一单元编码三个成熟的亚基，即18S(小亚基)，5.8S和28S(大亚基)。这些亚基被大约300bp长的两个内转录间隔区ITS1和ITS2分隔开来(White等人，1990；In：PCR Protocols；Eds.：Innes等人；pages 315-322)。另外，转录单元被非转录间隔区序列(NTSs)分隔开来。ITS和NTS特别适合于用来检测不同真菌病原体的特定致病型。
本发明的DNA序列来自一个迄今尚未知的球腔菌属植物病原体核糖体RNA基因区的内转录间隔区序列。来源于一个病原体种或属的不同致病型的ITS DNA序列在种或属的不同成员有差异。一旦确定了病原体的ITS序列，这些序列就可以与其他ITS序列如来自M.fijiensis和香蕉褐条斑球腔菌的序列进行比对。这样引物就可以来源于ITS序列。即引物可以基于ITS序列内区域来设计，该区域在真菌致病型序列中含有最大的差异。这些序列和基于这些序列的引物可用于鉴定特定的病原体。
本发明中来源于球腔菌属ITS序列的有代表性的寡核苷酸引物序列如SEQ ID NOs：5-13所示。这些序列在用基于PCR的方法对感兴趣的病原体进行鉴定时很有用。
本发明中引物序列用于PCR分析的用途在本领域中众所周知。例如可参见美国第4,683,195号和第4,683,202号专利以及Schlesser等人(1991)Applied and Environ.Microbiol.57：553-556。也可参见Nazar等人(1991；Physiol.and Molec.Plant Pathol.39：1-11)，其中用到PCR扩增来发现棉黄萎轮枝孢(Verticilliumalbo-atrum)和大丽花轮枝孢(Verticilliumdahliae)的ITS区域的差异并因此区分该两个物种；在美国第5,585,238号专利中，描述了区分香蕉病原体Mycosphaerella fijiensis和香蕉褐条斑球腔菌的类似的技术。
将ITS序列在每一病原体群体中进行比较以定位序列差异，该序列差异可用于通过PCR方法区分不同的物种和/或菌株。通过对差异序列的鉴定，合成了众多的引物并用PCR扩增进行了检验。用于PCR扩增检验的模板起初是纯化的病原体DNA，随后是从受感染的宿主植物组织中分离的DNA。因而，有可能鉴定出具有诊断性能的引物对，即那些可以鉴定一个特殊的病原体物种或菌株而不能鉴定同样病原体其他的物种或菌株的引物对。也针对物种间高度保守的区域设计引物以得到属特异性的引物以及可以鉴定导致某一特定疾病的几个真菌病原体中的任何一个的引物。例如，正如此处所述，发展了引物来将迄今尚未知的球腔菌属物种与球腔菌属其他物种如Mycosphaerellafijiensis和香蕉褐条斑球腔菌区分开来。
优选引物组合可以在受感染的宿主组织中区别不同的物种或菌株，即在以前用一个特定的病原体物种或菌株感染过的宿主组织。本发明提供了众多引物组合来将迄今尚未知的球腔菌属物种与球腔菌属其他物种如Mycosphaerella fijiensis和香蕉褐条斑球腔菌区分开来。本发明的引物是基于真菌ITS区域的序列差异设计而来的。序列间最小的一个碱基对的差异就可以设计一个有辨别力的引物。针对一个特定的真菌DNA的ITS区域设计的引物可以与一个针对核糖体DNA的编码区内保守序列区域设计的引物组合使用，以扩增物种特异性的PCR片段。一般而言，引物应该具有一个在约60℃至约70℃之间的理论解链温度以得到较好的敏感性，引物应避免重大的二级结构和引物组合中3’端的交迭。引物通常与ITS1和ITS2的至少5-10个相邻的核苷酸碱基具有序列一致性。在优选实施方案中，不论何处引物长度都大约为5到30个核苷酸碱基。
本发明自身使得很容易制作“试剂盒”，该试剂盒包含实施方法的必需成分。这样一个试剂盒可含有一个载体(carrier)，其被区室化以在其中密闭放置一个或多个容器，如试管或小瓶。其中一个容器可装有未标记的或可检测的标记了的DNA引物。如果必要，标记的DNA可以以冻干形式或在一种合适的缓冲液中存在。一个或多个容器可装有一种或多种PCR反应中要用到的酶或试剂。这些酶可单独或以混合物形式存在，以冻干的形式或保存在合适的缓冲液中。
最后，该试剂盒可以含有完成本发明的技术所必需的所有另外的成分，如缓冲液、提取试剂、酶、吸液管、平皿、核酸、核苷三磷酸、滤纸、凝胶材料、转移材料、放射自显影设备等。
下面的实施例展示了典型的实验方案，可用于合适引物序列的选择，引物选择性和诊断性功效的检验，以及这些引物在疾病及真菌分离物检测中的使用。这些实施例是为了说明而不是为了限制使用而提供的。
实施例
此处使用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域中众所周知的，具体描述见J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis编写的《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)，冷泉港(Cold Spring Harbor)实验室，冷泉港(Cold SpringHarbor)，纽约(1989)，T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist编写的《基因融合实验》(Experiments with Gene Fusion)，冷泉港(Cold Spring Harbor)实验室，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约(1984)以及Ausubel，F.M.等人编写的《分子生物学最新实验方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，GreenePublishing Assoc.和Wiley-Interscience出版。
实施例1：真菌分离物及真菌基因组DNA的提取
