BRPI0709282A2

BRPI0709282A2 - vacina contra estreptococos

Info

Publication number: BRPI0709282A2
Application number: BRPI0709282-2A
Authority: BR
Inventors: Jean-Christophe Francis Audonnet; Jules Maarten Minke
Original assignee: Merial Ltd
Priority date: 2006-03-29
Filing date: 2007-03-29
Publication date: 2011-07-05
Also published as: US7455844B2; EP3167900A1; WO2007115059A3; EP3167900B1; NZ571459A; US20070243195A1; WO2007115059A2; EP2019687A2; BRPI0709282B8; JP2009531464A; JP2013010764A; EP2019687B1; EP2759307A2; CA2647566A1; AU2007233252B9; EP2759307B1; AU2007233252B2; EP2759307A3; BRPI0709282B1; CA2647566C

Abstract

VACINA CONTRA ESTREPTOCOCOS. A invenção se refere a composições de vacina ou subunidades imunogênicas as quais podem compreender pelo menos um polipeptídio de Streptococcus equi e aos métodos para preparar e/ou formular tais composições. A invenção também se refere ao uso de tais composições de subunidades, tal como a um método para eliciar uma resposta imunogênica ou uma resposta imunoprotetora, a qual pode compreender a administração da composição a um mamífero suscetível à infecção por estreptococos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "VACINA CONTRA ESTREPTOCOCOS"

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

Este pedido reivindica o beneficio do Pedido dePatente Provisória americana número 60/786.936 depositadoem 29 de março de 2006.

Os pedidos precedentes e todos os documentos citadosneles ou durante seus processos ("documentos citados nospedidos") e todos os documentos citados ou referidos nosdocumentos citados nos pedidos, e todos os documentos pormeio deste citados ou referidos ("documentos por meio destecitados"), e todos os documentos citados ou referidos emdocumentos por meio deste citados, junto com quaisquerinstruções do fabricante, descrições, especificações deproduto, e manuais de produtos para quaisquer produtos pormeio deste mencionados ou em qualquer documento por meiodeste incorporado por referência, são por meio desteincorporados por referência, e podem ser empregados naprática da invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere aos polipeptidios debactérias estreptocócicas, mais particularmente deStreptococcus equi, os quais podem ser usados paraprevenir, diagnosticar e/ou tratar infecção porestreptococos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Streptococcus equi (S. equi subsp. equi) é um cocogram-positivo que tem uma grande cápsula. S. equi é oagente causador de garrotilho em eqüinos, caninos eCamelideos, notavelmente em cavalos, jumentos, mulas,cachorros, camelos e dromedários. 0 garrotilho é umainfecção altamente contagiosa do trato respiratóriosuperior e linfonodos associados. Em eqüinos, a doença écaracterizada por febre, descarga nasal mucopurulentaespessa, inchaço e formação de abscesso dos linfonodossubmandibulares, submaxilares, e retrofaringeos. Em casosseveros, a infecção pode se tornar disseminada com formaçãode abscesso interno e externo e pode, em último caso,resultar em morte. Ele pode ocorrer em cavalos susceptíveisde qualquer idade. A transmissão ocorre através do contatodireto ou indiretamente através de fômites que foramcontaminados por secreções do trato respiratório ou saliva.Embora raro, S. equi é um patógeno zoonótico muito sério deCamelideos (Sechi L A et ai, New Microbiol, 1999, 22(4):383-387), de humanos infectados por contato com cavalos(Elsayed S et ai, Clin Microbiol Infect, 2003, 9(8): 869-872). Em humanos, a mortalidade foi alta (25%),especialmente entre pacientes mais velhos e pacientes comendocardite, meningite e infecção disseminada (Bradley S Fet al, Rev Infect Dis, 1991, 13(2): 270-280; Popescu G Ά etal, South Med J, 2006, 99(2): 190-191).

Após a infecção, S. equi geralmente tem um período deincubação de 3 a 14 dias antes do início dos sinaisclínicos. O organismo transloca rapidamente a mucosa paradentro dos vasos linfáticos e daí se move para um ou maisdos linfonodos regionais levando à inflamação e edema.

Os linfonodos aumentados logo desenvolvem centrospurulentos com liquefação flutuante. Os linfonodossubmandibulares tipicamente se rompem externamente atravésda pele, enquanto que abscessos formados nos linfonodosretrofaríngeos tipicamente se rompem para dentro da bolsagutural. Isto pode levar até 2 semanas para ocorrer após oinício dos sinais.

A maioria (70%) dos animais é imune a ataquesposteriores de garrotilho após recuperação de uma primeirainfecção. Entretanto, uma proporção substancial de animais(30%) pode contrair a doença uma segunda vez, e destes umapequena proporção pode contrair a doença mais que duasvezes (Todd A.G., J. Comp. Pathol. Ther., 1910, 23, 212-229). Até 10% dos animais afetados continua a disseminar S.equi intermitentemente por períodos prolongados após ossinais clínicos terem terminado. Este estado de portador écausado provavelmente por drenagem incompleta do exsudatodas bolsas guturais (empiema) e/ou sinus após a ruptura doabscesso formado nos linfonodos retrofaringeos (Newton J Ret al, Vet Record, 1997, 140: 84-90). O ressecamento eendurecimento do exsudato levam a formação de corposdiscretos chamados condróides que permanecem na bolsagutural por vários anos. Está se tornando cada vez maisreconhecido em todo o mundo que o transporte sub-clinicopersistente de S. equi é fundamental para a persistênciadesta infecção entre os surtos (Fintl C et al, Vet Record,2000, 147: 480- 484; Newton J R et al, Vet Record, 1997,140: 84-90; Newton J R et al, Equine Vet J, 2000, 32: 515-526; Timoney J F et al, Vet Record, 1998, 142: 648) e istopermanece verdadeiro apesar do advento das vacinas modernas(Newton R et al, Vet Record, 2005, 156: 291-292).

A proteção contra a doença é mediada primariamentepor anticorpos das subclasses IgA e IgG produzidoslocalmente na nasofaringe.

Anticorpos séricos para Streptococcus equi (S. equi)podem ser medidos por uma variedade de ensaios incluindoELISA (Reif et al., Proc. Am. Assoc. Equine Practitioners,1982, 27, 33-40), o teste de proteção de camundongo (BazelyPX., Aust. Vet. J., 1943, 19, 62-85), e o teste deprecipitina de difusão em gel.Vacinas disponíveis comercialmente que consistem embacterina inativada pelo calor ou extratos ricos emproteína M têm sido amplamente usadas no campo. Emboraeficazes em estimular anticorpos bactericidas séricos,estas vacinas aparentemente não estimulam um nível útil deanticorpo nasofaríngeo e assim o nível de proteçãoestimulada em uma população de cavalos é desanimadora. Umacepa avirulenta geneticamente modificada de S. equiadministrada intranasalmente foi recentemente mostrada comoestimuladora de anticorpos nasofaríngeos locais similaresàqueles encontrados em cavalos imunes convalescentes.

Cavalos vacinados eram imunes a estímulo experimentalsubseqüente com S. equi virulento (Timoney & Galan, 1985,The protective response of the horse to an avirulent strainof Streptococcal equi. In Y. Kimura, S. Kotami & Y.Shokawa, eds., Recent Advances in Streptococci andStreptococcal disease. Reedbooks, Surrey, England, p. 294-295). Portanto parece que uma vacina eficaz para garrotilhodeverá ser capaz de estimular uma resposta imunenasofaríngea.

Vacinas do tipo bacterina freqüentemente causamreações locais e sistêmicas indesejáveis que consistem emedema, endurecimento, rigidez, febre transitória, eneutrofilia, efeitos que são provavelmente devidos aopeptidoglicano da parede celular. Além disso, púrpurahemorrágica pode se desenvolver após a vacinação de cavalospreviamente sensibilizados a antigenos estreptocócicos.

Streptococcus zooepidemicus (S. equi subsp.zooepidemicus) é uma importante causa de doençarespiratória e metrite em eqüinos. S. zooepidemicus é umpatógeno oportunista que causa infecções respiratóriaspurulentas de cavalos desmamados menores de um ano de idadee infecções uterinas em éguas mais velhas. Na situação deinfecção concomitante por influenza, alta temperatura ouestresse devido ao transporte, ele pode ser um patógenofatal rápido e devastador no trato respiratório. Emborararo, S. zooepidemicus é um patógeno zoonótico muito.gravede Camelideos (Younan M et al, J Vet Med B Infect Dis VetPublic Health, 2005, 52(3): 142-146), de humanos infectadospelo contato com cavalos (Downar J et al, J Clin Microbiol,2001, 39(6): 2358-2359; Ural 0 et al, Scand J Infect Dis,2003, 35(3): 206-207) e de animais caninos que têm doençarespiratória, notavelmente já infectados por Bordetellabronchiseptica (Chalker V J et al, Vet Microbiol, 2003,95 (1-2) : 149-156) .

Mamíferos afetados por S. equi podem carregar abactéria por vários meses, dentre outros lugares, nasbolsas guturais e, assim disseminam e agem comoreservatórios de S. equi. Embora S. equi seja altamentesensível à penicilina e outros antibióticos, o tratamentocom antibiótico é, por várias razões, o menos eficaz. A fimde combater a doença e mitigar complicações clínicassérias, pesquisas têm sido focadas principalmente emdesenvolver vacinas eficazes.

0 desenvolvimento tem sido lento, possivelmente emparte, porque as vacinas devem ser capazes de controlar ainfecção sem induzir uma resposta inflamatória acentuada.

Portanto, é desejável desenvolver vacinas que tenhamum alto grau de imunogenicidade e que exibam boa segurançacom pouco ou nenhum efeito colateral.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção se refere a composições de vacina ousubunidades imunogênicas as quais podem compreender pelomenos um polipeptídio da invenção; por exemplo,polipeptídios de Streptococcus equi. A invenção, portanto,também se refere aos métodos para preparar e/ou formulartais composições, por exemplo, misturar os polipeptídioscom um veículo, excipiente, diluente, ou veículo e/ouadjuvante e/ou estabilizante farmacêutica ouveterinariamente adequado. A invenção também se refere aouso das tais composições de subunidades; por exemplo, ummétodo para desencadear uma resposta imunogênica ou umaresposta imunoprotetora, a qual pode compreender aadministração da composição a um mamífero suscetível àinfecção por estreptococos.

A invenção se refere a composições de vacina ousubunidades imunogênicas as quais compreendem pelo menos umvetor de expressão recombinante que codifica pelo menos umpolipeptídio da invenção, capaz de expressar in vivo estepolipeptídio em um mamífero suscetível à infecção porestreptococos. Neste documento, tal composição de vacina ouimunogênica a qual pode compreender pelo menos um vetor deexpressão recombinante é chamada uma composição de vacinaou imunogênica recombinante. A invenção, portanto, serefere também aos métodos para preparar tais vetores, porexemplo, inserir pelo menos um polinucleotídeo que codificaum polipeptídio de acordo com a invenção em um vetor deplasmídeo ou vetor viral tal que o vetor contenha eexpresse o polinucleotídeo no hospedeiro. A invenção,portanto refere-se aos métodos para formular taiscomposições de vacina ou imunogênicas recombinantes, porexemplo, misturar os vetores com um veículo, excipiente,diluente, ou transportador e/ou um adjuvante e/ouestabilizante veterinário ou farmaceuticamente aceitável. Ainvenção também se refere ao uso das tais composições devacina ou imunogênicas recombinantes; por exemplo, ummétodo para desencadear uma resposta imunogênica ou umaresposta imune protetora, a qual pode compreender aadministração da composição a um mamífero suscetível àinfecção por estreptococos.

Por definição, mamíferos suscetíveis à infecção porestreptococos abrangem eqüinos (cavalos, éguas, potros,jumentos e mulas), camelídeos (isto é, camelos,dromedários), caninos (isto é, cachorros, cadelas, filhotesde cachorros), bovinos (isto é, bois, vacas, bezerros), ovinos (isto em carneiros, ovelhas, cordeiros) e humanos.Mamíferos suscetíveis a infecção por Streptococcus equiabrangem eqüinos (isto é, cavalos, éguas, potros, jumentose mulas), camelídeos (isto é, camelos, dromedários),caninos (isto é, cachorros, cadelas, filhotes de cachorros) e humanos. Mamíferos suscetíveis a infecção porStreptococcus zooepidemieus abrangem eqüinos (isto é,cavalos, éguas, potros, jumentos e mulas), caninos (isto é,cachorros, cadelas, filhotes de cachorros), camelídeos(isto é, camelos, dromedários), e humanos.

A invenção também se refere aos usos de vetores deexpressão recombinantes; por exemplo, a um método paraproduzir um polipeptídio da invenção, o qual podecompreender cultivar, crescer ou propagar célulasprocarióticas ou eucarióticas transformadas para conter osvetores de expressão recombinantes e para expressar umpolinucleotídeo que codifica o polipeptidio sob condiçõesadequadas para expressão, e cultivar ou isolar ou separar opolipeptidio de células transformadas para expressá-lo.

A invenção ainda se refere aos métodos para induzir emum eqüino, isto é, um cavalo, um jumento e uma mula, umaresposta imune protetora ou imunogênica contra bactériasestreptocócicas, tais como Streptococcus equi ouStreptococcus zooepid.em.icus, os quais podem compreender aadministração, ao eqüino, de uma composição de vacina,subunidade imunogênica da invenção ou uma composição devacina ou subunidade imunogênica recombinante da invenção.

A invenção ainda se refere aos métodos para induzir emum canino, isto é um cachorro, uma cadela, um filhote, umaresposta imunogênica contra bactérias estreptocócicas, taiscomo Streptoeoceus equi ou Streptoeoecus zooepidemieus, osquais podem compreender administrar ao canino umacomposição de vacina ou subunidade imunogênica da invençãoou uma composição de vacina ou subunidade imunogênicarecombinante da invenção.

A invenção ainda se refere aos métodos para induzir emum Camelideo, isto é, um camelo e um dromedário, umaresposta imunogênica contra bactérias estreptocócicas, taiscomo Streptoeoceus equi ou Streptoeoceus zooepidemieus, osquais podem compreender administrar ao Camelideo umacomposição de vacina ou subunidade imunogênica da invençãoou uma composição de vacina ou subunidade imunogênicarecombinante da invenção.

A invenção ainda se refere aos métodos para induzir emum humano uma resposta imunogênica contra bactériasestreptocócicas, tais como Streptococcus equi ouStreptococcus zooepidemieus, os quais podem compreenderadministrar ao humano uma composição de vacina ousubunidade imunogênica da invenção ou uma composição devacina ou subunidade imunogênica recombinante da invenção.

A invenção ainda se refere a úm polipeptidio que temuma seqüência de aminoácido codificada por umpolinucleotideo selecionado do grupo que consiste nospolinucleotideos identificados nas SEQ ID NOS: 17, 19, 21,23 e 25. A invenção também se refere a um polipeptidio quetem uma identidade que é igual ou maior do que cerca de70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,98%, ou 99% com uma seqüência de aminoácido codificada porum polinucleotideo selecionado do grupo que consiste nospolipeptidios identificados nas SEQ ID NOS: 17, 19, 21, 23e 25. A invenção se refere a um polipeptidio selecionado dogrupo que consiste de polipeptidios identificados nas SEQID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52. A invenção tambémse refere a um análogo de polipeptidio que tem umaidentidade que é igual ou maior do que cerca de 70%, 75%,80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou99% com um polipeptidio selecionado do grupo que consistenos polipeptidios identificados nas SEQ ID NOS: 18, 20, 22,24, 26, 48, 50 e 52. A invenção também se refere a umfragmento de polipeptidio, contento pelo menos um epitopo,o qual é parte de um polipeptidio selecionado do grupo queconsiste nos polipeptidios identificados nas SEQ ID NOS:18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52 ou seus análogos, enotavelmente um fragmento contendo pelo menos um epitoposelecionado do grupo que consiste nos polipeptidiosidentificados nas SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e58. E, a invenção se refere aos usos, composições e métodosque envolvem tais polipeptidios, seus análogos ou seusfragmentos conforme descrito aqui.

Desta forma, a invenção se refere a um vetor deexpressão recombinante, em que o dito vetor contém pelomenos um polinucleotideo o qual codifica para umpolipeptidio selecionado do grupo de polipeptidiosidentificados nas SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e52, e suas combinações. A invenção também se refere a umvetor de expressão recombinante, em que o dito vetor tempelo menos um polinucleotideo o qual codifica para umanálogo de polipeptídio que tem uma identidade que é igualou maior do que cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%,93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% com um polipeptídioselecionado do grupo que consiste nos polipeptídiosidentificados nas SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e52, e suas combinações. A invenção também se refere a umvetor de expressão recombinante, em que o dito vetor tempelo menos polinucleotídeo o qual codifica para umfragmento de polipeptídio, contendo pelo menos um epítopoque é parte de um polipeptídio selecionado do grupo queconsiste nos polipeptídios identificados nas SEQ ID NOS:18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52 ou seus análogos enotavelmente um fragmento selecionado do grupo que consisteno grupo que consiste nos polipeptídios identificados nasSEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e 58. A invenção serefere a um vetor de expressão recombinante, em que o ditovetor tem pelo menos um polinucleotídeo selecionado dogrupo que consiste nos polipeptídios identificados pelogrupo que consiste nos polinucleotídeos identificados nasSEQ ID NOS: 17, 19, 21, 23, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 47, 49,51, 53, 55 e 57, e suas combinações. A invenção também serefere a um vetor de expressão recombinante, em que o ditovetor tem pelo menos uma identidade que é igual ou maior doque cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% com um polinucleotideoselecionado do grupo que consiste nos polinucleotideosidentificados nas SEQ ID NOS: 17, 19, 21, 23, 25, 31, 33,35, 37, 39, 47, 49, 51, 53, 55 e 57, e suas combinações. E,a invenção se refere aos usos, composições e métodos queenvolvem tais vetores conforme descrito aqui.

Os polinucleotideos da invenção podem ser usados emreações de hibridização (por exemplo, Northern ou Southernblots, em microarranjos de ácido nucléico ou em "chips degenes"), em reações de amplificação (por exemplo, reação emcadeia da polimerase ou PCR).

Deve ser observado que a invenção fornecepolinucleotideos que podem compreender seqüênciascomplementares àquelas descritas acima.

Polinucleotideos de acordo com a invenção podem serpreparados de várias formas (por exemplo, por sintesequímica, de bibliotecas genômicas ou de cDNA, doestreptococo em si, etc.) e pode ter várias formas (porexemplo, fita simples, fita dupla, iniciadores, sondas etc.).

Os polinucleotideos de acordo com a invenção podem sermarcados, por exemplo, com um marcador radioativo oufluorescente.

Os polinucleotideos de acordo com a invenção podem sermarcados, por exemplo, com um marcador radioativo oufluorescente. Isto é particularmente útil como um iniciadorou como uma sonda.

Além disso, o termo "polinucleotídeo" inclui DNA, RNA,e também seus análogos, tais como aqueles contendoesqueletos modificados.

Ainda adicionalmente, a invenção prevê uma preparaçãode anticorpo que pode compreender pelo menos um anticorpoespecifico para um polipeptidio da invenção. Este anticorpopode ser policlonal ou monoclonal. A preparação deanticorpo pode compreender também um fragmento do ditoanticorpo.

A invenção também envolve um kit de diagnóstico paradetectar infecção por bactérias estreptocócicas, incluindopelo menos um polipeptidio de acordo com a invenção ou umapreparação de anticorpo que pode compreender pelo menos umanticorpo especifico para um polipeptidio da invenção. Ainvenção também envolve um método de diagnóstico paradetectar infecção por bactérias estreptocócicas emmamíferos, o qual compreende usar um kit de diagnóstico dainvenção e detectar em uma amostra o polipeptidio ou umanticorpo específico para aquele polipeptidio.