所用的真菌分离物及其来源列表参见表1。在150 ml接种了从马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar，PDA)来的菌丝体片段的马铃薯葡萄糖培养基中培养真菌。培养物在一个定轨摇床中28℃培育7到11天。或者从PDA平皿中直接分离得到菌丝体。通过离心沉淀菌丝体，再在液氮中研碎，然后用Lee和Taylor的方案(1990；《PCR方案：方法及使用指南》(PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications)；Eds.：Innes等人pages 282-287)提取总的基因组DNA。
表1：所检验分离物的来源
| 分离物 | 生物体 | 来源 | 分离来源(Isolation) | 产地 |
| 22116 | M.fijiensis | ATCC1 | 香蕉 | 菲律宾共和国 |
| 22115 | M.musicola | ATCC1 | 香蕉 | 菲律宾共和国 |
| 24046 | M.citri | ATCC1 | 葡萄 | 佛罗里达 |
| 62714 | M.graminicola | ATCC1 | 小麦 | 蒙大拿 |
| 36054 | M.difformis | ATCC1 | 香蕉 | 洪都拉斯 |
| PA92 | M.fijiensis | A.Johanson2 | 香蕉 | 巴拿马 |
| PNG291 | M.fijiensis | A.Johanson2 | 香蕉 | 巴布亚新几内亚 |
| GH6-3 | M.fijiensis | A.Johanson2 | 香蕉 | 加纳 |
| TG120 | M.fijiensis | A.Johanson2 | 香蕉 | 汤加 |
| HSB4 | M.fijiensis | A.Johanson2 | 香蕉 | 洪都拉斯 |
| RT689 | M.fijiensis | A.Johanson2 | 香蕉 | 拉罗汤加岛 |
| CR548 | M.musicola | A.Johanson2 | 香蕉 | 哥斯达黎加 |
| CI31 | M.musicola | A.Johanson2 | 香蕉 | 象牙海岸 |
| CB90 | M. musicola | A.Johan son2 | 香蕉 | 哥伦比亚 |
| BD1-4 | M.musae | A.Johanson2 | 香蕉 | 巴巴多斯岛 |
1美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Rockville，Maryland，美国
2Andrea Johanson博士，自然资源研究所，英国
实施例2：从香蕉组织中提取DNA
采用MicroProbe公司(Garden Grove，CA)的IsoQuick核酸提取试剂盒(Cat#MXT-020-100)提供的快速DNA提取方案的改进方案从香蕉叶子中提取得到了DNA，如下：
(1)用乙醇洗过的剪刀从香蕉叶子上剪切约0.2g的组织并将其置于无菌的Eppendorf管中。
(2)在管中加入50微升(∏L)样品缓冲液A和50微升(∏L)试剂#1(裂解溶液)以及一些沙粒以助于使组织浸软。
(3)用Kontes杵锤研磨组织直到呈纤维性的。
(4)样品在10,000g离心5分钟以使得沙子和残余物从含有释放的DNA的上清液中分离开来。将上清液转移到一个新的Eppendorf管中。
(5)在上清液中加入50微升(∏L)试剂2(提取基质)。
(6)在混合物中加入200微升(∏L)试剂3(提取缓冲液)并涡旋振荡样品。
(7)将样品在12,000g离心5分钟。将大约200微升(∏L)水相物转移到一个新管中。
(8)在该水相物中加入0.1X体积的试剂#4(乙酸钠)。
(9)加入等体积的异丙醇并涡旋振荡该混合物。
(10)12,000g离心10分钟使DNA沉淀成片状沉淀物。
(11)倒掉异丙醇并加入0.5ml用冰预冷的70％乙醇。
(12)在12,000g离心5分钟以洗涤DNA。
(13)在含有100微克每毫升(∏g/ml)RNase的50微升(∏L)TE中重悬DNA。
有香蕉叶斑病迹象的香蕉叶子样品来自马提尼克岛和瓜德罗普岛(表2)。通过观察香蕉叶子表面的病斑来估计可见的疾病。从中用本实施例所述的实验方案准备了DNA。
表2：香蕉叶子组织的来源
| 名称 | 来源国 | 可见疾病的估计 |
| Capesterre-babin 2 | 瓜德罗普岛 | 受感染的 |
| Matouba bas 3 | 瓜德罗普岛 | 受感染的 |
| Temoin 0 | 瓜德罗普岛 | 无症状 |
| Temoin Infeste Forte | 马提尼克岛 | 受感染的 |
实施例3：聚合酶链式反应扩增
用来自Perkin-Elmer(Foster City，CA；part no.N808-0009)的GeneAmp试剂盒来进行聚合酶链式反应，使用50mM KCl，2.5 mMMgCl2，10 mM Tris-HCl，pH8.3，含有各200μM(∏M)的dTTP，dATP，dCTP和dGTP，各50pmol的引物，2.5单位的Taq聚合酶和10ng基因组DNA。反应在一台Perkin-Elmer 9600或9700型热循环仪上进行30到40个循环，每一循环为94℃15秒，50到70℃15秒，72℃ 45秒。将10μl(∏)每一PCR产物样品加入1.0％的琼脂糖凝胶通过电泳来分析PCR结果。
实施例4：寡核苷酸的合成与纯化
寡核苷酸(引物)由如Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)或Midland Certified Reagent Company(Midland，Texas)合成。
实施例5：感染香蕉的一个迄今尚未知的球腔菌属物种的鉴定