A invenção ainda diz respeito a um método deimunização passiva que pode compreender administrar apreparação de anticorpo a um mamífero suscetível à infecçãopor bactérias estreptocócicas ou infectado por bactériasestreptocócicas. Em particular, ò método de imunizaçãopassiva compreende administrar a preparação de anticorpo aum eqüino suscetível à infecção por bactériasestreptocócicas ou infectado por bactérias estreptocócicas,notavelmente suscetível à infecção por Streptococcus equiou infectado por Streptococcus equi.

É observado que nesta descrição e particularmente nasreivindicações, termos tais como "compreende","compreendido", "compreendendo" e semelhantes podem ter osignificado atribuído a ele na lei de patentes americana;por exemplo, eles podem significar "inclui", "incluído","incluindo" e semelhantes; e que termos tais como"consistindo essencialmente em" e "consiste essencialmenteem" têm o significado atribuído a eles na lei de patentesamericana, por exemplo, eles permitem elementos nãoexplicitamente citados, mas excluem elementos que sãoencontrados na técnica anterior ou que afetam umacaracterística nova ou básica da invenção.

Estas e outras modalidades são descritas ou são óbviasa partir da, e abrangidas pela, seguinte DescriçãoDetalhada.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A seguinte descrição detalhada, dada como exemplo, masnão pretendida para limitar a invenção unicamente àsmodalidades especificas descritas, pode melhor ser mais bemcompreendida conjuntamente com os desenhos anexos, nosquais

FIG. 1: mostra as pontuações clinicas médias decamundongos vacinados e de controle após o estimulo comStreptococcus equi;

FIG. 2: mostra a porcentagem média da mudança na massade camundongos vacinados e de controle após o estimulo comStreptococcus equi;

FIG. 3: mostra as pontuações médias de toques comfocinho de camundongos vacinados e de controle após oestimulo com Streptoeoceus equi;

FIG. 4: mostra as pontuações clínicos médias decamundongos vacinados com Sel631, Sel681, e Sla e decontrole após o estímulo com Streptoeoceus equi;

FIG. 5: mostra a porcentagem média da mudança na massade camundongos vacinados com Sel631, Sel681, e Sla e decontrole após o estímulo com Streptoeoceus equi;

FIG. 6: mostra as pontuações médias de toques com ofocinho de camundongos vacinados com Sel631, Sel681, Sla ede controle após o estímulo com Streptoeoceus equi(expressos como unidade formadora de colônia (ufc) ) e

FIG. 7: mostra a porcentagem dos camundongos quesobreviveram e que não perderam mais do que 7% do peso decamundongos vacinados com Sel631, Sel681, Sla e de controleapós o estimulo com Streptococcus equi.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção se refere à identificação dospolipeptidios de Streptococcus equi capazes, quandoadministrados a um mamífero, de desencadear uma respostaimunogênica ou imune, e à identificação dospolinucleotídeos que codificam estes polipeptidios. Estespolipeptidios são úteis para a produção de composições desubunidades imunogênicas ou vacinas de subunidades. Estespolinucleotídeos são úteis para a produção de composiçõesimunogênicas de DNA, vacinas de DNA, composiçõesimunogênicas de vetor viral recombinante ou vacinas devetor viral recombinante.

A invenção diz respeito a composições, usos e métodoscontra infecções causadas por bactérias da famíliaStreptoeoeeal, causadas notavelmente por Streptoeoeeusequi, por exemplo, a doença do garrotilho em eqüinos,camelídeos, caninos e humanos, e contra infecções causadaspor Streptoeoeeus zooepidemieus em eqüinos, camelídeos,caninos e humanosA invenção diz respeito aos polipeptidios,polinucleotídeos e genes obtidos ou derivados doStreptococcus equi. A presente invenção pode se referirtambém aos polipeptidios, polinucleotídeos e genes obtidosou derivados de outros estreptococos, notavelmente deStreptocoeeus zooepidemieus, Streptoeoeeus suis,

Streptoeoceus uberis, Streptoeoeeus dysgalaetiae,

Streptoeoeeus agalaetiae, Streptoeoeeus pneumoniae,Atreptoeoeeus pyogenes.

Um aspeto particular da invenção é um polipeptídioselecionado das seqüências SEQ ID NOS. 18, 20, 22, 24, 26,48, 50 e 52.

o genoma completo de Streptoeoeeus equi estádisponível na base de dados da Sanger:(http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_equi/).

Os polipeptidios são identificados como SEQ ID NOS.:18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52 e por Se50, Sel459, Se595,Se528, Se358, Sel631, Sel681 e Sla, respectivamente.

Um aspeto particular da invenção é um polinucleotídeoselecionado das seqüências de nucleotídeo SEQ ID NOS: 17,19,21, 23 e 25.

Os polinucleotídeos são identificados como SEQ IDNOS.: 17, 19, 21, 23 e 25 e por Se50, Sel459, Se595, Se528e Se358, respectivamente.A prática da presente invenção empregará, a menos queindicado de outra maneira, técnicas convencionais debiologia molecular, microbiologia, tecnologia de DNArecombinante, e imunologia, que estão dentro da habilidadeda técnica. Tais técnicas são explicadas inteiramente naliteratura. Veja, por exemplo, Sambrook et al. (2001)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold SpringHarbor Press; DNA Cloning, Vols. I e II (D. N. Glover ed.1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984);Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higginseds. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986);Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal,B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); a série,Methods In Enzymology (S. Colowick e N. Kaplan eds.,Academic Press, Inc.); e Handbook of ExperimentalImmunology, Vols. I-IV (D. M. Weir e C. C. Blackwell eds.,1986, Blackwell Scientific Publications).

Antes de descrever a presente invenção em detalhes,deve ser compreendido que esta invenção não está limitada aDNA, seqüências de polipeptidios ou parâmetros de processoparticulares já que tais podem, naturalmente, variar. Devetambém ser compreendida que a terminologia usada nestedocumento tem a finalidade de descrever modalidadesparticulares da invenção somente, e não pretende serlimitante.

A menos que definido de outra maneira, todos os termostécnicos e científicos usados neste documento têm o mesmosignificado que compreendido geralmente por um versado natécnica a que a invenção pertence. Embora vários métodos emateriais similares ou equivalentes àqueles descritos nestedocumento possam ser usados na prática da presenteinvenção, os materiais e métodos preferidos são descritosaqui.

Pelo termo "complementaridade" ou "complementar"entende-se, para as finalidades do relatório descritivo oudas reivindicações, um número suficiente nos pares de basescomplementares de oligonucleotídeos na sua seqüência parainteragir especificamente (hibridizar) com uma seqüência deácido nucléico alvo do polimorfismo gênico a seramplificado ou detectado. Conforme conhecido daquelesversados na técnica, um grau muito alto decomplementaridade é necessário para especificidade esensibilidade envolvendo a hibridização, embora não preciseser 100%. Desta forma, por exemplo, um oligonucleotídeo queé idêntico em seqüência de nucleotídeos a umoligonucleotídeo por meio disso descrito, exceto por umaalteração ou substituição de base, pode funcionar de formaequivalente aos oligonucleotídeos descritos. Um gene de"DNA complementar" ou "cDNA" inclui genes recombinantessintetizados por transcrição reversa de RNAmensageiro("mRNA").

Uma "reação cíclica mediada por polimerase" refere-sea uma reação bioquímica na qual uma molécula molde ou umapopulação de moléculas molde é periodicamente erepetidamente copiada para criar uma molécula moldecomplementar ou moléculas molde complementares, aumentandodesse modo o número das moléculas molde com o tempo.

Pelo termo "porção detectável" entende-se, para asfinalidades do relatório descritivo ou reivindicações, umamolécula marcadora (isotópica ou não-isotópica) que éincorporada indiretamente ou diretamente em umoligonucleotídeo, em que a molécula marcadora facilita adetecção do oligonucleotídeo no qual ela está incorporada,por exemplo, quando o oligonucleotídeo é hibridizado aseqüências polimórficas gênicas amplificadas. Desta forma"porção detectável" é usada de forma sinônima com "moléculamarcadora". A síntese dos oligonucleotídeos pode serexecutada por qualquer de diversos métodos conhecidosdaqueles versados na técnica. As moléculas marcadoras,conhecidas daqueles versados na técnica como sendo úteispara detecção, incluem moléculas quimioluminescentes,fluorescentes ou luminescentes. Várias moléculasfluorescentes são conhecidas na técnica, as quais sãoadequadas para uso para marcar um ácido nucléico para ométodo da presente invenção. 0 protocolo para talincorporação pode variar dependendo da moléculafluorescente usada. Tais protocolos são conhecidos natécnica para a respectiva molécula fluorescente.

"Amplificação de DNA" conforme usado aqui, se refere aqualquer processo que aumenta o número de cópias de umaseqüência de DNA especifica por amplificar enzimaticamentea seqüência de ácido nucléico. Uma variedade de processos éconhecida. Um dos mais comumente usados é o processo dereação em cadeia da polimerase (PCR) de Mullis conformedescrito nas Patentes Americanas Nos. 4.683.195 e4.683.202. Os métodos, dispositivos e reagentes descritos

<table>table see original document page 24</column></row><table>6.566.103; 6.566.067; 6.566.052; 6.558.929; 6.558.909;6.551.783; 6.544.782; 6.537.752; 6.524.8306.514.7506.492.1146.468.7436.432.6466.403.3416.379.9326.355.4226.316.1926.300.0736.270.9776.261.4316.251.6076.221.5956.183.9636.146.8346.087.0976.046.0396.015.6645.985.6195.955.2745.888.7405.869.3186.514.706; 6.503.750

6.485.907; 6.485.903

6.465.638; 6.465.637

6.428.987; 6.426.215

6.399.320; 6.395.518

6.372.484; 6.368.834

6.348.336; 6.346.384

6.312.930; 6.309.840

6.503.705

6.482.588

6.465.171

6.423.499

6.391.559

6.365.375

6.319.673

6.309.837

6.518.020;

6.4 93.64 0;

6.475.729;

6.448 . 014;

6.410.223;

6.383.755;

6.358.680;

6.316.195;

6.303.343;

6.300.072; 6.287.781; 6.284.455; 6.277.605;

6.270.966; 6.268.153; 6.268.143; D445.907;

6.258.570; 6.258.567; 6.258.537; 6.258.529;

6.248.567; 6.235.4 68; 6.232.07 9; 6.225.093;

D441.091; 6.218.153; 6.207.425; 6.183.999;

6.180.372; 6.180.349 ; 6.174.670; 6.153.412;

6.14 3.4 96; 6.14 0.613; 6.14 0.110; 6.103.4 68;

6.072.369; 6.068.974

6.037.129; 6.033.854

6.015.534; 6.004.747

5.976.842; 5.972.602

5.952.200; 5.936.968

5.883.924; 5.876.978

5.863.772; 5.863.731

6.063.563

6.031.960

6.001.612

5.968.730

5.909.468

5.876.977

5.861.251

6.048.688;

6.017.699;

6.001.572;

5.958.686;

5.905.732;

5.874.221;

5.861.245;5.8 58.725; 5.858.718; 5.85 6.086; 5.853.991

5.837.468

5. 824.516

5. 811.296

5. 776.686

5.747.251

5.710.381

5.681.741

5.656.461

5.639.871

5.627.054

5.602.756

5.565.340

5.527.898

5.501.947

5.484.699

5.436.144

5.389.512

5.279.952

5.229.297

5.830.663

5. 824 . 479

5.804.383

5.774.497

5.741.656

5.705.627

5.674.717

5.654.144

5.639.611

5.618.703

5.599.674

5.565.339

5.527.510

5.494.795

5.476.774

5.426.026

5.364.790

5.254.469

5.224.771

5.827.695

5.817.797

5.800.997

5.766.889

5.716.784

5.702.884

5.665.572

5.652.102

5.639.606

5.618.702

5.589.333

5.556.774

5.514.568

5.491.225

5.475.610

5.420.009

5.364.758

5.241.363

5.219.727

5.827.661

5.814.489

5.780.271

5.759.822

5.712.125

5.693.467

5.665.539

5.650.268

5.631.128

5.614.388

5.585.238

5.556.773

5.512.463

5.487.993

5.447.839

5.411.876

5.340.728

5.232.829

5.213.961

5.849.497

5.827.657

5.814.453

5.780.222

5.750.347

5.712.090

5.691.146

5.656.493

5.643.765

5. 629.171

5.610.017

5.576.197

5.538.871

5.512.462

5.487.985

5.437.975

5.393.657

5.283.171

5.231.015

5.198.337

5.187.0 60; 5.142.033; 5.091.310; 5.082.780; 5.066.5845.023.171 e 5.008.182 também podem ser empregados naprática da presente invenção. O PCR envolve o uso de umaDNA polimerase termoestável, seqüências conhecidas comoiniciadoras, e ciclos de aquecimento, os quais separam oácido desoxirribonucléico (DNA) replicante, estendem eamplificam exponencialmente um gene de interesse. Qualquertipo de PCR, tal como PCR quantitativo, RT-PCR, PCR hotstart, LAPCR, PCR multiplex, PCR touchdown, etc., podem serusados. Vantajosamente, PCR em tempo real é utilizado. Emgeral, o processo de amplificação por PCR envolve umareação enzimática cíclica em cadeia para prepararquantidades exponenciais de uma seqüência de ácido nucléicoespecífica. Isso requer uma pequena quantidade de umaseqüência para iniciar a reação em cadeia e iniciadores deoligonucleotídeo que irão hibridizar a seqüência. No PCR,os iniciadores são anelados para desnaturar o ácidonucléico seguido pela extensão com um agente indutor(enzima) e nucleotídeos. Isto resulta em produtos deextensão recentemente sintetizados. Já que seqüênciasrecentemente sintetizadas se tornam moldes para osiniciadores, ciclos repetidos de desnaturação, anelamentodos iniciadores e extensão resultam em acúmulo exponencialda seqüência específica sendo amplificada. 0 produto deextensão da reação em cadeia será um duplex de ácidonucléico distinto com terminações que correspondem àsextremidades dos iniciadores específicos empregados.

Pelos termos "amplificar enzimaticamente" ou"amplificar" entende-se, para os propósitos do relatóriodescritivo ou reivindicações, amplificação de DNA, isto é,um processo pelo qual seqüências de ácido nucléico sãoamplificadas em número. Há vários meios para amplificarenzimaticamente seqüências de ácido nucléico. Atualmente ométodo mais comumente usado é a reação em cadeia dapolimerase (PCR). Outros métodos de amplificação incluemLCR (reação em cadeia da ligase) o qual utiliza DNA ligase,e uma sonda que consiste em duas metades de um segmento deDNA que é complementar à seqüência do DNA a seramplificado, enzima replicase QB, e uma seqüência molde deácido ribonucléico (RNA) ligada a uma sonda complementar aoDNA a ser copiado, o qual é usado para fazer um molde deDNA para a produção exponencial de RNA complementar;amplificação por deslocamento de fita (SDA); amplificaçãopor replicase Qft (QftRA); replicação auto-sustentada (3SR);e NASBA (amplificação baseada em seqüência de ácidonucléico), a qual pode ser realizada em RNA ou DNA como aseqüência de ácido nucléico a ser amplificada.

Um "fragmento" de uma molécula tal como uma proteínaou ácido nucléico entende-se por referir a qualquer porçãoda seqüência genética de nucleotídeo ou aminoácido.

Conforme usado neste documento, o termo "genoma" serefere a todo o material genético nos cromossomos de umorganismo particular. Seu tamanho é, geralmente, dado comoseu número total de pares de base. Dentro do genoma, otermo "gene" se refere a uma seqüência ordenada denucleotideos localizados em uma posição particular ou em umcromossomo particular o qual codifica um produto funcionalespecifico (por exemplo, uma molécula de RNA ou proteína).Em geral, caracter!sticas genéticas de um animal, conformedefinido pela seqüência de nucleotideos do seu genoma, sãoconhecidas como seu "genótipo" enquanto que ascaracterísticas físicas de um animal são descritas como seu"fenótipo".

Por "hibridização" ou "hibridizar", conforme usadoneste documento, entende-se como a formação de pares debases A-T e C-G entre a seqüência de nucleotídeo de umfragmento de um segmento de um polinucleotídeo e umaseqüência de nucleotídeo complementar de umoligonucleotídeo. Por complementar entende-se que no lócusde cada A, C, G ou T (ou U em um ribonucleotídeo) naseqüência do fragmento, o oligonucleotídeo sequenciado temum T, G, C ou A, respectivamente, ofragmento/oligonucleotídeo hibridizado é chamado um"duplex".

Um "complexo" de hibridização, tal como em um ensaiosanduíche, significa um complexo de moléculas de ácidonucléico que incluem, pelo menos, o ácido nucléico alvo euma sonda sensora. Ele também pode incluir uma sondaâncora.

Uma "temperatura de fusão" significa a temperatura naqual duplexes hibridizados desibridizam e voltam ao seuestado de fita simples. Da mesma forma, a hibridização nãoocorrerá originalmente entre dois oligonucleotideos, ou,neste documento, um oligonucleotideo e um fragmento, emtemperaturas acima da temperatura de fusão do duplexresultante. É atualmente vantajoso que a diferença nastemperaturas do ponto de fusão de duplexes deoligonucleotideo-fragmento desta invenção seja de cerca de1°C a cerca de 10°C a fim de ser facilmente detectável.

Conforme usado neste documento, o termo "molécula deácido nucléico" pretende incluir moléculas de DNA (porexemplo, cDNA ou DNA genômico) , moléculas de RNA (porexemplo, mRNA), análogos de DNA ou RNA gerados usandoanálogos de nucleotideo e derivados, fragmentos e seushomólogos. A molécula de ácido nucléico pode ser fitasimples ou fita dupla, mas vantajosamente, é DNA fitadupla. "DNA" se refere à forma polimérica dedesoxirribonucleotideos (adenina, guanina, timina oucitosina) , tanto no seu estado de fita simples como dehélice fita dupla e não se limita a nenhuma forma terciáriaem particular. Desta forma, este termo inclui DNA fitadupla encontrado inter alia, em moléculas de DNA lineares(por exemplo, fragmentos de restrição, virus, plasmideos,e cromossomos. Ao discutir a estrutura de moléculas de DNAfita dupla particulares, as seqüências podem ser descritasneste documento de acordo com a convenção normal de darapenas a seqüência na direção 5' para 3' na direção da fitade DNA não-transcrita (isto é, a fita que tem uma seqüênciahomóloga ao mRNA). Uma molécula de ácido nucléico "isolada"é uma que está separada de outras moléculas de ácidonucléico que estão presentes na fonte natural do ácidonucléico.

Um "nucleosídeo" se refere a uma base ligada a umaçúcar. A base pode ser adenina (A), guanina (G) (ou suasubstituta, inosina (I)), citosina (C), ou timina (T) (ousua substituta uracila (U) ). 0 açúcar pode ser ribose (oaçúcar de um nucleotideo natural no RNA) ou 2-desoxirribose(o açúcar de um nucleotideo natural no DNA). Um"nucleotideo" se refere a um nucleotideo ligado a um únicogrupo fosfato.

Conforme utilizado aqui, o termo "oligonucleotídeo" serefere a uma série de resíduos de nucleotídeos ligados, nosquais o oligonucleotídeo tem um número suficiente de basesnucleotídeos para serem usadas em uma reação de PCR. Umaseqüência curta de oligonucleotídeo pode ser baseada em, oudesenhada a partir, de uma seqüência genômica ou de cDNA eé usada para amplificar, confirmar ou revelar a presença deum DNA ou RNA idêntico, similar ou complementar em umacélula ou tecido particular. Oligonucleotideos podem sersintetizados quimicamente e podem ser usados comoiniciadores ou sondas. Oligonucleotídeo significa qualquernucleotídeo de mais de 3 bases de comprimento usado parafacilitar a detecção ou identificação de um ácido nucléicoalvo, incluindo sondas e iniciadores.

Uma "polimerase" é uma enzima que catalisa a adiçãoseqüencial de unidades monoméricas a uma cadeia polimérica,ou liga duas ou mais unidades monoméricas para iniciar umacadeia polimérica. A "polimerase" funcionará pela adição deunidades monoméricas cuja identidade é determinada por, eque é complementar a, uma molécula molde de uma seqüênciaespecífica. Por exemplo, DNA polimerases tais como a DNApol 1 e Taq polimerase adicionam desoxirribonucleotídeos àextremidade 3' de uma cadeia polinucleotídica de umamaneira molde-dependente, deste modo sintetizando um ácidonucléico que é complementar à molécula molde. Aspolimerases podem ser usadas para estender um iniciador umavez ou repetitivamente ou para amplificar umpolinucleotídeo pela iniciação repetitiva de duas fitascomplementares usando dois iniciadores. Uma "polimerasetermoestável" se refere a uma enzima DNA ou RNA polimeraseque pode resistir a temperaturas extremamente altas, porexemplo, próximas a 100°C. Freqüentemente, polimerases termoestáveis são derivadas de organismos que vivem emtemperaturas extremas, tal como Thermus aquaticus. Exemplosde polimerases termoestáveis incluem Taq, Tth, Pfu, Vent,deep vent, UlTma, e suas variações e derivados.

Um polinucleotideo se refere a uma cadeia linear denucleotideos conectados por uma ligação fosfodiéster entreo grupo hidroxila-3'de um nucleosideo e o grupo hidroxila-5' de um segundo nucleosideo que por sua vez está ligadoatravés de seu grupo hidroxila-3' ao grupo hidroxila-5' deum terceiro nucleosideo e assim por diante para formar umpolímero constituído de nucleosídeos ligados por umesqueleto de ligações fosfodiéster. Um "polinucleotideomodificado" se refere a um polinucleotideo no qual um oumais nucleotideos naturais foram parcialmente,substancialmente, ou completamente substituídos comnucleotideos modificados.

Um "iniciador" é um oligonucleotídeo, a seqüência depelo menos uma porção do qual é complementar a um segmentode um DNA molde que deve ser amplificado ou replicado.Tipicamente, iniciadores são usados na realização de umareação em cadeia da polimerase (PCR). Um iniciadorhibridiza com o (ou "anela" ao) DNA molde e é usada pelaenzima polimerase como o ponto de partida para o processode replicação/amplificação. Os iniciadores aqui contidossão selecionados para serem "substancialmente"complementares a diferentes fitas de uma seqüência de DNAalvo particular. Isso significa que os iniciadores devemser suficientemente complementares para hibridizar com suasrespectivas fitas. Portanto, a seqüência do iniciador nãoprecisa refletir a exata seqüência do molde. Por exemplo,um fragmento de nucleotideo não-complementar pode serligado à extremidade 5' do iniciador, com o restante daseqüência do iniciador sendo complementar à fita.Alternativamente, bases não-complementares ou seqüênciaslongas podem ser intercaladas dentro do iniciador, contantoque a seqüência do iniciador tenha complementaridadesuficiente com a seqüência da fita para hibridizar com elae assim formar o molde para a síntese do produto deextensão.

"Sondas" referem-se a seqüências oligonucleotídeo deácido nucléico de comprimento variável, usadas na detecçãode seqüências de ácidos nucléicos idênticas, similares, oucomplementares por hibridização. Uma seqüência deoligonucleotídeo usada como uma sonda de detecção pode sermarcada com uma porção detectável.

A seguir estão exemplos não limitantes depolinucleotídeos: um gene ou um fragmento gênico, éxons,íntrons, mRNA, tRNA, rRNA, ribozimas, cDNA,polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeosramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquerseqüência, RNA isolado de qualquer seqüência, iniciadores esondas de ácido nucléico. Um polinucleotídeo podecompreender nucleotídeos modificados, tais comonucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos, uracila,outros açúcares e grupos ligantes tais como fluororribose etiolato, e ramificações de nucleotídeo. A seqüência dosnucleotídeos pode ser ainda modificada após apolimerização, tal como por conjugação com um componentemarcador. Outros tipos de modificações incluídas nestadefinição são "caps", substituição de um ou mais dosnucleotídeos de ocorrência natural por um análogo, eintrodução de meios para ligar o polinucleotídeo aproteínas, íons de metal, componentes de marcação, outrospolinucleotídeos ou um suporte sólido.

Um polinucleotídeo ou polipeptídio "isolado" é um queé substancialmente livre dos materiais com os quais eleestá associado no seu ambiente nativo. Por substancialmentelivre, entende-se pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelomenos 60%, pelo menos 65%, vantajosamente pelo menos 70%,pelo menos 75%, mais vantajosamente pelo menos 80%, pelomenos 85%, ainda mais vantajosamente pelo menos 90%, pelomenos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%,pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, ou maisvantajosamente pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos99,5%, pelo menos 99,9% livre destes materiais.

Uma molécula de ácido nucléico "isolada" é umamolécula de ácido nucléico que está substancialmenteseparada e distinta do organismo inteiro com o qual amolécula é encontrada na natureza; ou uma molécula de ácidonucléico desprovida, em todo ou parte, de seqüênciasnormalmente associadas com ela na natureza; ou umaseqüência, conforme ela existe na natureza, mas que temseqüências heterólogas (conforme definido abaixo) emassociação com ela.

O termo "polinucleotideo que codifica uma proteína",conforme usado aqui, se refere a um fragmento de DNA oumolécula de DNA isolada que codifica uma proteína, ou afita complementar a ela; mas RNA não está excluído,conforme é compreendido na técnica que timidina (T) em umaseqüência de DNA é considerada igual à uracila em umaseqüência de RNA. Desta forma seqüências de DNA para uso nainvenção, por exemplo, para uso em vetores de RNA, pode serderivada de seqüências de DNA, por timidina (T) naoc^ucu^xa κλ^ L^iNri i^uiioiuciaua xy ua± cl uiauna ncioseqüências de RNA.

Uma "seqüência codificante" de DNA ou uma "seqüênciade nucleotideo que codifica" uma proteína particular é umaseqüência de DNA que é transcrita e traduzida em umpolipeptídio in vitro ou in vivo quando colocada sob ocontrole de elementos regulatórios apropriados. Os limitesda seqüência codificante são determinados por um códon deinício na terminação 5' (amino) e um códon de parada naterminação 3' (carboxi). Uma seqüência codificante podeincluir, mas não é limitada a, seqüências procarióticas,cDNA de mRNA eucariótico, seqüências de DNA genômico de DNAeucariótico (por exemplo, de mamífero) e ainda seqüênciasde DNA sintéticas. Uma seqüência de terminação datranscrição estará localizada geralmente a 3' da seqüênciacodificante.

"Homologia" se refere ao percentual de identidadeentre duas porções de polinucleotídeo ou duas porções depolipeptídio. Duas seqüências de DNA, ou de proteína são"substancialmente homólogas" uma a outra quando asseqüências exibem pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%,84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, preferivelmente pelo menoscerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94% e o mais preferivelmentepelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9%de identidade de sequencia ao longo de uma extensao definida das moléculas. Conforme usado aqui,substancialmente homólogo também se refere a seqüências quemostram identidade completa (100% de identidade deseqüência) ao DNA especificado ou seqüência depolipeptidio.

A homologia pode ser determinada por hibridização depolinucleotideos sob condições que formam duplexes estáveisentre as regiões homólogas, seguido por digestão comnucleases especificas para fitas simples, e determinação dotamanho dos fragmentos digeridos. Seqüências de DNA que sãosubstancialmente homólogas podem ser identificadas paraaquele sistema particular. Definir condições apropriadas dehibridização está dentro do conhecimento na técnica. Veja,por exemplo, Sambrook et al. supra; DNA Cloning, supra;Nucleic Acid Hybridization, supra.

Dois fragmentos de ácido nucléico são considerados"seletivamente hibridizáveis" a um polinucleotideo se elesforem capazes de hibridizar especificamente a um ácidonucléico ou sua variante ou iniciar especificamente umareação em cadeia da polimerase: (i) sob condições típicasde hibridização e lavagem, conforme descrito, por exemplo,em Sambrook et al. supra e Nucleic Acid Hybridization,supra, (ii) usando condições de lavagem de severidadereduzisa, que permitam no maximo 25 a 30% de naopareamentos de pares de bases, por exemplo, SSC 2x, SDS0,1%, temperatura ambiente duas vezes cada, e então SSC 2x,SDS 0,1%, 37 0C uma vez, 30 minutos; então SSC 2 χ atemperatura ambiente duas vezes, 10 minutos cada, ou (iii)selecionar os iniciadores para uso em reações de PCRtípicas (PCR) sob condições usuais (descritas por exemplo,em Saiki, et al. (1988) Science 239:487-491).

0 termo "capaz de hibridizar sob condições severas",conforme usado neste documento, refere-se ao anelamento deum primeiro ácido nucléico a um segundo ácido nucléico sobcondições severas conforme definidas abaixo. Condiçõesseveras de hibridização permitem tipicamente a hibridizaçãode moléculas de ácido nucléico que têm pelo menos 70% deidentidade de seqüência de ácido nucléico com a molécula deácido nucléico que está sendo usada como uma sonda nareação de hibridização. Por exemplo, o primeiro ácidonucléico pode ser uma amostra de teste ou uma sonda, e osegundo ácido nucléico pode ser a fita senso ou antisensode um ácido nucléico ou seu fragmento. A hibridização doprimeiro e segundo ácidos nucléicos pode ser conduzida sobcondições severas, por exemplo, alta temperatura e/ou baixoconteúdo de sal tendem e desfavorecer a hibridização de39seqüências de nucleotideo dissimilares. Alternativamente, ahibridização do primeiro e do segundo ácido nucléico podeser conduzida sob condições de severidade reduzida, porexemplo, baixa temperatura e/ou alto conteúdo de sal, o que tende a favorecer a hibridização de seqüências denucleotideos dissimilares. As condições de hibridização debaixa severidade podem ser seguidas por condições de altaseveridade ou condições de severidade média para aumentar aseletividade da ligação do primeiro e segundo ácidosnucléicos. As condições de hibridização podem ainda incluirreagentes tais como, mas não limitados a, dimetil sulfóxido(DMSO) ou formamida para desfavorecer ainda a hibridizaçãode seqüências de nucleotideo dissimilares. Um protocolo dehibridização adequado pode, por exemplo, envolverhibridização em SSC β χ (em que SSC Ix compreende citratode sódio 0,015 M e cloreto de sódio 0,15 M) a 65° Celsiusem uma solução aquosa, seguido por lavagem com SSC Ix a 65°C. Fórmulas para calcular condições de hibridização elavagem para obter hibridização que permitem 30% ou menosde não pareamentos entre duas moléculas de ácido nucléicosão descritas, por exemplo, em Meinkoth et al. (1984)Anal. Biochem. 138: 267-284; o conteúdo dos quais está pormeio disso incorporado por referência na sua totalidade.Protocolos para técnicas de hibridização são bem conhecidosdaqueles versados na técnica e manuais de biologiamolecular podem ser consultados para selecionar umprotocolo de hibridização adequado sem experimentaçãoexcessiva. Veja, por exemplo, Sambrook et al. (2001)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold SpringHarbor Press, os conteúdos dos quais estão por dissoincorporados por referência nas suas totalidades.

Tipicamente, condições severas serão aquelas nas quaisa concentração de sal é menor do que cerca de 1,5 M de ionsódio, tipicamente concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M deion Na+ (ou outros sais), de cerca de pH 7,0 a cerca de pH8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca 30° Celsius parasondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotideos) e pelomenos cerca de 60°C para sondas maiores (por exemplo, maisdo que 50 nucleotideos). Condições severas também podem serobtidas com a adição de agentes desestabilizantes tais comoformamida. Condições de baixa severidade exemplares incluemhibridização com uma solução tampão de 30 a 50% deformamida, NaCl 1 M, SDS 1% (dodecil sulfato de sódio) a 31° Celsius, e uma lavagem em SSC 1 a 2 χ em 50 a 55°Celsius. Condições de severidade moderada exemplaresincluem hibridização em formamida 40 a 45%, NaCl 1 M, SDS1% a 37° Celsius, e uma lavagem em SSC 0,5 a 1 χ em 55 a60° Celsius. Condições de alta severidade exemplares41incluem hibridização em formamida 50%, NaCl 1 M, SDS 1% a37° Celsius, e uma lavagem em SSC 0,1 χ em 60 a 65°Celsius.

Também abrangido pela presente invenção são fragmentosde polipeptidios selecionados das seqüências SEQ ID NOS:18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52. Procedimentos dedeterminação de fragmentos de polipeptidios e epitopos,tais como, gerar bibliotecas de peptideos sobreponiveis(Hemmer B. et al., Immunology Today, 1998, 19 (4), 163-168), Pepscan (Geysen Η. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sei.USA, 1984, 81 (13), 3998-4002; Geysen Η. M. et al., Proc.Nat. Acad. Sei. USA, 1985, 82 (1), 178-182; Van der Zee R.et al., Eur. J. Immunol, 1989, 19 (1), 43-47; Geysen H. M.,Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 1990, 21 (4), 523-533; Multipin® Peptide Synthesis Kits de Chiron) ealgoritmos (De Groot A. et al., Nature Biotechnology, 1999,17, 533-561), podem ser usados na prática da invenção, semexperimentação excessiva.

Os polipeptidios ou fragmentos são produzidosvantajosamente por expressão in vitro. Outro aspecto dainvenção é o uso dos polinucleotideos de acordo com ainvenção, para a expressão e produção de peptideos,polipeptidios ou proteínas, ou mais geralmente, produtos deexpressão, por exemplo, imunógenos, antígenos ou epitopos.Em uma modalidade, os polipeptídios ou peptídeos ouproteínas codificados por estes polinucleotídeos podem serusados como imunógenos ou antígenos ou epítopos desubunidades em composições imunogênicas ou vacinas. Anvenção também abrange os fragmentos imunogênicos destespolipeptídios, os quais têm pelo menos uma cadeia de 8aminoácidos do polipeptídio, pelo menos 10, pelo menos 20,tal como pelo menos 30, vantajosamente pelo menos 50 e maisvantajosamente pelo menos 70, por exemplo, fragmentos dospolipeptídios que contêm pelo menos 8 aminoácidos contíguosdo polipeptídio, pelo menos 10 aminoácidos contíguos dopolipeptídio, vantajosamente pelo menos 20, tal como pelomenos 30 e mais vantajosamente pelo menos 50 aminoácidoscontíguos do polipeptídio, e ainda mais vantajosamente pelomenos 70 aminoácidos contíguos do polipeptídio.Logicamente, um fragmento é menor do que o polipeptídiointeiro. Um fragmento pode ser combinado com outrospolipeptídios, por exemplo, em polipeptídios de fusão; porexemplo, um polipeptídio da invenção ou um fragmento seu,pode ser uma porção de um polipeptídio de fusão que incluioutra porção (outro polipeptídio) (isto é, fundido ao genede glutationa S-transferase (GST) (Chanter N et al.,Microb. Pathog., 1999, 27(3): 133-143), ou à toxinacolérica (Sheoran AS et al., Vaccine, 2002, 20(11-12):1653- 1659)), por exemplo, porção que aumenta aimunogenicidade e/ou porção que aumenta a secreção tal comouma porção de lipoproteína que aumenta a imunogenicidade,tal como um peptideo de epítopo de célula T ou uma porçãode seqüência lider ou de sinal. Conseqüentemente, ainvenção prevê a expressão de polipeptidios, proteínas,antígenos, imunógenos ou epítopos - quer sejam seqüênciasidentificadas aqui ou seus fragmentos ou aquelas que sãoheterólogas aos vetores da invenção - como fusões, por exemplo, como uma porção de um polipeptídio de fusão, porexemplo, um polipeptídio de fusão que inclui,vantajosamente, uma porção que aumenta a imunogenicidadetal como uma porção de lipoproteína e/ou uma porção queaumenta a secreção tal como uma porção de seqüência líderou de sinal.

Conforme usado aqui, o termo "antígeno" ou "imunógeno"significa uma substância que induz uma resposta imuneespecífica em um animal hospedeiro. 0 antígeno podecompreender um organismo inteiro, morto atenuado ou vivo;uma subunidade ou porção de um organismo; um vetorrecombinante que contêm um inserto com propriedadesimunogênicas; um pedaço ou um fragmento de DNA capaz deinduzir uma resposta imune mediante apresentação a umanimal hospedeiro; uma proteína, um polipeptídio, umpeptídeo, um epitopo, um hapteno, ou qualquer uma de suascombinações. Alternativamente o imunógeno ou antigeno podecompreender uma toxina ou antitoxina.

o termo "proteína ou peptídeo imunogênico", conforme usado neste documento, também se refere e inclui peptídeose polipeptídios que são imunologicamente ativos no sentidode que uma vez administrado ao hospedeiro, é capaz deevocar uma resposta imune do tipo humoral e/ou celulardirecionada contra a proteína. Preferivelmente o fragmentoda proteína é tal que ele tem substancialmente a mesmaatividade imunológica que a proteína inteira. Desta forma,um fragmento de proteína de acordo com a invençãocompreende, consiste essencialmente ou consiste em pelomenos um epitopo ou determinante antigênico. 0 termo epitopo se refere a um sítio de proteína capaz de induziruma reação imune do tipo humoral (células B) e/ou do tipocelular (células T).

O termo "proteína ou peptídeo imunogênico" contemplatambém deleções, adições e substituições à seqüência, contanto que o polipeptídio funcione par produzir umaresposta imunológica conforme definida neste documento. Comrelação a isto, substituições particularmente preferidasgeralmente serão conservativas na natureza, isto é, aquelassubstituições que ocorrem, dentro de uma família deaminoácidos. Por exemplo, os aminoácidos geralmente sãodivididos em quatro famílias: (1) ácidos — aspartato eglutamato; (2) básicos — lisina, arginina, histidina; (3)não-polares — alanina, valina, leucina, isoleucina,prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polarnão-carregado — glicina, asparagina, glutamina, cisteína,serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano, etirosina são algumas vezes classificados como aminoácidosaromáticos. De forma razoável é previsível que umasubstituição isolada de leucina por serina ou vice-versa;um aspartato por glutamato ou vice-versa; uma treonina poruma serina ou vice-versa; ou uma substituição conservativasimilar de um aminoácido por outro aminoácidoestruturalmente relacionado, não terá um efeito importantesobre a atividade biológica. Proteínas que têmsubstancialmente a mesma seqüência de aminoácido que amolécula de referência, mas que possuem substituições deaminoácido secundárias que não afetam substancialmente aimunogenicidade da proteína estão, portanto, dentro dadefinição do polipeptídio de referência.

O termo "epítopo" se refere ao local em um antígeno ouhapteno ao qual células B e/ou células T específicasrespondem. O termo também é usado intercambiavelmente com"determinante antigênico" ou "sítio determinanteantigênico". Anticorpos que reconhecem o mesmo epítopopodem ser identif içados em um imunoensaio simples quemostra a habilidade de um anticorpo de bloquear a ligaçãode outro anticorpo a um antigeno alvo.