用引物JB473(SEQ ID NO：13)和引物ITS4(SEQ ID NO：4)依实施例3所述的聚合酶链式反应从受感染的香蕉叶子中扩增的序列测序后与M.fijiensis和香蕉褐条斑球腔菌的ITS区序列(分别是SEQ IDNOs：17和18)进行比较。从三个不同来源的受感染香蕉叶子的扩增产物中得到了一些序列(SEQ ID NOs：14，15和16)。由于这三个序列有99.5-100％的同源性，从而设计了一个代表这三个序列的共有序列(SEQ ID NO：19)。将该共有序列包含ITS2的部分与GenBank中公共的数据库进行比较来寻找相似的序列(BlastN 2.0.7，Altschul等人.(1997)，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。SEQ ID NO：19的ITS2区与球腔菌属物种关系最近，包括M.fijiensis，M.pini，M.africana和M.keniensis(表3)。
表3：从受感染的香蕉样品中扩增所得的真菌DNA共有序列的ITS2
区在BlastN结果中发现的最接近的匹配
| GenBank Accession | 物种 | 分数 | E值 |
| AF181705 | Mycosphaerella fijiensis | 167 | 1e-39 |
| AF211197.1 | Mycosphaerella pini | 147 | 1e-33 |
| AF173314.1 | Mycosphaerella africana | 147 | 1e-33 |
| AF173300.1 | Mycosphaerella keniensis | 147 | 1e-33 |
实施例6：物种特异性引物的选择
将来自美国第5,585,238号专利的M.fijiensis和香蕉褐条斑球腔菌的ITS区序列(分别为SEQ ID NOs：17和18)与从受感染的香蕉叶子所得的共有序列(SEQ ID NO：19)进行了多重序列比对。结果发现该共有序列与M.fijiensis和香蕉褐条斑球腔菌的相应序列仅有84-87％的同源性。根据这个事实，我们断定用引物JB473和ITS4从受感染的香蕉叶子中扩增的序列既不是来自M.fijiensis，也不是来自香蕉褐条斑球腔菌的，而是来自一个迄今尚未知的球腔菌属物种。基于比对序列的分析依照实施例4合成了特定地以该新序列为靶序列的寡核苷酸引物，如下面表4所示。引物是针对那些包含真菌中序列最大差异的区域而设计的。
另外，还合成了已发表的核糖体基因特异性引物ITS1、ITS2、ITS3和ITS4(White等人，1990；In：PCR Protocols；Eds.：Innes等人.pages 315-322)以与ITS区特异的引物组合使用进行检验。
表4：设计用于检测新真菌序列的引物
实施例6：引物对纯化的真菌基因组DNA特异性的确定
为了扩增得到单一的特异性片段，根据实施例3用不同的引物组合(表5)进行了PCR反应。从一些引物中得到了特异的PCR扩增产物，这些引物是自感兴趣的真菌菌株中大小核糖体DNA亚基之间的ITS区设计得来的。
表5：用于特异性扩增未知的香蕉病原体的ITS源性PCR引物的可能组合
| 目标生物 | 大概大小(bp) | ||
| 5’引物 | 3’引物 | ||
| 球腔菌属物种 | J-BP1(SEQ ID NO：5) | J-BP6(SEQ ID NO：10) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP1(SEQ ID NO：5) | J-BP7(SEQ ID NO：11) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP1(SEQ ID NO：5) | J-BP8(SEQ ID NO：12) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP1(SEQ ID NO：5) | J-BP9(SEQ ID NO：13) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP1(SEQ ID NO：5) | ITS4(SEQ ID NO：4) | 380 |
| 球腔菌属物种 | J-BP2(SEQ ID NO：6) | J-BP6(SEQ ID NO：10) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP2(SEQ ID NO：6) | J-BP7(SEQ ID NO：11) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP2(SEQ ID NO：6) | J-BP8(SEQ ID NO：12) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP2(SEQ ID NO：6) | J-BP9(SEQ ID NO：13) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP2(SEQ ID NO：6) | ITS4(SEO ID NO：4) | 380 |
| 球腔菌属物种 | J-BP3(SEQ ID NO：7) | J-BP6(SEQ ID NO：10) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP3(SEQ ID NO：7) | J-BP7(SEQ ID NO：11) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP3(SEQ ID NO：7) | J-BP8(SEQ ID NO：12) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP3(SEQ ID NO：7) | J-BP9(SEQ ID NO：13) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP3(SEQ ID NO：7) | ITS4(SEO ID NO：4) | 380 |
| 球腔菌属物种 | J-BP4(SEQ ID NO：8) | J-BP6(SEQ ID NO：10) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP4(SEQ ID NO：8) | J-BP7(SEQ ID NO：11) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP4(SEQ ID NO：8) | J-BP8(SEQ ID NO：12) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP4(SEQ ID NO：8) | J-BP9(SEQ ID NO：13) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP4(SEQ ID NO：8) | ITS4(SEO ID NO：4) | 380 |
| 球腔菌属物种 | J-BP5(SEQ ID NO：9) | J-BP6(SEQ ID NO：10) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP5(SEQ ID NO：9) | J-BP7(SEQ ID NO：11) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP5(SEQ ID NO：9) | J-BP8(SEQ ID NO：12) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP5(SEQ ID NO：9) | J-BP9(SEQ ID NO：13) | 290 |
| 球腔菌属物种 | J-BP5(SEQ ID NO：9) | ITS4(SEO ID NO：4) | 380 |
| 球腔菌属物种 | ITS1(SEQ ID NO：1) | J-BP6(SEQ ID NO：10) | 420 |
| 球腔菌属物种 | ITS1(SEQ ID NO：1) | J-BP7(SEQ ID NO：11) | 420 |
| 球腔菌属物种 | ITS1(SEQ ID NO：1) | J-BP8(SEQ ID NO：12) | 420 |
| 球腔菌属物种 | ITS1(SEQ ID NO：1) | J-BP9(SEQ ID NO：13) | 420 |
实施例7：引物对受真菌感染的植物组织的特异性及与其他真菌病
原体交叉反应性的确定
依照实施例2从可见的受感染的香蕉叶子部分分离得到了总基因组DNA。依照实施例3进行了PCR反应，针对来自香蕉组织的DNA检验了如表5所列的引物组合。依照实施例1获得了提纯的真菌基因组DNA，并依照实施例3用诊断引物进行了PCR分析。还用其他的真菌DNA和分离物进行了检验，以判断诊断引物与之交叉反应的能力。有代表性的实验结果如下：
除引物ITS1(SEQ ID NO：1)和ITS4(SEQ ID NO：4)之外的所有引物组合都从受感染的香蕉叶子提取物中扩增得到了一个约300 bp长的产物。引物J-BP3(SEQ ID NO：7)和J-BP8(SEQ ID NO：12)似乎得到了最单一的产物。没有观察到针对其他真菌DNA的交叉扩增。当针对健康的香蕉组织(表2中的Temoin 0)反应时，引物对J-BP3/J-BP-8没有交叉扩增。
虽然本发明只描述了关于它的特定实施方案，应当理解众多变化、修改以及进一步的实施方案都是可能的，因此，所有这些变化、修改以及实施方案都将认为是在本发明范畴之内的。
序 列 表<110>Syngenta Participations AG<120>用聚合酶链式反应对球腔菌属的检测<130>PB/5-31382A<140><141><150>US 60/211902<151>2000-06-16<160>19<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物ITS1<400>1tccgtaggtg aacctgcgg 19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物ITS2<400>2gctgcgttct tcatcgatgc 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物ITS3<400>3gcatcgatga agaacgcagc 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物ITS4<400>4tcctccgctt attgatatgc 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物J-BP1<400>5gcatcattgc gtcggagtaa 20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物J-BP2<400>6tcattgcgtc ggagtaaaag t 21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物J-BP3<400>7tcattgcgtc ggagtaaaag t 21<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物J-BP4<400>8cattgcgtcg gagtaaaagt ga 22<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物J-BP5<400>9gcgtcggagt aaaagtgaat ga 22<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物J-BP6<400>10gcctccgaag cgaatagttg 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物J-BP7<400>11ggcctccgaa gcgaatagtt 20<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物J-BP8<400>12cctccgaagc gaatagtt 18<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物JB-473<400>13ggcctccgaa gcgaatag 18<210>14<211>377<212>DNA<213>球腔菌属物种<220><221>misc_feature<222>(1)..