Uma "resposta imunológica" a uma composição ou vacinaé o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imunecelular e/ou mediada por anticorpo a uma composição ouvacina de interesse. Geralmente uma "resposta imunológica"inclui, mas não é limitada a um ou mais dos seguintesefeitos: a produção de anticorpos, células B, células Tauxiliares, e/ou células T citotóxicas, direcionadasespecificamente a um antigeno ou antigenos incluídos nacomposição ou vacina de interesse. Preferivelmente, ohospedeiro irá apresentar uma resposta imunológicaterapêutica ou protetora tal que a resistência a novainfecção será aumentada e/ou a severidade clínica da doençareduzida. Tal proteção será demonstrada por uma redução oupor uma falta de sintomas normalmente apresentados por umhospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápidoe/ou uma titulação viral reduzida no hospedeiro infectado.

Uma proteína ou polipeptídio "imunogênico" conformeusado neste pedido também se refere a uma seqüência deaminoácido que elicia uma reposta imunológica conformedescrita acima. Uma proteína ou polipeptídio "imunogênico",conforme usado aqui, inclui a seqüência de extensãocompleta da proteina, seus analogos, ou seus fragmentosimunogênicos. Por "fragmento imunogênico" entende-se umfragmento de uma proteína que inclui um ou mais epítopos eassim elicia uma resposta imunológica descrita acima. Taisfragmentos podem ser identificados usando qualquer númerode técnicas de mapeamento de epítopo, bem conhecidas natécnica. Veja, por exemplo, Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris,Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N.J. Por exemplo, epítoposlineares podem ser determinados, por exemplo, porsintetizar concomitantemente grandes números de peptídeossobre suportes sólidos, os peptídeos correspondendo aporções da molécula de proteína, e reagir os peptídeos comos anticorpos enquanto que os peptídeos ainda são ligadosaos suportes. Tais técnicas são conhecidas na técnica edescritas, por exemplo, na Patente Americana No. 4.708.871;Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 :3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715,todos por meio deste incorporados por referência nas suastotalidades. Similarmente, epítopos conformacionais sãofacilmente identificados por determinar a conformaçãoespacial dos aminoácidos tais como, por exemplo, porcristalografia de raio-X e por ressonância magnéticanuclear bidimensional. Veja por exemplo, Epitope MappingProtocols f suip2Γ3. ·

Antigenos sintéticos também estão incluídos dentro dadefinição, por exemplo, poliepitopos, epítoposflanqueadores, e outros antígenos recombinantes. Veja porexemplo, Bergmann et ai. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et ai. (1996) J. Iitimunol. 157:3242-3249;Suhrbier, A. (1997) Immunol, e Cell Biol. 75:402-408;Gardner et al. (1998) 12a World AIDS Conference, Geneva, Suiça, 28 Jun. a 3 Jul., 1998. Fragmentos imunogênicos,para os propósitos da presente invenção, incluirãogeralmente pelo menos cerca de 3 aminoácidos ,preferivelmente pelo menos cerca de 5 aminoácidos, maispreferivelmente pelo menos cerca de 10 a 15 aminoácidos, e o mais preferivelmente 25 ou mais aminoácidos, da molécula.Não há limite superior crítico para o cumprimento daseqüência de proteína, ou ainda uma proteína de fusão quecompreende pelo menos um epítopo da proteína.

Conseqüentemente, uma estrutura mínima de um polinucleotídeo que expressa um epítopo é que elecompreende ou consiste essencialmente em nucleotídeos paracodificar um epítopo ou determinante de antígeno daproteína ou poliproteína de interesse. Um polinucleotídeoque codifica um fragmento da proteína total oupoliproteina, mais vantajosamente compreende ou consisteessencialmente, mais vantajosamente compreende ou consistevantajosamente pelo menos 42 nucleotideos, epreferivelmente pelo menos 57, 87 ou 150 nucleotideosconsecutivos ou contíguos da seqüência que codifica aproteína total ou poliproteina. Procedimentos dedeterminação de epítopo, tais como, gerar bibliotecas depeptídeo sobreponíveis (Hemmer B. et al. , Immunology Today,1998, 19 (4), 163-168), Pepscan (Geysen et al., (1984)Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 81, 3998-4002; Geysen et al.,(1985) Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 82, 178-182; Van der ZeeR. et al., (1989) Eur. J. Immunol, 19, 43-47; Geysen H.M.,(1990) Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 21,523-533; Multipin.RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) ealgoritmos (De Groot A. et al, (1999) Nature Biotechnology,17, 533-561), e no Pedido PCT No. de sériePCT/US2004/022 605 todos os quais estão por meio desteincorporados por referência nas suas totalidades, podem serusados na prática da invenção, sem experimentaçãoexcessiva. Outros documentos citados e incorporados pormeio disso por referência também podem ser consultados pormétodos para determinar os epítopos de um imunógeno ouantígeno e assim moléculas de ácido nucléico que codificamtais epítopos.Em uma modalidade, os fragmentos de polipeptídio sãoselecionados a partir das seqüências SEQ ID NOS: 32, 34,36, 38, 40, 54, 56 e 58, os quais são respectivamentecodificados pelas seqüências de nucleotideo SEQ ID NOS: 31,33, 35, 37, 39, 53, 55 e 57. Os fragmentos de polipeptidiosSEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e 58 são parte deSe50, Sel459, Se595, Se528, Se358, Sel631, Sel681 e Sla,respectivamente.

Os polinucleotideos que codificam polipeptidios deacordo com a presente invenção, seus análogos ou seusfragmentos são inseridos em um vetor, ligados a elementosregulatórios tais como promotor, região de ligação deribossomo e terminador, e códon de inicio e de parada. Ospolipeptidios, seus análogos e seus fragmentos podem serproduzidos por expressão in vitro nas células hospedeiras.

Os vetores de expressão in vitro são vetores de expressãousados para a expressão in vitro de proteínas em um sistemacelular apropriado. Isso pode ser produzido em célulashospedeiras procarióticas, isto é, em Escherichia coli(Mahona F et al, Biochimie 1994, 46(1): 9-14; Watt M A etal, Cell Stress Chaperones 1997, 2(3): 180-90; Frey J Res.Microbiol. 1992, 143(3): 263-9) ou em Lactobacillus(Seegers J F, Trends Biotechnol. 2002, 20(12): 508-515;Pouwels P H et al, Methods Enzymol. 2001, 336: 369-389), ouem células hospedeiras eucarióticas, isto é, em levedura(Gerngros3 T ü, Nat Biotechnol. 2004, 22(11): 1409-1414;Malissard M et al, Glycoconj J. 1999, 16(2): 125-139), emcélulas de inseto (Oker-Blom C et al, Brief Funct Genomic Proteomie. 2003, 2(3), 244-253), células de mamífero oucélulas de ave. Para Escherichia coli, diferentes cepaspodem ser usadas, notavelmente a cepa BL21(DE3) (Novagen ouInvitrogen; veja Hedayati M A et al, Protein Expr Purif,2005, 43(2): 133-139) cepa 0rigami2(DE3) (Novagen ou Invitrogen), Y1089 (Galan J E et al, Infect Immun, 1987,55(12): ^3181-3187). Os vetores são vantajosamenteplasmídeos, isto é, plasmídeos pGEX (GE Healthcare),plasmídeos pET (Novagen ou Invitrogen) (Jiang XY et al, JBiochem MoI Biol. 2006, 39(1): 22-25; Hedayati M A et al, Protein Expr Purif, 2005, 43(2): 133-139; Jedrzejas M J etal, Protein Expr Purif, 1998, 13(1): 83-89). 0 vetor tambémpode ser um vírus, notavelmente um bacteriófago, isto é,fago lambda-gtl 1 (Galan J E et al, Infect Immun, 1987,55(12): 3181- 3187). Outra abordagem é usar genes fundidospara a produção de proteínas quiméricas entre uma proteínade Streptococcus e uma proteína de Escherichia coli,notavelmente lipoproteína (Cullen P A et al, Plasmid, 2003,49(1): 18-29), ou com GST (Zhao G et al, Protein ExprPurif, 1999, 16(2): 331-339). 0 inserto estreptocócico podeser ligado a um promotor, isto é, promotor de bacteriófagoT7 (Yamato M et al, FEMS Microbial Lett, 1995 132 (3) :209-213), uma seqüência de peptideo de sinal, isto é,peptideo de sinal da proteína A externa de Borreliaburgdorferi (De B K et al, Vaccine, 2000, 18(17): 1811-1821), uma seqüência de sinal da lipoproteina da membranaexterna principal de Escherichia coli (Cullen P A et al,Plasmid, 2003, 49(1): 18-29).

Para Lactobacillus, diferentes cepas podem ser usadas,notavelmente Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum,Laetobaeillus casei (Seegers J F, Trends Biotechnol., 2002,20(12): 508-515). Promotores e genes regulatóriosenvolvidos na produção de sacacina P são adequados paraestabelecer expressão gênica de alto nível indutível emLaetobaeillus (Mathiesen G et al, Lett Appl Microbiol,2004, 39(2): 137-143), ou promotor de operon de lactose(Oliveira M L et al, FEMS Microbiol Lett., 2003, 227(1):25-31) . Outra abordagem é usar os genes fundidos para aprodução de proteínas quiméricas entre uma proteína deLaetobaeillus e uma proteína de Streptoeoeeus (Hung J etal, FEMS Microbiol Lettf 2002, 211(1): 71-75).

Para a expressão in vitro em células de inseto, osvetores são vantajosamente vírus, expressão em células deinseto, vetores são vantajosamente vírus, isto é,baculovírus {veja, por exemplo, patente americana No.4,745,051; Vialard J. et al, J. Virolf 1990 64 (1), 37=50;Verne A., Virology, 1988, 167, 56-71; Oker-Blom C et al,Brief Funct Genomic Proteomic. 2003, 2(3), 244-253), por exemplo, Virus da Poliedrose Nuclear de Autographacalifornica AcNPV, e células de inseto são células deSpodoptera frugiperda Sf9 (ATCC CRL 1711; veja também aspatentes americanas Nos. 6.228.846, 6.103.526). A produçãode proteína pode ocorrer pela transfecção de células de mamífero por plasmídeos, pela replicação ou expressão semreplicação produtiva de vetores virais em células demamífero, ou células de ave. Células de mamífero que podemser usadas são vantajosamente células de hamster (porexemplo, CHO ou BHK-21) ou células de macaco (por exemplo, COS ou VERO) ou células bovinas (por exemplo, MDBK), istoé, cultura de vetores de EHV-I em células MDBK (Ibrahim elS M et al, Microbiol. Immunol, 2004, 48(11): 831-842) ou emcélulas Vera (US-A-4.110.433), ou cultura de replicons deVEEV em células BHK (Lee J S et al, Infect. Immun., 2001,69(9): 5709-5715).

É compreendido por um versado na técnica que ascondições para cultivar uma célula hospedeira in vitrovariam de acordo com o gene particular e que experimentaçãode rotina é necessária em momentos para determinar ascondições ótimas para cultivar uma proteína dependendo dacelula hospedeira. Uma "celula hospedeira" denota umacélula procariótica ou eucariótica que foi alteradageneticamente, ou que é capaz de ser alterada geneticamentepela administração de um polinucleotídeo exógeno, tal comoum plasmídeo ou um vetor recombinante. Quando se refere acélulas alteradas geneticamente, o termo se refere tanto àcélula originalmente alterada quanto a sua progênie.

Os vetores de expressão in vitro podem serintroduzidos em uma célula hospedeira adequada parareplicação e amplificação. Os vetores que contêm ospolinucleotideos de interesse podem ser introduzidos nacélula hospedeira por qualquer um de vários meiosapropriados, incluindo absorção direta, endocitose,transfecção, conjugação-f (parelhamento-f), eletroporação,transfecção empregando cloreto de cálcio, cloreto derubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextran ou outrassubstâncias; bombardeio com microprojéteis; lipofecção, einfecção (onde o vetor é infeccioso, por exemplo, um vetorretroviral). A escolha da introdução de vetores oupolinucleotideos geralmente dependerá de aspectos da célulahospedeira.

As proteínas expressas podem ser coletadas no, ou apartir do, sobrenadante da cultura após, ou antes, dasecreção (se não há secreção a Iise celular tipicamenteocorro ou e realizada) ocionalmente concentradas pormétodos de concentração, tais como ultrafiltração e/oupurificadas por meios de purificação, tais como métodos decromatograf ia de afinidade, troca de ion ou do tipo defiltração em gel, notavelmente por cromatografia porafinidade, isto é, usando Ni NTA Superflow (Qiagen) ou NiSepharose fastflow (Amersham) ou por filtração em gel, istoé, usando Sephacryl® ou Superdex® (Amersham GE Healthcare).

Os polipeptidios e seus fragmentos também podem serobtidos por extração, notavelmente extração ácida ouextração com mutanolisina (Boschwitz J S et al., CornellVet., 1991, 81(1): 25- 36) e purificação, notavelmenteimunoprecipitação (Erickson E D et al., Can J Comp Med.,1975, 39(2): 110-115), a partir de cultura bruta debactérias estreptocócicas, principalmente de Streptococcusequi.

Os polipeptidios e seus fragmentos também podem sersintetizados quimicamente (Luo Y et al., Vaccine 1999, 17 (7-8) : 821-31) .

Por "composição de vacina de subunidade" entende-seuma composição que contém pelo menos um polipeptidio ou umpolinucleotideo imunogênico capaz de expressar pelo menosum, mas não todos os antigenos derivados de, ou homólogosa, um antígeno de um patógeno de interesse. Tal composiçãoe substanczalmente livre de partículas ou célulaspatogênicas intactas, ou o lisado de tais células oupartículas. Assim, uma "composição de vacina de subunidade"é preparada a partir de polipeptídios imunogênicos pelomenos parcialmente purificados (preferivelmentesubstancialmente purificados) do patógeno ou seus análogosrecombinantes. Uma composição de vacina de subunidade podecompreender o antígeno ou antígenos de subunidade deinteresse substancialmentes livre de outros antígenos oupolipeptídios do patógeno.

Um objetivo da invenção é uma composição imunogênicade subunidades ou vacina de subunidade que compreende pelomenos um polipeptídio, seu análogo ou seu fragmento deacordo com a invenção e um excipiente, diluente ou veículofarmaceuticamente aceitável e opcionalmente um adjuvantee/ou um estabilizante.

A subunidade imunogênica ou composição de vacina podecompreender pelo menos um polipeptídio selecionado do grupoque consiste nas seqüências de SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24,26, 48, 50 e 52 ou seus análogos ou seus fragmentos. Asubunidade imunogênica ou composição de vacina podecompreender vantajosamente dois, três, quatro ou cincopolipeptídios selecionados do grupo que consiste nasseqüências de SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52ou ssus analogos ou seus fragmentos.

A subunidade imunogênica ou composição de vacina podecompreender pelo menos um polipeptidio selecionado do grupoque consiste das seqüências de SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38,40, 54, 56 e 58 ou suas análogas. A subunidade imunogênicaou composição de vacina pode compreender vantajosamentedois, três, quatro ou cinco polipeptidios selecionados dogrupo que consiste de seqüências de SEQ ID NOS: 32, 34, 36,38, 40, 54, 56 e 58 ou seus análogos

Outro objeto da invenção é uma composição imunogênicaou vacina recombinante que compreende pelo menos um vetorde expressão recombinante in vivo e um excipiente, diluenteou veiculo farmaceuticamente aceitável e opcionalmente umadjuvante e/ou um estabilizante. Os vetores de expressãorecombinantes in vivo são vetores que compreendempolinucleotideos ou seus fragmentos inseridos nesses ecapazes de expressar in vivo, no mamífero alvo, opolipeptidio codificado por esse polinucleotídeo ou seufragmento. Os vetores podem ser vetores de polinucleotídeoou plasmídeos (EP-A2- 1001025; Chaudhuri P Res. Vet. Sei.2001, 70(3), 255-6) para composições imunogênicas de DNA evacinas de DNA ou podem ser vírus (por exemplo, herpesvírustal como herpesvírus eqüino tipo 1 (Trapp S et al., J.Virol. 2005, 79(9): 5445- 5454), herpesvírus eqüino tipo 2,herpesvirus Gquxno tipo 4; poxvirus tal corno vírus davaríola ou vírus avipox, como fowlpox (US-A-5, 174.993 US-A-5.505.941 e US-A-5.766.599) ou canarypox (US-A-5.756.103); adenovírus tal como adenovírus humano(Chroboczek J et al., Virol. 1992, 186: 280-285); vírus daencefalíte tal como vírus da encefalite eqüina venezuelana(Pushko P et al. Virol. 1997, 239: 389-401; Davis N L etal. J. Virol. 2000, 74: 371-378)) para composiçõesimunogênicas de vetor viral recombinante e vacinas de vetorviral recombinante. Em uma modalidade adicional, ospolinucleotídeos ou seus fragmentos podem ser inseridos emvetores de expressão bacterianos in vivo, notavelmente emSalmonella, para produzir composições ou vacinasimunogênicas bacterianas recombinantes vivas

0 termo plasmídeo cobre qualquer unidade detranscrição de DNA que compreende um polinucleotídeo deacordo com a invenção e os elementos necessários para suaexpressão in vivo em uma célula ou células do hospedeirodesejado ou alvo; e com relação a isto, é observado que umplasmídeo circular superenovelado ou não-superenovelado, umplasmídeo circular, assim como uma forma linear, sãopretendidos estar dentro do escopo da invenção. Em umexemplo específico, não-limitante, o plasmídeo pVR1020 ou1012 (VICAL Inc.; Luke C. et al, Journal of InfectiousDiseascs, 1997, 175, 91-97; Kartikka J. et al, Hurnan GeneTherapy, 1996, 7, 1205-1217) pode ser utilizado como umvetor para a inserção de uma seqüência de polinucleotideo.

0 plasmídeo pVR1020 é derivado de pVR1012 e contém aseqüência de sinal tPA humana. Cada plasmideo compreende oucontém, ou consiste essencialmente em, além dopolinucleotideo ou seu análogo ou seu fragmento,operativamente ligado a um promotor ou sob o controle de umpromotor ou dependente de um promotor. Em geral, évantajoso empregar um promotor funcional forte em célulaseucarióticas. 0 promotor forte preferido é o promotorimediato precoce de citomegalovirus (CMV-IE) de origemhumana ou de murino, ou opcionalmente de outra origem talcomo de rato ou porco da guiné. 0 promotor de CMV-IE podecompreender uma parte promotora real, que pode ou não podeestar associada com a parte intensificadora. Pode se fazerreferência a to EP-A-260 148, EP-A-323 597, PatentesAmericanas Nos. 5.168.062, 5.385.839, e 4.968.615, assimcomo Pedido PCT No. WO-A-87/03905. 0 promotor de CMV-IE évantajosamente um CMV-IE humano (Boshart M. et al., Cell,1985, 41, 521-530) ou um CMV-IE de murino. Em termos maisgerais, o promotor tem uma origem viral ou celular. Umpromotor viral forte com exceção de CMV-IE que pode serempregado com utilidade na prática da invenção é o promotorprecoce/tardio do vírus SV40 ou o promotor de LTR do vírusdo sarcoma de Rous. Um promotor celular forte que pode serempregado com utilidade na prática da invenção é o promotorde um gene do citoesqueleto, tal como, por exemplo, opromotor desmina (Kwissa M. et ai., Vaccine, 2000, 18,2337-2344) ou o promotor de actina (Miyazaki J. et ai.,Gene, 1989, 79, 269-277). Subfragmentos funcionais dessespromotores, isto é, porções desses promotores que mantêmuma atividade promotora adequada, estão incluídos dentro dapresente invenção, por exemplo, promotores de CMV-IEtruncados de acordo com o Pedido PCT No. WO-A-98/00166 ouPatente Americana No. 6.156.567 e podem ser usados naprática da invenção. Um promotor na prática da invençãoinclui, conseqüentemente, derivados e subfragmentos de umpromotor de extensão completa que mantém uma atividadepromotora adequada e, portanto, funcionam como um promotor,promovendo preferivelmente atividade substancialmentesimilar àquela do promotor real ou de extensão completa doqual o derivado ou subfragmento é derivado, por exemplo,semelhante à atividade dos promotores de CMV-IE truncadosda Patente Americana No. 6.156.567 para a atividade depromotores de CMV-IE de extensão completa. Assim, umpromotor de CMV-IE na prática da invenção pode compreenderou consistir essencialmente em, ou consistir na porçãopromotora do promotor de extensão completa β/ou na porçãointensificadora do promotor de extensão completa, assimcomo derivados e subfragmentos. Vantajosamente, osplasmideos compreendem ou consistem essencialmente emoutros elementos de controle da expressão. Éparticularmente vantajoso incorporar seqüência(s)estabilizadora(s), por exemplo, seqüência(s) de intron,preferivelmente o primeiro intron de hCMV-IE (Pedido PCTNo. WO-A-89/01036) , o intron II do gene de β-globina decoelho (van Ooyen et al., Science, 1979, 206, 337-344).