(377)<223>从香蕉样品”Capesterre-babin 2”中扩增的一个真菌的内转录间隔区的截短的DN<400>14acactgcatc attgcgtcgg agtaaaagtg aatgaaacaa aactttcaac aacggatctc 60ttggttccag catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat 120tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgccctc tggtattccg gggggcatgc 180ctgttcgagc gtcatttcac cactcaagcc tggcttggta ttgggcgtcg cggtaccgcg 240cgccttaaag tcttccggct gagctgtccg tctctaagcg ttgtggcaac tattcgcttc 300ggaggccggg cggccgcggc cgttaaatct ttcacaaggt tgacctcgga tcaggtaggg 360atacccgctg aacttaa 377<210>15<211>377<212>DNA<213>球腔菌属物种<220><221>misc_feature<222>(1)..(377)<223>从香蕉样品”Matouba bas 3”中扩增的一个真菌的内转录间隔区的截短的DNA序列<400>15acactgcatc attgcgtcgg agtaaaagta aatgaaacaa aactttcaac aacggatctc 60ttggttccag catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat 120tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgccctc tggtattccg gggggcatgc 180ctgttcgagc gtcatttcac cactcaagcc tggcttggta ttgggcgtcg cggtgccgcg 240cgccttaaag tcttccggct gagctgtccg tctctaagcg ttgtggcaac tattcgcttc 300ggaggccggg cggccgcggc cgttaaatct ttcacaaggt tgacctcgga tcaggtaggg 360atacccgctg aacttaa 377<210>16<211>377<212>DNA<213>球腔菌属物种<220><221>misc_feature<222>(1)..(377)<223>从香蕉样品”Temoin Infest Forte”中扩增的一个真菌的内转录间隔区的截短的DNA序列<400>16acactgcatc attgcgtcgg agtaaaagta aatgaaacaa aactttcaac aacggatctc 60ttggttccag catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat 120tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgccctc tggtattccg gggggcatgc 180ctgttcgagc gtcatttcac cactcaagcc tggcttggta ttgggcgtcg cggtgccgcg 240cgccttaaag tcttccggct gagctgtccg tctctaagcg ttgtggcaac tattcgcttc 300ggaggccggg cggccgcggc cgttaaatct ttcacaaggt tgacctcgga tcaggtaggg 360atacccgctg aacttaa 377<210>17<211>534<212>DNA<213>Mycosphaerella fijiensis<400>17tccgtaggtg aacctgcgga gggatcatta ccgagtgagg gctcacgccc gacctccaac 60cctttgtgaa ccacaacttg ttgcttcggg ggcgacctgc cgtcggcggg cgcccccgga 120ggccgtctaa acactgcatc tttgcgtcgg agtttaaaac aaatcgaaca aaactttcaa 180caacggatct cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg 240aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac attgcgccct ttggtattcc 300gaagggcatg cctgttcgag cgtcatttca ccactcaagc ctggcttggt attgggcgtc 360gcggttcttc gcgcgcctta aagtctccgg ctgagctgtc cgtctctaag cgttgtggat 420ctttcaattc gcttcggagt gcgggtggcc gcggccgtta aatctttatt caaaggttga 480cctcggatca ggtagggata cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg agga 534<210>18<211>540<212>DNA<213>香蕉褐条斑球腔菌<400>18tccgtaggtg aacctgcggg gggatcatta ccgagtgagg gctcaccccc gacctccaac 60cctttgtgaa ccacacctgt tgcttcgggg