Para vetores recombinantes baseados em herpesviruseqüino, em particular cepas atenuadas (isto é, cepas EVH-IKyA (Zhang Y et al., Virology, 2000, 268(2): 482-492)) ouatenuadas por mutação ou deleção de genes envolvidos napatogenicidade (Kirisawa R et al., Vet. Microbiol., 2003,95(3): 159-174) ou por passagens seriadas em cultura (US-A-4.110.433) podem ser usadas. Para EHV-1, a inserção podeser feita na região intergênica entre ORF 62 e ORF63(Ibrahim el S M et al., Microbiol. Immunol, 2004, 48(11):831-842; Csellner H et al., Arch. Virol, 1998, 143(11):2215-2231) ou nos genes, eventualmente após a deleçãoparcial ou completa dos genes, isto é, no gene da timidinaquinase (TK) , nos genes 1 ou 71 (Kirisawa R et al., Vet.Microbiol, 2003, 95(3): 159-174), no gene da glicoproteinaI e gene da glicoproteina E (Matsumura T. et ai.,Virology, 1998, 242(1): 68-79), no gene da proteína IR6(Osterrieder N et al., Virology, 1996, 217(2): 442-451), nogene 15 (EP-B1-0.668.355). Para EHV-4, a inserção pode serfeita no gene da glicoproteina I e no gene da glicoproteinaE (Damiani A M et al., Virus Res., 2000, 67(2): 189-202),no gene de US2 ou TK ou glicoproteina E (US-A-5. 741.696;US-A-5. 731. 188), eventualmente após a deleção parcial oucompleta dos genes. Em uma modalidade, o polinucleotídeo aser expresso é inserido sob o controle de um promotorfuncional em células eucarióticas, vantajosamente umpromotor de CMV-IE (murino ou humano). Uma seqüência depoli (A) e uma seqüência de terminação podem ser inseridas àjusante do polinucleotídeo a ser expresso, por exemplo,sinal de poliadenilação do gene do hormônio do crescimentobovino ou de β-globina de coelho. Para um vetorrecombinante baseado no vetor de poxvírus, um vírus devaríola ou um vírus de varíola atenuado (por exemplo, MVA,uma cepa Ankara modificada obtida após mais de 570 passagens do cepa da vacina Ankara em fibroblastos deembrião de galinha: veja Stickl & Hochstein- Mintzel,Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149-1153; Sutter et al,Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1992, 89, 10847-10851;disponível como ATCC VR-1508; ou NYVAC, veja PatenteAmericana No. 5.494.807, por exemplo, exemplos 1 a 6 e etseq de Patente Americana No. 5.494.807 que discute aconstrução de NYVAC, assim como variações de NYVAC com ORFsadicionais deletadas do genoma do vírus da varíola cepaCopenhague, assim como a inserção de moléculas de ácidonucléico codificante heterólogo nos sítios dessarecombinação e, também, o uso de promotores pareados; vejatambém WO-A-96/40241), um vírus avipox ou um vírus avipox atenuado (por exemplo, canarypox, vírus fowlpox, dovepox,pigeonpox, quailpox, ALVAC ou TROVAC; veja, por exemplo,Patente Americana No.. 5.505.941, 5.494.807) podem serusados. Vírus canarypox atenuados estão descritos naPatente Americana No. 5.756.103 (ALVAC) e WO-A-01/05934. Também é feita referência a Patente Americana No. 5.766.599que está ligada a cepa de vírus fowlpox atenuada TROVAC. Éfeita referência ao canarypox disponibilizado pela ATCC sobo número de acesso VR-Ill. Numerosas cepas para vacinaçãodo vírus fowlpox também estão disponíveis, por exemplo, a cepa DIFTOSEC CT, comercializada por MERIAL e a vacinaNOBILIS VARIOLE comercializada pela INTERVET. Parainformação sobre o método para gerar recombinantes desses ecomo administrar recombinantes desses, os versados natécnica podem consultar os documentos citados nesse e WO-A-90/12882, por exemplo, em relação ao vírus da varíola éfeita menção nas Patentes Americanas No.s. 4.7 69.330,4.722.848, 4.603.112, 5.110.587, 5.494.807, e 5.762.938entre outras; em relação ao vírus fowlpox é feita mençãonas Patentes Americanas No.s. 5.174.993, 5.505.941 e5.766.599 entre outras; em relação ao vírus canarypox éfeita menção na Patente Americana No.. 5.756.103 entreoutras. Quando o vetor de expressão é um vírus de varíola,sítio ou sítios de inserção para o polinucleotídeo oupolinucleotídeos a serem expressos estão vantajosamente nogene ou sítio de inserção de timidina quinase (TK) , no geneou sítio de inserção de hemaglutinina (HA), a região quecodifica o corpo de inclusão do tipo A (ATI); veja tambémos documentos citados aqui, especialmente aqueles que serelacionam com o vírus da varíola. No caso de canarypox, osítio ou sítios de inserção são, vantajosamente, 0RF(s) C3,C5 e/ou C6; veja também os documentos citados aqui,especialmente aqueles que se relacionam com o víruscanarypox. No caso do vírus fowlpox, o sítio ou sítios deinserção são, vantajosamente, ORFs F7 e/ou F8; veja tambémos documentos citados aqui, especialmente aqueles que serelacionam com o vírus fowlpox. 0 sítio ou sítios deinserção para o vírus MVA são vantajosamente como em váriasoutras publicações, incluindo Carroll M. W. et al, Vaccine,1997, 15 (4), 387-394; Stittelaar Κ. J. et al, J. Virol,200, 74 (9), 4236 - 4243 : Sutter G. et al, 1994, vaccine,12 (11), 1032-1040; e, nesse aspecto também é observado queo genoma completo de MVA está descrito em Antoine G.,Virology, 1998, 244, 365-396, o que possibilita ao versadona técnica usar outros sítios de inserção ou outrospromotores. Vantajosamente, o polinucleotídeo a serexpresso é inserido sob o controle de um promotor depoxvírus específico, por exemplo, o promotor de 7,5 kDa devaríola (Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35), opromotor I3L de varíola (Riviere et al., J. Virology, 1992,66, 3424-3434), o promotor HA de varíola (Shida, Virology,1986, 150, 451-457), o promotor ATI de cowpox (Funahashi etal., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47), o promotor H6 devaríola (Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508; GuoP. et al. J. Virol, 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. et al,J. Virol, 1989, 63, 3829-3836), interalia.

Para o vetor recombinante baseado em vetor deadenovírus, um adenovírus humano (HAV), vantajosamente, umvetor de adenovírus humano sorotipo 5 (Ad5), um adenovírusEl-deletado e/ou interrompido, um adenovírus E3-deletadoe/ou interrompido ou um adenovírus El- e E3-deletado e/ouinterrompido podem ser usados. Opcionalmente, E4 pode serdeletado e/ ou interrompido a partir de qualquer um dosadenovirus descritos acima. Por exemplo, os vetores de Ad5humanos descritos em Yarosh et al. e Lutze-Wallace et al.podem ser usados (veja, por exemplo, Yarosh et al., Vacina.1996 Set; 14 (13):1257-64 e Lutze-Wallace et al.,Biologicals. 1995 Dez; 23 (4):271-7). Em uma modalidade ovetor viral é um adenovirus humano, particularmente umadenovirus sorotipo 5, tornado incompetente para replicaçãopor uma deleção na região El do genoma viral. O adenovirusdeletado é propagado em células 293 que expressam El oucélulas PER, particularmente PER.C6 (F. Falloux et al.Human Gene Therapy 1998, 9, 1909-1917). 0 adenovirus humanopode ser eventualmente deletado na região E3 eventualmenteem combinação com uma deleção na região El (veja, porexemplo J. Shriver et al. Nature, 2002, 415, 331-335, F.Graham et al. Methods in Molecular Biology VoI .7: GeneTransfer and Expression Protocols editado por E. Murray,The Human Press Inc, 1991, ρ 109-128; Y. Ilan et al. Proc. Natl.

Acad. Sei. 1997, 94, 2587-2592; S. Tripathy et al.Proc. Natl. Acad. Sei. 1994, 91, 11557-11561; B. TapnellAdv. Drug Deliv. Rev.1993, 12, 185-199;X. Danthinne et alGene Therapy 2000, 7, 1707-1714; K. Berkner Bio Techniques1988, 6, 616-629; K. Berkner et al. Nucl. Acid Res. 1983,11, 6003-6020; C. Chavier et al. J. Virol. 1996, 70, 4805-4810) . Os sítios de inserção podem ser os Ioci El e/ou E3eventualmente após uma deleção parcial ou completa dasregiões El e/ou E3. Vantajosamente, quando o vetor deexpressão é um adenovírus, o polinucleotídeo a ser expressoé inserido sob controle de um promotor funcional em célulaseucarióticas, tal como um promotor forte, preferivelmenteum promotor gênico imediato precoce de citomegalovírus(promotor CMV-IE). 0 promotor CMV-IE é preferencialmente deorigem murina ou humana. 0 promotor do fator de alongamentoIa também pode ser usado. Um promotor músculo-especificotambém pode ser usado (X. Li et al. Nat. Biotechnol. 1999,17, 241-245). Promotores fortes também são discutidos nestedocumento em relação a vetores plasmidiais. Uma seqüênciapoli (A) e uma seqüência terminadora podem ser inseridas àjusante do polinucleotídeo a ser expresso, por exemplo umgene do hormônio de crescimento bovino ou um sinal depoliadenilação do gene da β-globina de coelho.

Para o vetor recombinante baseado no vírus deencefalite, um vírus de encefalite eqüina venezuelana(VEEV) pode ser usado (Nelson E L et al., Breast CâncerRes. Treat., 2003, 82(3): 169-183), em particular como umreplicon, ou seja, como um RNA auto-replicante contendotodos os genes não estruturais de VEEV e um sítio declonagem múltipla no lugar dos genes estruturais de VEEV(Lee J S et al., Infect. Immun., 2003, 71 (3): 1491-1496;Velders M P et al., Câncer Res., 2001, 61(21): 7861-7867).Os polinucleotideos a serem expressos são inseridos nestesitio de clonagem múltipla, opcionalmente ligados àseqüência de nucleotideos que codifica uma seqüênciasecretória ou uma seqüência secretória ativadora deplasminogênio tecidual. Os polinucleotideos a seremexpressos também podem ser inseridos à jusante do promotor26S subgenômico no lugar dos genes virais estruturais deVEEV (Lee J S e al, Infect. Immun., 2001, 69 (9): 5709-5715; Pushko P et al., Vaccine, 2000, 19 (1): 142-153).

Para vetores recombinantes baseados em bactérias,Salmonella, notavelmente Salmonella typhimurium (Yang X Let al, Biomed. Environ. ScL, 2005, 18 (6): 411-418; DunstanS J et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol, 2003, 37 (2-3):111-119), Salmonella typhi (Santiago-Machuca A E et al.,Plasmid., 2002, 47(2): 108-119) pode ser usada. Ospolinucleotideos a srem expressos podem ser inseridos nogene da flagelina de Salmonella (Chauhan N et al, MoI CellBiochem., 2005, 276(1-2): 1-6), ou no gene aroC (Santiago-Machuca A E et al., Plasmid., 2002, 47 (2): 108-119). Ospolinucleotideos a serem expressos também podem serinseridos sob o controle do promotor nirB induzivelanaerobicamente (Santiago-Machuca A E et al., Plasmid.,2002, 47 (2): 108-119).

A composição de vacina ou imunogênica recombinantepode conter pelo menos um vetor de expressão recombinanteque compreende pelo menos um polinucleotideo que codificaum polipeptidio selecionado do grupo que consiste nasseqüências de SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52,ou seus análogos ou seus fragmentos. A composição de vacinaou imunogênica recombinante pode conter pelo menos um vetorrecombinante de expressão que compreende pelo menos umpolinucleotideo que codifica um polipeptidio selecionado dogrupo que consiste nas seqüências de SEQ ID NOS: 32, 34,36, 38, 40, 54, 56 e 58, ou seus análogos. A composição devacina ou imunogênica recombinante podem contervantajosamente pelo menos um vetor de expressãorecombinante que compreende pelo menos um polinucleotideoque codifica dois ou três ou quatro ou cinco polipeptidiosselecionados do grupo que consiste nas seqüências SEQ IDNOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e 58, ou seus análogos.

Os vetores da invenção podem compreender ainda, alémdisso, pelo menos um polinucleotideo heterólogo. Isto éútil para reproduzir ou replicar polinucleotideosheterólogos e/ou para a expressão de polinucleotideosheterólogos, in vivo ou in vitro. Tais vetores também sãoúteis para preparar composições de vacina ou imunogênicasmultivalentes, notavelmente composições imunogênicas ouvacinas de DNA multxvalente e composxçoes xmunogenxcas ouvacinas de vetor viral recombinante multivalente. Aseqüência de ácido nucléico heteróloga codificavantajosamente para um imunógeno, um antigeno ou um epitopode um agente viral patogênico, agente parasitico oubacteriano, tal agente bacteriano é diferente das bactériasestreptocócicas na origem dos polinucleotideos quecodificam os polipeptidios de acordo com a invenção. Estaseqüência heteróloga pode codificar um imunógeno, antigenoou epitopo do virus de encefalite eqüina ocidental (WEEV),virus de encefalite eqüina oriental (EEEV), virus deencefalite eqüina venezuelana (VEEV), virus da influenzaeqüina, herpesvirus eqüino tipo 1 (EHV-I), herpesviruseqüino tipo 2 (EHV-2), herpesvirus eqüino tipo 4 (EHV-4),virus da Arterite Eqüina (EAV), virus do Oeste do Nilo(WNV), tétano, rodococos. Em uma modalidade particular, aseqüência heteróloga pode codificar um imunógeno, antigenoou epitopo do virus da influenza eqüina e de EHV-I e/ouEHV-4. Um imunógeno ou antigeno é uma proteina oupolipeptidio capaz de induzir uma resposta imune contra oagente patogênico ou um antigeno secretado do agentepatogênico, e contém um ou mais epitopos; um epitopo é umpeptideo ou' polipeptidio que é capaz de induzir umaresposta imune contra o agente patogênico ou um antigenosecretado do agente patogênico.

Opcionalmente, a composição ou vacina imunogênica desubunidade da invenção pode ser combinada com um ou maisimunógenos, antigenos ou epitopos selecionados de outrosmicroorganismos patogênicos ou virus para formar umacomposição ou vacina imunogênica de subunidademultivalente. Para eqüinos, tal composição ou vacinaimunogênica de subunidade multivalente pode compreenderpelo menos um polipeptidio de acordo com a presenteinvenção e pelo menos um imunógeno, antigeno ou epitopo deWEEV, EEEV, VEEV, virus da influenza eqüina, EHV-1, EHV-4,EAV, WNV, tétano, rodococos. Em uma modalidade particular,tal composição ou vacina imunogênica de subunidademultivalente pode compreender pelo menos um polipeptidio deacordo com a presente invenção e pelo menos um imunógeno,antigeno ou epitopo do virus da influenza eqüina e de EHV-Ie/ou EHV-4.

O excipiente, diluente ou veiculo veterinário oufarmaceuticamente aceitável pode ser água ou salina,tampão, mas ele também pode, por exemplo, compreender omeio de cultura de estreptococos.

Os transportadores ou veículos ou excipientesfarmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis são bemconhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, umtransportador ou um veiculo ou um excipientefarmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode seruma solução de NaCl 0,9 % (por exemplo, salina) ou umtampão fosfato. Outro transportador ou veiculo ouexcipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitávelque pode ser usado para métodos desta invenção incluempoli- (L-glutamato) ou polivinilpirrolidona, mas não sãolimitados a eles. 0 transportador ou veiculo ou excipientesfarmaceuticamente ou veterinariamente aceitável podem ser .qualquer composto ou combinação de compostos que facilitema administração do vetor (ou proteína expressa in vítropelo vetor da invenção); vantajosamente, o transportador, oveículo ou excipiente pode facilitar a transfecção e/oumelhorar a preservação do vetor (ou proteína). As doses evolumes de doses são discutidos neste documento nadescrição geral e também podem ser determinados pelosversados na técnica a partir desta descrição e invençãolida em conjunto com o conhecimento na técnica, semqualquer experimentação indevida.

Os lipídios catiônicos que contêm um sal de amônioquaternário os quais são vantajosamente, mas nãoexclusivamente adequados para plasmídeos, sãovantajosamente os que têm a seguinte fórmula:<formula>formula see original document page 74</formula>

na qual R1 é um radical alifático de cadeia linear saturadaou insaturada, que tem um 12 a 18 átomos de carbono, R2 éoutro radical alifático que contém 2 ou 3 átomos de carbonoe X é um grupo amina ou hidroxila, por exemplo, DMRIE. Emoutra modalidade o lipidio catiônico pode estar associadocom um lipidio neutro, por exemplo, DOPE.

Dentre estes lipidios catiônicos, a preferência é dadapara DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-amônio propano; W096/34109),vantajosamente associado com um lipidio neutro,vantajosamente DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina; BehrJ. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389, paraformar DMRIE-DOPE.

Vantajosamente, a mistura de plasmideos com oadjuvante é formada extemporaneamente e vantajosamente,contemporaneamente com a administração da preparação oupouco antes da administração da preparação; por exemplo,pouco antes ou antes, da administração, a misturaplasmídeo-adjuvante é formada, vantajosamente a fim de dartempo suficiente antes da administração para a misturaformar um complexo, por exemplo, entre cerca de 10 e cercade 60 minutos antes da administração, tal comoaproximadamente 30 minutos antes da administração.

Quando DOPE está presente, a proporção molar deDMRIE:DOPE é vantajosamente de cerca de 95: cerca de 5 acerca de 5: cerca de 95, mais vantajosamente cerca de 1:cerca de 1, por exemplo, 1:1.

A proporção em peso do plasmideo:adjuvante de DMRIE ouDMRIE-DOPE pode estar entre cerca de 50: cerca de 1 e cercade 1: cerca de 10, tal como cerca de 10: cerca de 1 e cercade 1: cerca de 5, e vantajosamente cerca de 1: cerca de 1 ecerca de 1: cerca de 2, por exemplo, 1:1 e 1:2.

As composições imunogênicas e vacinas de acordo com ainvenção podem compreender ou consistir essencialmente emum ou mais adjuvantes. Adjuvantes adequados para uso naprática da presente invenção são (1) polímeros de acrílicoou ácido metacrílico, anidrido maléico e polímeros dederivados de alquenila, (2) seqüências imunoestimuladoras(ISS), tais como seqüências de oligodesoxirribonucleotídeosque têm uma ou mais unidades CpG não-metiladas (Klinman etal., Proc. Natl. Acad. Sci., EUA, 1996, 93, 2879-2883;W098/16247), (3) uma emulsão óleo em água, tal como aemulsão SPT descrita na página 147 do "Vaccine Design, TheSubunit and Adjuvant Approach" publicado por M. Powell, M.Newman, Plenum Press 1995, e a emulsão MF59 descrita napágina 183 do mesmo trabalho, (4) lipidios catiônicos quecontêm um sal de amônio quaternário, por exemplo, DDA (5)citocinas, (6) hidróxido de alumínio ou fosfato dealumínio, (7) saponina ou (8) outros adjuvantes discutidosem qualquer documento citado e incorporado por referênciana presente invenção, ou (9) quaisquer de suas combinaçãoou misturas.

A emulsão óleo em água (3), que é especialmenteapropriada para vetores virais, pode ser baseada em: óleode parafina líquida leve (do tipo da Farmacopéia Européia) ,óleo de isoprenóide, tal como esqualano, esqualeno, óleoresultante da oligomerização de alcenos, por exemploisobuteno ou deceno, ésteres de ácidos ou alcoóis que têmum grupo alquila de cadeia linear, tais como óleosvegetais, oleato de etila, propilenoglicol,

di(caprilato/caprato), tri(caprilato/caprato) de glicerol edioleato de propilenoglicol, ou ésteres ramificados dealcoóis ou ácidos graxos, especialmente ésteres de ácidoisoesteárico.

0 óleo é usado em combinação com emulsificantes paraformar uma emulsão. Os emulsificantes podem ser tensoativosnão-iônicos, tais como: ésteres, por um lado, de sorbitano,manida (por exemplo, oleato de anidromanitol) , glicerol,poliglicerol ou propilenoglicol e por outro lado, de ácidosoléico, isosteárico, ricinoleico ou hidroxiesteárico, osditos ésteres sendo opcionalmente etoxilados, ou blocos decopolímero polioxipropileno-polioxietileno, tais comoPluronic, p. ex., L121. Dentre os polímeros adjuvantes tipo(1), a preferência é dada para polímeros de ácido acrílicode metacrílico reticulados, especialmente reticulados cométeres de polialquenila de açúcares ou polialcoóis. Estescompostos são conhecidos pelo nome de carbômeros(Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, Junho de 1996). Um versado natécnica também pode se referir à patente Americana No.2.909.462, a qual fornece tais polímeros acrílicos decadeia reticulados por um composto poliidroxila que tempelo menos três grupos hidroxila, preferivelmente não maisdo que oito de tais grupos, os átomos de hidrogênio de pelomenos três grupos hidroxila sendo substituídos por radicaisalifáticos insaturados que têm pelo menos dois átomos decarbono. Os radicais preferidos são os que contêm 2 a 4átomos de carbono, por exemplo, vinilas, alilas e outrosgrupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturadostambém podem conter outros substituintes, tais como metila.

Os produtos vendidos sob o nome Carbopol (BF Goodrich,Ohio, EUA) são especialmente adequados. Eles sãoreticulados pela alil sacarose ou por alil pentaeritritol.Dentre eles, referência é feita para Carbopol 974P, 934P e97IP. Quanto aos copolimcros de anidrido maléico -derivadosde alquenila, a preferência é dada ao EMA (Monsanto) , osquais são copolimeros de etileno-anidrido maléicoreticulados ou de cadeia linear e eles são, por exemplo,reticulados por éter de divinila. Referência também é feitapara J. Fields et al.r Nature 186: 778-780, 4 de junho de1960.

Com relação à estrutura, os polímeros acrílicos oumetacrílicos e EMA são formados preferivelmente porunidades básicas que têm a seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 78</formula>

na qual:

- Ri e R2, os quais podem ser iguais ou diferentes,representam H ou CH3

- χ = 0 ou 1, preferivelmente χ = 1

- y = 1 ou 2, com χ + y = 2.

Para EMA, x=0ey=2e para carbômeros χ = y = 1.

Estes polímeros são solúveis em água ou solução salinafisiológica (20 g/l NaCl) e o pH pode ser ajustado de 7,3 a7,4, por exemplo, por soda (NaOH), para fornecer a soluçãode adjuvante na qual a expressão do(s) vetor(es) pode serincorporada. A concentração de polímero na composição finalda vacina pode variar entre 0,01 e 1,5 % p/v,vantajosamente 0,05 a 1 % p/v e preferivelmente 0,1 a 0,4 %p/v.

A citocina ou citocinas (5) podem estar na forma deproteína na composição ou vacina imunogênica, ou podem serco-expressas no hospedeiro com imunógeno ou imunógenos ouseus epítopo(s). A preferência é dada para co-expressão dacitocina ou citocinas, quer pelo mesmo vetor que expressa oimunógeno ou por imunógenos ou seus epítopo(s), ou por umvetor separado para isto.

A invenção abrange preparar tais composições decombinação; por exemplo, por misturar os componentesativos, vantajosamente em conjunto e com um adjuvante,transportador, citocina, e/ou diluente.

Citocinas que podem ser usadas na presente invençãoincluem, mas não são limitadas a, fator de estimulação decolônia por granulócito (G-CSF), fator de estimulação decolônia por granulócito/macrófago (GM-CSF), interferon α(IFN α), interferon β (IFN β), interferon γ, (IFN γ),interleucina-1 α (IL-I α) , interleucina -1 β (IL-I β) ,interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6),interleucina-7 (IL-7), intcrlcucina-8 (IL-8), interleucina™9 (IL-9), interleucina-10 (IL-IO), interleucina-11 (IL-I1), interleucina-12 (IL-12), fator de necrose tumoral α(TNF a), fator de necrose tumoral β (TNF β), e fator decrescimento transformante β (TGF β). É conhecido quecitocinas podem ser co-administradas e/ou administradasseqüencialmente com a composição imunogênica ou de vacinada presente invenção. Assim, por exemplo, a vacina dapresente invenção também pode conter uma molécula exógenade ácido nucléico que expressa in vivo uma citocinaadequada, por exemplo, uma citocina combinada a estehospedeiro a ser vacinado ou no qual uma respostaimunológica deve ser produzida (por exemplo, uma citocinacanina para preparações a serem administradas a cães).

Vantajosamente, as composições farmacêuticas e/outerapêuticas e/ou as formulações de acordo com a invençãocompreendem ou consistem essencialmente em uma quantidadeeficaz para desencadear uma resposta terapêutica de um ou mais vetores de expressão e/ou polipeptidios, conformediscutido neste documento; e, uma quantidade eficaz podeser determinada a partir desta descrição, incluindo osdocumentos por meio deste incorporados, e o conhecimento datécnica, sem experimentação indevida.O vetor viral recombinante das composiçõesimunogênicas e o vetor viral rccombinante das vacinas, deacordo com a invenção, podem ser secos por congelamentovantajosamente com um estabilizador. Secagem porcongelamento pode ser feita segundo os procedimentos usuaisde secagem por congelamento bem conhecidos. Osestabilizadores veterinários ou aceitáveisfarmaceuticamente podem ser carboidratos (por exemplo,sorbitol, manitol, lactose, sacarose, glicose, dextran,trealose), glutamato de sódio (Tsvetkov T et al.,Cryobiology 1983, 20(3): 318-23; Israeli E et al.,Cryobiology 1993, 30(5): 519-23), proteínas, tais comopeptona, albumina, lactoalbumina ou caseína, agentes quecontêm proteína, tais como leite desnatado (Mills C K etal., Cryobiology 1988, 25(2): 148-52; Wolff E et al.,Cryobiology 1990, 27(5): 569-75), e tampões (por exemplo,tampão fosfato, tampão fosfato de metal alcalino). Umadjuvante pode ser usado para fazer as preparações secaspor congelamento.

Além disso, a presente invenção se refere ao uso depelo menos um polipeptídio que tem uma seqüência deaminoácido conforme mostrada nas SEQ ID NOS: 18, 20, 22,24, 26, 48, 50 e 52, ou seus análogos ou seus fragmentos,para o tratamento e/ou vacinação de mamíferos contrainfecção estreptocócica, especialmente das espécieseqüinos, de caninos e humana. Em uma modalidade, es Lesfragmentos são selecionados do grupo que consiste nasseqüências SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e 58, ouseus análogos. Uma modalidade particular diz respeito aouso de pelo menos um polipeptidio selecionado do grupo queconsiste nas seqüências SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 32,34, 36, 38, 40, 48, 50, 52, 54, 56 e 58, ou seus análogos,para o tratamento e/ou vacinação de eqüinos contragarrotilho. Uma modalidade preferida diz respeito ao uso depelo menos um peptideo selecionado do grupo que consistenas seqüências SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e 58,ou seus análogos, para o tratamento e/ou vacinação deeqüinos contra garrotilho.

Uma modalidade adicional diz respeito ao uso de pelomenos um polipeptidio que tem uma seqüência de aminoácidosconforme mostrada em SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50e 52, ou seus análogos ou seus fragmentos, para apreparação de uma vacina de subunidade que protege eqüinoscontra infecção por Streptococcus equi. Esta modalidadeadicional diz respeito preferivelmente ao uso de pelo menosum polipeptidio que tem uma seqüência de aminoácidosconforme mostrada em SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56e 58, ou seus análogos, para a preparação de uma vacina desubunidade que protege eqüinos contra infecção porStreptococcus equi.

Outra modalidade adicional diz respeito ao uso de pelomenos um vetor recombinante e de pelo menos umpolinucleotideo inserido nele que codifica um polipeptidioque tem uma seqüência de aminoácidos conforme mostrada nasSEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52, ou um seuanálogo ou seus fragmento, e o dito vetor é capaz deexpressar in vivo este polipeptidio em um mamíferosuscetível à infecção estreptocócica, para a preparação deuma vacina recombinante que protege o eqüino contrainfecção por Streptococcus equi.

Uma modalidade adicional diz respeito preferivelmenteao uso de pelo menos um vetor recombinante e de pelo menos um polinucleotideo inserido nesse, em que o ditopolipeptidio tem uma seqüência de nucleotídeo conformemostrada nas SEQ ID 17, 19, 21, 23, 25, 31, 33, 35, 37, 39,47, 49, 51, 53, 55 e 57, ou seus análogos, e o dito vetor écapaz de expressar in vivo o polipeptidio codificado pelodito polinucleotideo em um mamífero suscetível à infecçãopor Streptococcus equi.

Em particular, combinações de polipeptídios a seremusados para o tratamento e/ou vacinação de eqüinos contragarrotilho são uma combinação de pelo menos um polipeptidioselecionado de um primeiro grupo de polipeptidios queconsistem em SEQ ID NOS: 18,20,24,26,32,34,36,38, 40, 48, 50, 52, 54, 56 e 58, ou seus análogos ou suascombinações, e pelo menos outro imunógeno de Streptococcusequi, o qual não está presente neste primeiro grupo,notavelmente pelo menos um imunógeno selecionado de umsegundo grupo de polipeptidios que consistem na proteínaFNZ, proteína EAG, proteína SFS, proteína SEC, fragmento deSFSCl, fragmento de FNZN, fragmento de SEC2.16, fragmento de SEC 1.18, fragmento de SclCl (WO-A-2004/032957) e SEQ IDNOS: 28, 30 ou seus análogos ou seus fragmentos, ou suascombinações. Em combinações preferidas de polipeptidios,este primeiro grupo consiste em SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38,40, 54, 56 e 58, ou seus análogos ou suas combinações.Adicionalmente, a presente invenção também diz respeito aouso destas combinações de peptídeos para a preparação devacinas de subunidades que protegem eqüinos contra infecçãopor Streptococcus equi. Nestas modalidades, o uso dospolipeptidios pode ser substituído pelo uso de vetores de expressão recombinantes de acordo com a presente invenção,os quais compreendem pelo menos um polinucleotídeo quecodifica os ditos polipeptidios. Em particular, pelo menosum vetor de expressão recombinante que compreende pelomenos um polinucleotídeo que codifica pelo menos umpolipeptídio selecionado de um primeiro grupo depolipeptidios que consistem em SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24,26, 32, 34, 36, 38, 40, 48, 50, 52, 54, 56 e 58, ou seusanálogos, e pelo menos um polinucleotideo que codifica pelomenos outro imunógeno de Streptococcus equi, o qual nãoestá presente neste primeiro grupo, notavelmente pelo menosum imunógeno selecionado de um segundo grupo depolipeptidios que consistem na proteína FNZ, proteína EAG,proteína SFS, proteína SEC, fragmento de SFSC 1, fragmentode FNZN, fragmento de SEC2.16, fragmento de SEC 1.18,fragmento de SclCl (W0-A-2004/032957) e ID NOS: 28, 30 ouseus análogos ou seus fragmentos, ou suas combinações sãousados para o tratamento e/ou vacinação de eqüinos contragarrotilho. Em uma modalidade preferida, este primeirogrupo consiste em SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e58, ou seus análogos ou suas combinações. Adicionalmente, apresente invenção também diz respeito ao uso desses vetoresde expressão recombinantes para a produção de vacinasrecombinantes que protegem eqüinos contra a infecção porStreptococcus equi.

Em uma modalidade particular as combinações dospolipeptidios a serem usados para o tratamento e/ouvacinação de eqüinos contra garrotilho são combinação depolipeptidios SEQ ID NOS: 52, 48, 22 e 26, ou seusanálogos, ou seus fragmentos. Em uma modalidade maispreferida, as combinaçoes de polipeptidios a serem usadospara o tratamento de/ou vacinação de eqüinos contragarrotilho são uma combinação de polipeptidios SEQ ID NOS:58, 54, 36 e 40, ou seus análogos.

Em uma modalidade particular, as combinações depolipeptidios a serem usadas para o tratamento e/ouvacinação de eqüinos contra a doença do garrotilho sãocombinações de polipeptidios de SEQ ID NOS: 52, 48, 22, 26e 50, ou seus análogos ou seus fragmentos. Em umamodalidade mais preferida, as combinações de polipeptidiosa serem usadas para o tratamento e/ou vacinação de eqüinoscontra a doença do garrotilho são combinações depolipeptidios de SEQ ID NOS: 58, 54, 36, 40 e 56, ou seusanálogos. Em uma modalidade particular, as combinações depolipeptidios a serem usadas para o tratamento e/ouvacinação de eqüinos contra a doença do garrotilho sãocombinações de polipeptidios de SEQ ID NOS 52, 48, 22, 26 e20, ou seus análogos ou seus fragmentos. Em uma modalidademais preferida, as combinações de polipeptidios a seremusadas para o tratamento e/ou vacinação de eqüinos contra adoença do garrotilho são combinações de polipeptidios deSEQ ID NOS: 58, 54, 36, 40 e 34, ou seus análogos.

Em uma modalidade particular, as combinações depolipeptídios a serem usadas para o tratamento e/ouvacinaçao de eqüinos contra a doença do yârrotilno saocombinações de polipeptídios de SEQ ID NOS: 52, 48, 22, 26e 18, ou seus análogos ou seus fragmentos. Em umamodalidade mais preferida, as combinações de polipeptídiosa serem usadas para o tratamento e/ou vacinação de eqüinoscontra a doença do garrotilho são combinações depolipeptídios de SEQ ID NOS: 58, 54, 36, 40 e 32, ou seusanálogos.

Posteriormente, a presente invenção refere-se amétodos para imunizar contra ou prevenir infecçãoestreptocócica em mamíferos, preferivelmente em espécies deeqüinos, caninos e humanos. De acordo com esses métodos,(1) uma composição ou vacina de subunidade imunogênica dapresente invenção ou (2) uma composição ou vacinaimunogênica recombinante da presente invenção ou suascombinações, são administradas. É claro, modalidades dapresente invenção podem ser empregadas com outras vacinasou composições imunogênicas que não são da invenção, porexemplo, processos de prime-boost, tais como onde umavacina ou composição imunogênica da invenção é administradaprimeiro e uma vacina ou composição imunogênica diferente éadministrada depois ou vice-versa. Processos de prime-boostparticulares podem ser aquele em que uma subunidade devacina ou composição imunogênica é administrada primeiro euma vacina ou composição iiriunogenica recombinante dainvenção é administrada depois ou vice-versa.

A administração pode ser feita notadamente por injeçãointramuscular (IM), intradérmica (ID), subcutânea (SC) outransdérmica ou por via intranasal, intratraquealadministração oral ou através das orelhas ou do lábio. Acomposição imunogênica ou vacina de acordo com a invenção éadministrada por uma seringa, uma seringa com microagulha(isto é, BD™ Intradermal Delivery System of Becton,Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA),equipamentos sem agulhas (como por exemplo, Pigjet, Avijet,Dermojet ou Biojector (Bioject, Oregon, USA), veja US-A-2006/0034867) ou um spray. A administração épreferivelmente feita por injeção IM com uma seringa ou porinjeção transdérmica com um equipamento sem agulha ou comuma seringa com microagulha (isto é, BD™ IntradermalDelivery System), ou por administração intranasal ou oralde uma vacina com um spray, isto é, uma nebulização liquidade uma vacina da invenção, ou por administração oral ounasal de um pó micronizado de uma vacina liofilizada deacordo com a invenção.

A quantidade de composições imunogênicas ou vacinaspode ser determinada e otimizada para pessoa versada natécnica, sem experimentação exaustiva a partir dessadescricao e do conhecimento da tenica. Geralmente, umanimal (incluindo um humano) pode ser tratado comaproximadamente 10^4-10^9 CFUs, vantajosamenteaproximadamente 10^5-10^8 CFUs e mais vantajosamente comaproximadamente 10^6-10^8 CFUs em uma unidade de dosagemúnica de composições ou vacinas imunogênicas viraisrecombinantes da presente invenção; aproximadamente 10 ng-1mg, vantajosamente aproximadamente 100ng a 500pg e maisvantajosamente aproximadamente ^g a 250μg por tipo deplasmideo em uma unidade de dosagem única de composições ouvacinas imunogênicas de DNA da presente invenção;aproximadamente 5μg a lmg, vantajosamente aproximadamente50μg a 500μg e mais vantajosamente aproximadamente 100 μg a200μg em uma unidade de dosagem única de composições ouvacinas imunogênicas da presente invenção. No caso decomposições terapêuticas e/ou farmacêuticas baseadas em umvetor de plasmideo, uma dose pode compreender, consistiressencialmente ou consistir de, em termos gerais, cerca de1 μg a cerca de 2000 μg, vantajosamente cerca de 50 μg acerca de 1000 μg e mais vantajosamente entre cerca de 100μg a cerca de 800 μg de plasmideo que expressa o antigeno,epitopo, imunógeno, peptideo ou polipeptidio de interesse.Quando as composições terapêuticas e/ou farmacêuticasbaseadas em um vetor de plasmídeo é administrada poreletroporacao, a dose de plasmideo e administrada porcerca de 0,1 μς e 1 mg, vantajosamente entre cerca de 1yg e 100 yg, vantajosamente entre cerca de 2 yg e 50 yg. Osvolumes da dose podem estar entre cerca de 0,1 e cerca de 2mL, vantajosamente entre cerca de 0,2 a 1 mL. Essas doses evolume de doses são adequadas para o tratamento dasespécies-alvo de mamíferos. 0 volume de uma unidade dedosagem única por seringa pode estar entre 0,2 mL e cercade 5,0 mL e vantajosamente entre cerca de 0,5 mL e cerca de2,0 mL e mais vantajosamente cerca de 1,0 mL. 0 volume deuma unidade de dosagem única por um equipamento sem agulhapode estar entre cerca de 0,1 mL e cerca de 1,0 mL evantajosamente entre cerca de 0,2 mL e cerca de 0,5 mL. 0volume de uma unidade de dosagem única por spray líquidopode estar entre cerca de 2,0 mL e cerca de 10,0 mL evantajosamente cerca de 5,0 mL (para spray em pó, asquantidades administradas são correspondentes aos volumesequivalentes).