gcgaccctgc cggcgaactt gtcgccgggc 120gcccccggag gtctccttaa cactgcatct ctgcgtcgga gttccaaaca aatcggacaa 180aactttcaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata 240agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgccctt 300tggcattccg aagggcatgc ctgttcgagc gtcatttcac cactcaagcc tagcttggta 360ttgggcgccg cggtgctccg cgcgccccaa agtctcccgg ctaagccgtc cgtctctaag 420cgttgtggat ttttcagttc gctccggagc gcgggtggcc gcggccgtta aatcttcaaa 480ggttgacctc ggatcaggta gggatacccg ctgaacttaa gcatatcaat aagcggagga 540<210>19<211>377<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：如SEQ ID NO：14-16所示的球腔菌属物种ITS序列的共有序列<400>19acactgcatc attgcgtcgg agtaaaagta aatgaaacaa aactttcaac aacggatctc 60ttggttccag catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat 120tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgccctc tggtattccg gggggcatgc 180ctgttcgagc gtcatttcac cactcaagcc tggcttggta ttgggcgtcg cggtgccgcg 240cgccttaaag tcttccggct gagctgtccg tctctaagcg ttgtggcaac tattcgcttc 300ggaggccggg cggccgcggc cgttaaatct ttcacaaggt tgacctcgga tcaggtaggg 360atacccgctg aacttaa 377
Claims (12)
1.在对球腔菌属物种的基于PCR的检测中使用的寡核苷酸引物，其中所述引物选自SEQ ID NO s：5-13。
2.在对球腔菌属物种的基于PCR的检测中使用的寡核苷酸引物对，其中所述引物中的至少一条是权利要求1中的寡核苷酸引物。
3.根据权利要求2的寡核苷酸引物对，其中所述的引物对选自：
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：13；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：12；
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：13；
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：12；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：13；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：12；
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：13；
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：13；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：12；以及
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：13。
4.根据权利要求2的寡核苷酸引物对，其中所述的引物对由SEQID NO：7和SEQ ID NO：12组成。
5.一种检测球腔菌属物种的方法，包括：
(a)从被所述球腔菌属物种感染的植物组织中分离DNA；
(b)以该DNA为模板用一对引物通过聚合酶链式反应扩增出该球腔菌属物种中内转录间隔区的部分序列，其中一条所述的引物是权利要求1的引物；以及
(c)通过形象化内转录间隔区序列的扩增部分来检测该球腔菌属物种。
6.一种检测球腔菌属物种的方法，包括：
(a)从被所述球腔菌属物种感染的植物组织中分离DNA；
(b)以该DNA为模板用根据权利要求2的一对引物通过聚合酶链式反应扩增出该球腔菌属物种中内转录间隔区的部分序列；以及
(c)通过形象化内转录间隔区序列的扩增部分来检测该球腔菌属物种。
7.一种检测球腔菌属物种的方法，包括：
(a)从被所述球腔菌属物种感染的植物组织中分离DNA；
(b)以该DNA为模板用根据权利要求3的一对引物通过聚合酶链式反应扩增出该球腔菌属物种中内转录间隔区的部分序列；以及
(c)通过形象化内转录间隔区序列的扩增部分来检测该球腔菌属物种。
8.一种检测球腔菌属物种的方法，包括：
(a)从被所述球腔菌属物种感染的植物组织中分离DNA；
(b)以该DNA为模板用根据权利要求4的一对引物通过聚合酶链式反应扩增出该球腔菌属物种中内转录间隔区的部分序列；以及
(c)通过形象化内转录间隔区序列的扩增部分来检测该球腔菌属物种。
9.一个用于检测球腔菌属物种的诊断试剂盒，包含权利要求1的引物。
10.一个用于检测球腔菌属物种的诊断试剂盒，包含权利要求2的引物。
11.一个用于检测球腔菌属物种的诊断试剂盒，包含权利要求3的引物。
12.一个用于检测球腔菌属物种的诊断试剂盒，包含权利要求4的引物。
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