Em um método particular, potros, ou seja cavalos com 2a 6 meses de idade e preferivelmente 3 a 4 meses de idade,são vacinados com vacinas de subunidade da presenteinvenção, suplementadas com CTB e/ou CTA e/ou Carbopol®,através da via intranasal ou oral. Em outro métodoparticular, potros são vacinados com vacinas viraisrecombinatos da presente invencao, suplementados ou naocom Carbopol®, através da via oral com um spray enebulização liquida. Preferivelmente, os vetores viraisdessas vacinas virais recombinantes são EHV-4 ou EHV-2, ouEHV-I.

Em outro método particular, potros são vacinados comvacinas virais recombinantes da presente invenção atravésdos lábios com uma seringa. Preferivelmente, os vetoresvirais dessas vacinas virais recombinantes são EHV-4 ouEHV-2, ou EHV-I.

Preferivelmente, para a vacinação de cavalos e éguas,duas administrações de vacinas de subunidade da presenteinvenção, suplementadas com Carbopol® e/ou CpG e/ou emulsãosão feitas por injeção IM com uma seringa. Administraçõesde reforço podem ser injetadas a cada 6 meses ouanualmente. Para éguas prenhas, uma administração dereforço pode ser injetada de 2 a 4 semanas antes da dataprovável do parto.

Preferivelmente para a vacinação de cavalos e éguas,duas administrações das vacinas de subunidade da presenteinvenção, auxiliadas com Carbopol® e/ou CpG, e ou emulsãosão feitas por injeção IM com uma seringa. Administraçõesde reforço podem ser injetadas a cada 6 meses ouanualmente. Para éguas grávidas, uma administração derefroco pode ser injetada de 2 a 4 semanas antes da dataesperada para dar cria.

Os polipeptidios da invenção e seus fragmentos tambémpodem ser usados na terapia.

Os polipeptidios e fragmentos também podem ser usadoscomo reagentes em reações anticorpo-antigeno.

Concordantemente, outro aspecto da invenção é, desta forma,um método de diagnóstico e/ou kit para detectar infecçãopor bactérias estreptococos. Kits, por exemplo ELISA, podemincluir pelo menos um polipeptidio ou fragmento de acordocom a invenção (por exemplo, pelo menos um polipeptidioidentificado pela seqüência aqui ou um fragmento seuconforme aqui discutido).

Anticorpos contra os polipeptidios daqui ou fragmentos(por exemplo, polipeptidios identificados pela seqüênciaaqui ou seus fragmentos conforme aqui discutidos) podem serusados como reagentes de diagnóstico ou na imunizaçãopassiva ou na vacinação ou na terapia. As quantidades deanticorpo administradas na imunização passiva podem ser asmesmas ou análogas às quantidades usadas na técnica, talcomo aquelas do conhecimento da técnica, o artesão datécnica podendo praticar imunização passiva semexperimentação demasiada.As proteínas codificadas pelo novo vírus da presenteinvenção, ou seus f ragmentos, podem ser usadas paraproduzir anticorpos, tanto policlonais quanto monoclonais.Se os anticorpos policlonais forem desejados, um mamíferoselecionado (por exemplo, camundongo, coelho, cabra,cavalo, etc.) é imunizado com um antígeno da presenteinvenção, ou seu fragmento, ou um antígeno modificado. Sorodo animal imunizado é coletado e tratado de acordo com osprocedimentos conhecidos. Ver, por exemplo, Jurgens et al.(1985) J. Chrom. 348: 363-370. Se soro contendo anticorpospoliclonais for usado, os anticorpos policlonais podem serpurificados por cromatografia de imunoafinidade, usandoprocedimentos conhecidos.

Outro aspecto da invenção é uma preparação deanticorpo compreendendo um anticorpo específico para umpolipeptídio ou um fragmento de acordo com a invenção emétodos de diagnóstico usando os mesmos. Em relação a umanticorpo específico para um polipeptídio, se entende que oanticorpo se liga preferivelmente ao polipeptídio, por exemplo, o anticorpo se liga ao polipeptídio e não a outrospolipeptídios ou tem uma especificidade pelo polipeptídioque é aceitavelmente particular para o polipeptídio, deforma que o anticorpo possa ser usado para isolar opolipeptídio de uma amostra ou detectar a sua presença numaamostra com não mais do que 5% de falsos positivos, usandotécnicas conhecidas na arte ou discutidas em documentosaqui citados, incluindo Sambrook, infra.

Anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais.

Se anticorpos policlonais forem desejados, um animalselecionado (por exemplo, camundongo, coelho, cabra,cavalo, etc.) é imunizado com um polipeptidio ou umfragmento. Soro do animal imunizado é coletado e tratado deacordo com procedimentos conhecidos e possivelmentepurificado. Ver, por exemplo, Jurgens et al., J. Chrom.,1985, 348: 363 - 370.

Anticorpos monoclonais para as proteínas e para osseus fragmentos também podem ser prontamente produzidos poruma pessoa versada na técnica. A metodologia geral parafazer anticorpos monoclonais pelo uso da tecnologia dohibridoma é bem conhecida. Linhagens celulares imortaisprodutodas de anticorpo podem ser criadas por fusãocelular, e também por outras técnicas tais comotansformação direta de linfócitos B com DNA oncogênico, outransfecção com vírus Epstein-Barr. Ver, por exemplo, M.Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling etal., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981);Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980); ver tambémPatentes Americanas Nos. 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783;4.444.887; 4.452.570; 4.466.917; 4.472.500, 4.491.632; e4.4 93.8 90. Os painéis de anticorpos monoclonais produzidoscontra a proteína desejada ou seu fragento podem servarridos para várias propriedades: isto é, para isotipo,epítopo, afinidade, etc. Anticorpos monoclonais são úteisna purificação, usando técnicas de imunoafinidade dosantígenos individuais para os quais eles são direcionadoscontra. Tanto anticorpos policlonais quanto monoclonaispodem ser usados para imunização passiva ou podem sercombinados com preparações de vacina de subunidade paraintensificar a resposta imune. Anticorpos policlonais emonoclonais também são úteis para propósitos dediagnóstico.

Uma modalidade da invenção é um método paradesencadear uma resposta imune contra o antígeno, epítopo,imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse numanimal, compreendendo a administração de uma formulaçãopara distribuição e expressão de uma vacina recombinantenuma quantidade eficaz para desencadear uma resposta imune.Ainda outra modalidade da invenção é um método de induçãode uma resposta imunológica ou protetora num animal,compreendendo a administração ao animal de uma quantidadeeficaz de uma formulação para distribuição e expressão deum antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídiode interesse, em que a formulação compreende uma vacinarecombinante e um carreador, veiculo ou excipienteveterinariamente aceitável.

A invenção se refere a um método para desencadear,induzir ou estimular a resposta imune de um animal,vantajosamente de um animal ou de um vertebrado.

Outra modalidade da invenção é um kit para efetuar ummétodo de indução de uma resposta imunológica ou protetoracontra um antigeno, epitopo, imunógeno, peptideo oupolipeptidio de interesse num animal compreendendo umavacina recombinante e instruções para efetuar o método dedistribuição numa quantidade eficaz para desencadear umaresposta imune no animal.

A invenção será agora adicionalmente descrita a titulodos seguintes exemplos não-limitativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Estudo ELISA de polipeptidios de Streptococcusequi

As respostas de anticorpo IgG direcionadas contra asproteínas da superfície celular de Streptococcus equi emsoros retirados de pôneis inoculados intranasalmente com 4doses de Streptococcus equi cepa 4047 foram determinadaspor ELISA. Essas proteínas de Streptococcus equi foramobtidas por expressão in vitro em Eseheriehia eoli. Asrespostas do anticorpo nos soros de seis pôneis quereceberam as doses mais elevadas de 3x10^ e 3x10^ cfu foramcalculadas e comparadas com aquelas dos pôneis inoculadoscom 3000 e 30 cfu de Streptococcus equi 4047. Pôneis quereceberam as doses mais elevadas desenvolveram garrotilho.Aqueles que receberam as doses menores permaneceramsaudáveis durante o estudo. Com base nos resultados desseestudo, polipeptidios de Streptococcus equi foramselecionados para expressão em Eseherichia eoli e parateste de eficácia em camundongos e pôneis.

Exemplo 2: Expressão de polipeptidios recoxnbinantes deStreptococcus equi em Escheríchia eoli

Polinucleotideos codificando fragmentos de Se50,Sel459 e Se358 foram produzidos usando Vent DNA polimerase (New England Biolabs® Inc.) nas condições como recomendadaspelos fabricantes com uma etapa de desnaturação de 5minutos seguida por 35 ciclos de anelamento por 30 segundosa 50-55°C, 1 minuto de extensão a 72°C e 30 segundos dedesnaturação a 95°C. Os produtos foram finalizados com umaextensão de 4 minutos a 72°C. 0 modelo em cada caso foi oDNA cromossômico de Streptocoeeus equi cepa 4047. Osfragmentos de Se50, Sel459 e Se358 são aqueles designadoscomo SEQ ID NOS: 32, 34 e 40, respectivamente.

Polinucleotideos que codificam fragmentos de Se528 eSe595 foram produzidos usando pfu polimerase nas mesmascondxçoes acima exceto o tempo de extensão estendido paradois minutos a 72°C. Os fragmentos de Se528 e Se595 sãoaqueles designados como SEQ ID NOS: 38 e 36,respectivamente.

Tabela 1: Iniciadores usados para clonar e subunidades deseqüência recombinante

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* Se358 recombinante termina no códon de parada real paraSe358 já que o sítio do iniciador ASW50 está localizado àjusante do gene.

Todos os produtos de PCR foram purificados usando okit de purificação Qiaquick PCR (Qiagen) com um volume deeluição de 32yL, então digeridos com a adição de tampão deEcoRI (3,5pL) (New England Biolabs® Inc.), BamHI (0,75μΙ>) eEcoRI (0,75yL) por 2 horas a 37°C. 1 μg de plasmídeo pGEX-3X (GE Healthcare) também foi digerido com EcoRI e BamHIcomo descrito acima. Os plasmídeos pGEX-3X têm sítios declonagem múltipla, um promotor tac, gene de glutationa S-transferase (GST) e códons de parada em todas as trêsfases, para a produção de proteínas de fusão de GST e seuisolamento e purificação.

Todos os produtos de digestão foram corridos em gel deagarose TAE 0,7%, o produto de restrição desejado cortado epurificado usando o kit de extração Qiaquick gel (Qiagen)100com uma eluição final de 35pL.

As reações de ligaçao foram inzciadas usando 16,5μ1ι deproduto de PCR purificado digerido e Ιμΐϋ de plasmideo pGEX-3X com 2μL de tampão de ligase e 0,5μΙι de ligase, eincubadas durante a noite em temperatura ambiente (rtp).

As reações de ligação foram transformadas em E. colicepa DH10B e plaqueadas sobre placas de L-ágarsuplementadas com ampicilina 50 μg/mL e incubadas durante anoite a 37°C. Os transformantes foram testados quanto àpresença do inserto por PCR de colônia. Uma única colôniafoi ressuspensa em 4μί de água e 2μΙ< disso foramadicionados a uma reação de PCR com Taq DNA polimerasecontendo os iniciadores de clonagem apropriados para opolinucleotideo de interesse e 35 ciclos de extensão foram realizados conforme descrito acima (1 minuto para Se50,Sel459 e Se358 e 2 minutos para Se595 e Se528). A presençado inserto desejado foi confirmada pela corrida da reaçãode PCR sobre géis de TAE agarose 0,7%.

Os plasmideos de cada um dos clones foram preparados esequenciados usando iniciadores 5' e 3' pGEX-3X PCR paratodos os clones (Tabela 1) . Devido a seu tamanho, Se595também foi sequenciado usando os iniciadores adicionaislistados acima (Tabela 1). Todos os polinucleotideosclonados foram confirmados ter a mesma seqüência como aseqüência montada do genoma de Streptococcus equi cepa 4 04 7(http://www.sanger.ac.uk/Projects/S equi/).

Clones de Sel459, Se595, Se528, Se50 e Se358 foraminduzidos para expressão usando o seguinte protocolo. Umaúnica colônia foi inoculada em 50 mL de meio de cultura 2 χYT contendo ampicilina 50pg/mL e foi cultivada durante anoite com agitação a 220 rpm a 37°C. Essa cultura foi entãoadicionada a 500 mL de YT 2 χ pré-aquecido (37°C) e pré-gaseificado e incubada por 1 hora a 37°C. Para todas asculturas, após 1 hora, 200 pL foram removidos e as célulasforam coletadas para análise (essa sendo a amostra de pré-indução), ITPG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranosideo) foiadicionado para uma concentração final de 0,1 mM e umaamostra de 100 pL foi removida para análise, após o que ascélulas foram coletadas por centrifugação e armazenadas a -70°C. Todas as amostras foram analisadas usando SDS-PAGE10% .

Para Sel459, Se595, Se528, Se50 e Se358, os péletesforam ressuspensos em 20 mL de PBS gelado (Oxoid Limited,catálogo # BR0014G), PMSF (Fluoreto de Fenilmetil sulfonil)foi adicionado para uma concentração final de 0,1 mM e ascélulas foram lisadas por sonicação sobre gelo com pulsosde 6 χ 10 segundos com 10 segundos de repouso entre cadapulso. Triton X-100 0,1% (v/v) foi adicionado e as célulasinsolúveis e intactas foram removidas por centrifugação(11.000g, 5 min 4°C). Amostras do lisado bacteriano soluvele do material insolúvel foram analisadas por SDS-PAGE. DTT(ditiotreitol; reagente de Cleland) (5 mM) foi adicionado e1,3 mL de glutationa sefarose 4B foram adicionados (igual a1 mL de esferas, essas foram pré-lavadas três vezes com 20mL de PBS). A mistura foi incubada em temperatura ambientepor 1 hora e então as esferas foram coletadas porcentrifugação (800 g, 2 min, rtp) e lavadas três vezes com50 mL de PBST gelado (PBS com Triton X-IOO 0,1% v/v).Amostras de cada lavagem (lavagens 1 a 3) foram retiradaspara análise por SDS-PAGE como foi a amostra de proteína defusão acoplada às esferas. Todas as amostras foramanalisadas usando SDS-PAGE 10%.

A remoção do veículo de GST foi feita para todas asproteínas de fusão por clivagem com protease.

Para Sel459, Se595, Se528, Se50 e Se358, as reações declivagem foram realizadas com a proteína de fusão acopladaa esferas de glutationa sefarose. As esferas foramequilibradas primeiro uma vez com 20 mL de tampão delavagem (Tris-HCl, 50 mM, pH 7.5, NaCl, 150 mM) e depoisduas vezes com 20 mL tampão de clivagem (tampão de lavagemcom CaCl2, 1,0 mM) e finalmente ressuspensas em 1 mL detampão de clivagem. Fator Xa (New England Biolabs® Inc.)(50 unidades) foi adicionado e incubado em um misturadorrotatório por 16 horas cm temperatura ambiente. A proteínaliberada foi recuperada pela peletização das esferas deglutationa (800 g, 2 min, rtp) e retenção do sobrenadante.

As esferas foram lavadas duas vezes com 1 mL de tampão delavagem e o sobrenadante foi retido a cada vez. Alíquotasde cada sobrenadante e as esferas de glutationaremanescentes foram analisadas por SDS-PAGE. As esferasforam lavadas três vezes com tampão de lavagem 2 (Tris-HCL,50 mM, pH 8,0) e eluídas com 3 mL de tampão de lavagem 2contendo glutationa reduzida 0,5 mM por 2 min emtemperatura ambiente seguido pela peletização das esferas(800 g, 2 min, rtp) e retenção do sobrenadante. Essaeluição foi repetida duas vezes e a pureza de cada fraçãofoi analisada por SDS-PAGE.

Todas as proteínas foram dialisadas duas vezes em 5litros de tampão fosfato de sódio 20 mM pH 7.4 a 4°Cdurante a noite.

Após a diálise, qualquer material insolúvel foiremovido por centrifugação (10.000 g, 2 min, 4°C) e entãofoi armazenada a -70°C.

Exemplo 3: Proteção em camundongos depois da administraçãoda vacina de subunidade e estímulo com Streptococcus equi

O objetivo deste estudo foi determinar se a vacinaçãocom a vacina de subunidade de Streptococcus equi protegeucamundongos do estimulo com Streptococcus equi intranasalsubseqüente.

Cinco vacinas de subunidade de Streptococcus equiforam usadas, Se595, Se358, Sel459, Se50 e Se528. Todasessas vacinas usaram as proteínas de Streptococcus equiobtidas no Exemplo 2. As proteínas de Streptoeoceus equirecombinantes Se595, Se358, Sel459, Se50 e Se528 forampurificadas por tampão trocado em fosfato de sódio pH 7,420 mM e concentradas para proporcionar uma concentraçãoequivalente à concentração molar de Se358 a 10 μg/mL, ondepossível. Proteínas, Se595 e Se528 foram insolúveis naconcentração desejada. As concentrações de proteínaverdadeiras estão mostradas na Tabela 2.

Tabela 2: Doses efetivas das subunidades recombinantesadministradas

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As proteínas purificadas em fosfato de sódio 20 mM, pH7,4, foram diluídas 1:3 em adjuvante TS6 (exemplo 1 de US-A-2005/0079185) antes da administração.

Grupos de 20 de camundongos BalbC fêmeas de 3 a 4semanas de idade foram vacinados no dia zero (DO) com cadauma das cinco vacinas de subunidade de Streptococcus equi.

As vacinações foram efetuadas por injeção intramuscular nacoxa e intranasalmente. Esses camundongos receberam umavacinação de reforço depois de 4 semanas (D28) e foramestimulados com Streptococus equi depois de mais 2 semanas(D42). Um grupo de controle adicional que não recebeuvacinação também foi incluído, e foi estimulado em D42. Umgrupo de 5 camundongos de controle não foi vacinado ouestimulado com Streptococcus equi (veja Tabela 3).

O tamanho do grupo é suficiente para detectar 50% deproteção do camundongo vacinado com 80% de infecção doscontroles. Sangue foi retirado antes da vacinação, antes doreforço, antes do estímulo e na eutanásia para determinar onível de resposta de anticorpo em relação à vacinação eestímulo.A cepa de Streptococcus equi 4047 foi cultivada para oestimulo em caldo Todd Hewitt (THB) suplementado com sorofetal bovino 10% (FCS). Uma cultura de um dia para o outrofoi diluída de 1:20 para inocular THB + FCS 10% pré-aquecido e gaseificado fresco e a cultura cresceu até seralcançada uma OD600 nm de 0,3. Nesse ponto, foram feitasdiluições da cultura. Após o preparo da dose necessária dacepa de Streptococcus equi 4047, os camundongos foramsedados com 100 mg/Kg de Ketaset por injeção intramusculare foram estimulados por administração intranasal de 10 μLde inóculo estímulo contendo aproximadamente 1 χ 10^4 cfu deS. equi.

Imediatamente após o estímulo, a dose administrada foiquantificada por titulação reversa e foi verificada comocontendo 0,9 χ 10^4 cfu.

Todos os camundongos foram cuidadosamente monitoradospara assegurar a completa recuperação da sedação everificados regularmente quanto ao início dos sinaisclínicos de doença; Esses incluíram mal-estar, calafrio oufalta de secreção sebácea e foram tomados como um sinal deefeito moderado com o início de efeitos mais severospossível. Os camundongos foram, finalmente, eutanasiados.

As observações clínicas foram registradas diariamenteatravés do estudo e os camundongos foram pesados antes davacinação, antes do reforço, antes do estímulo e, a seguir,diariamente após o estímulo. Esfregaços nasais foramretirados dos camundongos após o estímulo para quantificaro nível de liberação de Streptococcus equi. Um exame pós-morte foi efetuado em todos os camundongos.

Tabela 3: Resumo do protocolo de estudo

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A fase de vacinação procedeu sem incidente, todos osgrupos ganharam peso de acordo com os controles. Nenhumareação de sitio de injeção adversa foi identificada. Todosos camundongos soroconverteram em relação à vacinaçãoadministrada.

Após o estimulo, os grupos vacinados com Se595, Se358,Sel459, Se528 e Se50 geralmente têm sinais reduzidos dedoença, perda de peso reduzida, mais ganho de peso,colonização nasal reduzida e sobrevivência melhorada emcomparação com os controles. Cada camundongo foi examinadono dia do estimulo e em cada um dos 7 dias a seguir para aocorrência de sintomas associados com Streptococcus equi(letargia, perda de peso, espirro, ereção de pêlos,agachamento, desequilíbrio do ouvido interno). Oscamundongos foram examinados pelo menos 4 vezes por dia. Ométodo de pontuação e registro a seguir foi aplicado(Tabela 4).

Tabela 4: Método de pontuação de garrotilho

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Por exemplo: um camundongo com ereção de pêlos queesteja quieto, encurvado e imóvel poderia pontuar 3+3+5+ 10 = 21.

Os pesos dos camundongos foram analisados numaplaninha diariamente para determinar a % de perda de pesoem relação ao dia do estimulo.

Após o estímulo, o nariz de cada camundongo foi tocadonuma placa de ágar seletiva para estreptococos claramentemarcados diariamente (bioMerieux). As placas foram riscadaspara determinar se bactérias S. equi viáveis estavampresentes. 0 nível de esfoliação de S. equi foiclassificado de acordo com o seguinte sistema de pontuaçãode 4 pontos: 0 = sem crescimento, 1 = 1 - 10 colôniaspresentes, 2 = 11 - 100 colônias presentes, 3 = mais de 100colônias e 4 - crescimento confluente.

As amostras de sangue foram retiradas da veia da coxa.

O soro foi preparado e armazenado, congelado a -20°C ouabaixo até o uso.

Os sinais clínicos foram observados a partir dos diasD44, 2 dias após o estímulo. Os grupos vacinados geralmente tinham sinais clínicos menores do que os grupos decontrole. Os camundongos vacinados com Se50 e Se358 tinhamo menor dos sinais clínicos de doença. Aqueles vacinadoscom Se595 tinham sinais clínicos de doença por um períodoreduzido comparado com os controles (FIG. 1) . No exame na alteração percentual média na massa após o estimulo, emrelação ao dia do estimulo (D42), ficou claro que os Gruposvacinados com Se528, Sel459 e Se50 tinham uma perda de pesolevemente reduzida. Entretanto, camundongos vacinados comSe358 e Se595 pareceram mais protegidos (FIG. 2) . Conforme esperado, o número médio de bactérias β-hemolíticasisoladas toques com o focinho aumentou após o estímulo,atingindo o pico no D45 (3 dias após o estímulo) . No D45,as menores pontuações de toques nasais foram vistas nosgrupos vacinados com Se358, Se595, Se50 e Sel459. Os gruposvacinados geralmente tinham pontuações menores que osgrupos de controle. A exceção sendo camundongos vacinadoscom Se358, os quais atingiram o pico no D46 (FIG. 3).

Tabela 5: respostas sorológicas de IgG

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*diluição dos soros para se obter uma leitura de ELISAde cerca de 1,5 em estudos preliminares.

** diluição dos soros para se obter uma leitura deELISA de cerca de 0,3 em estudos preliminares.

Exemplo 4: Expressão de polipeptidios recombinantes deStreptococcus eqai Sel631, Sel681 e SIa em Escherichia. coliPolinucleotideos que codificam os fragmentos de Se1631, Se 1681 e Sla foram produzidos usando Vent DNApolimerase (New England Biolabs® Inc.) de acordo com ascondições recomendadas pelo fabricante com uma etapa dedesnaturação de 5 minutos seguida por 35 ciclos usando 30segundos de anelamento a 50 a 55°C, 1 minuto extensão a72°C, e 30 segundos de desnaturação a 95°C. Os produtosforam finalizados com uma extensão de 4 minutos. 0 molde emcada caso foi DNA cromossômico de cepa 4047 deStreptococcus equi.

Os fragmentos de Sel631, Sel681 e Sla são aquelesdesignados como SEQ ID NOS: 53, 55 e 57, respectivamente.Tabela 6: Iniciadores usados para clonar e seqüênciassubunidades recombinantes.

<table>table see original document page 113</column></row><table><table>table see original document page 114</column></row><table>

Todos os produtos de PCR foram purificados usando okit de purificação Qiaquick PCR (Qiagen) com um volume deeluição de 32μL, e então digeridos com a adição de tampãode EcoRI (3,5μL) (New England Biolabs® Inc.), BamHI(0,75μL) e EcoRI (0,75uL) por 2 horas a 37°C. 1 μg deplasmideo pGEX-3X (GE Healthcare) também foi digerido comEcoRI e BamHI como descrito acima. Os plasmideos pGEX-3Xtêm sítios de clonagem múltipla, um promotor de tac, genede glutationa S-transferase (GST) e códons de parada emtodas as três fases, para a produção de proteínas de fusãode GST e seu isolamento e purificação.

Todos os produtos de digestão foram corridos em géisde agarose TAE 0,7%, o produto de restrição desejadocortado e purificado usando o kit de extração Qiaquick gel(Qiagen) com uma eluição final de 35 uL.

As reações de ligação foram iniciadas usando 16,5uL deproduto de PCR purificado digerido e ΙμL de plasmideo pGEX-3X com 2μL de tampão de ligase e 0,5μL de ligase, eincubadas durante a noite em temperatura ambiente (rtp).

As reações de ligação foram transformadas em E. colicepa DHlOB e plaqueadas sobre placas de L-ágarsuplementadas com ampicilina 50 μg/mL e incubadas durante anoite a 37°C. Os transformantes foram testados quanto àpresença do inserto por PCR de colônia. Uma única colôniafoi ressuspensa em 4pL de água e 2\iL disso foramadicionados a uma reação de PCR com Taq DNA polimerasecontendo os iniciadores de clonagem apropriados para opolinucleotideo de interesse e 35 ciclos de extensão foramrealizados conforme descrito acima. A presença do insertodesejado foi confirmada pela corrida da reação de PCR sobregéis de TAE agarose 0,7%.

Os plasmideos de cada um dos clones foram preparados esequenciados usando iniciadores 5' e 3' pGEX-3X PCR paratodos os clones (Tabela 6). Todos os polinucleotideosclonados foram confirmados ter a mesma seqüência como aseqüência montada do genoma de Streptococcus equi cepa 4047(http://www.sanger.ac.uk/Projects/S equi/).

Todos os clones foram induzidos para expressão usandoo seguinte protocolo. Uma única colônia foi inoculada em 50mL de meio de cultura 2 χ YT contendo ampicilina 50μg/mL efoi cultivada durante a noite com agitação a 220 rpm a37°C. Essa cultura foi então adicionada a 500 mL de YT 2 χpré-aquecido (37°C) e pré-gaseifiçado e incubada por 1 horaa 37°C. Após 1 hora, 200 μΐϋ foram removidos e as célulasforam coletadas para análise (essa sendo a amostra de pré-indução), ITPG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo) foiadicionado para uma concentração final de 0,1 mM e atemperatura foi reduzida para 28°C. A cultura foi induzidapor mais quatro horas e uma amostra de 100 foi removidapara análise, após o que as células foram coletadas porcentrifugação e armazenadas a -70°C.

Todas as amostras foram analisadas usando SDS-PAGE 10% .

Os péletes foram ressuspensos em 20 mL de PBS gelado(Oxoid Limited, catálogo # BR0014G), PMSF (Fluoreto deFenilmetil sulfonil) foi adicionado para uma concentraçãofinal de 0,1 mM e as células foram lisadas por sonicaçãosobre gelo com pulsos de 6 χ 10 segundos com 10 segundos derepouso entre cada pulso. Triton X-100 0,1% (v/v) foiadicionado e as células insolúveis e intactas foramremovidas por centrifugação (11.000gf 5 min 4°C). Amostrasdo lisado bacteriano solúvel e do material insolúvel foramanalisadas por SDS-PAGE. DTT (ditiotreitol; reagente deCleland) (5 mM) foi adicionado e 1,3 mL de glutationasefarose 4B foram adicionados (igual a Iml de esferas,essas foram pré-lavadas três vezes com 20 mL de PBS) . Amistura foi incubada em temperatura ambiente por 1 hora eentão as esferas foram coletadas por centrifugação (800 g,2 min, rtp) e lavada três vezes com 50 mL de PBST gelado(PBS com Triton X-IOO 0,1% v/v). Amostras de cada lavagem (lavagens 1 a 3) foram retiradas para análise por SDS-PAGEcomo foi a amostra de proteína de fusão acoplada asesferas. Todas as amostras foram analisadas usando SDS-PAGE10%.

A remoção do veículo de GST foi feita para todas asproteínas de fusão por clivagem com protease

As reações de clivagem foram realizadas com a proteínade fusão acoplada a esferas de glutationa sefarose. Asesferas foram equilibradas primeiro uma vez com 20 mL detampão de lavagem (Tris-HCl, 50 mM, pH 7.5, NaCl, 150 mM) e depois duas vezes com 20 mL tampão de clivagem (tampão delavagem com CaCl2, 1,0 mM) e finalmente ressuspensas em 1mL de tampão de clivagem. Fator Xa (New England Biolabs®Iric.) (50 unidades) foi adicionado e incubado em ummisturador rotatório por 16 horas em temperatura ambiente. A proteína liberada foi recuperada pela peletização dasesferas de glutationa (800 g, 2 min, rtp) e retenção dosobrenadante. As esferas foram lavadas duas vezes com 1 mLde tampão de lavagem e o sobrenadante foi retido a cadavez. Alíquotas de cada sobrenadante e as esferas deglutationa remanescentes foram analisadas por SDS-PAGE. Asesferas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem 2(Tris-HCL, 50 mM, pH 8,0) e eluidas com 3 mL de tampão delavagem 2 contendo glutationa reduzida 0,5 mM por 2 min emtemperatura ambiente seguido pela peletização das esferas(800 g, 2 min, rtp) e retenção do sobrenadante. Essaeluição foi repetida duas vezes e a pureza de cada fraçãofoi analisada por SDS-PAGE.

Exemplo 5: Proteção em camundongos após administração devacina de subunidade Sel631, Sel681 ou Sla e estimulo comStreptococcus equi.

Grupos de 20 de camundongos BalbC fêmeas de 3 a 4semanas de idade foram vacinados no dia o (DO) com cada umdos peptídeos de S. equi Sel631, Se 1681 e Sla e um grupode controle com GST + adjuvante. Este tamanho de grupo ésuficiente para detectar 50% de proteção de camundongos com80% de infecção de controles. Um grupo controle adicionalde 5 camundongos que não recebeu nenhuma vacinação ouestímulo foi incluído (veja a Tabela 7). Três vacinas desubunidade de Streptococcus equi foram usadas, Sel631,Sel681358 e Sla. Todas estas vacinas usaram as proteínas deStreptococcus equi obtidas no Exemplo 4.

As proteínas recombinantes foram preparadas paravacinação por concentração de centricon em tampão fosfatoem tampão fosfato 0,02 M pH 7,4 a 7,5 mg/mL e adicionar 2partes de adjuvante TS6 (exemplo 1 de US-A-2005/0079185) .

Os camundongos foram vacinados no Dia Oeo reforço no Dia 28. Vacinações de IM foram administradas na coxaesquerda no Dia o e na coxa direita no Dia 28 de acordo coma seguinte tabela. Vacinações de IN serão administradasatravés de uma pipeta nas narinas dos camundongos.

Sangue foi retirado antes da vacinação, antes do reforço, antes do estímulo e na eutanásia para determinar onível de resposta de anticorpo em relação à vacinação eestímulo.

Os camundongos foram estimulados com S. equi após mais2 semanas. A cepa de S. equi 4047 foi preparada conforme o exemplo 3. Após a diluição para a dose necessária, 10 \iLforam administrados a camundongos sedados pela viaintranasal em um ambiente contido. Os camundongos foramcuidadosamente monitorados para garantir a completarecuperação da sedação e checados regularmente quanto aoinicio dos sinais clínicos de doença. Estes incluem mal-estar, mal-estar, calafrio ou falta de secreção sebácea eforam tomados como um sinal de efeito oderado com o iníciode efeitos mais severos possível.

Tabela 7: Restimo do protocolo de estudo

<table>table see original document page 120</column></row><table><table>table see original document page 121</column></row><table>

As observações clínicas foram registradas diariamente

por todo o estudo (para o método de pontuação veja a Tabela4) e camundongos foram pesados antes da vacinação, antes doreforço, antes do estímulo e então diariamente após oestímulo. Toques nos focinhos foram tomados de camundongosapós o estímulo para quantificar o nível de liberação de S.equi.

Os sinais clínicos foram observados a partir dos diasD44, 2 dias após o estímulo. Os grupos vacinados geralmente tinham sinais clínicos menores do que os grupos decontrole. Os camundongos vacinados com Sel631 tinham omenor dos sinais clínicos de doença. Aqueles vacinados comSel681 e Sla tinham sinais clínicos de doença por umperíodo reduzido comparado com os controles (FIG. 4).

No exame na alteração percentual média na massa após oestimulo, em relação ao dia do estimulo (D42), ficou claroque os Grupos vacinados com Sel681, Sel631 e Sla tinham umaperda de peso levemente reduzida. No dia D4 9, oscamundongos vacinados com Sla pareceram menos protegidos(FIG. 5).

Conforme esperado, o número médio de bactérias β-hemoliticas isoladas toques com o focinho aumentou após oestimulo, atingindo o pico no D49 (7 dias após o estimulo).No D49, as menores pontuações de toques nasais foram vistasnos grupos vacinados com Sel631 e Sel681. Os gruposvacinados geralmente tinham pontuações menores que osgrupos de controle. A exceção sendo camundongos vacinadoscom Sla os quais atingiram o pico no D48 (FIG. 6).

No exame da porcentagem de camundongos que sobrevierame não perderam mais do que 7% do peso (FIG. 7), ficou claroque os grupos vacinados com Sel631, Sel681 e Sla tiveramuma perda de peso reduzida e uma melhor taxa de sobrevidaque os grupos de controle.

Tendo assim descrito em detalhe as modalidadespreferidas da presente invenção, deve ser entendido que ainvenção definida pelos parágrafos acima não deve serlimitada aos detalhes particulares descritos na descriçãoacima já que muitas variações claras desta são possíveissem se afastar do objeto ou escopo da presente invenção.

Claims

1. Vacina caracterizada pelo fato de compreender pelomenos um polipeptidio com uma seqüência de aminoácidosconforme mostrada nas SEQ ID Nos: 18, 20, 22, 24, 26, 48,- 50 e 52, ou um análogo ou um fragmento seu.

2. Vacina, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o polipeptidio é umfragmento com uma seqüência de aminoácidos conformemostrado nas SEQ ID Nos: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e 58,ou um análogo seu.

3. Vacina caracterizada pelo fato de compreender pelomenos um vetor recombinante e pelo menos um polinucleotideoali inserido codificando para um polipeptidio com umaseqüência de aminoácidos conforme mostrada nas SEQ ID Nos:- 18, 20, 22, 24, 26, 48, 50 e 52, ou um análogo seu ou umfragmento seu, e o referido vetor é capaz de expressar invivo esse polipeptidio num mamífero suscetível a infecçõespor estreptococos.

4. Vacina, de acordo com a ; reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que o polipeptidio é umfragmento com uma seqüência de aminoácidos conformemostrada nas SEQ ID Nos: 32, 34, 36, 38, 40, 54, 56 e 58,ou um análogo seu.

5. Vacina caracterizada pelo fato de compreender pelomenos um vetor recombinante e pelo menos um polinucleotideoali inserido, em que o referido polinucleotideo tem umaseqüência de nucleotideos conforme mostrada nas SEQ ID Nos:-17, 19, 21, 23, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 47, 49, 51, 53, 55e 57, ou um análogo seu, e o referido vetor é capaz deexpressar in vivo o polipeptidio codificado pelo referidopolinucleotideo num mamífero suscetível à infecção porestreptococos.

6. Vacina, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 3 a 5, caracterizada pelo fato de que ovetor é um vetor de expressão.

7. Vacina, de acordo com a reivindicação 6,caracterizada pelo fato de que o vetor é um plasmídeo, umvírus, notavelmente um poxvírus, um herpesvírus eqüino(EHV), um adenovírus humano, um vírus de encefalite eqüina.

8. Vacina, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que avacina é uma vacina que protege o eqüino contra garrotilhoscausados por infecção por Streptococcus equi.

9. Uso de pelo menos um polipeptidio com uma seqüênciade aminoácidos conforme mostrada nas SEQ ID Nos: 18, 20,-22, 24, 26, 48, 50 e 52, ou análogos seus ou fragmentosseus caracterizado pelo fato de que estes são usados napreparação de uma subunidade de vacina protetora de eqüinoscontra infecção por Streptococcus equi.

10. Uso de pelo menos um polipeptidio com uma seqüênciade aminoácidos conforme mostrada nas SEQ ID Nos: 32, 34,36, 38, 40, 54, 56 e 58, ou análogos seus, caracterizadopelo fato de que estes são usados no preparo de umasubunidade de vacina protetora de eqüinos contra infecçãopor Streptococcus equi.

11. Uso de pelo menos um vetor recombinante, conformedefinido em uma das reivindicações de 3 a 7, caracterizadopelo fato de que este vetor é usado no preparo de umavacina recombinante protetora de eqüinos contra infecçãopor Streptococcus equi.

12. Preparação de anticorpos caracterizada pelo fato decompreender pelo menos um anticorpo especifico para umpolipeptidio ou análogos ou fragmentos seus, conformedefinido na reivindicação 1 ou 2, cujo anticorpo époliclonal ou monoclonal, ou um fragmento do referidoanticorpo.

13. Kit de diagnóstico para detectar infecções por umabactéria estreptocócica, caracterizado pelo fato decompreender pelo menos um polipeptidio ou análogos ou umfragmento seu conforme definido na reivindicação 1 ou 2, ouuma preparação de anticorpos de acordo com a reivindicação-12 .

14. Método de diagnóstico para detectar infecção por umabactéria estreptocócica caracterizado pelo fato decompreender o uso de um kit de diagnóstico, de acordo com areivindicação 13, e a detecção numa amostra do polipeptidioou de um anticorpo especifico para aquele polipeptidio.

15. Método de imunização passiva caracterizado pelo fatode compreender a administração da preparação do anticorpoda reivindicação 12 a um mamífero suscetível a bactériasestreptocócicas ou infectado por bactéria estreptocócica.

16. Método de imunização passiva, de acordo com areivindicação 15, caracterizado pelo fato de compreender aadministração da preparação do anticorpo a um eqüinosuscetível à infecção por Streptococcus■ equi ou infectadopor Streptococcus equi.